JPH0253483A

JPH0253483A - 接着性動物細胞の培養方法

Info

Publication number: JPH0253483A
Application number: JP63204733A
Authority: JP
Inventors: Miharu Takazawa; 高沢　美治; Michiyuki Tokashiki; 渡嘉敷　通之
Original assignee: Teijin Ltd
Current assignee: Teijin Ltd
Priority date: 1988-08-19
Filing date: 1988-08-19
Publication date: 1990-02-22
Anticipated expiration: 2011-01-24
Also published as: JPH084495B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（ａ）産業上の利用分野本発明は接着性動物細胞の培養方法に関するものである
。さらに詳しくは有用物質を産生する接着性動物細胞を
、細胞同志の凝集を抑えて浮遊細胞と同様の状態で培養
する方法に関するものである。

（ｂ）従来技術工業的規模による細胞大量培養は、例えばウィルス、ワ
クチン、インターフェロンなどの抗ウィルス剤、おるい
はホルモンなどの生物薬品の製造に必須である。これら
の生理活性物質の生産に用いられる動物細胞は接着性の
ものが多く、その効率的培養技術の開発は工業的に重要
な課題である。

従来、接着性細胞の大量培養方法及びそのための装買と
していくつかの提案がなされている。しかしその多くは
固体表面に細胞を接着させて増殖させるものであり、ス
ケールアップや操作性、長期安定性などに問題が残って
いる。例えばファン・ウエツェル（Ｖａｎ　Ｗｅｚｅｌ
　）らによって開発されたマイクロキャリアー培養法は
タンク培養が可能な方法として有用であるが、長期間培
養していると細胞が担体からはがれ落ちるという問題が
ある。

更にυＳＰ　４．Ｃ）５９，４８５号明細書には血清培
地で接着性細胞の浮遊培養を試みた例が記載されている
が、細胞は大きな凝集塊をつくってしまい内部の細胞の
壊死という問題や長１ｉ安定性がないという問題点が残
っている。

（Ｃ）発明の目的そこで、本発明者らは、接着性動物細胞を担体を用いる
ことなく浮遊状態で長期間安定に培養することを目的と
して研究を進めたところ、培養系中のカルシウムイオン
濃度を低く抑える。ことにより、細胞凝集が抑制される
ことを見出し本発明に到達した。

（ｄ）発明の溝成すなわち、本発明は、接着性動物細胞を、実質的に無血
清の培地において、増殖、維持するに当つて、少くとも
増殖時期および維持時期の一時期に培養系中のカルシウ
ムイオン濃度を０．３ｍＭ未満とすることを特徴とする
接着性動物細胞の培養方法である。

以下、本発明について詳細に説明する。

本発明において用いられる接着性動物細胞は、シャーレ
を用いた血清培地での培養後、ピペッティングを行い、
生きたシングル・セル（ｓｉｎｇｌｅｃｅｌｌ）に解離
できないタイプの細胞であり、天然の正常細胞のみなら
ず、非人為的必るいは遺伝子操作等の人為的手段により
変性された細胞でおってもよい。また、本発明は特に有
用な生理活性物質を産生ずる接着性動物細胞の培養にお
いて、生理活性物質を高い濃度で得る目的のために適し
ている。

具体的にはＴｌＬｕ　、ＢＦ２．ＣＰＡ、ＣＰＡＥ、Ｆ
ＢＨＥ、ＭＤＢＫ、ＥＢ丁ｒ、ＢＴ、Ｂｕ。

Ｆ丁、ＢＢ、ＣＲＦＫ、ＡＫ−Ｄ、　Ｆｅ２Ｌｕ　、Ｆ
ｅ３丁ｃｒ　、５Ｌ−２９，ＷＥＳ、Ｄ−１７，Ｄｏ　
ＣＭＤＣＫ、Ｃ１２Ｔｈ　、Ａ−７２，ＳＤ　ＩＫ、Ｍ
ｐｆ。

Ｆｏｌｕ　、１ＣＲ２Ａ、１ＣＲ１３４、ＦＴ、ＧＬｌ
。

１ＭＲ−３３，Ｇｅ　Ｌｕ　、　ＭＬＡ１４４　、　　
Ｃｈ　　１　Ｅｓ　。

ＣＡＲ，ＣＧＢＱ、ＧＦ、ＧＰＣ−１６，１０４ＣＪＨ
４Ｃ１ｏｎｅ１．　　　ＢＨＫ−２１，Ｈａ　　Ｋ、　
　ｔｋ’ｔｓ１３　、ＡＨＬ−１，Ｄｅｄｅ　、Ｄｏｎ
、ＦＦ、ＲＰＭ１１８４６、ＤＤＴ＋　　ＭＥ２．ＣＨ
Ｏ−Ｋｌ　　、Ｂ１４ＦＡＦ２Ｂ−Ｇ３．　　ＮＣＴＣ
４２０６，Ｒ１６１０，Ｅ、　　Ｄｅｒｍ　。

ＳＷ−１３，ＡＶ：ｌ　　、ＦＬ、ＷＩＳＨ，ＣＡ４６
．ＪＶＯＶｅ　、　　Ｐ３ＨＲ−１，５Ｔ４８６　、　
　Ｈ３７３８Ｂｌ　。

ＨＴ−１１９７，ＨＴ−１３７６、Ｊ８２．　　ＨＴ４
．　　ＳＣａ　ＢＥＲ，ＴＣＣ３ＵＰ、Ｈ２４，５６３
７，ＲＤ−ＥＳ、１Ｍ−９，ＫＧ−１，ＫＧ−１ａ　、
Ａ−１７２，Ｈ３６８３、Ｈ４、ＴＥ６７１　、Ｔ９８
Ｇ、Ｕ−８７ＭＧ、Ｕ−１３８ＭＧ、Ｕ−３７３ＭＧ、
ＢＴ、ＢＴ−４７４，ＢＴ−４８３、ＢＴ−５４９，Ｄ
ｕ４４７５　、　　ＨＢＬ−１００，Ｈ３５７８Ｂｓｔ
、Ｈ３５７８Ｔ、ＭＣＦ７　、ＭＤＡ−ＭＢ−１３４−
ＶＩ　、ＭＤＡ−ＭＢ−１５７，ＭＤＡ−ＭＢ−１７５
−Ｖｌｌ　、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１，ＭＤＡ−ＭＢ−３
３０，ＭＤＡ−ＭＢ−３６１，ＭＤＡ−ＭＢ−４１５，
ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ、ＭＤＡ−ＭＢ−４３６，ＭＤ
Ａ−ＭＢ−４５３゜ＭＤＡ−ＭＢ−４６８，５Ｋ−ＢＲ
−Ｉ　　ＩＩＩ、５Ｋ−ＢＲ−２ＩＩＩ、　　５Ｋ−Ｂ
Ｒ−３，Ｔ−４７Ｄ、　　ＺＲ−７５−１。

ＺＲ−７５−３０，ＣＣＤ−１４Ｂｒ　、　　Ｃａ　Ｓ
ｋｉ、　　Ｃ−４１。

Ｃ−４１１，Ｃ−３３Ａ、　　Ｈｅ　　Ｌａ　、　　Ｈ
ｅ　　Ｌａ　３３　、　　Ｈｅ　　Ｌａ　２２９　、　
　Ｈｓ６０２．　　ＨＴ−３，ＭＥ−１８０，ＭＳ７５
、　３＋　　＠ａ　、　　Ｃａｃｏ−２、ＣＣＤ−１８
Ｃｏ　、　　ＣＣＤ−３３Ｃｏ　、ＣＣＤ−１１２Ｃｏ
　Ｎ、Ｃ０ＬＯ２０１。

Ｃ０ＬＯ２０５、Ｃ０ＬＯ３２０ＤＭ、Ｃ０ＬＯ３２０
Ｈ３Ｒ，ＤＬＤ−１，ＨＣＭＣ，ＨＣＴ−１５、ＨＣＴ
１１６　、　　ＨＴ　　−２９、Ｌｏ　Ｖｏ　、　　Ｌ
Ｓ１７４　Ｔ、　　ｌ３１８０．５Ｋ−Ｃｏ−１，５Ｗ
４８，５Ｗ４０３．５Ｗ４８０　、　５Ｗ６２０　、　
５Ｗ９４８　、　５Ｗ１１１６．　５Ｗ１４１７゜Ｗｉ
　　Ｄｒ　、　　　　ｃｌｏｎｅ　１−５ｃｍ４．　　
Ｈｓ　７２９　、　　Ｄ４２２Ｔ、Ｈｕ　Ｔｕ　８０．
Ｈｓ１７３Ｗｅ　、ＡＮ３　ＣＡ、ＮＥＣ−１−Ａ、Ｎ
ＥＣ−１−Ｂ、ＫＬＥ、ＲＬ９５−２．Ｙ２Ｏ、トｌ５
９１３Ｔ、　　ＨＴ−１０８０、ＦＨｓ７４　　　Ｉｎ
ｔ、　　ＨＣＴ−８，ＨＩ　ＳＭ、　　Ｉ　ｎｔｅｓｔ
ｉｎｅ　４０７．　　Ａ−４９８，Ａ−７０４、ＡＣＨ
Ｎ、　　Ｃａｋｉ−１、Ｃａｋｉ−２、Ｇ−４０１，Ｇ
−４０２，５Ｋ−Ｎ　Ｅ　Ｐ−１，２９３、ＨＥｐ−２
、Ｃｈａｎｇｖｅｒ、ＣＬＣＬ、５Ｋ−ＨＥＰ−１，Ｗ
ＲＬ６８゜Ａ４２７　、　　Ａ３４９　、　　Ｃａ１ｕ
−１、Ｃａ１ｕ−３、Ｃａ１ｕ−６。

ＣＣＤ−８Ｌｕ　、ＣＣＤ−１１Ｌｕ−、ＣＣＤ−１３
Ｌｕ　。

ＣＣＤ−１４Ｂｒ　、　　ＣＣＤ−１６Ｌ　ｕ　、　　
ＣＣＤ−１８Ｌｕ　、ＣＣＤ−１９Ｌｕ　　、ＣＣＤ−
２５Ｌｕ　、ＣＣＤ−２９Ｌｕ　、ＣＣＤ−３２Ｌｕ　
、ＣＣＤ−３３Ｌｕ　、ＣＣＤ−３４Ｌ　ｕ　、　　Ｃ
ＣＤ−３７Ｌ　ｕ　、　　ＣＣＤ−３９Ｌｕ　。

ＨＥＬ２９９　、ＨＦＬｌ　　、ＨＬＦ−ａ、Ｈｓ７３
８Ｌｕ　。

Ｈ３８８８Ｌｕ　　、　　ＩＭＲ−９０、ＬＬ２４．　
　ＬＬ２９．　　ＬＬ４７．ＬＬ８６．ＬＬ９７Ａ、Ｌ
−１３２，ＭＲＣ−５，ＭＲＣ−９，ＮＣｌ−Ｈ６９，
ＮＣｌ−Ｈ１２８，５ＫＬＵ−１，３に−ＹＥＳ−１．
ＷＩ−２６、Ｗｌ−２８ＶＡ４　、　ＷＩ−３８、ＷＩ
−３８ＶＡ１３．５ｕｂｌｉｎｅ２ＲＡ。

Ｗｌ−１００３、ＥＢＩ　、　　Ｒａｊｉ　　、　　Ａ
−３７５，Ｃ３２，Ｃ３２ＴＧ、Ｃ−３６１，Ｈ３２９
４Ｔ、Ｈ３６９５Ｔ、ＨＴ−１４４，Ｍａｌｍｅ−３Ｍ
、　　ＲＰＭ　ｌ−７９５１、ＳＫ−ＭＥＬ−１，３に
−ＭＥＬ−２．ＳＫ−ＭＥＬ−３．ＳＫＭＥ　Ｌ−５，
３に−ＭＥ　Ｌ−２４、ＳＫ−ＭＥ　Ｌ−２８。

ＳＫ−ＭＥ　Ｌ−３１、ＷＭ−１１５，ＷＭ２６＆−４
、ＫＢ。

ＲＰＭ　ｌ８２２６．ＳＨＭ−Ｄ３３．ＲＰＭ　Ｉ２６
５０．ＩＭＲ−３２、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ，５Ｋ−Ｎ−３Ｈ
，Ｃａｏｖ−３、Ｃａｏｖ　−４，ＥＢ２　　、　　Ｎ
　　Ｉ　　Ｈ二　０ＶＣＡＲ−３゜ＰＡ−１，５Ｋ−Ｏ
Ｖ−３，ＨＥＰＭ、ＡＳＰＣ−１゜Ｂｘ　　ＰＣ−３，
０ａｐａｎ−１，Ｃａｐａｎ−２，ｌ−１３７６６Ｔ。

Ｍ　ＩＡＰａ　Ｃａ−２、ＰＡＮＣ−１，Ｄｅｔｒｏ＋
ｔ５６２　。

Ｆａ　Ｄｕ　、Ｂｅ　Ｗｏ　、ＪＡＲ，ＪＥＧ−３，３
△。

３Ａ−５ｕｂＥ、ＡＲＨ−７７、Ｈ３−３ｕｌｔａｎ　
、ＤＵ１４５　、　　ＰＣ−３，５Ｗ８３７　、　５Ｗ
１４６３．　　△−２０４，Ａ６７３　、　　Ｅｓａ−
１，Ｇ−２９２，ｃｌｏｎｅ　Ａ１４１　　Ｂｌ　、　
　ＨＯ３，ＫＨＯ３，／ＮＰ、ＫＨＯ３−２４０５，Ｋ
ＨＯ３−３２１Ｈ，ＭＧ−６３，ＭＮＮＧ／ＨＯ３，Ｒ
Ｄ、５ａｏｓ−２，５Ｋ−ＥＳ−１，５Ｋ−ＥＳ−２，
ＳＫ−ＬＭＳ−１，５Ｋ−ＵＴ−１，５Ｋ−ＵＴ−ＩＢ
、Ｕ−２−Ｏ３，Ａｍｄｕｒ　ＩＩ　、　　Ａ−４３１
，ＢＵＤ−８，ＣＨＦ３　。

ＣＨＦ２　、　　Ｃｉｔｒｕｌｌｉｎｅｍｉａ、　　Ｃ
ｒｉ　ｄｕ　Ｃｈａｔ　、　　Ｃ２１１、［）ｅｍｐｓ
ｅｙ、　　［）ｅｔｒｏ＋ｔ　５１０．　　Ｄｅｔｒｏ
＋ｔ　５２５゜Ｄｅｔｒｏｉｔ　５２９．　　　［）ｅ
ｔｒｏｉｔ　５３２．　　Ｄｅｔｒｏｉｔ　５３９゜Ｄ
ｅｔｒｏ＋ｔ　５４８．　　　Ｄｅｔｒｏ＋ｔ　５５１
．　　Ｄｅｔｒｏ＋ｔ　５７３゜Ｇ５−１０９−　　Ｉ
　Ｖ−８，Ｇ５−１０９−　　Ｖ−２０、Ｇ５−１０９
−　　Ｖ−２１、Ｇ５−１０９−　　Ｖ−３４、Ｇ５−
１０９−　　Ｖ−６３。

ＨＧ２６１　、　　Ｈ３２７，Ｈ３６８，ＫＤ、　　Ｍ
ａｌｍｅ−３，ＷＳｌ　、　　Ｈ３７４６Ｔ、　　ＫＡ
ＴＯＩＩＩ、　Ａ２５３　、　　Ｃａｔｅｓ−ＩＢ、　
　Ｔｅｒａ−１、Ｔｅｒａ−２、Ｈｓ　６７、５ｃｃ−
４゜５ＣＣ−９，５ＣＣ−１５，５ＣＣ−２５、ＡＮ３
　ＣＡ。

ＨＥＣ−１−Ａ、ＨＥＣ−１−Ｂ、５Ｋ−ＵＴ−１，５
Ｋ−ＵＴ−ＩＢ、ＳＫ−ＬＭＳ−１，Ｉ（ＩＨ−２，Ｂ
９５−８゜ＭＰＫ、Ｍｉ　　　ＣＩ２．ＭＶＩＬＵ、Ｆ
Ｆ−ＩＭ、Ｂ５−Ｃ−１，ＣＯ３−１，ＣＯ３−７，Ｃ
Ｖ−１，ＦＲｈＫ−４，ＬＬＣ−ＭＫ２　、ＬＬＣ−Ｍ
Ｋ２　　、ｄｅｒｉｖａｔ＋ｖｅ、　　ＮＣＴＣｃｌｏ
ｎｅ　３５２６．　　ＯＭＫ、　　Ｖｅｒｏ　、　　Ｖ
ｅｒｏ　Ｃ１００８，ｖｅｒｏ　７６、　　ＤＢＳ−Ｆ
ＣＬ−１，ＤＢＳ−ＦＣＬ−２，ＤＢＳ−ＦＲｈ　Ｌ−
２，ＤＰＳＯ１１４／７４．４　ＭＢｒ−５、１２ＭＢ
ｒ６．　　Ａｅｄｅｓ　ａｅｇｙｐｔｉ。

Ａｅｄｅｓ　　　　　ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ、　Ａｅｄ
ｅＳ　ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ　。

ｃｌｏｎｅ　Ｃ６／３Ｂ、　　ＴＲＡ−１７１，Ａｎｔ
ｈｅｒａｅａ　ｃｅｌｌｓ。

ａｄａｐｔｅｄ　、　　Ｙ−１，Ｅ、　　ＢＣＩ　　Ｈ
ｌ　、　　ＫＬＮ２０５　。

５ＣＣ−ＰＳＡＩ　　、Ｌ−Ｍ、Ｌ−Ｍ　（ＴＫ−）。

Ｎ　ＣＴＣｃｌｏｎｅ　９２９　、　　Ｎ　ＣＴＣｃｌ
ｏｎｅ　２４７２．　　Ｎ　ＣＴＣｃｌｏｎｅ　２５５
５．　ＮＣＴＣ２０７１，ＢＡＬＢ／３Ｔ３　。

ｃｌｏｎｅ　Ａ３１．ＢＡＬＢ／３Ｔ１２−３．Ｃ３Ｈ
／ＭＣＡ。

ｃｌｏｎｅ　１５．　　Ｃ３Ｈ／ＭＣＡ、　ｃｌｏｎｅ
　１６．　　Ｃ３Ｈ／１０　Ｔ１／２　、　ｃｌｏｎｅ
　８　、　　Ｋ−ＢＡＬＢ、　Ｍ−ＭＳＶ−ＢＡＬＢ／
３Ｔ３　、ＮＣＴＣ４０９３，Ｎ　Ｉ　Ｈ／３Ｔ３　。

５Ｃ−１，５Ｖ−Ｈ２，３Ｔ３−Ｌｌ　、３Ｔ３−３ｗ
ｉｓｓ　　Ａｌｂｉｎｏ　、　３丁６−３ＷｉＳＳ　　
　ＡＩｂｉｎｏ　。

ＢＡＬＢ／Ｂ０．７５．ＢＡＦＡ、ＩＲ，１，ＨＤＡ、
８゜８ＡＬＢ／ｃＡＭｕ　ＬＶ、Ａ、３Ｒ，１，８ＡＬ
Ｂ／ｃＡＭｕ　ＬＶ、Ａ、６Ｒ，１，ＢＡＬＢ／ｃＣＬ
、７．ＢＡＬＢ／ｃ１０ｃｒ　、ＭＣＡＡ、２Ｒ，１，
ＢＡＬＢ／３Ｔ３　。

ｃｌｏｎｅ　　Ａ３１．　　ＢＬＫＣＬ４　　、　　Ｂ
ＬＫＳＶＨＤ、２゜Ａ、５Ｒ，ＩＡ、３Ｒ，１，Ｃ３Ｈ
／１０　Ｔｌ／２　、　ｃｌｏｎｅ８．３丁０，３Ｔ３
−Ｌｌ　、Ｘ５−２．ＲＡＧ、ＴＣＭＫ−１，ＢＮＬＣ
Ｌ、２．ＢＮＬＳＶＡ、８．ＢＮしＩ　ＭＥＡ、７Ｒ，
１，ＢＮＬ　ＩＮＧＡ、２．ＮＣＴＣｃｌｏｎｅ　１４
６９．　　ＮＭｕ　　　Ｌｉ　、　　ＬＡ−４，ＬＬ／
２．　ＭＬｇ、　　ＣＬ−３ｔ　、　　Ｃ１２７１，Ｍ
ＭＴＯ６０５６２，Ｍｍ５ＭＴ、　　ＮＭｕ　ＭＧ、　
　Ｐ８１５　、　　Ｃ１ｏｎｅ−Ｍ−３，ＮＢ４１Ａ３
　、　　Ｎｅｕｒｏ−２ａ　、　Ａｔ　Ｔ−２０、ＭＯ
ＰＣ−３ＩＣ，ＭＰＣ−１１，Ｐ３／ＮＳＩ／１−Ａｇ
４−ｔ、ＣＭＴ−９３、ＢＣＬ＋　　ｃｌｏｎｅ　５　
Ｂｌｂ、　　ＣＣＲＦＳ−１８０ＩＩ。

Ｈ３ＤＭ＋　　Ｃ＋　　、　　ＭＢＨＩ　、　　３ａｒ
ＣＯｍａ　１８０．　　ｌ　−１０、ＮＵＬＬ　ｌ−８
ＣＣ１，ＥＳＫ−４，ＬＬＣＰＫＩＡ、　ＬＬＣＰ　　
Ｋｌ　、　ＰＫ（１５）、　Ｐｊ　Ｋ１　。

Ｐ［Ｋ２　、　Ｓ　Ｉ　ＲＣ，Ｌ　Ｌ、ＣＰＫＩ　、　
ＰＫＩ３゜Ｒ９ａｂ　、ＲＡＢ−９，ＧＨ＋　　、ＧＨ
：ｌ　　、４／４　Ｒ，Ｍ。

−４，Ｊｅｎｓｅｎ　　　　　３ａｒｃｏｍａ、　　Ｒ
Ｒ１０２２，ＸＣ。

ＦＲ，ＬＣ−５４０，Ｒ２Ｃ，ＦＲＴＬ、６−２３．Ｃ
Ｈ３Ｅ−２１４，ＳＣＰ、ＭＤＯＫ、Ｂ（ｌｅ、Ａ６　
、ＲＴＧ−２，ＴＨｌ、　　　　５ｕｂｌｉｎｅ　Ｂ、
ＶＨ２、ＶＳＷ。

Ｈｅｐ　３Ｂ、　　Ｈｅｔ）Ｇ２　、　　ＵＣＤ−ＭＬ
Ａ−１４４，５ｆｌＥｌ）、ＰＬＩ　　Ｕｔ　、ＮＢＴ
−１１、ＬＬＣ−ＷＲ０２５＆　、　　Ｃａ　　、　　
Ｈ９ｃ２　（２−１）　、　　Ｉ　Ａ−Ｘｓ　ＳＢＲ。

ｌＥＣ−６，Ｉ　ＥＣ−１８，ＫＮＲＫ、ＮＲＫ−４９
Ｆ。

ＮＨＫ−５２Ｅ、ＢＲＬ３　Ａ、Ｃ１ｏｎｅ　９．Ｈ４
ＴＧ。

Ｈ−４−ＩＩ−Ｅ、Ｈ４−１１−Ｅ−Ｃ３、Ｍｃ　Ａ−
ＲＨ７７７７、Ｍｃ　Ａ　　ＲＨ８９９４，ＭＨ＋　　
Ｃ＋　　、　　Ｎ１−３１゜Ｎ１−３１　　　　Ｆｕｄ
ｒ　、　　Ｌ　２　、　　ＲＦＬ−６，Ａ７ｒ５　。

ＡＩＯ，Ｈ９ｃ２　（２−１）　　、　　Ｌ６　、　　
ＡＲＩ　Ｐ、　　ＡＲ４２Ｊ。

ＮＢ４１Ａ３　、　Ｎｅｕｒｏ−２ａ　、　Ａｔ　Ｔ−
２０、ＭＯＰＣ−３１Ｃ，ＭＰＣ−１１、Ｐ３／ＮＳＩ
／１−Ａｇ４−１．　　ＣＭＴ−９３、ＢＣＬ＋　　ｃ
ｌｏｎｅ　５　　Ｂｌｂ、　　ＣＣＲＦＳ−１８０ＩＩ
、　　Ｈ２ＯＭ＋　　Ｃ＋　　、　　ＭＢＩＩＩ　、　
　３ａｒＣＯＩＩｌａ　１８０゜ｌ−１０、ＮＵＬＬＩ
−３ＣＣＩ　　、ＦＳＫ−４，ＬＬＣ−ＰＫｌＡ、ＬＬ
Ｃ−ＰＫＩ　、ＰＫ（１５）、Ｐｔ　Ｋ１　。

ＰｔＫ２．ＳＩＲΩ、　ＬＬＣＰＫＩ　、　ＰＫＩ３゜
Ｒ９ａｂ　、　ＲＡＢ−９またはそれらに遺伝子を導入
したトランスフォーマット等が挙げられ、中でもヒト胎
児腎細胞由来２９３株、ＢＨＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯ
Ｓ細胞、ラットＨｅｐＩ細胞、ラットト＋ｅｐ■細胞、
ヒト肺細胞、ヒト肝癌細胞、Ｈｅ１）Ｇ２細胞、マウス
肝細胞、ＤＵＫＸ細胞、であることが好ましい。　トラ
ンスフォーマットの作り方としては、目的タンパク質の
アミノ酸配列をコードする塩基配列を持つＤＮＡを含む
発現ベクターを宿主動物細胞にトランスフェクトするこ
とによって行う。

接着性動物細胞にトランスフェクトする発現ベクターと
しては、プロティンＣ（ＰＣ）、活性型プロティンＣ（
ＡＰＣ＞、インターフェロン（ＩＦＮ）、インターロイ
キン２（ＩＬ−２＞、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、コロニ
ー刺激因子（Ｃ３Ｆ）。

エリスロポエヂン（ＥＰＯ）、ティシュ−・プラスミノ
ーゲンアクチベータ（ＴＰＡ）、成長ホルモン、インシ
ュリン、血液凝固箱■因子、ウロキナーゼ（ＵＫ）、イ
ンターロイキン１（ＩＬ−１＞、インターロイキン３（
ＩＬ−３）、リンホトキシン、免疫グロブリン、　ＨＢ
Ｓ　Ａｆｊ　、キモシン。

ＥＧＦ、ＴＧＦ、β−エンドルフィン、カルシトニン、
ソマトスタチン、プロウロキナーゼ（ｐｒｏ−ＵＫ）、
成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）、セルレイン、コレシ
トキニン、カルシトニン、副腎皮質刺激ホルモン放出因
子、αネオエンドルフィン。

方ストリン、下垂体性性腺刺激ホルモン、グルカゴン、
　Ｌ　Ｈ−Ｒ）−Ｌ、ナトリウム利尿ペプチド、オキシ
トシン、副甲状腺ホルモン、セクレチン、ＴＨＲ，パッ
プレシン、プロインシュリン、黄体形成ホルモン、エン
ケファリン、エラスターゼ、血清アルブミン、上皮細胞
成長因子（ＥＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ＞、リポコ
ルチン、ソマトメジン、インターロイキン４　（ＩＩ−
４）、インタロイキン５（ＩＬ−５＞、Ｂ細胞分化因子
（ＢＣＤＦ）、Ｔ細胞代替因子（ＴＲＦ）２．スーパー
オキサイドディスムターゼ、レニン、アンジオシュニッ
ク・ファクター、チオール・プロテアーゼ・インヒビタ
ー（ＴＰ　Ｉ　）　、α１−アンチトリプシン（ＡＡＴ
）、コラゲナーゼ・インヒビターグルタチオン、プロテ
ィンＡ、ウロガストロン。

α−アミラーゼ、Ｔ４リソチーム、インターリューロン
、ニグリン、カルデイオナトリン、インシュリン様成長
因子、ＥＢウィルス抗原性蛋白、ＡＴＬＶ抗原性ペプチ
ド、ポリオウィルス抗原性蛋白、Ａ型肝炎つィルス抗原
性蛋白、Ｈ３Ｖ抗原性蛋白、ＦＭＤＶ抗原性蛋白、ＡＴ
ＬＶ抗原性蛋白。

連鎖球菌のＭ蛋白、ジフテリア汚素抗原性蛋白。

アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ｔ４リガー
ゼ、βラクタマーゼ、βブルカナーゼ、βグルコシダー
ゼ、スタフィロキナーゼ、リパーゼ、ペニシリンＧアシ
ラーゼ、ストレプトキナーゼ、メタピロ力テナーゼ、グ
ルコアミラーゼ、プルラナーゼ、カテコール２，３−オ
キシゲナーゼ。

インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン（
Ｉ　Ｌ　−７＞　、　Ｎ　ＫＣＦ、　Ｌｅｕｋｏｒｅｇ
ｕｌｉｎ、ＭＣＦ、ファセオリン、プレプロー１−マチ
ン、プロキモシン、カルデイオナトリン、アンジオキン
シンＩ、メタロチオネイン、マクロファージ増殖因子α
、リューモルフイン、アポリポプロティンＥ、アポリポ
プロティンＡ−１，β−アクチン。

Ａ型肝炎つィルス抗原線蛋白、ポリオウィルス抗原性蛋
白、水痘・帯状庖疹ウィルス抗原性蛋白。

メタピロ力デカーゼ、オキシリダクタ−ｔ”、　ＤＮＡ
Ｎカリゼ、ダイズ貯蔵蛋白（グリシニン）、ヒルジン、
セルレイン等をコードするＤＮＡを、例えばＢＰ、ＭＭ
ＴＶ、バタテイニアウイルム（Ｖａｃｃｉｎｉａ　Ｖｉ
ｒｕｓ）等の如きベクターに、５Ｖ−４０フーリープロ
モーター、アデノウィルスＭＬＰ。

Ｒ３Ｖプロモーター等の如きプロモーターやセレクショ
ン・マーカーと共に挿入して得られる発現ベクターが挙
げられる。本発明で用いられる接着性動物細胞としては
上記の如き方法でトランスフェクトされたプロティンＣ
（ＰＣ）または活性型プロティンＣ（ＡＰＣ＞を産生す
る細胞であることが好ましい。

本発明において用いられる培養法としては、培養槽内か
ら、連続的に、あるいは間歇的に一部の古い培養液を細
胞を含んだまま、あるいは細胞と分離して扱き出しつつ
、それと見合う量の新しい培養液を供給して、長期間培
養条件を一定に制御しつつ細胞を培養する連続培養法等
が挙げられる。

その中でも潅流培養法であることが好ましい。潅流培養
するに当って重要なことの１つは、培養液中の生細胞と
培養液とを効率よく分離し、古い培養液を培養槽外へ取
り出し、培養槽内の細胞の生育環境を最適条件下に維持
することである。また、ここで培養液から分けられ、培
養槽外へ取り出された古い培養液は、膜による分離法、
おるいは吸着による分離法などにより、その中に含まれ
る有用物質や生育阻害物質を分離・除去した後、培養に
必要な添加成分を新たに加えかつ、カルシウムイオン濃
度も所定８度に調整することにより、新しい培養液とし
て再使用することができる。

本発明において、増殖時期とは、生細胞密度を低い状態
から例えば５×１０６　ｃｅｌｌｓ　／ｍ１２以上の高
い細胞密度に変化させる時期であり、維持時期とは、生
細胞密度を例えば５×１０６　ｃｅｌｌｓ　／威以上に
維持したまま生存させる時期である。ここで増殖終了時
および維持時期における細胞密度は７×１０６〜５×ｔ
（＞７　ｃｅｌｌｓ　／ｌｒｄ！で必ることが好ましい
。

これら増殖時期と培養時期とは特に連続して行う必要は
なく、また培養槽も同一でなくてもよい。

本発明において培養系中のカルシウムイオン濃度は少く
とも増殖時期および維持時期の一時期に０．３ｍＭ未満
とするものである。該カルシウムイオン濃度は、好まし
くは０．００１ｍＭ以上０．３ｍＭ未満、特に好ましく
は０．００２ｍＭ以上０．３ｍＭ未満、更に好ましくは
Ｏ１０２ｍＮ以上０．３ｍＭ未満である。

培養系中のカルシウムイオン濃度を上記の範囲とするこ
とにより、培養系中に生じる細胞凝塊は１塊当りの平均
細胞数が１〜１５個、好ましくは１〜１０個程度となり
、細胞塊内部の細胞が壊死することなく長期的に安定に
増殖、培養することが可能となる。

また、本発明においては、増殖時ｉ１Ｊ］および維持時
期の少くとも一時期に所定の低カルシウムイオン濃度と
することが必要であり、その態様としては例えば下記の
如く種々の態様がある。

（ｉｌ　　増殖時期に低カルシウムイオン濃度の時期を
有し、維持時期は高カルシウムイオン濃度である場合（ｉｉ）　　増殖時期および維持時期とも低カルシウム
イオン濃度である場合（ｉｉｉｌ　　増殖時期は高カルシウムイオン濃度であ
り、維持時期に低カルシウムイオン濃度の時期を有する
場合ｍの場合についていえば、かかる濃度コントロルを行う
目的は、例えば接着力の強い細胞を用いる場合に、増殖
時期において細胞の凝集を強く抑制して有効に細胞数を
増やし、しかも、有用産物を生産させる維持時期におい
ては、有用産物の生産に最も適したカルシウムイオン濃
度まで高めて、生産を効率化することが目的である。

従ってこの場合、増殖時期のカルシウムイオン１度は、
０．３ｍＭ未満、好ましくは０．００１ｍ）１以上０．
３ｍＭ未満、特に好ましくは０．００２ｍ）１以上０．
３ｍＭ未満、更に好ましくは０．０２ｍＭ以上０．３ｍ
Ｍ未満に制御し、一方、維持時期のカルシウムイオン濃
度は細胞の種類により異なるが、例えば０．３ｍＮ以上
、好ましくは０．５ｍＭ以上１ｍ）ｌ以下に制御するこ
とが好ましい。

この場合、維持時期においても細胞分裂はおこるのでそ
の際凝集が発生したり、また細胞分裂によるものでなく
ても細胞間の凝集が生じてくる場合もあるが、この場合
であっても、カルシウムイオン濃度は、基本的には低目
にコントロールされているため凝集の程度はあまり強く
なく、簡単な処理、例えば、低カルシウムイオン濃度に
一時もどすとか、少し強目の攪拌とかで凝集をこわすこ
とが可能である。

かかる操作が有効な細胞としては、ＢＨＫ細胞等が挙げ
られ、特にＢＨＫ細胞またはそれに遺伝子を導入したト
ランスフォーマットは、かかる操作の効果が如実に現わ
れる。

（ｉｉ）の場合についていえば、増殖時期および維持時
期とも低カルシウムイオン濃度であり、本発明において
は最も好ましい態様である。すなわち、増殖時期２ｍ持
時期ともに細胞の凝集を抑えることができ、かつ維持時
期においても生理活性物質を効率的に産生ずることがで
きる。該カルシウムイオン濃度は、０．３ｍＭ未満であ
り、好ましくは０、００１ｍＭ以上０．３ｍＭ未満、特
に好ましくは０．００２ｍ）ｌ以下０．３ｍＭ未満、更
に好ましくは０．０２ｍＮ以上０、　、Ｍ未満である。

かかる操作が有効な細胞としてはヒト胎児腎細胞由来２
９３株、ＣＨＯ細胞等か挙げられ、特にヒト胎児腎細胞
由来２９３株、ＣＨＯ細胞またはそれに遺伝子を導入し
たトランスフォーマットはかかる操作の効果が如実に現
われる。

（ｉｉｉｌの場合についていえば、これは本来接着性の
低い細胞に適用しうる方法ということができるか、増殖
時期に高カルシウム濃度で増殖させ、凝集した細胞を何
らかの手段でバラバラにし、しかるのち、低カルシウム
イオン濃度で維持培養する方法である。

この場合、増殖時期に形成された凝集を解く方法として
は、培養系中のカルシウムイオン濃度を低くし、通常の
攪拌を行うことによって可逆的に解離させることもでき
る。また場合によっては、トリプシン、コラゲナーゼ等
の蛋白質分解酵素を用いて解離させることもできる。

かくして予め別途用意させた増殖細胞を低カルシウムイ
オン濃度で維持培養するのは、維持培養時期は長期間で
あるので、この時期に凝集がおこると凝塊の内部の細胞
が壊死してしまうからである。

以上のような理由から、本態様においては、増殖時期と
維持時期は、別々の時期に別々の装置を用いて行うのが
好ましい。

上記増殖時期のカルシウムイオンａ度は０．３ｍＭ以上
、好ましくは０．５…Ｈ以上２ｍＭ以下であり、−方、
維持時期のカルシウムイオン濃度は０．３ｍＭ未満、好
ましくは０．００１ｍＭ以上０．３＋ｎＨ未満、特に好
ましくは０．００２ｍＭ以上０．３ｍ）を未満、更に好
ましくは０．０２ｍ１（以上０．３ｍＭ未満である。

かかる操作を用いることができる細胞としては前記態様
（ｉｉ）で記載したヒト腎細胞由来２９３株、ＣＨＯ細
胞等が挙げられ、特にヒト胎児腎細胞由来２９３株、Ｃ
ＨＯ細胞またはそれに遺伝子を導入したトランスフォー
マットが好ましい。

本発明において用いられる実質的に無血清の培地とは、
本質的に血清等の生物由来のタンパク質を含有しない無
血清培地からなるものであり、細胞の種類に応じて高々
３ＶＯ１％迄の血清が添加されていてもよいことを意味
する。

かかる無血清培地としては、血清培養用の基礎培地とし
て従来より知られていたものを利用することができる。

例えばＲＰＨＩ−１６４０培地、イーグルベーサルメデ
ィウム（ＢＭＥ）培地、ミニマムエッセンシャルメディ
ウム（ＭＥＭ）培地、イスコツ氏培地、ハムＦ１２培地
、　Ｌ−１５培地、ウィリアムス氏培地、ウェイマウス
氏培地、ダルベツコ変法イーグル培地（ＤＭＥ）等が挙
げられる。これらの基礎培地中のカルシウムイオン濃度
は通常０．３ｍ）ｌ〜１　、８＋ｎＨに調整されて市販
されているので、本発明の低カルシウムイオン濃度培養
に用いるには、カルシウムイオン濃度については、例え
ば０．００２８ｍＭ等の低濃度に調整したものを用意し
、必要に応じてカルシウムイオンを添加して好ましい濃
度に調整して用いる。上記の基礎培地の組成は本来血清
を１０％以上添ｌＪロシて使用するように調整されてい
るものでおるので、本発明の無血清培養に使用するため
には、その血清の代わりに種々の栄養分や増殖因子等を
添加する必要がある。

これらの低カルシウムイオン濃度に調整された無血清培
地には、必要に応じて高々３ｖｏ１％迄の血清が加えら
れてもよい。これは、細胞の凝集を抑えるという観点か
らは低いカルシウムイオン濃度での培養が十分な効果を
発揮するが、細胞の増殖、維持という観点からは、細胞
の種類によっては若干の血清を添加するのが好ましい場
合があるからである。血清の種類としては、ウシ胎児血
清（Ｆｅ２）、ウシ新生児血清（Ｎ８Ｃ３）、ウシ血清
（Ｃ３）、ウマ血清（ＨＳ　）等が挙げられる。

このように血清が加えられる場合、血清中には通常、い
くらかのカルシウムイオンが含有されているので、この
ことも考慮してカルシウムイオン濃度は調整されねばな
らない。

また、市販の無血清培地を利用せずとも、実質的に水よ
りなる水性媒体中に種々の無機塩、ビタミン類、補酵素
、ブドウ糖、アミノ酸、抗生物質などの通常細胞培養に
使用される添加成分を加え、更に、カルシウム塩として
塩化カルシウム、硝酸カルシウムのいずれか、あるいは
両者の混合物などを添加し、必要に応じて３ＶＯＩ％以
下の血清を加えることによって、本発明で用いられる低
カルシウムイオン濃度の培養液を調整することもできる
。

本発明の培養方法において、培養液中の酸素濃度を一定
に維持するために、酸素を供給する方法としては、サス
ペンション液中へ酸素または酸素含有ガスを直接供給し
てもよい。他の供給手段としては、例えば酸素キャリア
ーを用いる方法がある。酸素キャリアーとしては、水と
実質的に混合しないで酸素を溶解し得る液状の化合物が
使用され、その例としては、人工血液の素材として使用
されるような種々のフルオロカーボンが挙げられる。か
ようなフルオロカーボンを酸素供給手段として使用する
場合には、酸素を溶解させたフルオロカーボンをサスペ
ンション液中の上部から液滴状または薄膜状で添加すれ
ばよい。また、酸素透過性のテフロンやシリコンのチュ
ーブを培養槽内に取り付けることによる供給方法もある
。

以下、実施例を掲げて本発明を詳述する。

実施例１１）培養装置添付図に示す培養システムを使用した。培養槽は図のよ
うに外壁の内側に隔壁によって仕切られたセトリングゾ
ーンが設けられ、その上部には培養液の排出口を有して
おり、正味培養容積は約１８０７！である。

２）培養液ＲＰ旧１６４０培地、ハム「１２培地及びダルベツコ変
法イーグル培地を２：１　：１で混合したものにざらに
ブドウ糖、アミノ酸等を加えたもの（以下ｅＲＤＦと称
する）からパントテン酸カルシウム以外のカルシウム塩
（塩化カルシウム。

硝酸カルシウム）を除いた組成のもの（以下１ｏｗｃａ
　　ｅＲＤＦと称する）を基礎培地として用い、増殖因
子としてインスリン、トランスフェリン、エタノールア
ミン、亜セレン酸ナトリウム（ＩＴＥＳ＞を加えた。添
加濃度はそれぞれ９μにｌ　／ｄ、　１０μ（Ｉｔ　／
ｄ、　１０μ）Ｉ　、　２０ｎＨである。

３）培養方法及び結果あらかじめオー１〜クレープ滅菌した前記培養槽に正味
培養容積が約１８０ｒｄ！になるように培養液を送入し
、これにＡＴＣＣから入手したヒト胎児腎細胞由来の２
９３株にヒトプロティンＣのアミノ酸配列をコードする
遺伝子を特開昭６２−１１１６９０号公報記載の方法を
用いて導入したプロティンＣ産生株２９３１１３株を播
種した。

培養槽には溶存酸素濃度が３　ＤＩ）ｍとなるように吹
込ノズル（Ｂ）を通して酸素ガスを自動的にコントロー
ルしながら送入した。

培養槽中の培養液は３７°Ｃに保持した。培養槽中には
マリン型階拌翼が取付けられており撹拌速度は４０ｐｐ
ｍとした。

播種後１日間は回分培養を行い、この後潅流を開始した
。

すなわら、ポンプＰを駆動し培養槽内で細胞と分離され
た培養液をライン（Ｄ）から扱き取り、その岳と同じ吊
の新培地をライン（Ａ）から連続的に送入した。培地置
換率は実験結果に併記した。

培養結果を第１表に示す。

実施例２培養液として実施例１で用いた培養液に塩化カルシウム
をｏ、ｏｉｍＭ４ｍＮ添加のを用いた以外はすべて実施
例１と同様に行った。

培養結果を第２表に示す。

実施例３培養液として実施例１で用いた培養に塩化カルシウムを
０．０４ｍＭ添加したものを用いた以外はすべて実施例
１と同様に行った。

培養結果を第３表に示す。

実施例４培養液として実施例１で用いた培養に塩化カルシウム０
．１ｍＮ添加したものを用いた以外はすべて実施例１と
同様に行った。

培養結果を第４表に示す。

比較例１基礎培地に通常のｅＲＤＦ（Ｃａ＋＋ｉｔ１度０．７４
ｍＭ）を用いた以外はすへて実施例１と同様に行った。

培養結果を第５表に示す。

実施例５細胞にＡＴＣＣから入手したＢＨＫ株にヒトプロブイン
Ｃのアミノ酸配列をコードする遺伝子を導入したプロテ
ィンＣ産生株Ｂ　ＨＫ　２２９−１０株を用いたこと、
及び培養１３日目までは実施例２で用いた培養液を、１
４日目以降は比較例１で用いた培地を用いたこと以外は
すべて実施例１と同様に行った。

培養結果を第６表に示す。

比較例２培養液に比較例１て用いたものを用いた以外は実施例５
と同様に行った。

培養結果を第７表に示す。

第２表　　実施例２実験結果２９３１３株０．０１ｍＭＣａ　ｒＪｌ　＋Ｉ　ＴＥＳ＋ｌＯＷ　Ｃ
ａ　ｅＲＤＦ第１表　　実施例１実験結果２９３１３株ＩＴＥＳ＋ＩｏｗＣａ　　ｅＲＤＦ（Ｃａ＋＋はパントテン酸Ｃａの０．００２６ｍＭのみ
を含む。）第３表　　実施例３実験結果２９３４３株０．０４ｍＭＣａ　殿＋ＩＴＥＳ＋ｌｏｗ　Ｃａ　ｅＲ
ＤＦ第４表実施例４実験結果細胞２９３菩３株培地０．１ｍＭＣａ　勃＋　ＩＴＥＳ＋ｌｏｗ　ＣａＲＤＦ第６表実施例５実験結果細胞ＨＫ２２９−１０株培地Ａ：　０．０１ｍＭＣａ　Ｃｆ１ｚ　＋ＩＴＥＳ＋ｌｏｗ　ＣａＲＤＦ８：　ＩＴＥＳ＋　ｅＲＤＦ　（通常カルシウムイオン
ｌ［０，７４ｍＭ）第５表比較例１実験結果細胞２９３羽３株培地ＩＴＥＳ＋ｅＲＤＦ（通常カルシウムイオン濃度：　０．７４ｍＭ）第７表比較例２実験結果細胞ＨＫ２２９−１０株培地ＩＴＥＳ＋ｅＲＤＦ（通常カルシウムイオンＩａ度：　０．７４ｍＭ）（ｆ
）発明の効果本発明方法によれば、接着性動物細胞を、それ自身を浮
遊させた状態において、細胞同志の過度の凝集を抑えて
、長期間安定に、かつ高密度で成育させることが可能と
なった。

【図面の簡単な説明】

添付図面は、本発明の培養方法を実施するために適した
培養装置の概略図を示したものである。１刃

Claims

【特許請求の範囲】

（１）接着性動物細胞を実質的に無血清の培地において
増殖、維持するに当つて、少くとも増殖時期および維持
時期の一時期に培養系中のカルシウムイオン濃度を０．
３ｍＭ未満とすることを特徴とする接着性動物細胞の培
養方法。
（２）培養系中のカルシウムイオン濃度を０．００１ｍ
Ｍ以上０．３ｍＭ未満とする請求項１記載の接着性動物
細胞の培養方法。
（３）培養系中のカルシウムイオン濃度を０．００２ｍ
Ｍ以上０．３ｍＭ未満とする請求項１記載の接着性動物
細胞の培養方法。
（４）培養系中のカルシウムイオン濃度を増殖時期およ
び維持時期ともに０．００２ｍＭ以上０．３ｍＭ未満と
する請求項１記載の接着性動物細胞の培養方法。
（５）培養系中のカルシウムイオン濃度を増殖時期にお
いては０．３ｍＭ以上とし、維持時期においては０．０
０２ｍＭ以上０．３ｍＭ未満とする請求項１記載の接着
性動物細胞の培養方法。
（６）培養系中のカルシウムイオン濃度を増殖時期にお
いては０．３ｍＭ以上とし、維持時期においては０．０
２ｍＭ以上０．３ｍＭ未満とする請求項１記載の接着性
動物細胞の培養方法。
（７）培養系中のカルシウムイオン濃度を増殖時期にお
いては０．００２ｍＭ以上０．３ｍＭ未満とし、維持時
期においては０．３ｍＭ以上とする請求項１記載の接着
性動物細胞の培養方法。
（８）増殖終了時および維持時期における細胞密度が５
×１０＾６〜５×１０＾７ｃｅｌｌｓ／ｍｌである請求
項１記載の接着性動物細胞の培養方法。
（９）増殖および維持時期における細胞凝塊が１〜１０
ｃｅｌｌｓ／塊である請求項１記載の接着性動物細胞の
培養方法。
（１０）接着性動物細胞がヒト胎児腎細胞由来２９３株
、ＢＨＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ラットＨｅｐ
I 細胞、ラットＨｅｐII細胞、ヒト肺細胞、ヒト肝癌
細胞、ＨｅｐＧ２細胞、マウス肝細胞、ＤＵＫＸ細胞、
またはそれらに遺伝子を導入したトランスフォーマット
である請求項１記載の接着性動物細胞の培養方法。
（１１）接着性動物細胞がヒト胎児腎細胞由来２９３株
、ＣＨＯ細胞またはそれらに遺伝子を導入したトランス
フォーマットである請求項４、５または６記載の接着性
動物細胞の培養方法。
（１２）接着性動物細胞がＢＨＫ細胞またはそれに遺伝
子を導入したトランスフォーマットである請求項７記載
の接着性動物細胞の培養方法。
（１３）培養法が連続培養法である請求項１記載の接着
性動物細胞の培養方法。
（１４）培養法が潅流培養法である請求項１記載の接着
性動物細胞の培養方法。
（１５）接着性動物細胞が生理活性ポリペプチドを産生
する細胞である請求項１記載の接着性動物細胞の培養方
法。
（１６）接着性動物細胞がプロテインＣまたは活性型プ
ロテインＣを産生する細胞である請求項１記載の接着性
動物細胞の培養方法。