JPH0239521B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 広範な分類学的研究に基づけばこれまで記載さ
れていない微生物、これはまだ無名のアルカリゲ
ネス（Alcaligenes）の一種であるが、を適当な
栄養培地中で培養することにより化合物Ｓ―130
は製造される。我々のヘテロポリサツカライドを
製造するのに使用したこの微生物は、制限を受け
ない永久寄託物としてアメリカンタイプコレクシ
ヨン（寄託番号ATCC 31555）に1979年８月27日
に寄託された。 以下の考案は、新しいアルカリゲネス
（Alcaligenes）属の一種の同定に必要であり、か
つその同定を正当化するものである。 菌株の記載 Ａ コロニー形態学上の特徴 栄養寒天上、30℃で５日間培養した後に直径
が約1.5mmに達する小さな黄色のコロニーが現
れる。このコロニーは円型、平滑、凸状粘液
状、かつ不透明である。培養が長くなるにつれ
て黄色はより濃い色になり、コロニーの組織は
硬くなる。 YM寒天上では、小さな粘液状の黄色のコロ
ニーが１日で現れ、５日間培養した後には直径
が約３mmに達する。コロニーは円型、平滑、凸
状、不透明であるが、コロニーの頂部は平坦で
ある。エンブラン様の硬い組織は認められな
い。 Ｂ 細胞形態学上の特徴 Ｓ―130株はグラム陰性の桿状細胞である。
栄養寒天上では、細胞の平均的な大きさは約
0.5―0.6と1.2―1.6μmであり、細胞の末端は先
き細になつており、しばしばわん曲が見られ
る。細胞の大きさと形は培養を長くしても大き
く変化しない。 YM寒天上では平均的な細胞の大きさは0.6
―0.8と1.6―2.0μmであるが、細胞はより長く
なり（３―4μm）、PHBがかなり蓄積する。運
動性あり、鞭毛染色（硝酸銀法の変法）はこの
株が混合型の鞭毛運動、つまり極鞭手及び周鞭
毛、ならびに菌株から突出した鞭毛を有するこ
とを示している。 Ｃ 生理学的及び生化学的特徴 試験の結果は次に示すとおりである。 チトクロームオキシダーゼは弱い、又は陰性
であり、カタラーゼは陽性。 37及び41℃で生育できるが43℃では生育でき
ない。 3.0％のNaClに耐性であるが、6.5％のNaCl
には耐性を示さない。 ５と12の間のPHで生育する。 以下のような種々の炭水化物から好気性の酸
を産生するが、気体は発生させない。 Ｄ―キシロース 乳糖 Ｌ―アラビノース マルトース Ｄ―グルコール メリビオース 果 糖 砂糖 カラクトース トレハロース マンノース ラフイノース リトマスミルクを還元するが、ペプトン化し
ない。 ADHは陽性であるが、LDC、ODC、PDA
は陰性である。 MRは陽性であるが、VP、インドール、ウ
レアーゼは陰性である。食用ゼラチン（弱い）
及びツイーン80（弱い）を加水分解するが、カ
ゼイン、澱粉、セルロース、ペクチンは加水分
解しない。 ホスフアターゼ及び血液分解は陰性である。 0.1％の塩化トリフエニルテトラゾリウムに
よつて阻害されない。 60℃で30分間の加熱に生き残る。 EMB寒天及びテルル血液で生育するが、SS
及びマツコンキー寒天上では生育しない。 Ｄ 抗生物質の感受性試験 Ｓ―130株は以下の抗生物質に感受性を示す。 カナマイシン ……30μｇ ネオマイシン ……30μｇ クロルテトラサイクリン ……5μｇ ノボビオシン ……30μｇ エリスロマイシン ……15μｇ テトラサイクリン ……30μｇ ゲンタミシン ……10μｇ カルベニシリン ……50μｇ 以下の抗生物質には感受性を示さない。 ペニシリン ……10単位 ストレプトマイシン ……10μｇ コリスチン 10μｇ ポリミキシンＢ 300単位 Ｅ 栄養要求性 有機生育因子は要求せず、硝酸塩を唯一の窒
素源として生育できる。唯一の炭素源及びエネ
ルギー源として合計で30個の有機化合物を利用
する。殆んどの炭水化物を利用する。 Ｆ DNAのＧ＋Ｃ含量 DNAの分析はしていない。 Ｇ APIシステムによる同定 本株は、このシステムによつて同定すること
は不可能であつた。 Ｈ 同定 Ｓ―130株はグラム陰性の好気的な桿状細菌
である。本微生物の鞭毛運動の形式は混合型で
あり、極鞭毛及び菌体が突出した鞭毛（多分退
化した鞭毛）が見られる。バージイマニアル
（Bergey’ｓ Mamual）８版、によればこの
ような微生物はアルカリゲネス（Alcaligenes）
属の一員となる。 【表】 【表】 【表】 醗酵条件 ヘテロポリサツカライドＳ―130は、アルカリ
ゲネス（Alcaligenes）属の無名の一微生物を適
当な液体培地中に接種し、管理された条件下で好
気的な醗酵を行つている間に生産される。培地は
通常使われるもので、炭素、窒素及び無機塩源を
含有している。 一般に、炭水化物（例えば、グルコース、果
糖、マルトース、砂糖、キシロース、マンニトー
ル等）はそれ単独で、或は他のものと組み合わせ
て栄養培地中の同化し得る炭素源として使用する
ことが可能である。培地中に利用する単数又は複
数の炭水化物源の正確な量は、部分的には培地中
の他の成分に依存するが、一般には炭水化物の量
は通常重量で培地の約２％から４％の間を変動す
る。好ましくは３％のグルコースを使用する。こ
れら炭素源は独立して、或はいくつかの炭素源と
併用して培地中に加える。一般に、醗酵期間中に
多くの蛋白質様物質を窒素源として使用すること
ができる。適当な窒素源としては、例えば、酵母
の加水分解物、プライマリーイースト、大豆粉、
綿実粉、カゼイン加水分解物、コーンスチープリ
カー、醸造家の可溶性成分、トマトペースト等が
あげられる。窒素源は、単独或は他のものと併用
して液体培地の重量当り約0.05％から0.4％の範
囲の量を用いる。 培地中に添加することのできる栄養無機塩のな
かには、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、
カルシウム、リン酸塩、硫酸塩、塩酸塩、炭酸塩
等を生じさせることができる通例の塩が含まれ
る。更にコバルト、マンガン、鉄及びマグネシウ
ム等の微量金属も含まれる。 実施例中で記述する培地は、広範囲の使用し得
る培地のうちから単に例示したものであり、それ
らに制限することを意図したものでないというこ
とに注目すべきである。 一つの特徴的な重要な培地は、Ｓ―130株を低
Ca⁺⁺条件下で、つまり脱イオン水中、又は
200ppm以下のCa⁺⁺を有する溶液系で培養する
と、得られるゴムは溶解性が改良されるというこ
とである。 醗酵は約25℃から35℃の範囲の温度で行うが、
最良の結果を得るためには、醗酵を約28℃から32
℃の温度で行うのが好ましい。アルカリゲネス
（Alcaligenes）を生育させ、ポリサツカライドＳ
―130を生産するための栄養培地のPHは約６から
８、好ましくは6.5から7.5の範囲で変えることが
可能である。 ポリサツカライドＳ―130は表面及び深部培養
の両方で生産されるが、培養は深部で行うのが好
ましい。 適当な栄養培地に培養物を接種し、生産培地に
移した後培養をシエーカー上数日間約30℃の一定
温度で進行させることにより、小規模の培養を都
合良く行う。 一段階、または数段階のシード培養を滅菌フラ
スコ中の培地で行うことによつて醗酵を開始させ
る。シード段階用の栄養培地は炭素及び窒素源を
適当に組合せためものであれば良い。シードフラ
スコは、約30℃の一定温度の室で１―２日間、又
は満足し得る生育が得られるまで振盪し、得られ
た生育物の一部を用いて第２段階のシード、又は
生産培地に接種する。中間段階のシードフラスコ
を用いる場合、実質的に同じ方法で培養を行う。
つまり最終シード段階のフラスコの内容物の一部
を用いて生産培地に接種する。接種したフラスコ
を一定温度で数日間振盪し、培養期間の終りにフ
ラスコの内容物をイソプロパノール等の適当なア
ルコールで沈澱させることにより回収する。 大規模の仕事を行うには、撹拌機及び醗酵培地
に通気する装置を備えた適当なタンク中で培養を
行うことが好ましい。この方法によれば、培養培
地はタンク中で調製し、約121℃にまで加熱する
ことにより滅菌する。冷却の際生産菌の培養物を
予め生育させておいたシードを滅菌培地に接種
し、醗酵を例えば２ないし４日間行う。この期間
中、栄養培地の撹拌及び／或は通気を行い温度を
約30℃に維持する。この生産方法はＳ―130を大
量に調製するためには特に適している。 生産はイソプロパノール等の適当なアルコール
によつて沈澱させることによつて醗酵培地から回
収される。 ヘテロポリサツカライドＳ―130 アルカリゲネス（Alcaligenes）の無名の種に
よつて生産されるヘテロポリサツカライドは、Ｏ
―グリコシド結合エステルとして３―５％のアセ
チル基を有する炭水化物から主として成つてい
る。 Ｓ―130ポリサツカライドの炭水化物部分は、
10―20％のグルクロン酸、10―25％のマンノー
ス、20―40％のグルコース及び30―60％のラムノ
ースを含有する。 ５―10％のアセチル含量は、Ｓ―130ゴムの0.2
％水溶液をアルカリ性ヒドロキシルアミン試薬で
処理し、次いで酸性の塩化第２鉄試薬〔S.
Hestrin（1949）J.Biol.Chem180巻249―261頁〕
で処理して決定した。 ポリサツカライドＳ―130の中性糖は、10mgの
生成物を２mlの2NH₂SO₄に溶かし、この混合物
を100℃で４時間加熱することにより決定した。
得られた溶液を冷却し、水酸化バリウムで中和
し、ドライアイスでPHを５―６にする。生成した
硫酸バリウムの沈澱を遠心によつて除き、上清を
減圧下で濃縮してシロツプにする。加水分解物中
の糖は、それらのアルドノニトリルアセテート誘
導体をガス―液体クロマトグラフイーにより仮に
同定した。クロマトグラフイーは80／100メツシ
ユのガスクロームＱを担体とする重量で３％の
OV―225を用い、ヒユーレツトパツカード5750
型により行つた。糖は標準試料と比較することに
より同定、定量した〔J.K.Baird.M.J.Holroyde、
及びD.C.Ellwood（1973年）、Carbohydr.Res、27
巻464―467頁〕。 ポリサツカライドの種々の中性糖は、ピリジ
ン：酢酸エチル：水（２：５：５）の上層を展開
溶媒とし、ワツトマン１号紙を用いる下降法によ
るペーパークロマトグラフイーによつても同定し
た。クロマトグラムは硝酸銀浸染法及び酸性アニ
リンフタレートスプレー試薬によつて染色した。
構成成分の糖は、標準糖とクロマトグラフイーを
行うこと、及びアニリンフタレート試薬との特有
の発色反応によつて同定した。 ポリサツカライドのグルクロン酸含量は２つの
別々の方法によつて決定した。１つの方法では試
料を19％の塩酸で脱炭酸し、発生した炭酸ガスを
標準水酸化ナトリウム中に捕獲し、逆滴定法
〔B.L.Browning（1976年）Methods of Wood
Chemistry．632―633頁〕、及びカルバゾール
発色法〔T.Bitter及びH.M.Muir（1962年）、
Anal.Biochem．４巻330―334頁〕により定量し
た。 上述の中和した加水分解物中のグルクロン酸の
分離及び試験的同定のためには紙電気泳動を用
いた。この加水分解物及び既知のグルクロン酸標
準試料の一定量を、カマグ電気泳動紙68―011
番につけ、カマグHVE型電気泳動装置を用いPH
2.7の緩衝液中で電気泳動する。クロマトグラム
を空気乾燥し、硝酸銀浸染試薬で染色し、分離さ
れたグルクロン酸の位置を明らかにする。 ポリサツカライドＳ―130は低濃度で水中に溶
かした時、水溶液媒体に粘性を付加する。この理
由のため、すなわち剪断力に対する感受性及び全
レオロジ―の故に、このポリサツカライドは特に
水溶液系での濃厚剤、懸濁剤、乳化剤、安定化
剤、潤滑剤、フイルム―形成剤、結合剤として有
用である。特に、このポリサツカライドは以下の
応用、又は製品に使用し得る：接着剤、壁―結合
用セメント、水保持セメント液及びモルタル、補
修用しつくい化合物、缶密閉剤、ボイラー用化合
物、生ゴムクリーム、溶接棒溶剤、はんだ付用ペ
ースト、セラミツク用うわ薬、押出し、クリーナ
ー及びつやだし剤、おもちや、乳化剤（生ゴム、
アスフアルト、シリコン）、銀の回収、種子の被
覆、殺虫剤及び除草剤用のスプレーコントロー
ル、乳化し得る濃縮及び流出殺虫剤と除草剤、タ
バコ結合剤、水性インクリトグラフ万年筆用溶
液、皮革の仕上げ剤、水―マルチング及び水―シ
ーデイング、織物染色及び仕上、ウエツト―エン
ドペーパー添加物、ウエツト―エンドペーパー保
持及び形成助剤、抗粘着化合物、鋳型解離剤、液
体樹脂、スラリー及び包装し爆発物、石油及び水
―井戸掘削用泥、石油ウオークオーバー及び完成
用液体、石油刺激液体、香水、薬学的懸濁液及び
乳化液。 更にこのゴムはゼリー及び他の砂糖高含量物、
クエン酸を主体とする飲み物を含めた飲料、アイ
スクリーム及びヨーグルトを含めた酪農製品、サ
ラダドレツシング、ドライミツクス、糖衣、うわ
薬、シロツプ、プデイング、粉食品、缶詰及びレ
トルト食品、及びパン屋の詰め物のような食品系
に使用し得る。 石油及び水―井戸掘削用泥の分野で特に有用性
が高い。この好ましい使用法を例示したより詳細
な具体例は後述する。 Ｓ―130ゴムは一般的な粘性―付加性質を有し
ているが、その溶液の特徴の特別な側面は、他の
ヘテロポリサツカライドとの区別を可能にする特
殊な形質である。 簡単に言えば、このゴムは0.1％KCl（1650cps）
及び脱イオン水（1470cps）の存在下では高度に
粘性である。このゴムはすばらしい酢酸熱安定性
（＋36％）及び熱安定性（−１％）を示す。１％
のNaOHとともに加熱するとゲルが形成される。
このゴムはKClと反応性を示し、0.1％及び2.5％
のKClの存在下で16％以上の粘度の増加が見られ
る。もろく、引つ張りに対して弱いフイルムが形
成される。 塩水中（KCl及びNaCl）及び海水中に於ける
良好な粘度、酢及び熱に対する良好な安定性、
1.5から12.1のPH範囲での一定の粘度、良好な剪
断安定性は、このゴムを掘削及び石油応用液体の
ような工業的利用に特に適したものとしている。
特に、Ｓ―130ゴムは秀れた熱安定性を有し、121
℃、15psiで15―20分間の高圧滅菌を行つても粘
度の減少は起らない。 １ 粘度及び剪断 Ａ ブルツクフイールド 【表】 Ｂ 剪断^b １ ｎ＠ 19.2秒^-1 10110cps ２ ｎ＠ 9.6秒^-1 2200cps ３ ｎ＠ 76.8秒^-1 320cps ４ ｎ＠ 384秒^-1 60cps ５ ｎ＠ 384²秒^-1 60cps ６ ｎ＠ 9.6秒^-1 1800cps Ｃ 40〓貯蔵 非常にずんぐりした流れ、No.４のスピンドルを
用いての2050cps＠60rpmは、その環境での温度
に於ける粘性を39％増加させる。 ２ 酸、塩基、熱安定性 Ａ 安定性 １ 酢酸と加熱 最初のｎ： 2500cps 最終のｎ： 3600cps ％変化 ＋36 ２ １％HClと加熱 最初のｎ： 1230cps 最終のｎ： 完全な消失 ％変化 完全な消失 ３ １％NaOHと加熱 最初のｎ： 1380cps 最終のｎ： ゲル ％変化 ゲル ４ 加熱のみ 最初のｎ： 2130cps 最終のｎ： 2100cps ％変化 −１ Ｂ PH効果 １ ５％酢酸 2.71PH 2560cps^c ２ ５％NH₄OH 11.09PH 2070cps^c ３ 塩及び染料との適合性 Ａ 塩 １ CaCl₂（飽和） 適合 ２ アンモニウム ポリリン酸 沈澱 ３ 60％NH₄NO₃ 適合 ４ １％Al₂（SO₄）₃・18H₂O 適合 ５ １％CaCl₂・2H₂O 適合 ６ １％KCl 適合 ７ 0.1％KCl 2560cps^c ８ 2.5％KCl 2560cps^c Ｂ 染料 １ ミリング グリーン 適合 ２ メチレン ブルー 沈澱 ４ 組織／流動性 高粘度のゴム、ずんぐりとした流れ、ゲル化せ
ず、ゴム様の触感 ５ 相乗作用と酵素^c 【表】 ６ ミルク反応性 Ａ 分散： 優秀 Ｂ ホエーの分離： １日め Ｃ 他の観察： ７ フイルムの形成 不ぞろいで引きたおされる；フイルムが形成
される、可塑性なし、非常にもろい、引つ張り
力に対し弱い。 ａ 粘度はブルツクフイールドLVF型を用い、
１番のスピンルとULアダプターを使用して
6rpmで測定した。 ｂ 測定は、すべてウエルス―ブルツクフイー
ル微小粘度計RVT―Ｃ／Ｐ型により行つた。 ｃ 粘度はウエルス―ブルツクフイール微小粘
度計RVT―Ｃ／Ｐ型により9.6秒^-1で測定し
た。 実施例 １ ヘテロポリサツカライドＳ―130を生産するた
めの醗酵方法 Ａ 培養維持 無名のアルカリゲネス（Alcaligenes）微生
物、ATCC31555はNA寒天上で良く生育し、
良好なコロニーを形成する。培養温度は30℃で
ある。本微生物は黄色の色素を生産する。 Ｂ シード調製 YMブロス中、30℃で24時間培養することに
よりフラスコシードを調製し、次いで最終醗酵
槽培地と同じシード培地に接種する。14の醗
酵槽に５％接種する。 Ｃ 最終醗酵槽培地 以下の培地は14の醗酵槽で良好な結果を与
え、より大規模の20及び70の醗酵槽に使用
することが可能である。 グルコース ……3.0％ K₂HPO₄ ……0.05％ プロモソイ 0.05％ NH₄NO₃ ……0.09％ MgSO₄・7H₂O ……0.01％ Fl⁺⁺ ……1ppm ホール塩 ……１ml／ PHは6.5と7.5の間に調節する。０時間でのPH
は7.3であり、残留炭素源は3.07％と測定され
た。25.5時間後、PHは7.0であり培養液の粘度
は2350と測定された。63.5時間後、PHは6.3で
あり培養液の粘度は3950であり、４％のイソプ
ロパノールを添加することによつて反応を停止
する。 ホール塩は酒石酸塩、モリブデン酸マグネシ
ウム、COCl₃、ZnCl₂、CuCl₂、ホウ酸、塩化マ
ンガン及び硫酸第１鉄を含有する微量元素溶液
である。 初期の撹拌及び通気の割合は、それぞれ
400rpm及び３／Ｍである。醗酵期間中通気
量は一定に保つ。醗酵期間中良く混合するため
に必要に応じて撹拌数を増加させる。最大撹拌
は1600rpmである。 低カルシウム製品を所望するときは、上述の
培地を脱イオン水と共に用いる。 Ｄ 回収 醗酵液を167〓で10―15分間殺菌する。沈降
条件下に於て上清IPAが58―60％である良好な
繊維が生産される。 Ｅ 乾燥 製品は強制式空気トレイ乾燥器中、50―55℃
で約１時間乾燥後回収する。 本実施例で調製した製品は、１％の脱イオン
水中で1490の粘度、１％の脱イオン水に１％の
KClを含む溶液中では2400の粘度を示す。本製
品の分析値はグルクロン酸12％、グルコース28
％、マンノース13％、ラムノース59％、アセチ
ル3.5％であり、ピルビン酸は０である。 ２％のKClでは、秀れたNaCl安定性と少な
くとも300〓までの粘度不変性という秀れた粘
度が測定される。２％のKCl中ではゴムの軽度
のゲル化が観察される。 実施例 ２ 海水泥組成物 Ｓ―130は油井掘削用の泥に使用できる。海水
泥用の組成及びデータは次のとおりである。 Ｓ―130 ……1.0ポンド 海 水 ……1.0バレル フアン粘度データ 速度(rpm) ３ ６ 100 200 300 600 ダイアルの読み 3.4 3.8 8.5 11.0 13.2 17.2 PH＝7.1 実施例 ３ 水力学的破砕用液体組成物 水力学的破砕用液体の具体例―高温用（200〓
以上） 1000ガロンにつき H₂O ５％メタノール又は500rpm亜硫酸ナトリウム ２％KCl ……165ポンド 過硫酸アンモニウム ……10ポンド Ｓ―130 ……40ポンド 上述の液体の粘度 【表】

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ アルカリゲネス（Alcaligenes）属の一種、
   ATCC31555を、管理された条件下で醗酵するこ
   とにより製造される10〜20％のグルクロン酸、10
   〜25％のマンノース、20〜40％のグルコース、30
   〜60％のラムノース及び３〜５％のアセチル基を
   含有し、かつ9.6秒^-1の剪断速度で1800〜2200cP
   の粘度を有するヘテロポリサツカライドＳ―130。 ２ 200ppm以下のCa⁺⁺イオンを含有する特許請
   求の範囲第１項記載の化合物。