JPH03108500A - アッセイにおける過酸化水素安定化 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、過酸化水素の安定化を必要とする診断アッセ
イ又は他のシステムに関する。

〔背　景〕

多くのアッセイにおいて、過酸化水素は、試薬として使
用される。アッセイが定量又は半定量的である場合、過
酸化水素は、検出可能なシグナルを生成する、通常クロ
モゲンを形成する態様で反応することが必要である。多
くのアッセイにおいて、血液又は血液誘導体、たとえば
血清又は血漿が存在し、ここで血液サンプルは、複雑な
成分の混合物を含む。これらの成分は、個人により異な
り、そしてそれは過酸化の定量化に対して効果を有する
ことが見出された。従って、所望とするアッセイ経路以
外の経路により過酸化水素の反応を妨げるシステムを提
供することが重要である。

〔関連文献〕

１９８７年６月２２日に出願された継続出願第０６４，
８８３号は、試薬として過酸化水素を用いる固相診断ア
ッセイを記載する。

そして、１９８８年５月１９日出願された同時継続出願
筒１９５．８８１号は、血清成分が、検出可能なシグナ
ルを生成するために続いて使用される過酸化水素に酵素
的に転換される固相診断アッセイを記載する・ 〔発明の要約〕 過酸化水素は、キレート剤、金属酸化物のオキシダント
、ニトロプルシド及び好ましくはカタラーゼインヒビタ
ーの混合物を組合すことによって血液又は赤血球細胞を
含まない血液の存在下で安定化される。これらの組成物
は、アッセイ測定の間、血液の成分と過酸化水素との反
応を妨げるのに十分な量で組合される。

〔特定の態様の記載〕

血液サンプル中の成分を定量化するために、過酸化水素
が試薬として使用される、血液又は赤血球細胞を含まな
い血液、たとえば血漿又は血清を使用するシステムにお
いて、アッセイ経路以外の経路によりその反応を妨げる
ために過酸化水素を安定化するための配合物が提供され
る。特に、その配合物は、キレート剤、特にヒドロキシ
ル化されたカルボキシレート、金属酸化物のオキシダン
ト、特に錫酸塩、ニトロプルシド及びカタラーゼインヒ
ビター、特にアジ化ナトリウムを含んで成る。

添加物は、キレート剤：金属酸化物：ニトロプルシドの
モル比が約０．２〜５：０．２〜５：０．２〜５、好ま
しくは約０．５〜２：０．５〜２：０．５〜２であるよ
うに組合される。所望により、種々の添加物は等モルで
ある。アジ化ナトリウムは、カタラーゼインヒビターと
してだけでなく、また保存剤として主に存在し、そして
存在する場合、一般的に、湿潤又は乾燥配合物の約ｌＸ
ｌ０−’〜０．１重量％の少量で存在する。

配合物は、多くの形を取ることができる。配合物は、ア
ッセイの間、アッセイ媒体に添加され得る。他方、配合
物は固体支持体により吸収され、その結果、それは、支
持体へのアッセイ媒体の添加に基づいてアッセイ媒体中
に溶解する。アッセイ媒体中における種々の基本的な成
分の濃度は、一般的に約０．０００１〜０．５、より普
通には約０．００１〜０．１Ｍの範囲であろう。吸収性
の強い支持体を含浸する場合、その吸収性の強い支持体
を含浸するために使用される溶液は、個々の成分のため
に約０．００５〜０．１１より普通には約０．Ｏ１〜０
．０５Ｍの範囲であろう。アジドは一般的に約ｏ、ｏｏ
ｓ〜０．１％の範囲であろう。組成物は、通常、従来の
緩衝液、たとえば約０．０５〜０．７５Ｍの範囲の濃度
でのリン酸塩により約６〜８、通常約７のｐＨで緩衝さ
れるであろう。

本発明の組成物は、オキシダーゼの反応が過酸化水素を
生成する場合、試薬としてオキシダーゼを使用する診断
アッセイに使用される６種々の酵素、たとえばグルコー
スオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、尿酸オ
キシダーゼ及び同様の酵素が使用され得る。これらの酵
素は、関与される特定のアッセイに従って、従来の方法
で且つ従来の量で使用されるであろう。

安定化配合物が吸収性の強い支持体に適用される場合、
種々の支持体、たとえばセルロース支持体、たとえば紙
、酢酸セルロース、硝酸セルロース、ガラス繊維又は同
様のものが使用され得る。

特に、その吸収性の強い支持体は試薬パ・ノドとして作
用することができ、ここで他の試薬、特に過酸化水素の
形成をもたらす酵素試薬もまた、そのパッドに結合され
る。

典型的には、本発明は試薬パッドの使用であり、ここで
血漿がアッセイの開始のためにパッドに添加される。そ
の試薬パッドに、オキシダーゼ、たとえばグルコースア
ッセイのためにグルコースオキシダーゼ、コレステロー
ルアッセイのためにコレステロールエステラーゼ及びコ
レステロールオキシダーゼ、及び試薬の混合物、本発明
の配合物及び酵素安定剤の混合物が結合される。特に、
試薬は、パッドに適用される溶液のｏ、ｉｏ〜１０重量
％であり、そして非イオン性且つアニオン性界面活性剤
の混合物であろう。酵素安定剤は、約０．１〜２０乾量
％で種の添加物、たとえば糖、タンパク質、アラビアゴ
ム、非イオン性界面活性剤を含むことができ、ここで酵
素安定剤の合計量は一般的に溶液の約０．５〜１０、よ
り普通には約１〜５重量％の範囲であろう。酵素の量は
、アッセイに依存して異なり、そして−船釣に、１ｒ１
１１当たり約１〜５００単位の量で存在するであろう。

他のアッセイの例示としてのコレステロールアッセイの
場合、含浸溶液は、ｌｄ当たり約２〜１００単位の２種
の酵素、たとえばコレステロールエステラーゼ及びコレ
ステロールオキシダーゼを有するであろう。界面活性剤
は媒体中に約０．１〜５重量％の合計重量で存在し、と
ころが混合物の場合、非イオン性界面活性剤の重量は、
合計界面活性剤混合物の約１０〜９０重量％、通常約２
５〜７５重量％である。結合剤は一般的に、媒体の約０
６２〜１０、より普通には約１〜５重量％の範囲で存在
するであろう、保存剤又は水素結合剤は、約１〜２０重
量％、より普通には約２〜１０重量％で存在する。残る
添加剤は一般的に、約１０重量％以下、より普通には約
５重量％以下の合計量で存在するであろう。残る組成物
は、水、非反応性成分、賦形剤、増量剤及び同様のもの
を含むことができる。

試薬パッドが溶液を吸収した後、その溶液は乾燥せしめ
られ、そして次に適当な場合に使用される。アッセイを
実施する場合、血漿は、試薬パッドにより吸収されるよ
うに試薬パッドに適用され、それによって過酸化水素が
生成される。次に、過酸化水素を測定するために、通常
ホースラディシュベルオキシダーゼ及びクロモゲン（こ
こで該クロモゲンは検出可能なシグナル、通常光の吸収
をもたらす）を用いて、いづれかの技法が使用され得る
。

アッセイは、２種の吸収性の強いメンバー間で架橋とし
て作用するサンプルパッドを含浸することによって実施
され得る。第一の吸収性の強いメンバーは、輸送溶液を
受けるために作用し、そしてこれはアッセイに依存して
、反応成分を有していても良く又は有していなくても良
い、この第一の吸収性の強いメンバーは、流体をサンプ
ルパッドに移行する。第二の吸収性の強いメンバーは、
サンプルパッドからの輸送流体を受け、そしてアッセイ
測定領域にサンプルパッドからの輸送流体を移行するた
めに架橋として作用する。サンプルは、サンプルがパッ
ドに移行される場合、分離手段、通常サンプルパッドか
ら吸収性の強いメンバーへの移行を阻止する不活性非多
孔性フィルムにより、２種の吸収性の強いメンバーとの
相互作用を妨げられる。サンプルパッドにより受容され
、そしてアッセイ媒体に含まれるサンプルの量は、非湿
潤スクリーンを通して吸収剤量中への、パッドを飽和す
る量販上の流体の移行を付与することによって調節され
得る。サンプルパッドへのサンプルの添加及び１〜３０
分のインキュベーションの後、多孔性非湿潤性物質及び
吸収剤層が除去され、アッセイのためにサンプルの単独
の貯蔵所としてサンプルパッドを残す。

次の例は、例示的であって、限定するものではない。

〔実　験〕

乾燥試薬パッドは次のものを含む： 試薬：コレステロールエステラーゼ　０．１８μコレス
テロールオキシダーゼ　０．５０μ酵素 塩素酸ナトリウム Ｎｏｎ１ｄｅｔ　ＰＬ　１０” Ｍｅｇａ−１３” Ｎａｋタルトレート ニトロプルシド Ｎａ錫酸塩 Ｎａアジド １％　界面活性剤 １％ １％ ０．０２５Ｍ ０．０２５Ｍ ０．０２５Ｍ ０．０１％ 添加物 アラビアゴム ゼラチン Ｇａｎ　ｔｒｅｚ スクロース ２％ ０．５％ ０．５％ ５％ 酵素安定剤 方−汰：１０１１！のＨ，０□（３，２６〜４．６３ａ
Ｍ　）を、患者の血清１０μ！に添加し、そして１２　
Ｘ　７５ａｍの試験管中Ｇこおいて２０分間インキュベ
ートする。ｌｌ１１のホースラティシュヘルオキシダー
ゼ（ＨＲＰ）（２５ｇ／ｍＱ）　＆び４−Ｃｌ３−１−
ナフトール基質溶液（２００Ｉ１ｇ／　ｍｌ　）を添加
し、そして１０分後、最終点の色を測定する。

この方法で、Ｈ，０□回収率を測定する。

メー」−一表 パ　ド上で　　　　　　れた　　　による対　照３ ブール＃１ サンプル＃３３ サンプル＃３８ サンプル＃４ ９２．５ ６　　　　　　　　　　　Ｂ９．７ ４８　　　　　　　　　　９０．７ ２０　　　　　　　　　　９３．６ ３９　　　　　　　　　　８７．３ １、　問題のある血清サンプルは、評価された４０個の
サンプルのうち最低の回収されたＨｚＯ□を付与した。

２、安定剤は、２５ｍＭのナトリウムカリウムタルトレ
ート、２５ｍＭの錫酸ナトリウム、２５ｍＭのナトリウ
ムニトロプルシド及び０．０１％のアジ化ナトリウムで
ある。

３、使用される対照は、ＨＲＰ−基質溶液ＩＩｄｌに、
１０μの血清、次に１０１１１のＨ２Ｏ２を添加するこ
とによって作られた。最良に予測されるｕｚｏｔ回収率
は９２．５％である。試験されたすべてのサンプルは、
安定剤が存在する場合、この値にひじょうに接近した数
値を与えた。

方−１に：１０ｐｌの血清サンプル＃４を、個々の５個
のアッセイ用ストリッフリに添加し、そして１，２゜５
．１０及び１５分間インキュベートした。移動の高さを
測定し、そして記録した。下記データは、その移動の高
さがこの問題のある血清サンプルでさえ少なくとも１５
分間、安定することを示す。

１　　　　　　　　　　　　２４．５ ３　　　　　　　　　　　　２８．０ ５　　　　　　　　　　　　２５．０ １０　　　　　　　　　　　　２６．０１５　　　　　
　　　　　　　２５．０本：サンプルストリップは、次
のようにして調製される。

支持層は、０．０１インチの厚さのポリスチレン性硬質
裏材料から成る。３Ｍ　４４３の両面テープを、一端が
ら始まる第１の１０ｍｍストリップ、続いて２．５価の
空間、５ｍｍの幅を有する接着剤の第２層、続いて２．
５胴の空間として供給する。最後に、支持体の残存部分
を、８０Ｉｎ１１の幅、３Ｍ　４１５両面テープで被覆
する。３胴の穴を、サンプル負荷口を供給するために、
端から１５鵬で支持体を通してバンチする。

測定又は定量領域が、大きな積層されたシートからスト
リップを切断するために、７０ｍｍ及びいづれか便利な
長さの幅を有するＷｈａｔｍａｎ　３１ＥＴクロマトグ
ラフイ一紙のシートを配置することによって用意される
。

原液を、その測定領域に染料を付着するために調製する
。Ｎ−（ω−１，２−エチレンジアミンブチルカルボキ
サミド〕、Ｎ−メチルアニリンである変性されたＮ、Ｎ
−ジメチルアニリンの使用が特に興味あるものである。

そのジメチルアニリン（Ｄ　Ｍ　Ａ　）　Ｅ’ｆ’−導
体が、カルボニルジイミダゾールを用いる紙に結合され
る。その紙は、塩化メチレン中、０．２０Ｍのカルボニ
ルジイミダゾールに紙をソーキングし、続いて、塩化メ
チレン中、１．５■／ｄのＤＭＡ誘導体に紙をソーキン
グすることによって活性化される。

ジメチルアニリン類似体の共有結合に続いて、その紙を
、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン（Ｍ
ＢＴＨ）の０．５ｍｇ／ｒｒｄｌ？容液（０，１〜２　
■／ｍｌの範囲の濃度が有用であるけれども）にソータ
する。

過剰の溶液を、皿の一つの縁上にその紙をこすりつけ、
続いて強制空気対流炉中において５０°Ｃで約２５分間
、その紙を乾燥せしめることによってぬぐい取る。

紙は、支持体の一端から延びる測定領域において両面接
着剤層上に堅く積層される。反対の端で、ブリッジング
ストリップが支持体に固定される。その端から始まる第
１ストリツプは１３ＩＩＩｆｆ＋の長さであり、そして
接着剤にそって一端で固定され、そしてサンプルパッド
を約１ｍｍオーバーラツプする。第２ストリツプは１４
［ｌｌｌ１１の長さであり、そしてサンプルパッドを約
１薗オーバーラツプする。さらに、その第２ストリツプ
は、サンプルパッドから測定領域に延びる接着剤の第２
ストリツプ上に、その測定領域及びサンプルパッドの両
者を約１ｆｆｌＩ１１オーバーラツプしながら配置され
る。

サンプルパッドは便利には、セルロースクロマトグラフ
ィー祇から構成されるが、しかしガラス繊維紙、合成膜
又は他の適切な材料も使用され得る。便利には、そのパ
ッドは、５　ｗ　Ｘ　５　ｍｍである。

シートが組立てられた後、そのシートは、最終装置を供
給するために５−ｍｍのストリ・ノブに切断される。そ
のストリップは、現在、アッセイに容易に使用される。

酵素転換パッドのための固定化試薬は、次の配合物の１
つを含む。

１２．５％のスクロース・・・・・・・・・・・・・・
・・・・・・・・・・１０％のＮｏｎ１ｄｅｔ　Ｐ−４
０・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・
１０％の塩素酸ナトリウム・・・・・・・・・・・・・
・・・・・１０％のＭｅｇａ−８ １ＭのＮａＫタルトレート・・・・・・・・・・・・・
・・・・ＩＭのＮａニトロプルシド・・・・・・・・・
・・・・・・ＩＭの錫酸ナトリウム・・・・・・・・・
・・・・・・・・・・・・００１１１ １００μ！ ００Ｊ ３Ｉ ２５ｊｌ！ ５４ ２５１！１ ９．２．５％のアジ化ナトリウム・・・・・・・・・・
・・・・・Ｉ 合計 Ｏｍｆｌ 配置１すもλ： １．２０％のアラビアゴム・・・・・・・・・・・・・
・・・・・・・・・・・２．５％のゼラチン ３．５％のＧａｎｔｒｅｚ　ＡＮ−１４９・・・・・・
・・・・・・・・・・・・・・・４．５０％のスクロー
ス・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・
・・・５．１０％のＮｏｎ１ｄｅｔ　Ｐ−４０・・・・
・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・６、　１０
％の塩素酸ナトリウム・・・・・・・・・・・・・・・
・・・７．１０％のＭｅｇａ−８ １００μ１ ００Ｉ１１ ００ｔＩ１ １００μ１ ００４ １００μ！ ８３μ１ ９、１ＭのＮａニトロプルシド（Ｓｉｇｍａ）　−２５
ｕ１１０．１Ｍの錫酸ナトリウム（Ａｌｆａ）・・・・
・・・・・・・・　２５μ！１１．２．５％のアジ化ナ
トリウム（Ｓｉｇｍａ）・・・１２、　５００Ｕ／ｄの
コレステロールエステラーゼ・・・・・・　３６μ！ ４μ！ 合計　１０ｔｒｒ１ 本発明の組成物は、血液の成分の存在下で過酸化水素の
定量化を可能にするために、過酸化水素の安定化を付与
することは、上記結果から明らかである。この場合、ア
ッセイは、液相中で又は吸収性の強い支持体上のいずれ
かで実施され、ここで分析物に比例して生成される過酸
化水素の量が定量化される。本発明の組成物は、広範囲
の種類の分析物を測定するための正確且つ単純な方法を
付与するために、アッセイの他の状況を妨害しない。

本明細書に引用されるすべての出版物及び特許出願は、
引用により本明細書に組込まれる。

前述の発明は、明確に理解するために例示的且つ測的に
いくらか詳細に記載されているけれども、特許請求の範
囲内で修飾及び変更を行なうことができる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、検出可能な過酸化水素の還元をもたらす血液中の成
   分の存在下でアッセイにおける過酸化水素を測定するた
   めの方法であって： 前記過酸化水素と共に、錫酸塩、ニトロプルシド、ヒド
   ロキシル化されたカルボキシレートキレート剤及びカタ
   ラーゼインヒビターを含んで成る組成物の安定化量を含
   むことを含んで成る方法。 ２、過酸化水素を生成する酵素を用いるアッセイを含ん
   で成る請求項１記載の方法。 ３、前記酵素が、コレステロールオキシダーゼ、グルコ
   ースオキシダーゼ、尿酸オキシダーゼ、アルコールオキ
   シダーゼ又はキサンチンオキシダーゼである請求項２記
   載の方法。４、過酸化水素が、アッセイ媒体に存在する
   分析物の量に比例する量で生成される、血液サンプル中
   の分析物を測定するためのアッセイ方法であって： 前記サンプルに存在する分析物の量に比例する量で過酸
   化水素を生成するための試薬及び錫酸塩、ニトロプルシ
   ド、タルタレート及びアシドを含んで成る組成物の過酸
   化水素安定化量と共に前記サンプルを組合せ；そして 前記サンプルにおける分析物の量の表示として過酸化水
   素の量を測定することを含んで成る方法。 ５、前記分析物がコレステロールである請求項４記載の
   方法。 ６、前記分析物がグルコースである請求項４記載の方法
   。 ７、前記分析物がアルコールである請求項４記載の方法
   。 ８、錫酸塩、ニトロプルシド及びタルタレートを含んで
   成る組成物。 ９、約０．２〜５：０．２〜５：０．２〜５のモル比で
   それぞれ錫酸塩、ニトロプルシド及びタルタレートを含
   んで成る請求項８記載の組成物。 １０、吸収性の強い支持体上に含浸される請求項９記載
   の組成物。 １１、界面活性剤及び酵素安定剤をさらに含んで成る請
   求項８記載の組成物。