JPH0249712B2 - Shinsuiseikobunshiniseitaikobunshioketsugosaseruhoho - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はセルロース等の炭水化物系の親水性高
分子に、酵素、蛋白質等のアミノ基を有する生体
高分子を結合させる方法に関する。

従来より、酵素や蛋白質を担体である高分子物
質に化学的に結合させて固定化した固定化酵素等
をバイオリアクターや液体クロマトグラフイー用
カラム充填剤として利用することが行われてい
る。例えば多糖類などの高分子に好ましくは
PH8〜13のアルカリ性条件下でハロゲン化シア
ンを作用させることにより活性化し、次にこれ
に、アミノ基を有する生体高分子を弱アルカリ性
条件で反応させて結合させる方法が知られてお
り、又、担体として用いられる多孔性ガラスない
しはシリカのアルキルアミン誘導体に、ダルタル
アルデヒドなどのアルカンジアールを介して１級
又は２級アミノ基を有する酵素等の生体高分子を
共有結合により結合し不溶化することも、酵素反
応を用いた生体物質分析のための酵素固定化担体
の調整に採用されている。

しかしながら、上記のうちハロゲン化シアンを
用いる方法においては、該ハロゲン化シアンは猛
毒であるので取扱いに注意し、使用後の廃水の処
理にも手間がかゝるという欠点があり、又、後者
の場合については、多孔性ガラスないしはシリカ
は非常で簡便で有用な担体であるが、アルカリに
対する耐久性が低く、高PH領域で高い活性を示
す酵素等を固定化して用いるには不適当であり、
さらに、該担体中に含まれるシリカが蛋白質等に
対して非特異的吸着をするので、この様な酵素固
定化担体を用いる場合は分析試料の前処理等を細
心の注意を払つて行う必要があり、分析操作の作
業性や信頼性に問題がある。

本発明は上述の如き現状にかんがみ、ハロゲン
化シアンの如き有毒な試薬を用いずともよく、さ
らに、生体成分に対する非特異的吸着の少ないセ
ルロース等の炭水化物親水性高分子に酵素等の生
体高分子を簡単にかつ確実に結合させることが出
来、しかも調整された酵素固定化担体等の生体高
分子結合物が該生体高分子の特性に応じたPH領
域で使用され得るように、広範囲なPH領域とく
にアルカリ領域での使用に耐え得るような担体素
材等としての高分子材料を用いた生体高分子の結
合法を提供することを目的としてなされたもので
あり、その要旨は、１級又は２級アミノ基を含有
する生体高分子を共有結合により炭水化物系の親
水性高分子に結合させる方法において、上記親水
性高分子を塩化スルフリルと、次いでイミダゾー
ルと反応させた後、α，ω−アルキレンジアミン
と反応させて該親水性高分子に１級アミノ基を導
入し、この親水性高分子中に導入された１級アミ
ノ基と上記生体高分子における１級又は２級アミ
ノ基とをアルカンジアールを作用させることによ
つて結合させることを特徴とする親水性高分子に
生体高分子を結合させる方法に存する。

本発明に用いられる親水性高分子は単糖類を含
む高分子、多糖類、これらの誘導体等水酸基を含
む炭水化物系の高分子であり、具体的には例えば
デキストラン、セルロース、デンプン、デキスト
リン、アガロースなどの多糖類やヒドロキシエチ
ルセルロースの様な多糖類誘導体が挙げられる。

本発明にもとづいて、１級又は２級アミノ基を
有する生体高分子を炭水化物系の親水性高分子に
結合させるには、まず親水性高分子を塩化スルフ
リルと反応させて該高分子の水酸基を式（）の
如く変化させ、 Ｒ−OH塩化スリフリル ――――――――→ Ｒ−OSO₂・Cl （） 次いで、これにイミダゾールを加えて反応し
て、式（）の如く１−イミダゾリル−スルホナ
ート誘導体を形成させ、 高分子の水酸基を活性化させる。（Ｒは親水性
高分子残基） なお式（）の反応は通常、水分を十分除いた
親水性高分子を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
等の適宜な有機媒質に懸濁若しくは溶解させ、−
40〜−50℃に冷却させた状態で塩化スルフリルを
滴下して行うのが好ましい。

又、式（）の反応は、上記において塩化スル
フリルを滴下したのち、大過剰のイミダゾールを
加えて、徐々に温度を室温まで上昇させながら行
うのが好ましい。

上記により得られた１−イミダゾリルスルホナ
ート誘導体を別、水洗したのち、該誘導体を例
えばＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド等の適宜な媒
質に分散させてこれにα，ω−アルキレンジアミ
ン、すなわちアルカンの両端にアミノ基を有する
化合物、例えばエチレンジアミンを式（）の如
くに作用させて、親水性高分子にアミノ基を導入
する。

なお、式（）の反応は、室温で、ゆるやかな
撹拌下に20時間前後の反応時間で行うのが好まし
い。

次に、上記反応後、該反応により１級アミノ基
が導入された親水性高分子を別等により取り出
し、洗浄後、これにアルカンジアール、例えばグ
ルタルアルデヒドを作用させて、好ましくは
PH7の緩衝液中で式（）の如くに反応させ、 Ｒ−Ｈ Ｎ （―CH₂）―_nNH₂＋HCO（―CH₂）―_oCHO→Ｒ−Ｈ Ｎ （―CH₂）―_nＮ＝CH（―CH₂）―_oCHO （） （ｎは整数） 該式（）で得られたアルカンジアール付加物
を取り出し、これを親水性高分子に結合せんとす
る生体高分子の緩衝液溶液に加えると、 Ｒ−Ｈ Ｎ Ｎ （―CH₂）―_nＮ＝CH（―CH₂）―_oCHO＋H₂N−→Ｒ−
Ｈ Ｎ （―CH₂）―_nＮ＝CH（―CH₂）―_oCH＝Ｎ−
（） （は生体高分子残基を示す） の如くに反応して、共有結合によつて安定に結合
した親水性高分子−生体高分子結合物が得られ
る。

なお、上式（）では第１級アミノ基（−
NH₂）を有する生体高分子を親水性高分子に結
合する機構を示したが、第２級アミノ基（
NH）を有する生体高分子についても上式（）
と同様の機構で親水性高分子と結合することが可
能である。上記の如くして本発明にもとづいて用
意された多糖類等の炭水化物系の親水性高分子と
酵素や蛋白質等の生体高分子との結合物は、固定
化酵素等としてバイオリアクターや、胆汁酸等の
生体物質分析用の液体クロマトグラフイーに用い
られる固定化酵素による反応カラムの充填剤とし
て使用出来るのであり、この使用に際して酵素等
生体高分子は高分子担体に共有結合によつて強固
に結合しているので簡単に分解されず、広いPH
範囲においても安定に使用され得るのである。

本発明方法は上述の通りの方法であり、とく
に、炭水化物系の親水性高分子を塩化スルフリル
と、次いでイミダゾールと反応させて活性化し、
さらにα，ω−アルキレンジアミンと反応させて
該親水性高分子中に１級アミノ基を導入し、これ
にアルカンジアールを作用させることにより、該
親水性高分子と生体高分子における１級又は２級
アミノ基とを結合させる方法であるので、本発明
方法によれば従来法の如く毒性の高いハロゲン化
シアンなどの試薬を用いずともよく、安全に反応
を行うことが出来、しかも高い活性固定化率でセ
ルロース等親水性高分子担体に酵素等の生体高分
子を結合させることが出来るという効果を奏する
のであり、さらに、生体高分子が結合した親水性
高分子は広いPH領域において安定であるので、
該生体高分子が最も高い活性を示し得る様なPH
領域を適宜選定して使用することが出来るのであ
る。

以下本発明につき、実施例にもとづいて説明す
る。

実施例 担体の活性化：セルロースビーズ（商品名セル
ロフアイン700M、生化学工業社製）を蒸留水で
洗浄後、脱水したＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
（DMF）中で平衡化したものから、セルロースビ
ーズ2.6ｇを取り出し、DMF60mlに撹拌・懸濁
し、ドライアイス−エタノール浴で−40℃に冷却
した。ゆるやかに撹拌しながらこれに塩化スルフ
リル1.6mlを滴下すると反応液は淡黄色になつた。
30分後、イミダゾール10.8ｇを添加し、撹拌しな
がら室温に戻し、セルロースビーズを別して取
り出し、DMF、蒸留水、DMFの順に洗浄し、吸
引脱水を十分に行つて活性化セルロースビーズを
用意した。上記活性化セルロースビーズ1.9ｇを
DMF20mlに加え、撹拌、懸濁し、これにエチレ
ンジアミン0.67mlを滴下し、室温でゆるやかに撹
拌した。24時間後、別し、蒸留水で充分洗浄し
た。かくして用意した２−アミノエチルアミノセ
ルロースビーズ1.3ｇを、PH7.0の0.1Mリン酸緩
衝液2.7ml及び25％グルタルアルデヒド0.3mlとの
混合液に加え、室温でゆるやかに撹拌しながら反
応させた。反応後別し、脱イオン水で充分洗浄
した。

酵素の固定化：次に、3α−ヒドロキシステロ
イドデヒドロゲナーゼ（3α−HSP）20mgを氷冷
したPH7.0の0.1Mリン酸緩衝液２mlにとかし、
このうち0.1mlを採取してPH9.5の20mMピロリン
酸緩衝液中（25℃）で、補酵素ニコチンアミドア
デニンヌクレチオド（0.5mM）、基質としてコー
ル酸（0.5mM）を用い活性を測定した。残りの
酵素溶液（1.9ml）にグルアルデヒドを作用後の
セルロースビーズ1.0ｇを加え、氷冷しながら
時々ゆるやかに撹拌して固定化反応を行つた。１
時間半後に別し、液の0.1mlを採取して上記
と同様にして液の残存酵素活性を調べた。又、
過されたセルロースビーズは、0.1mMのエチ
レンジアミン四酢酸及び0.05％の２−メルカプト
エタノールを含むPH7.0の0.1Mリン酸緩衝液で
洗浄し、保存した。

酵素固定化率の算出：かくして用意された3α
−HSD固定化セルロースの酵素固定化率につい
ては、固定化前の酵素活性が0.427ユニツト／0.1
ml、固定化後の液の残存酵素活性が0.103ユニ
ツト／0.1mlと測定された所からして、該固定化
率75.9％と算出された。

固定化酵素の活性測定：PH9.5の20mMピロリ
ン酸緩衝液（25℃）中で、補酵素ニコチンアミド
アデニンヌクレオチド1mM及び基質（コール酸）
1mMの存在下に、精秤した固定化酵素を添加撹
拌して反応させ、活性を調べた所、１ｇ当り7.22
ユニツトの比活性値が測定された。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ １級又は２級アミノ基を含有する生体高分子
   を共有結合により炭水化物系の親水性高分子に結
   合させる方法において、上記親水性高分子を塩化
   スルフリルと、次いでイミダゾールと反応させた
   後、α，ω−アルキレンジアミンと反応させて該
   親水性高分子に１級アミノ基を導入し、この親水
   性高分子中に導入された１級アミノ基と上記生体
   高分子における１級又は２級アミノ基とをアルカ
   ンジアールを作用させることによつて結合させる
   ことを特徴とする親水性高分子に生体高分子を結
   合させる方法。