JPH0280956A - 免疫凝集反応の確認方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、体液中の抗原又は抗体の免疫学的検出方法に
関するものである。

更に詳しくは、基体表面上で抗原−抗体反応による凝集
状態を観察するスライド凝集反応による検出方法におい
て、その正確度を向とさせるために、生じた凝集が抗原
−抗体反応による凝集であるか否かを確認する方法であ
る。

［従来技術］ 尿、血清等体液中に存在する抗原又は抗体の免疫学的反
応を用いた検出法は、従来より行なわれており、中でも
抗原又は抗体を不溶性担体粒子に結合させた試薬と被検
液とをガラス、合成樹脂、紙等のスライド状あるいはプ
レート状等の基体表面上に適下し、抗原−抗体反応を行
なわせ、その凝集状態を観察する、いわゆるスライド凝
集反応による検出法が繁用されている。

上記、不溶性担体粒子としては、血球、ベントナイト、
コロジウム、カオリン等が用いられていた。最近では、
マイクロカプセルあるいはポリスチレン等の合成ラテッ
クス粒子が、目的に応じた粒径、比重に調節できること
、天然物質と比較して自然凝集による非特異反応を生じ
にくい等の理由により、好んで利用されている。

これら不溶性担体粒子と抗原又は抗体との感作法には、
　物理的吸着法　（シシガー　７シド　ブ＋１１９ッ　
；アメリカンジャーナル　才ブ　メヂイシシ　２１，１
９５６年）　あ　るいは化学的結合法が用いられる。こ
れらの方法によって、充分な検出感度を有する試薬を得
るため、種々検討が行なわレテイる。　　（ＵＳＰ　４
，０４５，３８４号公報、ＵＳＰ　　４０４６．７２３
号公報） しかし、感度を高くすると、非特異反応因子による非特
異凝集の生じる度合いも、又高くなることが知られてい
る。この非特異凝集を防止する為の種々の改良法が報告
されている。

すなわち、不溶性担体粒子の溶媒を工夫（特公昭５９−
２４３８７号公報）、抗原−抗体が反応する場の工夫（
特公昭６１−９４２号公報）、被検液にｆ過等の前処理
を施すことにより、非特異反応因子を反応系より除去す
る（特公昭５４−９０７８号公報）等である。

ｃ全１！１が解決しようとする問題・、γコしかしなが
ら、Ｊｌ特異凝集を起こす因子は不確定であり、これら
の下人を行なっても非特異反応因子の影響を完全に除く
ことはできないのが現状である。殊に、尿を被検体とす
るスライド等の基体表面１−での凝集反応による検出法
は、抗原−抗体反応以外の要因によるものを含め、非特
異凝集が生じ易く、ｉＥ！度において問題を有し、満足
のいくものではなかった。

従って、特別な試薬の工夫や、煩雑な被検体の前処理を
必要としないで正確度を向トさせる簡易な方法の出現が
９ノまれでいる。

［問題点を解決するための手段］ 本発明は、従来のスライド凝集反応によって生じる凝集
が、検出しよう七する抗原又は抗体による特異凝集であ
るか否かを、煩雑な１程をふむことなく確認する方法を
提供するものである６すなわち、本発明は検出しようと
する抗原又は抗体を含む尿、血清等の被検液をスラ・イ
ト状等の基体表面］二で凝集反応試薬と混合し、抗原−
抗体反応の結果生じる凝集像を観察し、判定する免疫ス
ライド凝集反応において、通常の一次判定後、凝集を生
じた反応系についてその水素イオン濃度（以下ｐＨと称
す）を３．０以下、あるいは９．０以−ヒに著しく変化
させること、及び／又はイオン強度を０．５Ｍ以上とす
ること、及び／又は高漕度のカオトロピックイオンを含
む化学物質を添加することによって、凝集が解離するか
否かを観察する二次判定を行なうことにより、先の一次
判定の凝集が抗原−抗体反応による特異凝集か、重なる
非特異凝集かを確認する方法である。

免疫反応による抗原と抗体の結合を解離する手段、それ
自体は公知である０例えば、一般の免疫血清字書（ｖｉ
方富雄、「理論血清学」、東京大学出版会、１９６８年
）に記載の公知技術、あるいは通常の７フイニテイーク
ロマトグラフイーで吸着した物質を溶出させるための技
術である。

しかしながらこれらの技術を、本発明の如き、免疫スラ
イド凝集反応の凝集を特定するために応用した例は、報
告されていない０本発明による方法の一つであるｐＨを
３．０以ドにするには、１１！酸等の強酸溶液を添加す
る。又９．０以上にするには水酸化ナトリウム等の強塩
基性を示す化学物質の溶液を添加することによって達成
できる。他の本発明の方法であるイオン強Ｉｆｆを０．
５Ｍ以上とするには、塩化ナトリウム等の高濃度の水溶
性の塩類を用いることができる。

更に、他の本発明の方法である高濃度のカオトロピック
イオンを含む化学物質を添加する方法に用いられる化学
物質としては１通常のアフィニティークロマトグラフィ
ーで吸着した物質を溶出させるために用いられているチ
オシアン酸ナトリウム、尿素、ドデシル硫酸ナトリウム
等を用いることができる。

本発明は、これらの方法の一つ、あるいはＭｌみ合わせ
ることによっても、その目的を達成することが可能であ
る。

以Ｆ、実施例に基づき、本発明の詳細な説明するが、こ
れにより本発明の範囲が限定されるものではない。

実施例１゜ ６種の被検尿について、市販の妊娠診断補助試薬［ツイ
ンクロンｈＣＧ　’栄研′」（栄研化学輛製：ツインク
ロンは登録商標）を使用し、その試薬の塗布されたスラ
イド反応板上の反応区域枠内に被検尿を２滴（ｔｏｏｐ
）滴下し、撹拌棒で混ぜ合わせ反応区域枠内に拡げ、２
分間ゆるやかにスライド反応板を動かした後、直ちにａ
実像を観察し、−次判定した。

判定は、肉眼的に凝集を認めた場合十と表示（妊娠）、
肉眼的に凝集を認めない場合−と表示（非妊娠）した。

次に、各々のスライド反応板の反応区域枠内にｌＮ＊酸
化ナトリウム溶液２５−を滴下し、再度１分間ゆるやか
にスライド反応板を動かした後、直ちに凝集像を観察し
、二次判定した。

判定は、−次判定と同様に肉眼的に凝集を認めた場合十
と表示、肉眼的に凝集を認めない場合−と表示した。そ
の結果を、第１表に示す。

以下余白 第１表の結果より、未発ＩＩＩの方法による二次判定に
より、−次判定で肉眼的に凝集を認めた被検尿の内、　
Ｎｏ、３並びに４の十と判定されたものは、凝集が解離
し、非特異凝集であったことが確認され総合判定は非妊
娠と判定できた。

実施例２゜ ６種の被検尿について、市販の妊娠診断補助試薬「ツイ
ンクロンｈＣＧ　’栄研゛」（栄研化学■製：ツインク
ロンは登録商標）を使用し、その試、・薬の塗布された
スライド反応板上の反応区域枠内に被検尿を２滴（１０
０ｕ）滴下し、撹拌棒で混ぜ合わせ、反応区域枠内に拡
げ、２分間ゆるやかにスライド反応板を動かした後、直
ちに凝集像を観察し、−次判定した０判定は、実施例１
と同様に行なった。

次に、各々のスライド反応板の反応区域枠内に８．０Ｍ
チオシアン酸ナトリウム溶液１００−を滴下し再度２分
間ゆるやかにスライドを動かした後直ちに凝集像を観察
し、二次判定した。

判定は、実施例１と同様に行なった。

その結果を、第２表に示す。

第２表の結果より、本発明の方法による二次判定により
、−次判定で肉眼的に凝集を認めた被検尿の内、　Ｎｏ
、３並びに４の十と判定されたものは、凝集が解離し、
非特異凝集であったことが確認され総合判定は非妊娠と
判定できた。

実施例３゜ ５種の被検尿を塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ８，２）
で希釈して２．５倍、５倍、１０倍、２０倍、４０倍、
８０倍、１６０倍の希釈液列を調製し、被検希釈法とす
る。

各々の被検希釈法１００−をキャピラリーを用いてスラ
イド反応板上の反応区域枠内に分注し、そこに１％抗Ｆ
　Ｄ　Ｐ　（Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ　ｄｅｇｒａｄａｔ
ｉｏｎ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ）抗体感作ポリスチレンラテ
ックス懸濁液２５−を滴下し、Ｗ！拌棒で混ぜ合わせ、
スライドの反応区域枠内に拡げ、２分間ゆるやかにスラ
イドを動かした後、直ちに凝集像を観察し、−次判定し
た０判定は、実施例１と同様に行なった。

次に、各々のスライドの反応区域枠内に０，５Ｎ水Ｍ　
化ナトリウ１、・　０．５Ｍｔ１！化ナトリウム溶液を
５０−滴ドし、１ｆｆＺ分間ゆるやかにスライドを動か
した後、直ちに凝集像をｉＳｌ察し二次判定した。

＝ｒＪ定は、実施例１と同様に行なった。

その結果を、第３表に示す。

以下余白 第３表中のＦＤＰｅ度（１１ｇ　／　ｍ１）　ハ、−次
判定の結果より、特異凝集と認められた最高希釈倍数（
Ｄ）を求め１次式により計算して得られた濃度を示す。

尿中ＦＤＰ濃度（囮／ｍ１）＝ｌＸＤ 第３表中の結果より、本発明の方法による二次判定によ
り、−次判定で肉眼的に凝集を認めた被検尿の内、Ｎｏ
、２．ｌびにＮ０１５の十と閂定されたものは、凝集が
解離し、特異凝集であったことが確認された。

実施例４ ４種の被検血清について、被検血清を塩化アンモニウム
緩衝液（ｐＨ８，２）で希釈して５倍、１０倍、２０倍
、４０倍、８０倍、１６０倍の希釈液列を調製し、被検
希釈血清とする。

各々の被検希釈血清１００１１Ａ’をキャピラリーを用
いてスライド反応板上の反応区域枠内に分注しそこに１
％抗Ｆ　Ｄ　Ｐ　（Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ　ｄｅｇｒａ
ｄａｔｉｏｎｐｒｏｄｕｃｔｓ）抗体感作ポリスチレン
ラテックス懸濁液２５−を滴ドし、攪拌棒で混ぜ合わせ
、スライドの反応区域枠内に拡げ、２分間ゆるやかにス
ライドを動かした後、直ちに凝集像を観察し、−次判定
した９判定は、実施例１と同様に行なった。

次に、各々のスライドの反応区域枠内に０．５Ｎ水酸化
ナトリウム・　３Ｍチオシアン酸ナトリウム溶液を５０
−滴下し、再度１分間ゆるやかにスライドを動かした後
、直ちに凝集像を観察し二次判定した。Ｎ定は、実施例
１と同様に行なった。

その結果を、第４表に示す。

以下余白 第４表中のＦＤＰｅ度（団／１）は、二次判定の結果よ
り、特異凝集と認められた最高希釈倍数（Ｄ）を求め１
次式により計算して（すられた濃度を示す。

血清中ＦＤＰ５度（ｐｇ　／　ｍ１）　−１Ｘ　Ｄ第４
表中の結果より、本発明の方法による二次目定により、
−次判定で肉限的に凝集を認めた被検尿の内、Ｎ０８２
の十と判定されたものは、凝集が解離し、特異凝集であ
ったことが確認された。

［発明の効果］ 各実施例から明らかなように１本発明の方法による二次
判定によれば、従来の一次判定のみの結果よりも、はる
かに正確度の高い結果が得ることができる。

本発明の簡易な確認方法によれば、従来の非特異凝集の
影響を避ける為、試薬の特別な改良や、煩雑な被検体の
前処理等を必要としないで、正確性を向上することを特
徴とする

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）所望の抗原又は抗体を含む被検液を基体表面上で凝
   集反応試薬と混合し、抗原−抗体反応の結果生じる凝集
   像を観察することからなる免疫スライド凝集反応におい
   て、凝集を生じた反応区域の水素イオン濃度を３．０以
   下、あるいは９．０以上とすることを特徴とする免疫凝
   集反応の確認方法 ２）凝集を生じた反応区域のイオン強度を０．５Ｍ以上
   とすることを特徴とする請求項１に記載の免疫凝集反応
   の確認方法 ３）凝集を生じた反応区域に、高濃度のカオトロピック
   イオンを含む化学物質を添加することを特徴とする請求
   項１に記載の免疫凝集反応の確認方法