JPH0228555A - 細胞機能測定装置および方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

［産業上の利用分野］ 本発明は、細胞浮遊液にずり応力を付加し、すり応力に
よる細胞の微少な応答を連続的に測定する装置に関する
。より詳しくは、本発明はたとえば、血小板浮遊液にず
り応力を付加し、すり応力による微少な血小板の凝集、
血小板の形状変化、血小板の放出反応などを連続的に測
定する装置に関し、血小板機能の変化を示す血小板無力
症、フォンウィルブランド（ｖａｎ　ＷＬｌｌｅｂｒａ
ｎｄ　）病などの先天的な疾患および心筋梗塞、血栓症
、動脈硬化店などの後天的な疾患の診断、治療に広く用
いられる。さらに、本発明による装置は、抗血小板作用
を目的とした薬剤の開発にも広く応用されるものである
。 ［従来の技術］ 細胞浮遊液を用いて、細胞の機能を測定する装置は、種
々のものが開発されており、特に、血小板機能の具体的
な測定装置として、Ｂｏｒｎおよび０’Ｂｒ１ｅｎによ
って最初に考案された装ｆｌ（Ｂｏｒｎ。 Ｇ、Ｖ、Ｒ，：Ｎａｔｕｒｅ　ＩＪＪ−，９２７（１９
６２）　　および　Ｏ’Ｂｒｅｉｎ、Ｊ、Ｒ：Ｊ、Ｃｌ
Ｉｎ、Ｐａｔｈ、ＬＬ、４４６（１９６２）　）と５ａ
ｌｚｓａｎによって考案された装置（Ｓａｌｚｍａｎ、
Ｅ、Ｗ、：　Ｊ、Ｌａｂ、Ｃ１１ｎ。 ！４ｅｄ、、［１，７２４（１９６３）　）があり臨床
検査に広く用いられている。 前者（以下第１従来例という）は、血小板の凝集機能を
調べるためのものであり、血小板浮遊液の透光度を測定
する直径が５ｍｍ程度のガラス製の円筒容器を含む部分
と、透光度を電気的信号に変換させて、ペンを動かして
凝集曲線を描く記録計からなる。この装置では、血液か
ら遠心分離によって分離された０、２〜０．３ｍｌの血
小板浮遊液をガラス製円筒容器に入れ、その中にアデノ
シン２リン酸、コラゲン、エピネフリン、リストセチン
、トロンビンなどの凝集惹起物置を加え、あらかじめ円
筒容器内に入れておかれた磁気攪拌子により血小板浮遊
液を撹拌すると、血小板は急速に凝集塊をつくり、それ
とともに血小板浮遊液の透光度が増加し、その変化を連
続的に凝集曲線として記録することができる。 後者（以下第２従来例という）は、血小板の粘着機能を
調べるためのものであり、血小板がガラス表面に粘着し
やすいという性質を利用して、ガラスピーズを充填した
チューブに血液を通過させた前佳の血小板数の変化を測
定するものである。 この装置は、内径２ｍｍ、長さ１５ｃｍ程度のチューブ
に直径０．３〜０．４ｍｍのガラスピーズを充填したも
のと、対照の血液の採取のために使われる空のチューブ
からなる。この２つのチューブの一端は採血針がついた
三方活栓で連結されており、両者のチューブの他端は２
．５ｍｌのプラスチック製の注射器が連結されいる。さ
らに、２本の注射器には血液吸引装置が接続され、一定
な速度で血液が採取される。 また、一方、血小板浮遊液に１　ｄ　ｙ　ｎ　ｅ　／　
ｃ　ｍ２程度のすり応力を付加して血小板の変化を連続
的に記録した学術的な報告（Ｋｌｏｓｅ、Ｈ，Ｊ、、Ｒ
ｌｅｇｅｒ。 Ｉｌ、　　ａｎｄ　５ｃｈｌｄ−Ｓｃｈｏｎｂｅｌｎ、
Ｈ，：Ｔ−ｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　Ｒｅｓ、ｌ。 ２６１（１９７５）　）がなされており、そこには実験
装置が開示されている。この実験装置（以下第３従来例
という）は、透光性を持つ凹状の液槽と、その液槽の底
面となす角度が３度の円錐面を持つ直径５ｃｍの回転体
からなり、回転体と液槽の底面の間隙に導入された血小
板浮遊液の流動方向から照射光を導入し、またその透過
光を導出する２本の光ファイバーが液槽の側外面にそれ
ぞれ設けられている。さらに光導入用の光ファイバーの
一端にはハロゲンランプ安定化光源が、また光導出用の
光ファイバーの一端には記録計が接続された光検出器が
設けられている。 また、さらに、上記第３従来例の改良型袋！（以下第４
従来例という）についても報告（Ｒｌｅｇｅｒ。 Ｈ，、Ｂａ１Ｌ！ｒ、Ｈ，、５ｅｈｒｏｄｅｒ、Ｈ，、
Ｗｕｒｚｉｎｇｅｒ、Ｌ、、５ｅｈｌｄ−３ｅｈｏｎｂ
ｅｉｎ、Ｈ，ａｎｄ　　Ｂｌａｓｂｅｒｇ、Ｐ、：Ｔｈ
ｒｏｍｂｏｓｉｓ　　Ｒｅｓ。 １１、５８９（１９ｓＯ）　）されている。この第４従
来例の装置は、血小板浮遊液内の光路長をできるだけ短
縮するために、光源を有した内筒とそのまわりに回転可
能に配置された外筒からなる回転二重円筒壁粘度計のよ
うな形状を持つ。−前約に回転円筒二重円筒型粘度計は
ティラー渦による二次流れが生じやすいという欠点を有
するが、この第４従来例の装置は外筒を回転することに
よりこの欠点を回避していることが特徴である。 さらにまた、第３従来例と類似のもので、血小板浮遊液
の流動方向の鉛直方向に光源と受光器を設置することに
より、光路長を１ｍｍ程度まで短縮させた装置（以下第
５従来例という）が報告（Ｆｒｏｊｍｏｖｉｅ、Ｍ、Ｍ
、：Ｂｉｏｒｈｅｏｌｏｇｙ　１２−．１９３（１９７
５）　）されている。 ［発明が解決しようとする課題］ 凝集惹起物質を血小板浮遊液に添加し、それにより得ら
れた凝集曲線から血小板の機能を調べる前記第１の従来
例の根本的な問題点は、血小板に対する刺激が生理的で
ないことである。たとえばこれによる装置を用いた臨床
検査では、アデノシン２リン酸の血小板浮遊液中の濃度
を２μＭ乃至１０μＭにするのが一般的であるが、生体
内の血液中においてこのような高濃度のアデノシン２リ
ン酸が血小板の凝集を惹起させているのかまったく不明
である。また、凝集惹起物質の一つであるリストセチン
は生体内に存在しないものである。 さらに、血小板は血液の流動状態の影響を受は活性化す
ることが多くの研究者達により報告されているにもかか
わらず、この第１の従来例では、流動状態を表す因子は
撹拌子の回転数という一般性を持たないあいまいなもの
でしか定義できない。 さらにまた、血小板浮′Ｉ／！：ｌｌ！内の光路長が５
ｍｍ程度しかないため、生体内で生じる軽微な刺激に応
答した血小板の微少な凝集による透過光量の変化を検知
することができない。第１従来例は以上のような問題点
を有しているため、臨床検査に広く用いられているにも
かかわらず、この従来例で測定された結果と臨床症状が
一致しないことが多くあるといわれている。 また、血小板のガラス表面への吸着性を利用して血小板
の粘着能を測定する第２の従来例は、あくまでもガラス
表面への粘着という非生理的な現象をみているため、前
述した第１従来例と同様な問題点を有する。また、第２
の従来例ではガラスピーズの間隙を流れるため、血小板
の粘着に大きな影響を及ぼす血液の流動状態は、生体内
の場合とまったく異なる。したがって、この従来例で得
られる結果は血小板本来の機能を反映しないことが多い
。 一方、前記第３、第４および第５の従来例の特徴は、流
動状態をすり応力という一般性のある因子で規定できる
ことである。心筋梗塞、血栓症、動脈硬化症などの疾患
には、流動状態下での血小板の反応が重要な役割を果し
ているため、これらの従来例の装置を始めその他流動状
態を規定できる装置を用いて、多くの科学文献において
長年研究、ｗｉ議されてきた。それにもかかわらず、こ
れらの優れた特徴を持つ第３、第４および第５の従来例
は、第１と第２の従来例のように臨床検査にまったく応
用されるには至っていない。これは、第３、第４および
第５の従来例による装πが以下に記述する問題点を有す
るため、すり応力に起因する血小板の′ａ渠および反応
の機序の解明と各疾患との対応が成されなかったからで
ある。 まず、第３の従来例は、１ｄｙｎｅ／ｃｍ”程度という
低いすり応力での血小板の凝集の測定を目的どした装置
で、円錐面と液槽の底面のなす角層が３度の回転体を用
いている。したがって、この装置を用いて、粘度が１．
　ｃ　Ｐ程度の血小板浮遊液に付加できる均一なずり応
力は５　ｄ　ｙｎ　ｅ　／　Ｃｍ２程度が限界である。 この値よりも高いすり応力を付加しようとすると流動状
態は乱流となり、血小板浮遊液に付加されるすり応力は
不均一になる。また、この従来例では、光源として波長
分布のあるハロゲンランプ光を光学フィルターあるいは
分光器を使用せずに、血小板浮遊液に照射しているため
、検出される透過光は、血液中の蛋白質による光の吸収
や脂質による光の散乱などの影響を受けやすくなる。４
二た、血小板浮遊液などのような粗大分散系では、粒子
の大きさと光散乱の関係は、光の波長によりＩＭに変化
する。したがって、波長分布を持つ光を直接血小板ｌ芋
遊液に照射しても、すり応力による血小板の微少な凝集
を捉えることは困難である。 第４の従来例は、二重円筒管という形態にして光路長を
短縮させ、第３の従来例の欠点を改良したものである。 しかし、この従来例は、光路長が第１の従来例と同程度
かそれよりも短いため、血小板の粗大凝集をみることは
できるが、生理的な軒微な刺部に対する血小板の微妙な
変化を測定することはできない。 さらにまた、第５の従来例に至っては、光路長が１ｍｍ
と極端に短いため、血小板の微少の微少変化の測定には
まったく不適当である。 本発明は、上記した従来技術の問題点に着目して、細胞
浮遊液にずり応力を付加し、すり応力による細胞の微少
な応答を連続的に測定する装置、特に、血小板浮遊液に
ずり応力を付加し、すり応力による微少な血小板の反応
を連続的に測定する装置に関し、血小板機能の変化を示
す疾患の診断と治療、さらに、抗血小板作用を目的とし
た薬剤の開発に応用される装置、および上記ｇ１を用い
て細胞機能を測定する方法を提供することを目的とする
。 ［課題を解決するための手段〕 上記目的は下記の本発明により達成できる。 すなわち、本発明は （イ）底板と側面からなる円筒形の試料室であり、かつ
該試料室に導入された試料内の光路長がＩｃｍ以上とな
るように照射光導入路と透過光導出路を側面に有する試
料室、 （ロ）該試料室の底板に対し、２度以下をなす凸形の円
鮮面回転体を有する細胞機能測定装置であり、さらに上
記装置に （ハ）透光性の側面を持つ円筒形の液槽、（ニ）！＊回
転体に係合し、該回転体を回転駆動する駆動装Ｌ （ホ）該駆動装置を制御する制御ｓ機構、（へ）該照射
光導入路に係合し、細胞浮遊籠に充分な光を提供する光
源、 （ト）該透過光導出路に係合し、細胞浮遊液を透過した
光または細胞浮遊液から発生した光を検出する受光器、
および （チ）該受光器に係合し、受光器で得られたｆＦ１号を
連続的に記録する記録計 を備えた細胞機能測定装置である。 またさらに本発明は」二記装置を用いて細胞の機能を測
定する方法を提供する。 ここで、本発明の装置において、測定する細胞機能とは
、すり応力によって直接的あるいは間接的に誘発される
細胞の反応、具体的には、細胞の、ＶＸ県、物質の放出
、形態の変化などである。 また、本発明の装置において、細胞浮遊液にずり応力を
付加する回転体の外周側面と該試料室の内側面との間隙
で生じるすり応力が、該回転体の円錐面と該試料室の底
面の間隙で得られるすり応力の値を一ヒ回らないように
設定しなくてはならないが、該試料室の内径を極端に大
きくすると、検体としてのｍ胞ｌ芋遊液の量が増すこと
になるので好ましくはない。したがって該試料室の内径
は、該回転体の外側面と該液槽の内側面との間隙が、０
．２ｍｍ乃至２ｍｍとするのが好ましい。なお試料室の
内側に、透光性の側面を持つ液槽を用いるのが取り扱い
容易性から好ましい。さらに該液槽は非透光性底板と透
光性側面からなるものが測定を正確に行う上で好ましい
。該液槽を用いた場合は、該回転体の外側面と該液槽の
内側面との間隔が、０．２ｍｍ乃至２ｍｍとするのが好
ましい。さらに、液槽を用いる場合、該液槽の四面にお
いて、照射光導入路と透過光導出路に接するところの材
質は、導入される光と導出される光に対して、それぞれ
、良好な透過性を保持したものでなくてはならない。た
とえば目的とする光が可視領域の場合は、安価なアクリ
ル系ポリマーやポリスチレンなどのプラスチックが好ま
しく、また、紫外あるいは赤外領域の光を目的とする場
合は、石英ガラスが好ましい。 また、本発明の装置において、細胞１１遊液にずり応力
を付加する該回転体の半径としては、３ｃｍ以下が好ま
し−く、０．７ｃｍ乃至２．０ｃｍがより好ましく、該
回転体の円錐面と該回転体の回転軸の軸心に垂直な平面
とがなす角度は、２度以下であり、０．３度乃至１．５
度が好ましい。 さらにまた、本発明の装置において、該試料室に連通し
て設けられた照射光導入路と透過光導出路には、光ファ
イバーを用いることが好ましい。 また、光ファイバー〇材貢としては、透過する光が可視
領域の場合は、安価なプラスチックが好ましく、また、
紫外あるいは赤外領域の場合は、石英ガラスが好ましい
。 また、本発明の装置において、該照射光導入路に係合し
て用いられる光源は、測定する細胞機、能によって選択
されるが、ハロゲンランプやタングステンランプなどの
光源に干渉フィルタを取付けたもの、あるいは、レーザ
などのように単色性に優れたものが好ましく、同時に２
種類以上の光源を用いて光ファイバーにより、照射光導
入路、の光ファイバーへ導入することも行われる。 さらに、また、本発明の袋πにおいて、該受光器には、
フォトダイオードなどのような光起電力を利用した検出
器が好ましいが、蛍光などのような微弱光を測定する場
合は、光電子増倍管がさらに好ましい。また、２種類以
」二の光を照射した場合、あるいは、２積類以十〇′社
光を測定する場合は、干渉フィルタなどの光学フィルタ
を用いて目的の波長の光のみを透過させ、光ファイバに
より受光器へそれぞれの光を導くことが好ましい。 なお光路長は、試料室内（液槽を用いる場合Ｉｆ液槽内
）における細胞浮遊液の光導入口から光１Ｎ出口までの
ａ短距離であり、１ｃｍ以（−とする必要があり、好ま
しくは１ｃｍ以−ｈ４ｃｍ以下、より好ましくは２ｃｍ
以上３ｃｍ以下である。この光導入口と光導出口の位置
は、中心を避けて、光路長を長くとるように設置するこ
とが好ましい。 本発明装置において、血小板の形状変化あるいは蛍光測
定による血小板内のカルシウム濃度変化を調べるには、
該試料室の焦面に散乱光導出路を設けることも好ましい
。 また本発明装置において、試料室の内底面と前記回転体
の円錐面との間の距離を調整して用いるのが好ましい。 たとえば前記回転体の少なくとも円錐面先端部を磁性体
で構成し、前記試料室の底壁側に渦電流センサを設け、
前記距離を該センサで検出する。さらに前記距離を容易
に測定するため、該円錐面回転体の先端部にステンレス
に代表される円柱状磁性体を埋め込み使用することもで
きる。 なお、血小板の形状変化を測定する場合は、１０ｄｙｎ
ｅ／ｃｍ２以下のすり応力で行うか、プロスタグランジ
ンＥｌなどの血小板凝集抑制剤を添加することが好まし
い。 また、本発明の装置において、該回転体を回転駆動させ
る駆動装置としては、エンコーダが組み込まれた直流モ
ータが好ましい。本発明の装置を用いることにより、２
００ｄｙｎｅ／ｃｍ２まで均一なすり応力を付加するこ
とができる。 さらに、この駆動装置に係合した制御機構は、一定速度
で駆動装置を回転させるだけでなく、使用者によって作
成されたプログラムに従って、駆動装置を回転制御させ
、１回の測定で、Ｏｄ　ｙ　ｎｅ／ｃｍ”乃至２００ｄ
ｙｎｅ／ｃｍ２までの広い範囲でずり応力に対する細胞
の反応を調べることができる。　また、血小板機能を測
定する場合、細胞膜を容易に透過し、細胞質内に蓄積し
、細胞質内のカルシウムイオンと結合し蛍光を発生する
色素であるＩ　ｎ　ｄ　ｏ　−Ｉ　Ａ　Ｍ　（Ｇｒｙｎ
ｋｉｅｗｌｅｚ、Ｇ、、ＰｏｅｎＬｅ、Ｍ、　　ａｎｄ
　Ｔｓｌｅｎ、Ｒ，Ｖ、：Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｓ、、
２ｊＪ、３４４０（１９８６）　）などを用い、光導入
路から凝集を測定用の光の他に該色素の励起光を血小板
浮遊液に照射すれば、血小板のすり応力による凝集の測
定と同時に、血小板浮遊液機能の調節において重要とさ
れている細胞質内のカルシウムイオン、濁度の変化を連
続的に測定することができる。 さらに、本発明の装置を用いることにより、１０ｄｙｎ
ｅ／ｃｍ２乃至４０ｄ、ｙｎｅ／ｃｍ”の低すり応力領
域と、８０ｄｙｎｅ／ｃｍ２以上の高ずり応力領域とで
、血小板凝集を測定することにより、血小板機能と密接
な関係にある血小板細胞真上の糖蛋白の異常、あるいは
該糖蛋白に結合する血漿蛋白の異常を容易に調べること
ができる。 すなわち、本発明の装置は、生理的な軽微な刺激である
すり応力を細胞に付加し、しかも、それに対する細胞の
微弱な変化を、高感度に渭定できるという特徴を有する
ため、血小板の機能に関して、以下に述べるような現象
を発見することが可能となった。 すり応力による血小板の凝集に関して、多くの研究が成
されているが、その機序については、不明な点が多い。 本発明の装置を用いて、０ｄｙｎｅ／ｃｍ２乃至２００
　ｄ　’ｊ　ｎ　ｅ　／　Ｃｍ　２のずり応力の範囲で
、すり応力と血小板凝集の関係を調べた結果、この血小
板の凝集には、血小板細胞謹上の糖蛋白とこれらの糖蛋
白に結合する血漿蛋白が深く関与し、１０ｄｙｎｅ／ｃ
ｍ”乃至４０ｄｙｎｅ／ｃｍ”のずり応力と、８０ｄｙ
ｎｅ／ｃｍ’以上のすり応力とでは、機序が異なること
が判明した。現在まで、血小板細胞膜上の糖蛋白（以下
ＧＰと略す）は、１０種類以上の存在が認められており
、血小板の粘着、凝集などの機能と密接に関与している
と言われている。特にこれらのＧＰの中で、ＧＰＩｂが
血小板粘着能と、またＧＰＩｒｂとＧＰＩＩＩａの複合
体（以下Ｇ　Ｐ　ｒｉｂ／ＩＩＩａと略す）が血小板凝
集能とそれぞれ密接な関係があると報告されている。一
方、血［蛋白ではフオンウイルブランド因子が血小板粘
着能と、またフィブリノーゲンが血小板凝集能とそれぞ
れ密接な関係があると報告されている。 まず血小板謹上の糖蛋白とすり応力による血小板凝集に
ついて鋭意検討した結果、以下の事実が判明した。実施
例２で示すように、血小板浮遊液をＧＰＩｂのモノクロ
ーナル抗体で処理すると、１０ｄｙｎｅ／ｃｍ２乃至４
０　ｄ　ｙｎ　ｅ　／　Ｃｍ　２のずり応力では、血小
板凝集が促進され、一方、８０ｄｙｎｅ／ｃｍ２以上の
すり応力では、血小板凝集が完全に抑制され、さらに、
血小板浮遊液をＧＰ　ＩＩｂ／ＩＩＩａモノクローナル
抗体で処理すると、１０　ｄ　ｙｎ　ｅ　／　Ｃｍ　”
乃至４０ｄｙｎｅ／ｃｍ２のずり応力においては、血小
板凝集が完全に抑制されるが、８０ｄｙｎｅ／ｃｍ２以
上のすり応力では、血小板凝集の抑制は不完全であるこ
、とを見出した。またさらに実施例２に示すように、Ｇ
ＰＩｂが欠損するベルナールスーリエ痛候群の患者では
１０ｄｙｎｅ／ｃｍ２乃至４０　ｄ　ｙｎ　ｅ　／　Ｃ
ｍ　”のすり応力では、正常に血小板が凝集するのに対
し、８０ｄｙｎｅ／ｃｍ２以上のすり応力では、血小板
は全く凝集しない。一方、Ｇ　Ｐ　ＩＴｂ／ｌ１ｌａが
欠損する血小板無力症の患者では、１０ｄｙｎｅ／ｃｍ
２乃至４０ｄｙｎｅ／ｃｍ”のすり応力において、血小
板は全く凝集しないが、８０ｄｙｎｅ／ｃｍ２以上のす
り応力では、わずかに血小板は凝集することも見出した
。 次に血漿蛋白とすり応力による血小板凝集について検討
した結果、実施例２に示すように、血小板浮遊液をフオ
ンウイルブランド因子のＧ　Ｐ　ＩＩｂ／ｌ１１ａ結合
部位に対するモノクローナル抗体で処理すると、１０ｄ
ｙｎｅ／ｃｍ２乃至４０ｄｙｎｅ／　Ｃｍ　２のずり応
力では、血小板凝集は全く抑制されないのに対して、８
０ｄｙｎｅ／ｃｍ２以上のすり応力では、血小板凝集は
完全に抑制されることを見出した。また実施例２に示す
ように、フォンウィルブランド因子を欠如するフォノウ
ィルブランド病の患者では、１０　ｄ　：／　ｎ　ｅ　
／　Ｃｍ　２乃至４０　ｄ　：／　ｎ　ｅ　／　Ｃｍ　
２のずり応力では、血小板は正常に凝集するが、８０ｄ
ｙｎｅ／ｃｍ２以上のすり応力になると、血小板は全く
凝集しないことと、さらに、フィブリノーゲンを欠損す
る蕉フィブリノーゲン血症の患者において、１０ｄｙｎ
ｅ／ｃｍ２乃至４０　ｄ　３／　ｎ　ｅ　／　Ｃｍ　２
のずり応力では、血小板の凝集が全く生じないのに対し
て、８０ｄｙｎｅ／ｃｍ２以上のすり応力では、血小板
は異常なく凝集することを発見した。　このように本発
明装置を用いたこれらの鋭意研究の結果、すり応力によ
る血小板凝集には２つの機序があることが解明された。 すなわち１０ｄｙｎｅ／ｃｍ２乃至４０ｄｙｎｅ／ｃｍ
２の低すり応力領域で惹起される血小板凝集は、血漿蛋
白であるフィブリノーゲンと血小板の膜上に存在するＧ
　Ｐ　ＩＩｂ／ＩＩＩａの相互作用による結合によるも
のであり、また、８０ｄｙｎｅ／ｃｍ”以上の高ずり応
力領域で惹起される血小板凝集は、血ｗ１蛋白であるフ
ォンウィルブランド因子がＧＰＩｂとＧ　Ｐ　ＩＩｈ／
ＩＩＩａによる結合によることが発見されたのである。 この重大な発見は、血小板の工大機能である凝集能と粘
着能の簡便かつ正確な測定方法を提供するものである。 つまりすり応力で惹起される血小板の凝集を測定するこ
とにより、１０ｄｙｎｅ／ｃｍ２乃至４０ｄｙｎｅ／ｃ
ｍ２の低すり応力領域では、従来からいわれている血小
板凝集能が、また８０ｄｙｎｅ／ｃｍ２以−ヒの高ずり
応力領域では、いわゆる血小板粘着能が、それぞれ測定
できる。 次に、本発明の装置の望ましい一例について、図面を９
照しながら説明する。なお、この実８１１例の装置は、
特に、血小板浮遊液中の血小板の機能を測定するための
ものとして設計されたものである。 第１図は、本発明の一実施態様に係る血小板機能を測定
する装置の概略図、第２図は、第１図に示した装置の細
胞浮遊液にずり応力を付加する部分の断面図、第３図は
、凹状の試料室の平面図である。 検体となる血小板浮遊液が導入される円筒形の液槽１は
、第２図に示す通り、鍼色透明の充分に研摩されたアク
リル樹脂の側壁３５と、非違光性で血小ｔｌｊ浮遊液と
接触する表面が充分に研摩されたアクリル樹脂の底板３
６とからなる。また、底板の裏面には、円筒形の凹部３
８が形成され、渦電流式変位セン勺３３が設置される。 液１１１１の内側には、前記底板３６に向って凸の円錐
体からなる非透光性で、表面が充分に研摩されたアクリ
ル樹脂の円錐面回転体２が設Ｂされ、該回転体２０円錐
の先端部には、表面が充分に研摩されたステンレスの円
１１体３１が埋め込まれている。また、該回転体２の上
部には、軸孔３４が設けられており、コアレス型エンコ
ーダ付モータ４（第１図において）の出力軸が、該軸孔
３４に挿入される。さらに、核モータ４は、モータ固定
プレート４１を介して、ベースプレート４２に固定され
た精密な高さ調整ステージ９と接合されており、該高さ
調整ステージ９に付属した粗動ダイヤル１０と微動ダイ
ヤル１１を回転することによって、該回転体２と該液槽
１の該底板３６の間隙が調節され、さらに、また、その
間隙の距離は。 前記渦電流式変位センサ３３が、該回転体２０円錐先端
部に埋め込まれた前記ステンレス円柱体３１の位置を感
知し、該センサ３３とコード３９によって接続されたベ
ースプレート４２上の回転体高さ表示器２７に表示され
る。 なおステンレス円柱体３１の底面はセンサー３３による
検出を容易にするため円錐面ではなく、部分的あるいは
底面全体をフラット面にしてもよい。 また該モータ４は、該モータ４とコード１７で接続され
たモータ駆動制御Ｉｌ装匝５によって、あらかじめ作成
されたプログラムに従って、駆動される。 一方、液槽１は、第２図に示す通り、ステンレスで形成
された試料室３の凹部内に保持され、さらに、該試料室
３の凹部の上部に設けられた液槽固定ビン３０で固定さ
れる。また、該試料室３．の凹部の低かられずかに上部
には、円筒管状の照射光導入路２８が貫通して形成され
、さらに、該先導入路２８の延長線上に、同じく円筒管
状の透過（以下余白〉 光導出路２９が貫通して形成され、さらに、また該先導
入路２８と該光導出路２９の間に、扇形をしたスリット
状の散乱光導出路４０（第３図において）が形成されて
いる。また、該光導入路２８および該光導出路２９しこ
は、ＦＣ形コネクタのプラグが接続されたコアが・′石
英で形成された単芯の光導入用光ファイバ１４と、同じ
く光導出用光ファイバ１５とがそれぞれ挿入されており
、これら二本の光ファイバは、ＦＣ形コネクタのアダプ
タ（図示せず）が“装着された二つの光フアイバ固定台
座３２．２６によって固定される。また、前記したスリ
ット状の散乱光導出路４０にも、ＦＣ形コネクタのプラ
グが接続されたコアの材質が石英の散乱光導出用光ファ
イバ１６が挿入されるが、該光ファイバ１６は、ＦＣ形
コネクタのアダプタが装着された光フアイバガイド２５
と該光フアイバガイド２５を支持しベースプレート４２
に固定されたスタンド２４によって固定されている。 前記試料室３裏０！１（第１図において）は、台座４３
に固定されており、さらに、該台座４３は、ベースプレ
ート４２に固定された微動回転ステージ１２の上円盤に
固定されている。該微動回転ステージ１２の上円盤は、
該微動ステージ１２の上円盤に付属している微動ダイア
ル１３を作動させることにより回転し、同時に、該試料
室３が回転し、その結果散乱光導出路４０のスリット幅
の範囲内の任意の角度から、散乱光導出路用光ファイバ
１６を介して散乱光が導出される。 光導入用光ファイバ１４を固定するＦＣ形コネクタのア
ダプタを有した光フアイバ固定台座３２には、１本のフ
ェルールに１２本の石英光ファイバが充填されたＦＣコ
ネクタのプラグを先端に有する多芯光ファイバ４４が接
続され、該光ファイバ４４は６本づつ２本の多芯光ファ
イバ１８．１９に分割される。これらの多芯光ファイバ
１８．１９の先端も、それぞれ１本のフェルールに充填
され、ＦＣコネクタのプラグによって光源部６のＦＣコ
ネクタのアダプタにそれぞれ接続される。 該光源部６内（第４図において）には、血小板の凝栗を
調べる目的に使用する波長６３２．８Ｈｍ、コア径１２
５μ長さ２ｍの石英光ファイバ接続時の端面出力１．６
ｍＷのＨｅ−Ｎｅガスレーザ４５と、血小板内部のカル
シウムイオン濃度の変化を測定する目的に使用する出力
１００Ｗの紫外光透過フィルタ４７が桁属し力水銀−キ
セノンランプ４６の励起光源が組み込まれている。 一方、前記光導出用光ファイバ１５を固定するＦＣ形コ
ネクタのアダプタを有した光フアイバ固定台座２６には
、ＦＣ型コネクタのプラグを両端に有する光ファイバ２
０の一端が接続され、該光ファイバ２０の他端のプラグ
は、受光器７のＦＣコネクタのアダプタに接続される。 また光フアイバガイド２５とスタンド２４によって固定
された散乱光導出用光ファイバ１６には、光フアイバガ
イド２５に付属しているＦＣ形コネクタのアダプタによ
って、１本のフェルールに１２本の石英光ファイバが充
填されたＦＣコネクタを先端に有する多芯光ファイバ２
３が接続される。該光ファイバ２３は、６本づつ２本の
多芯光ファイバ２１．２２に分割され、それぞれの多芯
光ファイバの先端も、１本のフェルールに充填され、Ｆ
Ｃコネクタのプラグによって、受光器７のＦＣコネクタ
のアダプタにそれぞれ接続される。 該受光器７内（第５図において）には、１個のフォトダ
イオード４８と２Ｈの光電子増倍管４９ａ、４９ｂとこ
れらの光検出器用とデータ解析用の電子回路５０が組み
込まれている。光ファイバ２０が接続されるＦＣコネク
タのアダプタには、中心波長６３３ｎｍの干渉フィルタ
５１が取り付けられ、さらに前記フォトダイオードが接
続される。また、光ファイバ２１と２２が接続されるＦ
Ｃコネクタには、それぞれ光電子増倍管に接続され、一
方の光電子増倍管の光電面の前面には、中心波長４１０
ｎｍの干渉フィルタ５２ａが、また他方の光電子増倍管
の光電面の前面には、中心波長４８０ｎｍの干渉フィル
タ５２ｂが、それぞれ取り付けられている。また、該受
光器７には、２個のペンを有した記録計８が接続され、
血小板の凝集による血小板浮遊液の濁度の変化と血小板
内部のカルシウムイオン温度変化が、該記録計８に連続
的に記録される。 本例においては渦電流式センサ３３が棋み込まれた液＄
１１１を使用するため、試料室３は中央に液槽挿入部３
７を有しているが、該液槽挿入部３７を有していない試
料室３を用いることができ、Ｓ。 次にずり応力による血小板凝集の定！化について説明す
葛。血小Ｗ、凝楽状態を定量的に評価するためには、帰
られた凝集曲線を一般化して何らかの指標を考案する必
要がある。現在臨床において広く用いられている前記第
１従来例の血小板凝集能潤定装置において、血小板の凝
集率は、次のように定義されている。 凝集率（Ｘ）　＝　ＣＩ　ｔ　−Ｉｒｐｒ）／（Ｉｐｒ
Ｐ−Ｉｐ艮ｐ）　Ｘ　１００　　（１）ここで１１は凝
集時の透過光量、ＩＰＰＰはＰＰＰの透過光量、ＩＰＩ
Ｐは凝集する前のＦ’ＲＰの透過光量を表す、この指標
は、セル内の光路長、血漿の濁度、凝集する前の血小板
数によって大きく変化する。また非凝集血小板数の変化
率に比例しないため、−ａ化には適当でなｉ、特に高感
度で血小板凝集を検知できる特徴を持つ本発明の装置で
は、ＰＰＰとｒ’ＲＰの透過光量の差が非常に大きくな
るため、これらの問題が顕在化する。鋭Ｗ：検討した結
果、本！ｉｆにおいて、血小板数と透過光量の関係がラ
ンベルト・ベール（Ｌａ＠ｂｅｒｌ、Ｂｅｅｒ　）の法
則に従うことと、さらに凝集による透過光量の変化が、
おもに非凝集血小板数の変化によって生じることを見い
出した。そこで以下に示す式で定義される指標を考案し
机 ｌｏｇ（Ｉ　Ｉ／　ＩＰＩＰ） 凝集率（％）　、、　　　　　　　　　　ＸＩＧＯ（２
）１０ｇ（Ｉｒｐｒ　／　Ｘｐ＊ｐ） この指標を用いれば血小板の凝集率を非凝集血小板数の
変化率にとして表すことが可能となり、しかも、セル内
の光路長、血漿の濁度、凝集する前の血小板数に関係せ
ずに血小板凝集を定量的に表すことができる。

【作用】

このように構成された本発明の装置において、適切な回
転駆ｌｌ＋装置と該駆動装置に係合した制御機構によっ
て、円錐面を有する回転体が、円筒形の液槽内で回転せ
しめられ、該回転体と該液槽の底面の間隙に導入された
細胞浮遊液に、層流状態を保持してすり応力を付加する
間に、試料室に連通した光導入路から、細胞浮遊液に適
切な光が照射され、放出反応などのすり応力に対する細
胞の微少な応答は、試料室に連通した光導出路から受光
器へ、光学フィルタを介して所望の光として導きかれ、
この光の強度変化として連続的に記録される。 ［実施例］ 実１Ｍ例１ 上述の装置で主要部の概略寸法が下記のものを用いて、
測定を行った。 回転体２０半径は、１．５ｃｍ、ステンレス円柱体の半
径は２．５ｍｍ、回転体２０円錐面と回転体２の回転軸
の軸心に垂直な平面とがなす角度は、１．０度をそれぞ
れ有する。液槽１の内径は、３．１ｃｍ、液槽１の外径
は、３．４ｃｍ、液槽１の血小板浮遊液を導入する凹部
の深さは、１３ｃｍである。液槽１の底板３６の厚さは
、２ｍｍ、渦電温式変位センサ３３が挿入される部位の
底板３６の厚さは０．５ｍｍである。試料室３の凹状の
液槽保持部の内径は、３．４１ｃｍ、該試料室の外径は
、５゜５ｃｍである。試料室３において、光導入路２８
と光導出路２９の位置は、凹状の液槽保持部の円の中心
ｍｃ第３図において）と、光導入路２８と光導出路２９
のそれぞれの中心を結ぶ線が、平行に、かつそれら２つ
の直線の距離が、０．８ｃｍになるように設定されてい
る。散乱光導出路４０のスリットの幅は該導出路４ｏの
両端と試料室３の凹状の液槽保持部の中心を結ぶ線が作
る角度が、１２０度となるように設定されている。光フ
ァイバ１４．１５．１６および２０のコア径は、ｉｎｍ
、クラツド径は、１゜０３！ｚｎｍである。光ファイバ
１８．１９．２１２２．２３および４４のコア径は、０
．２００ｍｍ、クラツド径は、０．２３０ｍｍである。 、高さ調整ステージ９の高さは、１５．５ｃｍ、微動回
転ステージの円盤の直径は、９ｃｍである。ベースプレ
ート４２の縦の長さは、２０ｃｍ、横の長さは、２５ｃ
ｍである。 次に、実際に血小板浮遊液中の血小板機能を測定する過
程を説明しながら、上述実施装置の作動の説明をする。 健康な成人の肘静脈より、シリコン加工２０ゲージ、針
を用い、血液を３．８％クエン酸ナトリウム水溶液／全
血液＝１７９の割合で、プラスチック容器に採取する。 この血液を１００Ｇの遠心力で１５分間遠心分離して多
血小板血漿（以下ＰＲＰと略する）を得た後、残りの赤
血球懸濁液を１５００Ｇの遠心力で１０分間遠心分離し
て貧血小板血漿（以下ＰＰＰと略する）を作り、このＰ
ＲＰとＰＰＰを用いて、血小板数を適肖に調節したＰＲ
Ｐを作成する。この血小板数を調整したＰＲＰを０．３
ｍｌ取り、液槽１の底板３６の中心付近に入れ、次に高
さ調整ステージ９の粗動ダイヤル１０と微動ダイヤル１
１を回転させることにより、回転体２を底板３６の上に
降ろし、該回転体の円錐先端部に埋め込まれたステンレ
ス円柱体３１と底板３６の中心の距離を感知する渦電漬
式変位センサ３３によって回転体高さ表示器２７に出力
される値を４０μｍに設定する。続いて、０ｄｙｎｅ／
ｃｍ２乃至２００ｄｙｎｅ／ｃｍ’の範囲のすり応力で
、５分間、ＰＲＰに付加され、光導入用光ファイバ１４
から入射された波長６３３ｎｍの透過光が、光導出用光
ファイバ１５から導出され、受光器７で検出され、血小
板が凝集すると、透過光量が増大し、その変化の様子が
、記録計８に描かれる。第６図に、ｉＩ！東な成人５人
のずり応力１８　ｄ　Ｖ　ｎ　ｅ　／　Ｃｍ　２３６　
ｄ　７　ｎ　ｅ　／　Ｃｍ”、　７２　ｄ　ｙｎ　ｅ　
／　Ｃｍ２および１０８ｄｙｎｅ　／　ｃ　ｍ２におけ
る血小板凝集曲線をそれぞれ示す６図から一般に、血小
板凝集は、３６ｄｙｎｅ／　Ｃｍ　２　と７２ｄｙｎｅ
／ｃｍ２のずり応力よりも、１８　ｄ　ｙｎ　ｅ　／　
Ｃｍ　２と１０８ｄｙｎｅ／ｃｍ２のずり応力でのほう
が、著しくなることがわかる。 実施例２ 実ｆｉ例１と同じ装置を用いて、通常の血小板浮遊液（
試料１）、血小板細胞膜上の血小板粘着能と密接な関係
がある糖蛋白ＧＰＩｂをモノクローナル抗体で処理した
血小板浮遊液（試料２）、血小板細胞膜上の血小板ａＩ
果能と密接な関係がある糖蛋白Ｇ　Ｐ　Ｉｌｂ／ＩＩＩ
ａの複合体（以下Ｇ　Ｐ　Ｉ’Ｉｂ／ＩＩＩａと略す）
をモノクローナル抗体で処理した血小板浮遊液（試料３
）、血小板粘着能に関与するフオンウィルブランド因子
のＧ　Ｐ　Ｉｌｂ／ＩＩＩａの結合部位に対するモノク
ローナル抗体で処理した血小板浮遊液（試料４３、ＧＰ
Ｉｂが欠損するペルナールスーリエ症候群の患者から採
取した血小板浮遊液（試料５　）　、Ｇ　ＰＩＩｂ／ｌ
１ｌａが欠損する血小板無力症の患者から採取した血小
板浮遊液（試料６）、フオンウィルブランド因子を欠如
するフォノウィルブランド病の患者から採取した血小板
浮遊液（試料７）、フィブリノーゲンを欠損する無フィ
ブリノーゲン血症の患者から採取した血小板浮遊液（試
料８）の各々について、ずり応力１８ｄｙｎｅ／ｃｍ”
、１０８ｄｙｎｅ／ｃｍ”における血小板凝集を実施例
１の場合と同様に測定した。 第７図（試料１）と比較して、試料２（ＧＰＩｂをモノ
クローナル抗体で処理した血小板浮遊液）については第
８図に示す通り、１８　ｄ　ｙ　ｎ　ｅ　／　ｃｍ２の
低ずり応力では血小板凝集が促進され、方、１０８ｄｙ
ｎｅ／ｃｍ２の高ずり応力では血小板凝集が完全に抑制
される。また試料３　（ＧＰ１１ｂ／ＩＩＩａをモノク
ローナル抗体で処理した血小板浮遊液）については第９
図に示す通り、１８ｄｙｎｅ／ｃｍ”の低すり応力では
血小板凝集が完全に抑制され、１０８ｄｙｎｅ／ｃｍ”
の高ずり応力では、わずかな血小板凝集が生じる。試料
４（フオンウイルブランド因子のＧ　Ｐ　ＩＩｂ／ＩＩ
Ｉａの結合部位に対するモノクローナル抗体で処理した
血小板浮遊液）では第１０図に示す通り、１８ｄｙｎｅ
　／　Ｃｎｌ　２の低ずり応力では、血小板凝集は抑制
されないが、１０８ｄｙｎｅ／ｃｍ”の寓ずり応力では
、血小板凝集はほぼ完全に抑制される。また図１１に示
すように試料５（ＧＰＩｂが欠損するペルナールスーリ
エ症候群の患者から採取した血小板浮遊液）では、ｔｓ
ａｙｎｅ／ｃｍ２の低ずり応力では、正常に血小板が凝
集するのに対し、１０８ｄｙｎｅ／ｃｍ”の高ずり応力
では、血小板は全く凝集しない、試料６　（Ｇ　Ｐ　Ｉ
Ｉｂ／Ｈ１ａが欠損する血小板無力症の患者から採取し
た血小板浮遊液）では、図１２かられかるように１８ｄ
ｙｎｅ　／　Ｃｍ　２の低ずり応力において、血小板は
全く凝゛集しないが、１０８ｄｙｎｅ／ｃｏｘ”の高ず
り応力では、わずかに血小板は凝集する。さらに試料７
（フォンウィルブランド因子を欠如するフォノウィルブ
ランド病の患者から採取した血小板浮遊液）では、図１
３に示すように１８ｄｙｎｅ／ｃｍ２の低すり応力では
、血小板は正常に凝集するが、１０８ｄｙｎｅ／ｃｍ２
の高ずり応力になると、血小板は全く凝集しない、最後
に試料８（フィブリノーゲンを欠損する無フィブリノー
ゲン血症の患者から採取した血小板浮遊液　）において
は、図１４に示すように、１８ｄｙｎｅ／ｃｍ２の低ず
り応力では、血小板の凝集が全く生じないのに対して、
１０８ｄｙｎｅ／ｃｍ２の高ず′り応力では、血小板は
異常なく凝集する。 以上の結果かられかるように、低すり応力領域および高
ずり応力領域で血小板凝集を測定することにより、血小
板の機能と密接に関連しているＧＰｌｂ％Ｇ　Ｐ　Ｉｉ
／ＩＩＩａ、フィブリノーゲンおよびフォンウィルブラ
ンド因子の異常が容易に調べられることがわかる。 実施例３ 実８Ｉ例１の装置において、２つの光電子増信管にフォ
トンカウンタ、ＧＰ−ＩＢインターフェイスおよびマイ
クロコンピュータから構成される計測システムを接続す
ることによって、すり応力による血小板内のカルシウム
イオン濃度の変化を測定した。 まず以下のようにしてカルシウムイオン溶液の４１　ｆ
ｆｉ溶液を作成する。６０ｍＭのエチレングリコール・
ビス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ、Ｎ、Ｎ’　。 Ｎ′−四酢酸（以下ＥＧＴＡと略す）と１２ｍλ（の３
−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（以下ＭＯＰ
Ｓと略す）のから成る溶液を、１２０ｍＭの塩化カリウ
ム（以下ＫＣＩと略す）、１２ｍＭのＭＯＰＳおよび１
２ｎｎＭの塩化カルシウム（以下ＣａＣｌ２と略す）か
ら成る溶液に添加し、カルシウムイオン電極でカルシウ
ムイオンが検出されなくなることを確認しながら、１０
０ｍＭのＫ　Ｃ１，１０ｍＭのＭＯＰＳおよび１０ｍＭ
（７）ＥＧＴＡカルシウム塩（以下に２ＣａＥＧＴＡと
略す）から成るｐＨ７，２０の溶液を調整する。また、
１２０ｍＭのＫＣＩと１２ｍＭのＭＯＰＳから成る溶液
に、６０ｍＭのＥＧＴＡと１２ｍＭのＭＯＰＳから成る
溶液を１１５容量添加し、１００ｍＭのＫＣｌ、ＬＯｍ
ＭのＭＯＰＳおよび１０ｍＭのＥＧＴＡカリウム塩（以
下に２Ｈ２ＥＧＴＡと略す）から成るｐＨ７，２０の溶
液を調整する。これらの１１Ｉ！１シた２種類の溶液を
用いて、ＣＬ　ｎ　Ｍ、３７゜３ｎＭ、１１００ｎ、２
２６ｎＭ、６０４ｎＭ。 １ｍＭの濃度のカルシウムイオンの１１衝溶液を作成す
る。 次にこれらのカルシウムイオン濃度の緩衝溶液に、カル
シウムイオンと結合することにより固有の蛍光を発する
色素Ｉｎｄｏ−１の水溶液を該緩衝溶液に対してそれぞ
れ６／１０００容量添加したものを試料とする。これら
の試料をそれぞれ０３ｍ１とり、実施例１の場合と同様
にして液槽１に導入して、回転体２を降下させる。続い
て回転体を適当な回転数で駆動させ、前記した計測シス
テムにより、光導入用光ファイバ１４から入射された紫
外光によって生じるＩｎｄｏ−１の２波長の蛍光、すな
わちカルシウムイオンと結合したＩｎｄｏ−１からの波
長４１０ｎｍの蛍光と、工ｎｄｏ−１単体の波長４８０
ｎｍの蛍光を測定する。カルシウムイオン濃度とこれら
の蛍光強度との関係についても、前記Ｇｒｙｎｋｉｅｗ
ｉｅｚ　らの文献に次のような式が報告されている。 Ｃａ２″’＝Ｋｄ（Ｓｆｆ９−ｓ／５ｆｔ９−　ｔｅａ
）（Ｒ−Ｒｍｉａ）／（Ｒａａｘ−Ｒ）ここで、Ｃａ”
はカルシウムイオン濃度、Ｋｄはカルシウムイオンが結
合したＩｎｄｏ−１のカルシウムイオン解離定数％　Ｓ
ｆ菅’２ｍ−（はカルシウムイオン濃度を０とした時の
波長４８０ｎｍの蛍光強度、５Ｆ２９゜−ｔｅａはカル
シウムイオンを大過剰にしてＩｎｄｏ−１にすべてカル
シウムイオンを結合させた時（カルシウムイオン濃度１
ｍＭのｌ１ｆｆｉ溶液を用いた場合に相当）の波長４８
０ｎｍの蛍光強度、ＲｍＩ＆はカルシウムイオン濃度を
０とした時の波長４１０ｎｍと４８０ｎｍの蛍光強度比
、Ｒｉｍａｘはカルシウムイオンが大過剰の時の波長４
１０ｎｍと４８０ｎｍの蛍光強度比、さらにＲは各カル
シラ・ムイオン１１衝溶゛嘗の蛍光測定時の４１０ｎｍ
と４８０ｎｍの蛍光強度比である。この関係式に各試料
の蛍光比ｋを代入して、にｄを求めて検量線を作成する
。 続いて血小板浮遊液の試料を以下のようにして作成する
。まず実施例１の場合と同様にして、健康な成人から採
血し、ＰＲＰを作成する。二〇ＰＲＰに酸性クエン酸ブ
ドウ糖液（Ａｃ１ｄ　Ｃ１ｔｒａｔｅＤｅｘｔｒｏｓｅ
　）を終濃度が２０％となるように添加し８００Ｇの遠
心力で７分間遠心分離して血小板を沈降させる。この上
清を除去した後、ＨＥＰＥＳ−Ｔｙｒｏｄｅ緩衝液（４
ｍＭのＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎｏ−エ
チル硫酸、１３７ｍＭの塩化ナトリウム、２．７ｍＭの
塩化カリウム、３３ｍＭのリン酸ナトリウム、１ｍＭの
塩化マグネシウム、５．１５ｍＭのグルコース、０．３
５ｍｇ　／　ｍ　１のウシ血清アルブミンからなる溶液
）を添加して、血小板数が１０　Ｘ　１０’叫１μｍと
なるように調整する。さらにこの血小板浮遊液に、前記
１ｎｄｏ−１のカルボキシル基をアセトキシメチルエス
テル化して細胞膜透過性を付与させた工ｎ　ｄ　ｏ　−
Ｉ　Ａ　Ｍの１ｍＭのジメチルスルホキシド溶液を添加
し、Ｉｎｄｏ−ＩＡＭの終濃度が５μＭになるように調
整し、３７℃で３０分間放置する。また、さらにこの血
小板浮遊液に酸性クエン酸ブドウ糖液を終濃度が２０％
になるように添加し、再び８００Ｇの遠心力で７分間遠
心分離して血小板を沈降させる。続いて上清を除去した
後、ＨＥＰＥＳ−Ｔｙｒｏｄｅ緩衝液に血小板を浮遊さ
せ、血小板数が１０×１０４個／μｍになるように調整
したものを血小板内力ルシウム濃度測定用の試料とする
。　以上のように作成した試料に、フィブリノーゲンと
フォンウィルブランド因子をそれぞれ終濃度２０μｇ　
／　ｍ　１になるように添加し、試料として０．３ｍｌ
を液槽１に入れ、前記した検Ｊｕｌｌの作成の場合と同
様な手順によって蛍光強度を測定する。第１５図にずり
応力１８　ｄ　ｙｎ　ｅ　／　Ｃｍ２と１０８ｄｙｎｅ
／ｃｍ”の場合で、波長４１０ｎｍと４８０ｎｍの蛍光
強度比Ｒの変化を比較した０図かられかるように、低ず
り応力では血小板内のカルシウムイオン濃度の変化がな
いのに対して、高ずり応力ではカルシウムイオン濃度が
増加することがわかる。 実施例４ 実施例１の装置において、透過光量の変化を測定するフ
ォトダイオードに光パワーメータ、ＧＰ−ＩＢインター
フェイスおよびマイクロコンピュータから構成される計
測システムを接続することによって、新たに考案しに血
小板の凝集指標の有効性について検討した。 まず体重的３Ｋｇの家兎の頚動脈に外径１．３５ｍｍの
塩化ビニール製チューブを挿入し、血液を３．８％クエ
ン酸ナトリウム水溶渣／全血液＝１７９の割合で、プラ
スチック容器に採取した。 次に実施例１の場合と同様にして、ＰＰＰとＰＲＰを作
成し、ＰＲＰをＰＰＰで希釈することにより血小板数４
２Ｘ１０’個／μｍ、２１Ｘ１０’ｆｌｉ／μｍ、１４
Ｘ１０’個ｌμｌの血小板浮遊液をそれぞれ試料１、試
料２、試料３とした。これらの試料にまず１５秒間血小
板に凝集を惹起させないように３ｄｙｎｅ／ｃｍ２のず
り応力を付加し、凝集する前のＰＲＰの透過光量を測定
した後、１５秒間で１８ｄｙｎｅ／ｃｍ”のすり応力に
上昇させて、血小板の凝集データを得た。さらにＰＰＰ
の透過光量を測定し、従来の（１）式で帰られる凝集率
で表記した凝系曲ｌｌ１（第１６図）と新たに（２）式
で得られる凝集率で表記した凝集曲線（第１７図）をマ
イクロコンピュータを用いて描き、それぞれ最大凝集率
も計算した。また測定終了後それぞれ血小板を即座にホ
ルマリンで固定化して、非凝集血小板の数を自動血小板
計数装置で測定し、凝粟前の血小板数との値から、非凝
集血小板数の変化率を計算した。その結果、試料Ａは６
５％、試料Ｂは７６％、試料Ｃは８０％となり第１７図
から得られる各試料の渕定経了点での凝集子と非常に良
く一致した。一方、第１６図かられかるように、従来の
凝集率で表記すると、凝集曲線から得られる測定絣了点
での凝集率は、自動血小Ｍ＊計数装置から得られるその
値を大ぎく下回る。またさらに従来の凝集率で表記する
と、凝集前の血小板数が少なくなるほど、血小板の凝集
が活発になるような錯覚を測定者に与える。 以上の結果から、（２）式により算出した凝集率は、血
小板の漿果状態を正確にかつ定量的を表す指標として非
常に有効であることがわかる。 ［発明の効果〕 本発明の装置は、細胞浮遊液に、広範囲のすり応力を、
層流状態でかつ均一に付加し、それに伴う細胞の微少な
応等を、従来のものの１０００倍程度０感度で測定しつ
るものである。また本発明の装置を用いることにより、
血小板機能と密接な関係がある血小板膜上の特定のＩ！
蛋白および血漿蛋白の異常を容易に調べることができる
。また本発明の装置を用いることは、血小板機能の変化
を示す疾患の診断、治療、さらに抗血小板作用を目的と
した薬剤の開発において極めて有益なものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の一実施例に係る血小ｉ機能を測定する
装置の概略図、第２図は第１図に示した装置の細胞浮遊
液にずワ応力を付加する部分の断面図、第３図は凹状の
試料室の平面図である。第４図は光源部内の平面図、第
５図は受光器内平面図である。第６図は第１図に示した
本発明に係る装置を用いて実施例１により得られた血小
板凝集曲線である。第７図から第１４図は第】９図に示
した；：の発明に係る秒置を用いて、実施例２により帰
られた血小板凝集曲線であり、第７図は通常の血小板浮
遊液、第８図はＧＰＩｂモノクローナル抗体で処理した
血小板浮遊液、第９図はＧ　Ｐ　Ｉｌｂ／ＩＩＩａモノ
クローナル抗体で処理した血小板浮遊液、第１０図はフ
ォンウィルグランド因子のＧ　Ｐ　ＩＩｂ／１１１ａの
結合部位に対するモノクローナル抗体で処理した血小板
浮遊液、第１１図はベルナールスーリエ症＃Ａ群のＨＡ
名“から採取した血小板浮遊液、第１２図は血小板無力
症の患者から採取した血小板浮遊液、第１３図はフォノ
ウィルブランド病の患者から採取した血小板浮遊液、第
１４図は篇フィブリノーゲン血症の患者から採取した血
小板浮遊液をそれぞれ測定したものである。第１５図は
第１図に示した本発明に係る装置を用いて、実８！例３
により得られた血小板内のカルシウムイオン濃度の変化
を測定した結果を示したものである。第１６図と第１７
図は、第１図に示した本発明に係る装置を用いて、実施
例４により得られた血小板凝集曲線であり、第１６図は
従来の凝集率により表した凝集曲線、また第１７図は新
たに考案した凝集率により表した凝集曲線である。 １：液槽 ２：回転体 ３：試料室 ４：コアレス形エンコーダ付モータ ５：モータ駆動制御装置 ６二光源部 ７：受光器 ８：記録計 ９：高さ調整ステージ １０：粗動ダイヤル １１：微動ダイヤル １２：微動回転ステージ １３：微動ダイヤル １４：先導入用光ファイバ １５：光導出用光ファイバ １６：散乱光導出用光ファイバ １７ニモータ用コード １８：多芯光ファイバ １９：多芯光ファイバ ２０：単芯光ファイバ ２１：多芯光ファイバ ２２：多芯光ファイバ ２３：多芯光ファイバ ２４：スタンド ２５：光フアイバガイド ２６：光フアイバ固定台座 ２７：回転体高さ表示器 ２８：先導入路 ２９：光導出路 ３０：液槽固定ビン ３１ニステンレス円柱体 ３２：光フアイバ固定台座 ３３・：渦電流式変位センサ ３４：軸孔 ３５：液槽側壁 ３６：液槽底板 ３７：液槽挿入部 ３８：センサ挿入部 ３９：センサ用コード ４０：散乱光導出路 ４１：モータ固定プレート ４２：ペースプレート ４３：台座 ４４：多芯光ファイバ ４５　：Ｈｅ−Ｎｅガスレーザー ４６：水銀−キセノンランプ ４７：紫外光透過フィルター ４８：フォトダイオード ４９ａ：光電子増倍管 ４９ｂ：光電子増倍管 ５０：を子回路 ５１：干渉フィルター ５２ａ：干渉フィルター ５２ｂ：干渉フィルター 特許出顆人 東し株式会社 第３図 すり応力　（ｄｙｎｅ／ｃｍ２） 第６図 透過光量 （ｐＷ） 透過光量 （ｐＷ） 透過光量 大 （ｐＷ） 透過光量 （ｎＷ） 透過光量 （ｎＷ） 第１ ○図 ずり応力 ８　ｄｙｎｅ／ｃｍ２ ずり応力 ０８　ｄｙｎｅ／Ｃｒｒ＋２ 時間 第１ １図 すり応力 時間 第１ ２図 すり応力 時間 第１ ３図 時間 第１４図 第１ ５図 時間 （ＭＩＮ、） 第１ ６図

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）（イ）底板と側面からなる円筒形の試料室であり
   、かつ該試料室に導入された試料内の光路長が１ｃｍ以
   上となるように照射光導入路と透過光導出路を側面に有
   する試料室、および （ロ）該試料室の底板に対し、２度以下をなす凸形の円
   錐面回転体 を有する細胞機能測定装置。
2. （２）（イ）底板と側面からなる円筒形の試料室であり
   、かつ該試料室に導入された試料内の光路長が１ｃｍ以
   上となるように照射光導入路と透過光導出路を側面に有
   する試料室、 （ロ）該試料室の底板に対し、２度以下をなす凸形の円
   錐面回転体、および （ハ）透光性の側面を持つ円筒形の液槽を有する細胞機
   能測定装置。
3. （３）請求項１または２記載の細胞機能測定装置におい
   て、さらに （ニ）該回転体に係合し、該回転体を回転駆動する駆動
   装置、 （ホ）該駆動装置を制御する制御機構、 （ヘ）該照射光導入路に係合し、細胞浮遊液に充分な光
   を提供する光源、 （ト）該透過光導出路に係合し、細胞浮遊液を透過した
   光を検出する受光器、および （チ）該受光器に係合し、受光器で得られた信号を連続
   的に記録する記録計 を備えることを特徴とする細胞機能測定装置。
4. （４）散乱光導出路を試料室の側面に設けた請求項１、
   ２または３記載の細胞機能測定装置。
5. （５）請求項１、２、３または４記載の細胞機能測定装
   置を用いて、血小板にずり応力を付加して惹起される凝
   集を測定することにより、血小板の凝集能と粘着能を測
   定する方法。
6. （６）請求項１、２、３または４記載の細胞機能測定装
   置を用いて、１０ｄｙｎｅ／ｃｍ＾２乃至４０ｄｙｎｅ
   ／ｃｍ＾２のずり応力において、血小板の凝集を測定す
   ることにより、血小板凝集能を測定する方法。
7. （７）請求項１、２、３または４記載の細胞機能測定装
   置を用いて、１０ｄｙｎｅ／ｃｍ＾２乃至４０ｄｙｎｅ
   ／ｃｍ＾２の低ずり応力領域と、８０ｄｙｎｅ／ｃｍ＾
   ２以上の高ずり応力領域で、血小板の凝集を測定するこ
   とにより、血小板凝集能およに粘着能を測定する方法。