JPH02247566A - ビタミンｂ↓１↓２及びホレートの分析用の血清サンプルのマイクロ波調製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、内因性結合物からのビタミン８１２（コバラ
ミン）及び／又はホレート（ｆｏｌａｔｅ）（葉酸）の
遊離法に関し、特にビタミンＢ　Ｉｇ及び／又はホレー
トについての分析用の哺乳動物の血清の調製法に関する
。

〔従来の技術及び発明が解決しようとする課題〕ヒトの
ビタミンＢｌｚの分析は、ビタミンＢＩ！の欠乏を生じ
させる成る疾患例えば悪性貧血、胃切除後症候群、栄養
欠乏、腸障害及びビタミンＢ　Ｉｔの血中濃度がしばし
ば低下する他の症状を診断し次に治療する価値のある技
術である。ヒトのビタミンＢ１２の分析は、又ビタミン
Ｂ　１ｍの血中濃度が上昇する成るを髄増殖性疾患例え
ば慢性骨髄白血病を診断するのに有用である。

最初、ビタミン１３１２は、例えば微生物学的分析にお
いてユウーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａｇｒａ
ｃｉｌｉｓ）　　又はラクトバチリス・レイハマンニ（
Ｌａｃｔｏｂａｃｉ１１ｕｓ　ｌｅｉｃｈｍａｎｎｉｉ
）の何れかを用いて分析された。最近では、ビタミンＢ
１２に関する放射性同位元素希釈（ＲＩＤ）分析が利用
されている。ビタミン８１２に関するこのようなＲＩＤ
分析技術は周知であり、文献も多い０例えば、ラウら、
「ミュウジャメント・オブ・セラムＢ１．・レベルズ・
ユウジング・ラジオアイソトープ・ダイリュウション・
アンド・コーテッド・チャーコール（Ｍｅａｓｕｒｅｍ
ｅｎｔ　　ｏｒ　　Ｓｅｒｕｍ　　Ｂａｔ　　Ｌｅｖｅ
ｌｓ　　Ｕｓｉｎｇ　　Ｒａ−ｄｉｏｉｓｏｔｏｐｅ　
Ｄｉｌｕｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｃｏａｔｅｄ　Ｃｈａｒｃ
ｏａｌ）　Ｊブラッド（ＢＬＯＯＤ）、　２６：２０２
〜２０４（１９８５）、その変法であるラブン（Ｒａｖ
ｅｎ）ら「インブルーブト・メソッド・ホア・メイジュ
アリング・ビタミンＢ１２・イン・セラム・ユウジング
・インドリシック・ファクター・”Ｃｏ−Ｂ凰８・アン
ド・コーテッド・チャーコール（Ｉｍ−ｐｒｏｖｅｄ　
　Ｍｅｔｈｏｄ　　ｆｏｒ　　Ｆｌｅａｓｕｒｉｎｇ　
　Ｖｉｔａｍｉｎ　　Ｂａｔ　　ｉｎＳｅｒｕｍ　　Ｕ
ｓｉｎｇ　　Ｉ＋１ｒｉｎａｉｃ　　Ｆａｃｔｏｒ、　
　”Ｇｏ−Ｂａｔ　　ａｎｄＣｏａｔｅｄ　Ｃｈａｒｃ
ｏａｌ）　Ｊ　、ジャーナル・オブ・クリニカル・バソ
ロジ−（ＪＯ［］ＲＮＡＬ　ＯＦ　ＣＬＩＮＩＣＡＬ　
ＰＡ−ＴＨＯＬＯＧＹ）　、　２２　：　２０５　（１
９６９）参照（両方とも、ここに参考文献として引用さ
れる）。

サンプル中のビタミン１３ｔｘ類似体の存在は、例えば
純粋の内因子又はビタミンＢ１１に対して特異的でない
結合蛋白を排除又は不活性化するように処理された結合
蛋白の何れかのように、分析に利用される結合蛋白がビ
タミンＢ１８に特異的でない限り、　ＲＩＤ分析により
見出だされる見かけ上のビタミンＢｔｔ濃度を誤らせる
原因となる。コールハウス（Ｋｏｌｈｏｕｓｅ）ら、「
コバラミン類似体は、ヒトの血清中に存在し、そしてコ
バラミン欠乏を隠す・・・・」、に、　Ｅ、　Ｊ、　Ｍ
ＥＤ、、２２９　：　７８４　（１９７８）参照。

Ｂ、を及びその類似体は、血清中の内因性担体蛋白に結
合する。これらの蛋白は、代表的にはＢ１１及びその類
似体に対してＩＯＸ　１０−’の親和力定数を有するヘ
プトコリン（ｈｅｐｔｏｃｏｒｒｉｎ）及びトランスコ
バラミン（ｔｒａｎｓｃｏｂａｌａｍｉｎ）である、ビ
タミンＢ、、の最近のＲＩＤ分析は、例えばコールハウ
スらの教示に従ってテストされるべき血清サンプルを沸
騰することにより、その内因性の天然の結合蛋白から内
因性ビタミンＳ＋Ｚを遊離する工程を一般に必要とする
。現在の沸騰法は、沸騰水浴を利用し、血清サンプルは
、通常少なくとも１５〜２０分間沸騰水浴に漬けること
により、比較的長時間高温度に保持される必要がある。

内因性結合蛋白の不活性化の次に、既知量の内因子（Ｂ
　息ｘに対して特異的）を加える。放射性ビタミンＢ４
例えば”Ｃｏ　−Ｂ　、！ちまたそれ自体全ての内因子
と結合するのに十分な既知量で加えられる。従って、全
ての加えられた内因子は、血清サンプルに存在するビタ
ミンＢｔｔ又は組成物に加えられる放射性ビタミンＢｌ
宜のいずれかに２より結合されなければならない、天然
のビタミンＢ１２及び放射性ビタミンＢ目は、ともに反
応中に動力学的に競合して制限された量の内因子結合蛋
白と結合するので、内因子結合ビタミンＥ３１２の放射
能カウントが阻害又は低下される程度は、テストされて
いるサンプル中に存在する天然のビタミンＢｅｘの量の
指標である。内因子による放射性ビタミンＢ１２の結合
の阻害は、概して、例えば未結合放射性１３＋ｘを吸着
する蛋白被覆木炭を用いることにより、又はレウイン（
Ｌｅｗｉｎ）ら、米国特許第３９３７７９９号（ここに
参考文献として引用する）に記載されたように、ベント
ナイトの使用により、内因子結合ビタミンＢ１ｍから全
ての未結合ビタミンａｔｉを分離することにより決定さ
れる。

内因子結合放射性ビタミンＥ３ｔｘの混合物を含む上澄
み液の放射能は、次に放射能についてカウントされる。

血清サンプル中のビタミンＢＩ！の濃度は、次にしばし
ば当業者に周知の技術を用い標準曲線との比較により、
カウントから決定される。

ホレートＲＩＤ分析は、同様なやり方で放射性ホレート
及びホレート結合物を用いて全く同様である。しかしな
がら、ホレート分析で、はホレート類似体について同様
な問題はなく、そしテ要特異性ホレート結合物について
も同様な問題はない、ホレート及びビタミンｓｔｉの両
者の競合分析技術は、分析されるべき血清サンプル中の
内因性結合蛋白からビタミンＢｒｌ及び／又はホレート
を遊離するために、テストに先立ってサンプルの加熱又
は沸騰を必要とする。現在の沸騰工程は、コントロール
するのが難しく、手間がかかりしかも時間を空費する。

沸騰することなく内因性結合蛋白からビタミンＢ１１を
遊離するためにサンプルを化学的に変性する手段も、報
告されている。大体、これらの方法は、サンプルに２Ｎ
水酸化ナトリウムを添加し、２０分後アルカリを緩衝さ
れたトレーサーの添加により吊布することを含む０例え
ば、ＰＣＴ公開第ＷＯ３２１０３４６１号、出願第Ｐ　
ＣＴ　／［ｌ５８２１００４２６号参照、有機液体例え
ばアセトンの使用が、又蛋白を変性してＢ１１を遊離す
るのに記載されている０例えば、マンスバッハら、米国
特許第４３００９０７号参照、これらの化学的技術のそ
れぞれにおいて、ＫＣＮが、サンプル中のビタミンＢ１
１をその最も安定な形であるジアノコバラミンに変換す
る主要な目的のため通常加えられる０例えば、ＰＣＴ公
開第ＷＯ３２１０３４８１号、出願！１！ＰＣＴ／ＵＳ
８２１０　Ｏ４２６号参照、同様に、ヅチオスレイトー
ルが、ホレート分析中ホレートを安定化する手段として
、通常ホレート分析に用いられ、それ故ビタミンＢ１２
−ホレート複合分析に用いられる０例えばレウイン（Ｌ
ｅｗｉｎ）ら、米国特許第４０２８４６５号参照、これ
らの化学的方法は、同様に時間を空費し、その上毒性の
ある化学品の使用を必要とする。従って、沸騰法より早
くしかも簡単でありその上化学的方法より安全な血清蛋
白の変性方法が求められている。

〔課題を解決するための手段〕

本発明の方法は、血清蛋白を変性する従来周知の方法よ
りも簡単、迅速、安全でしかも工業上実施できるもので
ある。任意の標準のマイクロ波を利用する本発明の変性
法は、約１分以内でうまく、安全に、完全にしかも迅速
に行なうことができる。

本発明のマイクロ波法は、ビタミンＢ！、！及び／又は
ホレートが内因性血清結合物から遊離されるような蛋白
の変性の驚くほど有効な方法である。

本方法は、さらに存在するビタミンＢ□□又はホレート
の全体を殆ど乱すことなく変性を生じさせることができ
る。

本発明は、ビタミンＢ、、について血清サンプルを分析
する前に血清サンプルをマイクロ波処理することよりな
る内因性血清結合物から哺乳動物の血清サンプル中のビ
タミンＢｔｚを遊離する新規な方法を提供する。血清サ
ンプルは、一般に約２０〜９０秒、好ましくは約３０〜
６０秒、最も好ましくは約６０秒の間、高の目盛りでマ
イクロ波処理される。

第１図は、高の目盛りでマイクロ波にかけられたときの
、時間の経過に対するヒト血清サンプル中の結合ビタミ
ンＢ□８の遊離の非直線的増加（黒丸）並びにマイクロ
波処理をされなかったサンプル中の時間の経過に対する
結合ビタミンＢ１２の遊離の欠如（白丸）を示す。

第２図は、血清サンプルが高の目盛りで６０秒間マイク
ロ波処理される本分析で用いられる標準曲線のプロット
である。未知の血清から得られた値は、曲線に適用され
て血清ビタミン１３ｔｚ濃度を見出だすことができる。

ビタミンＢ目又はホレートの分析用の哺乳動物の血清サ
ンプルの調製は、内因性結合物からのビタミンＢ１２及
び／又はホレートの遊離を必要とする０本発明方法は、
従来のマイクロ波オーブンの使用によるビタミン８１４
又はホレートを遊離する簡単、迅速、完全且つ清潔な方
法を提供する。

ビタミンＢ１２又はホレートについて分析されるべき血
清サンプルの配置は、それらを従来のマイクロ波オーブ
ンに置き、そして内因性血清結合物からビタミンＥｌｘ
ｘ又はホレートを遊離するのに十分な時間マイクロ波に
それらをさらすことによりマイクロ波処理される。ビタ
ミンＢ１３及び／又はホレートを結合できる血清結合物
が不可逆的に変性されたとき、内因性結合物の遊離が完
全に行なわれる。Ｉ３＋ｘ又はホレートの遊離の測定は
、当業者の周知の任意の方法によりテストでき、このよ
うな方法の一つは、以下の実施例に詳細に示される９例
えば、ここで示されたガイドラインが与えられると、当
業者は、本発明の方法に従ってＢ　ｒｚ又はホレートの
遊離について特定のマイクロ波オーブンの最適な時間及
び温度目盛りを容易に決定できる。

マイクロ波を発する任意のマイクロ波オーブンを用いる
ことができる。マイクロ波オーブンは、概して低、中間
、高の目盛りそしてこれらの間の段階を有する０本発明
において、高の目盛りは、オーブンのマグネトロンがオ
ーブンが操作している時間の８０〜１００％でマイクロ
波を発していることを意味する。中間から高（中−高）
の目盛りは、マグネトロンがオーブンが作動している時
間の６０〜８０％でマイクロ波を発していることを意味
する。

中間の目盛りでは、マイクロ波は上記時間の４０〜６０
％で発し、低の目盛りでは、マイクロ波は上記時間の４
０％以下で発する。概して、もしマイクロ波のパワーレ
ベルが１〜１０とされるならば、レベルｌＯはマグネト
ロンが上記時間の　１００％でマイクロ波を発する目盛
りに相当し、レベル９はマグネトロンが上記時間の９０
％でマイクロ波を発する目盛りに相当するなどとなる。

本発明の方法では、高いワット数を発生できるマイクロ
波例えば７００ワツトを発生するものを用いることが好
ましい、その上、高いパワーレベルを用いること、並び
に分析されるべきサンプルが約２０〜９０秒、好ましく
は約３０〜６０秒、最も好ましくは約６０秒の間マイク
ロ波処理されることが好ましい、用いられるパワーレベ
ル及び時間は、選択されたオーブンのタイプさらにサン
プルの大きさ及び数により変化することが考えられる。

さらに、もし中間から高いパワーレベル又はそれより低
いパワーレベルが選ばれるならば、マイクロ波処理をよ
り長い時間行うことが望ましい。

一方、血清サンプルは、マイクロ波処理されて、最少約
１５〜２０秒の間約６５〜約１００℃、好ましくは約８
０〜１００℃、最も好ましくは約８０〜約８５℃の温度
にされる。血清サンプルは、６０秒以下の間これらの温
度でマイクロ波処理される。

好ましくは、個々の血清サンプルの大きさは、少なくと
も１５０μＱである。概して、血清サンプルは、大きさ
約１５０〜２５０μ２、最も好ましくは大きさ約２００
μ２である。

本発明方法は、内因性結合物からビタミンＢ、２及び／
又はホレートを遊離するのが望まれるとき、任意の従来
のＢｌ□及び／又はホレート分析のために哺乳動物の血
清サンプルを調製するのに用いることができる。これら
の方法は、当業者にとり周知の技術である競合結合分析
技術例えばＲＩＤに　とり有用である。このような技術
の例は、米国特許第３９３７７９９号、レウインら、米
国特許第４０２８４６５号、キャベリ（Ｃａｂｅ１１ｉ
）ら、米国特許第４３３２７８８号に見出だされ、これ
らの全てはここに参考文献として引用される。

本発明のマイクロ波方法は、存在するビタミンＢｉｔ又
はホレートの全体を殆ど乱すことなく変性を生じさせる
、蛋白の変性の驚くほど完全な方法である。過去の加熱
方法は、沸騰水浴を利用し、それでは血清は長時間概し
て１５〜２０分間連続的に加熱される必要があった。サ
ンプルは従来の方法では１５〜２０分間沸騰温度に保た
れる必要があったので、６０秒以下の非常に短い時間の
マイクロ波の高いパワーが有効であるとは驚くべきこと
であった。低いパワーレベルがたとえ時間をかけても有
効でないことはさらに驚くべきことであった。

［実施例］ １、マイクロ波： 全てのテストで、７００ワツトの出力を出せるシャープ
・カル−セル（５ｈａｒｐ　Ｃａｒｏｕｓａｌ）　ＩＩ
タイプマイクロ波オーブン［シャープ・エレクトロニッ
クス・コーポレーション（Ｓｈａｒｐ　Ｅｌｅｃｔｒｏ
ｎｉｃｓＣｏｒｐ、　）マー９（Ｍａｈｗａｈ）　、Ｎ
、　Ｊ　、　］を使用した。

２、高の目盛りでの血清の変性 ”Ｃｏ標識Ｂ−１２を、以下の変法を加えたエキンス（
Ｅｋｉｎｓ）　Ｒ，Ｐ、　　　ｒクリソ、キミ、アクタ
、（Ｃ１ｉｎ、Ｃｈｉｍ、Ａｃｔａ、）　」５．４５３
　（１９６０）及びラウ（Ｌａｕ）　Ｋ、　Ｓ、ら、「
ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）　Ｊ　２６．２０２　（１９６
５）（両者ともとこで参考文献として引用する）に記載
された飽和分析の手順及び趣旨に基づいて製造した。

単離されたコロニー中のプソイドモナス・シエルマニイ
（Ｐｓｅｕｄｏａ＋ｏｎａｓ　ｓｈｅｒｍａｎｉｉ）　
　（Ａ、Ｔ、Ｃ，Ｃ，１１３６７３）の生培養物を３０
分間３０℃でステージＩのＢ−１２液体培地に移し、そ
して最良の生長物で培養された３０分間３０℃のステー
ジ■からステージ■の液体培地の第二の懸濁された培養
物を発酵の目的のために選んだ、計算量の塩化コバルト
（５７℃）をステージ■のＢ−１２液体培地にスパイク
し、そして発酵工程を暗室で４日間続けた０発酵生長物
を次の２４時間５．６−シメチルベンズイミダゾールに
よりスパイクし、モしてカラム精製にかけた。

（１）ＡＬＡカラムＡＧＩＸ８ＡＣ１００−２００メツ
シユ［バイオ−ラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）カタログ＃１
８７−２０００、リッチモンド、ＣＡＩ（２）ＳＭ−２
バイオ−ビーズ（Ｂｉｏ−Ｂｅａｄｓ）を有するカラム
（バイオ−ラッド・カタログ＃１５２−３９２０、リッ
チモンド、ＣＡ） ”Ｃｏ標識Ｂ−１２を酢酸及びメタノールを用いてカラ
ムから溶離し、さらに２０ＸＩＡＧ５０Ｗ−Ｘ２　（１
００−２００メツシユ）　Ｎ　ａ＋型の樹脂カラム（陽
イオン交換）により精製し、そして濃縮物を０．９％ベ
ンジルアルコール中で１０μＣＬ／−に希釈した。

各試験管に２００μ２のヒト血清サンプルを入れた。１
艷のＢｏｗｌ’レーサーであるｓ７Ｃｏ標識Ｂ１□を各
試験管に加え、次に各試験管を十分に攪拌し、１０分間
室温でインキュベートして標識した１３ｔｔを血清結合
蛋白に結合させた。試験管の半分をコントロールとして
残し、マイクロ波処理しなかった。他の半分を高の目盛
りでマイクロ波処理した。試験管の別々の組を５．１０
．１５．２０．３０．４５又は６０秒間マイクロ波処理
した。

それぞれの処理時間後、管のサンプルを室温に放冷し、
前記のラウら、及びレイブンらに記載された木炭法によ
りｆａｔｓの遊離について測定した。木炭の錠剤を各管
に加えて遊離のＢ＋ｔを結合させた。

管を次に５分間インキュベートしついで攪拌した。

各管を１０分間３０００ＲＰＭで遠心分離した。

結合しそして上澄み液中に残った１３＋ｔをガンマ・カ
ウンターにより測定した。従って、マイクロ波処理によ
り遊離されるＢ、！は、活性化木炭に結合するようにな
り、上澄み液中に残る標識したＢ、！の量は血清結合蛋
白に結合して残ったものを表した。結果は、表Ｉ及び第
１図に示される。マイクロ波にさらされたサンプルは、
より多い遊離した結合Ｂ目を含み、一方マイクロ波処理
を受けなかったサンプルは、殆ど又は全く遊離Ｂ、を含
まなかった。さらに、第１図は結合Ｅ３１２の遊離が非
直線であったことを示しているが、遊離した結合Ｂ１２
の量は、サンプルがマイクロ波にさらされた時間の量と
ともに増加することをデータは示している。

表Ｉ　　　　高の目盛りのマイクロ波 時間（秒’）　　　Ｂ　ｚｘｃ　Ｔ　Ｓ　　　　Ｂ　Ｉ
ＩＣＴ　Ｓマイクｐｉ１１　　　　　　　　　　マイク
Ｄ１１１＆ｔ。

５　　　　　　　　９Ｑ９５　　　　　　　　　　　　
９３５６２０　　　　　　　　４６９Ｇ 合計のカウント　　　１５２３４ ３、中間より高及び中間の目盛りでの血清の変性第２の
テストで前述のようにして調製した若干の血清サンプル
管を、１０，２０．３０．４５又は６０秒間、中間の目
盛りでマイクロ波処理し、そして他のセットを中間より
高の目盛りでマイクロ波処理した。異なる時間の処理で
、管のセットを取出し、冷却した。結合しそして遊離し
た８１ｍを前記の木炭法を用いて分離した。この実験か
ら得られたデータを表■に示す、結果は、結合Ｂ＋ｍの
不完全な遊離を示す、６０秒で、若干のＢｌ、はまだ血
清蛋白に結合していた。

表ｎ　中間より高及び中間の目盛りでのマイクロ波処理 時間（秒）　　Ｂ鳳ｚｃ　Ｔ　Ｓ　　　　Ｂ　ｒｔｃ　
Ｔ　Ｓ合計のカウント　　　１５５４０ ４、マイクロ波法を用いるＢ１２分析 試験管（１２Ｘ７５ｍ）を標準、ブランクコントロール
及び血清サンプルとラベルした。管に２００μａの標準
、コントロール又は患者の血清サンプルを適当に加えた
。ブランク管に２００μ２の零の標準を加えた。全ての
管にさらにｌｉｄの”Ｇ　ｏ標識Ｂ皇ｘトレーサーを加
えた。管を高の目盛りで６０秒間マイクロ波処理し、次
に室温に冷却した。下記のようにマイクロビーズ試薬に
結合された内因子及びホレート結合蛋白を含むマイクロ
ビーズ試薬１００μ２ずつを容管に加えた。ブランク管
に１００μ意のブランク試薬を加えた。

全ての管を攪拌し、次に１時間室温でインキユベートシ
た。インキュベーション後、管を１０分間遠心分離し、
デカンテーションし、ガンマカウンターによりカウント
した。使用したコントロールは、エンピロメンタル・ケ
ミカル・スペシアリティ−Ｘ（Ｅｎｖｉｒｏｎｓ＋ｅｎ
ｔａｌ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　５ｐｅｃｉａｌｔｉｅｓ）
、アナハイム（Ａｎａｈｅｉｓ＋）　、ＣＡ及びギルフ
ォー　ド・チバ・コーニング・ダイアグノスティクス　
（Ｇｉｌｆｏｒｄ、　Ｃｉｂａ−Ｃｏｒｎｉｎｇ　Ｄｉ
ａｇｎｏｓｔｉｃｓ）　、オバリン（Ｏｂｅｒｌｉｎ）
　、オハイオから得られた。

表■は、既知の濃度のＢ１．を含む標準についての得ら
れたカウントを示す、結合８１．の％は、標準中の未標
識Ｂ１！の濃度の増加とともに減少する。

標識Ｂ１３の殆ど完全な置換は、標準中のＢ１１の高い
濃度で生ずる。対数一対数のグラフで表示されるデータ
は、直線となる。第２図は、標準曲線を表す、患者のサ
ンプルのデータは、表■に示される０表■は又マイクロ
波法を用いてホレートの遊離に関するデータを含む、ホ
レートは、沸騰法に近い程度にマイクロ波法の下で遊離
される。

表ｍ 全カウント（ＣＰＭ）　　　　　１６０２２．００ブラ
ンク（ＣＰＭ）　　　　　　　　７３９．００零標準　
　　　　　　　　　　　　１００．００１　００　ｐｇ
／艷　　　　　　　　　　　　　　　　　　７９．　６
０２５０ｐｇ／ｄ　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　５８．　５０５００ｐｇ／ｄ　　　　　　　　　　
　　　　　　　　３　９．　８　０１０００ｐｇ／ｄ　
　　　　　　　　　　　　　　　２３．　８０２０００
ｐｇ／ｗｔＬ　　　　　　　　　　　　　　　　１２．
　９９マイクロビーズ試薬は、マイクロビーズに結合し
た内因子及びホレート結合蛋白の混合物よりなった（６
〜２０μの大きさのポリアクリルアミドのビーズ、バイ
オ−ラッド・ラボラトリーズ）。

精製したホレート結合蛋白は、脱イオン水で透析し、−
晩ＥＤＡＣｒエチル−３（３−ジメチルアミノ　プロピ
ル　カーポジイミド）」を用いてｐＨ６．３で水和した
ビーズに結合した。結合したビーズを低塩及び高塩の緩
衝液により洗いそして１０■／ｄの濃度に再懸濁した。

精製した内因子を脱イオン水について一晩透析し、ＥＤ
ＡＣを用いてｐＨ４，９で加水分解したビーズに結合し
た。ビーズを高塩及び低塩の緩衝液により洗い、濃度を
Ｌｏｇ／Ｉ！に調節した。マイクロビーズ試薬混合物は
、１０■／ｄのホレート結合蛋白を結合したビーズ及び
１０■／−の内因子結合ビーズを含んだ、ビーズの懸濁
物を滴定し、参考ビーズに一致させた。

二元トレーサー例えば＋ｔｓＩホレートプラス”Ｃｏ　
　ＢＩｔの使用により、葉酸及びＥａｔｓの濃度の両方
が同一のサンプルで分析できる。これらの分析は、当業
者に周知でありそして実施されている。

本発明は、明瞭さ及び理解のために説明及び実施例によ
りやや詳細に記述されたが、説明及び実施例は請求の範
囲に制限するものと考えてはならない。

〔発明の効果〕

本発明の方法によれば、血清蛋白を、簡単、迅速、安全
且つ完全に、しかも存在するビタミンＢ、２又はホレー
トの全体を殆ど乱すことな（変性できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、高の目盛りでマイクロ波にかけられたときの
、時間の経過に対するヒト血清サンプル中の結合ビタミ
ンＢ１２の遊離の非直線的増加（黒丸）並びにマイクロ
波処理をされなかったサンプル中の時間の経過に対する
結合ビタミンＢ１□の遊離の欠如（白丸）を示すグラフ
であり、第２図は、血清サンプルが高の目盛りで６０秒
間マイクロ波処理される本分析で用いられる標準曲線を
表すグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）ビタミンＢ＿１＿２について血清サンプルを分析
   する前に、血清サンプルをマイクロ波処理することより
   なる、内因性血清結合物から哺乳動物の血清サンプル中
   のビタミンＢ＿１＿２を遊離する方法。 （２）血清サンプルが、約２０〜９０秒間マイクロ波処
   理される、請求項１記載の方法。（３）血清サンプルが
   、中−高の目盛りから高の目盛りでマイクロ波処理され
   る、請求項１記載の方法。 （４）血清サンプルが、ヒト血清サンプルである、請求
   項１記載の方法。 （５）血清サンプルがマイクロ波処理されて、サンプル
   を少なくとも１５秒間約６５〜約１００℃の温度にする
   、請求項１記載の方法。 （６）血清サンプルがマイクロ波処理されて、サンプル
   を少なくとも１５秒間約８０〜約８５℃の温度にする、
   請求項１記載の方法。 （７）ホレートについて血清サンプルを分析する前に、
   血清サンプルをマイクロ波処理することよりなる、内因
   性血清結合物から哺乳動物の血清サンプル中のホレート
   を遊離する方法。 （８）血清サンプルが、約２０〜９０秒間マイクロ波処
   理される、請求項７記載の方法。（９）血清サンプルが
   、中−高の目盛りから高の目盛りでマイクロ波処理され
   る、請求項７記載の方法。 （１０）血清サンプルが、ヒト血清サンプルである、請
   求項７記載の方法。 （１１）血清サンプルがマイクロ波処理されて、サンプ
   ルを少なくとも１５秒間約６５〜約１００℃の温度にす
   る、請求項７記載の方法。 （１２）血清サンプルがマイクロ波処理されて、サンプ
   ルを少なくとも１５秒間約８０〜約８５℃の温度にする
   、請求項７記載の方法。 （１３）ビタミンＢ＿１＿２及び／又はホレートについ
   て血清サンプルを分析する前に、血清サンプルをマイク
   ロ波処理してサンプルを少なくとも１５秒間約８０〜約
   ８５℃の温度にすることよりなる、内因性結合物から哺
   乳動物の血清サンプル中のビタミンＢ＿１＿２及び／又
   はホレートを遊離する方法。