JPH03198771A - 神経細胞のパターン化方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （イ）産業上の利用分野 本発明は、神経細胞をパターン状に成長させる方法に関
し、所定パターンの神経細胞成長層を簡便に形成するこ
とができる方法を提供するものである。

（ロ）従来の技術 近年、神経細胞に人工的なネットワークを作らせ、その
系の挙動や素子としての神経細胞の機能を測定する方法
が注目を浴びている。これは一方でバイオコンピュータ
への指針となり、一方では生理学的な研究に貢献する方
法である。つまり人工の素子ではなく複雑な機能を備え
た神経細胞をそのまま用いてこれらを自由にネットワー
ク化できれば、脳のように高度な情報処理を行うバイオ
コンピュータにつながる可能性がある。また生理学の分
野でも、特定の神経細胞間のシナプス結合や神経伝達物
質の研究には、人工的神経構築が欠かせない。神経細胞
は固体の表面上でしか成長できないので、固体の表面状
態を変化させて細胞が接着又は耐着しやすいパターンを
作り、その上で神経細胞を培養する方法が一般に用いら
れている。

従来の神経細胞パターン化方法には、具体的に以下のよ
うな方法がある。

（１）正電荷をもつ基質上にパターン化する方法神経細
胞の細胞膜表面は負電荷で被われているため、正電荷を
もつ基質にぽ親和性を強くもつ一方、負電荷をもつ基質
には付着しない。この性質を利用して、負電荷もしくは
電荷をもたない基板上に正電荷をもつ基質をパターン状
に塗布らしくは結合させ、その上で細胞を培養する方法
である。

正電荷をもつ基質として、ボリリンン、ポリアルギニン
、ポリオルニチン、アミノアルキルシラン（Ｄ、Ｋｌｅ
ｉｎｆｅｌｄ　ｅｔ、ａｌ、Ｊｏｕｎａｌ　ｏｆ　Ｎｅ
ｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ。

Ｎｏｖｅｍｂｅｒ　１９８８．８（１１）：　４０９８
−４１２０）などが用いられている。

（２）疎水性物質上から神経細胞を排除してパターン化
する方法 疎水性物質でネガパターンを作り、そこから細胞を排除
することによって、逆にパターンを作り出す方法である
。疎水性物質としてアルギルシラン（Ｄ、Ｋｌｅｉｎｆ
ｅｌｄ　ｅｔ、ａｌ、　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｎｅｕ
ｒｏｓｃｅｉｎｃｅ、８．４０９８−４１２０（１９８
８）、）などが用いられている。

（３）細胞が生体内で接着している基質上にパターン化
する方法 神経細胞は生体中では基質となるようなタンパク質に付
着した形態で生存している。また細胞が移動する際や神
経突起を伸ばす際には、これらのタンパク質を手がかり
にすると考えられている。

一 これらのタンパク質のパターンを作製し、この上で神経
細胞を培養することにより、生体内と同しように機能さ
せて神経細胞のパターンを作製する。

ここで用いるタンパク質として、コラーゲン「福田潤　
ｅｔ、ａｌ、「コラーゲン線維による神経線維成長の方
向づけ」、生物物理学会第２６回年会講演予稿集、Ｓ　
２３３（１９８８）］　、ラミニン（Ｒ，Ｔｉｍｐｌ　
ｅｔａｌ、　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃ
ａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　２５４９９３３−９９３
７（１９７９）、　）、フィブロネクチン等が用いられ
ている。

（４）金属酸化物上にパターン化する方法インジウムや
アルミニウム等の金属の酸化物をミクロンオーダーのパ
ターン状に塗布した培養用基板を用いることにより、培
養神経細胞の神経突起成長方向を制御することが報告さ
れている［鳥光慶−ｅｔ、ａｌ、「神経突起成長方向制
御」、生物物理学会第２７回年会予稿集Ｓ　１５５（１
９１１１９）］。

（５）基板に刻んだ微小な溝構造によるパターン化方法 微小な溝構造を刻んだ基板上で神経細胞に培養すると、
神経突起は溝によって方向づけられて成長することが報
告されている［福田潤　ｅｔ、ａｌ「神経細胞による微
小立体構造と表面分子構造の認識」、日本生理学会第６
６回大会予稿集　３０１（１９８９）　］。

（６）神経細胞もしくは神経突起の成長を促す物質によ
るパターン化方法 神経細胞の成長を促す物質として有名なものに神経成長
因子（ＮＧＦ）がある。生体内でＮＧＰを分泌する細胞
があると、神経細胞はその方向に神経突起を伸ばす。こ
の性質を利用して神経突起の成長方向を制御しパターン
化する方法である。

この場合は成長促進物質をピペット等で局所的に与える
必要がある。

（７）電気的制御によるパターン化方法神経細胞の細胞
内電位をガラス電極によって変化させると神経突起の成
長が制御できることが、カタツムリの神経細胞で報告さ
れている（Ｄ、Ｐ、ＭｃＣｏｂｂ　ｅｔ、ａｌ、　Ｄｅ
ｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　１３０，
５９９−６０９（１９８９）、）。

（ハ）発明か解決しようとする課題 しかしながら、これらの従来のパターン化方法において
は、いずれにおいても正確なパターンを得るのが困難で
あったり、形成される神経細胞層の成長形態ら不良であ
ることが多いという問題点があった。ことに、パターン
化方法（１）〜（３）のうち基質等の物質を塗布する必
要のあるものについてはパターンの空間分解能を高める
ことが難しく、パターン化方法（５）については溝の加
工に高い精度が必要であり、パターン化方法（６）、（
７）については２次元平面上で局所的な部分しか制御で
きない等の欠点があった。

本発明は、かかる状況下なされたちのであり、従来困難
であった簡単で精度の高いパターン化方法を提供しよう
とするものである。

（ニ）課題を解決するための手段 本発明者らは、上記観点から鋭意研究を行った結果、パ
ターン化した電極を電解重合に付し、その際、電解系に
神経細胞成長を促進さ什る物質を存在させて得られた電
解重合高分子膜をパターン化基体として用いることによ
り、上記目的を達成しうろことを見いだし、この発明を
完成するに至った。

かくしてこの発明によれば、基体上に、神経細胞成長促
進物質を固定化又はドーピングしてなる所定パターンの
電解重合高分子膜を形成し、この電解重合高分子膜形成
基体を神経細胞の培養条件に付すことにより、上記電解
重合高分子膜上にパターン状に神経細胞を成長さ仕るこ
とからなる神経細胞のパターン化方法が提供される。

この発明における基体としては、電解重合における電極
として作用しうる導電材又は導電膜形成材を用いること
ができ、この導電材は導電膜を所定形状にパターン化し
ておくことにより、正確にパターン化された電解重合高
分子膜を形成することが可能となる。具体的な基体とし
ては、白金、金、アルミニウム等の金属板、カーボン板
等の所定形状の導電材や、白金、金、アルミニウム、カ
ーボン等の導電膜をガラス、プラスチック等の絶縁体表
面に所定パターン（矩形状、くし状、ストライブ状等）
に形成してなる導電膜形成材が挙げられる。なお、絶縁
体上への導電膜のパターン形成は、蒸着法、ＣＶＤ法等
により、あるいはこれらの気相成長技術とメツキ法とを
組合わせることにより行うことができる。

このような基体を、電解重合用モノマーと神経細胞成長
促進物質を含有する電解質中に浸漬し、この状態で電解
を行って重合を進行さＨ・ることにより、神経細胞成長
促進物質を固定化又はドーピングしてなる電解重合高分
子膜を上記電極面上に簡便かつ効率的に形成することが
できる。ここで電解重合高分子膜は少なくともミクロン
オーダーの空間分解能で電極上に形成される。したがっ
てミクロンレベルのパターン化にも対応できる点もこの
発明の１つの利点である。

上記電解重合用モノマーとしては、水溶性でかつ水溶液
中で重合しうるちのが適しており、例えば、アニリン、
ピロール、０−フェニレンジアミン、フェノール等が挙
げられる。溶液中のモノマー濃度はとくに限定されない
が、通常０．１〜０．２Ｍ一 程度が適している。

この発明において用いられる神経細胞成長促進物質には
、上記電解重合の際に電解重合高分子膜の成長中に非イ
オン的に捕捉されて固定化される乙のと、イオン的に高
分子膜中にドープされるものに分けられる。通常、分子
量が約５００以上のものは電解重合高分子膜に固定化す
ることが可能である。また分子量が約１５０以下で中性
溶液中でアニオンになっているものは通常ドーピングす
ることが可能であり、神経の培養時にその放出を電位に
よって制御することが可能である。

上記固定化が可能な神経細胞成長促進物質としては神経
成長因子（ＮＧＰ）、ソマトスタチン、ＦＭＲＦアミド
、スモール・カルデイオアクチイブ・ペプチドＡ（ＳＣ
ＰＡ）、スモール・カルデイオアクチイブ・ペプチドＢ
（ＳＣＰＢ）、バソアクティブ・インテステイナル・ポ
リペプチド（ＶＩＰ）、プロクトリン、ダリア由来ネク
ンン（ＧＤＮ）等のペプチドもしくはタンパク質が挙げ
られる。また、ドーピングが可能である神経細胞成長促
進物質としては、グルタミン酸、アスパラギン酸、γ−
アミノ酪酸、クリンン等のアミノ酸類が挙げられる。こ
れらの成長促進物質は、培養する神経細胞の種類に対応
して適宜選択される。これらの電解質溶液中への添加量
は特に限定されないが、固定化する物質については１μ
９／ＩＲ（１、ドーピングする物質については１０−１
Ｍ程度が適当である。

一方、電解重合用の支持電解質としては、電解重合に用
いられる一般的な塩が使用でき、ｐ−トルエンスルホン
酸アルカリ金属塩、Ａ　ｓ　Ｆ　ｅアルカリ金属塩、Ｃ
ＩＯ，アルカリ金属塩、ＢＦ４アルカリ金属塩等が適し
ているが、ドープしようとする物質についてはそのアル
カリ金属塩を直接用いることもできる。これらの支持電
解質濃度としては、０．０５〜０．１Ｍ程度が適してい
る。この際の電解重合は、室温等の緩和な温度下で行う
のが適しており、神経細胞を構成するペプチドもしくは
タンパク質の活性をできるだけ低下させないように０℃
付近で行うのが好ましい。また電解条件は、定電位法、
定電流法、電位走査法のいずれを用いてもよい。例えば
定電位電解で重合を行う場合には、電解電位０．６〜０
．８Ｖ　　ｖｓ、Ａｇ／ＡｇＣ１とするのが適している
。電解重合時間により、形成される高分子膜の厚みを調
整することができる。

かかる厚みは、神経細胞の成長の支持体として充分な厚
みであればよい。場合によっては、ドープされたイオン
成分を電気的に放出（脱ドープ）しうる程度の厚みに調
整されてもよい。

神経細胞の培養は、公知の方法に従い上記のパターン化
した電解重合高分子膜上で行われる。ここで培養神経細
胞は、を推動物の小脳、海馬、を髄、上動神経節、後板
神経節網膜等及び無を推動物の各種神経節から解離して
用いる。解離の方法としてトリプシン処理や、ピペッテ
ィングなどの操作を行う。培養時の神経細胞の密度は実
験の目的に合わせて適宜決定すればよい。培養液の組成
や血清の有無および培養温度、ｐＨなども培養する神経
細胞の種類や性質によって決定する。

（ホ）作用 電解重合系にモノマーと共存するペプチドやタンパク質
等からなる神経細胞成長促進物質は、モノマーのパター
ン化電極面上への重合に伴って重合膜中に包括固定され
ることとなる。また、電解重合系にモノマーと共存する
低分子アニオン等からなる神経細胞成長促進物質は、モ
ノマーのパターン化電極面上への重合時にドーパントと
して取り込まれることとなる。

そしてこのような成長促進物質含有の電解重合高分子膜
上で神経細胞を培養すれば、神経細胞が固定化又はドー
ピングされた成長促進物質に沿って成長もしくは神経突
起を伸ばし、電解重合高分子膜のパターン通りにネット
ワークが形成される。

またドーピングされた成長促進物質を局所的に任意の時
期に放出させることにより、時系列に沿った形でのパタ
ーン制御も可能になる。

（へ）実施例 以下、この発明の一実施例を図面と共にさらに詳細に説
明する。

まず、第２図に示すようにパターン化した白金１− ２ 電極板２（幅５ｘｘ、２Ｘ２洛子）をプラスチック培養
皿内に固定し導線を取り付けた。この培養皿内に０．１
Ｍビロール及び神経成長因子ＮＧＦ’（１μ９ＩＲＱ）
、を含む電解液水溶ｔＬ（０，１Ｍパラトルエンスルホ
ン酸ナトリウム、０．１Ｍリン酸緩衝溶液、ｐＨ７，０
）を注入し、０°Ｃ約５分間の定電位電解酸化重合（０
，７Ｖ　　ｖ　ｓ　、　Ａｇ／Ａｇ　Ｃｌ　）を行い、
白金電極板上にポリピロール−ＮＧＦ固定化（包括）高
分子膜（約２μｍ［電気量より換算コ）を形成した。

このポリピロール−ＮＧＦ固定化高分子膜電極を備えた
培養皿を十分水洗いした後、ここにモルモット上動神経
筋からトリプシン処理によって解離した神経細胞をブレ
ーティングした（８ｘ　Ｉ　Ｏ５細胞／ｃｍ’）。ブレ
ーティングの約９０分後に液を子牛血清ｌＯ％含むＧｉ
ｂｃｏ社製のＤＭＥＭ／Ｆ’・１２倍溶液に交換し、接
着しなかった細胞を取り除いた。培養は３７℃、二酸化
炭素濃度５％、湿度１００％のインキュベータ内で行っ
た。

第１図に培養１日後の培養皿側面図を示す。図中、■は
プラスチック培養皿、２はパターン化した白金電極、３
はポリピロール−ＮＣＦ固定化高分子膜、４はモルモッ
ト上動神経節細胞成長層、５は培養液を各々示すもので
ある。このように神経細胞はポリピロール−ＮＧＦ固定
化高分子膜上に接着し、活発に神経突起を伸ばすが、プ
ラスチック培養皿の上ではほとんど接着せず、接着した
としても神経突起を伸ばすような成長は行わなかった。

このようにポリピロール−ＮＧＦ固定化高分子膜上に選
択的に神経の成長を制御することができた。

また同様なポリピロール−ＮＧＦ固定化高分子膜を備え
た培養皿を繰り返し作製して培養を行ったところ、再現
性および神経細胞の活性も良好であり、電解重合法によ
りＮＧＦの固定化が再現性良く行えることも判明した。

一方、ＮＧＦを固定化しないポリピロール膜を作製し培
養を行ったところ、膜への細胞の接着および成長が一部
みられたが、その程度はＮＧＦを固定化したものに比べ
劣っていた。したがって神経細胞の成長が促進するのは
固定化したＮＧＦに起因し、ポリピロールはそれをサポ
ートするにすぎないことも判明した。

（ト）発明の効果 この発明による神経細胞のパターン化方法によれば、従
来の方法に比して、簡便かつ高精度に神経細胞のパター
ン化を行うことができ、細胞の成長も良好である。また
電解重合高分子膜自体が導電性を持っているため、電気
的制御によりドーパントの局所的放出や神経細胞の活動
をモニターすることも可能となる。さらに電解重合高分
子を用いた電気化学的な手法によって神経細胞成長促進
物質が固定化又はドーピングされているので、エネルギ
ー的にコストが安く、膜厚制御も容易である。

【図面の簡単な説明】

第１図はこの発明によってパターン化された培養神経細
胞の形態を示す説明図、第２図はパターン化に用いた白
金電極の形状を示す上面図である。 ｌ・・・・・プラスチック培養皿、 ２・・・・・・白金電極板、 ３・・・・・・ポリピロール−ＮＧＦ固定化高分子膜、
４・・・・・・モルモット上動神経節細胞成長層、５・
・・・・・培養液。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）基体上に、神経細胞成長促進物質を固定化又はド
   ーピングしてなる所定パターンの電解重合高分子膜を形
   成し、この電解重合高分子膜形成基体を神経細胞の培養
   条件に付すことにより、上記電解重合高分子膜上にパタ
   ーン状に神経細胞を成長させることを特徴とする神経細
   胞のパターン化方法。