JPH03201986A - ネコ免疫グロブリンγ鎖の定常領域をコードする遺伝子断片およびマウス×ネコキメラ抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ネコの疾病、特に伝染病の診断、治療及び予
防に期待できる新規なネコモノクローナル抗体に関する
。さらに詳細にはネコモノクローナル抗体を構成するネ
コ免疫グロブリンγ鎖の定常領域をコードする遺伝子断
片およびこれを利用したマウス×ネコキメラ抗体に関す
る。

も咄曵責遣 ネコはペットとして昔から人間に愛着のある動物である
が、近年の欧米では、　「伴侶、仲間、相棒としての動
物」（Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ　５ｐｅｃｉｅｓ）と称され
、人間社会の一員としての地位を獲得しつつある。

もう一方では、医学、薬学、畜産学、獣医学から心理学
にいたる実験動物としての貢献度は従来から大きなもの
であったが、近年では医薬品の効果検定や安全性試験に
ｍｌｎｉｍａｌ　ｄｅｓｅａｓｅ　ｃａｔなどの呼称の
もとて更に貢献度が高まっている。いずれの場合にも当
然の事として、これらのネコの疾病、特に伝染病に関す
るより確実な知識がますます必要となり、その診断、治
療、予防のための方法が確立される事が要求されている
。

ネコのウィルス性疾患は多く、なかでもネコ鼻気管炎ウ
ィルス、ネコパルボウイルス、ネコ伝染性腹膜炎ウィル
ス等の疾患は急性で致死率が高い。

予防としてのワクチンは開発されているものの、感染・
発症したネコの治療法としては、抗生物質、サルファ剤
等の二次細菌感染予防の対症療法しかないこと等、現在
の治療法には問題を残している。

従来より治療法として高度免疫血清や血清由来の免疫グ
ロブリンが使用され有効な実績を残してきた。しかし、
現在では、動物置設ＲＭＡの高まりと共に、ネコ血清原
料の入手が困難になりこの治療法は使いたくとも使用で
きない状況になっている。

従って、従来の高度免疫血清に代わって感染ウィルスを
中和できるモノクローナル抗体が出来れば、これらウィ
ルス性疾患の治療に大きく貢献することが可能である。

見東技韮 上記のような高度免疫血清の代替品として、ウィルス中
和活性を有するモノクローナル抗体の使用が考えられる
。モノクローナル抗体作製に関する基本的な技術は、こ
れまでに主としてマウス型モノクローナル抗体において
確立されている。バイブリドーマ等の細胞が産生ずるモ
ノクローナル抗体は大量にしかも半永久に得られ、原料
不足の問題を解消できうる。しかし、ここにおけるモノ
クローナル抗体は、副作用（マウスモノクローナル抗体
をネコに使用した場合、異種タンパクとしてアナフィラ
キシ−ショックや血清病などの副作用を起こすことが考
えられる）をなくす意味から、従来のマウスモノクロー
ナル抗体ではなくネコモノクローナル抗体でなければな
らない。

これらのネコウィルス性疾患の治療薬としてのネコモノ
クローナル抗体の作製法には次のようなものが考えられ
る。（１〉ネコ×ネコハイブリドーマを用いる方法、（
２〉ある種のウィルス及び化学薬剤等でトランスフオー
ムさせたネコリンパ球を用いる方法、（３）ネコ×マウ
スヘテロハイブリドーマを用いる方法、（４）ネコ×マ
ウスへテロハイブリドーマを親株としたネコ×（ネコ×
マウス〉ハイブリドーマを用いる方法、（５）キメラモ
ノクローナル抗体（抗原と結合する可変（Ｖ）領域はウ
ィルス中和活性を有するマウスモノクローナル抗体から
、抗原性あるいは免疫原性及び生理活性に関与する定常
（Ｃ）領域はネコモノクローナル抗体からなる、マウス
（Ｖ）−ネコ（Ｃ）キメラモノクローナル抗体）を遺伝
子組換えで作製する方法、等であるが、これらの方法に
よる成功例は一切報告されていない。

ここで、（１）については融合効率が低いことや適当な
ミエローマ親株がないこと、〈２〉についてはヒトの場
合のＥＢウィルスに相当する適当なウィルスや適当な化
学薬剤がないこと、さらに、（３）（４）の方法ではヒ
ト型モノクローナル抗体作製例から考えて、目的のネコ
型モノクローナル抗体を高効率に得るまでには多くの困
難が予想される〈例えば、安定性の問題等）、従って、
〈５〉のキメラモノクローナル抗体法がより実現性の高
い方法であると考えられる。

このキメラモノクローナル抗体は、可変（Ｖ）領域の原
料となるマウスモノクローナル抗体を産生ずるマウス×
マウスハイブリドーマからクローニングしたその■遺伝
子と、定常＜ｃ＞ｔｉａ域の原料となるネコモノクロー
ナル抗体を産生ずるネコ抗体産生細胞からクローニング
したＣ遺伝子とを結合させたマウス（Ｖ）−ネコ（Ｃ）
キメラ抗体遺伝子を含むプラスミドベクターを、動物細
胞（例えば、マウスミエローマ〉宿主中で発現させ、そ
の培養上清中に得られるものである。ヒトにおいてはす
てにキメラ抗体に関するいくつかの報告が見受けられる
（特開昭６０−１５５１３２号、特開昭６１−４７５０
０号）。

このようにネコキメラ抗体の作製には、目的の抗原と結
合能を持つ抗体分子の可変（Ｖ）領域のアミノ酸配列を
コードする遺伝子とネコ免疫グロブリンの定常（Ｃ）領
域のアミノ酸配列をコードする遺伝子が必要となる。キ
メラ抗体の可変（Ｖ）領域遺伝子は、前述した種々のネ
コウィルス等に対して中和活性を有するマウスモノクロ
ーナル抗体を産生ずる細胞から得られるもので、この細
胞は従来のマウス×マウスハイブリドーマ法で比較的容
易に作製することが出来る。しかしながら、キメラ抗体
の定常領域遺伝子となるネコ免疫グロブリンＣｙｓ−Ｉ
域遺伝子については現在のところ全くその構造が知られ
ておらず、遺伝子もクローニングされていない、従って
、ネコキメラ抗体を作製するためには、ネコ免疫グロブ
リンの定常（Ｃ）領域のアミノ酸配列をコードする遺伝
子を見いだすことが非常に重要な要素となっている。

４呪空且旬 このような状況にあって、本発明者らは、ネコ免疫グロ
ブリンの定常領域のアミノ酸配列をコードしている遺伝
子を単離すべく研究を重ねた結果、これを単離すること
に成功した。すなわち、本発明は、これまでに−切報告
されていないネコ免疫グロブリンγ鎖の定常領域をコー
ドする遺伝子を提供するものであり、とれによりネコキ
メラ抗体の作製を可能にするものである０本発明のネコ
免疫グロブリンγ鎖をコードする遺伝子を用いて作られ
たネコキメラ抗体は、ネコの疾病、特に伝染病に対して
副作用のない診断薬、治療薬・予防薬への応用を可能に
するものである。

免虹ａ遺基盈旦１１ 免疫グロブリンのγ鎖としては、すでにヒト及びマウス
［ＭえばＡ、　Ｓｈｌｍｉｚｕら、Ｃｅ１ｌ、　２９．
　ｐ１２１（１９８２）；　　Ｎ、Ｔａｋａｈａｓｈｌ
ら、　Ｃｅ１ｌ、２９．ｐ６７１　　（１９８２）］で
発見され、さらに、他の動物種のγ鎖では、ラビット［
Ｃ，Ｌ、　Ｍａｒｔｅｎｓら、Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ
、　＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ、　７９．　ｐ６０１ａ　（１９８２）］、ウシ
［、Ｌ、　Ｘｎｌｇｈｔら、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　
１４０．　ｐ３６５４　（１９８８）１等が報告されて
いるが、ネコ免疫グロブリンγ鎖に関する報告はまだな
い。

本発明者らは、ネコ肝臓＃胞の染色体ＤＮＡから、ヒト
免疫グロブリン遺伝子をプローブとして用い、ネコ免疫
グロブリン定常領域をコードすると思われる遺伝子断片
を得ることに成功した。さらに、これをプローブにネコ
抗体産生＃ｌ胞のｃＤＮＡライブラリィから免疫グロブ
リンγ鎖Ｃ領域ｃＤＮＡをクローニングした。クローニ
ングされた遺伝子断片の塩基配列から予測されるアミノ
酸配列と、他の動物種の免疫グロブリンのＣ領域遺伝子
の配列とを比較し遺伝子解析を行った結果、本発明によ
り得られた遺伝子断片は、γ鎖に属する免疫グロブリン
定常領域をコードする遺伝子断片であることが判明した
。

得られたネコ免疫グロブリンγ鎖定常領域をコードする
ＤＮＡＷｉ片の塩基配列を解析し、該定常領域のアミノ
酸配列を見いだし、これをこれまでに報告されているヒ
ト、マウス、ウサギ等の免疫グロブリンγ鎖定常領域の
アミノ酸配列と比較検討したところ、ネコ免疫グロブリ
ンγ鎖定常領域に特異的なアミノ酸配列として、該γ鎖
定常領域のＣｙｓ−１１ドメインのＮ末端側から最初の
システィンの近傍のアミノ酸配列が下記（Ａ）のアミノ
酸配列であることが見いだされた。

（＾）　　−８ｅｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−本発明
者らは、本発明により解析されたネコの免疫グロブリン
γ鎖定常領域のアミノ酸配列、およびこれまでに解析さ
れている種々の動物の免疫グロブリンγ鎖定常領域のア
ミノ酸配列を比較することにより、上記のシスティンの
近傍に存在する一Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−の
領域は、ネコ、マウス、ヒト等の種の違いによっていず
れも異なるアミノ酸配列となっている領域であることを
見いだした。

また、同時にこの領域は、例えばヒトのγ鎖定常領域の
アミノ酸配列としては、サブクラス間で極めてよく保存
されていることも見いだし、今回本発明により明らかに
された上記の配列は、ネコ免疫グロブリンγ鎖定常領域
特有の配列であると推測された。

また、Ｃｙｓ−目ドメインのＣ末端側のシスティンの近
傍（下記アミノ酸配列（Ｂ））　、ＣＨ２ドメインの糖
鎖結合部位（Ａｓｎ）のＮ末端側（下記アミノ酸配列（
Ｃ））、ＣＩ＋３ドメインのＮ末端側のシスティンの近
傍（下記アミノ酸配列（Ｄ））にも、同様なネコ免疫グ
ロブリンγ鎖定常領域特有の配列を見いだした。

（Ｂ）−＾ｒｇ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔ
ｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−（Ｃ）−Ｌｙｓ−Ｔｈ
ｒ−８ｅｒ−Ｐｒｏ−ＸＸＸ−ＸＸＸ−ＸＸＸ−ＸＸＸ
−ＸＸＸ−Ａｓｎ（Ｄ）　−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−ＸＸＸ−
ＸＸＸ−ＸＸＸ−ＸＸＸ−Ｃｙｓ−（ＸＸＸは任意のア
ミノ酸〉 尚、本発明においてクローニングされたこの領域のアミ
ノ酸配列は下記の通りであり、このアミノ酸配列がネコ
免疫グロブリンγ鎖定常領域に存在する特有のアミノ酸
配列（Ｂ）、（Ｃ）および（Ｄ）の好ましい一例として
挙げられる。

（Ｂ）−＾ｒｇ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−８ｅｒ−Ａｓｐ−Ｔ
ｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−（Ｃ）−Ｌｙｓ−Ｔｈ
ｒ−８ｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｇｌ　ｕ−Ｇｌ
　ｎ−Ｐｈｅ−＾５ｎ−（Ｄ）−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｖａ
ｌ−８ｅｒ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｃｙ！１本発明のネコ免
疫グロブリンγ鎖定常領域をコードする遺伝子断片にお
いても、上記（＾）、　（Ｂ）、　（Ｃ）または（Ｄ）
のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列をその一部に有
することを特徴とする４　このような上記のγ鎖に含ま
れるアミノ酸配列は、ネコ免疫グロブリンγ鎖のＣ領域
を決定する重要なアミノ酸配列と考えられ、本発明によ
り初めて明らかにされた。

これらのアミノ酸配列を含んだネコ免疫グロブリンγ鎖
定常の好ましい一例を示すと、下記に示すアミノ酸配列
が挙げられる． ＴｈｒＴｈｒＡｌａＰｒｏＳｅｒＶａｌＰｈｅＰｒｏＬ
ｅｕＡｌａＰｒｏＳｅｒＣｙｓＧ１ｙＴｈｒＴｈｒＳｅ
ｒＧＩｙＡｌｉＴｈｒＶａｌＡｌａＬｅｕＡｌｉＣｙｓ
ＬｅｕＶａｌＬｅｕＧＩｙＴｙｒＰｈｅＰｒｏＧＩｕＰ
ｒｏＶａｌＴｈｒＶａｌＳｅｒＴｒｐＡｓｎＳｅｒＧＩ
ｙ＾１ａＬｅｕＴｈｒＳｅｒＧｌｙＶａｌ旧ｓＴｈｒＰ
ｈｅＰｒｏＡｌａＶａｌＬｅｕＧＩｎ＾１ａＳｅｒＧｌ
ｙＬｅｕＴｙｒＳｅｒＬｅｕＳｅｒＳｅｒＭｅｔＶａｌ
ＴｈｒＶａｌＰｒｏＳｅｒｖｅｒ＾ｒｇＴｒｐＬｅｕＳ
ｅｒＡｓｐＴｈｒＰｈｅＴｈｒＣｙｓＡｓｎＶａｌＡｌ
ａＩｔ　ＩｓＰｒｏＰｒｏＳｅｒＡｓ　ｎＴｈｒＬｙｓ
ＶａｌＡｓｐＬｙｓＴｈｒＶａ　ｌＡｒｇＬｙｓＴｈｒ
＾ｓｐＨ　ＩｓＰｒｏＰｒｏ（ｉ　ＩｙＰｒｏＬｙｓＰ
ｒｏＣｙｓＡｓｐＣｙｓＰｒｏＬｙｓＣｙｓＰｒｏＰｒ
ｏＰｒｏ（ｉｌｕＭｅｔＬｅｕＧＩｙＧ１ｙＰｒｏＳｅ
ｒｌｌｅＰｈｅｌｌｅＰｈｅＰｒｏＰｒｏＬｙｓＰｒｏ
ＬｙｓＡｓｐＴｈｒＬｅｕＳｅｒｌｌｅＳｅｒＡｒｇＴ
ｈｒＰｒｏＧＩｕＶａｌＴｈｒＣｙｓＬｅｕＶａｌＶａ
ｌ＾ｓｐＬｅｕＧｌｙＰｒｏ＾ｓｐＡｓｐＳｅｒＡｓｐ
ＶａｌＧＩｎｌｌｅＴｈｒＴｒｐＰｈｅＶａｌＡｓｐＡ
ｓｎＴｈｒ（ｉｌｎＶａｌＴｙｒＴｈｒＡｌａＬｙｓＴ
ｈｒＳｅｒＰｒｏ＾ｒｇＧｌｕＧ１ｕＧｌｎＰｈｅＡｓ
ｎＳｅｒＴｈｒＴｙｒＡｒｇＶａｌ　Ｖａ　ＩＳｅ　ｒ
Ｖａ　ＩＬｅ　ｕＰｒｏ　Ｉ　１　ｅＬｅ　ｕｌｌ　ｉ
ｓＧ　ｌ　ｎＡｓｐＴｒｐＬｅｕＬｙｓＧｌｙＬｙｓＧ
ＩｕＰｈｅＬｙｓＣｙｓＬｙｓＶａｌＡｓｎＳｅｒＬｙ
ｓＳｅｒＬｅｕＰｒｏＳｅｒＰｒｏｌｌｅＧＩｕＡｒｇ
ＴｈｒｌｌｅＳｅｒＬｙｓＡｌａＬｙｓＧＩｙＧｌｎＰ
ｒＯ旧ｓＧｌｕＰｒｏＧＩｎＶａｌＴｙｒＶａｌＬｅｕ
ＰｒｏＰｒｏＡｌａＱｌ１１ＱｌｇＱｌｕＬｅｕＳｅｒ
＾ｒｇ＾ｓｎＬｙｓｖａｌＳｅｒＶａｌＴｈｒＣｙｓＬ
ｅｕ１１ｅＬｙｓＳｅｒＰｈｅＨｌｓＰｒｏＰｒｏＡｓ
ｐｌｌｅＡｌａＶａｌＧＩｕＴｒｐＧ１ｕ１１ｅＴｈｒ
ＧＩｙＧｌｎＰｒｏＧ１ｕＰｒｏＧｌｕＡｓｎＡｓｎＴ
ｙｒＡｒｇＴｈｒＴｈｒＰｒｏＰｒｏＧＩｎＬｅｕＡｓ
ｐＳｅｒ＾ｓｐＧＩｙＴｈｒＴｙｒＰｈｅＶｉｌＴｙｒ
ＳｅｒＬｙｓＬｅｕＳｅｒＶａｌＡｓｐＡｒｇＳｅｒ旧
ｓＴｒｐＧ１ｎＡｒｇＧＩＹ＾ｓｎＴｈｒＴｙｒＴｈｒ
ＣｙｓＳｅｒＶａｌＳｅｒ旧ｓＧＩｕＡｌａＬｅｕＨｉ
ｓＳｅｒ旧ｓＨｉｓＴｈｒＧｌｎＬｙｓｓｅｒＬｅｕＴ
ｈｒ（ＩｌｎｓｅｒＰｒｏＧｌｙＬｙｓこのようなアミ
ノ酸配列もしくはこれをコードする核酸塩基配列につい
ては一切その報告例はなく、本発明により初めて開示さ
れるものである．また、本発明のネコ免疫グロプリンγ
鎮のＣ領域をコードする遺伝子の具体的核酸堪基配列の
一例としては、第６図に示された塩基配列が挙げられる
． また、本発明のγ鎖遺伝子を用いてネコ染色体ＤＮＡと
サザンハイブリダイゼーションを行った結果、本発明の
γ鎖以外に、同じネコγ鎖に属している他のサブクラス
のＣ領鳩遺伝子がいくつか存在していることが示された
．ヒトとマウスの例［例えば、＾．　　Ｓｈｌｍｉｚｕ
ら、　Ｃｅｌｌ，　　２９，　　ｐｌ２１　　（１９８
２）；　　Ｎ．　　Ｔａｋａｈａｓｈｌら、Ｃｅｌｌ，
　２９．　ｐ６７１　（１９８２）］からも、ネコγ鎖
にもいくつかのサブクラスが存在すると思われる．また
、ネコγ鎖には血清学的に少なくとも２つのサブクラス
があることが知られており［Ｊ．Ｍｉｃｈａｅｌ　　Ｋ
ｅｈｏｅら、　Ｊ．　　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｖｏｌ
．１０９，Ｎｏｊ，ｐ５１１−５１６　（１９７２）］
、本発明の遺伝子はこれら２つのサブクラスの内のいず
れかをコードしていると思われる．従って、本発明の遺
伝子を用いて残りのサブクラスのＣ領域遺伝子をクロー
ニングすることが可能である． 尚，同一のサブクラス内においても１ケ所から数カ所の
アミノ酸が置換されているアロタイプの異なる遺伝子が
存在することがヒト、ラビット等の免疫グロブリンγ鎖
の遺伝子解析の結果からも予想される．本発明のネコ免
疫グロブリンγ鎖定常領域をコードする遺伝子断片は、
上記のアミノ酸配列をコードする遺伝子断片のみに限ら
れず、このような部分的にアミノ酸が置換されているア
ロタイプの異なる遺伝子をも包含する．キメラ抗体の作
製方法はすでにマウスーヒトキメラ抗体で示された方法
［渡辺ら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，　４７，
　ｐ９９９−１００５　（１９８７）］に準じて行うこ
とが出来る．すなわち、キメラ抗体遺伝子は、基本的に
Ｖ領域遺伝子とＣ領域遺伝子の２種類の遺伝子断片を結
合させることにより構築される．さらに、遺伝子の単離
法に応じて、主として２つの結合の組合せがある．すな
わち、染色体ＤＮＡから単離したＶとＣ領域遺伝子、ｃ
ＤＮＡから単離したＶとＣ領域遺伝子の組合せである． 例えば、マウス染色体ＤＮＡから単離したＶ領域遺伝子
を、ネコ染色体ＤＮＡから単離したＣ領域遺伝子と結合
させた場合、マウスＶ領域遺伝子には発現に必要なプロ
モーターやエンハンサー等の発現調節領域を含んでいる
ことが好ましい．ただし、プロモーターやエンハンサー
等はマウス由来である必要はなく、ネコ由来でもヒト由
来でもウイルス由来でも差しつかえない．また、プロモ
ーターはＶ領域の５゛上流域に位置し、エンハンサーは
Ｖ領域遺伝子とＣｆＲ域遺伝子の間に位置するのが好ま
しいが、エンハンサーについては必ずしもこの位置に限
定されるものではない．一方、マウスｃＤＮＡから単離
した■領域遺伝子を、ネコｃＤＮＡがら単離したＣ領域
遺伝子と結合させる場合、その結合部分は適当な制限酵
素サイトや、必要であれば適当な合成リンカ−を用いて
、■領域遺伝子のコードしているアミノ酸配列とＣ領域
遺伝子のコードしているアミノ酸配列がずれないよう、
またＶ領域アミノ酸配列とＣ領域アミノ酸配列が変化し
ないよう結合しなければならない、さらに、動物細胞中
で発現を可能にするための適当なプロモーターやエンハ
ンサ−等の発現調節領域を遺伝子の５°上流域に付加し
てやる必要がある。このようにして作製したキメラ抗体
遺伝子を、例えば、ｐｓＶ２−ｇｐｔ［Ｒ，Ｃ，Ｍｕｌ
ｌｉｇａｎら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　
Ｓｃ１．　ＵＳＡ、　７８．ｐ２０２７　（１９８１）
］、ｐｓＶ２−ｎｅｏ　　［Ｐ、　　Ｊ、　　５ｏｕｔ
ｈｅｒｎら、　Ｊ、　　Ｍｏ１．　　＾ｐｐｌ。

Ｇｅｎｅｔ、　、　１．　ｐ３２７　（１９８２）　１
等の選択マーカーの付いた適当なベクタープラスミドに
、あるいは、宿主細胞内でプラスミド状態で増殖できる
ウィルス遺伝子の一部（パピローマウィルスなど）を持
ったベクタープラスミドに、Ｈ鎖遺伝子とＬ鎖遺伝子を
別々に、あるいは同時に組み込み、キメラ抗体遺伝子プ
ラスミドを構築することが望ましい、尚、キメラ抗体り
鎖遺伝子の調製および発現方法に関しては、先に本出願
人により出願されており（特願平１−２５５４２４号）
、これに詳細に記載されている。

マウス−ネコキメラ抗体を得るためには、このようにし
て調製されたキメラ抗体遺伝子を含むプラスミドを用い
て宿主動物細胞を形質転換することが必要である。該宿
主動物細胞としては、不死化されたマウス及び他の動物
細胞、好ましくはＢリンパ系細胞株［例えばＰ３Ｘ６３
Ａｇ８・６５３　（ＡＴＣＣＣＲＬ　１５８０）、Ｐ３
Ｘ６３Ａｇ８Ｕ−１（ＡＴＣＣＣＲＬ　１５９７）、Ｐ
３／ＭＳＩ／Ｉ　Ａｇ４−１（ＡＴＣＣＣＲＬ１８）、
Ｓｐ２１０−Ａｇ１２　（ＡＴＣＣＣＲＬ　１５８１）
等の形質細胞腫、ハイブリドーマ］である。　　ＤＮＡ
による細胞の形質転換方法としては、ＤＥＡＥ−デキス
トラン法、燐酸カルシウム共沈降法、プロドブロスト融
合法、エレクトロボレーシラン法等の方法［例えば、Ｂ
、Ｄ、　Ｆｌａｍｅｓら編集＋Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉ
ｏｎ　ａｎｄ　Ｔｒａｎｓｌａｔｌｏｎ″ＩＲＬ　Ｐｒ
ｅｓｓ　（１９８４）Ｉ＞照］があり、いずれの方法で
もよい、Ｈ鎖とＬ鎖のキメラ抗体遺伝子を同時に持つプ
ラスミドで形質転換を行う場合には選択マーカーは１種
類でよいが、Ｈ頷り鎖別々の場合には２種類のマーカー
が必要である。この場合には、１つのプラスミドで形質
転換を行った後に、さらにもう一方のプラスミドで形質
転換を行う二重形質転換法を用いるのが好ましい、この
ようにして形質転換された細胞を通常のハイブリドーマ
と同じ適当な条件下（例えば、１０％牛脂児血清を含む
ＲＰＭ　ｌ１６４０培地中）で培養すれば、この細胞か
ら通常のハイブリドーマの産生ずる抗体と同様にマウス
ーネコキメラ抗体が分泌産生される。このキメラ抗体は
通常の抗体と同様な方法により精製することが出来る。

本発明により提供されるネコ免疫グロブリンをコードす
る遺伝子断片は、ネコ免疫グロブリンγ鎖のＣ＠域の特
異的アミノ酸配列もしくはＤＮＡ配列を開示するもので
あり、この遺伝子を用いて、上述のようにして得られる
マウス−ネコキメラ抗体は、ネコの疾病に対して、これ
までになかった実質的に有効な診断、予防及び治療剤と
なりうるちのである。

次に、その実施例を示すが本発明はこれに限定されるも
のではない。

ネコγ鎖遺伝子をクロスハイブリダイゼーション法によ
りクローニングするために、ヒトγ鎖とのクロスハイブ
リダイゼーションの条件を検討した。ここで使用したヒ
トＣγ領域を含んだ遺伝子は、ヒト培ｇＩ！細胞ＡＲＨ
７７株［ＡＴＣＣＣＲＬ　１６２１１よりクローニング
されたものであり、大川大学・生体防御医学研究所・渡
邊武教授より分与されたものである〔工藤ら、Ｇｅｎｅ
、　３３．　ｐ１８１　（１９８５）；内材ら、Ｃａｎ
ｃｅｒ　Ｒｅｓ、、　４７．　ｐ９９９　（１９８７）
１Ｂ照］、コンピュータを用いてマウス、ヒト、ラビッ
トγ鎖間でボモロジー解析をした結果、特にＣＨ２−Ｃ
ｌ＋３エクソンを含む領域が非常にホモロジーが高いこ
とが示された。従って、このヒトＣγ遺伝子より、ＣＨ
２−ＣＨ３エクソンを含むＢａ鵬旧−Ｈｐａｌ断片を切
り出し、プローブとして使用した。

ネコ肝臓細胞より、Ｎ、　Ｂ１Ｉｎとり、　Ｗ、　５ｔ
ａｆｆｏｒｄの方法［Ｎｕｃ、　Ａｃ１ｄｓ、　Ｒｅｓ
、、　３．　ｐ２３０３　（１９７６）］に従って染色
体ＤＮＡを単離し、各染色体ｌｌＮＡｌ０μ９を制限酵
素Ｂａ５ａｌ（宝酒造製：以下本実施例で使用した試薬
は、特に断りのない限り宝酒造あるいは東洋紡製を使用
した）で切断する。制限酵素切断ＤＮＡを電気泳動で０
．７％アガロースゲルに展開し、ニトロセルロースメン
ブレンフィルター（Ｓ＆Ｓ：Ｂ＾８５）に転写後、ヒト
Ｃγ領域を含んだ［＊２ｐｌ標１１１ＤＮＡ７０−ブと
サザンハイプリダイゼーションを行った。サザンハイプ
リダイゼーションの条件は、６ｘＳＳＣ［０，０９Ｍ　
ＷａｓＣｅＨｓＯｙ・２Ｈ２０，０，９Ｍ　ＮａＣｌ］
、　　１０ｓ＋＋４　ＥＤＴＡ［同位化学］、０．５％
ＳＤＳ［バイオ・ラット］の溶液中で６５℃−晩行った
。フィルターの最終的な洗浄条件は、０．１ｘＳＳＣｙ
ｓ−０，１％ＳＤＳの溶液中で４５℃、１５分間行った
。このフィルターをオートラジオグラフィーにかけた結
果は、第１図に示すように約５．８ｋｂと５．５ｋｂの
２本のバンドを形成した０分子のサイズはλファージＤ
Ｉｌ＾をＨｉｎｄｍで切断したマーカーＤＮＡによって
算出した。

この２本のバンドをクローニングするターゲットとした
。

ネコ肝臓の染色体ＤＤＮＡ１００１ｔをＢａｌｌＨＩで
完全消化した後、この５．８と５．５ｋｂに相当するＤ
ＮＡ断片をしょ糖密度勾配遠心［ショ糖１０〜４０％（
ｗｔ／ｖｏｌ）、２６０００「−１１８時間、１５℃］
により調製した０次にこのＤＮＡ断片とＣｈａｒｏｍｌ
ｄ　９−４２ベクターＤＮＡ　にツポンジーン社製）の
ＢａｍＨＩ切断ＤＮＡとをＴ４ＤＮ＾リガーゼにより連
結させ、ストラタージン社のキットを用いて、Ｉｎ　ｖ
ｉｔｒｏパッケージングを行い、Ｌｌ！３９２大腸菌（
ストラタージン）に感染させ１、ネコ肝臓細胞のγ鎖遺
伝子ライブラリィを得た。このライブラリィから、ヒト
Ｃγプローブを用いて前述のクロスハイブリダイゼーシ
ョンと同じ条件でコロニーハイブリダイゼーション（最
新：遺伝子操作実験実用ハンドブックｐ４２６）を行い
、ネコＣγ鎖エクソンを含むクローンＣＢ２５γ７ｃを
選択した。このクローンのサイズは約５．８ｋｂで、先
にサザンプロット分析に示した２本のバンドのうちの１
本である。その制限酵素切断点地図を第２図に示す、こ
のプラスミドクローンを常法［例えば、　　Ｔ、　Ｍａ
ｎｉａｔｌｓ″Ｎｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｌｎｇ″
Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ、　（
１９８２）参照］に従って大量に調製し、Ｂａ■ＩＩ挿
入断片を単離した。

さらに使い易くするためＳａｃ　１で切断した後、Ｃγ
エクソンが含まれていると思われる約１．３ｋｂのＤＮ
Ａ断片（Ｓａｃｌ断片〉を単離し、ｐＵｃ１８ベクター
のＳａｃ　１サイトに再クローニングした。

ＣＢ　　　ｃ　　　いｆ−”　　　ノー　゛　ロ止逝 初めにこのＣＢ２５γ７ｃを用いたサザンプロット分析
を行った。ネコ肝臓細胞の染色体ＤＮＡ１０ｕｇを制限
酵素ＥｃｏＲＩで切断し、このＤＮＡを電気泳動で０．
７％アガロースゲルに展開し、ナイロンメンブレンフィ
ルター（シーンスクリーンプラス、ＭＥＮ・リサーチ・
プロダクト）に転写後、ネコＣγ鎖領域を含んだＥ″２
ｐ］標議ＣＢ２５γ７ｃプローブとサザンハイプリダイ
ゼーションを行った。サザンハイブリダイゼーションの
方法はシーンスクリーンプラスに付属していたマニュア
ルのプロトコールに従った。検出されたバンドのパター
ンを、以前行ったヒトＣγ鎖プローブを用いたクロスハ
イブリダイゼーションのパターンと比較した結果、全く
同じ位置く約５．８と５．５ｋｂ）にバンドがみとめら
れた（第１図と同じ結果）０分子サイズはλファージＤ
ＮＡを旧ｎｄｌｌｌで切断したマーカーＤＮＡによって
算出した。この結果より、このＣＢ２５γ７ｃ以外に同
じネコγ鎖に属している他のサブクラスのＣγ領域遺伝
子がいくつか存在していることが示された。上述したご
とく、ネコγ鎖にも２つのサブクラスが存在することが
報告されており、このＣＢ２５γ７ｃ遺伝子はこれら２
つのサブクラスの内のいずれかをコードしていると思わ
れた。

次にノーザンプロット分析を行った。ハイブリダイゼー
ションに使用したＲＮＡはネコ牌ｍａ胞と本発明者らが
確立したネコ×マウスヘテロハイブリドーマＦＭ−ＴＩ
ＪＩ胞（微工研薗寄第１００７７号として本出願人より
寄託されている〉から全ＲＮＡをグアニジウムチオシア
ネート法［Ｊ、　Ｍ、　Ｇｈｉｎｇｗｉｎら、Ｂｉｏｃ
ｈｅｍＩｓｔｒｙ、　１８．　ｐ５２９４　（１９７９
）］により分踵し、さらにオリゴｄＴカラム（ファルマ
シア〉を用いてポリＡ＋ＲＮ＾に精製したものである。

このＲＮＡ２ｔｔｇを電気泳動により３％ホルムアルデ
ヒドを含む０．７５％アガロースゲルに展開し、ナイロ
ンメンブレンフィルター（シーンスクリーンプラス）に
転写後、［５２ｐｌ標識ＣＢ２５γ７Ｃプローブとノー
ザンハイブリダイゼーシランを行った。ノーインハイブ
リダイゼーションの方法はシーンスクリーンプラスに付
属のマニュアルの１０トコールに従った。このプローブ
により両方の細胞のＲＮＡにおいて約１．８ｋｂの位置
にバンドが検出された〈第３図〉、このサイズはマウス
及びヒトで知られている免疫グロブリンγ鎖遺伝子のサ
イズとほぼ同じである。

これら２つの結果より、このＣＢ２５γ７Ｃは機能的な
ネコＣγ領域を含む活性な遺伝子であると判断された。

尚、このＣＢ２５γ７Ｃが組み込まれたプラスミドを有
する大腸菌が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｔ　Ｃ
ＣＧ−ＣＢ２５Ｇ［微工研薗寄第１１１６６号］として
出願人により寄託されている。

ｃＤＮＡ　ローゝ ネコＣγ領域は、マウス及びヒトの例からエクソン・イ
ントロン構造をとっていることが予想される。ネコＣγ
領域のエクソン部分の核酸塩基配列を知るためには、ス
プライシングの終わったネコ免疫グロブリンγ鎖鵬ＲＮ
Ａから作られたｃＩＩＮ＾をクローニングすることが必
要である。上述のように、ネコ×マウスヘテロハイブリ
ドーマＦＭ−Ｔ１ｍ胞は、ＣＢ２５γ７ｃとハイブリダ
イゼーションする鵬ＲＮ＾を合成している。そこで、Ｆ
Ｍ−Ｔ１＃Ｂ胞よりｃＤＮＡライブラリィを構築し、Ｃ
Ｂ２５γ７ｃをプローブにネコγ鎖ｃＤＮＡのクローニ
ングを試みた。

ＦＭ−ＴＩ細胞より抽出精製したポリＡ＋ＲＮＡからｃ
ＤＮ＾合成システムプラス（アマジャム〉を用いてＦｌ
ｌ−ＴＩ細胞のｃ　ＤＮＡを合成した０合成したｃＤＮ
ＡのＥｅｏＲＩサイトをＥｃｏＲＩメチレースを用いて
メチル化した後、Ｔ４ＤＮ＾リガーゼを用いてＥｃｏＲ
Ｉリンカ−を付加した。

さらにこのｃＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで完全消化し
、バイオゲルＡ−５０−カラム（バイオ・ラッド）を用
いてＥｃｏＲＩリンカ−の付加したｃＤＮＡを精製した
０次にこのｃＤＮＡとλｇｔｌｌベクターＤＮＡ（スト
ラタジーン社）のＥｃｏＲＴアームとをＴ４ＤＮ＾リガ
ーゼにより連結させ、ストラタジーン社のキットを用い
て、ｉｎ　ｖｌｔｒｏパッケージングを行い、ＦＭ−Ｔ
Ｉ細胞のｃＤＮ＾ライブラリィを得た。

このライブラリィから、ＢｅｎｔｏｎとＤａｖｉｓのプ
ラークハイブリダイゼーション法［％、　Ｄ、　Ｂｅｎ
ｔｏｎ、Ｒ。

Ｗ、　Ｄａｖｉｓ、　５ｃｉｅｎｃｅ、　１９６．　ｐ
１８０　（１９７７）参照］により、ＣＢ２５γ７Ｃプ
ローブによりネコ免疫グロブリンＣγ鎖を含むクローン
ＴＩＣＢを選択した。このクローンのサイズは！、　３
ｋｂでその制限酵素切断点地図は第４図に示す、このク
ローンのＥｃｏＲＩ挿入断片をＴｈｏｓａｓとＤａｖｉ
ｓの方法［Ｍ、　Ｔｈｏｍａｓ、　Ｒ，Ｗ、　Ｄａｖｉ
ｓ、　ＪＭｏｌ、　Ｂｌｏｌ、、　９１．　ｐ３１５　
（１９７４）ＩＩ照］によりファージＤＮＡより単離し
、ｐＵｃ１８のＥｃｏＲ１サイトに再りロニングした。

Ｃ ネコＣγ領域の核酸塩基配列を調べるために、クローン
ＴＩＣＢから、Ｐｓｔｌ−Ｐｓｔｌ、　Ｐｓｔｌ−Ｒｓ
ａｌ、　Ｐｓｔｌ−旧ｎｄｆｌｌ　、　Ｓａｃ　ｌ−９
ｅａｌ、　ＥｃｏＲＩ−３ａｃｌ、旧ｎｄｍ−ＥｃｏＲ
Ｉの各小ＤＭＡ断片を調製した。これらの各小断片を７
４−ＤＮＡポリメレースを用いて切断面を平滑末端に変
えた後、Ｍ１３ｍｐ１９ベクターのＳｍａ　夏サイトに
宝ライゲーションキットを用いて挿入した。東洋紡イン
ストラクトマニュアルの方法に従い、ＪＭＩＯＩのコン
ピテント細胞を調製し、Ｃγ領域遺伝子を挿入したＭ１
３ｓｐ１９ＤＮＡで形質転換させ、−本鎖ＤＮＡを抽出
精製した。

さらにこの−本鎖ＤＮＡの核酸塩基配列決定は、タカラ
旧３シークエンシングキットと富士・ジエンサー・ゲル
・システムを用いて行った。核酸塩基配列行った方向は
第４図に示す、核酸塩基配列決定の結果、ＶＤＪＣから
なるネコγ遺伝子が確認された。

第５図にその結果を示す、さらに、この核酸塩基配列を
基にアミノ酸に変換したところ、この遺伝子がオープン
リーディングフレームをとり、疑似遺伝子でないことが
示されたく第６図参照）。

このＴＩＣＨの核酸塩基配列を基に遺伝子解析ソフト（
Ｇｅｎｅｔｙｘ：ソフトウェア開発社製〉を用いて、Ｌ
ＡＳＬとＥＭＢＬのデータベースをホモロジー検索した
ところ、ヒト及びマウスの免疫グロブリンγ鎖と高いホ
モロジーを示し、免疫グロブリンγ鎖遺伝子以外の遺伝
子とはホモロジーは示さなかった。ＴＩＣＢ遺伝子のＣ
γ領域とマウス及びヒトのＣγ領域をホモロジー比較す
ると、核酸レベルでマウスγｌとは７０．２％、ヒトＧ
ｌとは７６．８％であり、アミノ酸レベルでマウスγ１
とは６１，０％、ヒトＧ１とは６９．７％であった。

以上の結果より、ＣＢ２５γ７ｃとＴＩＣＢ遺伝子は間
違いなくネコγ鎖に属する遺伝子であり、マウス−ネコ
キメラ抗体の作製を可能にする遺伝子であると思われた
。

抗ＣＰｖ抗体産生ハイブリドーマＪＰ２　（γ１．に）
より染色体ＤＮＡを単離し、染色体Ｄ　Ｎ　Ａ　１００
μｇを制ａＳ素旧ｎｄｍで切断するくイヌバルボウイル
スを中和するモノクローナル抗体は、ネコパルボウイル
スをも中和できることが知られている）０次にこのＤＮ
Ａ断片とλＬ４７ベクターＤＮＡ　（ストラタジーン）
をＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結させ、ＪＰＺ＃ｌ胞の
染色＃ＩＩＮＡライブラリィを得た。このライブラリィ
から、プラークハイブリダイゼーション法［Ｗ、　Ｄ、
　Ｂｅｎｔｏｎ＋Ｒ，Ｗ、　Ｄａｖｉｓ、　　５ｃｉｅ
ｎｃｅ。

１９６、　ｐ１８０　（１９７７）参照］によりマウス
Ｊ　Ｈプローブを用いて抗ＣＰｖ抗体のＶＨ領域遺伝子
を含むクローンＪＰ２ｇＨ２１１を選択した。第７図は
その制限酵素切断点地図である。この遺伝子断片よりＶ
Ｈエクソン部分を含んだＦｉｃｏＲＩ−３ａｃ　Ｉ断片
を調製し、以下のネコーマウスキメラ抗体Ｈ＃遺伝子の
材料とした。尚、この抗イヌバルボウイルス活性を有す
るマウス免疫グロブリンＨ鎖のＶ領域遺伝子が組み込ま
れたプラスミドを有する大腸菌が、　Ｅｓｃｈｅｒｌｃ
ｈｉａ　ｃｏｌｉ間ＶＨ−ＪＰ２　［微工研薗寄第１１
１６７号］として出願人により寄託されている。尚、同
じＪＰ２細胞から、マウスＪにプローブを用いてクロー
ニングした抗イヌパルボウイルスマウス免疫グロブリン
ＬＨのＶ領域遺伝子は、Ｅｓｃｈｅｒｌｃｈｌａ　ｃｏ
ｌｉ　ＭＶＫ−ＪＰ２［微工件菌寄第１１１６５号］と
して出願人により寄託されている。

（４）で得られたプラスミドｐＣＢ２５γ７ＣをＢａ園
旧で切断し、ネコ免疫グロブリンＣγ鎖遺伝子を含む５
．８ｋｂのＢａｇ旧断片を調製した。この遺伝子をＢａ
ｍ１ｌｌで切断したｐｓＶ２−ｇＰｔベクターともに宝
ライゲーションキットを用いて連結し、プラスミドｐＳ
Ｖ２−ＣＣγを得た０次に、（５）で得られたｐＪＰ２
ｇＨ２１１のＥｃｏＲＩ−５ａｃ１断片の両端を７４−
ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑末端に変え、宝ライゲ
ーションキットを用いて前述のプラスミドＰＳＶ２−Ｃ
ＣγのＨｐａ　ｌサイトに挿入しプラスミドｐｓＶ２−
ＰＨＣＣγを作製した。（第８図参照）

【図面の簡単な説明】

第１図は、ネコ肝１ｉｕａ胞の染色体ＤＮＡを制限酵素
Ｂａ鵬旧で切断し、これをヒトＣγ鎖領域を含んだ［３
２Ｐ］標識プローブとサインハイブリダイゼーションを
行った結果の模式図である。 第２図は、本発明においてクローニングされたネコ免疫
グロブリンγ鎖定常領域をコードする染色体ＤＮＡ断片
（ＣＢ２５γ７ｃ）の制限酵素切断地図を示す。 第３図は、ネコ牌臓細胞（レーンｌ〉及びネコ抗体産生
ヘテロハイブリドーマＦＭ−Ｔｌ　（レーン２〉カラ抽
ｆｆｉ　Ｌ　タホ’）　Ａ＋　ＲＮＡト［”Ｐ］ｌ１ｌ
ＩＣＢ２５７７Ｃ７”ロープとのノーインハイブリダイ
ゼーションの模式図である。 第４図は、本発明でクローニングされたｃＤＮＡ断片Ｔ
ｌＣＢ１１ｔの制限酵素切断地図および塩基配列解析を
行った領域（→）を示す。 第５図は、本発明でクローニングされたｃＤＮＡ断片Ｔ
ＩＣＢ１ａに存在するネコ免疫グロブリンγ鎖定常領域
をコードするＤＮＡ塩基配列を示す。 第６図は、本発明でクローニングされたＣＤＮＡ断片Ｔ
ｌＣＢ１１Ｌ中にコードされるネコ免疫グロブリンγ鎖
定常領域の全アミノ酸配列を示す、下線のアミノ酸配列
は、発明の詳細な説明で述べたネコ免疫グロブリンγ鎖
定常領域に特有のアミノ酸配列（＾〉〜（Ｄ）の領域を
示す。 第７図は、実施例（５〉で調製した抗ｃｐｖ抗体の■Ｈ
領域遺伝子を含むクローンＪＰ２ｇＨ２１１の制限酵素
切断点地図を示す。 第８図は、実施例（６）で構築した抗ＣＰＶマウス×ネ
コキメラ抗体Ｈ鎖を発現する遺伝子（ＰＳＶ２−ＰＨＣ
Ｃγ）の構築図を示す。 第１図 第３図 第２図 第５図 第６図 ＣＣＡＣＣＡＣＧＧＣＣＣＣＡＴＣＧＧＴＧ　ＴＴＣＣ
ＣＡＣＴＧＧ　ＣＣＣＣＣＡＧＣＴＧ　ＣＧＧＧＡＣＣ
ＡＣ＾ＴＣＴＧＧＣＧＣ（：Ａ　ＣＣＧＴＧＧＣＣＣＴ
　ＧＧＣＣＴＧＣＣＴＧ　ＧＴＧＴＴＡＧＧＣＴ　ＡＣ
ＴＴＣＣＣＴＧＡＧＣＣＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＴＣＣＴ
ＧＧＡ　ＡＣＴＣＣＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧ
ＧＴＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＧＧＣＣＧＴＣＣＴ
ＧＣＡＧ　ＧＣＣＴＣＧＧＧＧＣＴＧＴＡＣＴＣＴＣＴ
　ＣＡＧＣＡＧＣＡＴＧＧＴＧＡＣＡＧＴＧＣＣＣＴＣ
ＣＡＧＣＡＧ　ＧＴＧＧＣＴＣＡＧＴ　ＧＡＣＡＣＣＴ
ＴＣＡ　ＣＣＴＧＣＡＡＣＧＴＧＧＣＣＣＡＣＣＣＧ　
Ｃ（：ＣＡＧＣＡＡＣＡ　ＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡ　ＣＡ
ＡＧＡＣＣＧＴＧ　ＣＧＣＡＡＡＡＣＡＧ＾ＣＣＡＣＣ
ＣＡＣＣＧＧＧＡＣＣＣＡＡＡ　ＣＣＣＴＧＣＧＡＣＴ
　ＧＴＣＣＣＡＡＡＴＧ　ＣＣＣＡＣＣＣＣＣＴＧＡＧ
ＡＴＧＣＴＴＧ　ＧＡＧＧＡＣＣＧＴＣＣＡＴＣＴＴＣ
ＡＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡ　ＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣ
ＡＣＣＣＴＣＴＣＧ　ＡＴＴＴＣＣＣＧＧＡ　ＣＧＣＣ
ＣＧＡＧＧＴ　ＣＡＣＡＴＧＣＴＴＧ　ＧＴＧＧＴＧＧ
ＡＣＴＴＧＧＧＣＣＣＡＧＡ　ＴＧＡＣＴＣＣＧＡＴ　
ＧＴＣＣＡＧＡＴＣＡ　ＣＡＴＧＧＴＴＴＧＴ　ＧＧＡ
ＴＡＡＣＡＣＣＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡ　ＣＡＧＣＣＡＡ
ＧＡＣＧＡＧＴＣＣＧＣＧＴ　ＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴ　
ＴＣＡＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＣＧＴＧＴＧ　ＧＴＣＡ
ＧＴＧＴＣＣＴＣＣＣＣＡＴＣＣＴ　Ａｃｈｃｃｈｄａ
Ａｃ　ＴＧＧＣＴＣＡＡＧＧＧＧＡＡＧＧＡＧＴＴ　Ｃ
ＡＡＧＴＧＣＡＡＧ　ＧＴＣＡＡＣＡＧＣＡ　＾＾ＴＣ
ＣＣＴＣＣＣＣＴＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＧＧＡＣＣ
Ａ　ＴＣＴＣＣＡＡＧＧＣＣＡＡＡＧＧＡＣＡＧ　ＣＣ
ＣＣＡＣＧＡＧＣＣＣＣＡＧＧＴＧＴＡＣＧＴＣＣＴＧ
ＣＣＴ　ＣＣＡＧＣＣＣＡＧＧ　ＡＧＧＡＧＣＴＣＡＧ
　ＣＡＧＧ＾＾Ｃ＾＾＾ＧＴＣＡＧＴＧＴＧ＾ＣＣＴＧ
ＣＣＴＧＡ丁ＣＡＡＡＡＧＣＴＴＣＣＡＣＣＣＧＣＣＴ
Ｇ　ＡＣＡＴＴＧＣＣＧＴ　ＣＧＡＧＴＧＧＧＡＧ＾Ｔ
ＣＡＣＣＧＧＡＣＡＧＣＣＧＧＡＧＣＣＡＧＡＧＡＡＣ
ＡＡＣＴＡＣＣＧＧＡＣＧＡ　ＣＣＣＣＧＣＣＣＣＡＧ
ＣＴＧＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＧＧＡＣＣＴ　ＡＣＩＴＣ
ＧＴＧＴＡ　ＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＴＣＧＧＴＧＧＡＣ
ＡＧＧＴＣＣＣＡＣＴＧ　ＧＣＡＧＡＧＧＧＧＡ　＾＾
ＣＡＣＣＴＡＣＡ　ＣＣＴＧＣＴＣＧＧＴ　ＧＴＣＡＣ
ＡＣＧＡＡＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡ　ＧＣＣＡＣＣＡＣＡ
ＣＡＣＡＧＡＡＡＴＣＣＣＴＣＡＣＣＣＡＧＴ　ＣＴＣ
Ｃ（ｉＧＧＴＡ＾ＡＴＧ＾ Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｍ
ａｌ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｔｒｐ＾ｓｎ　Ｓｅｒ
　ＧｌｙＡｌａ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｖ
ａｌ　Ｈｌｓ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ＾ｌａ　Ｖａｌ
　Ｌｅｕ　ＧｌｎＡｌａ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｔ
ｙｒ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｍｅｔ　Ｖａ
ｔ　Ｔｈｒ　Ｖａｔ　Ｐｒ。 Ｔｈｒ　Ａｓｐ　ｌ１ｌｓ　Ｐｒ。 Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｒ。 Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｖ’ａｌ　　Ｔｈｒ Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ Ｇｌｕ　Ｍｅｔ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｖａｌ ｌｉｅ　Ｔｈｒ　Ｔｒｐ　Ｐｈｅ Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　Ａｓｐ　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　ＬｙｓＧｌ
ｙ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ｐｈｅ　ｌ１ｅＬｅｕ　
Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　ＴｈｒＡｓｐ　Ｌｅ
ｕ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　ＡｓｐＶａｌ　Ａｓｐ＾
ｓｎ　Ｔｈｒ　Ｇｌｎ　ＶａｌＴｒｐ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ
　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　
Ｌｙｓ　Ｖａｔ＾ｓｎ　Ｓｅｒ　ＬｙｓＳｅｒ　Ｌｅａ
　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　ＩＩｅＧｌｕ　Ａｒｇ　Ｔ
ｈｒ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ＾ｌａ　ＬｙｓＧｌｙ　
Ｇｉｎ　Ｐｒｏ旧ｓ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｎ　Ｖａｌ
　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　ＰｒｏＡｌ＆１１
ｅ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ Ｔｈｒ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ ＾３ｐ＾ｒｇ　Ｓｅｒ　Ｈｌｓ Ｖａｌ　　Ｓｅｒ　Ｈｌｓ　Ｇｌｕ Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ ＡＳｎ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　ＴｈｒＴｈｒ　Ｔｙ
ｒ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　ＴｙｒＴｒｐ　Ｇｌｎ＾ｒｇ　Ｇ
ｌｙ　ＡｓｎＡｌａ　Ｌｅｕ　Ｈｌｓ　Ｓｅｒ旧５ Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ 第７図 第８図 ｅ−−−→１ｋｂｐ ＋ＩＰ＋ ｐＳＶ２−ＰＨＣＣＪ

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. （１）ネコ免疫グロブリンγ鎖の定常領域ポリペプチド
   をコードするＤＮＡ配列を有する遺伝子断片。
2. （２）該定常領域ポリペプチドのＮ末端側から最初のシ
   ステイン（Ｃｙｓ）の近傍のアミノ酸配列が下記のアミ
   ノ酸配列を有する前記第（１）項記載の遺伝子断片。 −Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−
3. （３）該定常領域ポリペプチドのＣＨ１ドメインのＣ末
   端側のシステイン（Ｃｙｓ）の近傍のアミノ酸配列が下
   記のアミノ酸配列を有する前記第（１）項記載の遺伝子
   断片。 −Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−
   Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−
4. （４）該定常領域ポリペプチドのＣＨ２ドメインの糖鎖
   結合部位（Ａｓｎ）Ｎ末端側のアミノ酸配列が下記のア
   ミノ酸配列を有する前記第（１）項記載の遺伝子断片。 −Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−ＸＸＸ−ＸＸＸ−
   ＸＸＸ−ＸＸＸ−ＸＸＸ−Ａｓｎ−（ＸＸＸは任意のア
   ミノ酸）
5. （５）該ＣＨ２ドメインの糖鎖結合部位（Ａｓｎ）Ｎ末
   端側のアミノ酸配列が下記のアミノ酸配列を有する前記
   第（４）項記載の遺伝子断片。 −Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−
   Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−
6. （６）該定常領域ポリペプチドのＣＨ３ドメインのＮ末
   端側のシステインの近傍のアミノ酸配列が下記のアミノ
   酸配列を有する前記第（１）項記載の遺伝子断片。 −Ａｓｎ−Ｌｙｓ−ＸＸＸ−ＸＸＸ−ＸＸＸ−ＸＸＸ−
   Ｃｙｓ−（ＸＸＸは任意のアミノ酸）
7. （７）該ＣＨ３ドメインのＮ末端側のシステインの近傍
   のアミノ酸配列が下記のアミノ酸配列を有する前記第（
   ６）項記載の遺伝子断片。 −Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−
   Ｃｙｓ−
8. （８）該定常領域ポリペプチドが下記のアミノ酸配列で
   ある前記第（１）項記載の遺伝子断片。 −Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−
   Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ【アミノ酸配
   列があります】 【アミノ酸配列があります】
9. （９）前記第（１）項から第（８）項のいずれかに記載
   のネコ免疫グロブリンγ鎖の定常領域をコードする遺伝
   子断片をマウス免疫グロブリンＨ鎖の可変領域をコード
   する遺伝子断片の３’側に接続したことを特徴とするマ
   ウス×ネコキメラ抗体Ｈ鎖をコードする組換えＤＮＡ分
   子。
10. （１０）前記第（９）項記載の組換えＤＮＡ分子を発現
    ベクターに組み込み、この組換えベクターによって形質
    転換された細胞を培養し、発現されたマウス×ネコキメ
    ラ抗体Ｈ鎖を回収することを特徴とするマウス×ネコキ
    メラ抗体Ｈ鎖の製法。
11. （１１）前記第（１０）項記載のマウス×ネコキメラ抗
    体Ｈ鎖の製法により得られるマウス×ネコキメラ抗体Ｈ
    鎖ペプチド。