JPH03127991A - 酸性繊維芽細胞増殖因子発現の増強方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 組換えヒト酸性ｍ！！芽細胞増殖因子（ｒ−ｈａＦＧＦ
）及び大ｌｌ！菌内でのその増殖因子の発現方法につい
ては公知である。ラインメイヤーら、バイオ／チック、
第５巻、第９６０−９６５頁、１９８７年（Ｌｉｎｅｓ
ｅｙｅｒ　ｅｔａｌ、、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈ、Ｓ：９６０
−９６５（１９８７）　）及び欧州特許出願公開筒２５
９，９５：１号明細書参照。

発現レベルは実験量のｒ−ｈａＦＧＦの単離及び特徴化
にとって十分であるが、但しこの創傷治癒タンパク質の
商業的生産にとっては十分でない。

大腸菌内におけるクローン化真核細胞タンパク質の高レ
ベル発現では、強プロモーターを含みその結果メツセー
ジの効率的翻訳を行うマルチコピー発現系へのその遺伝
子の組込みを通常要する、マルチコピー発現系、強プロ
モーター及び効率的リポソーム結合部位による発現レベ
ルは異なる真核細胞遺伝子毎に広く変動している（シコ
ナーら、プロシーディング・オフ・ナショナル・アカデ
ミ−・サイエンスＵＳＡ、第８３巻、第８５０６８５１
Ｏ頁、　　１９８６年（Ｓｃｈｏｎｅｒ　ｅｔａｌ、、
Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ　ｏｆＮａＬｉｏｎａｌＡｃａｄ
ｅｍｙ　　ｏｆ　　５ｃｉｅｎｃｅ　　ＵＳＡ　　８３
：８５０６−８５１０（＋９８６）　）。ショナーらは
大腸菌内ての牛ｒ＆長ホルモンの増強発現に関して２シ
ストロン発現系を評価し、第一シストロンか比較的短く
、停止Ｅコドンの上流にシャイン・ダルガルノ配列を含
み、それらすべてか所望タンパク質についてコードする
シストロンの上流に存在すべきであると結論付けた。

したがって、ｒ−ｈａＦＧＦの改良された産生方法を提
供することか本発明の目的である。もう１つの目的は、
ｒ−ｈａＦＧＦ産生用の二重シストロン発現系を提供す
ることである。他の目的は、ｒ−ｈａＦＧＦ発現か約１
５倍増加するｒ−ｈａＦＧＦ産生用の特異的二重シスト
ロン発現系を提供することである。

組換えヒト酸性繊維芽細胞増殖因子（ｒ−ｈａＦＧＦ）
の増強発現に関する独特な二重シストロン発現ベクター
か開示されている。二重シストロン発現ベクターでは、
ｒ−ｈａＦＧＦの発現か約５〜１３倍増強している。

ヒト酸性繊維芽細胞増殖因子は主に３種の微異質形で存
イＥしている。最長、即ち１５４アミノ酸形のアくノ酸
及びヌクレオチド塩基配列は、ジエイら、サイエンス、
第２３３巻、第５４１−５４５頁、１’１８６年（Ｊａ
ｙｅ　ｅＬａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ　２３３：５４１−
５４５（１９８６））に記載された。１４０アミノ酸残
基又は１３９アミノ酸残基のいずれかを含む更に短い形
は、ギメネズガレゴら、バイオケミカル・アンド・バイ
オフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ、第１
３８巻、第６１１−６１７頁、１９８６年（Ｇｉｍｅｎ
ｅｚ−Ｇａｌｌｅｇｏ　ｅｔａｌ、、Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｃａｌ　ａｎｄ　ＢｉｏｐｈｙｓｉｃａｌＲｅｓｅａｒ
ｃｈＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ　　１３８　二６１
１−６１７（１９８５））　　に記＋１！された。　ａ
ＦＧＦの短鎖形の合成遺伝子は、ラインメイヤーらの欧
州特許出願公開筒２５９，９５：１号明細書に記載され
た。１３９アミノ酸形は、アミノ末端フェニルアラニン
が除去された１４０アミノ酸形に相当する。アミノ末端
アスパラギン残基は。

ｈａＦＧＦの１３９アミノ酸形においてはアスパラギン
酸に脱アミド化されていてもよい。

本発明は、ヒトａＦＧＦのすべての微異質形に関する天
然又は合成いずれかの遺伝子も包含していると考えられ
る。天然遺伝子とは、ａＦＧＦを産生しうるヒト細胞か
ら単離されたＤＮＡのヌクレオチド配列として本明細書
では定義される。合成遺伝子とは、化学的に合成された
ヌクレオチド配列として本明細書では定義され、ｈａＦ
ＧＦの適切なアミノ酸配列をコードする天然ヌクレオチ
ド及び他のヌクレオチド配列を含んでいる。本発明は従
来の微異質形よりも短いがｈａＦＧＦ活性を有するタン
パク賀をコードするヌクレオチド配列を含むことが更に
意図されている。

ｈａＦＧＦ遺伝子の増強発現は、更に効率的な発現をす
るようｈａＦＧＦ遺伝子の上流に挿入された短鎖ＤＮＡ
配列を含む発現ベクターをデザインすることにより達成
される０本明細書で用いられる上流とは、　ａＦＧＦヌ
クレオチド配列の前で転写かつ翻訳されるヌクレオチド
配列として定義される。本明細書で用いられる発現ベク
ターとは、プラスミドに格別限定されず、１つ以上の転
写及び翻訳アクチベーター配列か組込まれたＤＮＡ分子
からなるあらゆる自律的複製体として定義される。増強
発現ベクターを産生ずるために使用可能な発現ベクター
としては格別限定されずｐＰＬａ２：ｉｌｌ、　ｐＫｃ
３０、ｐｔａｃ＋２、λｇＬ１１．　ｐＡｓｌ、　ｐｌ
ｃ：２４．　ｐｓＢ２２６、ｐＲＩＴ２Ｔ、ＳＶ４０、
ｐＢＲ３２２及びｐＫＫ２２３−３があるが、ｐＫＫ２
２３−３が好ましい。発現ベクター及びｈａＦＧＦの１
４０アミノ酸形に関する合ｒｓ、遺伝子の組込み操作は
、ラインメイヤーらの欧州特許出願公開筒２５９，９５
３号明細書に記載されている。ｈａＦＧＦの１４０アミ
ノ酸形の発現に用いられる操作は、ｈａＦＧＦの他の微
異質形の発現にも適用可能であると解される。

増強発現ベクターは、増強発現に関する第一シストロン
即ち増強シストロンとｈａＦＧＦについてコードする第
二シストロンとを含んでいる。シストロンは特定ペプチ
ドについてコードするか又は翻訳されないか単に密接に
関連したシストロンの発現を増強しうるヌクレオチドの
特定配列として機能するＤＮＡ領域として定義される。

増強シストロンは、翻訳開始コドン（ＡＴＧ）　、　Ｌ
／かる後シャイン・ダルガルノ配列（１６Ｓリポソーム
ＲＮＡ（ｒＲＮＡ）結合部位と相補的なヌクレオチド塩
基て約８塩基からなる）及びしかる後停止コドン（ＴＡ
Ａ）を含んている。ｈ　ａ　Ｆ　Ｇ　Ｆシストロンの上
流にある増強シストロンはｈａＦＧＦシストロンに作動
可能に結合され、プロモーターの下流に存在する。作動
可能に結合されたとは作動可能に結合された遺伝子又は
シストロン１適切なプロモーター及び終結系含有発現ベ
クターを含む細胞から所望のタンパク質が産生されるよ
うなヌクレオチドセグメント、シストロン又は遺伝子の
適切な連続配列を指す。ｈａＦＧＦについてコードする
第二シストロンの翻訳効率は、増強シストロンの長さ、
第一シストロン中の停止Ｌコドンに対するシャイン・ダ
ルガルノ配列の位置及びｈ　ａ　Ｆ　Ｇ　Ｆシストロン
の開始コドンに対する第一シストロン中の停止コドンの
位置によって決定される。増強第一シストロンは長さか
約６〜約１２コドンである。第一シストロンΦの停止Ｌ
コドンに関して奸ましい位置は、シャイン・ダルガルノ
配列の下流てあって第二シストロンの開始コドンの約２
塩基以内である。増強シストロンとしては格別限定され
ず下記表中のヌクレオチド塩基配列があるか、これらは
ショナーら、プロシープインク・オフ・ナショナル・ア
カデミ−・オフ・サイエンスＵＳＡ、第８３巻、第８５
０６−８５１０頁、１９８６年で記載された配列と類似
している。

第１表 ＡＴＧ　　ＴＡＴ　　ＣＧＣＧＡＴ　　ＴＴＡ　　ＡＡ
Ｔ　　ＡＡＧ　　ＧＡＧ　　ＧＡＡ　　ＴＡＡＡＴＧ　
　ＴＡＴ　　ＣＧＡ　　ＴＴＡ　　ＡＡＴ　　へへＧＧ
へＧ　　ＧＡＡ　　ＴＡＡＡＴＧ　　ＴＡＴ　　ＣＧＴ
　　ＧＡＡ　　ＴＴ（：　　ＣＧＡ　　ＴＴＡ　　八Ａ
Ｔ　　ＡＡＧ　　ＧＡＧ　　ＧＡＡ　　ＴＡＡ奸ましい
増強シストロンのヌクレオチド配夕１は下記表で示され
ている。

第２表 ５°八ＡＴＴ八ＴＧＴ八ＴＣＧ八ＴＴＡＡＡＴＡ八ＧＧ
ＡＧＧＡＡＴ　　３゜’ｌ’ＴＡｃＡＴ八Ｇ（：ＴＡＡ
へＴＴ八ＴＴＣＣへＣＣＴＴＡＴＴＡ八　５゜（へラス
ミド）　（シストロン１．２オリゴマー）　　（ｈａＦ
ＧＦ）第一・シストロンは、ラインメイヤーらの欧州特
許田廟公開第２５９．９５：１号明細書で記載されるよ
うにＥｃｏＲ１部位において適切なｐＫに−ｈａＦＧＦ
構造体中に挿入される。挿入の結果、　ＥｃｏＲ１クロ
ーニンク部位を喪失する０組換え体はＥ、ｃｏｌｉ　Ｊ
Ｍ１０５　（ファルマシア（Ｐｈａｒａａｃｉａ）　）
又はＤ１１５（ＢＲＬ）のような適切な宿主細胞中に組
込まれて形質転換され、発現される。増強発現ベクター
を含むプラスミドはｐＫに２ｃｍｈａＦＧＦと命名され
る。本発明はｐＫＫ２ｃｍｈａＦＧＦ（１５４）、ｐＫ
Ｋ２ｃｍｈａＦＧＦ（１４Ｇ）及びｐＫＫ２ｃｍｈａＦ
ＧＦ（１：１９）のような増強発現ベクター含有クロー
ンを含むとみなされる。発現は、ラインメイヤーら、バ
イオ／チック、第５巻、第９６０−９６５頁、１９８７
年で記載されたような当業界て公知の条件下で行われる
。

ｒ−ｈａＦＧｌ’および単一及び二重シストロン発現系
発現細胞はプロテアーゼ阻害剤含有緩衝液に懸濁されて
破壊される。無細胞溶菌液はｐＨ６、Ｏのリン酸緩衝液
、イオン交換樹脂ＣＭ−セファデックスと混合され、カ
ラムに充てんされリン酸緩衝液中０．６０−μｓＣ１で
溶出される。陽性分画が集められ、プールされ、ｐｌ−
１が７．２に調整される。サンプルはヘパリン−セファ
ロースに加えられ、カラムに加えられる。ｒ−ｈａＦＧ
ＦはｐＨ７，２で１０ｍＭリン酸ナトリウム、１．５　
Ｍ　ＮａＣｌで溶出される。ｒ−ｈａＦＧＦ含有分画は
トーマス（Ｔｈｏｍａｓ）ら、プロシーディング・オフ
・ナショナル・アカデミ−・オフ・サイエンスＵＳＡ　
、第８１巻、第３５７−３６１頁、　１９８４年で記載
されるように逆相ＨＰＬＣで更に精製される。ポリアク
リルアミドゲル電気泳動は精製度を確認するために用い
られ、一方ｒ−ｈａＦＧＦの同一性はアミノ酸分析及び
アミノ末端配列決定により確認される。

単一及び二重シストロン発現系により産生されたｒ−ｈ
ａＦＧＦかラインメイヤーら、バイオ／チック、第５巻
、第９６０−９６５頁、１９８７年の方法を用いてウェ
スターンイムノプロット分析により比較された場合、二
重シストロン系は屯−シス−トロン系よりも約１０倍高
いレベルでｒ−ｈａＦＧＦを発現する。

ｒ−ｈａＦＧＦの濃度は、トーマス、メソッズ・イン・
エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ）、第１４７巻、第１２０−１：１５頁、　
１９１３７年で記載された吸光係数法及び実施例３に記
載された分析ＨＰ　Ｌ　Ｃ法を用いて測定される。単一
及び二重シストロン発現ｒ−ｈａＦＧＦの量が吸光係数
法で比較された場合、単一シストロン発現系は形質転換
細胞１　ｘ　１０Ｉ２当たり高精製ｒ−ｈａＦＧＦ約２
．２ｍｇを産生したか、一方二重シストロン発現系は同
一・細胞濃度てｒ−ｈａＦＧＦ約２９．２１１ｇを産生
じた。二重シストロン系はｒ−ｈａＦＧＦの量を約１３
．３倍増加させた。ｒ−ｈａＦＧＦ濃度測定用の分析Ｉ
Ｉ　Ｐ　Ｌ　Ｃ法によれば、清澄化溶菌液中で約８．２
倍、ＣＭ−セファロースクロマトグラフィー後約６．０
倍、ヘパリン−セファロースクロマトクラフィー後で約
５．４倍の増加かあった。

繊維芽細胞、血管及び角膜内皮細胞等を含めた様々な細
胞タイプの分裂を促進しうるａＦＧＦ及びｒ−ｈａＦＧ
Ｆの能力は、ｒ−ｈａＦＧＦを医薬として有用なものに
している。組換えｈａＦＧＦは、格別限定されないか熱
傷、切り傷又は裂傷に起因する柔組織創傷、骨折、靭（
１）及び１１！断裂のような筋骨格創傷を伴う皮膚潰瘍
並びに滑液前及び社の炎症の治癒又は修復を促進する上
て有用である。本明細書で用いられる組ｍ修復とは、ｒ
　−ｈ　ａ　Ｆ　Ｇ　Ｆによる細胞の刺ｍ後における組
織の再生として定義される。組換えｈａＦＧＦは、軟骨
及び軟骨組織の治癒及び再生を促進する上でも有用であ
る。組織修復又は創傷治療用のｒ−ｈａＦＧＦの医薬製
剤は、ヘパリンのような硫酸グリコサミノグリカンを通
常含有している。

下記実施例は本発明について説明しているか、しかしな
がら本発明をそれに制限するものてはない。

実施例１ ｐ′−■ベクター ｈａＦＧＦに関する発現の増強レベルは、ラインメイヤ
ーら、バイオ／チック、第５巻、第９６０−９６５頁、
１９８７年の操作を用い、ｂａＦＧＦコード配列の上流
にシストロンを更に導入する発現ベクターｐＫＫ−ｈａ
ＦＧＦの修飾により得られた。好ましい第一シストロン
は、第２表で示されるような配列をイＩする２つのオリ
ゴマーとして合成された。オリゴマーは、マチューシ及
びカルサーズ、ジャーナル・オフ・アメリカン・ケミカ
ル・ソサエティ、第１０３巻、第：１１８５−：＋１９
１頁、　１９８１年（ＭａｔＬｃｕｃｃｉａｎｄ　Ｃａ
ｒｕｔｈｅｒｓ、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃ
ａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａ！５ｏｃｉｅｔｙ　１０：ｌ：３
１８５−３１９１（１９８１）　）　；ビュケージ及び
カルサーズ、テトラヘドロン・レターズ、第２２巻、第
１８５９−１８５２頁、１９８１年（Ｂｅａｕｃａｇｅ
　ａｎｄＣａｒａｔｈｅｒｓ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｍ
　　Ｌｅｔｔｅｒｓ　　２２：ｌ８５９−１８６２（１
９８１））で記載されたような当業界で周知の方法によ
り合成される。アニーリングされた場合、これらのオリ
ゴマーはＥｃｏＲＩ開裂で得られる伸長部と相補的な４
塩基の５°伸長部、ＡＴＧ翻訳開始コドンの後でＴＡＡ
停止コドンの前の７コドンオープン読取り枠及び更に停
止コドンの上流でオーブン読取り枠内に位置するシャイ
ン・ダルガルノリポソーム結合部位を与える。各オリゴ
マー１ｐｍｏｌを用いて、オリゴマーをＤＮＡリガーゼ
緩衝液２０ＪＬ＋中で７０°Ｃで１０分間加熱して徐々
に冷却することにより、互いにアニーリングさせた。ア
ニール化された混合物０．３ｐ■ｏ１を７４ＤＮＡリガ
ーゼ（ファルマシア）３単位含右の最終容量２５井１中
１４°Ｃで２．５時間かけてＥｃｏＲ１開裂ｐＫＫ−ｈ
ａＦＧＦプラスミド［１ＮＡ（第１図参照）　０．１１
）＠０１に結合させた。結合されたＤＮＡ５ｎｇを用い
て当業界て公知の標準的操作によりコンピテントＥ、ｃ
ｏｌｉ　Ｊ旧０５細胞を形質転換させた。形質転換株を
ＥｃｏＲ１部位かこの挿入で失われるので、制限分析、
及びイムノプロット分析でスクリーニングした。高レベ
ルのｈａＦＧＦ産生を示したクローンの発現ベクターを
マキサム（Ｍａｘａｍ）及びギルバート（Ｇｉｌｂｅｒ
ｔ）　、プロシーディング・オフ・ナショナル・アカデ
ミ−・オフ・サイエンスＵＳＡ　、第７４巻、第５６０
−５６４頁、１９７７年の化学的方法により配列決定し
て、新しいシストロン配列が正しく挿入されたことを確
認した。

増強発現ｐＫＫ２ｃｍｈａＦＧＦベクターを当業界で公
知の標準的形質転換操作により大腸菌ＤＨ５に導入した
。

発現クローンを０．４％グルコース及び５０ｇｇ／１１
１アンピシリン含有ＬＢブロス（１％トリプトン０．５
％酵母エキス、０．５％ＮａＣＩ）中３７℃で増殖させ
た。５５０同の光学密度が０．５に達した時、ＩＰＴＧ
を加えて１ｍＭとし、増殖を３７°Ｃで３時間続けた。

細胞を１０，０００　ｘ９で２０分間の遠心により回収
し、培養液１文からの細胞をｐｌ＋７．２の１０−リン
酸ナトリウム（ヘパリン−セファロース緩衝液）、５ｍ
ＭビＤＴＡ、　１０．６ルｇ／鵬Ｉ　ＴＰＣＫ、：１４
．：ｌドｇ／ｍｌベブスタチンＡ、８７　ｇ　ｇ／ａｌ
　ＰＭＳＦ、１５　ｐ、　３Ｈ／ｍｌ　ＢＰＴＩ及び３
４１．ｇ／ｍ１０イベプチンを含む２０ｍ！に再ｒｆＡ
’ＦＡした。再懸濁された細胞をトライアイス／エタノ
ール浴中て迅速に凍結し、−７０°Ｃて一夜貯蔵した。

実施例２ えｈａＦＧＦの　　び 実施例１の凍結細胞を解凍し、ｐＨ６，０の５　ｍｇ／
ｍｌ　ＥＤＴ八含へ１００＋１Ｍリン酸ナトリウム等容
量と混合し、４℃において２７，０００　ｘ９で５分間
遠心した。細胞を洗浄し、破砕前に０．０５ｍＭ　ＰＭ
ＳＦ、０．０３ＩＩＭＴＰｃＫ、０．０５＋ｗＭペプス
タチンＡ、０．０５ｍＭロイペプチン及び１５Ｊｊ−ｇ
／鵬Ｉ　ＢＰＴＩ含有リン酸緩衝液６０−１に再懸濁し
た。細胞懸濁液を４°Ｃの定温下フレンチンレス１２，
０［］（ｌｐｓｉ　　（約８４０Ｋｇ／ｃ１）て３回通
過させた。得られた溶菌液を４℃において２７，０００
　ｘ９で１５分間遠心して細胞破片を除去し、最終遠心
からの上澄液を集め、ドライアイス／エタノール浴中で
迅速に凍結し、−７０°Ｃで貯蔵した。

無細胞凍結溶菌液をｐＨ６，０の１００會婦リン酸ナト
リウム２００ｍ１および６．５ｍｌ／ｇタンパク質の割
合の洗浄ＣＭ−セファデックスと混合した。懸濁液は焼
結ガラス漏斗中てｐＨ６，０の０．１５Ｍ　ＮａＣ１含
有１００ｍＭリン酸洗Ｍ２Ｏ０ｍ１て３同温合して洗浄
した。ＣＭ−セファデックス−溶菌液複合体を２．５ｃ
ｍ径カシカラム填し、ｐＨ６，０の１１００ＩＩリン酸
及び０．６Ｍ　ＮａＣｌからなる溶出液により速度１２
ｍ１／ｈｒ／ａｍ”で溶出させた。分画を２８０ｎｍの
吸光度によりモニターし、タンパク質含有分画を集め、
プールし、冷脱イオン水で導電率約１０ｇ５／ｃ■とな
るまて希釈した。タンパク質サンプルをｌ　Ｎ　ＮａＯ
ＨでｐＨ７，２に調整し。

しかる後ｐｌ＋７．２の２ＭＮａＣ１含有１０５Ｍリン
酸で洗浄されかつｐＨ７，２の１０ｍＭリン酸で平衡化
されたヘパリン−セファロースに加えた。タンパク質ｌ
１ｇ当たり充填ヘパリン−セファロース１ｍｌ含有懸濁
液を４°Ｃでｌ蒔間穏やかに攪拌し、焼結ガラス上て集
め、１ｃｍ径カラムに充填し、流速２カラム容量／ｈｒ
で溶出させた。充填後、カラムを２８Ｏｎ＋ｓの吸光度
がバックグラウンドに低下するまでｐＨ７，２のｌ〇−
リン酸ナトリウム、０．８Ｍ　ＮａＣｌで洗浄した。結
合ｒ−ｈａＦＧＦはｐＨ７，２の１０日−９ン酸ナトリ
ウム、１．５Ｍ　ＮａＣ１で単一ピークとして溶出され
た。ヘパリン−セファロースカラムからプールした分画
なトーマスら、プロシーディング・オフ・ナショナル・
アカデく−・オフ・サイエンスＵＳＡ、第８１巻。

第３５７−：１６１頁、１９８４年で記載されたように
４．６■Ｘ　２５ｃｍＧ、カラム〔セパレーションズ・
グループ（Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ　Ｇｒｏｕｐ）　）
を用いた逆相ＨＰ　Ｌ　（１：により精製した。ｒ−ｈ
ａＦＧＦは多数の副混入ピークから分離して単一主ピー
クとして溶出したが、これはタンパク質か均一に純粋で
あることを示している。

ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて純度を確認し
た。精製されたｒ　−ｈ　ａ　Ｆ　Ｇ　Ｆを還元し、オ
ーツ）・レル、ジャーナル・オフ・バイオロジカル・ケ
ミストリー、第２５０　＠、第４００７−４０２１頁、
第１９７５年（０’Ｆａｒｒｅｌｌ、Ｊｏｕｒｎａｌ　
ｏｆ　ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ　２５
０：４００７−４０２１（１９７５）　）て記載された
ように調整された１５％ポリアクリルアミドゲルでドデ
シル硫酸ナトリウム存在下電気泳動に付した。銀染色で
は分子量１６，０００トルトンの単一バンドを示した。

タンパク質ｈａＦＧＦとしての同一性はアミノ酸分析及
びアミノ末端配列決定の双方て確認された。

回収された純粋なｒ−ｈａＦＧＦの量は、トーマス、メ
ソッズ・イン・エンザイモロジー、第１４７巻、第１２
０−１：１５頁、１９８７年で記載されたように２８０
ｎｍの吸光係数を用いて測定された。単一シストロン発
現系は形質転換細胞１　ｘ　１０１２個当たり高純度ｒ
−ｈａＦＧＦ　２．２ｍｇを産生じたが、一方二重シス
トロン発現系は形質転換細胞１　ｘ　１０”個当たり高
純度ｒ−ｈａＦＧＦ　２９．２＋ｉｇを産生した。二重
シストロン系はｒ−ｈａＦＧＦ発現を１３．３倍増加さ
せた。

実施例３ 大バッチ発酵における単一及び二重シストロン発による
　　　　　　　　　　　　の 単一シトロン発現ベクターｐＫＫ−ｈａＦＧＦ及び実施
例１のｐＫＫ２ｃｍｈａＦＧＦのような二重シストロン
発現ベクターを含有した大腸菌を同一のスケールアップ
条件下で増殖させかつ精製した。これらの条件は２つの
発現系下におけるａＦＧＦ産生の直接比較を可能にした
８発現クローンはブロスのｐＨ及び溶存酸素を維持する
ように運転される発酵槽内の５０　ｇ　ｇ／■ｌアンピ
シリン含有緩衝増殖培地（０，１％酵母エキス、０．５
％ＨｙＳｏｙ及び通常塩類、ｐＨ７，０）中て増殖させ
た。５５０ｎｍの吸光度か０．５に達したときｌ　ｍＭ
　ＩＰＴＧを加え、増殖を１７時間又は最大ａＦＧＦか
発現されるまで３７°Ｃて統けさせた。各形質転換細胞
タイプの２つの９．５文ハツチをプールし、洗浄し、破
砕用にｅｉＷｔ、た。実施例２のプロテアーゼ阻害剤存
在下で洗浄細胞をマントン・ゴーリン（Ｍａｎｔｏｎ−
Ｇａｕｌｉｎ）実験用ホモジナイザーで破砕した。単一
及び二重シストロン発現ｒ−ｈａＦＧＦを実施例２に示
した多段階クロマトグラフィープロセスで精製した。

様々なサンプル中のａＦＧＦ５度は０４カラム（ハイダ
ック（Ｖｙｄａｃ）　）を用いて分析用ＩＩ　Ｐ　Ｌ　
Ｃにより測定された。カラムを溶媒Ａ（１０ｎＭトリフ
ルオロ酢酸水溶液）で平衡化した。流速は１．５ｍｌ／
ｗｉｎであった。酸性ＦＧＦは、溶媒Ａが６０〜４０％
、溶媒Ｂ　（アセトニトリル６７％／溶媒１３３％）が
４０〜６０％、アセトニトリル約３５％の場合に溶出す
る。これらの条件下で、ａＦＧＦの調製用カラム溶出物
は０．８９ＩＩｇ／ｍｌの濃度まではＨＰ　１．Ｃ上直
線的応答を生しることが示されている。したかって、更
に高濃度のａＦＧＦサンプルの場合には正確な定量のた
めに希釈を要する。すべての希釈は溶出用緩衝液て行わ
れる。標準品を調製し前記のように分析し、生成物濃度
はサンプルビーク面積を標準品のピーク面積で割り更に
標準品の濃度を掛けて計算される。

下記衣は単一及び二重シストロン発現系におけるａＦＧ
Ｆ濃度を比較している。等容量の発酵ツロスを単一及び
二重シストロン系について処理した。細胞濃度はホモジ
ナイズ前に一定値に調整した。その後におけるクロマト
グラフィー樹脂充填量は標品の総タンパク賀含有量を基
とした。単一シストロン系（溶菌液物２，７文処理）の
総ａＦＧＦ値は二重シストロン系（１，４５５１処理）
に対して換算される。

第 表 単一及び二重シストロン発現系による酸性繊維芽細胞増
殖因子産生の比較 単一シストロン系の発現レベルと比較した場合ａＦＧＦ
産生能の４〜８倍増加が、二重シストロン発現系を用い
た組換え大腸菌て観察された。レベルは清澄化された溶
菌液において最高であって、サンプルが精製されるにつ
れて約４〜５倍まで低下した。

【図面の簡単な説明】

ｉ１図はｈａＦＧＦに関する遺伝子を含んたｐＫＫ２２
３−３プラスミドの図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、形質転換された原核細胞中で発現されるヒト酸性繊
   維芽細胞増殖因子の発現を増強させるための方法であっ
   て、 ａ、ベクターが： ｉ、翻訳開始コドン、シャイン・ダルガルノ配列及び停
   止配列を含み、第二シストロンに上流で作動可能に結合
   された第一シストロン（双方のシストロンは同一プロモ
   ーターのコントロール下にある）； ｉｉ、酸性繊維芽細胞増殖因子についてコードする第二
   シストロン； を含む発現ベクターを準備し；及び ｂ、原核細胞をａで記載されたベクターで形質転換し、
   ：及び ｃ、遺伝子発現及び酸性繊維芽細胞増殖因子の産生にと
   って適した増殖条件下で形質転換細胞を培養する； ことを特徴とする方法。 ２、ステップａのセクションｉｉにおいてシャイン・ダ
   ルガルノ配列が長さ約８ヌクレオチドである、請求項１
   記載の方法。 ３、ステップをにおいて原核細胞が大腸菌である、請求
   項１記載の方法。 ４、ステップａのセクションｉにおいて第一シストロン
   が 【遺伝子配列があります】 からなる群より選択される、請求項１記載の方法。 ５、第一シストロンが 【遺伝子配列があります】 のヌクレオチド塩基配列を有する、請求項４記載の方法
   。 ６、ステップａのセクションｉｉにおいてヒト酸性繊維
   芽細胞増殖因子シストロンがヒト酸性繊維芽細胞増殖因
   子の１５４アミノ酸残基微異質形についてコードしかつ
   メチオニン残基についてコードするコドンを更に有して
   いて、この付加コドンが上記微異質形のＮ末端で通常の
   第一コドンに結合されている、請求項１記載の方法。 ７、ステップａのセクションｉｉにおいてヒト酸性繊維
   芽細胞増殖因子シストロンがヒト酸性繊維芽細胞因子の
   １４０アミノ酸残基微異質形についてコードしかつメチ
   オニン残基についてコードするコドンを更に有していて
   、この付加コドンが上記微異質形のＮ末端で通常の第一
   コドンに結合されている、請求項１記載の方法。 ８、ステップａのセクションｉｉにおいてヒト酸性繊維
   芽細胞増殖因子シストロンがヒト酸性繊維芽細胞増殖因
   子の１３９アミノ酸残基微異質形についてコードしかつ
   メチオニン残基についてコードするコドンを更に有して
   いて、この付加コドンが上記微異質形のＮ末端で通常の
   第一コドンに結合されている、請求項１記載の方法。 ９、ヒト酸性繊維芽細胞増殖因子の１３９アミノ酸微異
   質形のアミノ末端アスパラギンアミノ酸残基がアスパラ
   ギン酸に脱アミド化されている、請求項８記載の方法。 １０、単一シストロン発現系と比較してａＦＧＦ産生が
   約５〜１３倍増加している、請求項１記載の方法。 １１、請求項１記載の方法で製造されたことにより特徴
   付けられる酸性繊維芽細胞増殖因子。 １２、酸性繊維芽細胞増殖因子の発現レベルが少なくと
   も５倍増加されている、請求項１記載の二重シストロン
   発現系で形質転換された大腸菌株。 １３、ヒト酸性繊維芽細胞増殖因子についてコードする
   シストロンに作動可能に結合された増強シストロンを含
   み、増強シストロンが翻訳コドン、シャイン・ダルガル
   ノ配列及び停止コドンを含んでいて、双方のシストロン
   が同一プロモーターのコントロール下にあることを特徴
   とするヒト酸性繊維芽細胞増殖因子の増強発現用二重シ
   ストロン発現系。