JPH02667B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

〔産業上の利用分野〕 本発明は全多孔質の活性化担体に関する。さら
に詳しくは、主として高速アフイニテイクロマト
グラフイー用充填剤の前駆体として適する全多孔
質で硬質の活性化担体に関する。 生化学の領域で、蛋白質や酵素その他の生体物
質を、それを含む混合物から分離することは重要
な課題の一つであり、これまで多大の努力がはら
われてきた。 生体物質の分離する方法としては、現在多くの
方法が用いられている。たとえば(i)溶解度差を利
用する方法、(ii)電荷の差を利用する方法、(iii)分子
の大きさ、あるいは形状の差を利用する方法、(iv)
化学的または物理的親和力の差を利用する方法な
どが挙げられる。また生物学的に特異的親和性を
利用して分離、精製、除去する方法は、選択性が
高く、汎用されている。特にアフイニテイを示す
物質の一方を不溶性担体に固定化して他方を選択
的に分離するアフイニテイクロマトグラフイーは
操作性の点から広く普及している（千畑一郎、土
佐哲也、松尾雄志共著“アフイニテイクロマトグ
ラフイー”講談社参照）。 生物学的親和性を示す物質（以下、配位子分子
という）を担体に固定化するのは、共有結合によ
る方法が好ましい。配位子分子は担体上の活性基
に直接、共有結合させてもよいし、あるいは、ス
ペーサー分子と呼ばれる線状分子を、担体上の活
性基に共有結合させた後に、該スペーサー分子の
末端に配位子分子を共有結合させてもよい。どち
らの場合にも、アミノ基、カルボキシル基、水酸
基、チオール基等の活性水素を持つ求核反応基と
付加および／または置換反応により共有結合を生
ずる活性基が共有結合により担体に固定化され
た、いわゆる活性化担体が必要である。 活性化された担体は、(i)配位子分子またはスペ
ーサー分子を共有結合できるように活性基が存在
すること、(ii)配位子分子を直接、共有結合させる
場合に、その生物学的親和性を失なわずに結合で
きること、(iii)目的により、活性基密度を変化させ
得ること、(iv)配位子分子および／またはスペーサ
ー分子を結合してクロマトグラフイーを行なう場
合に、目的とする物質のみを特異的に吸着するよ
うに、担体の非特異吸着が少ないこと、(v)配位子
分子またはスペーサー分子を固定化する操作の際
に、担体が破壊されないこと、(vi)多孔質であるこ
と、(vii)クロマトグラフイーを行なう場合に、使用
する溶媒、変性剤、PHの変化、温度に耐えるこ
と、(viii)保存中に腐敗しないこと、などの特性が望
まれる。また、アフイニテイクロマトグラフイー
は、配位子分子に固定化された担体をカラムに充
填して行なわれることが多い。その場合には液体
を高流速で流せるように、十分な機械的強度が要
求される。 また、場合によつては、凍結乾燥してエチレン
オキサイド滅菌、熱滅菌や放射線滅菌を行なう必
要が生じるので、これらの滅菌によつて担体の化
学構造が破壊されないことが望ましい。 〔従来の技術〕 従来、かかる目的に対して、アガロース、セル
ロース等の天然の不溶性担体をブロムシアンで活
性化したものが多く用いられてきた。特に、アガ
ロースが広く用いられてきた（たとえば、商品名
セフアローズ、フアルマシア社、スウエーデン）。
しかし、アガロースは以下のような欠点を有す
る。 すなわち、まず、アガロースは保持し得る水の
量が極めて多く、湿潤時の強度が不十分なために
操作上の制約が多い。たとえば、活性化、固定化
等の操作中に破壊されたり、カラムに充填した場
合に、分離すべき物質を含む液体を高流速で流す
ことができない等の欠点を有する。 このような従来の活性化担体の欠点を克服した
活性化担体として、特開昭57−19003号公報で示
される全多孔質活性化ゲルがある。ここで示され
た活性化ゲルは活性基密度が、300〜3000μmol／
ｇと高いので、配位子分子を高密度に固定化で
き、たとえば、生体液中から特定成分を吸着除去
するのに好適とされている。 ここで、高速液体クロマトグラフイーにアフイ
ニテイクロマトグラフイーの原理を応用した高速
アフイニテイクロマトグラフイーは、目的成分に
特異的な相互作用を利用した吸着、溶出による分
析が可能なため、たとえば、特定の酵素に着目し
た臨床検査装置等に有効であると予想される。 〔発明が解決しようとする問題点〕 活性化担体を高速アフイニテイクロマトグラフ
イー用充填剤の前駆体として用いる場合、活性化
担体に固定化された配位子分子の量が必要以上に
多すぎると、分析対象物質との相互作用が強くな
りすぎ、吸着された物質が溶出しない、あるいは
溶出までに時間がかかるという問題が生じてく
る。活性基に結合される配位子分子の量を高める
ことのみが、必ずしもクロマトグラフイーの目的
に対し有利に働くものではないことは通常のアフ
イニテイークロマトグラフイーの場合にも指摘さ
れている（山崎誠、石井信一、岩井浩一共編“ア
フイニテイクロマトグラフイー”（講談社）参
照）。 〔問題点を解決するための手段及び作用〕 そこで、高速アフイニテイクロマトグラフイー
用充填剤（以下、充填剤という）の前駆体として
用いた場合に、特に有効である活性化担体を開発
すべく鉛意検討の結果、アルコール性水酸基1.0
〜14.0ｍmol／ｇ、活性基0.001〜250μmol／ｇ、
保持し得る水の量が0.5〜4.0ｇ／ｇ、比表面積が
５〜1000m²／ｇである架橋共重合体よりなる活性
化担体が好適であることを見い出し、本発明に至
つた。 本発明の活性化担体は、アルコール性水酸基を
1.0〜14.0ｍmol／ｇの範囲で含む。アルコール性
水酸基の中ではビニルアルコール単位に由来する
水酸基が好ましい。水酸基をこの範囲で含むこと
により、この活性化担体から得られる充填剤は親
水性を有し、水中において多くの水溶性物質に対
して疎水的吸着や分配を示さない。アルコール性
水酸基の量が1.0ｍmol／ｇ未満では吸着物質の
選択性が低下し、14.0ｍmol／ｇをこえると、担
体の機械的強度が低下すると共に吸着物質の選択
性が低下する。水酸基の量は、実用上は1.5〜
11.0ｍmol／ｇの範囲にあるのがよい。 水酸基の量は、水酸基を無水酢酸と反応させて
消費した無水酢酸の量、または活性化担体の重量
変化を測定することにより求めることができる。
このとき、活性基も反応する場合は、活性基を保
護した後、上記の方法により求めることができ
る。乾燥した活性化担体１ｇが１ｍmolの無水酢
酸と反応した時の水酸基の量を１ｍmol／ｇとす
る。 以下の物性測定においても、測定条件下で活性
基が反応する場合には、水酸基量の測定の時と同
様に活性基を保護して測定することにより物性を
知ることができる。 活性化担体中の活性基は、0.001〜250μmol／
ｇの範囲で存在する。活性基がこの範囲で存在す
ることにより、高速アフイニテイクロマトグラフ
イーの目的に適した充填剤をつくることができ
る。活性基が0.001μmol／ｇ未満では吸着力が低
すぎ、250μmol／ｇをこえると吸着力が強すぎる
ために脱着が円滑に進むように特定の操作を施す
か、特別の条件を設定することが必要となる。 活性基の密度は、たとえば、簡便な方法として
は、活性化担体とオリゴペプチドを接触させ、結
合したオリゴペプチドの量から求める方法がある
（R.Axen、S.Ernback、Eur.J.Biochem.、18、
351（1971）参照）。より簡便な方法としてオリゴ
ペプチドの代わりに６−アミノヘキサン酸のよう
なアミノ酸を接触させ、結合したアミノ酸の量を
滴定で求める方法も可能である。 本発明の活性化担体の活性基とは、配位子分子
またはスペーサー分子のアミノ基、カルボキシル
基、水酸基、チオール基等の活性水素を有する求
核反応基と置換および／または付加反応し得る基
を言う。 このような活性基の例としては、イミダゾリル
カルバメート基、イミドカーボネート基、シアネ
ートエステル基、エポキシ基、カーボネート基、
プロモアセチル基、ハロゲン化トリアジン基など
が挙げられ、好ましくは、イミダゾリルカルバメ
ート基、イミドカーボネート基、シアネートエス
テル基およびエポキシ基等であり、特に好ましく
は、イミダゾリルカルバメート基である。 活性化担体中には、単一種の活性基が結合して
いてもよく、２またはそれ以上の種類の活性基が
結合していてもよい。 本発明の活性化担体は架橋共重合体よりなる。
架橋構造は、エピクロルヒドリンやビスエポキシ
化合物が水酸基と結合して形成する構造も用い得
るが、トリアジン環を有する架橋性単量体単位に
よつて架橋された構造が好ましい。なかでもトリ
アリルイソシアヌレートやトリアリルシアヌレー
ト等のトリアジン環を有する架橋性単量体単位に
よつて架橋された構造が好ましい。トリアジン環
を有する架橋性単量体単位とは、次式(A)、(B)で示
される単量体が重合または共重合して形成する構
造を表わす。

【式】

【式】 （ただし、R₁、R₂およびR₃はそれぞれ独立に−
CH₂−CH＝CH₂、−CH₂−Ｃ≡CHまたは

〔実施例〕

以下の実施例において、本発明をさらに詳細に
説明するが、本発明は実施例に何ら限定されるも
のではない。 実施例 １ 酢酸ビニル100ｇ、トリアリルイソシアヌレー
ト45.4ｇ、酢酸ｎ−ブチル80ｇ、デカリン40ｇお
よび２，2′−アゾビスイソブチロニトリル3.4ｇ
よりなる均一混合液と、少量のポリビニルアルコ
ールおよびリン酸ナトリウムを溶解した水800ml
とを還流冷却器、窒素導入管、撹拌棒を備えた３
の三つ口フラスコに入れ十分撹拌したのち、65
℃で18時間、さらに75℃で５時間加熱した懸濁重
合を行ない粒状共重合体を得た。次に、過、水
洗、ついでアセトン抽出後、カセイソーダ65ｇを
溶解したメタノール２と共に還流冷却器、窒素
導入管、撹拌棒を備えた５三つ口フラスコ中で
15℃で20時間撹拌して共重合体のケン化反応を行
なつたのち粒子を過、水洗、さらに乾燥した。 該粒子10ｇを500mlのビーカーに入れ、モレキ
ユラーシーブ4Aで乾燥したジオキサン100ml、
１，1′−カルボニルジイミダゾール3.24ｇを加え
て撹拌しつつ室温で15分間反応を行ない、イミダ
ゾリルカルバメート基を活性基として有する活性
化担体とした。該活性化担体は、上記の乾燥ジオ
キサンで洗浄したのち、吸引過した。該活性化
担体の平均粒径は9.0μｍ、水酸基密度は4.9ｍ
mol／ｇ活性化担体、活性基密度は40μmol／ｇ
活性化担体、保水量は1.9ｇ水／ｇ活性化担体、
比表面積は35m²／ｇ活性化担体であつた。 なお、上記の物性値の測定は、該活性化担体の
活性基を６−アミノヘキサン酸と以下の方法で反
応させることにより保護して行なつた。すなわ
ち、６−アミノヘキサン酸26.2ｇを含む／Ｍ炭酸
ナトリウム水溶液（PH10.0）200mlに上記の吸引
過した活性化担体を加え、振盪しつつ４℃で25
時間反応させた。 実施例 ２ 実施例１で得られた粒状共重合体のケン化反応
を行なつたのちの粒子10ｇを500mlのビーカーに
入れ、モレキユラーシーブ4Aで乾燥したアセト
ン100ml、1.1′−カルボニルジイミダゾール4.05ｇ
を加えて撹拌しつつ室温で15分間反応を行ない、
イミダゾリルカルバメート基を活性基として有す
る活性化担体とした。実施例１と同様の方法で測
定した該活性化担体の活性基密度は119μmol／ｇ
活性化担体であつた。 実施例 ３ 実施例１で得られた活性化担体の活性基に、６
−アミノヘキサン酸を反応させることにより６−
アミノヘキサン酸を固定化した乾燥ポリマー２ｇ
を50mlビーカーに入れ、さらに、0.2M2−（Ｎ−
モルホリノ）エタンスルホン酸水溶液（PH4.75）
15ml、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプ
ロピル）カルボジイミド塩酸塩0.29ｇを加え、室
温で30分間撹拌した。この懸濁液にｐ−アミノベ
ンツアミジン塩酸塩25.8mgを加ええ、PHを4.75に
調整したのち、懸濁液を100mlの三角フラスコに
移し、室温で24時間振盪してスペーサー分子とし
て６−アミノヘキサン酸、配位子分子としてｐ−
アミノベンツアミジンを有する吸着体を得た。得
られた吸着体は、水、0.05N水酸化ナトリウムを
含む1M塩化ナトリウム水溶液、0.05N塩酸を含
む1M塩化ナトリウム水溶液、水の順で洗浄した。
洗液を回収してその292nｍにおける吸光度から
算出したｐ−アミノベンツアミジンの固定化量は
乾燥吸着体１ｇ当り13μmolであつた。 この吸着体を、パイレツクスガラス製カラム
（内径６mm×長さ10cm）に充填し、50ｍＭリン酸
ナトリウムと100ｍＭ塩化ナトリウムを含む水溶
液（PH7.4）を移動相として、室温、流速0.5ml／
minで牛トリブシン0.5μｇを注入したところ、ト
リプシン活性を持つ蛋白質は溶出しなかつた。続
いて移動相を50ｍＭリン酸ナトリウム、100ｍＭ
塩化ナトリウムおよび20ｍM6−アミノヘキサン
酸を含む水溶液（PH7.4）に切りかえると、トリ
プシン活性を持つ二つの蛋白質を主成分とする成
分が溶出した。 なお、移動相送液ポンプとしては、KHU26
１／２（協和精密(株)）、検出器としては、蛋白質の検
出にはRF−530（(株)島津製作所）励起波長285nｍ、
検出波長340nｍ、酵素活性の検出にはFD−110
（日本分光工業(株)）励起波長365nｍ、検出波長
460nｍを用いた。トリプシン活性の検出には、
合成基質ｔ−プトキシカルボニル−Ｌ−グルタミ
ル−Ｌ−リシル−Ｌ−リシン４−メチルクマリル
−７−アミドがトリプシンにより分解されること
により遊離される７−アミノ−４−メチルクマリ
ンのけい光を利用した。 実施例 ４ 実施例３で充填したカラムに、50ｍＭリン酸ナ
トリウムと100ｍＭ塩化ナトリウムを含む水溶液
（PH7.4）を移動相として、室温、流速0.5ml／min
でヒトプラスミノーゲン（ミドリ十字）10μｇを
高分子量型ウロキナーゼ（ミドリ十字）15Uを用
いて、３分間、37℃で活性化した混合物を注入し
た。酵素活性を持たないプラスミノーゲンが素通
り部分に溶出したのみであつたが、続いて移動相
を50ｍＭリン酸ナトリウム、100ｍＭ塩化ナトリ
ウムおよび20ｍM6−アミノヘキサン酸を含む水
溶液（PH7.4）に切りかえると、プラスミン活性
を持つ蛋白質が溶出した。なお、装置、合成基質
等は実施例３と同じものを用いた。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 重合体重量当り、ビニルアルコール単位に由
   来するアルコール性水酸基1.0〜14.0ｍmol／ｇ、
   活性基0.001〜250μmol／ｇを有し、保持し得る
   水の量が0.5〜4.0ｇ／ｇ、比表面積が５〜1000
   m²／ｇで、トリアジン環を有する架橋性単量体単
   位により架橋された架橋共重合体よりなる高速ア
   フイニテイクロマトグラフイー用充填剤のための
   全多孔質の活性化担体。