JPH02424A - 上皮肺腺癌起源ヒト細胞系 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、肺す−ファクメントタンバク質金産生する上
皮肺組織起源の新規な樹立連続ヒト腺癌細胞系に関する
。本発明はまた、肺サーファクタントタンパク質の発明
全調節する新規な方法、肺す−フアクタ／トタンバク質
を産生する肺上皮起源の腫瘍細胞金スクリーニングする
新規な方法、および産生されたサーフアクタントタンパ
ク質を収穫する新規な方法に関する。本発明はさらに、
新規なヒト肺サーファクタントタンパク質に関する。

発明の背景 肺界面活性剤は、ｎ型上皮肺細胞によって合成てれ、肺
胞中に分泌されるリポタンパク質複合体である。肺界面
活性剤の８５壬以上は脂質であるが、数種のサーファク
タントタンパク質が、界面活性剤機能に必要な生物物理
学的性質との関連で同定されている。最も豊富なサーフ
ァクタントタンパク質は、ＳＡＰ　−３５と呼ばれるＭ
ｒ　””　３５．ＯＤＤの糖タンパク質であり、多くの
動物種の肺洗浄によって単離されている。ヒトおよびイ
ヌＳＡＰ　−３５の遺伝子およびＣＤＮＡは、コラ−ダ
ン様の（１，１７−Ｘ　−Ｙ　−Ｃ）ｌｙドメイン？含
む約２３，０００ダルトンのポリペプチド金コードして
いる。ｉｎ　ｖｉｖｏおよびｉｎ　ｖｉｔｒｏにおける
ｎ型細胞の両培養で観察されるサイズおよび電荷不均一
性は、一部、アスパラギン連結炭水化物の付加、硫酸化
、カルボキシル化、アセチル化およびヒドロキシル化に
よるものであるが、ほかに翻訳後プロセッシング、たと
えばＳＡＰ　−３５ポリペプチドへのパルミテートまた
はミリステートのような脂肪酸の共有結合による付加も
関係する。ＳＡ、Ｐ　−３５はカルシウム依存性のリン
脂質凝集全誘発し、Ｗ部活性リン脂質の生物物理学的性
質を増強する。

最近、肺界部活性すピドの有機溶媒抽出液中に２種のも
つと小さいサーファクタントタンパク質、ＳＰＬ　（Ｐ
ｈｅ　）およびＳＰＬ　（ｐｖａｌ　）が同定された。

これらは疎水性の５，０口Ｏ〜１２．０００ダルトンの
ポリペプチドで、界面活性リン脂質に強く会合している
。両ポリペプチドとも活性肺界面活性剤の成分であり、
界面活性リン脂質の生物物理学的活性の増強と関係づけ
て考えられてきた。Ｑ　ＤＮＡの同定およびｌｌ　ｍＲ
ＮＡのｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｖＡ訳により、これらのポリ
ペプチドはもつと大きい前■体として合成されることが
明らかにされた。

肺界面活性剤は効率的な呼吸に必須である。ある種の疾
患状態、たとえば新生児のヒアリン膜疾患は、界面活性
剤の欠乏によるものである。５ＡＰ−６５も、界面活性
グロテオリビドＳＰＬ　（Ｐｈｅ　）およびＳＰＬ　（
ｐｖａｌ）も、リン脂質の生物物理学的な界面活性作用
を改善するので、これらのタンパク質には界面活性剤欠
乏の治療における有用性が期待される。

これらのタンパク質の肺界面活性に対する重要性にもか
かわらず、治療に使用できるだけの量を取得するには困
難な問題がある。この問題の解決するひとつの可能性と
しては、肺サーファクタントタンパク質のヒト死体から
の抽出がある。しかしながら、これでは供給は十分では
ない。しかも、死体肺はヒトウィルスおよび細菌エンド
トキシンに汚染されやすく、これが単離タンパク質のヒ
ト治療への応用全不適当にする。死体肺が汚染されてい
なかったとしても、収量はきわめて低く、このような材
料中に存在するタンパク質の量はきわめて低いため精製
は難しく、この方法は採用できない。

ヒトサーフアクタントタンパク質の取得に関連した困難
を解決する他の可能性としては、と）Ｉｔ型上皮細胞を
単離し、細胞培養によって生育させ、サーファクタント
タンパク質を細胞ま友はメジウムから収穫する方法が考
えられる。この方法は、とくに■型肺細胞が数種の完全
にプロセッシングｔｌｆｆ；ｅサーファクタントタンパ
ク質金産生すること、ヒト肺上皮細胞は細切した新鮮な
ヒト肺材料、肺生検材料ま友は流量胎児から容易に得ら
れることから最初は見込みがありそうに思え次が、欠点
が多い。たとえばｎ型上皮細胞を培養液中に含む組織片
培養では、一般に、メジウム中にサーファクタントタン
パク質は分泌されない。し几がって、タンパク質を回収
するｔめには、このような細胞を収穫し、分解しなけれ
ばならない。これは達成できる収率を著しく制限する。

さらに、ｎ型上皮細胞は培養液中で再生を継続すること
がなく、培養液中では約２４〜４８時間以内に分化性金
欠ってしまう。脱分化の結果、これらの細胞は界面活性
タンパク質の産生全停止する。このような問題点は、ヒ
）Ｉｔ型上皮細胞が培養液中に樹立されれば、すなわち
これらの細胞が再生しくしたがって数が増加する）、脱
分化を生じないように改変され、長時間にわたってサー
ファクタントタンパク質の合成能を維持すれば解決され
る筈である。しかしながら、現在まで、サーファクタン
トタンパク質を長期にわ几り産生するｎ型上皮細胞（ヒ
トまたは動ｖｌＪ）の培養液中での樹立を可能にする方
法は明らかにされていない。また、分化およびサーファ
クタントタンパク質の産生能を維持する１型上皮ヒトま
友は動物細胞の長期間にわ九る培養メジウム中での樹立
も行われていない。

ヒトサーファクタントタンパク質の取得に伴う問題全克
服するさらに他の可能性は、組換えＤＮＡ技術の使用で
ある。この方法では、選択されたサーファクタントタン
パク質をコードする遺伝子を単離し、適白なりローニン
グベクター九とＬｔｄプラスミドま友はファージに挿入
する。このベクターを用いてついで宿主細胞たとえば細
菌、酵母もしくは哺乳動物細胞たとえばチャイニーズハ
ムスター卵胞（ＣＦ！Ｏ）細胞をトランスフェクション
し、ついでこれ全培養し、問題のタンパク質を発現させ
る。しかしながら、この方法にも、その有用性を制限す
る問題がある。第一に、導入された遺伝子の・発現レベ
ルは多くの場合低い。第二に、サーファクタントタンパ
ク質は、それが完全な生物学的活性を達成するには、翻
訳後様々に修飾されなければならないことである。ＳＡ
Ｐ　−３５の場合、プロリン残基のヒドロキシル化、ア
スパラギン連結炭水化物の付加、脂肪酸でのアシル化、
および炭水化物の硫酸化等のプロセッシングが行ワ些ル
。

これらの翻訳後の修飾はすべてｎ型上皮細胞によって自
発的に行われる。しかしながら、一般に、操作された非
道型上皮細胞、たとえば細菌や酵母細胞は、ヒト蛋白質
と見分けがつかない成熟サーファクタントタンパク質の
産生に必要なすべての翻訳後修飾を実施するＫは適して
いない。このような修飾の九めの生化学的機構は複雑で
、］型ヒト細胞に特異的なものと思われる。すなわち、
非補乳動物細胞におけるヒト組換えＤＮＡ肺サーファク
タント遺伝子の発現では、一般に、ヒトサーファクタン
トタンパク質と真に同一なタンパク質は生成しない。第
三に、細胞が天然分子と同一のヒトサーファクタントタ
ンパク質を高い効率で発現するように遺伝子的に構築さ
れたとしても、これらの細胞は通常、ただ１種のサーフ
ァクタントタンバク質七発現するようにしか操作されな
い。−方、Ｉｌｆｊ１ｍ胞は、数種のサーファクタント
タンパク質？高い効率で合成し、分泌する。

ヒトサーファクタントタンパク質の取得に伴う難点から
、最近導入れた治療用界面活性製剤（サーファクタント
−ＴＡ、　Ａｂｂｏｔｔ　ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉ、ｃ
ａｌ）の製造には、ヒト起源の単離タンパク質よりもむ
しろ、ウシの肺のような他の原料から単離され九す−フ
ァクタントタンパク質を使用している。しかしながら、
クシサーファクタントタンパク質はヒトタンパク質とは
同一ではない。ヒトタンパク質が好ましいのは明らかで
あるが、上に略述し几ように、ヒト死体、培養ｎ型上皮
細胞および遺伝子操作細胞からのヒトサーファクタント
タンパク質の単離には実際上難点があって、少なくとも
経済上の観点から、Ｃれらの方法は採用できない。

したがって、サーフアクタントタンパク質を発現、分泌
できる天然のヒト細胞系の樹立がきわめて有利と考えら
れる。また、ヒトサーファクタントタンパク質の取得に
伴う上述の問題全解消する江は、樹立ヒト細胞系に十分
な量のサーファクタントタンパク質の発現全誘導する手
段全提供することもきわめて有利である。

発明の要約 要約すれば、本発明は、本技術分野における上述の現状
の問題点および欠点を、形態学的にｎ型上皮肺細胞と類
似し、少なくとも１種のサーフアクタントタンパク質を
章生し、分泌できる新規な連続ヒト腫瘍細胞系の発見に
よって緩和するものである。しかも、本発明の少なくと
も１種の細胞系は、以下の誘導により少なくとも１種の
サーファクタントタンパク質を十分な量、産生ずること
ができる。

本発明の樹立細胞系は一般的に、肺癌と診断された患者
から外科的に摘除された上皮性肺腺癌組織から得られる
。組織学的に、この細胞系は「非小」細胞肺癌の典型で
ある。この細胞系は、培養液中で上皮性細胞金形成し、
−船釣にはグラスチックにゆるく付着し、培養液中で単
層にまたは浮遊凝集体に生育する。ＮＣＩ　−Ｈ４４１
−４およびＮＣＩ　−Ｈ８２０細胞系はｎ型上皮細胞に
典型的な形襲学的基準金示し、薄板ｔＣは類脂様体の封
入が認められ、これらは位相差顕微鏡および電子顕微鏡
検査（写真は示していない）で確認される。

さらに、細胞は多数の顆粒体、および界面活性リビド封
人体の典型である類脂様、屈折体を有する。

これらの特性は、ラットおよびヒトの初代培養ｎ型上皮
細胞Ｋ　ｇめられる性質と類似している。

ＮＣＩ　−Ｈ３２２細胞系の細胞は、多数の顆粒状封入
体音もつ几上皮細胞である。これらの細胞系の細胞は同
種と考えられ、１年以上にわする細胞培養での継代に成
功している。現在、この細胞系は安定な、連続細胞系と
して存在している。

本発明の樹立細胞系はＮＣＩ　−Ｈ４４１−４と命名さ
れ、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　＋：：ｕｌｔｕｒｅ
　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、ＲＯｃｋｖｉｌｌ
ｅ、Ｍａｒｙｌａｎａ　）に寄託番号ＡＴＣＣＣＲＬ　
　９４００として寄託されている。本発明の他の樹立細
胞系はＮＣＩ　−Ｈ８２０、ＮＣＩ　−Ｈ６２２および
ＮＣＩ　−Ｈ１４０４と畠名され、同じくそバぞれ寄託
番号ＣＲＬ　９５３１、ＣＲＬ　９５３２、およびＣＲ
Ｌ　９５３３としてＲｏｃｋｖｉｌｌｅ　、　Ｍａｒｙ
ｌａｎｄのＡＴＣＣに寄託されている。本発明によるＮ
ＣＩ　−Ｈ４４１−４細胞系および他の３攬の代表的細
胞全取得する最も簡単な方法はこの指定され之公的利用
による方法であるが、本発明の教示を参考に他の方法で
類似の実質的に機能的に同一なヒト細胞系全連続的に製
造することは不可能でもあり得ないことでもない。この
ような実質的に機能的に同一な細胞系は本発明の細胞系
の生物学的均等物と考えられ、したがって本発明の一般
範囲内に包含される。また、上述の本発明によって提供
される細胞系の改良、クローニングまたはサブクローニ
ングによって本技術分野の熟練者が、細胞系の形態学的
および機能的性質を実質的に変えることなく取得できる
実質的に同一の細胞系も本発明の範囲に包含される。

たとえばＮＣＩ　−Ｈ４４１−４、Ｎｃｘ　−Ｈ８２０
、ＮＣＩ　−Ｈ１４０４およびＮＣＩ　−Ｈ３２２細胞
系の細胞は、ＳＡＰ　−３５およびＳＰＬ　（Ｐｈｅ　
）　ｆｉ　７バク質のようなサーファクタントタンパク
質少なくとも１種全産生および／または分泌するようで
ある。

この細胞系によって産生されるサーファクタントタンパ
ク質は半ばまたは完全にプロセッシングを受けていて、
正常ヒト肺ｎ型上皮細胞によって産生、分泌されるサー
ファクタントタンパク質と区別できないものと考えられ
る。したがって、本発明の細胞系は、本明細書に記載の
方法または慣用方法で単離できるヒトサーファクタント
タンパク質の連続的起源全提供することにより、上述の
問題全解決するものである。さらに、サーファクタント
タンパク質の本質的合成により、細胞は、問題のタンパ
ク質をコードするＲＮＡ　またけＤＮＡ　、ならびその
タンパク質の翻訳後プロセッシングに与かる一部’Ｅ；
７’（はすべての酵素を提供することができる。この細
胞系の細胞はまた、高生産性クローン細胞系を得る目的
でクローン化することができる。

本発明の一部はｆ之、サーファクタントタンパク質１ｔ
はそのタンパク質をコードするｍＲＮＡの産生上選択的
に調節する新規な方法の発明に基づくものである。この
独特な方法は、少なくとも１種のこのようなタンパク質
の産生能を有する培養細胞金、その選ばれたタンパク質
の産生全誘導および／または阻害する１［ま７′ｃＶｉ
２種以上の有効な調節剤に曝露するものである。たとえ
ばＮＣＩ−Ｈ４４１−４のような培養細胞をこのような
調節剤に曝露すると、１種もしくは２種以上のタンパク
質および／またはそのようなタンパク資金コードするｍ
ＲＮＡの産生が驚くべきことに増大することが明らかに
された。また、驚くべきことに他の１種または２種以上
のタンパク質およびそのタンパク質をコードするｍＲＮ
Ａの産生は同時に低下することも明らかにされたのであ
る。友とえば、ＮＣＩ　−Ｈ４４１−４細胞系の細胞を
デキサメサテン含有メジウム中で培養すると、疎水性タ
ンパク質ＳＰＬ　（Ｐｈｅ　）およびＳＰＬ　（Ｐｈｅ
　）　ｍＲＮＡの前駆体の産生が著しく増大し、一方、
ｓＡｐ−３５ｍタンパク質およびＳＡＰ　−３５ｍＲＮ
Ａの産生は有意に低下する。同様に、Ｎａｘ−Ｈ４４１
−４細胞系の細胞ヲ、８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ含有メジウム
中で培養すると、５ＡＰ−３５の産生が有意に増大する
。しかしながら、本技術分野の熟練者には明らかなよう
に、メジウム中で培養されたサーファクタントタンパク
質およびそのタンパク質をコードする特定のｍＲＮＡ産
生能を有し、かつそのタンパク質の産生の調節能を有す
る細胞は、本発明の方法により調節され、少なくとも１
種のサーファクタントタンパク質およびそのタンパク質
をコードする特定のｍＲＮＡの産生が選択的に誘導ま友
は阻害される。

さらに、特定の調節剤は、上述のデキサメサゾン・の場
合のようにサーファクタントタンパク質の産生を誘導ま
友は増大させるが、同時に他のタンパク質の産生を阻害
または低下させることを理解すべきである。

本発明の一部は筐た、ＳＤＳ　−ＰＡＧＥにおけるＭｒ
−約４０，０００−４６．０００、Ｍｒ−約２７．００
０〜３３，０００およびＭｒ−約２３，０００で活性ま
たは完全にプロセッシングを受けた疎水性ＳＰＬ　（Ｐ
ｈｅ）タンパク質の前駆体と考えられる新規なヒトサー
ファクタントタンパク質の発見に基づくものである。こ
の新規な前駆体タンパク質はＮＣＩ　−Ｈ４４１−４細
胞系によって産生され、それから、九とえばＳＰＬ　（
Ｐｈｅ）と反応性のウシポリクローナル抗体による免疫
沈降で単離され友。

免疫沈降タンパク質は、Ｉ　Ｄ−３ＤＳ−ＰＡＧＥおよ
びＮＥＰＨ（＋Ｅ　−ＳＤＳ　−ＰＡＧＥ　（非平衡Ｐ
Ｈ勾配電気泳動−ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリル
アミドゲル電気泳動）解析およびオートラジオグラフィ
ーによって解析される。Ｍｒ−４０，０００〜４６．０
００のタンパク質はｐＩ約４．６〜５．４全示し、最初
Ｍｒ　−４０，０００〜４２；０００のグレグロタンパ
ク質として発現され、それがアスパラギン残基でのグリ
コシル化およびシアリル化を受け、Ｍｒ約４０，０００
〜４６，０００ダルトンのプｏタンパク質を生成しｔも
のと考えられる。Ｍｒ　ｅ−２７，０００〜３３，００
０のタンパク質はｐＩ約６．０〜７．３　ｋ示し、Ｍｒ
−４１］、０００〜４６，０００のタンパク質がタンパ
ク分解上受けて切断されたフラグメントである。この２
７，０００−３３，０００ダルトンのタンパク質もアス
パラギン残基でのグリコシル化とシアリル化を受ける。

Ｍｒ　−４０，０００〜４６．０００前駆体およびＭｒ
　−２７，０００〜３３，０００のタンパク分解で切断
されたフラグメントの両者がグロセンシングを受け、活
性なＭｒ−６，０００−８，０００のｐンパク質を生じ
るものと考えられる。さらに、Ｍｒｍ４０．０００−４
６，０００およびＭｒ　−２７，０００〜３３，０００
の前駆体は、より小さい疎水性の活性なＭｒ　−６，０
００〜８，０００のタンパク質に比べて水溶性が高いも
のと考えられる。この４０．０００〜４６，０００ダル
トンのプログ／バク實および２７，０００〜３３，００
０ダルトンのタンパク質の大きさおよび電荷の不均一性
は、一部、アスパラギン連結オリ！サツカライドの存在
によるものと考えられる。Ｍｒ−４０，０００〜４６．
０００およびＭｒ　−２７，０００〜３３，０００の新
規なタンパク質はエンドグリコシダーゼ−Ｆ消化に感受
性金示し、上述のようにヒト５ｐＬ（４９）ＳＰＬ（Ｐ
ｈｅ）に対する抗体に反応性を示す。２３，０００ダル
トン・）タンパク質は、脱グリコシル化および脱アシル
化されていて、活性ＳＰＬ　（４９）ＳＰＬ（Ｐｈｅ）
の前駆体であり、ＳＰＬ　（Ｐｈｅ　）の抗体と反応性
を示し、２７．０００〜３３，０００ダルトンのタンパ
ク質のアスパラギン連結オリザサツカライドの酵素的切
断によって生成する。２３，０００ダルトンのタンパク
質は１）Ｉ約６．３〜７．３を示す。

本発明はさらにその一部として、サーファクタントタン
パク質を構造的に産生ずる肺上皮起源の腫瘍細胞をスク
リーニングする新規な方法、ならびに産生されたタンパ
ク質をその細胞および／−！九はメジウムから収穫また
は精製する新規な親和性精製方法を提供するものである
。本発明のスクリーニング方法は、全く驚くべきことに
、肺上皮起源の「非小」または大細胞型腫瘍細胞に対し
篤くべき正確さで陽性の結果金与え、一方、小細胞型肺
陣瘍には陰性の結果を与える。−船釣に、本発明のスク
リーニングの一方法は、分解した腫瘍細胞または腫瘍細
胞金培饗し九メジクムを抗−サーフアクタントタンパク
質（抗体）に暴露し、それからのタンパク質を免疫沈降
させ、腫瘍細胞による産生金確認する方法である。他の
本発明によるスクリーニング方法は、肺上皮起源の腫瘍
細胞から単離されるサーフアクタントタンパク質をコー
ドするｍＲＮＡ　ｇ　、そのｍＲＮＡと相補性の放射標
識ｃＤＮＡプローブに暴露し、放射標識ＱＤＮＡをｍＲ
ＮＡとハイブリダイゼーションさせ、ハイブリダイゼー
ションし定放射標識プローブを同定して腫瘍細胞による
ｍＲＮＡの発現を確認する方法である。新規な親和性精
製方法は、一般に、細胞全培養したメジウムまたは細胞
分解物音、タンパク質を結合させる九めに親和剤を抱合
させたカラムに適用し、結合し九タンパク質をカラムか
ら分離して、実質的に精製されたタンパク質を生成させ
ることからなる培養細胞からのサーファクタントタンパ
ク質の精製方法である。親和剤としては、友とえば、抗
−サーフアクタントタンパク質（ポリクロ−カル１次は
モノクローナル抗体）マ几はα−メチルマンツールがあ
る。これらの方法全実施するに際しては、サーファクタ
ントタンパク質と反応性の任意の有効な親和剤が使用で
きること全理解すべきである。同様に、丈−フアクタン
トタンバク質をコードするｍＲＮＡと相補性の任意の有
効なＱ　ＤＮＡプローブが使用できる。

文献には、気管支肺胞上皮癌起源の連続細胞峯、Ａ３４
９細胞によるサーファクタント糖タンパク質の予報があ
る（　Ｂａ１ｉｓら：　Ｉ、ａｂ、　　工ｎｖｅｓｔ、
。

５２Ｃ６）：６５７〜６６９．１９８５およびＢａ１ｉ
Ｂら：Ｅｘｐ、Ｌｕｎｇ、Ｒ８Ｂ、、６：１９７〜２１
６．１９８４’Ｊ照）。Ｂａ：Ｌｉａらに、ｌｔＨ、サ
ーファクタント塘タンパク質の高分子景凝集体に対して
１導され几りサギ抗体が、ｎ型細胞のみでなくＡ３４９
細胞とも反応すると報告されているが、その後の研究で
はＡ３４９細胞によるＳＡＰ　−６５の合成の確証的な
証拠は示されていない。とくに注目すべき点は、ＳＡＰ
　−３５に対して誘導され几抗体金用いて、Ａ３４９細
胞および培養上清ｔスクリーニングした場合、細胞生育
メジウム中％Ｃ８−Ｂｒ　−ｃＡＭＰ　ｆ包含させても
、ＳＡＰ　−３５は検出されていないことでおる。しか
も％　ｐ”　５４９細胞全［３５Ｓ］　メチオニンで標
識して４　ＳＡＰ　−３５の合成は検出されていない。

マ友文献には、ヒト胎児肺外植体中におけるＳＡＰ　−
３５タンパク質および／またはＲＮＡの合成が８−　Ｂ
ｒ　−（ＡＭＰ−！　友は上皮成長因子で増進され、デ
キサメサゾンまたは形質転換成長因子−βによって阻害
されることが報告されている（　５ｎｙｄｅｒ。

−Ｊ、Ｍ、ら：　Ｅｎａｏｃｒｌｎｏｘｏｇｙ、　１２
０　：　１２５０〜１２５７、１９８７；ｗｈｌｔｓｅ
ｔｔ、　Ｊ、Ａ、う：Ｊ、　Ｂｌｏｘ、　ｃｈｅｍ、、
２６２　：５２５６〜５２（５１゜１９８７　：　ｗｈ
ｌｔｓｅｔｔ、　、Ｔ、Ａ、ら：　Ｊ、　５１ｏｘ、　
Ｃｈｅｍ、。

２６２　：　７９０８〜７９１３，１９８７；Ｂａ１ｌ
ａｒｄ、　Ｐ、　Ｌ、ら：　ｐｒｏｃ、　１Ｊａｔｌ、
　Ａｃａｄ、　３ｃｉ。

ＵＳＡ、　　８３：９５２７〜９５３１．　１９８６゜
およびＭｅｎｄｅｌｓｏｎ、　Ｃ，Ｒ，ら：Ｊ、阻ｏ１
．　Ｃｈａｍ、　。

２＜５１　：９９３８〜９９４３．１９８６参照）。

しかしながら、５ＡＰ−３５タンパク質および／または
ＲＮＡの合成が、ヒト培養細胞おいてこのような調節剤
によって調節、すなわち誘導または阻害されることはこ
れまで知られていなかった。

本発明の細胞系によって産生されるサーファクタントタ
ンパク質またはその７ヲグメ／トは精製して、生物学的
液体中のタンパク質の定量および、肺成熟や肺の他の疾
患たとえば肺硝子膜症の診断のためのイムノアッセイに
際して、抗原としてモノクローナルまたはポリクローナ
ル抗体の生成に使用できる。サーファクタントタンパク
質およびそのｍＲＮＡからそれぞれ誘導される抗体およ
びＣＤＮＡはサーファクタントタンパク質を産生ずる肺
上皮起源の他の腫瘍細胞金、本明細書に記載する方法に
従ってスクリーニングおよび同定する定めに使用できる
。

すでに述べたように、本発明の細胞系によって産生され
るサーファクタントタンパク質は、正常ヒト］型上皮細
胞から得られるサーファクタントタンパク質と区別でき
ないと考えられる。したがって、本発明の細胞系によっ
て産生されたタンパク質またはその７ラグメントは単独
でまたはリン脂質と配合して混合し、肺硝子膜症または
他の呼吸疾患の処置のための置換療法用合成界面活性剤
上作成することができる。このような配合物は、その界
面活性と急速な拡散能により、たとえば遠位呼吸上皮に
他の薬剤または抗生物質を輸送するための担体としても
使用することができる。

本発明の上述の特徴および利点は、本発明の好ましい態
様全例示した図面の簡単な説明および実施例を参照すれ
ば、さらに明瞭に理解できるものと考える。

図面の説明 本発明の範囲内に包含される態様を例示する几めに添付
した図面について以下に説明する。

第１Ａ図、第１Ｂ図、第１Ｃ図および第１Ｄ図はそれぞ
れ、ＮＣＩ−Ｔ（４４１−４、ＮＣＩ　−［８２０、Ｎ
ＣＩ　−Ｈ１４０４およびＮＣＩ　−Ｈ３２２細胞系の
細胞の位相差顕微境写真である。

第２Ａ図および第２Ｂ図は、ＮＣＩ　−Ｈ４４１−４細
胞によりメジウム中に分泌されたサーファクタントタン
パク質の（３５Ｓ：ｌメチオニン標識、２Ｄ−ｒＥｒ−
５ＤＳ−ＰＡＧＥ（ＰＨ−３，５−７，０）ｆｆｉ示す
図である。Ｎｃエニー４４１−４細胞は約１００μＣ１
／ｍｌの（３５ｓ）メチオニンで標識される。

ＮＣＩ　−Ｈ４４１−４細砲を約６時間標識したのち、
メジウムを氷冷アセトンで収穫しく沈殿）、ＩＥＦ−Ｓ
ＤＳ　−ＰＡＧＥによって解析する。第２Ａ図のＮＣニ
ーＨ４４１−４細胞はデキサメサゾンの不存在下に培養
し、第２Ｂ図のＭＣｌ−［４４１−４細胞は標識前に約
１０ｎＭデキサメサゾンで約３日間処理する。第２Ｂ図
では、デキサメサゾンによって阻害されるＳＡＰ　−３
５の検出を可能にするため、２倍の放射標識全適用する
。第２Ａ図の対照パネル中、下方の矢印はＳＡＰ　−３
５タンパク質に典型的なチャージトレイン全示し、上方
の矢印は少量のＳＰＬ　（Ｐｈｅ　）タンパク質を示す
。デキサメサゾンの存在下にはＳＡＰ　−３５の合成は
著しく阻害され、いくつかの蛋白質が誘導されているこ
とが第２Ｂ図かられかる。第２Ａ図および第２Ｂ図の上
方の矢印は、対照以上に誘導されたＳＰＬ（Ｐｈｅ）タ
ンパク質を示している。数種の未知の高ｔｉは低分子量
タンパク質も、図から明らかなようにデキサメサゾンで
誘導される。

第３Ａ図および第３Ｂ図は、ＮＣＩ−［４４１−４細胞
系の細胞およびそのメジウムからＳＡＰ　−３５タンパ
ク’１ｆｆｆｉ、（”Ｓ　）メチオニン標識および２　
Ｄ　−ＩＥＦ　−ＳＤＳ　−ＰＡＧＥ後の免疫沈降およ
び精Ｍｋ示している。第６Ａ図は、）、＜ｒ−３０，０
００〜３５．０００ＳＡＰ−３５細胞内前駆体タンパク
質のオートラジオグラムで、／により３４，０００　ｋ
ｌ　、’ｃ　ｐＩ工約、０？表示しである。これらの前
駆体タンパク質は、以前にヒト肺外植片中に検出し元細
胞内ＳＡＰ　−３５タンパク質の「高マンノース」前８
体の場合と、移動度は区別できない。第３Ｂ図は、メジ
ウムからの免疫沈降によるＳＡＰ　−３５タンパク質の
精製？示す。ＮＣＩ−Ｈ４４１−４細胞によって産生さ
れ７’（ＳＡＰ　−３５は、ヒト肺胞洗液′ｆ、几は羊
水の場合に認められた移動度ｐ１約４．２〜５．０、Ｍ
ｒ−約３０．［］　ＯＣＪ　−３５，［１ＣＪ　［１と
同一の電荷不均一性で移動する。

第４Ａ図は、ＮＣＩ−）（４４１−４のメジウムからの
〔３５Ｓ〕メチオニン標識ＳＡＰ　−３５の、ヒトＳＡ
Ｐ　−３５に対して誘発され几マウスモノ′クローナル
抗体？セファロース４Ｂに抱合させｔアフィニティーカ
ラムによる親和性精製を示す。（３２）Ｂ　〕メチオニ
ン標識ＳＡＰ　−３５全含有するＭＣｌ−Ｈ４４１−４
からのメジウム金力ラムに適用し、リン酸緩衝液で洗浄
後に、５ＡＰ−３５’ｔＩＭ酢酸で溶出し、２　Ｄ　−
ＩＥＦ　−ＳＤＳ　−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラ
フィーに付す。

第４Ｂ図は、ヒ）　ＳＡＰ　−３５に対して誘導され九
ウサギポリクローナル抗血清の３０　％　　ＮＨ，Ｓｏ
４分画金用い、これ？セファロース４Ｂに抱合させたア
フィニティーカラムで、ＮＣＩ−Ｈ４４１−４のメジウ
ムからの［３５３３メチオニン標ａ　５ＡＰ−３５の親
和性精製を示している。［３５Ｂ　］メチオニン標識Ｓ
ＡＰ　−３５全含有するＭＣｌ−Ｈ４４１−４からのメ
ジウム金力ラムに適用し、リン酸緩衝液で洗浄後、ＳＡ
Ｐ　−３５を１Ｍ酢酸で浴出し、２Ｄ−ＩＥＦ　−ＳＤ
Ｓ　−ＰＡＧＥに付す。

第５図は、Ｃ”Ｓ　）メチオニン標識および１Ｄ−ＳＤ
Ｓ　−ＦＡＩ後、ＮＣＩ−Ｉ（４４１−４細胞からのＳ
ＡＰ　−３５タンパク質の免疫沈降？示している。

レーン１，２および、６は、非処置ＮＣＩ　−Ｈ４４１
−４から免疫沈降させた細胞培養物の３回の実験の結果
であり、レーン４，５および６は１００μＭの３−　Ｂ
ｒ　−ｃＡＭＰで処理し次ものであって、３−Ｂｒ−ｃ
ＡＭＰの存在下におけるＳＡＰ　−３５タンパク質の誘
導全示している。ＳＡＰ　−５５タンパク質の誘導は２
４〜４８時間以内に認められる。

第６Ａ図および第６Ｂ図は、〔３５Ｓ〕メチオニン標識
サーフアクタントタンパク質の、ＩＱｎＭデキサメサゾ
ンの存在下または非存在下における免疫沈降を示してい
る。第６Ａ図の対照レーン１〜４はＣ３５Ｓ］メチオニ
ン標識後、抗−ＳＡＰ　−３５血清で免疫沈降している
。ＮＣＩ　−Ｈ４４１−４細胞は、レーン１および２で
はデキサメサゾンの非存在下に培養し、レーン６および
４では約ｉ［］ｎＭのデキサメサゾンの存在下に６日間
培養したものでＳＰ　−Ａと表示したＳＡＰ　−３５タ
ンパク質の産生は阻害されている。第６Ｂ図は類似の実
験で、ＭＣｌ−Ｈ４４１−４細胞金デキサメサゾンの非
存在下（レーン１および２）または１０　ｎＭデキサメ
サゾンの存在下（レーン３および４）に６日間培養し、
抗−ＳＰＬ　（Ｐｈｅ　）　　プロテオ＋）ｆド抗体で
免疫沈降させたもので、デキサメサゾンに反応して４０
，０００〜４６，０００ダルトンのＳＰＬ　（Ｐｈ８　
）タンパク質（ｐｒＯ８Ｐ　−Ｂと表示）の著しい誘導
がみられる。Ｍｒ−約２７，０００〜３３，０００のバ
ンドの出現（同じくデキサメサゾンにより誘導）はｐｒ
ｏ　ＳＰＬ　（Ｐｈｅ）ポリペプチドの部分タンパク分
解プロセッシング金示すものと考えられる。

ＳＰＬ　（Ｐｈｅ　）タンパク質前駆体の存在は、これ
らの培養条件下に、Ｐｒｏ　ＳＰＬ　（Ｐｈｅ　）に対
するこの細胞系によって産生されるタンパク分解酵素の
存在することを支持するものである。タンパク質はＳＤ
Ｓ　−ＰＡＧＥ　Ｔ分離Ｌ　、ニトロセルロースにブロ
ッティングし、同一時間オートラジオグラフィーに付す
。

第７図はＳＡＰ　−３５およびｐｒｏ　ＳＰＬ　（Ｐｈ
ｅ）のエンドグリコシダーゼおよびコラーデナーゼ消化
？示す。細胞は１［］ｎＭのデキサメサゾンの存在下（
レーン５および６）およびデキサメサゾンの非存在下（
レーン１〜４）にインキュペーションする。第７図は、
対照ＳＡＰ　−３５の移動（レーン１）ならびにＮＣＩ
　−Ｈ４４１−４細胞系のＳＡＰ　−３５タンパク質の
、エンドグリコシダーゼ−Ｈ（レーン２、非感受性）、
エンドグリコシダーゼ−Ｆ（レーン３、感受性）および
コラ−ブナ−ぜ（レーン４、感受性）に対する感受性を
示し、ＳＡＰ　−３５タンパク質のこれらの剤による特
徴的炭水化物およびペプチドマツぎング金例示するもの
である。レーン５および６はＥＩＰＬ　（Ｐｈｅ）タン
パク質、Ｍｒ　−４０，０００〜４６．０００およびＭ
ｒ−２７，０００〜３３，０００の免疫沈降、ならびに
ＳＰＬ　（Ｐｈｅ）タンパク質のエンドグリコシダーゼ
−Ｆ処理（レーン６、感受性）全示し、これはＳＰＬ　
（Ｐｈｅ）タンパク質前駆体上にＮ連結炭水化物が存在
し、エンドグリコシダーゼの添加でそれが除去されるこ
と金示している。２７，０００〜３３．０００で移動す
る物質（４０，０００〜４６．０００ＳＰＬ　（４９）
ＳＰＬ（Ｐｈｅ）　夕７バ／　ｘ）ｃｏ　−ｙ　ラｙ　
メツトモエンドグリコシダーゼ−Ｆに感受性で、エンド
グリコシダーゼ−Ｆ処理後（レーン６）、約２３．００
０に移動する。Ｃ３５８］メチオニン標識タンパク質は
ＭＣｌ−Ｈ４４１−４培養メジウムから酵素処理前に免
疫沈降させ、ＳＤＳ　−ＰＡＣ）Ｅで分離し、ついでニ
トロセルロースに転移シ、オートラジオグラフィーに付
す。

第８図は、Ｎｃｒ−ａ４４１−４細胞のＳＡＰ　−３５
タンパク質（レーン１および２）および５ＰＬ（４９）
ＳＰＬ（Ｐｈｅ）タンパク質（レーン３および４）全コ
ードするｍＭＡのノデンプロット解析金示す。レーン１
および６の細胞はデキサメサゾンの非存在下に培賽し、
レーン２および４の細胞は１０　ｎＭデキサメサゾンの
存在下に３日間培養する。総量ＲＮＡ約１２μｇがニト
ロセルロースにプロッティングされ、ＳＡＰ　−３５（
レーン１および２）またはＳＰＬ　（Ｐｈｅ　）　（レ
ーン３および４）に特異的な３２ｐ標識ｃｐＮＡ　ｋプ
ローブとして解析する。５ＡＰ−３５ｍＲＮＡのサイズ
は約２．１５〜２．２キロ塩基で、正常ヒト肺ＳＡＰ　
−３５ｍＲＮＡ　（Ｗｈｉｔｓｅｔｔ　。

Ｊ、　Ａ、ら：Ｊ、　Ｂｌｏｌ、　ｃｈｅｍ、、　　２
６２　：　５２５６〜５２６１，１９８７）と識別でき
ない。５ＰＬ（４９）ＳＰＬ（Ｐｈｅ）全コードする約
２．０キロ塩基のｍＲＮＡは、最近、正常ヒト肺に認め
られたｍＲＮＡと識別不能である。これらの研究によっ
て、ＮＣＩ−Ｔ（４４１−４細胞系のＳＡＰ　−３５お
よびＳＰＬ　（Ｐｈｅ）をコードするｍＲＮＡが同定さ
れ、その発現に対するｍＲＮＡの効果が確認される。

第９図は、ＮｃＩ−Ｈ８２０細胞系の細胞により、約１
０　ｎＭのデキサメサゾンの存在下またはデキサメサゾ
ンの非存在下に産生されｆｔ　ＳＰＬ　（Ｐｈｅ　）タ
ンパク質をコードするＲＮＡのノデンプロット解析を示
す。ＲＮＡは対照レーン１および６から抽出し、ＳＰＬ
　（Ｐｈｅ　）　ｆ−ｙ−ドする”Ｐ　ＣＤＮＡでのノ
デンプロット解析に付す。ＮＣＩ　−Ｈ８２０およびＮ
ＣＩ　−Ｈ１４０４細胞は、それぞれ、デキサメサゾン
の非存在下（レーン１および３）”！７’ｉ：ｉｄｌ。

ｎＭデキサメサゾンの存在下（それぞれレーン２および
４）に培讐する。ＳＰＬ　（Ｐｈｅ　）　ｙｌ（コード
するｆｆｌ　ＲＮＡの発現は、レーン２に認められるよ
うに、ＮＣＩ−Ｈ８２０細胞系中デキサメサゾンによっ
て誘導される。ＳＰＬ　（Ｐｈｅ　）　ｍＲＮＡの発現
は、デキサメサゾンの非存在でも存在下でも（レーン３
および４）、ＮＣＩ　−Ｈ１４０４細胞系には認められ
ない。

第１０図は、右側のレーンにＭｒ−４０，０００〜４６
，０００タンパク質（４３を表示）、左側のレーアＫＭ
ｒ−２７，０ＤＤ−３３，０００タンパク質の精製物の
ＳＤＳ　−ＰＡＧＥ解析金示す。両者ともＮｃｒ−ａ４
４１−４細胞系から産生され、単離される。デキサメサ
ゾン処理細胞＋　（３２）ｓ　〕メチオニンで標識し、
メジウムを集め、抗−ウシ界面活性グロテオリピドで免
疫沈降させ、約１６チポリアクリルアミド中８ＤＳ　−
ＰＡＧＥで解析する。放射性標識タンパク質はオートラ
ジオグラフィーにより可視化する。タンパク質を湿つ７
ｃゲルから切り出し、電気溶出後、ＳＤＳ　−ＰＡＧｇ
、ニトロセルロースへの転移、オートラジオグラフィー
に付す。

第１１Ａ図は、ＮＣＩ　−Ｈ４４１−４細胞系の細胞に
よって産生され、α−メメチーマンノースーアがロース
アフィニティーカラムで精製した５ＡＰ−６５タンパク
質のオートラジオグラムを示す。

非処置ＮＣＩ−Ｈ４４１−４細胞全標識し、標識メジウ
ムｔカラムに添加する。精製ＳＡＰ　−３５はマンノー
スで溶出する（矢印）。

第１１Ｂ図は、ＮＣＩ　−Ｈ４４１−４細胞系の細胞で
産生され、α−メメチーマンノースーアがロースアフィ
ニティーカラムで精製しｆｃＳＡＰ　−３５タンパク質
のｍ製金グラフで表示した図である。

図から明らかなように、５ＡＰ−３５タンパク質は、マ
ンノース含有溶出液の最初のほぼ３　ｒｎｌ中に検出さ
れる。

第１２図は、ＳＡＰ　−３５およびＰｒｏ　ＳＰＬ　（
Ｐｈｅ　）合成に対するデキサメサゾンの用址反応を示
す。

ｓＣニーｕ４４１−４ｕＪ胞系の細胞２様々の濃度のデ
キサメサ・メンと３日間インキュベーションし、ついで
６時間〔３５Ｓ〕メチオニン標識を行う。

ＳＡＰ　−３ｓ　（ロ）およびｐｒｏ　ＳＰＬ　（Ｐｈ
ｅ　）　（Δ）　ｋメジウムから免疫沈降し、ＳＤＳ　
−ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロースに電気ブロッテ
ィングする。ついでオートラジオグラムをデンシトメー
ターで走査する。第１３図における各点は、２回のアッ
セイのひとつの走査結果で２回のこのような実験の代表
値である。

第１３図はＳＡＰ　−３５およびＳＰＬ　（Ｐｈｅ　）
　ｍＲＮＡ産生に対するデキサメサ・メンの時間経過を
示す。

ＮＣＩ　−Ｈ４４１−４細胞系の細胞ｆ　１［］　ｎＭ
デキサメサゾン中、様々な時間インキュベーションする
。本明細書に述べるようにしてｖｌ）ｍＲＮＡ　を単ベ
シ、ニトロセルロースにプロツテインクスル。ニトロセ
ルロースプロット全本明細書に述べるように［３２ｐ　
〕標識ｓＡｐ　−３５（ロ）および５ＰＬ（Ｐｈｅ）（
Δ）ＣＤＮＡｉＤＮＡミプローブ理し、オートラジオグ
ラム全走査する。ｍＲＮＡの４倍希釈液全第１４図の各
点について走査し、直線範囲内で検出する。

発明の詳細な記述 本発明および本発明による利点全例示し、より完全な理
解？図る友め、以下に、サーファクタントタンパク質、
連続ヒト細胞系、少なくとも１種のサーファクタントタ
ンパク質およびそのタンパク質をコードする特定のｍＲ
ＮＡの産生およびその産生の選択的調節方法、ならびに
サーファクタントタンパク質を産生する肺上皮起源の＠
瘍細胞のスクリーニング方法について詳細に説明する。

サーファクタントタンパク質 「サーファクタントタンパク質」および／マ九は「タン
パク質」の語は、本明細書においては、互換的に広い意
味で用いられ、肺界部活性機能および調節に必要な生物
物理学的、生物学的性質を伴う任意のタンパク質を包含
する。サーファクタントタンパク質の例としては、ＳＡ
Ｐ　−３５，５ＰＬ（Ｐｈｅ　）およびＳＰＬ　（ｐｖ
ａｌ　）がある。サーファクタントタンパク質またはタ
ンパク質の語は貰た、成熟または完全にプロセッシング
され几サーフアクタントタンパク質に対する前駆体とし
て最初生業されるブレタンパク質、グレグロタンパク質
、プロタンパク質およびそれらの任意のフラグメントｔ
も包含する。活性なサーファクタントタンパクηは最初
、プレグロタンパク質およびプロメンバク質として産生
され、これが複雑な翻訳後プロセッシング會受けて完全
にプロセッシングされｔ活性なサーフ７クタントタンパ
ク質を生成スると考えられている。たとえば、ＳＰＬ　
（Ｐｈｅ　）サーフアクタ／トタンバク質は、ＮＣニー
　Ｈ４４１−４細胞系により最初、新規なＭｒ−４０，
０００〜４２．０００プレバレージヨンとして発現され
、ついでアスパラギン残基のグリコシル化およびシアリ
ル化金受けてＭｒ−４０，０００〜４６，０００（Ｄプ
ロタンパク質を生じ（第６Ａｆ　　６Ｂ、７および１０
図）、次にタンパク分解によってＭｒ　−６，０００〜
８，０００の脱グリコシル化、脱シアリル化された活性
なまたは完全にプロセッシング全受は友ＳＰＬ　（Ｐｈ
ｅ　）タンパク質に切断されることが明らかにされてい
る。まｔ１新規なＭｒ−２７，０００〜３３，０００の
タンパク質もＳＰＬ　（ｐｈθ）の前駆体と考えられ、
ＮＣＩ−Ｈ４４１−４細胞系によって産生され、エンド
グリコシダーぜ−Ｆおよびニユーラミニダーゼ消化に感
受性金示し、Ｍｒｍ２３．０００の脱グリコシル化、脱
シリル化ポリペプチド全生成することが明らかにされて
いる（第＜５Ａ、　６Ｂｔ　７および１０図）。Ｍｒ　
−２３，０００ダルトンのタンパク質は約６．３〜７．
６のＩ）Ｉ値を有する。Ｍｒ　−２３，０００のタンパ
ク質は、Ｍｒ＝４０．０００〜４６，０００のＳＰＬ　
（Ｐｈｅ　）前駆体がタンパク分解により切断されたフ
ラグメントと考えられている。Ｍｒ−４０，０００〜４
６，０００およびＭｒ　−２７，０００〜３３，０００
のタンパク質はＳＰＬ　（４９）ＳＰＬ（Ｐｈｅ）に比
べると水溶性が高＜、ｐｘ値はそれぞれ約４．６〜５．
４および６．０〜７．３である。

ｇ、＜ｒ−４０，０００〜４６，０００およびＭｒ　ｗ
＝２７．０００〜３３，０００のタンパク質はｉｎ　ｖ
ｉｖ。

においては速やかにタンパク分解金堂けると考えられて
いるので、それら全ヒト肺ま九は肺胞洗液から有意な量
、抽出できるとは考えられない。

ＳＰＬ　（ｐｅａｌ　）サーファクタントタンパク質に
ついては、最初Ｍｒ−２２ｔ０００の前駆体として産生
され、ついで気道に見出される活性なＭｒ　〜５．００
０〜６，０００のタンパク質にプロセッシングされるも
のと考えられる。ＳＰＬ　（Ｐｈｅ　）　Ｍｒ　ｘ２３
．０００の前駆体はＳＰＬ　（ｐＶａｌ　）　Ｍｒ　−
２２，０００前駆体と大きさは類似するが、５ＰＬ（ｐ
ｖａｌ）　ｍＲＮＡはＮＣＩ　−Ｈ４４１−４細胞系に
は検出されないので、ＳＰＬ　（Ｐｈｅ　）の前駆体で
あり、ＳＰＬ　（ｐＶＩＬｌ　）の前駆体ではないと考
えられている。２３，０００ダルトンのタンパク質のグ
リコシル化パターン、抗血清との免疫反応性および１Ｄ
−Ｓｎ２−　ＰＡＧＥ後の移動はすべて、Ｍｒ　−４０
，０００〜４６．Ｄ　００　ＳＰＬ　（４９）ＳＰＬ（
Ｐｈｅ）前駆体の基本的フラグメントとしてのその起源
に一致する（第７図）。

ＮＣＩ−Ｅ（４４１−４細胞から単離され、本明細書に
おいて論じられる新規なヒトタンパク質に加えて、４０
，０００〜４６，０００ダルトンの前駆体の他のタンパ
ク質の７ラグメントがＮＣＩ　−Ｈ４４１−４（第２Ａ
図および第２Ｂ図）および他のヒドンバク質を生成した
その分子のフラグメントである。

細胞系 少なくとも１種の丈−７アクタントタンバク質を生成す
る新規な細胞系が樹立され、それぞれＭＣｌ−Ｈ４４１
−４、ＭＣｌ−Ｈ８２Ｄ、ＮＣ’Ｉ　　−Ｈ１４０４お
よびＮＣＩ　−Ｈ，３２２と命名された。これらの細胞
系は肺腺癌患者から樹立されたものである。これらの細
胞系の細胞は、有意な形質転換または分化もしくは形態
学的特徴の喪失を伴うことなく、永久に、培養メジウム
中で生育されることができる。腺癌細胞系の形態学的お
よび細胞化学的特徴は、ヒト肺組織由来のｎ型上皮細胞
の特性である（第１Ａ、ＩＢ、ＩＣおよび１Ｂ図）。

ＮＣＩ−Ｈ４４１−４、ＮＣニー　Ｈ８２０、ＮＣＩ　
−Ｈ３２２およびＮＣＩ　−Ｈ１４０４細胞系はすべて
、ＥＬ工Ｆ３Ａ型アッセイで、ＳＡＰ　−３５に対し陽
性で、ＮＣＩ−Ｈ４４１−４およびＦｉＣＩ　−Ｈ！＋
　２２は（３１５Ｂ　）メチオンにより本明細書の記載
に従い標識したのち免疫沈降−オートラジオグツフィー
アッセイに付して抗−界面活性プロチオリｔド（ＳＰＬ
　（４９）ＳＰＬ（Ｐｈｅ　）に対して一次的に誘導〕
との免疫反応性全確認する試験で陽性を示す。ＮＣＩ　
−Ｈ８２０細胞系は、〔３５Ｓ　）メチオニン標識免疫
沈降−オートラジオグラフィーアッセイによって評価さ
れるようにＳＡＰ　−３５’ｃ産生ずる。４種のすべて
の細胞系はノデンプロット解析によりＳＰＬ（ｐｅａｌ
　）に対しては陰性である。

ＮＣＩ　−Ｈ４４１−４、ＮＣニーＨ８２０およびＮＣ
Ｉ　−Ｈ３２２細胞系は、たとえば約１０チウシ胎仔血
清中ＲＰＭＩ　−１６４０メジクムでよく生育し、静か
にぎペットで採取して新しいメジウムで希釈することに
よる連続培養で容易に継代できる。

好ましいＲＰＭＩ　−１６４０メジウムは、Ｇｉｂａ。

Ｌａｂｏｒａｔｏｒｌｅｓから入手可能で、本技術分野
においてよく知られている液体（１Ｃ）、Ｎｏ、　３２
０−１８７５である。その他、Ｇａｚｄａｒ、　Ａ、　
Ｆ、　　＆＋Ｑｉｅ、　Ｈ，Ｂ　（ＣａｎｃｅｒＲｅｓ
、、　　４６　：　６（１７）１　＃（５（１７）２，
１９８６年１１月）によって記載されているように％細
胞系の培養にＡＣＬ　−３およびＡＣＬ　−４メジクム
のような溶媒も使用できる。アスコルビン酸を連続的に
メジウム中に約１０〜５０ｍ９１Ｉｔ量添加し、ＳＡＰ
　−３５ｐ　ンハ／’Ｘ上ｃＤプロリン残基の適当なヒ
ドロキシル化全確実にする。ビタミンに類縁体も、５Ａ
Ｐ−３５上のグルメミン酸残基の適当なカルボキシル化
全確実にするのに十分な債、メジウム中に連続的に加え
る。これらの細胞系は、血清金倉まないメジウム中でも
長時間相容性を示し、血清含量の低いメジウム中で連続
的に生育できる。細胞の培養に利用できる有用な可能性
のある血清全含１ない様々なメジウムがＢｒａｖｅｒ　
、　Ｍ、ほか（Ｇｒｏｖｔｈ　ｏｆ　ｃｅｌｌ　１ｉｎ
ｅｓａｎｄ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ　
ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｎｏｎ−ａｍａｌｌｃｅｌｌ　　ｌ
ｕｎｇ　　ｃａｎｃｅｒ　　ｉｎ　　ａ　　ｓｅｒｕｍ
−ｆｒｅｓ　　ｄｅｆｉｎｅａｍｅｄｉｕｍ、　　Ｃａ
ｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、　　４　（５：　７９３−８［］
　（５゜１９８６年２月）によって開示されている。細
胞系は通常、血清含有メジウム中約９５チ空気−約５　
％　ｃｏ２通気下に単層培養として、または組織培養フ
ラスコ、プレート、ペトリ皿もしくはローラーボトルの
いずれかの密栓容器中で生育させる。

まｔｌこのような培蒙体は、コラービンまたはこのよう
な目的で設計され几基底膜タンパク質（ＢＡａｔｒｉｇ
θ１）音用いま九は用いないで様々な担体ビーズ上に生
育させることもできる。４種の庫瘍用胞はすべて、標章
トリプシン化による培養、または細胞全静かにピペット
で平板上に約１：乙に１週１回もしくは２週に１回の割
合で希釈することＫより、容易に継代できる。メジウム
からのタンパク質の精製には、抑清含量の低いメジウム
がきわめて有用である。

発現の調節方法 すでに述べたように、本発明は、メジウム中で培りされ
几細胞によるサーファクタントタンパク質の発現全調節
する新規な方法を包含する。−船釣にいえば、この方法
は、メジウム中で培養された細胞全有効な調節剤に暴露
し、少なくとも１種のサーファクタントタンパク質の細
胞による発現全調節するものである。これはたとえば、
細胞全培養するメジウム中に調節剤ｔ−ｆｆ５加するこ
とによって達成される。「調節剤」の語は、本明細書に
おいては、少なくとも１欅のサーファクタントタンパク
質および／ま友はそのタンパク質ビコードするｍＲＮＡ
の細胞による産生を誘導および／゛または阻害するため
に使用できる有効な任意の側音意味する。もちろん、調
節剤が何らかの作用金示す細胞は、サーフアクタントタ
ンパク質を産生できる細胞でなければならない。さらに
、細胞はこのようなタンパク質の産生全調節する遺伝的
能力１有しなければならない。すなわち、遺伝子操作さ
れｔ培養細胞の場合には、このような細胞は調節のため
に遺伝子的に操作されなければ、通常、調節されない。

したがって、本発明の調節は、サーファクタントタンパ
ク質および／またはそのタンパク質をコードするｍＲＮ
Ａの発現ならびにその発現の調節が可能な、天然または
他の任意の培養細胞を考慮するものである。

本明細書において用いられる「調節剤」の語は、培ｆ細
胞全遺伝子またはウィルスでそれぞれトランスフェクシ
ョンまたは感染させて、サーファクタントタンパク質の
長期間にわたる産生能全維持させる遺伝子４几はウィル
スも包含する。このような調節剤の例としては、各種の
唖瘍遺伝子たとえはｒａｅ、ｖ　−Ｈａ　−ｒａｅ、上
皮成長因子様腫瘍遺伝子たとえばθｒｂ　Ｂ１ならびに
Ｎ−ｍｙａ、　Ｃ−ｆｏｓ等のｌＦｉ　ｓＪ遺伝子があ
る。しかしながら、この種類の調節剤は加えるというよ
りも１Ｍを行う。暴１は細胞全有効な遺伝子またはウィ
ルス（調節剤）でそれぞれトランスフェクションまたは
感染全行うことで達成され、脱分化が変えられ、発現７
５Ｋｍ持される。

ＳＡＰ　−３５タンパク質の発現全選択的に１１節する
ためには、細胞全調節測定とえばｃＡＭＰの８−ブロモ
誘導体（Ｂ　−Ｂｒ　−ｃＡＭＰ　）または他の機能的
均等物の存在下に生育させることができる（第５図）。

ＳＰＬ　（Ｐｈｅ　）タンパク質の発現？選択的に調節
する穴めには、細胞をグルココルチコイドホルモン″！
！たけ他の機能的均等物のような調節剤の存在下に生育
させることができる（第２Ａ、２Ｂ。

６Ａ、　６Ｂ、７および１２図）。

ＮＣＩ　−Ｈ４４１−４細胞系は調節剤に暴露しなくて
もＳＡＰ　−３５ｋ合成する。しかしながら、８−　Ｂ
ｒ　−ｃＡＭＰで調節後には、ＮＣ’Ｉ　−Ｈ４４１−
４細胞の組織培養液中ＳＡＰ　−３５の増量が観察され
（第５図）、５ＡＰ−３５タンパク質はグリコシル化さ
れ定プロセッシング金受けｔタンパク質トシて、血清を
含まないメジウム中に分泌される。たとえば、数日間の
培養後、はぼ集密的なＮＣＩ−Ｈ４４１−４細胞のメジ
ウム中には約１〜１０μＩ／　ｍｌの濃度のＳＡＰ　−
３５の蓄積が観察され、８−Ｂｒ　−ｃＡＭＰによりこ
れは増量させることができる。

これはＥＬＩＳＡ型のアッセイで評価できる。しかしな
がら、デキサメサゾンはＳＰＬ　（Ｐｈｅ）前駆体およ
びＳＰＬ　（Ｐｈｅ）　ｍＲＮＡの発現を劇的に増加さ
せ、培養中におけるこの独特なタンパク質とｍＲＮＡの
産生の選択的な操作が可能である（第２　Ａ＊　２　Ｂ
ｔ６Ａ、６Ｂｔ　７，８．１２および１３図）。デキサ
メサゾンはま７’１−Ｘ５ＡＰ−３５およびＳＡＰ　−
３５ｍＲＮＡの合成全選択的に阻害する（第２Ａ、２Ｂ
ｔ＜ＳＡ、　６Ｂｔ　７，８１１２および１３図）。友
とえば、メジタム中約１０〜約１００　ｎＭのデキサメ
サゾンはＮＣＩ　−Ｈ４４１−４細胞系におけるＳＡＰ
　−３５タンパク質の産生上約２〜約１０分の１のオー
ダーに阻害する。一方、この濃度範囲のデキサメサゾン
をメジウムに添加した場合、ＮＣニー、（４４１−４細
胞系によるＳＰＬ　（ＰＭ　）　）　ンパク質の発現は
、［３５８］メチオニンで代謝的に標識して評価すると
約２倍以上に増加する。デキサメサゾンは他の調節剤と
同様釦、用量依存的に、５ｐＬ（４９）ＳＰＬ（Ｐｈｅ
）タンパク質の産生を誘導し、ＳＡＰ−３５の合成を阻
害する（第１２図）。しかも、デキサメサゾンは、用量
依存的Ｋ　、　ＳＡＰ　−３５ｍＭＡの相対数度を低下
させ、ＳＰＬ　（４９）ＳＰＬ（Ｐｈｅ）　ｍＲＮＡの
相対数産金上昇させる。ＳＡＰ　−３５およびＳＰＩ。

（４９）ＳＰＬ（Ｐｈｅ）両ｍＲＮＡに対するデキサメ
サゾンの用量依存的作用ＨＣ”Ｓ　］メチオニン導入に
よって観察される用量反応に類似する（第１２図、デー
タは示されていない）。ＳＡＰ　−３５およびＳＰＬ。

（Ｐｈｅ　）　ｍＲＮＡの数度はデキサメサゾｙ（ＩＱ
ｎＭ）の添加後緑時的に測定し、第１６図に示す。５Ａ
Ｐ−３５ｍｙｈに対するデキサメサゾンの阻害作用はこ
のホルモン添加後約１２時間で検出され、最大阻害は約
４８時間後に生じる。ＳＰＬ　（Ｐｈｅ　）　ｍＲＮＡ
はデキサメサゾン添加後約１２〜２４時間に上昇し、暴
露７２時間後にも依然として上昇している（第１６図）
。デキサメサゾンの場合、ＮＣＩ−Ｅ（４４１−４細胞
系の誘導または阻害のＥＤ５０は約１〜ＩＱｎＭと考え
られている。産生されたＳＰＬ。

（４９）ＳＰＬ（Ｐｈｅ　）は上述のようにホルモン処
理した細胞の細胞分解物および／ま九は調整メジウムか
ら収穫できる。

−Ｎｃｘ−ａ４４１−４細胞系［Ｌ７１＞Ｅっテ、ｎ型
上皮肺′！几クララ細胞が作り出すことが知られている
サーファクタントタンパク質を生成する点で独特の細胞
系である。しかも、この細胞系は、選択的に誘導される
と、過剰の単離可能量のＳＡＰ　−３５およびＳＰＬ　
（Ｐｈｅ　）　’ｊｚ生成する。したがって、ＮＣＩ　
−Ｈ４４１−４細胞系は生理学的に重要な完全にまたは
半ばプロセッシング金受けたサーファクタントタンパク
質の製造手段全提供するものである。さらに、その調節
への応答能により、ＭＣｌ−Ｈ４４１−４細胞系は、そ
のタンパク質？コードするｍＲ］’ＪＡの比較的大量の
発現も可能にする。

慣用の技術上使用して、これらのタンパク質をコードす
るｍＲＮＡ　七存在するｍＲＮＡ集団から分離すること
ができる。単離され、選択されたｍＲＮＡは、これらの
および他の界面活性ま友肺タンパク質のＱＤＮＡの製造
に使用することができる。本発明の調節方法に用いられ
るＮＣＩ　−Ｈ４４１−４細胞または他の細胞の感受性
は、培養条件、継代数、調節剤への暴露時間、細胞密度
、メジウム中の他の成分等に依存し、したがって、応答
は様々に変動するものであることを理解すべきである。

サーファクタントタンパク質およびそれ全コードするｍ
ＲＮＡの発現を調節するその他の調節剤としては、たと
えば、ｃＡＭＰ、コレラ毒素、ホルスコリン（約１０〜
１００μＭ）、ｃＡＭＰ−ホスホジェステラーゼ阻害剤
たとえばインブチルメチルキサンチン、テオフィリン、
アミノフィリン等（約１〜ＩＱｍＭ）、ＯＡＭＰの他の
誘導体たとえばジブチリル−ＯＡＭＰ　（約１０〜１０
０μＭ）、ホルボールエステルたとえばテトラドデコニ
ル１２−アセテート−１３−ミリステートホルボールエ
ステル（ＴＰＡ　）もしくはホルボール−ミリステート
アセテートエステｈ　（ｐｌｍ　）　（約１〜１（１７
）００ｎ、ＳＰＬ　（Ｐｈｅ）プレタンパク質およびそ
れをコードするｍＲＮＡの誘導に有効と考えられる各種
グルココルチコイド九とえばペタメサゾン、トリアムシ
ノロン、ハイドロコーチデン、コーチゾール等およびフ
ッ素化グルココルチコイドアゴニスト（約０．１〜１（
１７）００ｎがある。これらの種類の調節剤はメジウム
、好１しくは血清１１ないメジウムに添加できるが、ま
た、希釈血清ま九は他のタンパク質含有メジクムも使用
できる。８−　Ｂｒ　−ｃＡＭＰおよびデキサメサゾン
は、メジウムに、それぞれ約１０〜１００μＭおよび約
０．１〜１１００ｎの濃度になるように添加できる。以
上述べた調節剤とその量は単に例示し友ものであって、
本発明全限定するものではない。これらの調節剤まｔは
他の有効な調節剤の適当量が本発明の範囲内に包含され
る。破はメジウム中の調節剤の濃度で示す。

さらに、本発明の細胞系は他の細胞性タンパク質の噸生
全誘導することができる。本発明の教示に従い、同じま
たは他の調節剤により、グロテアーゼ、抗グロテアーゼ
およびホルモンの産生が誘導される。

タンパク質の精製方法 特定のタンパク質の発現全選択的に調節し元のち、細胞
の分解物またはメジウムからタンパク質の精製が行われ
る。ＳＰＬ　（４９）ＳＰＬ（Ｐｈｅ　）は上述のよう
に、細胞を、たとえばグルココルチコイドまたは他の適
当なホルモンの単独または配合物金含有するメジウム中
で選択的に誘導できる。ホルモンは約２４〜７２時間添
加し、ついでメジウム金集める。

連続的帯露まｔは短時間暴露後、細胞ｔｉはメジウムか
ら、ＳＡＰ　−３５、Ｍｒ　−３０，０００−３５，０
００ならびにＳＰＬ　（Ｐｈｅ　）前駆体、Ｍｒ　−４
０，０００〜４６，０００、Ｍｒ−２７，０００〜３３
．０００およびＭｒ−２３，０００に収穫することがで
きる。

培養時間は短い場合２４時間から長い場合１週間または
それ以上で連続培養できる。インキュベーション後、メ
ジウムおよび／または細胞には問題のタンパク質が蓄積
される。細胞？ホルモン含有メジウム中に維持し、問題
のタンパク質？連続的に採取して精製に付すこともでき
る。

Ｓｐ　−３５タンパク質は、細胞分解物まｔはメジウム
から様々な技術によって容易に精製できる。

たとえば、ＲＯθＢ、　Ｃ，Ｆ、ら（３ｔｒｕｃｔｕｒ
ｅ　ｏｆ　ｔｈｅＭａｊｏｒ　（Ｈｙｃｏｐｒｏｔｅｉ
ｎｓ　ｆｒｏｍ　’Ｈｕｍａｎ　Ａ’１ｖｅｏｘａｒｐ
ｒｏｔｅｉｎｏｓｉａ　３ｕｒｆａｃｔａｎｔ、　Ｂｉ
ｏｃｈｉｍ、　Ｂｔｏｐｈ７８゜Ａｃｔａ、　　９１１
　：２９４，１９８７）の記載し友方法金用いる等１ホ
ーカシング、Ｐｈａｒｍａｃｉａから得られる等電ホー
カシング全用い几高速タンパク質液体クロマトグラフィ
ー（ＦＰＬＣ）ついでモルキュラーシーブクロマトグラ
フイーおよびＣｔｂａｅｒｏｎ　Ｂｌｕｅアフィニティ
ークロマトグラフィーがある。モノクローナルおよびポ
リクローナル抗体ま九は３ｅｐｈａｒｏｓθ４Ｂもしく
はアがロースカラムにカップリングさせたα−メメチマ
ンノース？用い之親和性精製法も、第４Ａ、４Ｂ、１１
Ａおよび１１Ｂ図に示しｔようにＳＡＰ　−３５の精製
に有用である。抗体金アフィニティーカラムに抱合させ
るには、標準方法全使用できる。細胞分解物またはメジ
ウム金力ラムに適用したのち、タンパク質はたとえばα
−メメチーマンノースアがロースカラムの場合にはマン
ノースのようなバズテン糖とＥＤＴＡ、　ＥＣ）ＴＡを
用いて溶出することができる。本明細書に記載するよう
なイムノアフィニティーカラムからタンパク質を溶出す
るには、高塩濃度、高酸濃度または高塩基濃度の緩衝液
たとえば１Ｍ酢酸全使用できる。さらに、精製に先立っ
て他のタンパク質からＳＡＰ　−３５Ｐンバク’！　ｋ
　Ｍ択的に除去するために、ＳＡＰ　−３５と結合する
ホスホリピド小粒千金メジウムに添加してもよい。

ＳＰＬ　（ＰＭ　）前駆体タンパク質の精製は免疫沈降
、ついでＳｎ２−　ＰＡＧＥおよび電気溶出によって行
うことができる（第（ＳＡ、＋ＳＢ、７および１０図）
。この方法のほかにも、ｓｐｒ、　（４９）ＳＰＬ（Ｐ
ｈｅ　）前駆体タンパク質の精製には様々な方法がある
。ｔとえば、Ｍｒ＝４ｏ、ｏｏｏ　〜４６，０００、０
００のプレタンパク質は約４．６〜５．４の酸性のＰＩ
値金有するので、細胞分解物またはメジウムを集め、Ｄ
ＥＡＥ−セルロース樹脂まｔは等電ホーカシングに付す
ことができる。精製はイオンまたは非イオン界面活性剤
たとえばＮＰ　−４０およびドデシル硫酸ナトリウムの
存在下または非存在下に実施することができる。レクチ
ンアフィニティーおよびモルキュラーシーブクロマトグ
ラフイー、ならびに５ＰＬ（Ｐｈｅ）まｆｃはその前駆
体に対して誘導させたポリクローナルマ友はモノクロー
ナル抗体音用いるアフィニティークロマトグラフィーも
精製に使用できる。

抗−ＳＡＰ　−３５について述べたように５ＰＬ（Ｐｈ
ｅ）抗体のカラムへの抱合も標準方法によって行うこと
ができる。ＳＰＬ　（Ｐｈｅ　）フラグメントはその前
駆体よりも疎水性で、ホスホリヒド九とえばホスファチ
ジルコリンおよびホスファチジルグリセロールと会合す
るので、ＳＰＬ　（Ｐｈｅ　）タンパク質まｔはその前
駆体ペプチドはボスポリキトタンパク質複合体として精
製し、これ全脂質タンパク質の場合に用いられるような
浮遊密度を用いる超遠心によりさらに精製することがで
きる。ＳＰＬ　（Ｐｈｅ　）プロタンパク質？１種また
は２種以上のプロテアーゼで処理し、精製前に小さな疎
水性ペプチド全生成させることも有用である。ＳＰＬ　
（Ｐｈｅ　）前駆体の各種疎水性フラグメントは、たと
えば、疎水性タンパク質の単離に従来用いられ報告され
ていルクロロホルム／メタノールもしくはｎ−ｊり／−
ルまたはエーテル／エタノール溶媒抽出音用いて精製す
ることもできる（ｆｃとえばＷｈｉｔｓｅｔｔ　。

Ｊ、　Ａ、ら：　ｐｅｄｉａｔｒ、　Ｒｅｓ、、　　２
０　：　４６０〜４６７＋’Ｉ、　９８　＜Ｓ　；　Ｗ
ｈｉｔａｅｔｔ　、　Ｊ、　Ａ、ら：　ｐｅｄｉａｔｒ
。

Ｒｅｓ、、２０ニア４４−７４９，１９８（Ｓ参照）。

上述のように、ＮＣ：［−Ｈ４４１−４細胞系は、Ｍ”
＝　４０＋０００〜４６．０００　　Ｐｒｏ　ＳＰＬ　
（４９）ＳＰＬ（Ｐｈｅ　）ノタンパク分解フラグメン
トと考えられるＭｒｗ＝２７．０００〜３３，０００ダ
ルトンのタンパク質を産生し、これは上述しｔと類似の
技術によって精製できる。ＳＰＬ　（Ｐｈｅ　）のクン
バク分解フラグメントの生成は、ＳＰＬ　（Ｐｈｅ）の
タンパク分解プロセッシングに必要なプロテアーゼがＮ
Ｃニー　Ｈ４４１−４細胞系起源のものであること全示
唆している。

ＳＰＬ　（Ｐｈｅ）前駆体は、ＳＰＬ　（Ｐｈｅ　）に
対して誘導された抗体を用い免疫沈降またはイムノアフ
ィニティークロマトグラフィによりさらに精製すれば、
完全かつ迅速な精製を達成できる。免疫沈降によって精
製されたＭｒ−４０，０００〜４６，０００およびＭｒ
−２７，０００〜３３，０００　５ＰＬ（Ｐｈｅ）の例
は第６Ａ、６Ｂ、７．および１０図に示す。

デキサメサゾン暴露後にＮＣＩ　−Ｈ４４１−４細胞系
からのメジウム全最初（３５Ｂ　）メチオニンで放射標
識し、ついでウシ疎水性プロテオリぎトタンバク質に対
して誘導されたヒ）　ＳＰＬ　（４９）ＳＰＬ（Ｐｈｅ
　）　全ｒ識するポリクローナル抗血清で沈降させる。

５ＰＬ（４９）ＳＰＬ（Ｐｈｅ　）ペプチドは次にＮＥ
ＰＨＧＥ　−ＳＤＳ　−ＰＡｆｌＥ分析に付し、ＳＰＬ
　（Ｐｈｅ）タンパク質を同定する。

ＭＣｌ−Ｈ４４１−４細胞系中で、ＳＰＬ　（Ｐｈｅ）
前駆体の一部はグリコシル化されているので、精製はま
た、多数の選択的レクチンアフィニティークロマトグラ
フィー剤たとえばコンカナバリンＡ−３ｅｐｈａｒｏｓ
ｅ　、小麦胚アグルチｙ　−３ｅｐｈａｒｏｓｅ（ＷＣ
）Ａ　）等全周いて効率金高めることもできる。

Ｍｒ−２７，０００−３３，０００のタンパク質は、ツ
ルの２　Ｄ　−ＩＥＦ　−ＳＤＳ　−ＰＡＧＥ（Ｐ、　
Ｚ。

Ｑ’　Ｆａｒｒｅｌｌら：　Ｈｌｇｈ　Ｈｅ５ｏ１ｕｔ
１ｏｎ　’ｌ’Ｗｏ−ｐｉｍｅｎｔｉｏｎａ１ｇ１ｅｃ
ｔ、ｒｏｐｈｏｒｅｓｌｓ　　ｏｆ　　Ｂａ５ｉｃ　　
ａｓ　　ｗｅｌｌ　　ａＥＩ　　ＡＣｌｄｉＯｐｒｏｔ
ｅｉｎｓ、Ｃｅ１ｌ、　　１　２　：　　１　１　３３
〜１　１　４２＋１９７７；この記載すべてを参考とし
て本明細書に導入する）に容易には入らないので、その
分析および精製にはＮＥＰＨＧｇ　−８ＤＳ　−ＰＡＧ
Ｅが好ましい。

しかしながら、同定されたＳＰＬ　（Ｐｈｅ）前駆体Ｍ
ｒ　−４０，０００〜４６，０００、Ｍｒ　−２７，０
００〜３３，０００およびＭｒ　−２３，０００のタン
パク質はすべて、第７図に示すようにＩ　Ｄ　−ＳＤＢ
　−ＰＡＧＥで精製できる。Ｍｒ　−２３１０００のタ
ンパク質の分析および精製には、Ｉ　Ｄ　−ＳＤＳ　−
ＰＡＣ）ＥまたはＮＥＰＨｌ　−ＰＡＣ）Ｅ　ｉ使用す
ることができ、また、Ｍｒ　＝　２７，０００〜３３，
０００　ｐ　ンパク質の精製について記載し友のと同じ
方法を用いて精製することができる（第７図）。

さらに、すでに述べたように、すぎド結合タンパク質を
選択的に結合し、これらの細胞によって分離される他の
非すピド結合タンパク質から分離するために、ホスホリ
キドの添加、ついでサイジングまたはアフィニティーク
ロマトグラフィーによって精製することができる。アル
ブミンはＣ１ｂａｃｒｏｎ　Ｂｌｕθクロマトグラフィ
ーまたは他のアルブミン結合アフィニティー樹脂音用い
て除去すｂことができ、夾惟血清アルブミンはこの方法
で除去さバる。タンパク質の同定はまｔ、既知のタンパ
ク質マーカーと合成タンパク質との共移動により、また
タンパク質をエンドグリコシダーゼ−Ｈまたはエンドグ
リコシダーゼ−Ｆで処理してＮ一連結グリコシル化の存
在全開らかにすることにより、まｔ気道に存在するタン
パク質もしくは正常、肺組織によって合成されるタンパ
ク質と共移動させることによって行われる。ＳＰＬ　（
Ｐｈｅ　）グロテオリピド前駆体、Ｍｒ　−４０，００
０−４６，０００のＭｒ　−２７，０００〜３３，００
０の前駆体へのタンパク分解プロセッシングは組織培養
中に有意な割合起Ｏる。疎水性のＭｒ−６，０００〜８
．０００ＳＰＬ　（Ｐｈｅ）への完全なプロセッシング
はＮＣＩ−Ｈ４４１−４メジウムをラット］型細胞に添
加しｔのちに観察されるが、ＳＰＬ　（Ｐｈｅ　）自体
は本明細書に記載する細胞系からはまだ単離されていな
い。

精製し几前嘔体メンバク質は、適当な肺プロテアーゼ、
メタログロチアーゼ、エラスターゼ、トリプシン、パパ
イン、スタフＶ−３プロテアーゼ、テルモリシン、カテ
プシン、キモトリプシンまたは他の標準的ｆＷ製グロテ
アーゼで処理して、特殊な療法に有用な適当なフラグメ
ントラ生成させることができる。疎水性タンパク質、Ｓ
ＰＬ　（Ｐｈｅ）およびＳＰＬ　（ｐｅａｌ　）はグロ
テアーゼ消化に抵抗性を示す（Ｗｈｉｔｓａｔｔ、　Ｊ
、　Ａ、ら：　Ｐｅｄｉａｔ、ｒ。

Ｒｅｓ、、　　２０：４６［１−４６７，１９８６）の
で、前駆体タンパク質からＮ−およびＣ−末端残基金除
去して、完全にプロセッシングされた成熟型の「活性な
」界面活性ペグチド金得ることができる。

ＳＰＬ　（ｐＶａｌ　）はＮＣＩ　−Ｈ４４１−４細胞
によっては検出可能なほどの量は発現されないが、他の
細胞もしくは類似の細胞におけるＳＰＬ　（ｐｅａｌ　
）または他の重要なｎ型細胞タンパク質の同定および発
現誘導には、類似の方法が有用であろうと思われる。し
かしながら、Ｎ一連結炭水化物は５ＰＬ（Ｐｈｅ　）に
検出されていないし、ＣＤＮＡから誘導される予想アミ
ノ酸配列ではＮ一連結炭水化物を欠くことが予測される
ので、レクチンの結合は有益ではないと思われる。

細胞のスクリーニング方法 サーファクタントタンパク質を産生する肺上皮起源の帷
瘍細胞のスクリーニングには、まず、細胞を標準培養メ
ジウム、元とえば５〜１０チクシ袷仔血清含有ＲＰＭＩ
　−１６４０、ＡＬ、Ｃ−３またはＡＬＣ−４中、９５
憾空気−５チＣＯ２全用い、プラスチック容器内で培養
する。ついで、これから、綱熾培養フラスコに、実験前
に細胞がほぼ集密状態に達するような濃度に平板培讐す
る。次に平板から細胞金かき取り、メジウム全洗い流す
。ＮＰ−４０または他の界面活性剤の存在下または非存
在下、希釈緩衝液中で超音波処理すると細胞分解物が得
られる。細胞分解物’！ｒ、５ＡＰ−３５についてのＥ
ＬＩＳＡ型アッセイによって試験する。ＥＬＩｓＡ型ア
ッセイには、硫安分画によって精製したヤギ抗−ヒトＳ
ＡＰ　−３５’ｒ用い、これ全プレートに適用する。細
胞分解物全プレートに加え、ついで第二の抗体、ウサギ
抗−ヒ）　ＳＡＰ　−３５、ついでイムノペルオキシダ
ーゼを含有する第三の抗−ウサギ抱合体抗体を加え、標
準の０−フェニルアミン−ジアミン反応で発色させる。

細胞がＥＬＨＥＡ型アッセイによりＳＡＰ　−３５陽性
であった場合は、さらにサーファクタントタンパク質発
現に至適な条件、ならびに特徴の調査、合成および産生
に至適な条件で検討する。これを行うには、スクリーニ
ングする細胞全上述のようにして生育させ、計画した実
験の約２４〜７２時間前にｔとえげ１００μＭ　　８−
　Ｂｒ　−ｃＡＭＰおよび／またはＩＱｎＭデギサメサ
・ｔン等？添加しその存在下に、ま７ｔばこのような調
節剤を加えないで培養する。ついで、細胞メジウムを洗
い流し、メチオニン欠乏、血清金倉まないメジウムで置
換する。新しく置換したメジウムＫ　（”５Ｓ　）メチ
オニン？添加して濃度約１００μＣ１／ｍノに４〜６時
間保持し、このメジウムを収穫し、抗−ＳＡＰ　−３５
または抗−界面活性グロテオリピド［ＳＰＬ　（Ｐｈｅ
　）および５ｐＬ（ｐｖａｌ））抗血清まｔは抗体によ
る免疫沈降に付す。この物質をついでＩ　Ｄ　−ＳＤＳ
　−ＰＡＣ）Ｅまたは２　Ｄ　−ＩＥＦ−ＰＡＩ、そし
てオートラジオグラムに付す。メジウムは免疫沈降の前
または後に２　Ｄ　−ＳＤＲ−ＰＡＧＥで集めることも
できる。

別法として、標識タンパク質ｉ、Ｉ　Ｄ−ＳＤＳ　−Ｐ
ＡＣ）Ｅ　、　ＩＪＥＰＨＧＥ　−ＳＤＳ　−ＰＡ（）
ｇま之は２　Ｄ　−ＩＥＦ−ＳＤＳ　−ＰＡＧＥで分離
し、ニトロセルロースに転移プロットし、乾燥し、つい
でオートラジオグラフィーおよびイムノプロット解析に
付してタンパク質を同定する。（３５ｓ　）メチオニン
または他の放射標識アミノ酸で標識された全タンパク質
を収穫し、トリクロロ酢酸で沈殿させ、分泌総タンパク
質に対し、サーファクタントタンパク質の分泌パーセン
ト？評価するためカウント全測定する。

細胞は機械的ホモシネ−ジョン、溶解ま之は窒素キャビ
テーションによってホモジナイズし、ついで分別遠心分
離によってＳＡＰ　−３５または５ＰＬ（Ｐｈｅ　）も
しくはＳＰＬ　（ｐＶａｌ　）に富んだ細胞分画を得る
。メジウムまたは細胞分解物全直接免疫学的精製に用い
てもよい。免疫学的抱合体？沈殿させるためにプロティ
ンＡ−８θｐｈａｒｏｇｅ　ｋ　用イル免疫沈降を実施
することもできる。

細胞は、Ｃｈｉｒｇｗｉｎら（Ｂｉｏｃｈｅｍｌｓｔｒ
ｙ、　１８　：５２９４〜５２９９，１９７９）の標準
方法によりｈｉｒｇｗｉｎ　の記載に従いホモシネ−ジ
ョンしたのち総ＲＮＡ　全調製する。ＲＮＡはついで、
ノデンプロット解析に使用する。アがロースゲル上で分
離し、ニトロセルロースに転移プロッティングし、つい
で３２ｐで放射標識したＣＤＮＡクローンによりハイブ
リダイゼーション解析全行い、種々の条件下に腫瘍Ａ中
の特異的ｍＲＮＡ　’ｉ同定する。

本明細書に記載し友細胞系でＳＰＬ　（ｐｅａｌ　）に
陽性とスクリーニングされなかつ友としても、ＳＰＬ　
（ｐＶａｌ　）または他のタンパク質を発現する可能性
がある他の細胞系のスクリーニングに使用できることを
理解すべきである。さらに、抗−ＳＰＬ　（Ｐｈｅ）ま
たは抗−ＳＡＰ　−３５抗血清を用いる免疫螢光法つい
で螢光顕微鏡により細胞系全スクリーニングすることも
できる。同様に、サーファクタントタンパク質の産生を
スクリーニングする几めに、放射イムノアッセイまたは
ドットグロットアツセイ？使用することもできる。

技術 抗体およびＱ　ＤＮＡプローブの生成、正常組織からの
タンパク質の単離、細胞系によって発現され７ｔタンパ
ク質の同定等に用いられる方法は大部分、本技術分野に
おいて広く実用化されているものであり、大部分の研究
者がその特異的条件および操作について記述する標準方
法の材料は熟知したものである。しかしながら、便宜の
ために、以下にそれらについて説明するとともに、参考
に掲げた文献はそのすべてを本明細に導入する。

さらに１本明細書における具体的技術および本発明につ
いては、Ｏ’Ｒｅ１ｌｌｙ、　Ｍ、　Ａ、ら：Ｄｉｆｆ
ｅｒｅｎｔｉａｌ　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　（）ｌｕｃ
ＯｃＯｒｔｉＱｏ：Ｌｄ　０ｎＥｚｐｒｅｓＩＩＩｉｏ
ｎ　ｏｆ　５ｕｒｆａｃｔａｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　
ｉｎ　ＨｕｍａｎＬｕｎｑ　Ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏ
ｍａ　（：ｓｌｌ　Ｌｉｎｅとして１９８７年、Ｊ、　
Ｂｉｏｌ、　Ｃｈθｍに投稿した。したがって、その全
記載全本明細に導入するとともに、以下に略述する。

ヒトグロテオリピドサーファクタントタンパク質の精製 肺界面活性剤は分別遠心分離によって精製し、疎水性タ
ンパク質はクロロホルム／メタノールまｆｃ’ｄ−エー
テル／エタノールで抽出する（　Ｗｂ　ｉ　ｔｓｅｔｔ
　。

Ｊ、Ａ、ら：　Ｐｅｄｉａｔｒ、　Ｒｅｓ、＋　２０　
：　４６０〜４６　Ｌ１９８６およびＷｈｉｔｓｓｔｔ
、　Ｊ、Ａ、ら：　Ｐｅｄｉａｔｒ。

Ｒｅｓ、、２０：　７４４〜７４９．１９８６）。ヒト
徂；哉の使用プロトコールは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　
ｏｆ　Ｃ１ｎ−ｃｉｎｎａｔｉ　ＣｏＣｏ１１ｅ　ｏｆ
　ＭｅｄｉｃｉｎｅのＨｕｍａｎ　ＲｅｓｅａｒｃｈＣ
ｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認されている。ヒトプレバ
レージョンＶこは、それらの異なるＮ末端配列によって
同定されるアポタンパク實、ＳＰＬ　（Ｐｈｅ）および
ＳＰＬ　（ｐｖａｌ）の２種［Ｇｌａｓｓｅｒ、　Ｓ、
Ｗ、ら：　ＰｒｏＣ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　ＳＣｉ、　ＵＳＡ＋　８４　
：　４００７〜４（１７）１＋１９８７および（１７）
ａｓｓｅｒ、　Ｓ、Ｗ、ら：　ｃＤＮＡ、　ｒ）９ｄｕ
ｃｅｄＰｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ　　３”、ｒｕｃｔｕｒ
ｅ　　ａｎｄ　　Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ　　Ａｓｓｉ
ｇｎ−ｍｅｎｔ　　ｏｆ　　Ｈｕｍａｎ　　Ｐｕｌｍｏ
ｎａｒｙ　　５ｕｒｆａｃｔａｎｔ　　Ｐｒｏｔｅｏｌ
ｉ−ｐｉａ　：　ｓｐｙ、　（ｐｖａｌ　）、　、ｒ、
　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ−＋　１９８７年投稿中）全含
有する。ＳＰＬ　（Ｐｈｅ）ペプチドのＮ末端、Ｐｈｅ
−Ｐｒｏ−ｒｕｅ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ等
は、すてＫＭ告したように（Ｇｌａｓｓｅｒ、　Ｓ、Ｗ
、ら：　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　　ＡＣａｄ、　　Ｓｃｉ、　　ｔＪ　ＳＡ
、　　８　４　　二　４　０　０　７　〜４（１７）１
゜１９８７）、ヒトプレバレージョンに得られる配列の
約３分の２である。残りはＳＰＬ　（ｐｖａｌ）　：　
Ｉｔｓ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｈ
ｉｓ−Ｌｅｕ等（正確なアミノ酸はＣＤＮＡおよび遺伝
子配列に由来）からなる。

Ｇｌａｓｓｅｒ＋　Ｓ、Ｗ、ら：　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ
ｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ。

８４　：　４００７〜４（１７）１．１９８７に記＄！
されたヌクレオチドおよびアミノ酸配列？とくに参考と
して本明細１に導入する。

ヒトＳＡＰ　−３５の精製 界面活性剤は、ヒト志願者および肺胞タンパク症患者の
肺洗浄液、満期帝王切開時に得られる羊水や、ヒト死体
剖検時の肺洗浄液から精製する。

すべてのプロトコールはＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　
ＣｉｎｃｉｎｎａｔｉＣｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｍｅｄｉ
ｃｉｎｅのＨｕｍａｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｏｍｍ１
ｔｔｅｅＫよって承認されている。ヒト界面活性剤は分
別遠心分離により精製し、肺洗浄液からのＳＡＰ　−３
５は、Ｒｏｓｓ、　Ｇ、Ｆ、らの記載（Ｂｉｏｃｈｉｍ
＋ＢｉｏｐｈｙＳ。

Ａｅｔａ、　８７０　：　２６７　、１９８６）に従り
、製造）１ホーカシングおよびＣ１ｂａｃｒｏｎ　Ｆ３
１ｕｅアフィニティークロマトグラフィーによって均一
に精製する。

界面活性剤のりａロホルム／メタノール抽出によって製
造したウシサーファクタント７ｇａテオリビド（Ｗｈｉ
ｔｓｅｔｔ、　Ｊ、Ａ、ら：　Ｐｅｄｉａｔｒ、　Ｒｅ
５−＋　２０：４６０〜４６７．１９８６ｂよびＷｈｉ
　ｔｓ８　ｔＬ、ｆ　、、Ａ、ら：　Ｐｅｄｉａｔｒ、
　Ｒｅｓ、、　２０　：　７４４〜７４９ｒ１９８６）
ｋウサゼに反復注射して抗血清（ポリクａ−ナル抗体）
？生成する。この抗血清（ウシ界面活性デａテオリピド
抗血清）は、４０．０００〜４６．０００り゛ルトンＳ
ＰＬ　（Ｐｈｅ）および２２．０００ダルトンＳＰＬ　
（ｐｖａｌ）前駆体の両者全免疫沈降する［　Ｇｌａｓ
ｓｅｒ、　Ｓ、Ｖｉ−ら：　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａ
ｅａｄ、　Ｓｃｉ　。

ＵＳＡ　、　８４　：　４００７〜４（１７）１．１９
８７；ＧｌａｓＳｅｒ、　Ｓ、Ｗ、ら：　ｃＤＮＡ、　
Ｄｅｄｕｃｅｄ　Ｐｏ１ＪｐｅｐｔｉｄｅＳｊｒ’、Ｉ
ＣｊｌｌｒＯａｎｄ　ＣｈｒＯｒＱＯ８Ｏｍａｌ　Ａｓ
ｓｘｇｎｍｅｎｔ　ＯｆＨｕｍＩｌｎ　Ｐｕｌｍｏｎａ
ｒｙ　５ｕｒｆａｃｔａｎｔ　Ｐｒｏｔｅｏｌｉｐｉｄ
　：　５ＰＬ（ｐｖａｌ）、　１９８７年Ｊ、　Ｂｉｏ
ｌ、　Ｃｈｅｍ、投稿：およびＷｈｉｔｓｅｔｔら：　
（）ｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ　ＥｎｈａｎｃｅｓＳ
ｕｒｆａｃｔａｎｔ　Ｐｒｏｔｓｏｌｉｐｊｄ　ＳＰＬ
　（Ｐｈｅ）ａｎｄ　５ＰＬ（ｐｖａｌ）　５ｙｎｔｈ
ｅｓｉｓ　ａｎｄ　ＲＮＡ　ｉｎ　Ｆａｔａｌ　Ｌｕｎ
ｇ、　１９８７年Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、投憤〕
。抗血清は、ウシ、？）およびイヌ界面活性剤の有機抽
出液のイムノプロットにおいて、ｖｒ−５，０（１７）
：ｌ〜１４，０００のタンパク質ト（β−メルカプトエ
タノールの存在下）反応する（　Ｗｈｉｔｓｅｔｔ、　
Ｊ、Ａ、ら：　Ｐｅｄｉａｔｒ、　Ｒｅ５−＋２Ｃｊ：
４６０〜４６７．１９８６および蒲ｊ、ｔｓｅｔｔ。

Ｊ、Ａ、ら：　Ｐｅｄｉａｔｒ、　Ｒｅｓ、、　２０　
：　７４４〜７４９゜１９８（Ｓ）。

ＳＡＰ〜６５は肺胞タンパク症、患者から得られた界面
活性剤音用いて均一に精製する（　ＲＯＳＳ＋　Ｇ、Ｆ
。

ら：　ＰｕｒｌｆｌＣａｊｌＯｎ　ｏｆ　Ｃａｎ１ｎｆ
３５ｕｒｆａｅｔａｎｔ−Ａｓｓｏｃｌ−ａｔｅｄ　Ｇ
ｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ、　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａ
ｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ、ＣｏｌｌａｇＣｏｌｌａ　　Ｒｅ
５ＩＳｊａｎｔ　Ｄｏｍａｉｎ、　　　Ｂ１０Ｃ１’１
１．ｍ＋　ＢＩＯｐｋｌｌｙＱ。

ＡＣｔａ、　８７０　：　２６７　、１９８６　）。抗
血清（ポリクローナル抗体）は、プロインドの完全アク
ユバント中精製タンパク質約３００μＩをヤヤおよヒニ
ューシーランド白色ウサギに反復注射することにより調
製する（　Ｗｅａｖｅｒ、　Ｔ、ｇ、ら：　５ｙｎｔｈ
ｅｓｉｓｏｆ　５ｕｒｆａｃｔａｎｔ　Ａｓ５ｏｃｉａ
ｔｅｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　−３５，ＱＱＱｉｎ　Ｐｅｔ
ａｌ　Ｌｕｎｇ　Ｏｒｇａｎ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ、　Ｊ、
　Ａｐｐｌ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、。

６１　：６９４，１９８６）。ＳＡＰ　−３５およびそ
のオリゴマーの特異性は、肺胞タンパク症患者の羊水ま
たは肺胞洗浄液から得た正常ＳＡＰ　−３５のイムノプ
ロット解析によって調べる。この抗血清の性質はＷｅａ
ｖｅｒ、　Ｔ、Ｅ、ら（５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　５
ｕｒｆａ−ｃｔａｎｔ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｄ　Ｐｒｏ
ｔｅｉｎ　−３５，Ｑ　Ｑ　Ｑ　ｉＨＦ’ｅｔａｌＬｕ
ｎｇ　Ｏｒｇａｎ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ、　Ｊ、　Ａｐｐｌ
、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、、　６１　：６９４．１９８６）
によって報告されている。

酵素 エンドグリコシダーゼ−Ｈおよび−ＦはＮｅｗｇｎｇｌ
ａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ　（Ｂｏｓｔｏｎ、　ＭＡ　）
から入手できる。タンパク質サンプルは本明細書に記載
するように免疫沈降する。エンドグリコシダーゼ消化に
際しては、ペレットｔｌ−５０ｍＭ酢酸ナトリウムーー
５．５と０−１　％　Ｎｏｎ１ｄｅｔ　Ｐ　−４０（Ｌ
ＫＢ）　２５０μを中に再懸濁する。酵素は終濃度１μ
ｆｊｌｒＬＩＩｌｃなるように加える。エンドグリコシ
ダーゼ−Ｐ消化に際しては、免疫沈降物ｔ”　５０　ｍ
Ｍ　＋）ン酸ナトリウムｐＨ−６，１，５ｍＭ　ＥＤＴ
Ａ　ｂよびＯ−１％　Ｎｏｎ１ｄｅｔＰ−４０中に再懸
濁する。酵素は終濃度２σ／ｄＫなるように加える。コ
ラーデナーゼ消化の場合は、免疫沈降物ｋ　１００　ｍ
Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｔｐＨ−７−３。

１００　ｍＭ　ＮａＣ１、Ｑ、５　ｍＭ　Ｍｇ５ｏ、、
　０．５　ｍＭ　ＣａＣ４２および０．１％Ｎｏｎ１ｄ
ｅｔ　Ｐ　−４０中に再懸濁する。

コラーｒナーゼは終濃度１００Ｕ／ｄになるように加え
る。酵素消化はすべて、３７°Ｏにおいて１８時間たえ
ず振盪しながらインキュベーションすることによシ行う
。

界面活性プロテオリピドのｇＬＩ８ＡはＳＡＬ　（Ｐｈ
ｅ）お二びＳＰＬ　（ｐｖａｌ）の両者を認識し、本明
細書に記載するようにして調製される抗−プロテオリピ
ド抗体を用いて行われる（　Ｗｈｉｔｓｅｔｔら：　Ｇ
ｌｙｃｏ−ｃｏｒｔｉｃｏｉｄ　Ｅｎｈａｎｃｅｓ　５
ｕｒｆａｃｔａｎｔ　ＰｒｏｔｅｏｌｉｐｉｄＳＰＬ　
（Ｐｈｅ）　ａｎｄ　ＳＰＬ　（ｐｖａｌ）　５ｙｎｔ
ｈｅｓｉｓ　ａｎｄ　ＲＮＡ１ｎ　Ｆａｔａｌ　Ｌｕｎ
ｇ、　１９８７年Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　Ｋ投
稿）。競合曲線はＳＰＬ　（ｐｖａｌ）　ｆ優位に含有
する精製ウシデロテオリぎド、または２種のタンパク質
ＳＰＬ　（Ｐｈｅ）およびＳＰＬ　（ｐｖａｌ）の混合
物で作成する。標準は、アッセイ条件下に抗体の免疫反
応性全児全に阻害する。標準プロテオリピドタンパク質
は、銀染色後および／または塩酸加水分解して前に行っ
たアミノ酸分析との関係から評価する（　（）ｌａｓｓ
ｅｒ、　８．Ｗ、ら：　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ
ａｄ、　Ｓｃｉ。

（ＪＳＡ、　８４　：　４００７〜４（１７）１，１９
８７）。この抗血清は、免疫沈降アッセイにおいて両プ
ロテオリピド前駆体と反応する。ｇＬＩ８Ａは、いずれ
のグラスナックウェルにも吸着される精製した、著明に
説脂質化したプロテオリビドを用いる競合的アッセイに
よって実施する。プロテオリピドゾレパレーションは、
抗血清の反応性全用量依存性に（１０〜ｉ　００　ｎ、
９　）阻害する。細胞ホモジネートのアッセイは、サン
プルを１０チグロパノ一ル水溶液中２〜３種の異なる希
釈率に希釈し、競合曲線と平行することを確認して行う
。細胞サンゾルは直ちにホモシネ−ジョンするか、また
はホモシネ−ジョン前１〜２週間、１０　ｍＭ　ＥＤＴ
Ａおよび１ｍＭ　ＲＭ８Ｆ含有リン酸緩衝食塩溶液ｐＨ
７，２中、−３０℃に凍結する。サンプルおよび抗−ウ
シブａテオリビドＰＭＳＦ抗血清（１：３０．０００ま
たは他の類似の希釈）は、ウェルへの添加前に３７℃チ
ー（ＩＥグレインキユベーションする。反応ハ、イムノ
（ルオキシダーゼ抱合ヤヤ抗−ウサｊＦ’１ｇＧ（１：
　１０００）とｏ−フェニレンシアミンで展開する。

ＳＡＰ　−３５ＥＬＩＳＡ型アッセイ ＳＡＰ　−３５の濃度は、本明細書に記載するようにし
て調製したヤｃｂよびウサギ抗血清を用いるＥＬＩＳＡ
　（酵素連結免疫吸着アッセイ）によって定量する。ア
ッセイはＦａｉｃｏｎマイクロタイターゾレ　−　ト　
（Ｂｅｃｔｏｎ　　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　　ａｎｄ　　
Ｃｏ、、　　０ｘｎａｒｄ　　ＣＡ）で実施する。標準
曲線は上述のように肺胞タンパク症患者から均一に精製
したヒト５Ａｐ−３５’に用いて作成する。肺胞タンパ
ク症タンパク質の組成、高速液体クロマトグラフィーお
よび薄層クロマトグラフィー（でよるトリプシン（プチ
ドマツビングの詳細はＲｏｓｓ、　Ｇ、Ｆ、ら（５ｔｒ
ｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ＭａｊｏｒＧｌｙｃｏｐｒｏｔｅ
ｉｎｓ　ｆｒｏｍ　Ｈｕｍａｎ　Ａｌｖｅｏｌａｒ　Ｐ
ｒｏｔｅｉｎｏｓｉｓｓｕｒｆａｅｔａｎｔ、　Ｂｉｏ
ｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ＋　９１１　
：２９４．１９８７）により報告されている。タンパク
質標準はＬｏｗｒｙ、　Ｏ，Ｈ，らの方法（Ｐｒｏｉｅ
ｉｎＭｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　Ｆｏ
ｌｉｎ−Ｐｈｅｎｏｌ　Ｒｅａｇｅｎｔ。

Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　ＣｈｅＩＴＬ、＋　１９３　：　２
６５　、１９５１　）により、ｚｊ照としてウシ血清ア
ルブミン？用い、加水分解およびアミノ酸分析後に定量
する。プレートは１　：　Ｉ　ＤＯヤシ抗−ヒトＳＡＰ
　−３５により４℃で一夜コーティングする。ついでウ
ェル全０．（１７）　Ｍ　　Ｔｒｌｓ−Ｈｃｔ　（ｐＪ
（８，０）および０．０５　％’ｐｗｅｅｎからなる「
洗浄緩衝液」で十分に洗浄する。

ウェルへの非特異的タンパク結合は、１５０ｍＭＮａＣ
６，１０ｒｒ＋Ｍ　Ｔｒｉｓ４Ｃ６（Ｘ　７．４　）、
５η／１ウシ血清アルデミン、５チヤヤおよび５毛ヒト
血清を含有する緩衝液で遮断する。ウェルを乾燥し、つ
いで羊水サンプルを添加する。ＳＡＰ　−３５含有液、
メジウムまたは細胞分解物は、１５ＱｍＭＮａＣｚ、　
５０　ｍＭ　Ｎａ２ＨＰ０４ＰＯ４（Ａ　７．、ｊ　）
と０，５壬ＮＰ−４Ｑ全含有する「希釈緩衝液」で１：
５０〜１：８００に希釈する。検定すべきサンプル（１
００μｔ）をウェル（三重実験）Ｋ加え、３７’Ｃで２
時間インキュベーションする。ウェル全Ａび洗浄緩衝液
で洗浄し、ついでウサギ抗血清）　５ＡＰ−３５を加え
る。ウサギ抗血清は「ｉｌ　＋所緩衝液」（５壬ヒトお
よび５壬ヤヤ血清含有）で１　：　２０００Ｋｌし、３
７℃で１時間インキュベーションする。ウェル？洗浄緩
衝液で洗浄し、ついで第三の抗体、西洋ワサげペルオキ
シダーゼ（（Ｍｂｉｏ　Ｃｈｅｍ　ＩＬａＪｏｌｌａ、
　ＣＡ　）に抱合したヤヤ抗−ウサｆ　ＩｇＧ　ｉｌ：
３０００に希釈して加える。この抗体は、５壬ヤ、ｆお
よび５％ヒト血清中０．０５％（Ｖ／Ｖ）Ｔｗｅｅｎ　
２０　ｋ含む希釈緩衝液で希釈する。プレート全３７℃
で１時間インキュベーションし、ついで洗浄緩衝液で繰
り返し洗浄する。１７ｍＭクエン酸および６５　ｍＭ　
Ｎａ２ＨＰＯ４／　ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ６−３）中基
質（０，０２％０−フェニレンシアミンおよび０．（１
７）５％Ｈ２Ｏ２）　ｋ室温でウェルに加える。

反応は３０分後に５Ｍ硫酸１００μｔで停止し、４９０
皿ンＣおける吸収音読む。この様式で実施したアッセイ
のアッセイ間変動係数は約５壬であった。

ＳＡＰ　−３５は安定に保存される。試薬および緩衝液
の作成に使用した化学薬品はＳｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃ
ａｌＣｏ、　（Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）から入手
した。細胞系のＳＡＰ　−３５産生のスクリーニングに
は上述の操作音用いる。

ｒル分析用界部活性タンパク質の単離 細胞は１０壬ウシ胎仔血清含有ＲＰＭＩ　−１６４０メ
クウム（（）ＩＢＣＯ）中、はぼ集密状態まで生育させ
る。デキサメサゾン（１００ｎＭ）、８−　Ｂｒ−ｃＡ
ＭＰ　　（１００ａＭ　　）　　（Ｓｉｇｍａ、　　　
丁ｎｃ、、　　Ｓｔ、　　Ｌｏｕｉｓ＋ＭＯ）は指示濃
度に約４８〜７２時間添加する。

メジウム金標識のため、血清を含まない、メチオニン欠
乏メジウムに変更する。細胞の代謝的標識は、メチオニ
ン欠乏（１Ｑ／を非標識メチオニン）の血清金倉まない
メジウム中で行う。比活性＝１０００　Ｃｉ　／　ｍｍ
ｏｌの［３５Ｓ］メチオニン（Ｎｅｗｇｎｇｌａｎｄ　
Ｎｕｃｌｅａｒ、　Ｂｏｓｔｏｎ、　ＭＡ　）　ｆ終濃
度１００〜１５０μＣｉ／ｖＶになるように加え、細胞
全５〜６時間インキュベーションする。［３５ｓ］メチ
オニン標識細胞ｋ　１９０　＋ｎＭ　ＮｔａＣｌ、　６
　ｍＭ　ＥＤＴＡ、　４　％ＳＤＳ、　１　ｍＭフェニ
ルメチルスルホニルフルオライドおよび６８　ｍＭ　Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｔ、　ＰＨ７，４中で超音波処理したのち
、電気泳動分析に付す。超音波処理物のサンプル全二重
にとり、トリクロロ酢酸で沈殿させて、［３５３］メチ
オニンの取り込み全測定する。

メジウムは冷アセトン沈殿によって集め、サンプル緩衝
液にとって、〔ｓ５Ｂ］標Ｒタンパク質の５ＤＳ−ＰＡ
ＧＥおよびＮＥＰＨＧＨ−８ＤＳ−ＰＡＧＥ解析金行う
。

タンパク質サンプルは減圧条件下、ドデシル硫酸ナトリ
ウム−ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ　−ＰＡＧｇ　
）　を気泳動（１３％）または二次元等電ホーカシング
ポリアクリルアミドｒル（２Ｄ　−ＩＥＦ−８ＤＳ−Ｐ
ＡＣ）Ｅ　）　ｌ（気泳＠（１６壬）（ｐ）（３，５〜
５，８）によって分析する（　Ｇａｒｒｉｓｏｎ、　Ｊ
、Ｃ，ら：　Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

ｃｈｅｍ、、　２５７　：　１３１３５〜１３１４３．
１９８２）。

タンパク質は電気泳動的にニトロセルロースに転移し、
ついでトルエン中２（１７）２．５−シフｚニルオキサ
・戸−ル溶液に浸漬し、Ｋｏｄａｋ　ＸＡＲ−２フイル
ムに一７０℃で露出するか、または５ＤＳ−ＰＡＩ後、
ニトロセルロースへの転移前もしくは後に直接オートラ
ジオグラフィーに付して同定する。５ＰＬ（Ｐｈｅ）前
駆体Ｍｒ−４０，０００〜４６，０００のＭｒ−２７，
０００〜３３．０００７ラグメントの同定には、類似の
技術音用い、Ｉ　Ｄ−８ＤＳ−ＰＡＧＥまたはＮＦＪＰ
ＨＧＥ−８ＤＢ分析が必要である。ｒル分析後のタンパ
ク質の検出にはＳａｍｍｏｎｓら：　Ｅｌｅｃｔｒｏｐ
ｈｏｒｅｓｉｓ。

２：１３５〜１４１．１９８１ｂよびＷｈｉｔｓｅｔｔ
ら：　Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ
、　８２８　：　１６２〜１７１．１９８５に記載され
ているイムノプロットまたは銀染色が使用される。

細胞は、４Ｍでニシンチオシアネート、０．５％Ｎ−ラ
ウロイルゲルコシン、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０
．Ｉ　Ｍβ−メルカゾトエタノールおよび０．１壬アン
チホームＡ含有緩衝液中でホモシネ−ジョンする。ＲＮ
Ａは塩化リチウム中沈殿（Ｃａｔｈａｌａ。

Ｇ、ら：　ＤＮＡ、　２　：　３２９〜３３５．１９８
３）または５．７Ｍ塩化セシウムのクツションを介した
遠心分離（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ、　Ｊ、Ｍ、ら：　Ｂ１０
Ｃｈ８ｍｌＳｔｒ７＋１８：５２９４〜５２９９．１９
７９）のいずれかによって抽出する。ＲＮＡベレットｔ
−１０，１％ＳＤＳ、　１　ｍＭ　ｇＤＴＡ、　１０　
ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｔ、　ｐＨ７，５含有可溶化緩衝
液または水に溶解し、フェノールおよびクロロホルムで
抽出し、エタノールで沈殿させる。水性溶液中のＲＮＡ
　ｉは２６０ｎｍｉＣおける吸光度で測定する。サンプ
ル間の変動を最小限にするために、対照および処理細胞
は平行して操作し、分析する。

ｍ　ＲＮＡを含有するニトロセルロース濾紙を、成人肺
ポＩＪ　Ａ”　ＲＮＡから生成させたλｇｔ　１１発現
ライブラリーより単離する１、５　ｋｂ　ＳＰＬ　（Ｐ
ｈｅ）　ｃＤＮＡクローン（２１４−１）　、０．３　
ｋｂ　ＳＰＬ　（ｐｖａｌ）ｃＤＮＡクローン（３３４
，２）または０．９　ｋｂ　ＳＡＰ　−３５ｃＤＮＡ　
／　ａ−ン（７，１）　トハイプリダイゼーションさせ
る（　Ｇｌａｓｓｅｒ、　Ｓ、Ｗ、ら：　Ｐ　ｒ　ＯＣ
，Ｎａ　ｔ　１．　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　　ＵＳＡ、８４：４００７〜４（１７）１　
．１９８７：Ｇｌａｓｓｅｒ、　Ｓ、Ｗ＋ら：　ｃＤＮ
Ａ、　Ｄｅｄｕｃｅｄ　Ｐｏ１ｙｐｅｐｔｉｄｅＳｔｒ
ｕｃｔｕｒｅ　　ａｎｄ　　Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　　
Ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ　　ｏｆ　匝鷹ｍＰｕ１ｍｏｎａ
ｒｙ　５ｕｒｆａｃｔａｎｔ　Ｐｒｏｔｅｏｌｉｐｉｄ
　　：　　ＳＰＬ　（ｐｖａｌ）。

１９８７年、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、に投稿；　
Ｗｈｉｔｓｅｔｔ。

Ｊ、Ａ、ら：　Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　２６２
　：　５２５６〜５２６１．１９８７；およびＷｂｉｔ
ｓｅｔｔ、　Ｊ、Ａ、ら：Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、
２　６２　　：　　７９０８〜７９１３゜１９８７）。

ＳＡＰ　−３５タンパク質クローンはｐＵＣｌ　Ｂ中に
連結する。このｃＤＮＡはＳＡＰ　−３５のほぼ全暗号
配列を含んでいる。ＳＡＰ　−３５タンパク質クローン
は、暗号配列中へ７番目の塩基で始ま勺、３′非翻訳領
域中へ１００塩基対に及ぶ。

ＳＡＰ　−３５ｃＤＮＡゾローデは、ランダムブライマ
ーｌ識キット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）またはニックト
ランスレーション試薬キット（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ
５ｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　）　ｆ用いて
〔α−３２Ｐ〕−ａｃｒｐで標識する。一部の実験では
、濾紙ｔ−ＳＰＬ　（Ｐｈｅ）プローブ金倉まなくなる
まで洗浄し、５ＡＰ−３５のほぼ全暗号領域を含むＳＡ
Ｐ　−３５ｃＤＮＡ　ｆ同様にしてデミープとして用い
る（　Ｗｈｉｔｓｅｔｔ、　Ｊ、Ａ−ら：Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　　Ｃｈｅｎｌ、ｅ　　２６７　　”　　７
９０８〜７９１　３　　。

１９８７およびＷｈｉｔｓｅｔｔ、　Ｊ、Ａ、ら：　Ｊ
、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、、２６２　：　５２５６〜５２６１．１　９
８７）。

ノヂンデａット分析では、ｍＲＮＡは細胞から調製Ｌ、
１．２％アがａ−スホルムアルデヒドゲル上で分離して
（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、ら：　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ
　ＣＣ１ｏ−ｎ１ｎ＋　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍ
ａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　駈ｂｏｒ。

ＮｅｗＹｏｒｋ、　　ｐｐｌ　　２　ｓ　〜ｉ　　２６
　　、　１　９８２）、　ニトロセルロースに転移する
。濾紙全８０℃で２時間ｍｍ−ｒる。ニトロセルロース
「スロットＪ−ｆロットは、スロットプロット複写装置
（５ｃｈｌｉｃｈｅｒ　＆５ｃｈｕｅｌｌ、　Ｉｎｃ、
　）　ｆ用いて、ホルムアルデヒド変性ＲＮＡ的２５０
〜５００　ｎｇｋニドａセルｏ　−スに適用することに
より作成される。ノヂ・ンデａット解析では、５〜１２
μｇのＲＮＡが適用される。

ライで［紙ｔ−１４０％脱イオンホルムアミド、５ｘ　
ｓｓｃ　（１ｘ　ｓｓｃ　−ｏ、ｌ　５　Ｍ　ＮａＣ４
ｏ、ｏ　１５　Ｍクエン酸ナトリウム）、５０　ｍｕ　
ＮａＨ２ＰＯ４，ｐＨ７、Ｑ　。

５ＸＸノンルトｇ液（１×デンハルト醇液−０，０２幅
ウシ血清アルブミン、０．０２％フィコール、０．０２
％ポリビニルビａリドン）、０．２　％　ＳＤＳ　ｉ−
よび１００．、、ｇ／は変性サケ精子ＤＮＡ中、４１℃
で一夜、グレハイプリダイゼーションする。ＲＮＡは同
じ溶液中、約５　ｘ　ｌ　Ｑ’　ｃｐｍ　／　ｍＡ　［
”２Ｐｌ標識ＳＡＰ　−３５ｃＤＮＡと、４１°Ｃで一
皮ハイデリダイゼーションする。ハイブリダイゼーショ
ン後、濾紙金、室温において２　Ｘ　ＳＳｃ、　０．２
壬ＳＤＳで好ましくは４回、同じ溶液で４１°Ｃにおい
て１回、０．２Ｘ　ＳＳＣ，０，２壬ＳＤＳで５０°Ｃ
において１回洗浄する。ついで、濾紙金２枚のサランラ
ップの間にはさんでＫｏｄａｋ　ＸＡＲ−２フイルムに
露出する。

はぼ集密状態のＮＣｒ−Ｈ４４１−４細胞を１５０α２
プラスチツク培養容器内で、１０チウシ胎仔血清と２０
η／ｌアスコルビン酸中２５　ｍＭ　ＷＰＦＦＢ（＃　
７．０　）　を有のＲＰＭＩメジウムで培養する。メジ
ウム′（ｌｌ″除去し、１η／ｌｎｅメチオニンおよび
２０ｒａｐ、’ｌアスコルビン酸含有ダルベツコ改良イ
ーグル培地に置換する。メジウム１２　ｍｌ　ＩＣ２，
５ｍｃｉ　（７）［３５Ｂ　］メチオニンを添加し、細
胞全豹３７°Ｃ１５％　ｃｏ２／空気において、約６時
間インキュベーションする。メジウムを鴨め、低速遠心
分隋器全用いてｓ　ｏ　ｏ　ｒｐｍで約８分間遠心分離
して細胞せたは細胞屑全除く。標識メジウムを一夜、約
４０°Ｃで、４ｔの２０田Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、　Ｏ
−Ｉ　Ｍ　ＮａＣ１緩衝液（ｐＨ７，４）中に透析する
。翌日も、標識メジウムの透析？同じ緩衝液で２回反復
する。タンパク償金、５　ｍＭ　ＣａＣ４２を添加した
同じ緩衝液中α−メチルーマンノースーアがロース（Ｓ
ｌｇｍａ、■ｎｃ、）のアフィニティーカラム（１１ｘ
　１．５ｃｍ）に室温で添加する。カラムを、緩衝液３
０（１１ｄ）分画で洗浄し、ついで５　ｍｕ　ＥＤＴＡ
金含むがＣａＣ６ｚを除いた上記緩衝液で洗浄する。Ｓ
ＡＰ　−３５タンパク質は、０．５Ｍマンノース含有の
同じ緩衝液（１０ｍｌ　）で溶出すると、マンノース含
有溶出液のほぼ最初の３１に検出される（第１１ｂ図）
。ＳＡＰ　−６５タンパク質は、マンノース分画にイム
ノプロットによって検出されるが、他のカラム分画には
検出されない。［”５ｇ）標識タンパク質をついで５Ｄ
Ｓ−ＰＡＧＥ　（１３憾）Ｋ付し、電気泳動で分離し、
ニドａセルａ−ス〈転移し、Ｘ線フィルムに適用してオ
ートラジオグラフィー全行う（第１１Ａ図）。

ＳＡＰ　−３５タンパク質およびそのダイマー　Ｍｒ−
３０、［］　ＯＯ〜３５．０００およびＭｒ　−６０，
０００〜６５．０００はそれぞれ、マンノース含有緩衝
液で選択的に溶出された。

はぼ集密状態のＨ４４１−４細胞を、ウシ胎仔血？ｌ含
まないＲＰＭＩメゾウム中、１０ｎＭデキサメサゾンで
約５日間処理する。メジウム全除去し、Ｑ、５習／ｌメ
チオニン金含有するＤＭｇＭで置換する。細胞を、７５
α２のプラスチックフラスコ中、１ｍＣ１の［３ｊＳ］
メチオニン全含有するメジウム２（１７）１！／を加え
て、６７℃、５壬ＣＯ□／空気において、−４（１８時
間）インキュベーションする。

メジ゛ウム（２０＋１１７）Ｌ：傾瀉し、濃縮し、凍結
乾燥し、ついｔｌｄｏＪｌ化緩衝液（１９［１＋ｎＭ　
ＮａＣ４゜６　ｍＭ　ＩＴＡ、　６　Ｑ　ｍＭ　Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣＬ、　４　％　ＳＤＳ　）および１１ＩＩｌ希
釈緩衝液（１９０ｍＭ　Ｎａｃｔ、　６　ｍｕ　ＦＤＴ
Ａ　。

５　Ｑ　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｔｐＨ７，４ｂよび２，
５　ｔｌｐＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００）で再構築する。

これ全マイクロツユ−シーＢで２分間遠心分離し、上清
を傾瀉し、上清に５０μ乙のウサギ抗−界部活性プロテ
オリビド（ウサヤ◆１０）を加え、ＳＰＬ　（Ｐｈｅ）
前駆体全結合させる。４℃で一夜（１８時間）インキュ
ベーションしたのち、サンプル全マイクロフユージーＢ
Ｔ２分間遠心分離し、可溶性タンパク質を２００μ乙の
１：１ゾロテイｙ　Ａ　−８ｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦＪ液
（８ｉｇｍａＣｈｅｍ　Ｃｏ、）に加える。キンプル全
室温で約６時間攪拌し、緩衝液（１５Ｑ　＋ｎＭ　Ｎａ
、Ｃ１ｒ　５０　ｍＭ　Ｔｒｊｓ−ＨＣＬ　ｐ）（７−
５、５＋ｎＭ　ＥＤＴＡ、　０．１　％　Ｔｒｉｔｏｎ
および０．０２１　ＳＤＳ　）、１ｍＭ　ＰＭＳＦ中で
洗浄する。プロティンＡ　−５ｅｐｈａｒｏｓｅ複合体
全１Ｍで５回、１５０ｍＭ　ＮａＣｔ、　５０　ｍＭ　
Ｔｒｉｓ−ＨＣｔｐＨ７，５および５ＱｍＭＥＤＴＡ　
（緩衝液２）、ｉ　ｍｕ　ＰＭＳＦで洗浄する。洗浄し
た免疫沈降体２５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（１３％）で分離Ｌ
、／Ｆ’ルの一部？ニトロセルロースにトランスブロツ
テイングし、Ｘｉフィルムに１８時間露出して、ｕｒ−
２７，０００〜３３，０００および４０．ＯＤＤ〜４６
．０００　ＳＰＬ　（ｐｈθ）タンパク質を同定する（
第１０図）。タンパク質ｆｆ１Ｐルから切り出し、ｇｌ
ｕｔｒａｐの商品名で知られている５ｃｈｌａｉＣｈｅ
ｒ　＆５ｃｈｕｅｌｌの電気分離システムを用い、Ｔｒ
ｉｓホウ酸塩（２０ｍＭ　）、０．５　ｍＭ　Ｆ、ＤＴ
Ａ　（ｐＨ８，２）緩衝液中、電気浴出に付す。精製し
たタンパク賞金つルロースにトランスプロッティングし
、乾燥し、−７０°Ｃで７２時間、オートラヅオグラフ
イーに付す。予め染色した標準タンパク質マーカー（Ｂ
ＲＬＩｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ　）と相対移動度を比較
することにより、分子量全判定する。精製したタンパク
質はｍ　−２７，０００およびＭｒ　−４３，０００に
移動し、これはそれぞれＳＰＬ　（Ｐｈｅ）前駆体Ｍｒ
　＝　２７，０００〜５３，０００お工びＭｒ　−４０
，０００〜４６，０００に相当する。

ＩＪＣＩ　−Ｈ４４１−４細胞系の細胞の８−　Ｂｒ　
−ｃＡＭＰ　ｊｃよる調節 ３５ｍプラスチックウェル中はぼ集密状態のＨ４４１−
４細胞を、１００μＭ　８−　Ｂｒ　−ｃＡＭＰ　。

？ＭＩ　−１０％ウシ給仕血清中、６日間培養する。

メジウムｔ−１８９７ｇウシ血清アルブミンを含むＤＭ
ｇＭメジウムで置換し、６７°Ｇ、５１ＣＯ２／空気に
おいて、Ｉ　Ｄ　ＯａＭ　８−　Ｂｒ　−ｃＡＭＰ　（
８ｌｇｍａ）および１ヤ／ｌメチオニンの存在下または
非存在下、約１時間ブレインキュベーションする。ｍＫ
細胞を別々のウェルで標識し、以下、別個の実験として
操作する。細胞にｌ　Ｑ　Ｑ　ｔｔｃｉの［３５Ｂ］メ
チオニンを加え、３７℃、５チＣＯ２／空気において６
時間標識する。メジウムを収穫し、痣メチオニン標識タ
ンパク質をＴＣＡ沈殿によって評価し、ウサヤーヒトＳ
ＡＰ　−３５血清（ウサヂ３６１）を用いてＳＡＰ　−
３５の免疫沈降のために標準化する。

免疫抱合体を、ゾロティンＡ　−８ｅｐｈａｒｏｓｅ　
ＣＬ　−４Ｂ免疫沈降緩衝液を用いて集める。タンパク
質をニトロセルロースに転移し、オートランオグラフイ
ーに付す。Ｈ５図のレーン１〜３は対照（非処理）ウェ
ルであり、レーン４〜６は１００μＭＳ　−Ｂｒ　−ｃ
ＡＭＰ処理している。最右端のレーンは標準マーカーで
ある。

ＮＣｒ　−Ｈ４４１−４肺腺癌細胞は、Ｎａｔｉｏｎａ
ｌＣａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　（Ｂｅｔｈｅｓ
ｄａ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ　）において、６膜侵襲のあ
るヒト肺の乳頭腺癌から単離した。組織源は心膜液であ
る。患者は３６歳の白人男性であった。

最初の培養細胞系はＮｃｒ　−Ｈ４４１と命名し、１９
８２年６月２５日に培’１１に：開始し、ＡＣＬ　−３
メヅウム中で培養した（　Ｂｒｏｗｅｒら：　Ｇｒｏｗ
ｔｈ　ｏｆＣｅｌｌ　Ｌｉｎｅｓ　ａｎｄ　Ｃ１１ｎｉ
ｃａｌ　Ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ　ｏｆ　ＨｕｍａｎＮｏｎ
−８ｍａｌｌ　Ｃａ１ｌ　Ｌｕｎｇ　Ｃａｎｃｅｒ　ｉ
ｎ　ａ　Ｓｅｒｕｍ−ＦｒｅｅＤｅｆｉｎｅｄ　Ｍｅｄ
ｉｕｍ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、　４６　：　７９
８〜８０６．１９Ｂ６）。ＮＣＩ　−Ｈ４４１細胞系の
原糸は・　１０憾ウシ胎仔血清を含有するＲＰＭＩ　−
１６４０メゾウム中で培養を開始し、維持した。この原
糸はＮＣＩ−Ｈ４４１−４と命名され、これは本明細書
においてＮＣＩ　−Ｈ４４１−４と呼ぶ細胞系と同一で
ある。上述したように、ＫＣｒ−［４４１−４細胞系は
、基質に付着する大上皮様細胞として生育し、第１Ａ図
に示すように、顕微鏡でリビドの封入が認められ、電子
顕微鏡では時ＫＭｉ胞質多質多重層状体す（図には示し
ていない）。この細胞系の細胞は、ｇＬｒｓＡ型アッセ
イでＳＡＰ　−３５およびＳＡＬ　（Ｐｈｅ）に關性を
示す。

ＮＣＩ　−Ｈ４４１−４ｍ胞系ｏ１ｍ胞ｆｉ、１００Ｕ
／はペニシリン、０．２５μＩ／Ｉｌｌアンホテリシン
および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（ＧｒＢＣ
Ｏ。

Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ、　ＮＹ　）含有１０チウシ
胎仔血清を含むＲＰＭＩ　−１６４０中で、３７°Ｃ，
５％ｃＯ２／空気においてインキエペーションする。細
胞は組織培養フラスコ中に維持し、メジウムは６〜７日
毎に変える。細胞は定常的に、１または２週毎に継代す
る。デキサメサゾン（Ｓｉｇｍａ　ＣｈｅｍｉｃａｌＣ
ｏｍｐａｎｙ、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）は９５
チ工タノール中１ＱｍＭ保存液として調製し、指定の濃
度にメジウムで希釈する。（３５Ｂ］メチオニン標識の
場合には、代謝的標識の研究のために、ウシ胎仔血清金
０．１壬ウシ血清アルデミン添加または非添加、メチオ
ニン欠乏（１卿／ｌ）ダルベツコ改良イーグル培地に変
えて、インキュベーションスル。１時間ブレインキュベ
ーションしたのち、比活性約１．０００　ｍＣｉ　／　
ｍｏｌｅの［３５Ｓ］メチオニン（ＮｅｗＥｎｇｌａｎ
ｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ、　Ｂｏｓｔｏｎ＋　ＭＡ　）　ｆ
終濃度５０〜１００μＣ１／１になるように加え、つい
で細胞全６〜８時間インキュベーションする。ついでメ
ジウム全集め、水冷アセトン？加えてタンパク質を沈殿
させる。細胞は１５０　ｍＭＮａＣｔ、　１０　ｍＭ　
ＥＤＴＡお工び３　Ｑ　ｍＭ　Ｔｒｉｓ＋　ｐＨ−７−
４の液体混合物のプラスチック表面から削りとって収穫
し、８００．！９で５分間遠心分離する。次に細胞ｔ１
９０ｍＭＮａＣ１，６ｍＭ　ＥＤＴＡ、　６０　ｍＭ　
Ｔｒｉｓ−ＨＣ４ｐ）（７，４および４　％　ＳＤＳ中
に可溶化し、ついで１０秒間超音波処理する。分解物を
４分間１００℃に加熱したのち、等容量の水を加え、サ
ンプル？分析時まで４°ＯＫ保存する。ａ胞およびメジ
ウムの２つのサンプルを常法により８’６ト’）りａａ
酢酸で沈殿させて［３５ｓ］メチオニン標Ｒｋ定量する
。処理の必要性全比較するために、免疫沈降に先立って
、弓細胞タンパク質中への［３５ｓ）メチオニンの導入
全サンプル間で正常化する必！がある。

ＮＣＩ−Ｈ４４１−４細胞系で合成されるタンパク質の
メジウムからの精製例および定量データは、第４Ａ、４
Ｂ、１１Ａおよび１１Ｂ図に示すとおりである。デキサ
メサゾンおよび３−　Ｂｒ　−ｃＡＩＪＰによる誘導の
比較は、第２Ａ、２Ｂ、５．６Ａ。

６Ｂ、７．８．１２ｂよび１６図に示されている。

ＮＣＩ　−Ｈ８２０肺腺癌細胞は最初、Ｎａｔｉｏｎａ
ｌＣａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　（Ｂｅｔｈｅｓ
ｄａ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ　）において、ヒト気管小胞
肺癌の鎖骨上部リンパ節への転位癌から単離された。患
者は５０歳の白人男性であった。

培養ａ多糸はＮＣＩ　−Ｈ８２０と命名され、１９８４
年９月２６日に培養を開始され、ＡＣＬ　−４メゾウム
中で連続的に培養されてきた（　Ｇａｚｄａｒ、　Ａ、
Ｆ。

＆　（１７）８．　Ｈ＋Ｂ、　：　Ｌｅｔｔｅｒ　ｔｏ
　Ｅｄｉｔｏｒ、　ｃａｎｃｅｒ　ＲｅＢ、。

４６：６（１７）１〜６（１７）２，１９８６）。

ＮＣＴ−Ｈ８２０細胞系は基質への付着性？欠き、腺形
成金示しながら、細胞集塊として浮遊して生育する。

ＭＣｌ−Ｈ４４１−４細胞系の場合と同様に、顕微鏡で
は、多くの細胞質リビド封入がみられる（第１Ｂ図）。

さら（・こ、ＮＣＩ　−Ｈ８２０細胞系は神経内分泌細
胞に特徴的ないくつかのマーカーたとえば、酵素Ｌ−ド
ーバデ力ルポキシラーゼシよびニューロン特異的エノラ
ーゼ？発現する。この細胞系の細胞はＥＬＩＳＡ型アッ
セイによ１１１１　ＳＡＰ　−３５に：４性の反応？示
す。［ｌ３５Ｓ］メチオニンの導入は、ＮＣＩ−Ｈ４４
１−４細胞の場合より低レベルでちるが、ＳＡＰ　−３
５およびＳＰＬ　（Ｐｈｅ　）の産生を確認させた。Ｓ
ＰＬ　（Ｐｈｅ）　ｍＲＮＡの比較的な誘導は第９図に
示す。

ＮＣＩ　−Ｈ１４０４肺ＩＩ！癌細胞は最初、Ｎａ、ｔ
ｊｏｎａｌＣａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｓ　（Ｂｅ
ｔｈｅｓｄａ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ　）において、ヒト
肺の気管小胞砿の鎖骨上部リンパ節への転移癌から単離
され之。患者は４８歳の白人男性であった。

ＮＣＩ−Ｈ１４０４と命名された細胞系の培養は１９８
６年６月１６日開始され、非付着性の腺形成細胞１饗集
体として生育し、ＡＣＬ　−４メジウム中で連続培養さ
れる。第１Ｃ崗に例示されたように、顕微鏡では、正常
クララ細胞または■型啼細胞て特徴的な顆粒または小胞
体金示さない。この細胞系の細胞はｇＩＪｓＡ型アッセ
イによりＳＡＰ　−３５に陽性反応金示す。ＳＰＬ　（
４９）ＳＰＬ（Ｐｈｅ）の合成は検出されず、ＳＡＰ　
−３５のｇＬＩｓＡ型アッセイの結果は、正常のＳＡＰ
　−３５以外の免疫学的に関連のあるタンパク質による
ものと考えられる。

本発明のＮＣＩ　−Ｈ４４１−４細胞系は以下の例によ
ってさらに詳細に例示する。

ＮＣＩ　−Ｈ３２２細胞系は、１９８１年２月２５日、
ＮａｊｌＯｎａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ
　（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　。

Ｍａｒｙｌａｎｄ　）において、肺癌転移によるヒト鎖
骨上部リンノぐ節から培養？開始された。患者は１９７
９年に小細胞肺癌と診断された。鎖骨上部リンノぞ節部
分には、小および「非小」癌細胞が含まれていた。培養
に際しては、非小細胞癌のみを生育させた。患者は力性
であった。

＠瘍は機械的に分解し、１０チウシ胎仔血清金含むＲＰ
ＭＩ　−１６Ａ　Ｏメジウム中で連続培養してきた。Ｎ
ＣＩ　−Ｈ３２２細胞系は、付着性の上皮様細胞全形成
する。顕微鏡では、第１Ｄ図に示すように、多くの細胞
質リピド封入体が観察される。

この細胞系の細胞はＥＬＩＳＡ型アッセイでＳＡＰ　−
３５に１場性を示す。［３５Ｂ］メチオニンの導入によ
り、ＮＣＩ　−Ｈ３２２細胞のＳＰＬ　（Ｐｈｅ）タン
パク質の産生が確認された。

Ｎｃｚ−Ｈ３２２ａｌ胞系は、ｇＬＩｓＡ型アッセイに
より、ＳＡＰ　−３５の発現に陽性？示し、［３５Ｂ］
メチオニンの導入により、この細胞系による５ＰＬ（４
９）ＳＰＬ（Ｐｈｅ）前駆体Ｍｒ−４０，０００〜４６
，０００の合成が明らかにされた。

例 以上述べた、第１Ａ図のＮＣＩ　−Ｈ４４１−４細胞系
の細胞は、ＥＬＩＳＡ型アッセイにより、５ＡＰ−３５
卦よびＳＰＬ　（Ｐｈｅ）に対し陽性全示した。さらに
サーファクタントタンパク質の産生の至適条件全検討し
、その合成および構造の特徴を明らかにした。細胞は〔
３５Ｓ〕メチオニンで標識し、ｔｉ−ＳＡＰ−６５、ま
たはＳＰＬ　（Ｐｈｅ）およびＳＰＬ　（ｐｖａｌ）の
両者全認識する抗−サーファクタントグロテオリピドを
用いてサーファクタントタンパク質の合成を検出するた
めの免疫沈降アッセイで試験した（第３Ａ、３Ｂ、５．
６ｈ、６Ｂ、７および１０図）。細胞は、１０チウシ胎
仔血清含有ＲＰＭＩメゾウム中、５チＣ０２／空気にお
いて単層培養で生育させた。細胞は、ＮＰ−４Ｑの存在
下に超音波処理装置音用い緩衝液に収穫、ホモシネ−ジ
ョンしてそのまま使用した。培養体からの調製メジウム
ｉ　ＳＡＰ　−３５のアッセイ用に集めた。タンパク質
の合ＭＣｔ選択的に変える丸めに、ｃｋＭＰの８−ブロ
モ誘導体（１００μＭ）およびデキサメサ・ｌン（Ｉ　
Ｑ　ｎＭ　）使用した（第２Ａ、２Ｂ、５．６に、６Ｂ
、７および１２図）。８−　Ｂｒ　−ｃＡＭＰはＳＡＰ
　−３５およびＲＮＡの合成および分泌を増大させだが
、ＳＰＬ　（Ｐｈｅ）またはＳＰＬ　（Ｐｈｅ）　ＲＮ
Ａの合成を有意に増大させることはなかった（第５図）
。

驚くべきことに、ＳＰＬ　（４９）ＳＰＬ（Ｐｈｅ）　
＠躯体とｍＲＮＡの合成は、＠＠全デキサメサゾンで前
処理しない限り、本明細書に述べた他の細胞系に比べて
さらに不明確であった（第２に、２Ｂ、６に、６Ｂ、１
２および１３図）。したがって、メジウムの除去前４８
〜７２時間、細胞全デキサメサゾンで処理し、タンパク
質を標識するために［３５ｓ］メチオニン全含有する血
清を含まないメジウムを培讐液に添加した（第２Ａ、２
Ｂ、＜５Ａおよび６Ｂ図）。デキサメサゾン（１０ｎＭ
　）はＳＡＰ　−３５ｂよびＳＡＰ　−３５１１１ＲＮ
Ａの合成および分泌を低下させたが、ＳＰＬ（Ｐｈｅ）
前駆体およびＳＰＬ　（Ｐｈｅ）　ｍＲＮＡの産生全署
しく増大させた（第２Ａ、２Ｂ、６Ａ、６Ｂ。

１２および１６図）。メジウム中のタンパク質は、１Ｄ
および２　Ｄ　−ＳＤＳ　−ＰＡＧＥにおいて、ヒト正
常肛の肺移植片中に同定されるＳＰＬ　（Ｐｈｅ）に特
徴的な移動度を示した（第２ＡＩ２Ｂ、６Ａおよび６Ｂ
図）。サイズ、電荷シエびグリコシル化パターンの同定
により、このタンパク質は、正常脈またはヒト界面活性
剤から単離されるタンパク質について知られているよう
に、またＳＰＬ　（４９）ＳＰＬ（Ｐｈｅ）　ｂよびＳ
ＡＰ　−３５タンパク質をコーげするｃＤＮｋの堰塞配
列から誘導されるＮ一連結グリコシル化全予想させる配
列によって示唆されるＮ一連結グリコシル化のプロセッ
シングを受けることが明らかにされた（第２Ａ、２Ｂ、
３Ａ、３Ｂ、５，６Ａおよび６Ｂ図）　ＯＳＰＬ　（Ｐ
ｈｅ）　ｂよびＳＡＰ　−３５タンパク質は、エンドヌ
クレアーゼに対して感受性全示し、両タンパク質ともＮ
一連結グリコシル化ヲ有することが示された。調製メジ
ウムを、免疫沈降させまたはしないで２Ｄ−’７”ルミ
気泳動に付すと、ヒト気管のＳＡＰ　−３５または肺タ
ンパク症患者から得られたＳＡＰ　−３５と同一の電荷
不拘−性全示した（第３Ａ、３Ｂ、４Ａおよび４Ｂ図）
。

ＳＰＬ　（Ｐｈｅ）標、を前駆体の移動度は、正常ヒト
肺移植片組織について報告された値と全く同一であった
（第２Ａ、２Ｂ、＜ＳＡ、６Ｂおよび１０図）。

ＳＰＬ　（Ｐｈｅ）およびＳＡＰ　−３５の合成は、各
ペプチドに特異的ｃＤＮＡデロープローブして、さらに
確１招された（第８および１６図）。これらのプローブ
は各タン／ぞり質をコーｒするｍＲＮＡ　ｆ選択的に認
識し、産生が増大する体液性条件が確認された（第８お
よび１３図）。ヒトＳＡＰ　−３５ふ・よびＳＰＬ　（
Ｐｈｅ）タンパク質のｍＲＮＡは、ＭＣｌ−Ｈ４４１−
４細胞中に存在し、そのサイではヒト肺に既に同定され
ているｍＲＮＡと識別できなかった（第８図）。

以上、本発明全実施するに際しての最善の態様について
説明したが、本発明はこれらの特定の態様に限定される
ものではなぐ、特許請求の範囲内に包含されるすべての
態様金倉むものである。

【図面の簡単な説明】

第１Ａ図、第１Ｂ図、第１Ｃ図および第１Ｄ図はそれぞ
れ、生物の形態を示す写真であり、ＭＣｌ−Ｈ４４１−
４、ＮＣＩ−Ｈ８２０，ｕＣｒ−Ｈ１４Ｑ４お工びＮＣ
Ｉ　−Ｈ３２２細胞系の細胞の位相差顕微鏡写真である
。 ’ＪＧ　２　Ａ　図ｂ　Ｌ　ヒ第２Ｂ図は、ＮＣ’ｌ−
Ｈ４４１−４細胞によりメジウム中に分泌されたサーフ
ァクタントタンパク質の［３５ｓ）メチオニン標職体の
２Ｄ　−ＩＥＴｉ’　−ＳＤＳ　−ＰＡＧＥ金示す写真
である。 第５１図Ｌ−ＬＵ第３Ｂ図は、ＮＣＩ−Ｈ４４１−４細
胞系の細胞およびそのメジウムからのＳＡＰ　−６５タ
ンパク質の％　　［”５ｓ〕メチオニン標識および２　
Ｄ　−ＩＥＦ　−１３Ｄ８−　ＰＡＧＥ後の免疫沈降お
よび精製金示す写真である。 第４Ａ図および第４Ｂ図はＭＣｌ−Ｈ４４１−４のメジ
ウムからの（３５８：）メチオニン標ａ　ＳＡＰ　−６
５の、アフィニティークロマトグラフィーによる精製を
示す写真である。 第５図は、〔３５Ｓ〕メチオニン標識および１Ｄ〜８Ｄ
Ｓ　−ＰＡＧＥ後の、ＮＣ’ｌ−Ｈ４４１−４細胞から
のＳＡＰ　−３５タンパク質の免疫沈降金示す写真であ
る。 ｉ６Ａ図および第６Ｂ図は、デキサメサ・ｌンの存在下
ま友は非存在下において生成したサーファクタントタン
パク質の［：３５Ｓ〕メチオニン標識体の免疫沈降金示
す写真である。 第７図は、ＳＡＰ　−３５およびｐｒｏ　ＳＰＬ　（Ｐ
ｈｅ）のエンドグリコシダーゼおよびコラーデナーゼ消
化金示す写真である。 第８図は、ＮＣＩ−Ｉ（４４１−４細胞のＳＡＰ　−３
５およびＳＰＬ　（Ｐｈｅ）タンパク賃金コーげするｍ
ＲＮＡのノずンデａット解析金示す写真である。 第９図は、ＮＣＩ　−Ｈ８２０細胞系の細胞によりデキ
サメサ・戸ンの存在下に産生されたＳＰＬ　（Ｐｈｅ）
タンパク質をコードするＲＮＡのノヂンプロット解析金
示す写真である。 第１０図は、Ｎｅｔ　−Ｈ４４１−４細胞系から産生さ
れたＭｒ　−４０，０００〜４６．０００およびＭｒ−
２７，０００〜３５．０　［１０タンパク質精製物のＳ
ＤＳ　−ＰＡＧＥ金示す写真である。 第１１Ａ図および第１１Ｂ図は、それぞれＭＣｌ−Ｈ４
４１−４細胞系の細胞で産生されたタンパク質のα−メ
メチーマンノースーアがロースアフィニティーカラムに
よる精製を示す写真及び図であるＯ 第１２図はＳＡＰ　−３５およびｐｒｏ　ｓＰＬ　（Ｐ
ｈｅ）合成に対するデキサメサゾンの用量反応を示す図
であり、第１３図はその反応の時間＠過を示す肉である
。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）少なくとも１種のサーフアクタントタンパク質を
   産生する上皮性細胞からなる樹立ヒト細胞系。 （２）サーフアクタントタンパク質を完全にまたは半ば
   プロセッシングを受けた形で産生する特許請求の範囲第
   １項に記載の樹立ヒト細胞系。 （３）ヒト上皮肺腺癌から誘導される特許請求の範囲第
   １項に記載の樹立ヒト細胞系。 （４）少なくとも１種のサーフアクタントタンパク質を
   選択的に発現する能力を有し、その産生量は適当量の有
   効調節剤に暴露された場合に増量する特許請求の範囲第
   １項に記載の樹立ヒト細胞系。 （５）ＳＡＰ−６５サーフアクタントタンパク質を選択
   的に産生し、その産生量は有効量の８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ
   またはその機能的均等物に暴露された場合に増量する特
   許請求の範囲第１項に記載の樹立ヒト細胞系。 （６）ＳＰＬ（Ｐｈｅ）サーフアクタントタンパク質を
   選択的に産生し、その産生量は適当量の有効なグルココ
   ルチコイドホルモンまたはその機能的均等物に暴露され
   た場合に増量する特許請求の範囲第１項に記載の樹立ヒ
   ト細胞系。 （７）ＮＣＩ−Ｈ４４１−４、ＮＣＩ−Ｈ８２０および
   ＮＣＩ−Ｈ３２２細胞系からなる群より選ばれる特許請
   求の範囲第１項に記載の樹立ヒト細胞系。 （８）ＮＣＩ−Ｈ１４０４細胞系である特許請求の範囲
   第１項に記載の樹立ヒト細胞系。（９）Ａｍｅｒｉｃａ
   ｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴ
   ＣＣ）に寄託番号ＡＴＣＣ　ＣＲＬ９４００として寄託
   された樹立ヒト細胞系。 （１０）ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏ
   ｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託番号ＡＴＣＣ　Ｃ
   ＲＬ９５３１として寄託された樹立ヒト細胞系。 （１１）ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏ
   ｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託番号ＡＴＣＣ　Ｃ
   ＲＬ９５３２として寄託された樹立ヒト細胞系。 （１２）ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏ
   ｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託番号ＡＴＣＣ　Ｃ
   ＲＬ９５３３として寄託された樹立ヒト細胞系。 （１３）少なくとも１種のサーフアクタントタンパク質
   を産生する能力を有する樹立ヒト細胞系を適当なメジウ
   ム中、サーフアクタントタンパク質の産生に十分な時間
   培養することを特徴とするサーフアクタントタンパク質
   の製造方法。 （１４）サーフアクタントタンパク質は完全にまたは半
   ばプロセッシングを受けた形で樹立ヒト細胞系によつて
   発現される特許請求の範囲第１３項に記載の方法。 （１５）樹立ヒト細胞系の細胞分解物から発現したサー
   フアクタントタンパク質を収穫する工程をさらに包含す
   る特許請求の範囲第１３項に記載の方法。 （１６）メジウムから発現したサーフアクタントタンパ
   ク質を収穫する工程をさらに包含する特許請求の範囲第
   １３項に記載の方法。 （１７）少なくとも１種のサーフアクタントタンパク質
   またはそのようなタンパク質をコードするｍＲＮＡを発
   現する能力およびさらにその発現を調節する能力を有す
   る細胞のメジウム中での培養によるサーフアクタントタ
   ンパク質の発現を調節する方法において、培養細胞を発
   現の調節に有効な量の有効調節剤に暴露することを特徴
   とする方法。 （１８）メジウムに調節剤を添加する工程をさらに包含
   する特許請求の範囲第１７項に記載の方法。 （１９）調節剤が有効な遺伝子またはウィルスである場
   合には培養細胞を調節剤でそれぞれトランスフエクシヨ
   ンまたは感染させる工程をさらに包含する特許請求の範
   囲第１７項に記載の方法。 （２０）調節剤は培養細胞による少なくとも１種のサー
   フアクタントタンパク質の発現を阻害する特許請求の範
   囲第１７項に記載の方法。 （２１）調節剤は培養細胞による少なくとも１種のサー
   フアクタントタンパク質の発現を誘導する特許請求の範
   囲第１７項に記載の方法。 （２２）培養細胞の誘導でサーフアクタントタンパク質
   の発現が増量する特許請求の範囲第２１項に記載の方法
   。 （２３）調節剤はＳＡＰ−３５サーフアクタントタンパ
   ク質の発現を誘導する８−Ｂｒ−ｃＡＭＰまたはその機
   能性均等物である特許請求の範囲第２１項に記載の方法
   。 （２４）調節剤はＳＰＬ（Ｐｈｅ）サーフアクタントタ
   ンパク質の発現を誘導する有効なグルココルチコイドホ
   ルモンまたはその機能性均等物である特許請求の範囲第
   ２１項に記載の方法。 （２５）培養細胞は樹立細胞系の細胞である特許請求の
   範囲第１７項に記載の方法。 （２６）樹立連続細胞系はＮＣＩ−Ｈ４４１−４と命名
   された樹立ヒト細胞系である特許請求の範囲第２５項に
   記載の方法。 （２７）樹立連続細胞系はＮＣＩ−Ｈ８２０およびＮＣ
   Ｉ−Ｈ３２２からなる細胞系群より選ばれる樹立ヒト細
   胞系である特許請求の範囲第２５項に記載の方法。 （２８）培養細胞の細胞分解物から発現したサーフアク
   タントタンパク質を収穫する工程をさらに包含する特許
   請求の範囲第１７項に記載の方法。 （２９）メジウムから発現したサーフアクタントタンパ
   ク質を収穫する工程をさらに包含する特許請求の範囲第
   １７項に記載の方法。 （３０）メジウム中の培養細胞によつて発現されたサー
   フアクタントタンパク質を収穫するにあたり、メジウム
   または細胞分解物をサーフアクタントタンパク質が結合
   する親和剤を抱合させたカラムに適用し、結合したサー
   フアクタントタンパク質をカラムから分離して実質的に
   純粋な形のサーファクタントタンパク質を生成させるこ
   とを特徴とする方法。（３１）親和剤はポリクローナル
   およびモノクローナル抗体からなる群より選ばれる抗−
   サーフアクタントタンパク質抗体である特許請求の範囲
   第３０項に記載の方法。 （３２）ポリクローナルまたはモノクローナル抗体は抗
   −ＳＰＬ（Ｐｈｅ）および抗−ＳＰＬ（ｐＶａｌ）抗体
   からなる群より選ばれる特許請求の範囲第３１項に記載
   の方法。 （３３）ポリクローナルまたはモノクローナル抗体は抗
   −ＳＡＰ−３５抗体である特許請求の範囲第３１項に記
   載の方法。 （３４）ポリクローナルまたはモノクローナル抗体は抗
   −サーフアクタントプロテオリピドである特許請求の範
   囲第３１項に記載の方法。 （３５）親和剤はα−メチルマンノースである特許請求
   の範囲第３０項に記載の方法。 （３６）分離工程は、カラムから、結合したサーフアク
   タントタンパク質を除去するのに有効な剤でカラムを溶
   出することからなる特許請求の範囲第３０項に記載の方
   法。 （３７）細胞は樹立ヒト細胞系の細胞である特許請求の
   範囲第３０項に記載の方法。 （３８）サーフアクタントタンパク質を産生する肺上皮
   起源の腫瘍細胞をスクリーニングする方法において、細
   胞分解物または細胞を培養したメジウムを抗−サーフア
   クタントタンパク質抗体に暴露して腫瘍細胞によつて産
   生されたサーフアクタントタンパク質を免疫沈降させ、
   免疫沈降したタンパク質を同定して腫瘍細胞によるサー
   フアクタントタンパク質の産生を確認することを特徴と
   する方法。 （３９）抗−サーフアクタントタンパク質抗体はポリク
   ローナルおよびモノクローナル抗体からなる群より選ば
   れる特許請求の範囲第３８項に記載の方法。 （４０）抗体は抗−ＳＰＬ（Ｐｈｅ）およびＳＰＬ（ｐ
   Ｖａｌ）抗体からなる群より選ばれる特許請求の範囲第
   ３８項に記載の方法。 （４１）抗体は抗−ＳＡＰ−３５抗体である特許請求の
   範囲第３８項に記載の方法。 （４２）抗体は抗−サーフアクタントプロテオリピド抗
   体である特許請求の範囲第３８項に記載の方法。 （４３）腫瘍細胞は、樹立ヒト腫瘍細胞系の細胞である
   特許請求の範囲第３８項に記載の方法。 （４４）暴露工程の前に、サーフアクタントタンパク質
   を〔＾３＾５Ｓ〕メチオニンで放射標識する工程をさら
   に包含する特許請求の範囲第３８項に記載の方法。 （４５）同定工程は、免疫沈降した放射標識サーフアク
   タントタンパク質を電気泳動ゲル上で電気泳動的に移動
   させ、ゲル上の免疫沈降した放射標識サーフアクタント
   タンパク質のオートラジオグラムを作成して、サーフア
   クタントタンパク質を同定し、腫瘍細胞によるサーフア
   クタントタンパク質を確認することからなる特許請求の
   範囲第４４項に記載の方法。 （４６）サーフアクタントタンパク質をコードするｍＲ
   ＮＡを発現する肺上皮起源の腫瘍細胞をスクリーニング
   する方法において、腫瘍細胞から単離したｍＲＮＡをそ
   のｍＲＮＡと相補性の放射標識ｃＤＮＡプローブとハイ
   ブリダイゼーシヨンさせ、放射標識ｃＤＮＡプローブと
   ハイブリダイゼーシヨンしたｍＲＮＡを同定して腫瘍細
   胞によるｍＲＭＡの発現を確認することからなる方法。 （４７）ＣＤＮＡプローブはＳＡＰ−３５、ＳＰＬ（Ｐ
   ｈｅ）およびＳＰＬ（ｐＶａｌ）前駆体タンパク質をコ
   ードするｍＲＮＡと相補性のＣＤＮＡプローブからなる
   群より選ばれる特許請求の範囲第４６項に記載の方法。 （４８）腫瘍細胞は樹立ヒト腫瘍細胞系の細胞である特
   許請求の範囲第４６項に記載の方法。 （４９）ＳＰＬ（Ｐｈｅ）ヒトタンパク質の前駆体であ
   り、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でのＭｒ＝約４０，０００〜４
   ６，０００、以下の性質：ａ）エンドグリコシダーゼ−
   Ｆ消化に感受性を有する、ｂ）ニユーラミニダーゼ消化
   に感受性を有する、ｃ）アスパラギン残基でグリコシル
   化されている、ａ）ｐＩは約４．６〜５．４である、ｅ
   ）抗−サーフアクタントプロテオリピド抗体と反応性を
   示す、ｆ）シアリル化されている、の少なくとも１つを
   有する単離ヒトサーフアクタントタンパク質。 （５０）ＮＣＩ−Ｈ４４１−４細胞系の細胞によつて産
   生される特許請求の範囲第４９項に記載の単離ヒトタン
   パク質。 （５１）ＳＰＬ（Ｐｈｅ）ヒトタンパク質の前駆体であ
   り、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でのＭｒ＝約２７，０００〜３
   ３，０００、以下の性質：ａ）エンドグリコシダーゼ−
   Ｆ消化に感受性を有する、ｂ）ニユーラミニダーゼ消化
   に感受性を有する、ｃ）アスパラギン残基でグリコシル
   化されている、ｄ）ｐＩは約６．０〜７．３である、ｅ
   ）抗−サーフアクタントプロテオリピド抗体と反応性を
   示す、ｆ）シアリル化されている、を有する単離ヒトサ
   ーフアクタントタンパク質。 （５２）ＮＣＩ−Ｈ４４１−４細胞系の細胞によつて産
   生される特許請求の範囲第５１項に記載の単離ヒトタン
   パク質。 （５３）ＳＰＬ（Ｐｈｅ）ヒトタンパク質の前駆体であ
   り、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でのＭｒ＝約２３，０００、以
   下の性質：ａ）アルギニン残基は脱グリコシル化されて
   いる、ｂ）脱シリル化されている、ｃ）ｐＩは約６．３
   〜７．３である、ｄ）抗−ＳＰＬ（Ｐｈｅ）タンパク質
   抗体と反応性を示す、ｅ）抗−サーフアクタントプロテ
   オリピド抗体と反応性を示す、を有する単離ヒトサーフ
   アクタントタンパク質。 （５４）ＮＣＩ−Ｈ４４１−４細胞系の細胞によつて産
   生される特許請求の範囲第５３項に記載の単離ヒトタン
   パク質。 （５５）ヒトサーフアクタントタンパク質の産生能を有
   するヒト細胞を適当なメジウム中でこのタンパク質を産
   生するのに十分な時間培養することを特徴とする方法で
   製造されたヒトサーフアクタントタンパク質。 （５６）ヒト細胞は樹立ヒト細胞系の細胞である特許請
   求の範囲第５５項に記載のヒトサーフアクタントタンパ
   ク質。 （５７）タンパク質はヒトＳＰＬ（Ｐｈｅ）タンパク質
   の前駆体タンパク質である特許請求の範囲第５５項に記
   載のヒトサーフアクタントタンパク質。