JPH03266984A

JPH03266984A - スーパーオキサイドジスムターゼのポリ結合体

Info

Publication number: JPH03266984A
Application number: JP2064308A
Authority: JP
Inventors: Tomohisa Nagasaki; 長崎　倶久; Yohei Natori; 名取　與平; Tatsuya Owaki; 大脇　達也; Masataka Kitamura; 北村　正孝; Shigeki Yamamoto; 茂樹山本
Original assignee: Lederle Japan Ltd; Nisshin Seifun Group Inc
Current assignee: Pfizer Japan Inc; Nisshin Seifun Group Inc
Priority date: 1990-03-16
Filing date: 1990-03-16
Publication date: 1991-11-27

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明はスーパーオキサイドジスムターゼ（以下、ＳＯ
Ｄと記す。）のポリ結合体に関し、詳細にはＳＯＤを架
橋剤、グルタルアルデヒドと反応させて得たＳＯＤのポ
リマーに関する。

活性酸素であるスーパーオキザイド（０２）を不均化反
応（ｄｉｓｕｍｕｔａｔｉｏｎ）で消失せしめるスーパ
ーオキサイドジスムターゼなる酵素は古くから知られて
おり、このＳＯＤ自体は活性酸素の起因する好ましくな
い疾病に有効に作用する薬剤となり得ることが種々示唆
されている。たとえば、炎症に対する活性酸素の関与は
早くから認められており、この炎症に関与する活性酸素
を不均化するものとしてウシ血液Ｓ　ＯＤは抗リウマチ
剤としてずでに外国において市販されているものである
。

加えて、リウマチの治療のみならず精製ＳＯＤでの投与
で難治疾患として知られているベーチェット病の治療の
例も報告され、さらには癌治療期にＳＯＤを併用するこ
とにより、制癌剤等による副作用ならびに放射線の照射
による副作用等を低下させる作用をも有するといわれ、
その応用の可能性の範囲はかなり広範囲に及Ａ、でいる
。またご（最近においては、虚血性心疾患の治療につい
てもＳＯＤの有効性が検討されてきている。

したがって、ＳＯＤ自体は種々の疾患に対する非常に有
効な薬物となり得る性質を有するものではあるが、血液
中での半減期が約６分といわれる程失活時間が早く、い
まだＳＯＤ自体を有効に投与し得る製剤化検討は十分に
なされていないのが現状である。

ところで、フランスの生化学者ミケルソンは、ウシＳＯ
Ｄをリボゾームに封入したりポゾーマルＳＯＤを提案し
ており、リポゾーマル化した結果、ＳＯＤが血中におい
てその失活化から保護されるとともに、細胞膜と融合し
ＳＯＤがそのまま細胞内に入るため効果的であると報告
している。

しかしながら、ミケルソンはそのリボゾーマル成分の詳
細についてはなんら明らかにしているものはなく、はた
してＳＯＤ自体が失活することなく疾患部位、たとえば
炎症部位に高濃度で輸送され、その場において有効に作
用するかは不明なものである。

したがって、ＳＯＤ本来の生理活性を考えた場合には、
ＳＯＤの活性を長時間にわたり持続するＳＯＤ自体の修
飾、ならびにそれを利用した製剤化が熱望されているも
のである。

かかる観点より、ＳＯＤ自体の化学修飾が種々検討され
ており、ＳＯＤを高分子化合物、たとえばポリエチレン
グリコールに架橋剤を用いて結合させたものあるいはＳ
ＯＤとアルブミンを結合させたもの等が提案され、これ
らＳＯＤの化学修飾物は、ＳＯＤの活性が持続した旨の
報告がなされている。しかしながら、上記のごとく化学
修飾されたＳＯＤはその活性の半減期が延長されたとし
ても、その物自体に抗原性の問題があり、臨床上適用し
得るにたる製剤とすることは不可能なものであり、いま
だ有効なるＳＯＤ自体の化学修飾手段は確立していない
。

そこで本発明者らは、臨床的に使用でき得る製剤化可能
なＳＯＤの化学修飾について検討を加えた結果、グルタ
ルアルデヒドを架橋結合剤として使用し、このグルタル
アルデヒドとＳＯＤを緩衝液中、ｐＨ６，５〜８０の領
域で反応させて得たポリ結合体には、ＳＯＤの活性が保
持されるとともに抗原性もなく、その半減期が持続した
ものであることを新規に見いだし、本発明を完成させた
のである。

すなわち本発明は、ＳＯＤのポリ結合体であって、ＳＯ
ＤをｐＨ６，５〜８．０の緩衝液中で架橋剤としてグル
タルアルデヒドと処理し、グルタルアルデヒド鎮により
スーパーオキサイドジスムターゼ分子を架橋させて得た
ＳＯＤのポリマーに関する。

本明細書において使用し、かつ本発明が目的とするｒｓ
ＯＤのポリマー」とは、上記の如く架橋剤として用いた
グルタルアルデヒド鎖の反応基とＳＯＤ中のアミノ基と
が結合し、グルタルアルデヒド鎖によりＳＯＤ分子が２
分子〜１５分子結合したポリ結合体を意味する。

加えて本発明のｒｓＯＤのポリマー」には、架橋反応の
結果得られた処理物それ自体をも意味し、上記にいうＳ
ＯＤのポリ結合体とともに架橋反応に使用した未反応の
ＳＯＤ分子が混在するものをも包含する。

また本発明にあっては、上記のポリ結合体は未反応のグ
ルタルアルデヒド由来の反応基がグリシンによりキャッ
ピングされたＳＯＤのポリマーをも提供する。

さらに本発明は、ＳＯＤのポリマーの製造法を提供する
ものであり、該方法は、ＳＯＤをｐＨ６，５〜８０の不
活性ガスもしくは窒素で置換した緩衝液中、グルタルア
ルデヒドを架橋剤として反応させ、グルタルアルデヒド
鎖によりＳＯＤ分子を架橋結合させる方法からなる。該
方法にあっては、反応終了後にＳＯＤポリマー中に残存
する未反応のグルタルアルデヒド由来の反応基をアミノ
酸でキャッピングさせるのが好ましく、該キャッピング
によりポリマーのそれ以上の重合がストップすることに
なる。

本発明でＳＯＤの架橋剤として使用するグルタルアルデ
ヒドは、たとえば、抗原−抗体反応のサンドイッチ免疫
試薬における共有結合の架橋剤として使用されたり、タ
ンパクの化学的架橋修飾剤として使用されているもので
はあるが、本発明においては、上記する如＜　ＳＯＤ中
のアミン基とグルタルアルデヒドのアルデヒド鎖の反応
基が結合を形成し、架橋反応を行い、ポリマーを構成す
るものである。

その中でも、本発明にあっては特にＳＯＤが２〜６分子
結合したものが良い。

本発明で使用するＳＯＤとしては、ウシ血球由来のＳＯ
Ｄ、ウシ肝臓由来ＳＯＤ、遺伝子組み換え型ヒトＳＯＤ
のいずれでも良く、グルタルアルデヒドによりポリマー
としたものには、ＳＯＤ活性が保持されるとともに、血
中半減期が延長されることが判明した。また、ＳＯＤ自
体に抗原性の問題があるが、本発明のポリマーにはその
抗原性が低減されているとともに、そのもの自体の安定
性も特に優れたものであることが判明した。

したがって本発明は、これまでに種々検討されてきたＳ
ＯＤの化学修飾の中でも特に応用性の高いものであると
いえる。

本発明においては、ＳＯＤをグルタルアルデヒドにより
ポリ結合体としたものであるが、ＳＯＤが２〜１５分子
、好ましくは２〜８分子、より好ましくは２〜６分子が
グルタルアルデヒド鎖により架橋したポリ結合体、すな
わち、ＳＯＤをモノマとしてとらえた場合にポリマーと
しては２　ｍｅｒ〜１５ｍｅｒ、好ましくは２〜８　ｍ
ｅｒ、特に好ましくは２〜６　ｍａｒであるものが良い
。

本発明のＳＯＤのポリマーはたとえば次のようにして製
造することができる。すなわち、ＳＯＤをｐＨ６，５〜
８，０の緩衝液中に溶解し、この溶液を不活性ガスもし
くは窒素で置換した後グルタルアルデヒドの溶液を添加
し、０℃〜室温の温度下に撹拌し、ＳＯＤのポリマーを
形成させる。グルタルアルデヒドの量は、特に限定され
ないが、ＳＯＤに対しそのモル数で１：２００〜３００
程度、好ましくは１：約２３０〜２５０程度が良い。ま
た、使用するグルタルアルデヒドはゲルパーミェーショ
ンクロマトグラフィー分析において単一の分子量分布を
もつ高純度に精製されたものを用いることが望ましく、
製造されたＳＯＤポリマーについて分子量分布やグルタ
ルアルデヒドの含有量において再現性のある結果を得る
ことができる。

用いる緩衝液としては、リン酸ナトリウムが好ましく、
そのｐＨは、特に６５〜８０、好ましくは７、１５程度
であるのが良い。撹拌時間は特に限定されないが、０．
５〜５．０時間であり、反応の停止は脱塩カラムまたは
、限外濾過膜にて過剰のグルタルアルデヒドを除去する
ことにより行われる。かかる方法によりＳＯＤのポリマ
ーが形成されるが、反応溶液中には目的とするポリ結合
体とともに原料として用いたＳＯＤが混在している。本
発明のＳＯＤのポリマーにはかかるＳＯＤが混在したも
のをも包含する。

かくして得られたポリマーの溶液は濃縮後、凍結乾燥す
ることにより結晶性ないし微結晶性の微粉末として取得
することができる。しかしながら、架橋反応終了後、未
反応のグルタルアルデヒドを除去して得られた溶液にア
ミノ酸を加え撹拌し、グルタルアルデヒドの鎖中に存在
する未反応の反応基をキャッピングしてやるのが特に良
いことが判明した。このキャッピングは、たとえば以下
のようにして実施される。すなわち、上記の方法で得ら
れたポリマーの溶液にアミノ酸を含む緩衝液を添加し、
撹拌することにより行われる。アミノ酸を含む緩衝液と
しては、ＳＯＤのポリマ化の実施に使用したと同様の緩
衝液が使用され、撹拌時間は１〜５時間程度、撹拌温度
は５−３０℃程度、好ましくは１５〜２２℃程度である
。このキャッピング処理が終了した段階で、反応に関与
しなかった過剰のアミノ酸を限外ろ過により除去し、濃
縮、蒸留水置換を繰り返すことにより、ＳＯＤポリマー
の溶液を得る。

なお、原料のＳＯＤを除去したＳＯＤのポリマーを得る
場合には架橋反応終了後、またはキャッピング処理後に
限外濾過膜またはカラムクロマトグラフィーによりかか
る原料のＳＯＤを除去してやることで製造することがで
きる。かくして得られたＳＯＤポリマー、またはＳＯＤ
モノマーを除去したＳＯＤポリマーは、凍結乾燥するこ
とにより粉末状ないし微結晶性の微粉末として取得でき
る。なお、このものは粉末として長期保存に耐えつるも
のであるが、本発明にあっては特に溶液状態で長期安定
性か良好であることが判明した。

以上の方法で製造された本発明のＳＯＤのポリマーは、
ＳＯＤ活性が保持されていると共に、血中での活性半減
期も延長され、実際の臨床使用に際し特に優れたもので
あることが判明した。

以下に実施例にて本発明を更に説明するが、本発明はこ
れに限定されるものではない。

実施例１：ウシ血球由来のＳ　ＯＤ　１００ｍｇをとり２０ｍＭリ
ン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，１５）　４０ｍ１に溶
解し、アルゴンガス置換のもとてグルタルアルデヒド７
５ｍｇを添加し、１０℃にて１２５時間撹拌する。反応
終了後、未反応のグルタルアルデヒドを限外濾過膜（分
画分子量１万）により除去、さらに蒸留水への置換を行
い、濃縮してｌｏｍｌとし、ＳＯＤポリマ１溶液を得た。

また、この溶液をゲル濾過カラム（セファデックスＧ７
５）に供しＳＯＤモノマーを除き、ＳＯＤモノマーを除
去したＳＯＤポリマー溶液を得た。

更に、上記のＳＯＤポリマー溶液およびＳＯＤモノマー
を除去したＳＯＤポリマー溶液を凍結乾燥し、結晶性な
いし微結晶性の微粉末を得た。

実施例２：実施例１の方法に準じ、ウシＳＯＤに代え遺伝子組換え
型ヒトＳＯＤを用い同様処理し、ＳＯＤポリマーならび
にＳＯＤモノマーを除去したＳＯＤポリマーを得た。

実施例３：ウシ血球由来のＳ　ＯＤ　２．５ｍｇを取り２０ｍＭリ
ン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，１５）　１ｍｌに溶解
し、アルゴンガス置換のもとてグルタルアルデヒド１．
９ｍｇを添加し、１０℃にて１２５時間撹拌する。反応
終了後、未反応のグルタルアルデヒドを限外濾過膜　２（分画分子量１万）により除去、さらに蒸留水への置換
を行い、濃縮して１ｍｌとし、ＳＯＤポリマ溶液を得た
。

この溶液にグリシン溶液（２４ｍｇ／ｍ］、　４０ｍＭ
リン酸ナトリウム緩衝液）を１ｍｌ加え、１８℃にて２
時間撹拌し、キャッピング処理を行った。反応終了後、
限外濾過膜（分画公刊１万）にて未反応のグリシンを除
去し、また蒸留水への置換を行い、濃縮してＳＯＤポリ
マー溶液を得た。

また、このＳＯＤポリマー溶液をゲル濾過カラム（ウル
トロゲルＡｃＡ３４　）に供し、ＳＯＤモノマを除き、
ＳＯＤモノマーを除去したＳＯＤポリマー溶液を得た。

更に、上記のＳＯＤポリマー溶液及びＳＯＤモノマーを
除去したＳＯＤポリマー溶液を凍結乾燥し、結晶性ない
し微結晶性の微粉末を得た。

実施例４：実施例３の方法に準じ、ウシＳＯＤに代え遺伝子組換え
型ヒトＳＯＤを用い同様処理し、ＳＯＤポリマーならび
にＳＯＤモノマーを除去したＳＯＤポリマーを得た。

実施例５：実施例３の方法に準じ、グリシンに代え、アラニンを用
い同様処理し、ＳＯＤポリマーならびにＳＯＤモノマー
を除去したＳＯＤポリマーを得た。

実施例６：ウシ血球由来のＳ　ＯＤ　１００ｍｇをとり２０ｍＭリ
ン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，０）　４０ｍ１に溶解
し、アルゴンガス置換のもとてグルタルアルデヒド７５
ｍｇを添加し、１０℃にて１．２５時間撹拌する。反応
終了後、未反応のグルタルアルデヒド及びＳＯＤのモノ
マーを限外濾過膜（分画分子量５万）により除去、さら
に蒸留水への置換を行い、濃縮して１０ｍ１としＳＯＤ
モノマーを除去したＳＯＤポリマー溶液を得た。

また、この溶液を凍結乾燥し、結晶性ないし微結晶性の
微粉末を得た。

実施例７実施例６の方法に準じ、ウシＳＯＤに代え遺伝子組換え
型ヒトＳＯＤを用い同様処理し、ＳＯＤモノマーを除去
したＳＯＤポリマーを得た。

実施例８：ウシ血球由来のＳ　ＯＤ　１００ｍｇをとり２０ｍＭリ
ン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７０）　４０ｍ１に溶解し
、アルゴンガス置換のもとでグルタルアルデヒド７５ｍ
ｇを添加し、１０℃にて１．２５時間撹拌する。反応終
了後、未反応のグルタルアルデヒド及びＳＯＤのモノマ
ーを限外濾過膜（分画分子量５万）により除去、さらに
蒸留水への置換を行い、濃縮して４０ｍ１としＳＯＤモ
ノマーを除去したＳＯＤポリマー溶液を得た。

この溶液にグリシン溶液（グリシン２４ｍｇ／ｍｌ。

４０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液）を４０ｍ１加え、１
９℃にて２時間撹拌し、キャッピング処理を行った。

５６反応終了後、限外濾過膜（分画分子量１万）にて未反応
のグリシンを除去し、また蒸留水への置換を行い濃縮し
て１０ｍ１とし、ＳＯＤモノマーを除去したＳＯＤポリ
マー溶液を得た。

またこの溶液を凍結乾燥し、結晶性ないし微結晶性の微
粉末を得た。

量分布の変化をゲル濾過クロマト分析（ＧＦＣ）により
観察した。

観察口は試験開始時、３日、７日、１４日、２４日及び
５６日後とした。

各条件下における結果を次表にまとめる。

実施例９実施例８の方法に準じ、ウシＳＯＤに代え遺伝子組換え
型ヒｌ−Ｓ　ＯＤを用い同様処理し、ＳＯＤモノマーを
除去したＳＯＤポリマーを得た。

本発明で得られたＳＯＤポリマーの安定性試験を以下に
記す。

■、安定性試験：実施例３で得られたウシ血球由来のＳＯＤポリマーの溶
液を使用し、４℃、１５℃、２５℃及び４０　’Ｃにて
２ケ月間にわたる安定性試験を検討した。

試験項目は性状（外観および沈殿の有無）、ＳＯＤ比活
性（ＮＢＴ法／Ｌａｗｒｙ法）および分子１２ＩＩ　、安定性試験：実施例４で得られた遺伝子組み替え型ヒト由来のＳＯＤ
ポリマーの溶液を使用し、４℃及び４０　℃にて１ケ月
間にわたる安定性試験を検討した。

試験項目は、性状（外観および沈殿の有無）、ＳＯＤ比
活性（ＮＢＴ法／　Ｌａｗｒｙ法）及び分子量分布の変
化をゲル濾過クロマト分析（ＧＦＣ）により観察した。

観察口は、試験開始時、７日、１６日および２６日後と
した。

各条件下における結果を次表にまとめる。

３４以上の結果からも明らかな如く、本発明のＳＯＤのポリ
マーの溶液は、性状変化もなく、ＳＯＤ活性が保持され
、安定であることが理解される。

■、血中半減期試験：実施例１．２．３および４で得られたＳＯＤポリマーの
血中半減期を試験した。

試験はＣ１ｅｌａｎｄらの方法に準じた。

亙抹二ＳＤ系ラット（雄性：５週齢）を−群４匹として使用し
、ラットに実施例１．２．３および４で得られたＳＯＤ
ポリマーをＳＯＤ用量３ｋｕ／ｋｇとなるよう静脈内注
射し、投与前、投与後１分、１０分、３０分、２時間、
５時間及び２４時間後に採血し、血漿中のＳＯＤ活性を
チトクロームＣ法にて測定した。

なお、対照としてＳＯＤのモノマーを同様に実施した。

２７次に本発明のＳＯＤポリマーの薬理活性について記す。

１、ＳＯＤポリマーのラットカラゲニン足距浮腫におよ
ぼす効果：友災庄ＳＤ系雌雄性ラット体重１６０ｇ前後）を１群７匹とし
、被験薬および１０ｍＭリン酸緩液を対照溶媒として尾
静脈内に投与した後、直ちに左後肢足踏皮下に０１ｍ１
の１％ん−Ｃａｒｒａｇｅｅｎｉｎ生理食塩溶液を処置
した。Ｃａｒｒａｇｅｅｎｉｎ注射足容積はラット用足
容積測定装置（型７１５０　：　ＵＧＯ’　ＢＡＳＩＬ
Ｅ）を用いて、薬物投与１〜５時間後まで１時間ごとに
測定した。

なお、被験薬として実施例３のＳＯＤポリマーを用い、
対照薬としてＳＯＤモノマーを使用した。

　９８ＩＩ　、マウス虚血足浮腫の抑制作用：実施例３で得た
ＳＯＤポリマーを用い、マウス虚血足浮腫の抑制効果を
検討した。

亙迭ユＩＣＲ系雄性マウス（体重的３０ｇ）を１群６匹とし、
被験Ｎ　（５ｍｌ／ｋｇ）を尾静脈より投与し、投与後
直ちにマウスをプラスチック固定具の中に入れ、片足を
固定し、ゴムバンドを１０回巻き付け、ケージへ戻した
。その２０分後にマウスからゴムバンドを切りはずし、
血液を再潅流させ、再潅流１５分後、３０分後、４５分
後に足践厚を測定し、ゴムバンドをかけていない反対側
の足踵厚との差を腫脹厚とし、腫脹率を求めた。

級来二その結果を次表に示す。

１２以上の結果より明らかな如く、本発明のＳＯＤポリマー
はＳＯＤの有する薬理活性が長時間保持される結果、優
れた薬効を発揮していることが理解される。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）スーパーオキサイドジスムターゼをｐＨ６．５〜
８．０の緩衝液中、架橋剤としてグルタルアルデヒドと
処理し、グルタルアルデヒド鎖によりスーパーオキサイ
ド分子を架橋させたスーパーオキサイドジスムターゼの
ポリマー。
（２）スーパーオキサイドジスムターゼが、ウシ血球由
来スーパーオキサイドジスムターゼ、ウシ肝臓由来スー
パーオキサイドジスムターゼ、遺伝子組み換え型ヒトス
ーパーオキサイドジスムターゼである請求項Ｌ記載のポ
リマー。
（３）アミノ酸で未反応のグルタルアルデヒド由来の反
応基をキャッピングした請求項１記載のポリマー。
（４）スーパーオキサイドジスムターゼをｐＨ６．５〜
８．０の緩衝液中、架橋剤としてグルタルアルデヒドと
処理し、グルタルアルデヒド鎖によりスーパーオキサイ
ドジスムターゼ分子を架橋結合させる、スーパーオキサ
イドジスムターゼのポリマーの製造法。
（５）請求項２に記載のスーパーオキサイドジスムター
ゼを用いる請求項４記載の製造法。
（６）架橋反応を不活性ガスもしくは窒素で置換した溶
液中で行う請求項４記載の製造法。
（７）架橋剤であるグルタルアルデヒドがゲルパーミェ
ーションクロマトグラフィー分析において単一の分子量
分布を有するグルタルアルデヒドである請求項４記載の
製造法。
（８）架橋反応後に更にアミノ酸でキャッピングする請
求項４記載の製造法。
（９）スーパーオキサイドジスムターゼをグルタルアル
デヒドにて架橋反応後、残存する未反応グルタルアルデ
ヒドを除去した後にアミノ酸でキャッピングをするスー
パーオキサイドジスムターゼのポリマーのキャッピング
法。
（１０）アミノ酸によるキャッピングを１５℃〜２２℃
において行う請求項９記載のキャッピング法。