JPH0228560A - 血中成分の履歴を調査する方法及び手段 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、血中成分の赤血球生成後の履歴を調査する方
法及び該方法に用いる装置に係るものであり、特に血糖
値の赤血球生成後の履歴の調査に好適な方法及び装置に
関するものである。

［従来の技術］ 赤血球は直径約７〜８．５μ鯖、厚さ約２゜５μｍの中
くぼみ円盤状の形態をした細胞であり、主として骨髄で
産出され、網状赤血球として、末梢血に送り込まれる。

その後２〜３日で網物質を失い、成熟赤血球となると言
われる。赤血球は常に体内を循環し、肺におけるガス交
換、及び全身各組織への酸素運搬など生命の維持上不可
欠な機能を分担している。赤血球の平均寿命は約１２０
日であり、その老化に従い赤血球生成後の酵素活性が低
下し、膜面に変化を生じて崩壊死滅すると言われている
。平均的には、全赤血球量の１／１２０が毎日崩壊死滅
し、はぼ同量の赤血球が毎日産出されで、一定の赤血球
量を保持している。従って、実際の血液では新生の赤血
球から崩壊寸前のものまでが混在している。

そこで、もしこれらの赤血球をその加齢の順に分けるこ
とができ、赤血球中の通切な成分、例えばヘモグロビン
、酵素、細胞膜成分等の量或いは活性値或いは特性値を
測定すれば、それらの量或いは活性値或いは特性値の加
齢に従った変動が見られることになる。さらに、赤血球
中の該成分の量或いは活性値或いは特性値が疾病若しく
は健康状態の推移により左右され、かつその変動が該成
分に「履歴」として「記憶」されていれば−、Ｍ赤血球
を加齢の順に分け、該成分の量或いは活性値或いは特性
値を測定することにより、健康時の変動相からの「ずれ
」として、疾病若しくは健康状態の推移を把握できるこ
とになる。

しかし、従来の臨床現場における検査では、血液を赤血
球と血漿の混合物である「全血」、或いは赤血球を分離
除去した血漿または血清として扱うことが圧倒的に多い
。また赤血球が検査対象となる場合でも、測定されるの
は赤血球数、血球容積（ヘマトクリット）、網状赤血球
比率、赤血球抵抗性、赤血球沈降速度、赤血球寿命など
であり、赤血球の加齢に関係して何らかの量の履歴を調
査することは極めて稀であり、それは特殊検査或いは研
究に属するものである。

さらに、以下詳述するように、特殊検査或いは研究を目
的として赤血球を加齢に従って分離している例において
も、分画の分取手段が通常のビベン１−操作を基本とす
るため、多量の血液を必要とし、また分離剤により比重
の異なる赤血球の間に隔壁を作る必要があるなど問題が
ある。

次に、赤血球中のある成分の量、或いは活性値或いは特
性値が疾病若しくは健康状態推移により左右され、かつ
その変動が該成分に「履歴」として「記憶」される事例
との関連で、従来技術を概観する。

血液中の糖は生体のエネルギー源として必須であるが、
この血中濃度が異常に高値となった状態が糖尿病であり
、従来血液中の糖濃度すなわち血糖値ば、糖尿病を判定
する診断指標として重要である。しかし、その値は種々
の要因　　　食事や断食、或いは精神的緊張や弛緩など
□によってかなり急激に、且つ大幅に変動する。従って
、血糖値を誤りなく診断指標として使うためには、採血
時の条件を揃える必要があり、被検者に余分な制限や苦
痛を与えることになる。これに対し、糖化ヘモグロビン
（ＨｂＡ＋（、、ＨｂＡｌ）は赤血球中の一成分である
ヘモグロビン（Ｈｂ）が血中成分である糖の経時的変動
の影響を受けつつ老化し、Ｍａｉｌｌａｒｄ反応により
物質的「履歴」として蓄積された糖化ヘモグロビン量の
全ヘモクロビン浬に対する平均比率として求められるも
のであり、血糖値と異なり、食事その他の要因によって
は変化せず、過去２〜３ケ月の血糖値の平均値を反映し
ており、糖尿病に関する安定な情報を提供することは周
知の通りである。糖化ヘモグロビン測定には採血時の条
件は揃える必要がないため、ＨｂＡＨＧ、、ＨｂＡｌの
測定装置は近年、臨床現場の検査に急速に普及するに至
った。

Ｈｂと同様血漿中の蛋白質もＭａｔ　１１ａｒｄ反応に
より糖化蛋白質を生成することは周知のとおりであり、
血糖変動の経緯を物質的「履歴」として蓄積する。１９
８２年ニューシーラントのＪｏｈｎｓｏｎ＋Ｂａｋｅｒ
らは、糖化蛋白質がアルカリ溶液中で発現するケトアミ
ンの還元力を利用した新しい糖化蛋白質の簡易比色定量
法を開発し、該方法により測定される血漿或いは血清中
の糖化蛋白質をフルクトサミンと命名したｅ　　（Ｒｏ
ｇｅｒ　Ｎ、Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｐａｔｒｉｃｉａ＾、Ｍ
ｅｔｃａｌｆ、　Ｊｏｈｎ　Ｒ，Ｂａｋｅｒ　：　Ｆｒ
ｕ−ｃｔｏｓａｍｉｎｅ　；ａ　　ｎｅｗ　　ａｐｐｒ
ｏａｃｈ　　ｔｏ　　ｔｈｅ　　ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ
　　ｏｆ　　ｓｅｒｕｍｇｌｙｃｏｓｙｌｐｒｏｔｅｉ
ｎ、　Ａｎ　１ｎｄｅｘ　ｏｆ　ｄｅａｂｅＬｉｃ　ｃ
ｏｎｔｒｏｌ、。

Ｃ１１ｎｔｃａ　　Ｃ１１ｎｔｃａ　Ａｃｔａ　１２７
　（１９８２）　８７−９５　）。

血漿或いは血清は多くの蛋白質の混合物として構成され
ているが、その主成分であるアルブミンの寿命がヘモグ
ロビンの寿命より短い（約４０日といわれている）ため
、フルクトサミン濃度はＨｂＡ、Ｑ　、ＨｂＡ、に比べ
、より現在に近い過去の平均血糖値を反映するものとさ
れ、次第に普及されようとしている状況である。ただし
、フルクトサミンは血漿或いは血清中蛋白を起源とする
糖化蛋白であり、赤血球中成分ではないので、本発明の
方法を通用することができない。すなわち、過去の血糖
変動を変化動態として捕えることはできない。

赤血球中成分は赤血球という細胞膜でその内外を仕切ら
れた細胞中に存在する成分であり、赤血球の加齢に従っ
た細胞比重の違いにより分離することが可能である。従
って、赤血球中成分が蓄積する血中成分の変動「ｗｉ歴
」をになう物質は、赤血球の細胞加齢の順に分けること
が可能であり、該物質の一種の「経時変化」を把握する
ことが可能である。すなわち、平均値ではなく、経時変
化としてのより情報量の豊かな測定値群を入手すること
ができるため、病態或いは健康状態をダイナミックに捕
えることが可能になる。ＨｂＡＩＱ。

Ｈｂ　Ａ　、は、赤血球中に多量に存在するヘモグロビ
ンを起源とする糖化蛋白であり、本発明の方法が通用で
きる好適例である。さらに、本発明の方法及び装置は、
この他にも赤血球膜の性状、赤血球中の各種酵素の量や
活性値、或いはヘモグロビンの酸素親和性などの赤血球
加齢に伴う変化の調査に通用することが可能であり、貴
重な医療情報を提供できる可能性に富んでいる。

次に赤血球をその加齢に従い分離する技術を中心に従来
技術を概観する。赤血球はその加齢に従って表面膜の性
状が変化し、またその細胞比重が増大することはよく知
られている。まず、赤血球膜性状の変化を利用した細分
画法には向流分配法があるが、分離に長時間を要するこ
と、低温分離が不可能なことなどから、臨床現場への適
用は困難とされている。

一方、加齢に従った赤血球比重の増大を利用した細分画
法は基本的に遠心分離法であり、遠心に際し、比重の異
なる分離剤を試料血液と共存させる方法が用いられてい
る。遠心の結果、既知比重の分離剤の位置に対し、より
比重の大きな赤血球は分離剤の下部に位置し、より比重
の小である赤血球は、分離剤の上部に位置するので、赤
血球を分離することができる。この方法には、分離剤の
比重を連続的に変える場合と、不連続に変える場合とが
ある。また、分離剤の比重を不連続に変える場合には、
異なる比重の分離液を重層して使用する場合と異なる比
重の分離液を各々分注された同一試料に各々添加し、各
々の分注された試料を添加された分離液の上下に分離す
る場合がある。

いずれの方法を採るにしても、分離剤が必要であり、分
離された試料の分画は、ピペットを使用して分取される
。分離剤には赤血球に対し悪影響を及ぼさないこと、わ
ずかに比重の異なる赤血球を分離するに必要な精度の比
重液が安定に調製できること、分離剤の溶液としての物
理化学的性状（浸透圧、ｐＨ１粘性等）が血清に近いこ
となどが要求される。実際に使用されている分離液とし
ては、ウシ血清アルブミン、フィコール、アラビアゴム
、デキストラン、フタル酸エステルなどがある。

このような分離剤を用いた各種の密度勾配遠心分離法は
、次のような特殊検査、或いは研究目的に用いられて来
ている。例えば、Ｄ、ＤＡＮＯＮらは、２０種の０．０
０４ずつ比重の異なるフタル酸エステルを分離剤として
用い、赤血球を比重に従って分離した。さらに家兎に５
’Ｆｅを注入し、生成する赤血球を放射性同位元素で標
識し、該放射性同位元素が次第に高比重画分に移行する
ことにより、赤血球の比重分布が該赤血球の加齢分布に
対応することを示している。　　（Ｄａｖｉｄ　Ｄａｎ
ｏｎ、ａｎｄ　ＹｅｈｕｄａＭａｒｉｋｏｖｓｋｙ　：
　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｒｉ　ｏｆ　ｄｅｎｓｉｔ
ｙ　ｄｉｓｔｒｉ−ｂｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒｅｄ　ｃｅ
ｌｌ　　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ　、Ｊ、Ｌａｂ、　　＆
Ｃｌ１ｎ、Ｍｅｄ、、６４　（１９６４）　　６６８−
６７４　）　。

本発明の発明者らは（Ｋｏｊｉ　Ｎａｋａｓｈｉｍａ、
　ＳｕｓｕｍｕＯｄａ、　ａｎｄ　５ｈｉｒｏ　Ｍｉｗ
ａ　：　Ｒｅｄ　ｃｅｌｌ　ｄｅｎｃｉｔｙ　１ｎｖａ
ｒｉｏｕｓ　ｂｌｏｏｄ　ｄｉＳｏｒｄｅｒｓ、Ｊ、Ｌ
ａｈ、Ｃ１１ｎ、Ｍｅｄ、、Ｂ；（１９７５）　２９７
−３０２　）　、ジメチルフタｌ／−）（比重１．１８
９　＞　とジブチルフタレート（比重］、、０４２　）
を混合し、高比重液Ａ（男性用：比重１．１０４　、女
性用：比ｉ１．．１０２　）　、低比重液Ｂ（男性用：
比重１．０９６　、女性用：比重１．０９４　＞を調製
し、種々の貧血患者について、Ａ液よ・り比重の大きい
赤血球画分くＤ画分）、Ａ液とＢ液にはさまれる赤血球
画分（Ｉ画分）、Ｂ液より比重の小さい赤血球画分くし
画分）に分離したゆその結果、貧血の病棟によりＤ、■
、■７の各画分の比率に特徴的な差異が表れることを発
見した。さらに、鉄欠乏性貧血においては、その治療過
程において■）、■、［７の画分比率が次第に正常化す
る様子が見られた。

Ｊａｍｅｓ、Ｆ、Ｆｉｔｚｇｉｌｌｂｏｎｓ　らは（Ｊ
ａｍｅｓ　Ｆ、Ｆｉｔｚｇｉｂｂｏｎｓ、　Ｒｏｂｅｒ
ｔ　Ｄ、Ｋｏｌｅｒ、　ａｎｄ　Ｒｉｃｈａｒｄ　Ｔ、
Ｊｏｎｅｓ：　Ｒｅｄ　Ｃｅ１ｌ　Ａｇｅ−Ｒｅｌａｔ
ｅｄ　Ｃｈａｎｇｅｓ　ｏｆ　Ｈｅ＋ｍｏｇｌｏｌ）ｉ
ｎｓＡ　　１，１４１）ａｎｄ　　Ａ　　１ｃ　　ｉｎ
　　Ｎｏｒｍａｌ　　ａｎｄ　　ＤｉａｂｅｔｉｃＳｕ
ｂｊｅｃｔｓ、　Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、、　５
８　（１９７６）　８２０−８２４　）分離剤として２
８．５％デキストラン溶液を使用することにより、全赤
血球の１０〜１５％に当たる比重の小さい（幼若）赤血
球層を分離し、分離剤として３０．５％デキス１−ラン
溶液を使用することにより、全血球の１０＝１５％に当
たる比重の大きいく老化）赤血球層を分離して、各々の
画分中の糖化ヘモグロビン（Ｈｂ　Ａ　＋ａ＋ｂ　及び
ＨｂＡ、（）を測定した。この結果、どちらの画分中の
糖化ヘモグロビン値も全血中の糖化ヘモグロビン同様に
、健常者と糖尿病患者では有意の差があることが請認さ
れ、また糖尿病患者の血糖値管理の良否が測定値に反映
される可能性があることが示唆されている。

以上詳述したように、医療の現場において赤血球を加齢
に従って分離・分画して検査することは極めて稀であり
、特殊検査または研究目的に限られている。その主原因
は分離・分画に経験と手間が必要であり、全く新しい臨
床知見が期待されるにもかかわらず、その手法の発展が
阻害されている現状である。

［発明が解決しようとする課題］ 」二連のように、赤血球を加齢に従い分離し、該赤血球
生成分を測定する手法は、多くの貴重な医療上の情報を
提供する可能性を内蔵しているが、現状では、はどんど
研究目的に用いられているに過ぎない。赤血球の分離・
分画に専門的な経験と長時間の手間が必要である点が、
この手法の一般的普及を妨げている阻害要因であると考
えられる。

本発明の課題は、これら阻害要因を取り除き１、簡便で
精度の良い赤血球の分離・分画方法と手段を確立し、上
記手法を研究目的のみでなく、臨床現場の検査等にも通
用できる手法とすることにある。

分離・分画技術の中心をなしている問題は、第一に分離
剤を使う点にある。第二に得られた画分の分取に、ピペ
ットを使用する点にある。第三に第一、第二の項目の結
果として、大型の遠心分離機を使用しなければならない
点にあると考えられる。以下、これらの点について詳述
する。

まず、分離剤の鋼製、管理の問題がある。密度勾配法に
より健常人の赤血球を比重に従い分離し配列した場合、
平均比旧約１６１に対し、最」二層と最下層の比重差は
通常ｏ、ｏｔｏ程度である。また、健常人の男女で平均
的に約００００２の比重差があり、男性の赤血球の比重
の方が大である。このような関係を考慮すれば、例えば
全赤血球層の１０％の容積比をもつ最も比重の小さい赤
血球層を分取するためには、最も表面に来るべき赤血球
（新生赤血球）より０．００１だけ比重の大きい分離剤
を調製する必要があり、その分離液の比重が０．０００
１の誤差をもてば全赤血球層の１０％の容積であるべき
赤血球層は全血球層の（１０±１）％となり、相対的に
１０％の誤差を持つことになる。

しかし、実際にはこのような精度を臨床現場で実現する
のは極めて困難である。分取する赤血球層が二層以上の
場合には、互いに比重の異なる複数種の分離液を調製し
なければならないので、−層の困難を生じる。また上記
のように、男女で赤血球比重には約０．０２の差がある
ので、男性用と女性用の分離液を別々に調製する必要が
ある。さらに、臨床現場では検査対象者は当然患者であ
り、赤血球比重が正常範囲から大きくはずれる例は、日
常経験するところである。例えば、健常人であれば全赤
血球層の１０％を占める最上層を形成できるような分離
剤であっても、鉄欠乏性貧血患者の赤血球に使用した場
合には、その５０％近くが分離剤の上側に層を形成する
ことが起こり得る。従って、このような患者の履歴を調
査するためには、患者毎に分離剤系列を鋼製する必要が
生じ、極めて繁雑な状況に陥ってしまう。さらに、分離
剤には経時的な比重の変化や、使用する材料によっては
変質の問題があり、定期的な再調製、比重の確認、保管
等の管理の問題が生じ、分離剤の種類が多数となれば、
実際的に分離剤の調製・管理は不可能となりかねない。

次に、分取すべき画分の全赤血球層に対する容積比率の
問題と、分取すべき画分数の問題がある。

これらの問題は最終の測定結果が提供する情報の質と量
に対応する。該画分の全赤血球層に対する容積比率が小
さければ小さい程、「分離能」の良好な「履歴情報」を
提供することが可能である。

分取した画分数が多ければ多い程、「正確度」の高い「
履歴情報」を与えることが可能である。これらの要求を
分離剤で実現するには、できるだけ比重の接近した多（
の分離剤を鋼製し、使用することが必要となる。これは
、上記の第一の問題点を精度の厳しさと調製すべき分離
剤をさらに多くするという繁雑さを極めて高度にする問
題に加えて、新たに分離剤原料の問題ないしは赤血球層
の分画操作を極めて困難にするという別の問題も生じる
。すなわち、分離剤を重層使用する方向で、該要求を解
決しようとすれば、異なる比重の分離剤は互いに拡散し
合ってはならないので、分離剤材質の選択及び処方の問
題を解決しなければならない。また、同質原料の混合比
のみを変えて調製した分離剤を使用する方向で該問題を
解決しようとすれば、分離剤添加の手順を工夫しなけれ
ばならない。

また、分離剤による赤血球の汚染及び損傷の問題がある
。分離剤は、赤血球と触れ、入れ換わりつつ、該分離剤
の比重と等しい比重の赤血球の位置で静止する。従って
、分離剤は必ず赤血球と接触するので、これを損傷し難
い原料を選定しなければならない。しかし、そのような
原料で分離剤を調製した場合でも、わずかな浸透圧の違
いで、赤血球比重に影響を与えてしまうことは避けられ
ない。また、分離剤はどうしても赤血球の画分に持ち込
まれるので、画分の測定に影響を及ぼす場合は、複数回
の洗浄によりこれを除去しなければならない。さらにそ
の洗浄液が該赤血球を損傷し、或いは測定対象成分に影
響することは避けなければならない。

最後に、従来の方法では、通常は分離した画分の採取に
ピペットを用いる点に注目しなければならない。このよ
うなピペットは吸口を細く絞っであるのが通例であるが
、それにもかかわらず、これを手操作する場合、赤血球
と共に分離剤も吸い取ることは避けられない。むしろ、
分離剤は赤血球層の隣接する画分を明確に切り離し、分
取の際のピペット操作によって、該隣接画分が混入する
のを回避するのが目的であるので、当然分離剤は赤血堺
と共に吸い取られるのである。従って、従来のこの方法
は、分離剤とピペット操作が前提であり、遠心分離機に
かける液体量は多量となるのは避けられない。また、遠
心操作は、１０．０００　Ｇ程度以上の遠心力で行なう
必要があり、必然的に高価な大型遠心分離機が必要とな
る。

以上述べたように、従来の密度勾配法は煩雑で、しかも
分画精度が不十分であり、高価な遠心分離機が必要であ
るなどの状況のため、血中成分の変動情報の赤血球成分
に「記憶された履歴」を調査する方法として有効に適用
できず、ますます厳しくなる医療の要求を満足させるこ
とかできなかった。

［課題を解決するための手段］ そこで本発明者は、−］二記諸点に温み鋭意研究した結
果本発明を成し得たのであり、その特徴とするところは
、第一に、血中成分の履歴を比重に従い連続的に形成さ
れた赤血球層から分画された各画分中の赤血球生成分を
測定することにより調査する方法において、該赤血球層
を複数の画分に分画・分取する点にある。この画分は、
容積比率約で１０％以下であることが好まし７く、さら
に好ましくは５％以下とする。

第二に、直管状分離容器中に比重に従い形成させた赤血
球層の全長を、該全長を計測することにより、該赤血球
層全長の１／ｒｉ（ｎは好ましくは１０以上）の分画位
置を直接設定できる装置として、歯車機構によるものを
提供する点にある。

第三に、分離容器から測定対象画分を分取する場合にお
いて、当該画分の露出させた液面に曲線状細管の先端部
（該先端部の試料吸引口面が分離容器の側面に略平行で
あることが好ましい）を挿入することによって画分の一
部を吸引・採取する点にある。

尚、比重に従い赤血球層を形成させる分離容器として、
本発明者による実用新案（実願昭６３５５６５６）にて
考案された分離容器を使用することも好ましい。

以下、本発明の内容について詳細に説明する。

まず、本発明で言う「血中成分」とは、血管中を循環す
る体液としての血液に含まれるいかなる成分をも指し、
分子、イオン、細胞膜、細胞等血液中に存在するどのよ
うな形態の物質であってもかまわない。また、その起源
が該血液本来の構成物質であってもかまわないのは勿論
、体外からの外来物質、例えば細菌、ヴイー・ルス或い
は薬物であってもかまわない。

また「赤血球生成分」とは、血液中主成分の一つである
赤血球に会まれでいるいかなる成分をも指し、分子、イ
オン、細胞膜等赤血球中に存在′１−るどのよ・うな形
態の物質であってもかまわない。

また、その起源が該赤血球本来の構成物質であっても、
赤血球層全長からの外来物質１、例Ａばヴイールス或い
は薬物であってもかまわない。

次に、「血中成分の履歴」を［赤血球生成分を測定する
ことによりｍ査する」とは、上述した意味における血液
中のいずれかの成分の過大の変動情報−一即ち該血中成
分の履歴−一一−−−−−毫、該血液中の一成分である
赤血球が経時的に懇知ｊ７つつ老化した結果、現在数血
中成分の履歴に対応して該赤血球の何れかの成分が結末
的に持つに至った、物質量或いは活性値或いは特性値を
推定することにより、さかのぼって該血中成分の変動情
報、すなわち履歴を推察できる情報を提供することを言
う。

一方、医療の焦点は、治療から予防−・移っており、老
人人口比率の増大により、その傾向に拍車がかかってい
る。本発明（１，ｉ、そのような医療−トの傾向に応じ
られる好適な手段を提供できるものであると考える。例
えば、糖尿病においては採血条件によらず安定な診断指
標と１７で糖化ヘモグロビン量が利用されてきた。さら
に近年、」−述のフルク［・サミン量がより近過去の血
値情報を反映する指標として導入されている状況である
。糖化ヘモグロビンは過去２−・・３ケ月の血糖値を反
映し、フルクトジ・ミンは過去２〜３週間の血糖値を反
映しているといわれており、医を束子の要求の傾向を具
体的に示すものであろう。

しかしながら、Ｘ４　ｌ）Ａ　ｌｃ　　もフルク１−サ
ミンも過去の血糖値の累積効用を示す情報であり、−回
の測定で、血糖値の動態を把握４′ることはできない。

本発明の方法を赤血球中のＨｂ　Ａ　、Ｃに通用すれば
、−回の測定で過去１２０目間（赤血球の寿命の期間）
の血糖値の動態を反映したＨｂＡ、（。

値のデータ群を入手することが可能であり、その動向を
見て、予防的な医療が実施可能になると考えられる。該
動向を示すデータの分解能は、赤血床層全長に対する各
画分の容積比率に依存し、小さい程分解能は向上する。

例えば、該容積比率が１０％の場合、平均的に表現すれ
ば、最も比重の小さい第１ｉ！ｉ分は最近過去約１２日
間に生成された赤血球を含み、次の第２画分以降も、各
々約１２日間ずつ過去にさがのぼった期間に生成された
赤血球を含むこととなる。

従って、第１画分について測定して得られるＨｂＡＩｃ
値は近過去約１２日間の血糖値変動を反映したものであ
り、第２画分について得られるＨｂＡｌ（、値は近過去
約２４日間の血糖値変動を反映したものである。第３画
分以下の画分についても同様である。

このように、比Ｍ（加齢）に従って形成した赤血球層に
対し、容積比約１０％以下の画分に分画・分取し、該画
分中のＨｂＡ、ｃ値を測定することにより、約１２日を
分解単位とする近過去の血糖値変動を反映した情報を提
供することができる。

この情報により、隔週ごとに訪れる糖尿病患者の治療と
指導を予防的に実施することが可能となる。

さらに、赤血球層の約５％以下の容積比率の画分に分画
・分取した場合には、約６日を分解単位とする近過去の
血糖値変動を反映した情報を提供することができ、この
情報により、さらにきめ細かい治療と患者指導が可能と
なる。特に重症糖尿病患者や糖尿病妊婦の場合には、こ
のような迅速な病態情報が強く望まれている。

全画分中の特定の１個または複数個の画分を測定対象と
することにより、医療上意義のある情報を提供すること
ができる場合があり、迅速性、経済面から有利である。

例えば、測定対象成分がＩ（ｂＡＩＱ　の場合、特定の
１個の画分が最も比重の小さい第１画分である場合であ
って、赤血球層に対する容積比率が１０％である場合に
おいては、該第１画分は近過去約１２日間の血糖値変動
を反映した情報を提供し、該容積比率が５％である場合
においては、該第１画分は近過去約６日間の血糖値変動
を反映した情報を提供することができる。

この情報は、平均的な糖化ヘモグロビン量やフルクトサ
ミンが反映する過去の血糖値変動の情報に比べ格段に短
期の情報を反映しており、まさに医療の求めている速い
応答の情報と言えよう。特定の画分として第１画分の他
に最も比重の大きい画分（各画分の容積比率が１０％の
ときには第１０画分、５％のときには第２０画分）を利
用することができる。この場合、第１画分のＨｂ　Ａ　
、（。

値は、上記のように最も近過去の血糖情報を反映し、最
も比重の大きい画分のＨｂ　Ａ　、ｃ　値は赤血球寿命
全期間（約１２０日）の血糖情報を反映する。従って、
これら２画分のＨｂ　Ａ　、Ｃ値の差又は比は過去１２
０日の血糖値に対し、最近１〜２週間の血糖値は高いの
か低いのか即ち糖尿病の動態をうかがい知るひとつの指
標を提供できる。つまり、適切な２画分のＨｂ　Ａ　、
（、の測定により、従来の方法では得られなかった質の
異なる情報を提供することができる。

以上は、測定対象成分としてＨｂＡＩｃを例に採ったが
、他の赤血球中成分であっても、測定対象とする画分の
数および画分番号の特定はすべての画分を測定した種々
の臨床例に関するデータ、当該対象成分の赤血球中にお
ける挙動あるいは特性を考慮し、必要とする情報は何か
によって、決定することができる。

比重に従い赤血球層を形成し、必要とする画分を分取す
る方法として、従来の密度勾配法を利用することは、実
用上不可能である点は、［従来の技術］の項で上述した
とおりである。この課題を解決するために本発明におい
ては、密度勾配法で前提とする二点について根本的な変
更を加えた。

第−点は、分離剤を使用せず、赤血球のもつ変形能を利
用できたこと、即ち赤血球そのものに分離剤の役割を負
わせることができたこと、第二点はピペットを使用せず
、専用の画分採取装置を開発したことである。

分離剤を使用しないため、遠心分離の結果得られた赤血
球層は外見上何の仕切り、もない状態であり、疾病、男
女差１個人差にかかわらず該被検者の赤血球層々の比重
（即ち加齢）の順序に配列される。従って、細い直管状
分離容器に該赤血球層を形成させた場合、必要に応じて
好適な分画長を決定し、各々の分画を採取し、測定にか
けることができる。あるいは、本発明者の考案になる実
用新案（実願昭６３−５５６５６）に記述した分離部位
を１個又は複数個持つ分離容器を使用し、測定にかける
ことができる。このように、分離剤を使用しないことに
より、採取すべき画分の分画位置及び分画の大きさの決
定に、大幅な柔軟性が生まれる。

分画を採取するための実用上の装置として、細い（内径
約０．２〜ｂ 成した赤血球層の全長に対し、１　／　ｎ長の画分位置
を決定する装置が便利である。ｎ−ｔｏとすれば容積比
率１０％の、ｎ−２０とすれば容積比率５％の画分位置
を決定することができる。本装置は、１／ｎ長の画分位
置を決定する手段であるが、原理的にはｍ　／　ｎ長の
画分位置を決定する機構も容易に実現できる。どちらを
選択するかは、画分分取の方法と経済性、簡便さにより
決定すればよい。

１／ｎ、ｍ／ｎ位置の決定装置は歯数比が１／ｎ、ｍ／
ｎになる歯車を同一軸に固定することにより、容易に実
現することが可能である。１／ｎ位置決定装置において
、該１／ｎ位置に、切断機構を備えれば、位置決定と同
時に分離容器を切断し、必要とする画分を採取できるの
で実用上便利である。分離容器の材質としては、ガラス
、プラスチック等が使用に耐えるが、切断の容易さから
プラスチックの方が好適である。

画分を採取する一つの方法としては、上記の１／ｎ位置
に切断機構を有する位置決定装置にて、分離容器を次々
に切断し、切断された断片を各々試験管、サンプル容器
等に採取すればよい。分離容器は内径が小さく、遠心さ
れ加圧された赤血球層の粘性が高いので、分離容器断片
から赤血球がこぼれ出ることはなく扱いが容易である。

測定に際しては、分取した赤血球を適切な溶媒で必要と
する濃度に希釈しなければならない。このため、断片を
収容した試験管又はサンプル容器に適量の溶媒を添加し
、分離容器断片内から溶出する。しかし、各画分中の赤
血球は、非常に密に充填されていて、溶出され難いので
、この溶出操作は、分画対象の血液試料の数が増加し分
画する画分数が増加するとともに、作業量として飛曜的
に増大する。この難点を解決する具体的手段としてシリ
ンジと密封状態で接続した曲線状細管を使用するのが簡
便である。

該細管は、外径約１ｍｍ以下（好ましくは外径約０．８
ｍｍ以下）の耐蝕性材料からなり、赤血球層内に一定量
さ該細管を挿入したとき、該細管の下端が分離容器の赤
血球露出面側の容器上端に当たるように曲線状に曲げら
れたものが好適である。実際の操作に当たっては、まず
赤血球層の最上層面が露出するよう分離管を切断する。

次に、該細管を挿入し、該細管の曲線部の下端が分離容
器上端に当たる一定位置で止め、シリンジを一定容量吸
引するためのスタートボタンを押す。この操作で必要と
する一定量の赤血球が吸引される。次に、該赤血球と適
切な溶媒の適量とを同時に吐出することにより、容易に
必要とする希釈検体を調製することが可能である。

次に、切断機構を有する１／ｎ位置決定装置により赤血
球層の１　／　ｎ長を切断する。残された分離管の露出
された液面から上記操作と同様に一定量の赤血球を吸引
後、一定量の溶媒と共に吐出し、希釈する。以上の操作
を続けることにより、必要な画分を採取し、好適濃度に
希釈さた検体を得ることができる。

なお、本発明の曲線状細管において、その試料吸引口が
張る面（開口面）は分離容器の側面に略並行であること
が望ましい。即ち、上記操作で赤血球を吸引するに際し
、吸引される赤血球は開口面の前方付近に存在する赤血
球が大部分を占めるので、開口面が分離容器の側面に略
並行であることにより、採取吸引する赤血球層が狭くな
り、分画精度が向上する。

以上の手段により、従来の密度勾配法が持つ全ての問題
点を解消し、医療の求める厳しい要求に適合し得る情報
を提供する方法が確立された。

［作用］ 本発明においては、赤血球加齢に対応して比重に従い連
続的に配列した赤血球層に対し、そのｌ／ｎ長の分画位
置を決定する装置および該画分からその一部の赤血球を
分離する手段を用いることにより、容積比約１０％以下
あるいは５％以下の赤血球画分を簡便に精度よく分取す
ることが可能となった。

さらに、各画分中の赤血球中成分を測定することにより
、該赤血球中成分を赤血球加齢に対する関数として把握
することが可能となり、結局血中成分の変動即ち履歴を
、赤血球中成分に残された影響として把握することが可
能となる。

［実施例］ 以下、本発明の方法および該方法を実行するための装置
について、実施例に基づいて説明する。

皿上　比重差により１６分画した、赤血球中の糖化ヘモ
グロビンの測定 第１図は、本発明方法に用いる遠心分離用分離容器１の
一例を示す。分離部位３は、硬質ポリエチレンからなる
内１２ｍｍ、外径３１１１１のチューブであり、一端が
閉じられている。液溜部２は、ポリエチレンを材質とす
る成形品である。液溜部２と分離部位３は第１図のよう
にしっかり挿入固定されている。

赤血球の分画に際しては、まずヘパリン血０．５ｍｌを
液溜部２に入れ、全体を２０００ｒｐｒｒｚ？５分間遠
心し、赤血球を分離部位３に閉じ込める。

次に、余分の赤血球とパフフィーコートおよび血漿の入
った液溜部２を外す。赤血球が充填された分離部位３を
、該分離部位３がかけられるようロータのみぞを拡大し
たヘマトクリット用遠心分離機にか、け、１２．００Ｏ
ｒ　ｐ　ｍにて１５分間遠心した。

この操作により、分離部位ｓ内に充填された前記赤血球
はさらに血漿部と赤血球層に分離されるので、その境界
（ＸＩ−Ｘ、線）で切断した。このｘｌ−ｘ、線から分
離部位３の閉止端３ａまでの長さが赤血球層全長となる
。

この露出された液面（ＸＩ−Ｘ、線面）より、実施例４
に記述する曲線状細管１３の先端部を挿入し、該曲線状
細管１３の末端部１７と密閉して接続されたシリンジに
て赤血球を１．３μｌ吸引し、これを溶血試薬と共に測
定用サンプルカップに吐出して、測定に適合する第１画
分の希釈検体を得た。さらに第２画分を得るためには、
上記血漿部と赤血球の境界で切断された分離部位３の閉
じられた方の断片を実施例３に記述する切断機構付き１
　／　ｎ位置決定装置の分離容器セット位置４に、露出
された液面が先端正位置５に接するようセットし、切断
位置６に降下するべく取り付けられている鋭利な刃物に
て長さＳ−１／１６だけ（Ｘ２Ｘ２線）切断した。これ
によって、第１画分の断片は切り捨てられ、第２画分の
液面が露出されたので、前記のように曲線状細管１３の
先端部を挿入し、１．３μｌの赤血球を吸引後溶血試薬
と共に吐出して、第２画分の希釈検体を得た。第３画分
以降の希釈検体も同操作を繰返すことによって得た。

以上の操作で得られた第１画分〜第１６画分までの糖化
ヘモグロビンを専用測定装置（株式会社京都第−科学製
ＨＡ−８１２１）にて測定した。

測定結果を第２図に示した。縦軸は測定された糖化ヘモ
グロビン（ｌ（ｂＡ＋（、％）であり、横軸は画分番号
である。測定点・−・・・・−・は、本発明の方法およ
び手段による赤血球分画法による希釈検体を測定した結
果得られたものである。Ｎｏｒｍａｌで表示した測定点
は、健常人より採血された赤血球、ＤＭで表示した測定
点は糖尿病患者より採血された赤血球を試料とした測定
結果を示している。なお測定点０　　０は、本発明の発
明者らの前記［従来の技術］の項で引用した文献（Ｎａ
ｋａｓｈｉｍａに、　ｅｔ　ａｌ、　、ｙ、　Ｌａｂ、
　Ｃｌ１ｎ、　Ｍｅｄ、、　８２　（１９７５）　２９
７−３０２）で使用した分離剤を２種類添加し、遠心分
離した後、本発明の手段を利用して、上記同様に画分採
取・希釈し得たデータである０分離剤が静止した位置の
赤血球のデータは分離剤と赤血球が混合し、分離困難で
あるため欠落している。

これら２方法で得たデータが第２図に示されるように、
極めて良く一致していることから、特殊な分離剤を用い
なくても、赤血球の持つ変形能により、赤血球そのもの
が比重液の役割を果たし、互いに個々の比重に合った部
位まで移動したこ、とが確認された。さらに、これら画
分において網状赤血球は第１画分（Ｆ　Ｉ）に全血の１
０倍以上集まり、第２画分以降で著減し、第５画分〜第
１６画分では殆どＯであったこと、ピルビン酸キナーゼ
活性は少量の白血球のコンタミのある第１画分で４．５
５ＩＵ／ｇＨｂと高いのを除き、赤血球のコンタミのな
い第２画分（３，０４Ｉ　Ｕ／ｇＨｂ）から第１６画分
（１，３８Ｉ　Ｕ／ｇ　Ｈｂ）まで直線的に低下してい
たことから、赤血球は本発明の方法と手段により加齢順
に分画されたと考えられる。

誹した 実施例１の方法と装置を適用し、分離・分画した赤血球
及び全血について、ＨｂＡ、ｃを測定した。さらに同じ
血液試料について、別途血漿フルクトサミンを測定した
。測定結果を整理したデータを第１表に示す。

第１表において、ドック受診者５５人は年齢３６〜７９
才、平均年齢５９才であり、ＧＴＴが性状パターンを示
し、糖代謝異常が見られなかった。

ＧＴＴ境界型３０人は年齢２８〜７４才、平均年齢５６
オであり、個々に見ると多くの例が正常パターンを示し
たが、未分画赤血球ＷとＬのＨｂＡＨｌ、　、フルクト
サミンが正常で、Ｍ２とＤのＨｂＡ、Ｏが高値を示す例
が見られ、し、フルクトサミンと異なり、Ｍ２、Ｄでは
老化赤血球が多いので、より長い期間の叫糖値を反映し
、耐糖能が正常でない境界型において、過去における過
食の繰り返しを反映しているものと考えられた。糖尿病
患者３８人は、年齢３５〜８０才、平均年齢６０才であ
り、個々に見ると新しくドックで発見された患者はＬ画
分のＨｂ　Ａ　Ｉ（、値が相対的に高く、治療によりＬ
のＨｂＡｌご値がフルクトサミン値より早く正常化した
。コントロール不良例では全ての測定値が高かった。特
にインスリン治療例において、一応、尿糖値、血糖値か
ら見てコントロールされたと考えられる症例で、ＬのＨ
ｂ　Ａ　ｌ（値が正常化しているにもかかわらず、フル
クトサミン及びＭ　１、Ｍ　２、Ｄ及び未分画赤血球Ｗ
のＩ（ｂＡ、　　値が高値を示した例が見られた（第１
図のＤＭ参照）。

第２表には、Ｌ、Ｍｌ、Ｍ２、Ｄの各画分及び未分画赤
血球ＷＯＨｂＡｌｃ値とフルクトサミンとの相関係数を
示した。Ｌ画分の相関係数が他の画分との相関係数に比
べて小さいことが上記インスリン治療例において、Ｌ画
分中ＨｂＡｌｃがフルクトサミンや他の画分中ＨｂＡｌ
ｃより早く正常化した件とともに注目に値する。

皿主　切断機構付き１　／　ｎ位置決定装置１／ｎ位置
決定装置の実施例として切断機構付き１／ｎ位置決定装
置を第３図にもとづいて説明する。

まず、血漿部と赤血球層の境界で切断された分離部位３
の閉じられた方の断片を分離管セット位置４に露出され
た液面が先端停止位置５に接するようにセットする。次
に赤血球層長位置設定子８を左右に動かせて、赤血球眉
墨設定位置７を赤血第 表 第 表 球層の液面位置に合わせる。この操作レバー（図示略）
は、大ギヤ９と小ギヤ１０の共通の軸に取りつけられて
おり、該操作レバーを左右に動かすことにより、その回
転角だけ該軸すなわち大ギヤ９と小ギヤ１０が回転させ
られる。

大ギヤ９は、並進ギヤ１１と噛み合っており、該並進ギ
ヤ１１は、大ギヤ９の回転角の長さｌだけ移動する。一
方小ギャ１０は他の並進ギヤ１２と噛み合っており、該
他の並進ギヤ１２は、小ギヤ１０の回転分の長さＳだけ
移動する。従って、並進ギヤ１１の移動路Ｆ＠βと他の
並進ギヤ１２の移動路１ｉＩＩＳとの比は、大ギヤ９の
歯数Ｚ、と小ギヤ１０の歯数２２の比と等しくなる。即
ち、この比をｎとすれば、 ｎ　＝　１２　／　Ｓ　＝　Ｚ　ｒ　／　Ｚ　２が成り
立つ。

ゆえに、この位置決定装置において赤血球層星位置決定
子８を切断位置（或いは１／ｎ位置）６から長さ４の位
置に設定すれば、先端止め位置５は、該切断位置６から
赤血球層星位置決定子８とは逆方向Ｓの長さの位置に設
定され、 Ｓ　＝　ｌ　／　ｎ の長さとなる。

即ち、大ギヤ９と小ギヤ１０の歯数比ｎｗＺ１／　Ｚ　
２を適切に選定することにより、ｎを任意の整数に設定
すれば、赤血球層全長βの位置に赤血球眉墨設定位置７
を合わせることによりその全長の１　／　ｎの長さの位
置を決定することができ、切断機構により、ｌ　／　ｎ
長だけ切断することが可能となる。以上の操作を繰り返
すことにより、赤血球層はその全長をｎ等分することが
できる。

桝土　赤血球画分を吸引・採取する曲線状細管比重に従
い連続的に赤血球層を形成させた直細管状分離容器から
測定対象画分を分取するに際し使用する、画分の一部を
吸引・採取する画分採取手段の実施例を第４図〜第６図
にもとづいて説明する。

測定対象画分を吸引・採取するに際し、該対象画分の１
画分だけ表面に近い画分は、予め切断し、測定対象画分
の液面を露出させる。次に、該液面に曲線状細管１３を
挿入する。該曲線状細管１３は外径１ｍｍ以下（好まし
くは０．８＋＋ｓ＋以下）の非反応性材料により製作さ
れ、第４図〜第６図のように先端から１〜５＋＋＋＋＋
位の部位で「り」の字状に成型するのが取り扱いに便利
であるばかりでなく、分取深さを安定化できる。すなわ
ち、「＜」の字形の開き角は１００°〜１３０°　（好
ましくは１２０°）が最も使用しやすく、「＜」の字形
の折れ曲がり点付近を分離容器１３の上端面との接触点
１５とすることにより、常に画分の一部を吸収・採取す
る深さを一定に管理することが容易となる。さらに、該
曲線状細管１３の先端に位置する試料吸引口１６が張る
面は、分離容器１３の側壁に路面していることが望まし
く、それにより吸引赤血球が該試料吸引口１６近傍吃特
に下方から補給されることが防止でき、対象画分の分画
精度が向上する。

このような曲線状細管１３を赤血球層の表面に挿入した
後、該曲線状細管１３の末端部１７と密封して接続され
たシリンジにて一定容積（実施例１の場合は１．３μ處
）を吸引する。さらに必要に応じて、赤血球の希釈液又
は、熔血試薬を別のシリンジに計量し、切り換えバルブ
を経由して、該曲線状細管に採取した赤血球と共に吐出
することにより、該赤血球を望ましい濃度に希釈するこ
とは容易である。

［発明の効果］ 本発明により、赤血球の変形能を利用し、遠心分離法に
より比重に従い連続的に形成させた赤血球層を該赤血球
層の容積比率１０％以下、必要に応じて５％以下の画分
に分画し、各画分よりそれぞれ一定量の赤血球を分取で
きるので、■　汚染の無い分画精度の良好な画分が極め
て容易に分取できる。

■　必要に応じ、該画分を測定に好適な濃度に直ちに希
釈できる。

■　該赤血球画分中の特定の成分の量あるいは活性値あ
るいは特性値を測定することにより、該成分が受けて、
物質的変化として該成分中に「記憶」した血中成分の履
歴を調査することができる。

■　赤血球中成骨が糖化ヘモグロビンである場合には、
糖化ヘモグロビン濃度（ＨｂＡ＋ｃ）の赤血球画分に従
った変化は、赤血球が幼若である程ＨｂＡ、ｃが低く、
赤血球が老化すればする程ＨｂＡｌ（が高い傾向がある
が、この変動の巾や絶対値により、血中成分であるグル
コース（血糖）の変動の履歴をうかがい知ることができ
る。

■　測定対象画分の特定の１個または複数個に限った場
合でも、生成間もない幼若赤血球のみの「記憶」した血
中成分の履歴や該幼若赤血球の「記憶」と、老化赤血球
の「記憶」との比較、あるいは幼若赤血球の「記憶」、
と平均値を示す赤血球画分の「記憶」との比較は非常に
有益な医療上の情報を提供できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は分離容器の断面図、第２図は本発明方法と従来
の分離方法により分画した赤血球層の各画分ごとの糖化
ヘモグロビンの割合を示すグラフ、第３図は分離容器の
切断装置を示す側面図、第４図は曲線状細管を用いて赤
血球試料を分取する状態の断面図、第５図及び第６図は
夫々異なる曲線状細管を示す斜視図である。 １・・・・・・分離容器 ２・・・・・・液溜部 ３・・・・・・分離部位 ４・・・・・・分離容器のセット位置 ５・・・・・・先端正位置 ６・・・・・・切断位置 ７・・・・・・赤血球眉墨設定位置 ８・・・・・・赤血球層星位置設定子 ９・・・・・・大ギヤ １０・・・・・・小ギヤ １１・・・・・・並進ギヤ １２・・・・・・並進ギヤ １３・・・・・・曲線状細管 １４・・・・・・赤血球層 １５・・・・・・接触点 １６・・・・・・試料吸引口 １７・・・・・・曲線状細管末端

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、比重に従い連続的に赤血球層を形成し、該赤血球層
   を容積比率で十数％以下の画分に分割・分取し、該画分
   中の赤血球中成分を測定することを特徴とする血中成分
   の履歴を調査する方法。 ２、赤血球層に対する容積比率が５％以下の画分を測定
   することを特徴とする請求項１記載の血中成分の履歴を
   調査する方法。 ３、測定対象画分が特定の１個または複数個の画分であ
   る請求項１又は２記載の血中成分の履歴を調査する方法
   。 ４、赤血球中成分が糖化ヘモグロビンである請求項１、
   ２又は３記載の血中成分の履歴を調査する方法。 ５、比重に従い赤血球層を形成させた直細管状分離容器
   において、赤血球層全長を計測することにより、該赤血
   球層全長の１／ｎの長さの画分位置を直接設定できる歯
   車機構を備えたことを特徴とする分離容器の１／ｎ位置
   決定装置。 ６、位置決定装置が１／ｎ位置において切断機構を有す
   ることを特徴とする特許請求の範囲第５項記載の位置決
   定装置。 ７、比重に従い連続的に赤血球層を形成させた直細管状
   分離容器から測定対象画分を分取するに際し、当該画分
   の露出させた液面に曲線状細管の先端部を挿入すること
   によって画分の一部を吸引・採取することを特徴とする
   画分採取方法。 ８、挿入させる曲線状細管の先端部に位置する試料吸引
   口面が分離容器の側面に略並行であることを特徴とする
   特許請求の範囲第７項記載の画分採取方法。