JPH02306997A - 軟体動物興奮性オリゴペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は軟体動物の興帛性オリゴペプチドに係る。さら
に詳細にいうと、本発明は、軟体動物巻貝（前紹類）の
コナガニシ神経節由来の神経ベブブード、軟体動物−投
置（９９ｗ類）のムラナナキイガイの足糸前牽引筋由来
の神経ベブブド、およびこれらデカベブブ〜ドのフラグ
メントペプチドに係る。

ざらに、本発明は、このようなオリゴペプチドの製造法
および用途にも関する。

本発明のオリゴペプチドは生物学や基１ｉ￥医学の分野
において有用な実験用試薬として利用ｅさるのみならず
、これらのオリゴペプチドをらとにして生物生産および
製薬分野にＪ３ける石川な薬剤を開発することが可能で
ある。

Ｅ従来の技術１ １９７フイ［、米国のＰｒ１ｃｅとａｒｃａｎｂｅｒｇ
によって、ある二装置の神経節からＨ−Ｐｈｅ−Ｎｅｔ
−八ｒｇ−Ｐｈｅ−Ｎｉｌ、。

なる構造のテトラペプチドが発見され、Ｆ　Ｍ　ＲＦｌ
） ａｓｉｄｅと名づけられた　。その後、ＦＭＲＦａｌｄ
ｅ　ｔ３よびその同族体が軟体動物ばかりで番よなくを
椎動物を含む他の種々の動物門に６存在１Ｊる２、３．
４）　　　〜 ことが明らかになった　　　。さ５に、ＦＭＲＦａｍｉ
ｄｅに対する抗体を用いた研究から、Ｆ　Ｍ　ＲＦａｍ
ｉｄｅのＣ末端の−Ａｒｏ−Ｐｈｅ−Ｎｌ１２なる構造
をｂつ種々のペプチドが発見された。たとえば、牛の脳
からはｔルヒネ作用修飾ペプチドが２種発見されている
５）。このように、Ｆ　Ｍ　ＲＦ　ａｓｉｄｅに関する
ω１究は広範囲にわたって行なわれており、生物学分野
にとどまらず医学分野の応用面にまで発展しつつある。

本発明者らもＦ　Ｍ　ＲＦ　ａｓｉｄｅに関する研究を
続け、ムラサキイガイ足糸竹牽引筋に対するＦＭＲＦａ
ｓｉｄｅの薬理作用を調べた結末、このペプチドｔよそ
の１度が１０−８〜１０”７Ｍ程度ではこの筋の特責的
緊張性収縮である４−ヤッチを解除してこの筋を弛緩さ
せるが、１０’Ｍ以十の濃度になると逆に筋の収縮を引
き起こ１ことを発見した６）、。

さらに、本発明者らは、多数のＦ　Ｍ　ＲＦ　ａｍｉｄ
ｅ類似ペプチドを用いてＦ　Ｍ　ＲＦ　ａｍ　ｉ　ｄｅ
　１７）４７４　％′ｉ−活性関係を調べた結果、弛緩
に関する１ｌｌＳ造−活性関係１．ｔそれまで他の筋に
ついて明らかにされ（いた関係と全く異なることを発見
した７）。このことから、ムラナナキイガイには、Ｉ’
−Ｍ　ＩＩ　Ｆａｍｉｄｅとある稈度似ているかもしれ
ないがｒ　Ｍ　ＲＦ　ａｍｉｄｅ系ベブブドに属さない
弛綴付ベブヂドが存ａ１ｆ８ｉす面性があると考えられ
た。また、収縮に関４る４Ｍ　’＋も〜活性関係はそれ
まで他の筋について知られていた関係とほぼ一致し、し
かもＦ　Ｍ　ＲＦ　ａＩａｉｄｅのＮ末端を伸長さける
と興８活性が大きく増大する土に弛緩活性がなくなるこ
とも発見された。すなわら、ムラサキイガイにはＦ　Ｍ
　Ｒｒ−ａｍｉｄｅのＮ末端が伸張した構造をもつＦ　
Ｍ　Ｉ’＜　Ｆ　ａｍｉｄｅ糸興６１竹ベブヂドが存在
する可能性があると考えられた。実際、本発明者らは、
その後の研究にＪ３い（、ムラサキイガイの足神経節か
ら強い弛緩活性をｂつへブタペプチドを発見し、ＣＡＲ
Ｐと名づけた８）。

これはＦ　Ｍ　ＲＦ　ａｍｉｄｅにやや似た構ｊｖ、を
しているがＦ　Ｍ　ＲＦ　ａｎｉｉｄｅ系ペプチドでは
ない。

この弛！ｔ！ｔベゾブドＣＡ　Ｒ１１に対し、存在が予
想されていたＩｌｌ　ｍ　ｔ’ｌペプチドは本発明に〒
るまて・ブｌ見されていなかった。

一方、］ナガニシ歯舌牽引筋がＦ　Ｍ　ＲＦ　ａｍｉ＋
ｊａにＪ、−）で四屓ザることがら、＝１ナガニシにも
ＦＭ　ＲＦ　ａｍｉｄｅまたはＦ　Ｍ　ＲＦ　ａｍｉｄ
ｅ系に属する他のペプチドが存在する可能性が考えられ
たが、」太ガニシのＦ　Ｍ　ＲＦ　ａｍｉｄｅ系ペブＦ
ドち未発見のまま残されていた。

［発明が解決しようとづる問題点］ Ｌ記のように存在がＹ想されるＦ　Ｍ　ＲＦ　ａｍｉｄ
ｅ系ベブブドがｔｌｉ離され、その構造が決定され、さ
らに合成されれば、神経生物学、生物生産学、１１礎医
学等の分野において１１用な試薬として利用できると考
えられる。

また、軟体！ｖＩ物において現在までに発見されている
Ｆ　Ｍ　ＲＦ　ａｌｄｅ系ペプチドとして１ま、２種の
ｊトラベブヂドと５種のへブタペプチドが知られている
が２）、これらペプチドの７ラグメントに活性発現のた
めに重要な共通構造が見い出されれば、より石川な実験
試薬に利用でき、特にそのようなフラグメントに対する
特異的抗体が作製されれば、咄乳類の新型神経ペプチド
の探索に４１用であり、ひいては有用な医薬の開発にも
利用ｅさると考えられる。

したがって、本発明の主たる目的は、コナガニシｔＢ　
Ｊ、びムラサキイガイのＦ　Ｍ　ｆ＜　Ｉ”　ａｍｉｄ
Ｃ系興粛性オリゴペプチドを捉供づることである。

また、本発明の別の［１的は、そのようなイリゴベブｆ
−ドの製造方ｌムを提供づることＣある。

さらに、本発明Ｇ、Ｌ、そのようなＡリゴベ／ブトの各
種用途６目的どケる。

１問題点を解決するための手段１ 本発明者ら番よ、］ナガーシの神経節の油田物から、−
」ナガニシの歯舌牽引筋に対してＩＪ４Ｉ酷活性全活性
ペプチドを甲禽１し、その構ｊ告を決定した。

このフ）ナガニシ興酊性デカペブ１ド（ＩＵＳｉｎＵ３
ｃｘｃｉｔａｔｏｒｙ　ｐｅｐｔｉｄｅ　Ａ、以”ドＦ
　Ｅ　Ｐ　Ａと略り）は次のアミノ酸配列式を有する。

ＦＦＰＡ：ｌトム１ａ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−＾５ｎ−Ａｓ
ｒ＋−１ｌｉｓ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−＾ｒｇ−Ｐｈｅ−Ｎ
Ｈ２ 一方、ムラサキイガイ星糸前牽引筋抽出物から、この筋
に対して興醒活性を示すペプチドを！ａ離し、ぞの構造
を決定した。このムラサ４−イガイ興ｍ竹デカペプチド
（Ｈｙｔｉｌｕｓ　　ｅｘｃｉｔａｔｏｒｙ　ｐｃｐｔ
ｉｄｃ　Ａ。

以下ＭＥＰＡと略丈）は次のアミノ酸配列式を右する。

ＭＥＰＡ：ＩＩ−＾１ａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａ
ｓｐ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−＾ｒＱ−ＰｈＯ−ＮＩ
Ｉ２ これら２種の新規なデカペプチドはいυ′れもＶ　Ｍ　
ＲＦ　ａｍｉｄｅ　ＪＩＱの興ｍ活性を示すＦ　ＩｖＩ
　ＲＦａ１ｄｅ系の同族体である。

また、ＦＥＰＡおよびＭ　Ｆ　ｆＪ　ＡのＮ末端のアミ
ノ酸残基を４個除いたフラグメン１−（イれぞれ、５−
１０ＦＥＦ’Ａおよび５−１０　Ｍ　Ｅ　Ｐ△と称する
）は、それぞれＦＥＰＡＪ３よびＭＥＰＡと同様の活性
を承りことが判明した。

５ｉ０　ｒＥＰＡ　：　トＡｓｐ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｌ
ｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｎｌ１２５−１０　ＨＥＰ＾：
　トＡｓｐ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−＾ｒｇ−Ｐｈｅ
−Ｎｔ１２これらへキサペプチドは１個のアミノ酸残基
を除いて同じ構造をもっている。ずなわＩ）、これらフ
ラグメントの構造はＦＩＥＰＡおよびＭ　Ｅ　Ｉ）への
活性発現に重要な役割を果しているとにλられる。

したがって、本発明は、 式： ％式％ で表わされるオリゴペプチドに係る。これらは軟体動物
の筋収縮を増強し、ｍ度を上げるとぞれ自体で収縮を引
き起こり神経ペプチドて゛ある。この活性は、低８１度
（１０−１０〜１０−９Ｍンで軟体動物前鯰類：」ｔガ
ニシの歯舌牽引筋単一収縮または斧足類ムラザキイガイ
の足糸前牽引筋の一過性収縮を増強する活性として検出
される。尚、上記式中のＸはＡｌａ、　Ｌｅｕ、　Ｔｈ
ｒ、　Ａｓｎ、　Ｇｌｙ等のアミノ酸残基を示し、Ｙは
ｌｅｕまたはｐｈｅを示しており、ｎはＯから４までの
整数である。

本発明のオリゴペプチドｔよ、　Ｉ＋−／１ｓｐ−Ｈｉ
ｓ−ｐｈｃ−１０：）−八ｒａ−Ｐｈｅ−Ｎｌ１２を基
本構造とし、この基本構造のＮ末端側に４個まて゛のア
ミノ酸残基が伸長したｆｆ４　ｆｆｉのらの（゛ある。

このＮ末端側の付加アミノ酸としてはｆｆ急のアミノ酸
が考えられるが、に記基本構造のへ１サベブブドの興奮
活性が紺１）されるように選択すべきである。

本発明の興合性オリゴベブブドの員体例としては次のも
のがある。（）内は略号。

１ト＾１ａ−Ｌｅｕ−Ｔｂｒ−＾ｓｎ−八５ｐへＩｌｉ
ｓ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−＾ｒｏ−Ｐｈｅ−Ｎｌｌ、、　　
　　　　　　　　　　　　　　（ｒ［ＰΔ）］］ト＾１
ａ−Ｌｅｕ−＾１ａ−Ｇｌｙ八５ｐ−Ｉｔｉ　５−Ｐｈ
ｅ−Ｐｈｅ−八ｒｇ−Ｐｈｅ−Ｎｌ１２　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　（Ｈ［Ｐ八）ト＾５ｐ−Ｈ
ｉｓ−Ｐｈｅ−Ｌｅｔｌ−＾ｒＱ−ＰｈＯ−Ｎｉ１２（
り−１０ｒｌ、ｌ’＾）１ト＾ｓｐ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−
Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｎｉｌ、、　　　（５−１０
１什ＰＡ）本発明のオリゴペプチドのうちＦＥＰＡとＭ
ＦＰＡは明らかに同族体である。

これらは、コナガニシ歯舌牽引筋またはムラリーキイガ
イ足糸竹牽引筋において強い収縮増強ｒＡ性（ｔｉｆ＋
＋７１０−９ＭＬＸ　下）　ト１５ＮＲＨｊｉＣｒｔ’
１ｆｆｆ　（ｆｉｌ　ｔｉｆｌＪは＋Ｏ’Ｍ　）を示し
、今までに知られているどのＦ　Ｍ　ＲＦ　ａｓｉｄｅ
系ペプチドよりも強い。

また、これらの７ラグメントである５−１０ＦＥＰＡお
よび５−１０　Ｍ　Ｅ　Ｐ　Ａの活性もＦＥＰＡやＭ　
Ｅ　Ｐ　Ａに比べると多少劣る（活性はそれぞれ約１７
３）が、Ｆ　Ｍ　ＲＦ　ａｓｉｄｅよりも強い。

１配の７ラグメントの＠造はＦＥＰＡ活性およびＭＥＰ
Ａ活性の発現に必要な基本構造と考えられ、この構造を
Ｃ末端にもつ未知のペプチドが自然界に存在する可能性
がある。また、ＦＭＩマＥａｓｔｄｅ系ペプチドには−
Ｐｈｅ−１．ｃｕ−＾ｒａ−Ｐｈｅ−Ｎｌ１２なるＣ未
開構造をもつものが多いが−Ｐｈｅ−ＭＯ（−静σ−Ｐ
ｈｅ−Ｎｌ１２なる構造をもつものもあるので、５１０
ＦＥＰＡの１−ｅｕがＭｅｔに置換されたか、あるいは
５−１０　Ｍ　Ｅ　Ｐ　ＡのＮ末から４番［１のｐｈｅ
がＭｅｔに置換された一＾５Ｄ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｎｅ
ｔ−＾ｒｇ−Ｐｈｅ−旧１２するＣ未開構造をもつペプ
チドも存在する可能性がある。

本発明のオリゴペプチド、特にＦ　ｔＥ　ＰΔおよびＭ
ＥＰＢは、後述の実施例にも示されるように、たとえば
ＴＪ−ｆガニシ神経節またはムラサキイガイ足糸前牽引
筋の抽出物を高速液体クロマトグラフィ（＋」Ｐ　Ｌ　
Ｃ’）なとの通常の方法で精製して製造することができ
る。抽出にはア廿トンなどの右’ａｒＢ剤が用いられる
。

また、本発明のオリゴペプチドは、後述の実施例にも示
されるように、たとえば通常の固相ペプチド合成法など
によって合成づることもできる。

［発明の効果］ 多くの神経ペプチドがそうであるように、本発明のオリ
ゴペプチドも軟体動物の筋系で作用を示ずだけでなく中
枢押杆系においても作用を示す゛ものど期待される。軟
体動物の神経系は我々の記憶や学習の神杼礪構を調べる
ためのよいモデル系と９、１０） してよく実験に用いられるので　　　、本発明のＡリゴ
ベプブドはこれらの実験においてイ、】用な試薬として
使用される。

Ｆ　Ｍ　ＲＦ　ａｓｉｄｅ系ペプチドは哺乳類にも存在
し、Ａｌｉ乳類においてもいろいろな作用を承りことが
知られている　。したがって、本発明のペブブドは、吐
乳類にお＋ｊる新規なＦ　Ｍ　ＲＦ　ａａｔｉｄｅ系ペ
プチドの探索やその働きについての研究に利用できる。

特に、５−１０ＦＥＰＡや５−１０５−１Ｏを用いてそ
の特異抗体を作製づ−れば、これらペブヂド横ｚｌｉを
フラグメントとしてもつＦ　Ｍ　ＲＦ　ａｓｉｄｅ系ペ
プチドの同定やその局在性の研究に使用でき、Ｑｌｉ乳
類を含めた種々の動物の研究に有用であろう。

［実施例］ 以下、実施例をあげて本発明を具体的に説明する。

実施例１：コナガニシＦＥＰΔの単頗・ｒｆｉ！Ｊ’Ｊ
軟体動物前鰓類（巻貝）のコノガニシは広＋’ニー’ｌ
　Ｉ弯で採取したものを使用した。コブガニシにＪ３い
ては内臓神経節を除く他の神経節が一つの塊になって存
在する。約１，１００個体のコナガニシから押杆節塊を
分離し、ただちにドライアイスで凍結し、−２０℃に保
存した。

凍結保存しておいた神杆可塊を水冷したアレトンに入れ
、ただちにホモゲナイズし、ホモゲネートを遠心分離し
、その上清中のアセトンを減圧Ｌバポレーターを用いて
蒸発さけた。残った水溶物に塩酸を最終濃度が０，１Ｎ
になるように加えて攪拌し、再び遠心して不溶物を除い
た。これをＣ−１８カートリツヂ（Ｗａｔｅｒｓ、　Ｓ
［Ｐ−Ｐ＾Ｋ）に通し、カートリッヂを４％酢酸で洗っ
た後、保持物質をメタノールで溶出し、溶出物を凍結乾
燥さ「た。この試料を蒸溜水に溶解し、５ｅｐｈａｄｅ
ｘ　Ｇ−１５ツノラム（２，６ｘ４０α）にの１土、０
．１Ｎ酢酸を流して分画した。各両分は凍結乾燥したの
ち、生物活性の検定に用いた。

生物検定は］ナガニシ歯舌牽引筋を用いて行った。約２
ｍの実験容器に筋標本を取り付け、電気ｅ１ｍ　（２０
Ｖ、　２ｔａｓｅｃ、　　０．２Ｈｚ　、　５パルス）
を与え、５個１組の単一収縮をη゛じさせ、この収縮に
及ぼす各画分の効果を調べた。以下に述べるペプチド純
化の各過程における生物検定す同様の方法で行った。な
お、Ｆ　Ｍ　ＲＦ　ａｎ＋ｉｄｃは、この筋においては
、低１１度でψ−収縮の１１強、少し＋ｒ＆　ａ１度に
なるとａ度依存的に収縮を引き起こす。したがって、コ
ナガニシに存在するＦ　Ｍ　ＲＦ　ａｍｉｄｅ系ペプチ
ドも似たような活性を示すであろうとべえ、甲−収縮に
対する増強活性に注目して純化を進めた。

５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−１５によるゲル濾過で得られた
各両分を生物検定した結束、最大増強活性が２２番［１
，４５番目、５０番目の両分にそれぞれ見られる３つの
ＩＸＩＩＷ性のピークを得た。また、両分２８〜３０に
最大活性を示す抑制活性のピークを得た。画分４５へ・
５０あたりには分子量６００前俊のベブブドが溶出され
るはずであり、本発明ではそれより高分子ｒ４のＦＭ　
ＲＦ　ａｉｉｄｅ系ペブブドを目的としていたので、両
分２２〜４０を集め、これをＣ−１８逆相カラム（丁Ｓ
Ｋ−ゲル　ＯＤＳ−８０ＴＭ）に注入し、０．１％ＪＦ
△（ｐＨ２，２）、０−６０％アセトニトリル（６０分
）の条件下で１−ＩＰＬ　Ｃシステム（日本分光ＴＩｔ
１−ＲＯＴＥ讐ＩＶ　）を用いて勾配溶出を行った。そ
の結束、興奮活性を示すピークと抑制活性を示づピーク
にはつさりと分かれた。しかし、興谷活ｆ１を示ずピー
クの活性はＦ　Ｍ　ＲＦ　ａｍｉｄｅ抗体（−Ａｒｏ−
Ｐｈｅ−Ｎｌ２を認１５する抗体、ベニンスラ社製）と
混合してもその活性が消えないので、この活性物質はＦ
　Ｍ　ＲＦａｍｉｄｅ系ペプチドとは考えられなかった
。そこで。

抑ａ、ＩＩ活性をポリピークをざらに陽イＡン交換カク
ム（Ｔ　Ｓ　Ｋ−ゲル　５Ｐ−５ＰＷ）に１１人し、２
０ｍＨリンＭバッフｐ　−（ｐｔｌ　６．８）、０−０
．４ＨＮａＣ１（９６分）の条件下で勾配溶出を行い、
３つの抑制活性ピークと１つの興奮活性ピークを４９だ
。この興奮活性ビークの活性はＦ　Ｍ　ＲＦ　ａ糟ｉｄ
ｃ抗体処理によって見られなくなった。そこで、この興
奮活性ビークを再び逆相カラム（ＴＳＫ−ゲル　００８
−８０ＴＭ）に注入し、１％ＴＥＡ　（ｐＨ２，２）　
、２７％アセ］ヘニトリルの条件下でイソクラう一イッ
ク溶出を行い、興醒活性を示づほぼｒｌｉ−のピークを
得たく第１図Ａ矢印）。このピークを再び同じ条（’を
手でイソクラグイツク溶出を行い、完全に単一のピーク
を１！７たく第１図Ｂ矢印）。このピークの］ナガニシ
歯舌牽引筋の単一収縮に対づる増強作用を調べた結果を
第１図Ｃに示寸。ずなわち、電気刺激（２０Ｖ１２ｍｓ
ｅｃ、　０．２　Ｈｚ、　５パルス）を与え、５個１組
の単一収縮を生じさせ、それにλ１する＋’ｌ川を見た
。活性物質は刺激の８弁面から作用さばく上向ぎの矢印
）、刺激後ただちに洗った（十向きの矢印）。活性物質
は神経節３匹分から１！？られたものを１ｊ１１！の生
理的塩類溶液に溶かした瀾痘で調べた。増強の程度は対
照（５個の単一収縮の張力の合計）の約２倍であった。

また、活性物質は８ｍ度（３０匹分／−生理的塩類溶液
）ではそれ自体が収縮を引き起こしたく第１図り参照）
。

得られた活性物質をＦＥＰＡと命名した。

割ｉ■ユニムラサキイガイＭＥＰＡの甲離・精製軟体動
物斧足類（二装置）のムラサキイガイは広島湾で採取し
たものを使用した。ムラサキイガイ約１０，０００個体
から足糸前牽引筋を分離し、実施例１のコナガニシの場
合と同様に凍＆＋１シて一２０℃の下に保存した。

凍結保存しておいたムラサキイガイ足糸前牽引筋を水冷
したアセトンに入れ、実施例１の」ナガニシ神経節の場
合と同様の方法で抽出し、ｌｆｆ１１様のｌｊ法でゲル
濾過を行った。ゲル濾過によって得られた各両分は凍結
乾燥したのら、生物活性の検定に用いた。

１物検定はムラサキイガイ足糸前牽引筋を用いで行った
。約２ｄの実験容器に筋標本を取りイ・］け、反復電気
刺ｆｆ１（１５Ｖ、３　ｍ５ｅｃ、１０１１２．５沙門
）を与えてこの筋の一過性収縮を生じさせ、この収縮に
及ぼづ各両分の効果、および筋に両分を作用させたとき
両分白身によって収縮が起こるかどうかについて調べた
。以下に述べるペプチド純化の各過程にお番ノる生物検
定も同様の方法で行った。なお、　ＦＭＲＦａｌｌｌｉ
ｄｅ　Ｇよ、この筋にＪ３いて、低温度（１０−９Ｍ以
上）では−過性収縮を増強し、高Ｉ　ＩＱ（１０’Ｍ以
上）になると−過性収縮増強に加えて、それ自身が収縮
を引き起こす６）。そこで、−過ｔ’１収縮増強作用と
、それ自身による収縮惹起ｆ１用に江口して生物検定を
行った。

ゲル心過によって得られた各両分を生物検定した結果、
両分２７．３６．　！１８．６３にそれぞれ最大活Ｍを
示１４つの収縮抑制活性のピークと、両分３２゜３４、
４６．４９にそれぞれ最人活暫を示１Ｆ４つの収縮増強
活性のピークを得た。Ｆ　Ｍ　ＲＦ　ａｍｉｄｅの分子
量は約６００であるが、本発明の目的はこれより人きい
分子量のＦ　Ｍ　ＲＦ　ａｉ＋ｉｄｃ系ベブヂドを探索
づることにあるので、両分２２〜４０をまとめ、）−１
１：）　ｔ、−Ｃ（「Ｊ２ンエー！Ｖ　’ｈ’ｎ　ＣＣ
Ｐ　Ｍ　）を用いＣν１装を進めＩこ。

まず、逆相カラム（Ｔ　Ｓ　Ｋ−ゲル、０　［’）　Ｓ
　−８０丁Ｍ）にｉ、ｌＥ人し、０．１％ＴＦ△、０−
００％　７　Ｌ！　ｌ・二１〜リル（６０分）の条ｆ１
て・勾配溶出を行った。ぞの結果、２つの収縮惹起活性
を示１ｊピークと２つの収縮抑制活性を示１−ピークを
（７だ。収縮惹起話ＰＩを示＝）ピークのうら１番［１
のピー９１よ一過付収縮へ・増強し／、ｊかったが、２
　Ｍ　ＬＩのピークは一過性収ｆｔ、を、ｊ、く１曽−
ｉｔ省した。・ど（二ζ・、この２番目のヒ゛−りに！
”　Ｍ　ＲＦ　ａｓｉｄｅ様ペプチドが存在Ｊるととえ
た。

次に、この２番Ｕ１のピークを陽イオン交換カラム（ｒ
ＳＫ−ゲル、５ｌ）−５ＰＷ）に１１人し、１０ｍＨリ
ン酸バッフｐ　−（ｐＨ１３，８）、０−０．７ＨＲａ
ｃｅの条件Ｆ”ｃ勾配溶出を行い、１！′？られた活性
ビークを、不純物を除く［１的で陰イＡン交換カラム（
ＴＳＫゲル、Ｄ［ΔＥ−５ＰＷ）に注入し、１０ａ＋Ｈ
丁ｒｉｓ　（ｐＨ９５）の電信下で溶出を行ったところ
、活性物質は溶出されたが多くの不純物は溶出されなか
った。

ついで、活性画分を逆相カラム（丁ＳＫグル、ＯＤＳ−
８０ＴＭ）に注入し、０．１％ＴＦＡ（Ｉ’１１２２）
、１０−３０％アセトニトリルの条件下で勾配溶出を行
い、活性をポリはぼ甲−のピークを（υることかできた
。ムラサキイガイ足糸萌牽引筋の［ＭＲＦ　ａｓｉｄｅ
による収縮はマーサリール酎によって不可逆的に遮断さ
れ、筋をシスティンで処理ηると収縮が回復することが
知られている６］。ぞこて・、ここで得られた活性ピー
クについて−ｂ調べてみｔ＝　。

結果を第２図Ａに承り。図はこの段階ぐ１１１られた活
性物質によるムラサキイガイ足糸前牽引筋の収縮とその
収縮のマーサリールＭ　（１０’Ｍ　）にＪ、る不可逆
的遮断およびシスティン（１０−２Ｍ）処理による遮断
からの回復を示す。活性物質は３０匹分の足糸前牽引筋
から１１られたｂのを１−の生理的塩類溶液に溶かした
濃度で用いた。活性物質は１５分おきに２．５〜４分間
与え、マーサリール酸およびシスティンはそれぞれ活性
物質作用の１０分前から投（５し、それぞれの中での収
縮反応について調べたのＩ５、たたらに洗った。図から
明らかなように、収縮はマーサリール醒によって完全に
、しかも不（ｉ■逆的に抑えられ、シスブイン処理によ
つＣ回復し１＝。４シｔ３、［二〜１　（＜　Ｆ：　ａ
ｎｔｄｃ　１．を低温１ａ（１０−８〜１０−７Ｍ　）
では筋を弛緩させ、高濃度（１０−６Ｍ以上）て゛ＩＪ
自身が収縮を惹起ザる効果があるので、得られた活性物
質がＦ　Ｍ　ＲＦ　ａｌｄｅそのムのでないかどうか確
かめるために、種々の９１１の活性物質を用いて調べた
ところ弛緩効果はまったくみられなかった。したがって
、ここで得られた活性物Ｙ１はＦ　Ｍ　ＲＦ　ａｓｉｄ
ｅ様物質であるがＦ　Ｍ　ＲＦ　ａｍｉｄｅそのもので
はない。そこで、この活性物質を再び上記の逆相カラム
に注入して０．１％Ｔ　Ｆ　Ａ　（ｐＨ２，２）、２９
％アセトニトリルの条件下でイソクラティック溶出をｔ
７い、活性を示す中−のピークを（（？ることができた
（第２図Ｂ矢印）。この活性物質にＪ、るムラサキイガ
イの足糸竹牽引筋にＪハＪる収縮病Ｍを第２図Ｃに、反
復電気刺激（１５Ｖ　、　３１１１３ＱＣ，１０Ｈ２，
５秒間）による一過性収縮に対Ｊる収縮増強活性を第２
図りに示す。ここで、収縮活性は１５０匹分の足糸前牽
引筋から得られた活ｆ／ｌ物質を１　ｎｉｌの生理的塩
類溶液に溶かした濃邸ｅ用いて調べｌζ。

また、一過性収縮増強活性は３匹分の筋から（１１に活
性物質を１−の生理的塩類溶液に溶かした濃度で用い−
（調べた。

得られた活性物質をＭＥＰΔと命名した。

及鹿点ユニ神経ベブヂドの構造決定 実施例１と２で得られた活性物質の描込は以下のように
して決定した。

（ｉ）アミノ酸組成 アミノ酸分析は、約１ナノモルの試料を用い、減圧封管
中１００−の定沸点塩酸（０，１％）Ｊ−ノール含有）
ｒ１１０℃、２４時間加水分解し、減圧乾固後０．０２
Ｎｍ酸１００〃に溶解し、日立自動アミノ酸分析礪Ｌ−
８５００型に供して行なった。結果を第１表に示す。

尚、第１表中、ＦＥＰＡは１ｅｕ＝２、Ｍ　ＩＥ　Ｐ　
ＡはＬ（３ｕ＝１として計ｎした。０内の数値は最も近
い整数比を示７゜ 第　　　　１　　　　表 （ｉｉ）アミノ酸配列 アミノ酸分析に用いたのと同ｒ１１の試料を自動プロデ
ィンシーケンサ−（アプライド・バイオシステムズ社製
４７７△型）に供した。得られるフェニルヂオヒダン（
〜インーアミノ酸（ＰＴＨ−アミノＭ）は、上記シーケ
ンザーとオンラインで結ばれた））　Ｔ　Ｈ−アミノ酸
分析ｍ＜７プライド・バイオシステムズ社製１２０Ａ型
）を用いて同定した。結果はＦＥＰＡについて第２表、
ＭＦＰΔについて第３表に示づ。

第　２　表　　ＦＥＰＡのアミノ酸配列第　３　表　　
ＭＥＩ）Ａのアミノ酸配列（ｉｉｉ　）　Ｆ　Ａ　Ｂ質
ｍ分析 ＦＡＢ＊ｆｆｉ分析は、日本電子製のＦＡＢ質吊分析１
　（ＪＦＯＬ　ＪＨ５）ＩＸ−１００型）を用イエ１１
ツだ、ＦＥＰＡの（Ｍ＋１＞”イオンは１２３２．７（
理論分子間１２３１．６）に、ＭＥＰＡの（Ｍ＋−１＞
’イＡンは１１７９．６　（理論分子ｐｉ１１７８゜６
）に検出された１゜以上の結果より、Ｆ　Ｅ　Ｐ　Ａと
ＭＥＰＡの構造式はそれぞれ次式のように推定された。

。 ＦＥＰＡ：ｌトム１ａ−Ｌｃｕ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−＾ｓ
ｐ−＋＋：５−ｐｈｅ−ｉｅｕ−八ｒｇ−Ｐｈｅ−Ｎｌ
１２ Ｍ　Ｅ　　Ｐ　Ａ　　：　　Ｉｆ−Ａｌａ−１ｅｕ−八
Ｉａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒ
ｇ−Ｐｈｅ−Ｎｌ１２ 実コＬＥＬ：神杆ベブｆ−ドの合成 合成はタベてアプライド・バイオシステムズ社製ベブブ
ド合成機４３０Δを用いる固相ベブヂド合成機により、
同社製の保護アミノ酸を用いて７７つだ。樹脂からの脱
離及び保護基の除去にはｌ−４Ｆ　−アニソール法を用
い、樹脂除去復の凍結乾燥物１よ逆相系カラムを用いた
ｌ」Ｐ　Ｌ　Ｏにより精製した。

合成品は、天然物の場合と同様に、アミノ酸分析、アミ
ノ酸配列分析、ＦＡ［３質層分析により描込確認を行っ
たのち前記と同じ活性試験に供した。

その結果、合成のＦＥＰＡ、ＭＥＰＡは、各々逆相系及
び陽イオン交換カラムを用いたＨ　Ｉ）　Ｌ　Ｃ上の？
初にＪ３いて、天然のＦＥＰＡ、ＭＥＰＡと−・致した
。さらに、生物活性においても合成品と天然品は一致し
、先に記したＦＥＰＡ、ＭＥＰＡの化学構造が＆Ｖ認さ
れた。

実施例５：神経ベブブドのフラグメンｌ−ペプチド実［
４ど同様の方法を用いて、以下のノラグメントベブチド
を合成、蹟暫し生物活性を調べたところ各々ＦＥＰＡ、
ＭＥＰＡより多少減弱されてはいるものの充分な活性（
それぞれ約１７３の活性）を認めた。

５−１０　　ＦＥＰＡ　：１ト＾ｓｐ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ
−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｎｌ１２５−１０　　ＨＥ
ＰＡ　　：　　Ｈ−Ａｓｐ−１ｔｉｓ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ
−八ｒｇ−ＰｈＱ−８１１２征」【】Ｌが 明細Ｖ（中で引用した文献を以下に列記Ｊる。

（１ン　　５ｃｉｅｎｃｅ、　　１９７．　　θ７０（
＋９７７）■　Ｚｏｏｌｏｇｉｃａｔ　５ｃｉｅｎｃｅ
、　４．３９５　（１９８７）■　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、
　９．　ｔ２５　（１９８８）（４）　　Ｐｅｐｔｉｄ
ｅｓ、　９．９１５　（１９８８）＜５）　　　Ｐｒｏ
ｃ、Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ、　　８２．
　７７５７　　（１９８５）（６）　　Ｃｏ１１ｐ、８
ｉｏｃｈｃｍ、Ｐｈｙｓｉｏｌ、、　８１Ｃ，６？　（
１９８５）（７）　　Ｃ０１１ｐ、ＢｉｏＣｈｅｌｌ、
ＰｈｙＳｉＯｌ、、　８５Ｃ，２０７ｆ１９８Ｇ）■　
Ｂｒａｉｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　４２２．３７４（１
９８７）■　科学、５１．　ＴＯ（１９８１） ω　科学、５１．１０９　（１９８１）

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例１で行なったＦＥＰＡの精製段階のＨ
Ｐ　Ｌ　Ｃクロマトグラムと得られたＦＥＰＡの活性試
験結果を示ず図である。△は最終段階１つ前のＨＰＬＣ
クロマトグラムであり、Ｂは最終段階のＨＰ　Ｌ　Ｃク
ロン１〜グラムである。ＣはＢで（９だ活性物質の低濃
度（３四分／ｄ生理的塩類溶液）でのコナガニシｒ＃古
牽引筋の甲−収縮に対する増強作用を検定した結果であ
る。Ｄは高濶麿（３０匹分／ｄ生理的塩類溶液）　−（
″の１ナガニシ爾汎牽引筋収縮惹起作用を検定した結果
である。 第２図は、実施８１１２で行なったＭ　Ｅ　Ｉ）　Ａの
精製ＩｉＪ柊段階の１（ＰＩＧクロマトグラム（第２図
Ｂ）、（ｑられた粗ＭＥＰＡ（３０匹分／ｒｎｌ！生理
的塩類溶液）の収縮惹起活性に及ぽケマー奮ナリール醇
どシスティンの効ＩＪ！　（第２図へ）、精製ＭＥＰＡ
の高濃瓜（１５０匹分／ｄ生即的塩類溶液）での収縮惹
起活性（第２図Ｃ）、Ｊ３よび精製Ｍ　Ｅ　））への低
濃度（３Ｖｃ分／　ｄ　’ｔ’理的塩類溶液）での一過
性収縮増強活性についての活性試験結果を承り図である
。なお、Ｄにおいて活性物質は一過性収縮の８分前から
投与したく矢印）。 第・２図 ３／ｒｎＲ

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. （１）式： Ｈ（Ｘ）＿ｎ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｙ−Ａｒｇ−
   Ｐｈｅ−ＮＨ＿２［式中、Ｘはアミノ酸残基を示し、Ｙ
   はＬｅｕまたはＰｈｅを示し、ｎは０〜４の整数である
   ］で示される興奮性オリゴペプチド。
2. （２）軟体動物の筋収縮を増強する請求項１記載のオリ
   ゴペプチド。
3. （３）軟体動物が前鰓類のコナガニシである請求項２記
   載のオリゴペプチド。
4. （４）コナガニシ歯舌牽引筋の単一収縮活性を有する請
   求項３記載のオリゴペプチド。
5. （５）軟体動物が斧足類のムラサキイガイである請求項
   ２記載のオリゴペプチド。
6. （６）ムラサキイガイ足糸前牽引筋の一過性収縮活性を
   有する請求項５記載のオリゴペプチド。
7. （７）式： Ｈ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ
   −Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ＿２ で示される請求項１〜４のいずれかに記載のオリゴペプ
   チド。
8. （８）式： Ｈ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ
   −Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ＿２ で示される請求項１、２、５および６のいずれかに記載
   のオリゴペプチド。
9. （９）式： Ｈ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ
   −ＨＨ＿２で示される請求項１〜４のいずれかに記載の
   オリゴペプチド。
10. （１０）式： Ｈ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ
    −ＮＨ＿２で示される請求項１、２、５および６のいず
    れかに記載のオリゴペプチド。
11. （１１）コナガニシ神経節またはムラサキイガイ足糸前
    牽引筋の有機溶剤抽出物をゲル濾過し、逆相カラムを用
    いて高速液体クロマトグラフ処理し、陽イオン交換クロ
    マトグラフ処理し、逆相カラムを用いてイソクラティツ
    ク溶出を行なうことからなる、請求項１〜８のいずれか
    に記載のオリゴペプチドの製造方法。
12. （１２）通常の固相ペプチド合成法によって合成するこ
    とからなる、請求項１〜１０のいずれかに記載のオリゴ
    ペプチドの製造方法。
13. （１３）請求項１〜１０のいずれかに記載のオリゴペプ
    チド１種以上からなる実験用試薬。