JPH02500081A

JPH02500081A - 微生物およびその他の生物の培養のための発酵装置

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Publication number: JPH02500081A
Application number: JP62503358A
Authority: JP
Inventors: タナック　ジョセフィーノ　ビー
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1986-05-27
Filing date: 1987-05-11
Publication date: 1990-01-18
Also published as: WO1987007293A1; EP0311609A1; EP0311609A4; US4665035A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】微生物およびその他の生物の培養のための発酵装置遣批ｉ巨本発明はバイオテクノロジー（生物技術）、および好気性発酵用のフラスコまたは容器装置の改良に関し、特に生物の成長によって発生される細胞または製造物の改良した生産のために微生物、細胞ラインまたは他の生物の液体成長媒体内の培養に使用される発酵容器に関する。

ＭＩＫの小さい装置を用いる本発明の容器は大きな空気散布式発酵容器で得られるレベルに近づく高い曝気容量を得ることができ、容器は低コストで培養プロセスを開発しまたはｉ＆適にし、大規模な生産に規模を拡大することができる。

え呪Δ１１好気性微生物による製品または代謝産物の成長速度および形成は培養媒体中に溶解している酸素の利用性によってしばしば調節される。低レベルの酸素はある微生物の代謝産物の成長または形成を抑制するが、臨界的レベル以上の酸素の濃度は活動に影響を与えない、このため、好気性生物の培養中高酸素供給を維持することが望ましい。

攪拌した発酵装置内で、曝気は容器中に空気を注入または散布することによって行われる。この工程中、高レベルの溶解した酸素が容易に得られる。フラスコまたはチューブに含まれた媒体に対して曝気は単純な気体−液体接触による。すなわち酸素は気体空間から液体培養液中に移送される。このため、液体媒体の表面積は移送工程中重要である。露呈されている表面積が大きければ大きいほど、媒体に対する曝気は良好である。大きな表面積の露呈はフラスコを振り混ぜることによって実行される。このことは渦を発生し、空間に一層多くの液体表面積を露呈させる。

曝気を増加するために発明された他の方法はフラスコに切れ目を設けることまたはフラスコの底部にバッフルを設けることを含んでいる。このようにすると、フラスコは振り混ぜられると、バッフルは渦を破り、液体媒体は飛沫が発生され、渦だけによって与えられる増加を越えた表面積のかなりの増加を発生ず乞。

しかしながら、フラスコ内部の媒体の表面積の増加は必ずしも高曝気とはならない、容器内部への空気の供給が他の制限的な要因である。フラスコの頚部の長さおよび蓋の形式が液体の表面に対する空気の流れに非常に影響を与える。微生物の培養に用いられるフラスコまたはチューブは汚染な防ぐために伝統的に綿製詰物で密封される。しかしながら、綿製詰物は空気の透過性に関して良好な蓋ではない、すなわち、綿製詰物は気体の移送にかなりの抵抗を示す、その結果、綿製詰物は、低レベルの酸素を容器中へ拡散し、容器内部で増大してしまう二酸化炭素をわずかに逃がすだけである。

綿製詰物に代えて蓋の数種の改良が導入されており、改良は、緩く嵌合するステンレススチール製、およびプラスチック製蓋、ガーゼ発泡パッドおよびシリコーンスポンジ詰物を含む、緩く嵌合する蓋は、空気がフラスコまたはチューブの口の上方でキャップの下方から滑り込みまたは拡散することを可能にするものであり、一方線製またはガーゼの蓋は空気が頂部から蓋を通して容器に入ることを可能にするものである。これらの方法による空気の取込みは貧弱なものであり、さらに空気は容器の頚部の長さを横切らねばならない。これらの理由のために、従来のフラスコ装置は媒体中への高レベルの酸素溶解を達成する空気散布式発酵装置より劣る。改良した小規模の装置および技術に対する要求にもかかわらず、そのようなものは得られていない。

ｉ乳α１吐したがって、本発明の目的は、バイオテクノロジーの分野において、成長の増加のための好気性微生物の培養および（または）代謝産物の製造に対して新規な改良した手段を提供することにあり、微生物培養の改良した曝気を行う発酵容器装置の設計を含むものである。

本発明の他の目的は発酵工程の規模拡大に利用できる改良した発酵容器を提供し、試作寸法の発酵装置を評価することにある。

本発明のこれらのまたは他の目的、特徴および利点は以下の記載および添付図面から明らかになる。

Ｈの　・および詳細なＵ本発明は適当な成長媒体において、微生物または細胞ラインのような選択した生物の好気性培養に対する容器装置に間する。

１つの好ましい実施例において、本発明は、液体成長媒体中の選択した生物の人工培養による細胞成長のための培養容器装置に間し、すなわち簡略化のために以後はときには培養ボトルと呼ぶものに関する。好ましくは、培養ボトルは丸い平らな底のボトルであり、中心軸線を中心として半径方向に対称であり、振り混ぜ中その液体の曝気含有量を最適にするための回転振り混ぜ、および渦発生に適しており、ボトルは、さらに、ボトルの底部の内部表面に環状バッフル、好ましくは半径方向のバッフルおよび周囲バッフルの対称的に離れた配列体から成る渦発生液体の表面を破るように機能する曝気を高める手段を有する。

好ましくは、バッフルの配列体は４点配列体または３点配列体である。

好ましくは、バッフルの４点配列体は、周囲バッフルに対して９０．１８０．２７０および３６０度でほぼ表さ九る周囲方向の間隔な有し、環状バッフルに対しては４５．１３５．２２５および３１５度で表される周囲方向の間隔を有する。

バッフルの３点配列体は、好ましくは、周囲方向の間隔を有し、環状バッフルに対して６０．１８０および３００度の周囲方向の間隔を有する。

各周囲バッフルは、好ましくは、渦発生方向に向かう曲率を持つバッフル部材を有し、１つの実施例では、各周囲バッフルは渦発生の方向に反対向きの曲率を持っバッフル部材も有する。

好ましくは、環状バッフルは周囲バッフルから半径方向に離れている。１つの実施例では、周囲バッフルは、底部周囲が液体の渦流に開口しているように、ボトルの側壁および底部と連結するブリッジバッフルである。また、好ましくは周囲バッフルは、底部周囲上方の環状区域が液体の渦流に開口しているように、底部周囲を遮断するが隣接する側壁から離れているバッフルであるような実施例である。

他の好ましい観点から、本発明の培養ボトルは渦発生室、肩、頚部および肩肉で肩から懸下し■形状バッフルの環状配列体に構成された飛沫保護手段を有する。

各■形状バッフルはボトルの頭部に向かって渦発生室から上方に飛沫する液体の上昇を分断し、中央方向および横方向に向きを変えるように構成した半径方向に配列したＶ形状頂縁に収束する下方に突出する側部がら成る。

好ましくは、■形状バッフルは同一形状および間隔を有し、互いに連結しており、ボトルの頚部の内部表面の下方延長部である仮想円筒状表面にほぼ一致する内部表面を有する。

本発明の培養ボトルは、曝気を高めるために、好ましくは巾広の口を持つ開口頚部を有し、および開口頚部に対してフィルタ材料から成る気体透過性曝気蓋を有する。好ましい実施例では、曝気蓋は、開口頚部用の同心的な第１および第２開口頂部の蓋を有し、蓋は好ましくは互いに嵌合できる。第１蓋は、開口頂部の中央に位置決めされかつ閉じたボトル内外に気体の移送を可能にする同−広がりの被覆関係で気体透過性フィルタ層材料を支持するように構成された半径方向に分割された孔付の隆起したスカフォールドを有する。第２蓋はその開口頂部の中央に位置決めされた半径方向に分割した孔付の隆起したスカフオールドを有する。

開口頭部、第１および第２益は第１および第２蓋の間に気体フィルタ作用関係で適所に固定されたフィルタ材料と密封閉鎖関係で互いに嵌合するように構成されている。

好ましい形状では、第１蓋および（または）第２蓋は、曝気蓋で密封したボトルが回転振り混ぜ作用下にあるとき、空気の周囲方向の移動を生じさせるように構成されて、それによってフィルタ材料を通る空気の流れを促進しかつボトル内部の曝気を容易にする半径方向のフィンを有する。

圀ｌαｌ監久乳肌本発明は添付図面を参照することによって充分理解できる。

第１図は、本発明の培養ボトルの好ましい実施例を部分的に断面で示す側面図である。

第１Ａ図は第１図の線ＩＡ−ＩＡにおける培養ボトルの断面図である。

第２図は第１図の線２−２における培養ボトルの断面図である。

第２Ａ図ないし第８Ａ図および第２Ｂ図ないし第８ＢＩＮは、培養容器中の環状バッフルおよび周囲バッフルの第１図および第２図と同様な図であり、第２Ａ図ないし第４Ａ図および第２Ｂ図ないし第４Ｂ図は従来のバッフル配列体と思われるものを示し、第５Ａ図ないし第８Ａ図および第５Ｂ図ないし第８Ｂ図は本発明のバッフル配列体の好ましい実施例を示す。

第９図および第１０図は、それぞれ本発明の外部曝気蓋の側面図および平面図である。

第１１図および第１２図は、それぞれ培養ボトルの開口頚部および外部蓋と嵌合自在の本発明の内部曝気蓋の側面図おｉび平面図である。

第１図を参照するに、培養ボトルまたは容器１０は中心軸線１〕を中心として円形で対称的であり、かつ開口１４を形成する比較的広い口１３を持つ頚部１２を有している。ボトルは、内壁および外壁１０ａ、１０ｂ、Ｗ部１５、回転下で液体成長媒体を混合し渦を発生する室２１および底部２２を有する。肩部１５において一体部品として、スプッラシュガード（飛沫保護）バッフル配列体１６が設けられている。第１Ａ図に最も良く示すように、配列体１６は同一形状の個々の連続したＶ形状バッフル１７の周囲方向の配列体であり、バッフルの各々は対向して下方に収束する側壁１つによって形成したＶバッフル突部１８および頚部１２の内壁１０ａの延長部である内部表面２０を有し、渦発生室２１から上方に出るまたは下方に入る空気の自由な流れを可能にしている。底部２２の内部表面１０ａ上で、環状バッフル２３および周囲バッフル２４の対称的配列体が配置されており、配列体は、点線の概路線の液体レベルライン２５によって示す容積内のボトル１０の液体を回転または振ることによって渦を発生することに関する中心２７を有する。バッフル配列体は第５Ｂ図の環状および周囲のバッフルの３点配列体または第２図の４点配列体のような異なったパターンを有することができる。バッフルは半径上直線セグメントまたは前方または後方に曲率を持つ弧状に湾曲したバッフル（第１図および第２図）のような異なった形状な持つことができる。１つの好ましい実施例は、バッフルが底部の周囲縁２２ａに配置されているが、室の底部および内壁１０ａに取付けられて縁間口を残しているようなブリッジバッフル２４ｃ（第７Ａおよび７Ｂ）である、ブリッジバッフルの下方の開口２４ｃはボトル内の渦流の流体の一部の流れを可能にし、液体の渦発生中のキャビテーション（空洞現象）および曝気を生じさせるような形状である。他の好ましい実施例は第８Ａ図および第８Ｂ図に示ｔＬ形状バッフルまたはＬバッフル２４ｄである。Ｌバッフル２４ｄは底部の縁２２ａに取付けられかつ液体レベルライン２５より上方に延び、内壁表面１０ａから離れた直立フィン２４を有する。

培養液が無菌で渦発生され、まき散らす（飛沫）ことなしに曝気されるように、培養ボトルを密封または閉鎖するために、蓋要素が設けられており、それは外部曝気蓋またはキャップ３ｏ、内部曝気蓋またはキャップ座４０、およびフィルタカップ５ｏを有する（第９図ないし第１２図）、好ましい実施例において、キャップ、フィルタカップ、キャップ座およびボトルの口１３は互いに嵌合し、相互に支持される。キャップ３０は同心的中央開口３２を持つ円筒状底部３１を有している。底部は、肩３３と、閉じた頂部３５を持つスカフオールド３４と、開口または穿孔３８を間に持つ周囲方向に離れて置いた垂直フィン３７を有する側壁３６と、を含んでいる。キャップ座４０は、同心的中央開口４１ａを持つ底部４１と、第１肩４２と、キャップ支持体４３と、横方向の穿孔４８ａを持つ第２肩４３ａと、閉じた頂部４５を持っスカフォールド４４と、側壁穿孔を間に持つ周囲方向に離れて置いた垂直フィン４７と、を含んでいる。積層したガーゼのような適当な空気透過性フィルタ材料から作られるフィルタカップ５゜は、キャップ座４０の横方向の穿孔４８ａおよび側壁穿孔４８ｂ上に同−広がりで被覆する関係に１かれるように、側壁５１および開口５２を有するように形成されている。

代表的な培養液成長操作において、装置（ボトル、キャップ、キャップ座、およびフィルタ）は予め滅菌され、液体成長媒体が液体レベルライン２５まで充填するのに充分な容積でボ゛トルに導入され、媒体に選択した種子培養液または微生物培養液が接種される６次に、ボトルは、ボトルの口１３にキャップ支持体くキャップ座）４０を置き、フィルタカップ５ｏ内に穿孔付スカフォールド４４を置き、フィルタカップ５０を外部キャップ３０で蓋をすることによって、段階的に閉じられる。ボトルを閉じるために、キャップ支持体、その開口４１ａおよび口１３は、これらの部分が入れ子式間係、スナップ嵌合、ロック嵌合、または他の適当な着脱自在の固定嵌合によって、互いに堅く嵌合するように、形成されている。同様に、キャップ、その開口３２およびフィルタカップ支持体４３および肩４・３ａは、これらの部分が互いに堅く嵌合するように、形成されている。後者の嵌合は、フィルタカップ５０がキャップ支持体のスカフオールド上に置かれて穿孔を被覆し、そのようにキャップ支持体上に置かれて、キャップ３０およびキャップ肩３３をキャップ支持体の肩４２および４３ａに置くことによってキャップおよびキャップ支持体の間に挟まれて適所に保持されるようなものである。この結果、穿孔３８．４８ａおよび４８ｂを通る空気の流れまたは気体の流れは滅菌したフィルタ５０を通過しなければならない、密封した培養ボトルは次に所定の期間接種した液体の渦発生を達成する安定な回転を伴った細胞成長状態下に置かれる。渦発生中液体の流れは、渦発生の方向において環状および周囲方向の両方である。液体の流れは前述のバッフルの配列体に破られて、液体の曝気が好ましく高められまたは最適にされ、望ましい微生物または種子培養の成長速度が改良される。ある量の飛沫がバッフル作用に起因して、またはバッフルが存在しないときでさえ生じ、この飛沫は回転速度に比例する。フィルタカップ５０が乾燥したままであるように飛沫を抑制するために、スプラッシュガード１６はバッフル付の藻発生室から直接上方に向かう飛沫を遮断し横方向に向きを変えさせる機能を持っている。

曝　容量および飛沫抑　に対　る評価本発明のボトルまたはフラスコ容器の好ましい実施例がクーパー等のＫＮ！ｉ酸化方法、１９４４年（工業技術化学３６　：　５０４）にしたがって曝気容量に対して評価された。このため、フラスコは５０−の硫酸液で満たされ、一層のガーゼで被覆された。対照フラスコは、ａ、バッフルなしの２５０−アーレンメヤ　フラスコ、ｂ、３００−の市販（ベルコ）の浅いバッフル付フラスコ、ｃ、３００−の市販（ベルコ）の深いバッフル付フラスコから成る。

また、前述のフラスコは発酵作用中のガーゼの湿潤度に対して評価された。この比較のために、５０−の次の媒体がフラスコに分配された。すなわち４％のしよ糖および４％の線種子あらびき粉が分配された。フラスコにはストレプトミセス　±−？／ＮΣ配＝−乞乙の１０％接種物が接種され１８０　ｒｐｍの振り混ぜ（モデルＧ−５３ニュー　ブランズウィック　シェーカ）で１−２日間培養された０表１の結果は、異なったフラスコ設計における異なった曝気容量を示す、５．１ｍＭ（ミリモル）酸素／リットル／分の酸素吸収速度（○ＡＲ）値を持つフラスコ番号１８に特に興味を引かれる。このフラスコのバッフル装置はフラスコの底部に４対のバッフル（”蝶”設計）を有するものであり、フラスコの底部中央に開口した十字バッフルが補足されているものである。このバッフル装置はフラスコ内で媒体を混合する際に極めて効率的であることを証明した。

表１　＠り混ぜ中興なったバックル装置を持つフラスコの酸素吸収速度（○Ａ　Ｒ−ｍ　Ｍ　ｒｔＬ素／リットル／分）および蓋の湿潤度（Ｃ＝清純、ＳＣ−わずかに清純、ＭＤ＝中間汚れ、ｂ＝汚れ）３ａ、３ｂ　：　１．５０：　ＭＤ　：　１．３９：　Ｄ５ａ、５ｂ　：　２．８１：　ＭＤ　：　−；　−６ａ、６ｂ　：　３．６９：　ＭＤ　：　４．９０：　ＭＤ７ａ、７ｂ　：　３．３０：　ＭＤ　：　４．５０：　ＭＤ８ａ、８ｂ　：　３．１８＋　ＭＤ　：　３．９０：　ＭＤ対照　Ａ　Ｉ　０．８５：　Ｃ：　０．９０：　ＣＢ：１．１３　二　Ｃ：　１．２８：　ＣＣ：　２．３３：　ｓｃ　：　２．７７：　ｓｃ対照　Ａ＝２５０ｄアーレンメヤ　バッフルなしフラスコ、Ｂ＝３００ｍ（ベルコ）浅いバッフル付フラスコ、Ｃ＝３００ｍ（ベルコ）深いバッフル付フラスコ、ＯＡＲ値およびキャップの湿潤度は表１に示されている。

例３：蓋設計第９図ないし第１２図の蓋はフラスコの口にぴったりと嵌合するスリップオンタイプの蓋である。Ｈの側壁にはガーゼが裏当てされており、外部殻にはリブまたはフィンが設けられている。リブは空気を捕獲するように設計されており、振り混ぜ中の゛フラスコの回転運動によって、捕獲した空気の積極的な拡散をフラスコの内部に向ける。

例４：フラスコ装置の曝気容量バッフルなしおよびバッフル付形状の本発明のフラスコ実施例（第１図および第２図）およびその蓋（第９図ないし第１２図）が市販のフラスコ、すなわち綿製蓋でテストされた２５０ｍ１ナルゲネ　ポリプロピレン　フラスコおよび市販（カプラ）のプラスチック製蓋でテストされた３００ｍＪベルコの浅いおよび深いバッフル付フラスコ、と比較して曝気容量に対して評価された。

フラスコの曝気容量は前述のクーパー等の硫酸酸化手順を用いて評価された。このために、５０ｍ１量の硫酸液がフラスコに分配され、種々のＲＰ　ＭレベルでモデルＧ−５３ニューブランズウィックシ二−カ内で振り混ぜられた。曝気値はｍＭ（ミリモル）酸素／リドツル／分の単位で酸素吸収速度（ＯＡＲ）として表されている０表２に示す実験結果は、現在用いられているフラスコに対する本発明のバッフル付およびバッフルなしくすなわち底部取付はバッフルなし）の優秀性を明らかに示している。

表２　酸素吸収速度（ＯＡＲ）　、５０ｍＱｆｊＥ酸／フラスコ、モデルＧ−５３ニューブランズウィックシニーカ、２６℃フラスコの形式　：　１００：　１５０：　２００：　２５０％式％バッフルなし　＋０．３８：０．６５：０．８６：０．９８（綿製蓋）　・３００−第１図、第：　・２図、第９図−第１２：０．４８：０．７８：１．０３：１．５１図、バッフルなし　：　・３００−ベルコ　：　。

浅いバッフル　：０．４４：０．８５：１．０５：１．７２（カプラ蓋）　・３００−ベルコ　：　・深いバッフル　：０．５９：１．４０：２．１６：３．６６（カプラ蓋）　・３００ｄ第１図、第：　・２図、第９図−第　：０．６９：１．６５：４．４０＋６．５９１２図、バッフル付：　・微生物の培養単一細胞の反核生物（エシェリキア　旦）、単一細胞の真核生物（サツカロミセス　セテビシアン）、アクチノミセテ（んＫの成長に対して評価された。比較のために、次の従来のフラスコも評価された。すなわち２５０ｍ１ナルゲナ　バッフルなしポリプロピレン　フラスコ（綿製蓋）および３００−の浅いおよび深いバッフル付フラスコ（カブラ蓋）である。

Ａ、　エシェリキア　エ± 種が白金耳一杯の微生物と２５０ｍ１アーレンメヤ　フラスコに含まれる養分液媒体（ディフコ）に接種することによって準備された。接種したフラスコは３７ ℃の温度で静止状態の下で一晩培養された。フラスコ中の微生物の成長が種の接種として用いられた。

１城の種が研究中の種々のフラスコに含まれる５Ｍの成長媒体に接種するために用いられた。成長媒体は次の組成物、すなわち３．０％グルコース、１．５７５％に２ＨＰＯ４，０，６７５％ＫＨ２ＰＯ４，０，１％酵母抽出物（ディ７コ）　、０．４５％（ＮＨ４）２ＳＯ４，０，０６％クエン酸ナトリウムおよび０．０１５％Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ４，７Ｈ２０がら成るものであった。ｐ−２０００ポリグリコール消泡剤の１滴が各フラスコに加えられて、２０ＯＲＰＭで１８時間３７℃の温度で培養されたくモデルＧ−５３ニューブランズウィック　シェーカ）。

表３の結果は、本発明のバッフル付フラスコが７．０９の成長値（光学密度５５５ｎ＋ｎ）の最も高いエシェリキアコリの成長を与えていることを示している。

表３　単一細胞の原核生物、エシェリキアコリの培養に対する従来のフラスコと本発明のフラスコの比較（５０ｍｌ媒体／フラスコ、３７℃、１８時間、モデルＧ−５３ニューブランズウィックシ二一カによる２０ＯＲＰＭの振り混ぜ）３００−　第１図、第２図、　：　７．０９：　０．１４第９図−１２図バッフル付　・（第９図−第１２図蓋）　・３００−、ベルコ、深いバッフル　：　５．９９：　０．２０（カブツブラスチックＭ）　・３００ｍ１　第１図、第２図、　・第９図−第１２図バッフルなし　：　５．３６：　０．０８（第９図−第１２図蓋）３００−、ベルコ、浅いバッフル　：　４．６８：　０．２３（カブラ蓋）２５０−、ナルゲナ、バッフルなし：　３．９６：　０．０９（綿製蓋）ａ）９サンプルの平均　差の意味の統計的比較に対するタラキーのＷ手順（Ｗｏ、０５１　＝　０　、２１　）は、成長値のすヘテニ著シい差があることを示す。

Ｂ、サツカロミセス　セレビシアエ種が白金耳一杯の微生物を細菌培養基の斜面から５０ｍ１サブロー　ブドウ糖液（ディフコ）に移すことによって準備された。っ接種したフラスコは３４℃で一晩静止状態で培養された。微生物成長は種接種として用いられた。

１ｍｌの種が研究中の種々のフラスコ中に含まれる５０ｍ１成長媒体に接種されるのに用いられた。成長媒体は、次の組成物、すなわち５．０％グルコース、１％（ＮＨ４）２ＳＯ４，０，６％ＫＨ２ＰＯ４，０，１％酵母抽出物（ディフコ）、０．３％ＭｇＳＯ４，７Ｈ２０，０，０１％ＣａＣＬ１２．２Ｈ２０および０．０１％ＮａＣＬから成るものであった。Ｐ−２００ＯＲＰＭ（モデル　Ｇ− ５３ニュー　ブランズウィック　シェーカ）で１８時間、３４℃で培養された。

表４の結果は、最良の微生物成長（それぞれ５．６３および５．５７）が本発明のバッフル付およびバッフルなしのフラスコで得られたことを示している。

表４　単一細胞の真核生物、サツカロミセス　セレビシアエの培養に対する従来フラスコと本発明のフラスコの比較（５０ｍｌ媒体／フラスコ、３４℃で１８時間２０ＯＲＰＭの振り混ぜ）フラスコ形式および蓋　：　成長（０，Ｄ、　５５５ｎｍ）　：　標準偏差３００ｍ１、第１図、第２図、：　５．６３　＋　０．１９第９図−第１２図バッフル付　：３００ｍ１、第１図、第２図、：　５．５７　：　０．１６第９図−第１２図バッフルなし：３００−、ベルコ、　：　５．３２　：　０．１９浅いバッフル（カブラ蓋）　：３００ｍ１、ベルコ、　：　５．３１　：　０．１８深いバッフル（カプラＭ）　：２５０−、ナルゲナ　：　５．１９　：　０．１５バツフルなしく綿製蓋）　：ａ）９サンプルの平均　差の意味の統計的比較に対するタラキーのＷ手順は下に示されている。Ｗｏ、。５＝０．２４（同一アンダーラインの数は意味のない差を示す。）５．１９　５．３１　５．３２　５．５７　５．６３Ｃ，ストレプトミセス　±エル１」ニラ乙ん種がストレプトミセス　チャルトルーシスの微生物成長を細菌培養基斜面から３００−ベルコの浅いバッフル付フラスコに含まれる発酵媒体に移すことによって準備された。発酵媒体は次の成分、すなわち０．５％酵母抽出物（アンバー　ラプス）、０．１％グルコース、２．５％デキストリン（アメリカン　メイ゛ズ）、０．５％消化液の硬質層（シェフイールド）、０．３％スプレー乾燥した肉溶解物（ジェンーキム）、および０．２％ＣａＣＯ３から成るものであった。接種したフラスコは３３℃で１８ＯＲＰＭで振り混ぜることによって培養された。２日後に、良好な微生物成長が得られ、外観上受わら色に着色されていた。これが種接種として用いられた。

２ｍ’；ｌの種が研究中の種々のフラスコに接触するのに用いられた。

フラスコは５０−の前述の発酵媒体を含んでいた。Ｐ−２０００ポリグリコール消泡剤の１滴が接種後に各フラスコに加えられ、フラスコは２６℃で２４時間２０ＯＲＰＭ（モデル　Ｇ−５３ニユー　ブランズウィック　シェーカ）で振り混ぜられることによって培養された。

表５の結果は、最良の成長（２７，７３％の沈殿）がバッフルなしフラスコ（第１図、第２図、第９図−第１２図）で得られていることを示している。他の場合、（第１図、第２図、第９図−第１２図）のバッフル付フラスコは最も重要ではないが優秀な成長を発生した。そのフラスコの微生物は発酵サンプル中の茶系黒色の変色によって証明されるような最も強烈な着色を発生した。

表５　アクチノミセテ　ストレプトミーｔん　±」ソト上ノヒニにス、の培養に対する従来フラスコと本発明フラスコの比較（５０ｍｌ媒体／フラスコ２６℃で２０　ＯＲＰＭで２４時間の振り混ぜ）：成長外観：（沈殿）　：３００−１第１図、第２図、：茶系黒　＋１９．２０：　ｏ、７０第９図−第１２図バッフル付：　“ ３００ｍ１、ベルコ、　：暗い茶　：１９．７０：０．７９深いバッフル（カブラ蓋）：　・３００ｍ１、ベルコ、　：明るい茶：１４．４３：１．１６浅いバッフル（カプラ蓋）：　・２５０ｍ１、ナルゲナ、　：麦わら色：１７．７３：１．１５バツフルなしく綿製蓋）　・３００−１第１図、第２図、：麦わら色：　２７．７３　＋　１．９６第９図− 第１２図バッフルなし：ａ）３フラスコの平均　差の意味の統計的比較に対するタラキーのＷ手順は下方に示されている。ＷＰＶｏ、０５ＰＶ＝３．８３（同一アンダーラインの数は意味のない差を示す）１４．４３　１７．３７　１９．２０　１９．７０　２７．７３Ｄ、ペニシリウム−７／（ラニウ人種が微生物の菌糸体断片を細菌培養基斜面から３００ｒｕｌベルコの浅いバッフル付フラスコに含まれる５０ｍ２のサブロー　ブドウ糖液（ディフコ）に移すことによって準備された。接種したフラスコは２日間、３３℃で１８０ＲＰＭ″？：振り混ぜられることによ２−の種が研究中の種々のフラスコを接種するために用いられた。フラスコは！５０ｍ！の発酵媒体、具体的にはジャガイモのブドウ糖液（ディフコ）を含んでいた。Ｐ−２０００ポリグリコール消泡剤の１滴が接種役名フラスコに加えられて、フラスコは２６℃で３日間２０ＯＲＰＭ（モデル　Ｇ−５３ニュー　ブランズウィック　シニー・−・力）で振り混ぜることによって培養された。

表６の結果は種々のフラスコ中の異なった種類の成長を示す。

特に、本発明のバッフルなしフラスコは最良の成長、すなわち３０．５％沈殿を発生した。一方、対応するバ・７フル付フラスコは異なった形態の、特にベレット状ではなく菌糸体のマ・７トの成長を発生した。

表６　かび、ペニシリウム　アベラニウムの培養に対する従来のフラスコと本発明の比較（５０ｍｌ媒体／フラスコ、２６℃で２０ＯＲＰＭで３日間の振り混ぜ）ａ）３フラスコの平均　注入できる発酵サンプルだけが評価された。フラスコの側部上の菌糸体マットの成長、特に本発明お、　よび深いバッフル付ベルコのバッフル付フラスコはこれらのフラスコに対する低い沈殿を考慮したものである。

本発明の容器および蓋装置は、容器、フィルタ、ガラス製品、プラスチック製品の技術で用いられている従来の材料でもよい任意の適当な材料から作られる。好ましい容器の実施例は一体のポリプロピレンまたは同様なプラスチックのフラスコであり、好ましくは射出成形で作られた第９図ないし第１．２図に示すような蓋要素を持つ第１図に示すようなバッフル付またはバッフルなし、好ましくは底部バッフル付のものであり、滅菌に適しており、再使用できるかまたは使い捨てされるものである。装置の形状および寸法は特に臨界的なものではない。２リツトルおよび３０〇−の寸法が好ましい０例えば、第１図に示す３００ｍｆｌの媒体用の好ましい寸法は次のような直径および間隔を有する。

（インチ単位）Ｄ□　１．７５　Ｄｓ　Ｄ２　１．７５Ｄ２　１．７５　Ｄ２　Ｄ３　１．０　（傾斜高さ）Ｄｓ　２．７５　Ｄ３　Ｄ４　２．５　（傾斜高さ）ＤＰＶ４ＰＶ　３．２５　Ｄａ　Ｄｓ　Ｏ□５　（傾斜高さ）Ｄ５２．５　底部バックル高さ　ＣａＯ，５国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．成長液体中の選択した生物の人工培養による細胞成長用培養ボトルにおいて、ボトルは中心軸線を中心として半径方向に対称であり、振り混ぜ中液体含有物の曝気を最適にするように液体の回転振り混ぜおよび渦発生に適しており、ボトルはさらに渦発生液体の表面を破って曝気を高める手段を有し、該手段はボトルの底部内部表面に配置した環状バッフルおよび周囲バッフルの対称的に離れて置いた配列体から成ることを特徴とする培養ボトル。
２．請求項１記載の培養ボトルにおいて、環状バッフルが半径方向バッフルであることを特徴とする培養ボトル。
３．請求項１記載の培養ボトルにおいて、バッフルの配列体は周囲バッフルに対して約９０、１８０、２７０および３６０度で表される周囲方向の間隔を有し、環状バッフルに対して４５、１３５、２２５および３１５度で表される周囲方向の間隔を有することを特徴とする培養ボトル。
４．請求項１記載の培養ボトルにおいて、バッフルの配列体が４点配列体であることを特徴とする培養ボトル。
５．請求項４記載の培養ボトルにおいて、各周囲バッフルが渦発生方向に向かう曲率を持つバッフル部材から成ることを特徴とする培養ボトル。
６．請求項５記載の培養ボトルにおいて、各周囲バッフルは渦発生方向に対抗する反対の曲率を持つバッフル部材であることを特徴とする培養ボトル。
７．請求項１記載の培養ボトルにおいて、バッフルの配列体が３点配列体であることを特徴とする培養ボトル。
８．請求項１記載の培養ボトルにおいて、バッフルの配列体は周囲バッフルに対して１２０、２４０、および３６０度で表される周囲方向の間隔を有し、環状バッフルに対して６０、１８０および３００度で表される周囲方向の間隔を有する培養ボトル。
９．請求項７記載の培養ボトルにおいて、各周囲バッフルは渦発生方向に向かう曲率を持つバッフルから成ることを特徴とする培養ボトル。
１０．請求項１記載の培養ボトルにおいて、環状バッフルは周囲バッフルから半径方向に離れていることを特徴とする培養ボトル。
１１．請求項１記載の培養ボトルにおいて、周囲バッフルは、底部周囲が液体の渦流に開口しているように、ボトルの側壁および底部を連結するブリッジバッフルから成ることを特徴とする培養ボトル。
１２．請求項１記載の培養ボトルにおいて、周囲バッフルは、底部周囲の上方の環状区域が液体の渦流に開口しているように、底部周囲を遮断するが隣接する側壁から離れているバッフルから成ることを特徴とする培養ボトル。
１３．請求項１記載の培養ボトルにおいて、渦発生室、肩、頸部、および肩の内部に肩から懸下されＶ形状バッフルの環状配列体で構成された飛沫保護手段をさらに有し、Ｖ形状バッフルの各々はボトルの頸部に向かって渦発生室から上方に飛沫する液体の上昇を分断し中央および横方向に向けるように構成した、半径方向に配列したＶ形状頂縁に収束する下方に突出する側部を有することを特徴とする培養ボトル。
１４．請求項１３記載の培養ボトルにおいて、Ｖ形状バッフルは同一形状および間隔を有し、相互に連続していることを特徴とする培養ボトル。
１５．請求項１４記載の培養ボトルにおいて、各Ｖ形状バッフルはボトルの頸部の内部表面の下方延長部である仮想円筒状表面とほぼ一致する内部表面を有することを特徴とする培養ボトル。
１６．請求項１記載の培養ボトルにおいて、開口頚部を有し、フィルタ材料から成る開口頸部用気体透過曝気蓋を有することを特徴とする培養ボトル。
１７．請求項１６記載の培養ボトルにおいて、曝気蓋は開口頸部用の第１および第２の項部開口の同心的な蓋から成り、第１蓋は、気体が蓋をしたボトルの内外に移動できるような同一の広がりの被覆関係にある気体透過性フィルタ材料を支持するように開口頂部の中央に位置決めされた半径方向に分割されて孔付隆起したスカブオールドから成り、第２蓋はその開口頂部の中央に位置決めされた半径方向に分割されて孔付隆起したスカブオールドから成り、開口頸部および第１蓋および第２蓋は第１および第２蓋の間で気体フィルタ作用関係で適所に固定したフィルタ層と密封閉鎖関係に互いに嵌合するように構成されていることを特徴とする培養ボトル。
１８．請求項１７記載の培養ボトルにおいて、第２蓋は、曝気蓋で密封したボトルが回転振り混ぜ作用の下にあるとき、空気の周囲方向の移動を生じさせて、それによってフィルタ材料を通る気体の流れを促進しかつボトル内部の曝気を容易にするように構成した半径方向フィンを有することを特徴とする培養ボトル。
１９．請求項１７記載の培養ボトルにおいて、開口頸部および第１および第２蓋が相互に嵌合することを特徴とする培養ボトル。
２０．請求項１７記載の培養ボトルにおいて、第１蓋は、曝気蓋で密封したボトルが回転振り混ぜの下にあるとき空気の周囲方向の移動を生じさせて、それによってフィルタ材料を通る気体の流れを促進しボトル内部の曝気を容易にするように構成した半径方向フィンを有することを特徴とする培養ボトル。
２１．培養ボトルにおいて、渦発生、肩、頸部および肩内部で肩から懸下されＶ形状バッフルの環状配列体に構成された飛沫保護手段、を有し、Ｖ形状バッフルの各々はボトルの頸部に向かう渦発生室から上方への液体飛沫の上昇を分断し中央および横方向に向けるように構成した半径方向に配列したＶ形状頂縁に収束する下方に突出する側部を有することを特徴とする培養ボトル。