JPH0262234B2 - - Google Patents
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Description
本発明はアルスロバクター属に属し、コール酸
塩を基質として3α，7α−ジヒドロキシ−12−ケ
ト−5β−コラン酸及び／又はその塩を生産する
突然変異菌株に関する。
本発明者らは先に、高濃度のコール酸塩を唯一
の炭素源とする培地で生育可能なアルスロバクタ
ー属に属する新規な微生物が、高濃度コール酸塩
を基質として7α−ヒドロキシ−３，12−ジケト
−5β−コラン酸及び／又はその塩、3α，7α−ジ
ヒドロキシ−12−ケト−5β−コラン酸及び／又
はその塩並びに7α，12α−ジヒドロキシ−３−ケ
ト−5β−コラン酸及び／又はその塩を主要な代
謝産物として生産することを見出し、この微生物
をアルスロバクターCA−35（Arthrobacter CA
−35）菌株（微工研菌寄第5145号）と命名した
（特願昭54−124866号参照）。
本発明者らはコール酸塩を基質として3α，7β
−ジヒドロキシ−12−ケト−5β−コラン酸及
び／又はその塩を選択的に蓄積する微生物を得る
ため鋭意研究を重ねた結果、上記のアルスロバク
ターCA−35菌株に通常の突然変異処理、例えば、
紫外線、Ｘ線、γ線などの照射、Ｎ−メチル−
N′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、４−ニ
トロキノリン−Ｎ−オキサイド、アクリフラビ
ン、エチルメタンスルホネートなどの突然変異誘
起剤との接触などを施すことにより、コール酸塩
を基質として3α，7α−ジヒドロキシ−12−ケト
−5β−コラン酸及び／又はその塩を極めて選択
的に生産する突然変異菌株を分離することに成功
し、本発明に到達した。
このような突然変異菌株として次の菌株を挙げ
ることができる。
(1) アルスロバクターCA−35−A589−29−32
（Arthrobacter CA−35−A589−29−32）菌株
（微工研菌寄第5522号）
(2) アルスロバクターCA−35−A589−47
（Arthrobacter CA−35−A589−47）菌株（微
工研菌寄第5523号）
(3) アルスロバクターCA−35−A849
（Arthrobacter CA−35−A849）菌株（微工研
菌寄第5524号）
(4) アルスロバクターCA−35−Ａ−1071−15
（Arthrobacter CA−35−Ａ−1071−15）菌株
（微工研菌寄第5525号）
(5) アルスロバクターCA−35−Ａ−1448
（Arthrobacter CA−35−Ａ−1448）菌株（微
工研菌寄第5526号）
(6) アルスロバクターCA−35−Ａ−1475
（Arthrobacter CA−35−Ａ−1475）菌株（微
工研菌寄第5527号）
(7) アルスロバクターCA−35−Ａ−1766−15
（Arthrobacter CA−35−Ａ−1766−15）菌株
（微工研菌寄第5528号）
(8) アルスロバクターCA−35−Ｍ−965−３
（Arthrobacter CA−35−Ｍ−965−３）菌株
（微工研菌寄第5529号）
(9) アルスロバクターCA−35−Ｙ−37−12
（Arthrobacter CA−35−Ｙ−37−12）菌株
（微工研菌寄第5530号）
これらの突然変異菌株のうち、等にアルスロバ
クターCA−35−A589−29−32菌株及びアルスロ
バクターCA−35−A589−47菌株がコール酸塩か
ら高い変換率かつ高い選択率で3α，7α−ジヒド
ロキシ−12−ケト−5β−コラン酸及び／又はそ
の塩を生産する能力を有する。
なお、これらの突然変異菌株のうち、アルスロ
バクターCA−35−A589−29−32菌株、アルスロ
バクターCA−35−A589−47菌株、アルスロバク
ターCA−35−A849菌株、アルスロバクターCA
−35−Ａ−1071−15菌株、アルスロバクターCA
−35−Ａ−1448菌株、アルスロバクターCA−35
−Ａ−1475菌株、アルスロバクターCA−35−Ａ
−1766−15菌株及びアルスロバクターCA−35−
Ｍ−965−３菌株はアルスロバクターCA−35菌株
をＮ−メチル−N′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグア
ニジンと接触させることにより、またアルスロバ
クターCA−35−Ｙ−37−12菌株はアルスロバク
ターCA−35菌株に紫外線を照射することにより
各々得られた。これら突然変異菌株の具体的な取
得方法を後述の実施例に示す。
上記の新株のアルスロバクターCA−35菌株及
びその突然変異菌株のそれぞれの菌学的性質をア
ルスロバクター・シンプレツクスIAM1660菌株
の菌学的性質と対比して列挙すると次表のとおり
である。なお、アルスロバクターCA−35菌株は
岡山県倉敷市の土壌より分離し採集した。
The present invention relates to a mutant strain belonging to the genus Arthrobacter that produces 3α,7α-dihydroxy-12-keto-5β-cholanic acid and/or its salts using cholate as a substrate. The present inventors have previously demonstrated that a new microorganism belonging to the genus Arthrobacter that can grow in a medium with high concentrations of cholate as the sole carbon source, uses 7α-hydroxy- , 12-diketo-5β-cholanic acid and/or its salts, 3α,7α-dihydroxy-12-keto-5β-cholanic acid and/or its salts, and 7α,12α-dihydroxy-3-keto-5β-cholanic acid and We discovered that this microorganism produces /or its salt as a major metabolite, and we developed this microorganism into Arthrobacter CA-35 (Arthrobacter CA-35).
-35) strain (Feikoken Bibori No. 5145) (see Japanese Patent Application No. 124866/1983). The present inventors demonstrated that 3α, 7β using cholate as a substrate.
As a result of intensive research to obtain a microorganism that selectively accumulates -dihydroxy-12-keto-5β-cholanic acid and/or its salts, the above Arthrobacter CA-35 strain was subjected to conventional mutation treatments, such as ,
Irradiation with ultraviolet rays, X-rays, γ-rays, etc., N-methyl-
Using cholate as a substrate, 3α,7α- We have succeeded in isolating a mutant strain that produces dihydroxy-12-keto-5β-cholanic acid and/or its salts extremely selectively, and have arrived at the present invention. Examples of such mutant strains include the following strains. (1) Arthrobacter CA−35−A589−29−32
(Arthrobacter CA-35-A589-29-32) Strain (Feikoken Bacteria No. 5522) (2) Arthrobacter CA-35-A589-47
(Arthrobacter CA-35-A589-47) Strain (Feikoken Bacteria Collection No. 5523) (3) Arthrobacter CA-35-A849
(Arthrobacter CA-35-A849) Strain (Feikoken Bacteria No. 5524) (4) Arthrobacter CA-35-A-1071-15
(Arthrobacter CA-35-A-1071-15) Strain (Feikoken Bacteria No. 5525) (5) Arthrobacter CA-35-A-1448
(Arthrobacter CA-35-A-1448) Strain (Feikoken Bacteria Collection No. 5526) (6) Arthrobacter CA-35-A-1475
(Arthrobacter CA-35-A-1475) Strain (Feikoken Bacteria Collection No. 5527) (7) Arthrobacter CA-35-A-1766-15
(Arthrobacter CA-35-A-1766-15) Strain (Feikoken Bacteria No. 5528) (8) Arthrobacter CA-35-M-965-3
(Arthrobacter CA-35-M-965-3) Strain (Feikoken Bacteria No. 5529) (9) Arthrobacter CA-35-Y-37-12
(Arthrobacter CA-35-Y-37-12) Strain (February 2011 No. 5530) Among these mutant strains, Arthrobacter CA-35-A589-29-32 strain and Arthrobacter Strain CA-35-A589-47 has the ability to produce 3α,7α-dihydroxy-12-keto-5β-cholanic acid and/or its salts from cholate with high conversion and high selectivity. Among these mutant strains, Arthrobacter CA-35-A589-29-32 strain, Arthrobacter CA-35-A589-47 strain, Arthrobacter CA-35-A849 strain, and Arthrobacter CA
-35-A-1071-15 strain, Arthrobacter CA
-35-A-1448 strain, Arthrobacter CA-35
-A-1475 strain, Arthrobacter CA-35-A
-1766-15 strain and Arthrobacter CA-35-
M-965-3 strain was obtained by contacting Arthrobacter CA-35 strain with N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine, and Arthrobacter CA-35-Y-37-12 strain was Each strain was obtained by irradiating Slobacter CA-35 strain with ultraviolet light. Specific methods for obtaining these mutant strains will be shown in Examples below. The following table lists the mycological properties of the new Arthrobacter CA-35 strain and its mutant strains in comparison with the mycological properties of Arthrobacter simplex IAM1660 strain. The Arthrobacter CA-35 strain was isolated and collected from soil in Kurashiki City, Okayama Prefecture.
【表】【table】
【表】【table】
【表】【table】
【表】【table】
【表】【table】
【表】【table】
【表】【table】
【表】【table】
【表】【table】
【表】
コール酸ナトリウム塩に対する態度
アルスロバクターCA−35菌株は唯一の炭素源
としてコール酸ナトリウム塩を約20〜500ｇ／
の高濃度で含む培地で生育可能であり、しかもコ
ール酸ナトリウム塩を基質として7α−ヒドロキ
シ３，12−ジケト−5β−コラン酸及び／又はそ
のナトリウム塩、3α，7α−ジヒドロキシ−12−
ケト−5β−コラン酸及び又はそのナトリウム塩
並びに7α−12α−ジヒドロキシ−３−ケト−5β−
コラン酸及び／又はそのナトリウム塩を主要な代
謝産物として生産することができる。一方、前記
のアルスロバクターCA−35菌株の突然変異菌株
は唯一の炭素源としてコール酸ナトリウム塩を含
む培地では生育困難か又は全く生育しない。ま
た、アルスロバクター・シンプレツクス
IAM1660菌株は唯一の炭素源としてコール酸ナ
トリウム塩を10ｇ／含む培地で生育困難であ
る。
上記の菌学的性質を有するアルスロバクター
CA−35菌株の分類学上の位置をバージーズ・マ
ニユアル・オブ・デターミネイテイブ・バクテリ
オロジー第７版及び第８版により検索した。アル
スロバクターCA−35菌株は特に色素生産性、糖
の資化性及びコール酸ナトリウム塩に対する態度
において明らかにアルスロバクター・シンプレツ
クスIAM1660菌株と異なる。アルスロバクター
CA−35菌株は黄色〜クリーム色の色素を生産す
るが、アルスロバクター属に属する菌で色素生産
菌としてはアルスロバクター・オキシダンス、ア
ルスロバクター・オーレツクス及びアルスロバク
ター・ウレアフアシエンスが存在する。しかし、
アルスロバクター・オキシダンス及びアルスロバ
クター・オーレツセンスは通常グラム染色が陰性
であること及びデンプンの加水分解性を有してい
ることより、アルスロバクターCA−35菌株とは
異なる。また、アルスロバクター・ウレアフアシ
エンスは通常グラム染色が陰性であること及び硝
酸塩の還元性を有していないことより、アルスロ
バクターCA−35菌株とは異なる。従つて、アル
スロバクターCA−35菌株はアルスロバクター属
に属するいずれの標準種の菌とも異なつているこ
とより、アルスロバクター属に属する新菌種を構
成する微生物であると判断した。また、一般に突
然変異菌株はその親株と同じ種に属するものと考
えられており、前記のアルスロバクターCA−35
菌株の突然変異菌株はいずれもその親株と同じ新
菌種に属するものと判定した。
本発明に係る突然変異菌株は上記の菌株に限ら
れるものではなく、微生物の突然変異菌株でアル
スロバクター属に属し、コール酸塩を基質として
3α，7α−ジヒドロキシ−12−ケト−5β−コラン
酸及び又はその塩を生産するものであればいずれ
でもよい。
本発明に係る突然変異菌株による3α，7α−ジ
ヒドロキシ−12−ケト−5β−コラン酸及び／又
はその塩の生産は、本発明に係る突然変異菌株を
コール酸塩を含む培地に培養することにより行な
われる。コール酸塩は具体的にはコール酸のナト
リウム、カリウムなどのアルカリ金属の塩又はカ
ルシウム、マグネシウムなどのアルカリ土類金属
の塩であるが、好ましくはコール酸のアルカリ金
属塩である。コール酸塩はそのまま所定濃度の水
溶液に調整してそれを基質として用いてもよい
し、或いは水に予めコール酸と塩を形成し得る所
定量のアルカリ金属化合物又はアルカリ土類金属
化合物を溶かしたのち、その水溶液にコール酸を
加えて所定濃度に調整したコール酸塩を基質とし
て用いてもよい。コール酸塩の濃度は通常約１〜
500ｇ／の範囲でよいが、生産される3α，7α−
ジヒドロキシ−12−ケト−5β−コラン酸及び／
又はその塩の収量、培養条件及び操作性などの経
済的観点から約10〜500ｇ／の範囲が好ましく、
さらに20〜300ｇ／の範囲がより好ましい。培
養方法は原則的には一般微生物の培養で採用され
る方法と同じであるが、通常は液体培地による振
盪培養法又は通気撹拌培養法が用いられる。培地
としては本発明に係る突然変異菌株が資化利用で
きる栄養源を含有するものであればよい。炭素源
としてはアラビノースなどのペントース類；グル
コース、マンノース、フラクトース、ガラストー
スなどのヘキソース類；マルトースなどの二糖
類；澱粉分解物、糖アルコール類、グリセリンな
どの多価アルコール類；又はポリペプトン、ペプ
トン、肉エキス、麦芽エキス、コーンステイープ
リカー、酵母エキス、各種アミノ酸などが用いら
れる。また蓄素源としては、例えば硫酸アンモニ
ウム、塩化アンモニウム、燐酸アンモニウム、硫
酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム
などが用いられる。また、この他に燐酸水素２カ
リウム、燐酸２水素カリウム、硫酸マグネシウム
などの無機塩が添加される。培養条件に特徴はな
いが、通常25〜35℃で６時間〜５日間振盪培養又
は通気撹拌培養を行なう。
このようにして培養液中に蓄積された3α，7α
−ジヒドロキシ−12−ケト−5β−コラン酸及
び／又はその塩を分離・採取するには、まず培養
液中の菌体その他の不溶成分を濾過又は遠心分離
などにより分離除去し、得られた培養濾液又は上
清に例えば塩酸を加える。このようにして培養濾
液又は上清を酸性とすることにより3α，7α−ジ
ヒドロキシ−12−ケト−5β−コラン酸をはじめ
とするコール酸塩の変換物が沈澱する。ここで、
沈澱する3α，7α−ジヒドロキシ−12−ケト−5β
−コラン酸以外のコール酸塩の変換物として7α
−ヒドロキシ−３，12−ジケト−5β−コラン酸、
7α，12α−ジヒドロキシ−３−ケト−5β−コラン
酸などがある。なお、この際、未変換のコール酸
塩はコール酸として沈澱する。沈澱物を除去した
液に例えば酢酸エチルを加えて残存する上記のコ
ール酸塩の変換物並びに未変換のコール酸及び／
又はその塩を抽出し、しかるのち酢酸エチルを溜
去することによりほぼ完全に3α，7α−ジヒドロ
キシ−12−ケト−5β−コラン酸をはじめとする
コール酸塩の変換物を採取し、未変換のコール酸
及び／又はその塩を回収することができる。この
ようにして得られたコール酸塩の変換物並びに未
変換のコール酸及び／又はその塩を例えばメチル
エステルに変換後、シリカゲルカラムに吸着さ
せ、クロロホルム、クロロホルム／エタノールの
99／１容量比の混合液及びクロロホルム／エタノ
ールの97／３容量比の混合液により順次溶出させ
る。すなわち、クロロホルムにより7α−ヒドロ
キシ−３，12−ジケト−5β−コラン酸メチルエ
ステルを溶出させ、クロロホルム／エタノールの
99／１容量比の混合液によりまず7α，12α−ジヒ
ドロキシ−３−ケト−5β−コラン酸メチルエス
テルを溶出させ、ついで目的とする3α，7α−ジ
ヒドロキシ−12−ケト−5β−コラン酸のメチル
エステルを溶出させる。さらに、クロロホルム／
エタノールの97／３容量比の混合液によりコール
酸メチルエステルを溶出させる。得られた3α，
7α−ジヒドロキシ−12−ケト−5β−コラン酸メ
チルエステルは常法により加水分解することによ
り3α，7α−ジヒドロキシ−12−ケト−5β−コラ
ン酸とすることができる。
本発明に係る突然変異菌株により得られる3α，
7α−ジヒドロキシ−12−ケト−5β−コラン酸は
フアン・ミンロン還元反応に供することにより胆
石溶解剤として有用なケノデオキシコール酸
（CDCA）に容易に変換できる。
以下実施例及び応用例によつて本発明をさらに
詳細に説明する。
参考例
アルスロバクターCA−35菌株（微工研菌寄第
5145号）を次に示す方法で培養した。コール酸
100ｇ、硝酸アンモニウム2.0ｇ、燐酸２水素カリ
ウム2.0ｇ、燐酸水素２カリウム5.0ｇ、硫酸マグ
ネシウム・７水和物0.2ｇ、酵母エキス0.1ｇ及び
水酸化ナトリウム10ｇに蒸留水を加えて容量を１
に調整し、これを培地とした。この培地を500
ml容坂口フラスコに100ml宛10本に分注し、120℃
で15分間、蒸気殺菌を行なつた。予め上記の培地
と同じ培地で試験管振盪機にて２日間増殖させた
種菌を上記の500ml容坂口フラスコあたり10ml宛
添加し、２日間振盪培養した。培養後、これらの
培養液を集め、遠心分離機で菌体を除去後、得ら
れた培養上清に塩酸を添加して該上清を塩酸酸性
にするとコール酸塩の変換物及び未変換コール酸
が沈澱した。この沈澱物を採取し、残りの溶液を
酢酸エチル１で抽出し、ロータリー・エバポレ
ーターで酢酸エチルを溜去後、得られた残存物を
先の沈澱物と合わせることにより、85ｇのコール
酸塩変換物及び未変換コール酸の混合物を得た。
この混合物の極く一部を取り、これにメタノール
を加えて１％溶液とし、この溶液10μをミクロ
ボンダパツクＣ−18カラムを備えた高速液体クロ
マトグラフイー（米国ウオーターズ社製、HLC
−GPC−244型）に注入した。移動相としてPH2.5
に調整した水／メタノールの30／70容量比の混合
液を流速１ml／分で流し、検出を屈折率方式で行
なつたところ第１図のクロマトグラムが得られ
た。このクロマトグラムにおけるピークＡ、ピー
クＢ、ピークＣ及びピークＤは標準品のピークと
照合することにより各々7α−ヒドロキシ−３，
12−ジケト−5β−コラン酸、3α，7α−ジヒドロ
キシ−12−ケト−5β−コラン酸、7α，12α−ジヒ
ドロキシ−３−ケト−5β−コラン酸及びコール
酸のものと一致した。また、これらのピークＡ、
ピークＢ及びピークＣの各々の部分に相当する化
合物を分取し、マススペクトル、赤外線吸収スペ
クトル及びNMRスペクトルにより化合物の構造
確認を行なつたところ、それぞれ上記の7α−ヒ
ドロキシ−３，12−ジケト−5β−コラン酸、3α，
7α−ジヒドロキシ−12−ケト−5β−コラン酸及
び7α，12α−ジヒドロキシ−３−ケト−5β−コラ
ン酸であつた。なお、ピークＡ、ピークＢ及びピ
ークＣの各々の部分に相当する化合物の赤外線吸
収スペクトル（Ａ，Ｂ及びＣ）はメチルエステル
化後の化合物についてのものであり、それらを標
準品の赤外線吸収スペクトル（A′，B′及びC′）
と対比してそれぞれ第２図、第３図及び第４図に
表示する。さらに、分取したクロマトグラムのピ
ークＡ、ピークＢ及びピークＣの部分に相当する
化合物をメチルエステル化したのち融点を測定す
ると次表に示すとおりであつた。[Table] Attitude towards sodium cholate The Arthrobacter strain CA-35 consumes about 20-500 g of sodium cholate as the sole carbon source.
7α-hydroxy 3,12-diketo-5β-cholanic acid and/or its sodium salt, 3α,7α-dihydroxy-12-
Keto-5β-cholanic acid and or its sodium salt and 7α-12α-dihydroxy-3-keto-5β-
Collanic acid and/or its sodium salt can be produced as the main metabolite. On the other hand, the mutant strain of Arthrobacter CA-35 described above grows poorly or does not grow at all in a medium containing sodium cholate as the sole carbon source. Also, Arthrobacter simplex
The IAM1660 strain has difficulty growing in a medium containing 10 g/sodium cholate as the sole carbon source. Arthrobacter with the above mycological properties
The taxonomic position of the CA-35 strain was searched using Virgie's Manual of Determinative Bacteriology, 7th and 8th editions. The Arthrobacter strain CA-35 clearly differs from the Arthrobacter simplex IAM1660 strain, particularly in pigment production, sugar assimilation, and attitude toward sodium cholate. Arthrobacter
The CA-35 strain produces a yellow to cream-colored pigment, and pigment-producing bacteria belonging to the genus Arthrobacter include Arthrobacter oxydans, Arthrobacter aurechus, and Arthrobacter ureafaciens. exist. but,
Arthrobacter oxydans and Arthrobacter auretuscens are different from the Arthrobacter CA-35 strain because they are usually negative in Gram staining and have the ability to hydrolyze starch. Furthermore, Arthrobacter ureafaciens is different from the Arthrobacter CA-35 strain because Gram staining is usually negative and it does not have nitrate reducing properties. Therefore, since the Arthrobacter strain CA-35 is different from any standard species belonging to the genus Arthrobacter, it was determined that it is a microorganism constituting a new species belonging to the genus Arthrobacter. Additionally, mutant strains are generally considered to belong to the same species as their parent strains, and the above-mentioned Arthrobacter CA-35
All mutant strains were determined to belong to the same new bacterial species as their parent strains. The mutant strain according to the present invention is not limited to the above-mentioned strains, but is a mutant strain of a microorganism that belongs to the genus Arthrobacter and uses cholate as a substrate.
Any material that produces 3α,7α-dihydroxy-12-keto-5β-cholanic acid and/or a salt thereof may be used. Production of 3α,7α-dihydroxy-12-keto-5β-cholanic acid and/or its salt by the mutant strain of the present invention can be achieved by culturing the mutant strain of the present invention in a medium containing cholate. It is done. Specifically, the cholate is a salt of an alkali metal such as sodium or potassium, or a salt of an alkaline earth metal such as calcium or magnesium, and preferably an alkali metal salt of cholic acid. Cholate may be prepared as is into an aqueous solution of a predetermined concentration and used as a substrate, or a predetermined amount of an alkali metal compound or alkaline earth metal compound that can form a salt with cholic acid is dissolved in water in advance. Thereafter, cholic acid may be added to the aqueous solution to adjust the concentration to a predetermined concentration, and the cholate salt may be used as a substrate. The concentration of cholate is usually about 1 to
The amount may be within the range of 500g/, but the amount of 3α, 7α− produced
dihydroxy-12-keto-5β-cholanic acid and/or
or its salt, from an economical point of view such as yield, culture conditions, and operability, preferably in the range of about 10 to 500 g/,
More preferably, the amount is in the range of 20 to 300 g/. The culture method is basically the same as that used for culturing general microorganisms, but usually a shaking culture method or an aerated agitation culture method using a liquid medium is used. Any medium may be used as long as it contains a nutrient source that can be utilized by the mutant strain of the present invention. Carbon sources include pentoses such as arabinose; hexoses such as glucose, mannose, fructose, and galstose; disaccharides such as maltose; starch decomposition products, sugar alcohols, and polyhydric alcohols such as glycerin; or polypeptone, peptone, and meat. Extract, malt extract, cornstarch liquor, yeast extract, various amino acids, etc. are used. Further, as the pixel storage source, for example, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium sulfate, sodium nitrate, potassium nitrate, etc. are used. In addition, inorganic salts such as dipotassium hydrogen phosphate, potassium dihydrogen phosphate, and magnesium sulfate are added. Although there are no specific culture conditions, shaking culture or aerated agitation culture is usually performed at 25 to 35°C for 6 hours to 5 days. 3α and 7α accumulated in the culture medium in this way
- To separate and collect dihydroxy-12-keto-5β-cholanic acid and/or its salts, first remove the bacterial cells and other insoluble components in the culture solution by filtration or centrifugation, and then For example, add hydrochloric acid to the filtrate or supernatant. By acidifying the culture filtrate or supernatant in this manner, converted products of cholate, including 3α,7α-dihydroxy-12-keto-5β-cholanic acid, are precipitated. here,
3α,7α-dihydroxy-12-keto-5β precipitates
-7α as a converted product of cholate other than colanic acid
-hydroxy-3,12-diketo-5β-cholanic acid,
Examples include 7α,12α-dihydroxy-3-keto-5β-cholanic acid. In addition, at this time, unconverted cholate is precipitated as cholic acid. For example, by adding ethyl acetate to the solution from which the precipitate has been removed, the remaining converted product of the above-mentioned cholate and unconverted cholic acid and/or
or its salt, and then distilling off the ethyl acetate to almost completely collect the converted products of cholate, including 3α,7α-dihydroxy-12-keto-5β-cholanic acid, and remove the unconverted cholate. of cholic acid and/or its salts can be recovered. The thus obtained converted product of cholate and unconverted cholic acid and/or its salts are converted into, for example, methyl ester, and then adsorbed onto a silica gel column, and then chloroform, chloroform/ethanol, etc.
It is sequentially eluted with a 99/1 volume ratio mixture and a 97/3 volume ratio mixture of chloroform/ethanol. That is, 7α-hydroxy-3,12-diketo-5β-cholanic acid methyl ester was eluted with chloroform, and 7α-hydroxy-3,12-diketo-5β-cholanic acid methyl ester was eluted with chloroform/ethanol.
First, 7α,12α-dihydroxy-3-keto-5β-cholanic acid methyl ester is eluted using a mixed solution with a volume ratio of 99/1, and then the target methyl 3α,7α-dihydroxy-12-keto-5β-cholanic acid is eluted. Elute the ester. Furthermore, chloroform/
Cholic acid methyl ester is eluted with a mixture of ethanol in a 97/3 volume ratio. Obtained 3α,
7α-dihydroxy-12-keto-5β-cholanic acid methyl ester can be converted into 3α,7α-dihydroxy-12-keto-5β-cholanic acid by hydrolysis using a conventional method. 3α obtained by the mutant strain according to the present invention,
7α-dihydroxy-12-keto-5β-cholanic acid can be easily converted to chenodeoxycholic acid (CDCA), which is useful as a gallstone dissolving agent, by subjecting it to the Huang-Minlong reduction reaction. The present invention will be explained in more detail below with reference to Examples and Application Examples. Reference example: Arthrobacter strain CA-35
No. 5145) was cultured using the following method. cholic acid
Add distilled water to 100 g, ammonium nitrate 2.0 g, potassium dihydrogen phosphate 2.0 g, dipotassium hydrogen phosphate 5.0 g, magnesium sulfate heptahydrate 0.2 g, yeast extract 0.1 g, and sodium hydroxide 10 g to reduce the volume to 1.
This was used as a culture medium. 500% of this medium
Dispense into 10 bottles of 100ml each into Sakaguchi flasks and heat at 120°C.
Steam sterilization was performed for 15 minutes. Inoculum, which had been previously grown in the same medium as the above medium for 2 days in a test tube shaker, was added to 10 ml per 500 ml Sakaguchi flask, and cultured with shaking for 2 days. After culturing, these culture fluids are collected, and after removing the bacterial cells with a centrifuge, hydrochloric acid is added to the obtained culture supernatant to make the supernatant acidic with hydrochloric acid, resulting in converted and unconverted cholate. Acid precipitated. This precipitate was collected, the remaining solution was extracted with 1 part of ethyl acetate, the ethyl acetate was distilled off using a rotary evaporator, and the resulting residue was combined with the previous precipitate to convert 85 g of cholate. A mixture of cholic acid and unconverted cholic acid was obtained.
Take a small portion of this mixture, add methanol to it to make a 1% solution, and apply 10μ of this solution to a high performance liquid chromatography (HLC, manufactured by Waters Co., USA, equipped with a Microbondapak C-18 column).
-GPC-244 type). PH2.5 as mobile phase
A mixed solution of water/methanol at a volume ratio of 30/70, adjusted to 30/70, was flowed at a flow rate of 1 ml/min, and detection was performed using the refractive index method, and the chromatogram shown in FIG. 1 was obtained. Peak A, peak B, peak C, and peak D in this chromatogram were compared with the peaks of the standard product, and 7α-hydroxy-3, 7α-hydroxy-3, and
It was consistent with that of 12-diketo-5β-cholanic acid, 3α,7α-dihydroxy-12-keto-5β-cholanic acid, 7α,12α-dihydroxy-3-keto-5β-cholanic acid, and cholic acid. In addition, these peaks A,
Compounds corresponding to each portion of peak B and peak C were separated and the structures of the compounds were confirmed by mass spectra, infrared absorption spectra, and NMR spectra. -5β-cholanic acid, 3α,
They were 7α-dihydroxy-12-keto-5β-cholanic acid and 7α,12α-dihydroxy-3-keto-5β-cholanic acid. In addition, the infrared absorption spectra (A, B, and C) of the compound corresponding to each part of peak A, peak B, and peak C are for the compound after methyl esterification, and they are compared with the infrared absorption spectrum of the standard product. (A′, B′ and C′)
The figures are shown in FIGS. 2, 3, and 4 in comparison. Furthermore, the compounds corresponding to peak A, peak B, and peak C in the fractionated chromatogram were methyl esterified, and the melting points were measured as shown in the following table.
【表】
第１図のクロマトグラムの面積比から得られた
コール酸塩変換物の収量及び未変換コール酸の残
存量を算出すると次表に示すとおりである。[Table] The yield of the converted cholate and the remaining amount of unconverted cholic acid obtained from the area ratio of the chromatogram shown in FIG. 1 are calculated as shown in the following table.
【表】
実施例 １
アルスロバクターCA−35−Ｍ−965−３菌株
（微工研菌寄第5529号）の取得
培地１（組成：水酸化ナトリウム0.5％、コール
酸5.0％、ペプトン0.5％、酵母エキス0.5％、塩化
ナトリウム0.5％及び寒天1.5％）のスラントに生
育させたアルスロバクターCA−35菌株の１白金
耳を、予め試験管（内径21mm、長さ200mm）内に
準備した培地２（組成：水酸化ナトリウム１％、
コール酸10％、硝酸アンモニウム0.2％、燐酸２
水素カリウム0.2％、燐酸１水素カリウム0.5％、
硫酸マグネシウム・７水和物0.02％及び酵母エキ
ス0.01％）の10mlに植菌し、30℃で24時間振盪培
養した。この培養液の0.3mlを予め試験管（内径
21mm、長さ200mm）に準備した培地３（組成：水酸
化ナトリウム0.05％、コール酸0.5％、グルコー
ス0.5％、硝酸アンモニウム0.2％、燐酸２水素カ
リウム0.2％、燐酸１水素カリウム0.5％、硫酸マ
グネシウム・７水和物0.02％及び酵母エキス0.01
％）の10mlに加え、30℃で15〜16時間振盪培養し
た。ついで、この対数増殖期にある菌体を0.45μ
のメンブランフイルターで無菌的に濾過集菌し、
0.1M燐酸塩緩衝液（PH7.0）2.0mlで洗滌後、同じ
緩衝液25mlに懸濁させた。この菌懸濁液４mlを試
験管（内径21ml、長さ200mm）に入れ、これに終
濃度が50μｇ／mlになるようにＮ−メチル−N′−
ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンを添加し、30℃
で45分間振盪することによつて突然変異処理を行
なつた。なお、この処理条件下でのアルスロバク
ターCA−35菌株の死滅率は約80％であつた。突
然変異処理を施した菌体を0.45μのメンブランフ
イルターで無菌的に濾過集菌し、0.1M燐酸塩緩
衝液（PH7.0）20mlで洗滌後、同じ緩衝液25mlに
懸濁させた。得られた菌懸濁液を滅菌した生理食
塩水で希釈し、それを培地４（組成：水酸化ナト
リウム0.1％、コール酸1.0％、硝酸アンモニウム
0.2％、燐酸２水素カリウム0.2％、燐酸１水素カ
リウム0.5％、硫酸マグネシウム・７水和物0.02
％、酵母エキス0.01％及び寒天1.5％）の寒天平
板上に300〜500個のコロニーを出現させるように
塗布したのち、30℃で４日間培養した。出現した
コロニー中の極小コロニーを単離し、培地５（組
成：ペプトン0.5％、酵母エキス0.5％、塩化ナト
リウム0.5％及び寒天1.5％）の寒天平板上で30℃
で24時間培養した。ここに出現したコロニーを培
地４の寒天平板上にレプリカし、30℃で20時間培
養した。この培地４で生育しないコロニーに対応
する上記の培地５のコロニーを培地６（組成：水
酸化ナトリウム0.1％、コール酸1.0％、ペプトン
0.5％、酵母エキス0.5％、塩化ナトリウム0.5％及
び寒天1.5％）のスラントにそれぞれ移し、30℃
で24時間培養した。このスラントから１白金耳の
菌体を予め試験管（内径21mm、長さ200mm）内に
準備した培地７（組成：水酸化ナトリウム0.5％、
コール酸5.0％、グルコース0.5％、硝酸アンモニ
ウム0.2％、燐酸２水素カリウム0.2％、燐酸１水
素カリウム0.5％、硫酸マグネシウム・７水和物
0.02％及び酵母エキス0.01％）の10mlに植菌し、
30℃で３日間振盪培養した。得られたそれぞれの
培養液中の生産物を薄層クロマトグラフイーで検
定し、目的とする3α，7α−ジヒドロキシ−12−
ケト−5β−コラン酸及び／又はその塩を選択的
に蓄積する１菌株を見出し、これをアルスロバク
ターCA−35−Ｍ−965−３菌株と命名した。
以後、この突然変異菌株の取得方法を総括して
単にNTG処理と称する。
実施例 ２
アルスロバクターCA−35−A849菌株（微工研
菌寄第5524号）の取得
実施例１で得られたアルスロバクターCA−35
−Ｍ−965−３菌株を親株とし、これにNTG処理
を施すことにより3α，7α−ジヒドロキシ−12−
ケト−5β−コラン酸及び／又はその塩を選択的
に蓄積する３菌株を見出し、これらをそれぞれア
ルスロバクターCA−35−A589菌株、アルスロバ
クターCA−35−A849菌株及びアルスロバクター
CA−35−Ａ−1071菌株と命名した。
実施例３及び４
アルスロバクターCA−35−A589−29−32菌株
（微工研菌寄第5522号）及びアルスロバクター
CA−35−A589−47菌株（微工研菌寄第5523
号）の取得
実施例２で得られたアルスロバクターCA−35
−A589菌株のコロニーから２個の優良菌株を単
離し、これらをそれぞれアルスロバクターCA−
35−A589−29−32菌株及びアルスロバクターCA
−35−A589−47菌株と命名した。
実施例 ５
アルスロバクターCA−35−Ａ−1071−15菌株
（微工研菌寄第5525号）の取得
実施例２で得られたアルスロバクターCA−35
−Ａ−1071菌株のコロニーから１個の優良菌株を
単離し、これをアルスロバクターCA−35−Ａ−
1071−15菌株と命名した。
実施例 ６
アルスロバクターCA−35−Ａ−1448菌株（微
工研菌寄第5526号）の取得
実施例２で得られたアルスロバクターCA−35
−A849菌株を親株とし、これにNTG処理を施す
ことにより3α，7α−ジヒドロキシ−12−ケト−
5β−コラン酸及び／又はその塩を選択的に蓄積
する複数個の菌株を見出し、それらの中の最も優
良な菌株をアルスロバクターCA−35−Ａ−1448
菌株と命名した。
実施例 ７
アルスロバクターCA−35−Ａ−1475菌株（微
工研菌寄第5527号）の取得
実施例６で得られたアルスロバクターCA−35
−Ａ−1448菌株を親株とし、これにNTG処理を
施すことにより3α，7α−ジヒドロキシ−12−ケ
ト−5β−コラン酸及び／又はその塩を選択的に
蓄積する複数個の菌株を見出し、それらの中の最
も優良な菌株をアルスロバクターCA−35−Ａ−
1475菌株と命名した。
実施例 ８
アルスロバクターCA−35−Ａ−1766−15菌株
（微工研菌寄第5528号）の取得
実施例２で得られたアルスロバクターCA−35
−Ａ−1071菌株を親株とし、これにNTG処理を
施すことにより3α，7α−ジヒドロキシ−12−ケ
ト−5β−コラン酸及び／又はその塩を選択的に
蓄積する複数個の菌株を見出し、それらの中の最
も優良な菌株をアルスロバクターCA−35−Ａ−
1766菌株と命名した。得られたアルスロバクター
CA−35−Ａ−1766菌株のコロニーから１個の優
良菌株を単離し、これをアルスロバクターCA−
35−Ａ−1766−15菌株と命名した。
実施例 ９
アルスロバクターCA−35−Ｙ−37−12菌株
（微工研菌寄第5530号）の取得
培地１のスラントに生育させたアルスロバクタ
ーCA−35菌株の１白金耳を、予め試験管（内径
21mm、長さ200mm）内に準備した10mlの培地２に
植菌し、30℃で20時間振盪培養した。この培養液
を無菌的に遠心分離（５℃、10000r.p.m.，５分
間）することにより集菌し、これを滅菌水10mlに
懸濁させた。得られた菌懸濁液を、15Wの紫外線
灯（波長2537Å）をつり下げた無菌箱内でその灯
下約27cmのところに設置した内径7.5cmのシヤー
レ内に入れ、10分間紫外線を照射させることによ
り突然変異処理を行なつた。なお、この処理条件
下でのアルスロバクターCA−35菌株の死滅率は
約99.9％であつた。突然変異処理を施した菌体を
0.45μのメンブランフイルターで無菌的に濾過集
菌し、0.1M燐酸塩緩衝液（PH7.0）20mlで洗滌
後、同じ緩衝液25mlに懸濁させた。得られた菌懸
濁液を滅菌した生理食塩水で希釈し、それを前述
のNTG処理におけると同様に培地４〜７を用い
て培養を繰返すことにより、3α，7α−ジヒドロ
キシ−12−ケト−5β−コラン酸及び／又はその
塩を選択的に蓄積する１菌株を見出し、これをア
ルスロバクターCA−35−Ｙ−37−12菌株と命名
した。
応用例 １
アルスロバクターCA−35−A589−29−32菌株
（微工研菌寄第5522号）の培養
アルスロバクターCA−35−A589−29−32菌株
を次に示す方法で培養した。コール酸100ｇ、硝
酸アンモニウム2.0ｇ、燐酸２水素カリウム2.0
ｇ、燐酸水素２カリウム5.0ｇ、硫酸マグネシウ
ム・７水和物0.2ｇ、酵母エキス0.1ｇ及び水酸化
ナトリウム10ｇに水道水を加えて容量を800mlに
調整した。この溶液を120℃で15分間、蒸気殺菌
した。また別途に、グルコース５ｇを200mlの水
道水に溶解し、この溶液を110℃で30分間、蒸気
殺菌し、冷却後、上記の溶液に加えて容量を１
に調整し、これを培地とした。次いで、この培地
を500ml容坂口フラスコに100ml宛10本に無菌的に
分注した。予め上記の培地と同じ培地で試験管振
盪機にて14時間増殖させた種菌の培養液を上記の
500ml容坂口フラスコあたり２ml宛添加し、３日
間振盪培養した。培養後、これらの培養液を集
め、遠心分離機で菌体を除去後、得られた培養上
清に塩酸を添加して該上清を塩酸酸性するとコー
ル酸塩の変換物及び未変換コール酸が沈澱した。
この沈澱物を採取し、残りの溶液を酢酸エチル１
で抽出し、ロータリー・エバボレーターで酢酸
エチルを溜去後、得られた残存物を先の沈澱物と
合わせることにより、99.3ｇのコール酸塩変換物
及び未変換コール酸の混合物を得た。この混合物
の極く一部を取り、これにメタノールを加えて２
％溶液とし、この溶液10μをミクロボンダパツ
クＣ−18カラムを備えた高速液体クロマトグラフ
イー（米国ウオーターズ社製、HLC−GPC−244
型）に注入した。移動相としてPH4.0に調整した
水／メタノールの30／70容量比の混合液を流速１
ml／分で流し、検出を屈折率方式で行なつたとこ
ろ第５図のクロマトグラムが得られた。このクロ
マトグラムにおけるピークＢ及びピークＤは標準
品のピークと照合することにより各々3α，7α−
ジヒドロキシ−12−ケト−5β−コラン酸及びコ
ール酸のものと一致した。また、ピークＢの部分
に相当する化合物を分取し、参考例と同様にして
そのマススペクトル、赤外線吸収スペクトル及び
NMRスペクトルによる化合物の構造確認を行な
つたところ、上記の3α，7α−ジヒドロキシ−12
−ケト−5β−コラン酸であつた。
第５図のクロマトグラムの面積比から、得られ
た3α，7α−ジヒドロキシ−12−ケト−5β−コラ
ン酸の収量及び未変換コール酸の残存量を算出す
ると次表に示すとおりである。[Table] Example 1 Obtaining Arthrobacter CA-35-M-965-3 strain (Feikoken Bibori No. 5529) Medium 1 (composition: sodium hydroxide 0.5%, cholic acid 5.0%, peptone 0.5% , yeast extract 0.5%, sodium chloride 0.5%, and agar 1.5%) culture medium prepared in advance in a test tube (inner diameter 21 mm, length 200 mm). 2 (Composition: 1% sodium hydroxide,
Cholic acid 10%, ammonium nitrate 0.2%, phosphoric acid 2
Potassium hydrogen 0.2%, potassium monohydrogen phosphate 0.5%,
The cells were inoculated into 10 ml of 0.02% magnesium sulfate heptahydrate and 0.01% yeast extract, and cultured with shaking at 30°C for 24 hours. Pour 0.3 ml of this culture solution into a test tube (inner diameter
21 mm, length 200 mm) prepared in medium 3 (composition: sodium hydroxide 0.05%, cholic acid 0.5%, glucose 0.5%, ammonium nitrate 0.2%, potassium dihydrogen phosphate 0.2%, potassium monohydrogen phosphate 0.5%, magnesium sulfate. Heptahydrate 0.02% and yeast extract 0.01
%) and cultured with shaking at 30°C for 15-16 hours. Next, the bacterial cells in the logarithmic growth phase were
Aseptically filter and collect bacteria using a membrane filter.
After washing with 2.0 ml of 0.1M phosphate buffer (PH7.0), it was suspended in 25 ml of the same buffer. Put 4 ml of this bacterial suspension into a test tube (inner diameter 21 ml, length 200 mm) and add N-methyl-N'- to a final concentration of 50 μg/ml.
Add nitro-N-nitrosoguanidine and heat to 30°C.
Mutation treatments were performed by shaking for 45 minutes at . Note that the mortality rate of Arthrobacter CA-35 strain under this treatment condition was about 80%. The mutant-treated bacterial cells were collected by aseptic filtration using a 0.45μ membrane filter, washed with 20ml of 0.1M phosphate buffer (PH7.0), and then suspended in 25ml of the same buffer. The obtained bacterial suspension was diluted with sterilized physiological saline and mixed with medium 4 (composition: sodium hydroxide 0.1%, cholic acid 1.0%, ammonium nitrate).
0.2%, potassium dihydrogen phosphate 0.2%, potassium monohydrogen phosphate 0.5%, magnesium sulfate heptahydrate 0.02
%, yeast extract 0.01%, and agar 1.5%) so that 300 to 500 colonies appeared on an agar plate, and then cultured at 30°C for 4 days. Isolate the smallest colonies among the colonies that appeared and incubate them on an agar plate in medium 5 (composition: peptone 0.5%, yeast extract 0.5%, sodium chloride 0.5% and agar 1.5%) at 30°C.
Cultured for 24 hours. The colonies that appeared here were replicated onto an agar plate in medium 4 and cultured at 30°C for 20 hours. Colonies in medium 5, which correspond to colonies that do not grow in medium 4, were transferred to medium 6 (composition: sodium hydroxide 0.1%, cholic acid 1.0%, peptone).
0.5% yeast extract, 0.5% sodium chloride, and 1.5% agar) and incubate at 30 °C.
Cultured for 24 hours. Culture medium 7 (composition: sodium hydroxide 0.5%,
Cholic acid 5.0%, glucose 0.5%, ammonium nitrate 0.2%, potassium dihydrogen phosphate 0.2%, potassium monohydrogen phosphate 0.5%, magnesium sulfate heptahydrate
Inoculate 10ml of yeast extract (0.02% and yeast extract 0.01%),
Culture was carried out with shaking at 30°C for 3 days. The products in each culture solution obtained were assayed by thin layer chromatography, and the target 3α,7α-dihydroxy-12-
One strain that selectively accumulates keto-5β-cholanic acid and/or its salts was found and named Arthrobacter strain CA-35-M-965-3. Hereinafter, the method for obtaining this mutant strain will be collectively referred to simply as NTG treatment. Example 2 Obtaining Arthrobacter CA-35-A849 strain (Feikoken Bacteria No. 5524) Arthrobacter CA-35 obtained in Example 1
-M-965-3 strain was used as the parent strain, and by treating it with NTG, 3α,7α-dihydroxy-12-
Three bacterial strains were found that selectively accumulate keto-5β-cholanic acid and/or its salts, and these were identified as Arthrobacter CA-35-A589 strain, Arthrobacter CA-35-A849 strain, and Arthrobacter strain CA-35-A849, respectively.
The strain was named CA-35-A-1071. Examples 3 and 4 Arthrobacter strain CA-35-A589-29-32 (Feikoken Bacteria No. 5522) and Arthrobacter
CA-35-A589-47 strain (Feikoken Bacteria No. 5523
Arthrobacter CA-35 obtained in Example 2
- Two excellent strains were isolated from the colony of A589 strain, and each of these strains was
35-A589-29-32 strain and Arthrobacter CA
The strain was named -35-A589-47. Example 5 Acquisition of Arthrobacter CA-35-A-1071-15 strain (Feikoken Bibori No. 5525) Arthrobacter CA-35 obtained in Example 2
-Isolate one excellent strain from the colony of A-1071 strain, and use it as Arthrobacter CA-35-A-
The strain was named 1071-15. Example 6 Acquisition of Arthrobacter CA-35-A-1448 strain (Feikoken Bacteria No. 5526) Arthrobacter CA-35 obtained in Example 2
−3α,7α-dihydroxy-12-keto-
We found multiple strains that selectively accumulate 5β-cholanic acid and/or its salts, and selected the best strain among them, Arthrobacter CA-35-A-1448.
The strain was named. Example 7 Acquisition of Arthrobacter CA-35-A-1475 strain (Feikoken Bacteria No. 5527) Arthrobacter CA-35 obtained in Example 6
- Using the A-1448 strain as the parent strain, we found multiple strains that selectively accumulate 3α,7α-dihydroxy-12-keto-5β-cholanic acid and/or its salts by subjecting it to NTG treatment, and Arthrobacter CA-35-A-
It was named strain 1475. Example 8 Acquisition of Arthrobacter CA-35-A-1766-15 strain (Feikoken Bibori No. 5528) Arthrobacter CA-35 obtained in Example 2
- By using the A-1071 strain as the parent strain and subjecting it to NTG treatment, we discovered multiple strains that selectively accumulate 3α,7α-dihydroxy-12-keto-5β-cholanic acid and/or its salts. Arthrobacter CA-35-A-
It was named strain 1766. Arthrobacter obtained
One excellent strain was isolated from the colony of CA-35-A-1766 strain, and this was used as Arthrobacter CA-1766.
The strain was named 35-A-1766-15. Example 9 Obtaining Arthrobacter CA-35-Y-37-12 strain (Feikoken Bacteria No. 5530) One platinum loop of Arthrobacter CA-35 strain grown on a slant in medium 1 was prepared in advance. Test tube (inner diameter
The cells were inoculated into 10 ml of medium 2 prepared in a container (21 mm long and 200 mm long) and cultured with shaking at 30°C for 20 hours. This culture solution was centrifuged aseptically (5° C., 10,000 rpm, 5 minutes) to collect bacteria, and the bacteria were suspended in 10 ml of sterile water. The obtained bacterial suspension is placed in a 7.5 cm inner diameter shear tray placed approximately 27 cm below the sterile box with a 15 W ultraviolet lamp (wavelength 2537 Å) suspended, and irradiated with ultraviolet light for 10 minutes. Mutation processing was performed by this method. The mortality rate of Arthrobacter CA-35 strain under this treatment condition was approximately 99.9%. Bacterial cells subjected to mutation treatment
Bacteria were collected by aseptic filtration using a 0.45μ membrane filter, washed with 20ml of 0.1M phosphate buffer (PH7.0), and then suspended in 25ml of the same buffer. The resulting bacterial suspension was diluted with sterilized physiological saline and cultured using medium 4 to 7 in the same manner as in the NTG treatment described above to obtain 3α,7α-dihydroxy-12-keto- A strain that selectively accumulates 5β-cholanic acid and/or its salts was found and named Arthrobacter strain CA-35-Y-37-12. Application Example 1 Cultivation of Arthrobacter CA-35-A589-29-32 strain (Feikoken Bibori No. 5522) Arthrobacter CA-35-A589-29-32 strain was cultured by the following method. Cholic acid 100g, ammonium nitrate 2.0g, potassium dihydrogen phosphate 2.0
g, dipotassium hydrogen phosphate 5.0 g, magnesium sulfate heptahydrate 0.2 g, yeast extract 0.1 g, and sodium hydroxide 10 g, tap water was added to adjust the volume to 800 ml. This solution was steam sterilized at 120°C for 15 minutes. Separately, dissolve 5 g of glucose in 200 ml of tap water, steam sterilize this solution at 110°C for 30 minutes, and after cooling, add to the above solution to reduce the volume to 1.
This was used as a culture medium. Next, this medium was aseptically dispensed into 10 100 ml flasks into 500 ml Sakaguchi flasks. The culture solution of the inoculum grown in advance in the same medium as above in a test tube shaker for 14 hours was added to the above.
2 ml was added per 500 ml Sakaguchi flask and cultured with shaking for 3 days. After culturing, these culture fluids are collected and the bacterial cells are removed using a centrifuge. Hydrochloric acid is added to the obtained culture supernatant to acidify the supernatant with hydrochloric acid, resulting in converted products of cholate and unconverted cholate. was precipitated.
Collect this precipitate and dilute the remaining solution with ethyl acetate.
After distilling off the ethyl acetate using a rotary evaporator, the resulting residue was combined with the previous precipitate to obtain 99.3 g of a mixture of converted cholate and unconverted cholic acid. Take a small portion of this mixture, add methanol to it and
% solution, and 10μ of this solution was subjected to high performance liquid chromatography (HLC-GPC-244, manufactured by Waters Co., USA, equipped with a Microbondapak C-18 column).
mold). As a mobile phase, a mixture of water/methanol with a volume ratio of 30/70 adjusted to pH 4.0 was used at a flow rate of 1.
When the flow rate was ml/min and detection was performed using the refractive index method, the chromatogram shown in FIG. 5 was obtained. By comparing peaks B and D in this chromatogram with the peaks of the standard product, 3α and 7α-
It was consistent with that of dihydroxy-12-keto-5β-cholanic acid and cholic acid. In addition, a compound corresponding to the peak B portion was fractionated, and its mass spectrum, infrared absorption spectrum and
When we confirmed the structure of the compound by NMR spectrum, we found that the above 3α,7α-dihydroxy-12
-keto-5β-cholanic acid. The yield of the obtained 3α,7α-dihydroxy-12-keto-5β-cholanic acid and the remaining amount of unconverted cholic acid were calculated from the area ratio of the chromatogram shown in FIG. 5 as shown in the following table.
【表】
応用例 ２
アルスロバクターCA−35−A589−47菌株（微
工研菌寄第5523号）の培養
応用例１においてアルスロバクターCA−35−
A589−29−32菌株の代りにアルスロバクターCA
−35−A589−47菌株を用い、コール酸及び水酸
化ナトリウムの濃度を各々50ｇ／、５ｇ／に
変え、かつ培養時間を35時間に短縮させた以外は
応用例１と同じ方法により培養し処理することに
より、コール酸塩変換物及び未変換コール酸の混
合物49.31ｇを得た。この混合物から応用例１と
同じ方法により第６図のクロマトグラムが得られ
た。このクロマトグラムにおけるピークＡ、ピー
クＢ、ピークＣ及びピークＤは標準品のピークと
照合することにより各々7α−ヒドロキシ−３，
12−ジケト−5β−コラン酸、3α，7α−ジヒドロ
キシ−12−ケト−5β−コラン酸、7α，12α−ジヒ
ドロキシ−３−ケト−5β−コラン酸及びコール
酸のものと一致した。なお、ピークＡ、ピーク
Ｂ、ピークＣ及びピークＤの各々の部分に相当す
る化合物を分取し、これらの化合物を薄層クロマ
トグラフイーを用いて調べたところ、ピークＢ、
ピークＣ及びピークＤの部分に相当する化合物は
単一化合物であつたが、ピークＡの部分に相当す
る化合物は7α−ヒドロキシ−３，12−ジケト−
5β−コラン酸と他の未同定物質との混合物であ
つた。
第６図のクロマトグラムの面積比から、得られ
たコール酸塩変換物の収量及び未変換コール酸の
残存量を算出すると次表に示すとおりである。[Table] Application example 2 Cultivation of Arthrobacter CA-35-A589-47 strain (Feikoken Bacteria No. 5523) In Application example 1, Arthrobacter CA-35-
Arthrobacter CA instead of A589-29-32 strain
-35-A589-47 strain was used and cultured and treated in the same manner as in Application Example 1, except that the concentrations of cholic acid and sodium hydroxide were changed to 50 g/, 5 g/, respectively, and the culture time was shortened to 35 hours. By doing so, 49.31 g of a mixture of cholate converted product and unconverted cholic acid was obtained. From this mixture, the chromatogram shown in FIG. 6 was obtained by the same method as in Application Example 1. Peak A, peak B, peak C, and peak D in this chromatogram were compared with the peaks of the standard product, and 7α-hydroxy-3, 7α-hydroxy-3, and
It was consistent with that of 12-diketo-5β-cholanic acid, 3α,7α-dihydroxy-12-keto-5β-cholanic acid, 7α,12α-dihydroxy-3-keto-5β-cholanic acid, and cholic acid. In addition, when compounds corresponding to each portion of peak A, peak B, peak C, and peak D were separated and examined using thin layer chromatography, peak B,
The compound corresponding to peak C and peak D was a single compound, but the compound corresponding to peak A was 7α-hydroxy-3,12-diketo-
It was a mixture of 5β-cholanic acid and other unidentified substances. The yield of the obtained cholate converted product and the remaining amount of unconverted cholic acid are calculated from the area ratio of the chromatogram shown in FIG. 6 as shown in the following table.
【表】
応用例 ３
アルスロバクターCA−35−A849−47菌株（微
工研菌寄第5524号）の培養
応用例２においてアルスロバクターCA−35−
A589−47菌株の代りにアルスロバクターCA−35
−A849菌株を用いる以外は応用例２と同じ方法
により培養し処理することにより、コール酸塩変
換物及び未変換コール酸の混合物49.34ｇを得た。
この混合物から応用例１と同じ方法により第７図
のクロマトグラムが得られた。このクロマトグラ
ムにおけるピークＡ、ピークＢ、ピークＣ及びピ
ークＤは標準品のピークと照合することにより
各々7α−ヒドロキシ−３，12−ジケト−5β−コ
ラン酸、3α，7α−ジヒドロキシ−12−ケト−5β
−コラン酸、7α，12α−ジヒドロキシ−３−ケト
−5β−コラン酸及びコール酸のものと一致した。
なお、ピークＡ、ピークＢ、ピークＣ及びピーク
Ｄの各々の部分に相当する化合物を分取し、これ
らの化合物を薄層クロマトグラフイーを用いて調
べたところ、ピークＡ、ピークＢ、ピークＣ及び
ピークＤの部分に相当する化合物はいずれも単一
化合物であつた。
第７図のクロマトグラムの面積から、得られた
コール酸塩変換物の収量及び未変換コール酸の残
存量を算出すると次表に示すとおりである。[Table] Application example 3 Cultivation of Arthrobacter CA-35-A849-47 strain (Feikoken Bacteria No. 5524) In application example 2, Arthrobacter CA-35-
Arthrobacter CA-35 instead of A589-47 strain
-49.34 g of a mixture of converted cholic acid and unconverted cholic acid was obtained by culturing and treating in the same manner as in Application Example 2, except that strain A849 was used.
From this mixture, the chromatogram shown in FIG. 7 was obtained by the same method as in Application Example 1. Peak A, peak B, peak C, and peak D in this chromatogram were compared with the peaks of standard products to identify 7α-hydroxy-3,12-diketo-5β-cholanic acid, 3α,7α-dihydroxy-12-keto, respectively. −5β
-Colanic acid, 7α,12α-dihydroxy-3-keto-5β-cholanic acid and cholic acid.
In addition, when compounds corresponding to each portion of peak A, peak B, peak C, and peak D were fractionated and examined using thin layer chromatography, it was found that peak A, peak B, peak C and the compound corresponding to the peak D portion were all single compounds. The yield of the obtained cholate converted product and the remaining amount of unconverted cholic acid are calculated from the area of the chromatogram shown in FIG. 7 as shown in the following table.
【表】
応用例 ４
アルスロバクターCA−35−Ａ−1071−15菌株
（微工研菌寄第5525号）の培養
応用例２においてアルスロバクターCA−35−
A589−47菌株の代りにアルスロバクターCA−35
−Ａ−1071−15菌株を用いる以外は応用例２と同
じ方法により培養し処理することにより、コール
酸塩変換物及び未変換コール酸の混合物49.31ｇ
を得た。この混合物から応用例１と同じ方法によ
り第８図のクロマトグラムが得られた。このクロ
マトグラムにおけるピークＡ、ピークＢ、ピーク
Ｃ及びピークＤは標準品のピークと照合すること
により各々7α−ヒドロキシ−３，12−ジケト−
5β−コラン酸、3α，7α−ジヒドロキシ−12−ケ
ト−5β−コラン酸、7α，12α−ジヒドロキシ−３
−ケト−5β−コラン酸及びコール酸のものと一
致した。なお、ピークＡ、ピークＢ、ピークＣ及
びピークＤの各々の部分に相当する化合物を分取
し、これらの化合物を薄層クロマトグラフイーを
用いて調べたところ、ピークＢ、ピークＣ及びピ
ークＤの部分に相当する化合物は単一化合物であ
つたが、ピークＡの部分に相当する化合物は7α
−ヒドロキシ−３，12−ジケト−5β−コラン酸
と他の未同定物質との混合物であつた。
第８図のクロマトグラムの面積比から、得られ
たコール酸塩変換物の収量及び未変換コール酸の
残存量を算出すると次表に示すとおりである。[Table] Application example 4 Cultivation of Arthrobacter CA-35-A-1071-15 strain (Feikoken Bacteria No. 5525) In application example 2, Arthrobacter CA-35-
Arthrobacter CA-35 instead of A589-47 strain
- By culturing and treating in the same manner as in Application Example 2 except for using the A-1071-15 strain, 49.31 g of a mixture of cholate converted product and unconverted cholic acid was obtained.
I got it. The chromatogram shown in FIG. 8 was obtained from this mixture by the same method as in Application Example 1. Peak A, peak B, peak C, and peak D in this chromatogram were compared with the peaks of the standard product, and 7α-hydroxy-3,12-diketo-
5β-cholanic acid, 3α,7α-dihydroxy-12-keto-5β-cholanic acid, 7α,12α-dihydroxy-3
-keto-5β-cholanic acid and cholic acid. In addition, when compounds corresponding to each portion of peak A, peak B, peak C, and peak D were fractionated and examined using thin layer chromatography, peak B, peak C, and peak D were detected. The compound corresponding to the portion of peak A was a single compound, but the compound corresponding to the portion of peak A was 7α
-Hydroxy-3,12-diketo-5β-cholanic acid and other unidentified substances. The yield of the obtained cholate converted product and the remaining amount of unconverted cholic acid are calculated from the area ratio of the chromatogram shown in FIG. 8 as shown in the following table.
【表】
応用例 ５
アルスロバクターCA−35−Ａ−1448菌株（微
工研菌寄第5526号）の培養
応用例２においてアルスロバクターCA−35−
A589−47菌株の代りにアルスロバクターCA−35
−Ａ−1448菌株を用いる以外は応用例２と同じ方
法により培養し処理することにより、コール酸塩
変換物及び未変換コール酸の混合物49.30ｇを得
た。この混合物から応用例１と同じ方法により第
９図のクロマトグラムが得られた。このクロマト
グラムにおけるピークＡ、ピークＢ、ピークＣ及
びピークＤは標準品のピークと照合することによ
り各々7α−ヒドロキシ−３，12−ジケト−5β−
コラン酸、3α，7α−ジヒドロキシ−12−ケト−
5β−コラン酸、7α，12α−ジヒドロキシ−３−ケ
ト−5β−コラン酸及びコール酸のものと一致し
た。なお、ピークＡ、ピークＢ、ピークＣ及びピ
ークＤの各々の部分に相当する化合物を分取し、
これらの化合物を薄層クロマトグラフイーを用い
て調べたところ、ピークＢ、ピークＣ及びピーク
Ｄの部分に相当する化合物は単一化合物であつた
が、ピークＡの部分に相当する化合物は7α−ヒ
ドロキシ−３，12−ジケト−5β−コラン酸と他
の未同定物質との混合物であつた。
第９図のクロマトグラムの面積比から、得られ
たコール酸塩変換物の収量及び未変換コール酸の
残存量を算出すると次表に示すとおりである。[Table] Application example 5 Cultivation of Arthrobacter CA-35-A-1448 strain (Feikoken Bacteria No. 5526) In Application example 2, Arthrobacter CA-35-
Arthrobacter CA-35 instead of A589-47 strain
By culturing and treating in the same manner as in Application Example 2 except for using the -A-1448 strain, 49.30 g of a mixture of cholate converted product and unconverted cholic acid was obtained. The chromatogram shown in FIG. 9 was obtained from this mixture by the same method as in Application Example 1. Peak A, peak B, peak C, and peak D in this chromatogram were compared with the peaks of the standard product, and 7α-hydroxy-3,12-diketo-5β-
Cholanic acid, 3α,7α-dihydroxy-12-keto-
It was consistent with that of 5β-cholanic acid, 7α,12α-dihydroxy-3-keto-5β-cholanic acid and cholic acid. In addition, compounds corresponding to each portion of peak A, peak B, peak C, and peak D were fractionated,
When these compounds were examined using thin layer chromatography, the compounds corresponding to peak B, peak C, and peak D were found to be a single compound, but the compound corresponding to peak A was 7α- It was a mixture of hydroxy-3,12-diketo-5β-cholanic acid and other unidentified substances. The yield of the obtained cholate converted product and the remaining amount of unconverted cholic acid are calculated from the area ratio of the chromatogram shown in FIG. 9 as shown in the following table.
【表】
応用例 ６
アルスロバクターCA−35−Ａ−1475菌株（微
工研菌寄第5527号）の培養
応用例２においてアルスロバクターCA−35−
A589−47菌株の代りにアルスロバクターCA−35
−Ａ−1475菌株を用いる以外は応用例２と同じ方
法により培養し処理することにより、コール酸塩
変換物及び未変換コール酸の混合物49.35ｇを得
た。この混合物から応用例１と同じ方法により第
１０図のクロマトグラムが得られた。このクロマ
トグラムにおけるピークＡ、ピークＢ、ピーク
Ｃ、及びピークＤは標準品のピークと照合するこ
とにより各々7α−ヒドロキシ−３，12−ジケト
−5β−コラン酸、3α，7α−ジヒドロキシ−12−
ケト−5β−コラン酸、7α，12α−ジヒドロキシ−
３−ケト−5β−コラン酸及びコール酸のものと
一致した。なお、ピークＡ、ピークＢ、ピークＣ
及びピークＤの各々の部分に相当する化合物を分
取し、これらの化合物を薄層クロマトグラフイー
を用いて調べたところ、ピークＡ、ピークＢ、ピ
ークＣ及びピークＤの各々の部分に相当する化合
物を分取し、これらの化合物を薄層クロマトグラ
フイーを用いて調べたところ、ピークＡ、ピーク
Ｂ、ピークＣ及びピークＤの部分に相当する化合
物はいずれも単一化合物であつた。
第１０図のクロマトグラムの面積比から、得ら
れたコール酸塩変換物の収量及び未変換コール酸
の残存量を算出すると次表に示すとおりである。[Table] Application example 6 Cultivation of Arthrobacter CA-35-A-1475 strain (Feikoken Bacteria No. 5527) In application example 2, Arthrobacter CA-35-
Arthrobacter CA-35 instead of A589-47 strain
By culturing and treating in the same manner as in Application Example 2 except for using the -A-1475 strain, 49.35 g of a mixture of cholate converted product and unconverted cholic acid was obtained. From this mixture, the chromatogram shown in FIG. 10 was obtained by the same method as in Application Example 1. Peak A, peak B, peak C, and peak D in this chromatogram were compared with the peaks of standard products to identify 7α-hydroxy-3,12-diketo-5β-cholanic acid, 3α,7α-dihydroxy-12-
Keto-5β-cholanic acid, 7α,12α-dihydroxy-
It was consistent with that of 3-keto-5β-cholanic acid and cholic acid. In addition, peak A, peak B, peak C
Compounds corresponding to each part of peak A, peak B, peak C, and peak D were fractionated and examined using thin layer chromatography. When the compounds were fractionated and examined using thin layer chromatography, it was found that the compounds corresponding to peak A, peak B, peak C, and peak D were all single compounds. The yield of the obtained cholate converted product and the remaining amount of unconverted cholic acid were calculated from the area ratio of the chromatogram shown in FIG. 10 as shown in the following table.
【表】
応用例 ７
アルスロバクターCA−35−Ａ−1766−15菌株
（微工研菌寄第5528号）の培養
応用例２においてアルスロバクターCA−35−
A589−47菌株の代りにアルスロバクターCA−35
−Ａ−1766−15菌株を用いる以外は応用例２と同
じ方法により培養し処理することにより、コール
酸塩変換物及び未変換コール酸の混合物49.27ｇ
を得た。この混合物から応用例１と同じ方法によ
り第１１図のクロマトグラムが得られた。このク
ロマトグラムにおけるピークＡ、ピークＢ、及び
ピークＤは標準品のピークと照合することにより
各々7α−ヒドロキシ−３，12−ジケト−5β−コ
ラン酸、3α，7α−ジヒドロキシ−12−ケト−5β
−コラン酸及びコール酸のものと一致した。な
お、ピークＡ、ピークＢ及びピークＤの各々の部
分に相当する化合物を分取し、これらの化合物を
薄層クロマトグラフイーを用いて調べたところ、
ピークＡ、ピークＢ及びピークＤの部分に相当す
る化合物はいずれも単一化合物であつた。
第１１図のクロマトグラムの面積比から、得ら
れたコール酸塩変換物の収量及び未変換コール酸
の残存量を算出すると次表に示すとおりである。[Table] Application example 7 Cultivation of Arthrobacter CA-35-A-1766-15 strain (Feikoken Bacteria No. 5528) In application example 2, Arthrobacter CA-35-
Arthrobacter CA-35 instead of A589-47 strain
- By culturing and treating in the same manner as in Application Example 2 except for using the A-1766-15 strain, 49.27 g of a mixture of cholate converted product and unconverted cholic acid was obtained.
I got it. From this mixture, the chromatogram shown in FIG. 11 was obtained by the same method as in Application Example 1. Peak A, peak B, and peak D in this chromatogram were compared with the peaks of standard products to identify 7α-hydroxy-3,12-diketo-5β-cholanic acid, 3α,7α-dihydroxy-12-keto-5β, respectively.
- consistent with those of colanic acid and cholic acid. In addition, when compounds corresponding to each part of peak A, peak B, and peak D were fractionated and these compounds were investigated using thin layer chromatography, it was found that
The compounds corresponding to peak A, peak B, and peak D were all single compounds. The yield of the obtained cholate converted product and the remaining amount of unconverted cholic acid are calculated from the area ratio of the chromatogram shown in FIG. 11 as shown in the following table.
【表】
応用例 ８
アルスロバクターCA−35−Ｍ−965−３菌株
（微工研菌寄第5529号）の培養
応用例２においてアルスロバクターCA−35−
A589−47菌株の代りにアルスロバクターCA−35
−Ｍ−965−３菌株を用いる以外は応用例２と同
じ方法により培養し処理することにより、コール
酸塩変換物及び未変換コール酸の混合物49.36ｇ
を得た。この混合物から応用例１と同じ方法によ
り第１２図のクロマトグラムが得られた。このク
ロマトグラムにおけるピークＡ、ピークＢ、及び
ピークＤは標準品のピークと照合することにより
各々7α−ヒドロキシ−３，12−ジケト−5β−コ
ラン酸、3α，7α−ジヒドロキシ−12−ケト−5β
−コラン酸及びコール酸のものと一致した。な
お、ピークＡ、ピークＢ及びピークＤの各々の部
分に相当する化合物を分取し、これらの化合物を
薄層クロマトグラフイーを用いて調べたところ、
ピークＢ及びピークＤの部分に相当する化合物は
単一化合物であつたが、ピークＡの部分に相当す
る化合物は7α−ヒドロキシ−３，12−ジケト−
5β−コラン酸と他の未同定物質との混合物であ
つた。
第１２図のクロマトグラムの面積比から、得ら
れたコール酸塩変換物の収量及び未変換コール酸
の残存量を算出すると次表に示すとおりである。[Table] Application example 8 Cultivation of Arthrobacter CA-35-M-965-3 strain (Feikoken Bacterial Serial No. 5529) In Application Example 2, Arthrobacter CA-35-
Arthrobacter CA-35 instead of A589-47 strain
- 49.36 g of a mixture of cholate converted product and unconverted cholic acid was obtained by culturing and treating in the same manner as in Application Example 2 except for using the M-965-3 strain.
I got it. The chromatogram shown in FIG. 12 was obtained from this mixture by the same method as in Application Example 1. Peak A, peak B, and peak D in this chromatogram were compared with the peaks of standard products to identify 7α-hydroxy-3,12-diketo-5β-cholanic acid, 3α,7α-dihydroxy-12-keto-5β, respectively.
- consistent with those of colanic acid and cholic acid. In addition, when compounds corresponding to each part of peak A, peak B, and peak D were fractionated and these compounds were investigated using thin layer chromatography, it was found that
The compound corresponding to peak B and peak D was a single compound, but the compound corresponding to peak A was 7α-hydroxy-3,12-diketo-
It was a mixture of 5β-cholanic acid and other unidentified substances. The yield of the obtained cholate converted product and the remaining amount of unconverted cholic acid are calculated from the area ratio of the chromatogram shown in FIG. 12 as shown in the following table.
【表】
応用例 ９
アルスロバクターCA−35−Ｙ−37−12菌株
（微工研菌寄第5530号）の培養
応用例２においてアルスロバクターCA−35−
A589−47菌株の代りにアルスロバクターCA−35
−Ｙ−37−12菌株を用いる以外は応用例２と同じ
方法により培養し、処理することにより、コール
酸塩変換物及び未変換コール酸の混合物49.33ｇ
を得た。この混合物から応用例１と同じ方法によ
り第１３図のクロマトグラムが得られた。このク
ロマトグラムにおけるピークＡ、ピークＢ、ピー
クＣ、及びピークＤは標準品のピークと照合する
ことにより各々7α−ヒドロキシ−３，12−ジケ
ト−5β−コラン酸、3α，7α−ジヒドロキシ−12
−ケト−5β−コラン酸、7α，12α−ジヒドロキシ
−３−ケト−5β−コラン酸及びコール酸のもの
と一致した。なお、ピークＡ、ピークＢ、ピーク
Ｃ及びピークＤの各々の部分に相当する化合物を
分取し、これらの化合物を薄層クロマトグラフイ
ーを用いて調べたところ、ピークＡ、ピークＢ、
ピークＣ及びピークＤの部分に相当する化合物は
いずれも単一化合物であつた。
第１３図のクロマトグラムの面積比から、得ら
れたコール酸塩変換物の収量及び未変換コール酸
の残存量を算出すると次表に示すとおりである。[Table] Application example 9 Cultivation of Arthrobacter CA-35-Y-37-12 strain (Feikoken Bacteria No. 5530) In Application example 2, Arthrobacter CA-35-
Arthrobacter CA-35 instead of A589-47 strain
- By culturing and treating in the same manner as in Application Example 2 except for using the Y-37-12 strain, 49.33 g of a mixture of cholate converted product and unconverted cholic acid was obtained.
I got it. From this mixture, the chromatogram shown in FIG. 13 was obtained by the same method as in Application Example 1. Peak A, peak B, peak C, and peak D in this chromatogram were compared with the peaks of standard products to identify 7α-hydroxy-3,12-diketo-5β-cholanic acid, 3α,7α-dihydroxy-12, respectively.
-keto-5β-cholanic acid, 7α,12α-dihydroxy-3-keto-5β-cholanic acid and cholic acid. In addition, when compounds corresponding to each portion of peak A, peak B, peak C, and peak D were separated and examined using thin layer chromatography, peak A, peak B,
The compounds corresponding to peak C and peak D were all single compounds. The yield of the obtained cholate converted product and the remaining amount of unconverted cholic acid were calculated from the area ratio of the chromatogram shown in FIG. 13 as shown in the following table.
第１図は参考例で得られたコール酸塩変換物及
び未変換コール酸の液体クロマトグラムを表わ
し、第２〜４図はそれぞれ第１図のクロマトグラ
ムのピークＡ、ピークＢ及びピークＣの各々の部
分に相当する化合物をメチルエステル化したもの
の赤外線吸収スペクトル（Ａ，Ｂ及びＣ）を標準
品の赤外線吸収スペクトル（A′，B′及びC′）と
対比して表示したものである。第５〜１３図はそ
れぞれ応用例１〜９で得られたコール酸塩変換物
及び未変換コール酸の液体クロマトグラムを表わ
す。
Figure 1 shows the liquid chromatograms of the converted cholate and unconverted cholic acid obtained in the reference example, and Figures 2 to 4 show the peaks A, B, and C of the chromatogram in Figure 1, respectively. The infrared absorption spectra (A, B, and C) of methyl esterified compounds corresponding to each part are shown in comparison with the infrared absorption spectra (A', B', and C') of standard products. Figures 5 to 13 represent liquid chromatograms of cholate converted products and unconverted cholic acid obtained in Application Examples 1 to 9, respectively.
Claims (1)
（Arthrobacter CA−35−A589−29−32）菌株
（微工研菌寄第5522号）、 アルスロバクターCA−35−A589−47
（Arthrobacter CA−35−A589−47）菌株（微工
研菌寄第5523号）、 アルスロバクターCA−35−A849
（Arthrobacter CA−35−A849）菌株（微工研菌
寄第5524号）、 アルスロバクターCA−35−Ａ−1071−15
（Arthrobacter CA−35−Ａ−1071−15）菌株
（微工研菌寄第5525号）、 アルスロバクターCA−35−Ａ−1448
（Arthrobacter CA−35−Ａ−1448）菌株（微工
研菌寄第5526号）、 アルスロバクターCA−35−Ａ−1475
（Arthrobacter CA−35−Ａ−1475）菌株（微工
研菌寄第5527号）、 アルスロバクターCA−35−Ａ−1766−15
（Arthrobacter CA−35−Ａ−1766−15）菌株
（微工研菌寄第5528号）、 アルスロバクターCA−35−Ｍ−965−３
（Arthrobacter CA−35−Ｍ−965−３）菌株
（微工研菌寄第5529号）および アルスロバクターCA−35−Ｙ−37−12
（Arthrobacter CA−35−Ｙ−37−12）菌株（微
工研菌寄第5530号）からなる群から選ばれる突然
変異株。[Claims] 1 Arthrobacter CA-35-A589-29-32
(Arthrobacter CA-35-A589-29-32) strain (Feikoken Bacterial Serial No. 5522), Arthrobacter CA-35-A589-47
(Arthrobacter CA-35-A589-47) strain (Feikoken Bacteria Collection No. 5523), Arthrobacter CA-35-A849
(Arthrobacter CA-35-A849) strain (Feikoken Bacteria No. 5524), Arthrobacter CA-35-A-1071-15
(Arthrobacter CA-35-A-1071-15) strain (Feikoken Bacterial Serial No. 5525), Arthrobacter CA-35-A-1448
(Arthrobacter CA-35-A-1448) strain (Feikoken Bacteria Collection No. 5526), Arthrobacter CA-35-A-1475
(Arthrobacter CA-35-A-1475) strain (Feikoken Bacteria Collection No. 5527), Arthrobacter CA-35-A-1766-15
(Arthrobacter CA-35-A-1766-15) strain (Feikoken Bacterial Serial No. 5528), Arthrobacter CA-35-M-965-3
(Arthrobacter CA-35-M-965-3) strain (Feikoken Bacteria Collection No. 5529) and Arthrobacter CA-35-Y-37-12
A mutant strain selected from the group consisting of (Arthrobacter CA-35-Y-37-12) strain (Feikoken Bacteria No. 5530).
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18878080A JPS578781A (en) | 1980-12-29 | 1980-12-29 | Microorganism producing 3alpha,7alpha-dihydroxy-12-keto-5beta-cholanic acid |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18878080A JPS578781A (en) | 1980-12-29 | 1980-12-29 | Microorganism producing 3alpha,7alpha-dihydroxy-12-keto-5beta-cholanic acid |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8225680A Division JPS578796A (en) | 1979-08-21 | 1980-06-17 | Preparation of 3alpha,7alpha-dihydroxy-12-keto-5beta-cholanic acid and/or its salt |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS578781A JPS578781A (en) | 1982-01-18 |
| JPH0262234B2 true JPH0262234B2 (en) | 1990-12-25 |
Family
ID=16229654
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP18878080A Granted JPS578781A (en) | 1980-12-29 | 1980-12-29 | Microorganism producing 3alpha,7alpha-dihydroxy-12-keto-5beta-cholanic acid |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS578781A (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5451510A (en) * | 1991-10-24 | 1995-09-19 | Tokyo Tanabe Company, Limited | Process for preparing 3α, 7α-dihydroxy-12-keto-5β-cholanic acid using bacillus spp. FERM BP-3394 and FERM BP-3397 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106758065A (en) * | 2016-12-02 | 2017-05-31 | 湖南中邮品惠文化发展有限公司 | A kind of Clothes cabinet capable of drying clothes |
-
1980
- 1980-12-29 JP JP18878080A patent/JPS578781A/en active Granted
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5451510A (en) * | 1991-10-24 | 1995-09-19 | Tokyo Tanabe Company, Limited | Process for preparing 3α, 7α-dihydroxy-12-keto-5β-cholanic acid using bacillus spp. FERM BP-3394 and FERM BP-3397 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS578781A (en) | 1982-01-18 |
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