JPH02234700A - 生体タンパク質の酵素的測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔利用分野〕 本発明は生体タンパク質の酵素的測定方法に関し、さら
に詳細にはヒトの尿中又は血清中のタンパク質の酵素的
測定方法に関するものである。

従来より尿中のタンパク質の測定は腎孟腎炎腎硬化症等
の腎疾患の紗断に用いられ．血清中のタンパク質の測定
は骨髄腫，肝硬変，ネフローゼ症候群等の診断を目的に
汎用されている。

〔従来技術〕

従来よりタンパク質の測定には各種方法があるが、臨床
検査領域において血清中のタンパク質の測定にはビウレ
ット法が、尿中のタンパク質の測定にはスルホサリチル
酸法あるいは試験紙法等が用いられている。

一方、最近食品加工分野において、タンパク質の加水分
解物にペプチダーゼを作用させ、生じたアミノ酸混合物
にアミノ酸分解酵素を作用させ、酵素反応の結果生じた
過酸化水素又はアンモニアに対応する酸化還元電流又は
電位変化、或いは前記酵素反応によって消費される酸素
濃度に対応する酸化還元電流を検出し、蛋白質の加水分
解によって生じるペプチドを測定する方法が報告されて
いる（特開昭６３−５３４６１）。

〔発明が解決しようとする問題点〕

近年、臨床検査の領域では高度な特異性を有し、高惑度
であり、さらに簡便な測定が可能なことより酵素的測定
法が広く用いられている。しかしながら、上記に述べた
ように従来は血清中のタンパク質の測定にはビウレント
法が、尿中のタンパク質の測定にはスルホサリチル酸法
．試験紙法等が用いられているに過ぎず、生体タンパク
を酵素的に測定する方法は試みられていないのが現状で
ある。ビウレット法は感度が低いこと、また高脂血清を
測定した場合には誤差を生じ易いこと、又ペプチド結合
の量を測定しているため糖やリピッドの含有量の多いタ
ンパク質が存在する血清を測定する場合には正確な値を
反映しにくいという欠点を有する。さらに、スルホサリ
チル酸法，試験紙法は定性試験法としては適用出来るが
定量性に欠ける点に問題がある。

一方、食品のタンパク質の加水分解物にペプチダーゼを
作用させ、生じたアミノ酸混合物にアミノ酸分解酵素を
作用させ、酵素反応の結果生じた過酸化水素又はアンモ
ニアに対応する酸化還元電流又は電位変化、或いは前記
酵素反応によって消費される酸素濃度に対応する酸化還
元電流を検出して蛋白質の加水分解によって住しるペプ
チドを測定する方法においては、食品製造のプロセス管
理を目的とするもので蛋白質分解酵素で部分分解された
蛋白質を測定の対象としたものである。これを生体タン
パク質のような特異なタンパク質を測定の対象とし、さ
らに微量な試料を対象とした高度な定量性を要求される
分野での応用は難しい。

つまり使用する酵素が生体タンパクの測定に対して特異
性の面で充分に満足する性質を持つものである必要があ
り、さらに迅速な測定を可能とする為にも反応性も考慮
しなければならない。

本発明はこの様な事情に鑑みてなされたものであって、
その目的とするところは血清あるいは尿中のタンパク質
を高度な特異性を有し、高惑度又簡便性を持って酵素的
に測定しようとするものである。

〔問題点を解決するための手段およびその作用〕本発明
は、血清あるいは尿にエンドタイププロテアーゼを作用
させてペプチドを生成させた後、エキソタイププロテア
ーゼを作用させてアミノ酸を生成させる。その後、以下
に示すような方法を用いて生体タンパク質を測定する方
法である。

■　アミノ酸酸化酵素を作用させ、生じた過酸化水素を
ベルオキシダーゼ，ｉＭ酸化水素検出試薬あるいは過酸
化水素電極で測定する方法。

■　アミノ酸酸化酵素を作用させ、消費される酸素を酸
素電極で測定する方法 ■　アミノ酸脱水素酵素，ＮＡＤあるいはＮＡＤＰを用
いて測定する方法。

エンドタイププロテアーゼとしては生体中のタンパクを
効率よくペプチドレベルに分解するが、自己消化を行わ
ない、つまり生体タンパク由来以外のペプチドを生成し
ない性質を持つものが望ましく、さらに後述のエキソタ
イププロテアーゼの影響を受けにくい性質を持つものが
望ましい。具体的には、バクテリアル・八１−プロテア
ーゼ（ナガセ生化学工業製〕，トリブシン．キモトリプ
シン，アクチナーゼＥ（科研製薬製）．サーモリシン，
パパイン等が挙げられる。より好ましくは、バクテリア
ル・ＡＩ−プロテアーゼがよく、使用量は１００〜３０
００ＰＵＮ／ａｓｓａｙ　，好ましくは５００〜１５０
０ＰＩＮ／ａｓｓａｙである。

エキソタイププロテアーゼとしては前記の反応で住成し
たペプチドを効果的にアミノ酸に分解するが、前記のエ
ンドタイププロテアーゼに分解されず、さらにエンドタ
イププロテアーゼを分解しにくい性質を持つものが望ま
しい。具体的には、カルポキシベプチダーゼＷ．カルボ
キシペプチダーゼＡ，カルポキシペプチダーゼＢ，グリ
シンペプチダーゼ，アミノペプチダーゼＭ　ロイシンペ
プチダーゼ等が挙げられる。より好ましくは、カルボキ
シベプチダーゼＷがよく、使用量は２〜５０ｕ／ａｓｓ
ａｙ　，好ましくは３　〜３０ｕ／ａｓｓａｙである。

アミノ酸酸化酵素としては各種の酵素が使用できるが、
具体的には、Ｌ−リジンオキシダーゼ，Ｌ−アミノ酸オ
キシダーゼ，Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼが挙げられ
る。より好ましくは、Ｌ−リジンオキシダーゼがよく、
使用量は０．３〜３．Ｏｕ／ａｓｓａｙである。

アミノ酸脱水素酵素としては各種の酵素が使用できるが
、より好ましくは、グルタミン酸デヒドロゲナーゼがよ
く、使用量は０，３〜３．Ｏｕ／ａｓｓａｙの範囲であ
る。

上記測定操作をさらに具体的に説明する。

試料にエンドタイププロテアーゼを加えた後、２５〜４
５゛Ｃで３〜１５分間，好ましくは３０゜Ｃで３〜６分
間作用させ、次にエキソタイププロテアーゼを２５〜４
５゛Ｃで１〜１０分間，好ましくは３０゜Ｃで２〜５分
間作用させる。その後アミノ酸酸化酵素を２５〜４５゜
Ｃで３〜１５分間，好ましくは３０゜Ｃで３〜６分間作
用させ、その反応の結果生じた過酸化水素を通常の方法
で測定する。例えばベルオキシダーゼ及び過酸化水素検
出試薬を用いて光学的に測定する、あるいは過酸化水素
電極を用いて電位の変化で測定する。また、反応の結果
消費される酸素を酸素電極で測定することもできる。

さらにエンドタイププロテアーゼ及びエキソタイププロ
テアーゼの反応により生成したアミノ酸にアミノ酸脱水
素酵素を，ＮＡＤ”あるいはＮＡＤＰ＋の存在下で作用
させて測定することもできる。

試験例１　エキソタイププロテアーゼとしてカルポキシ
ペプチダーゼＷを用いた場合の 各種エンドタイププロテアーゼのヒト 血清アルブミンへの反応挙動 ０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ　７．０）で溶解したヒト
血清アルブミン（４０■／ａ）０．７５ｄに後記の各種
エンドタイププロテアーゼ（２５ｍｇ／Ｉｄ．）　　０
．１ｍｌを加エ３０゜Ｃで５分間反応させた後、カルボ
キシベプチダーゼＷ　（ＩＯＯＩＪ／ｄ）　　（生化学
工業製）　　０．１ｍｆｔを加え３０℃で３分間反応さ
せる。その後Ｌ−リジンオキシダーゼ（３００ｕ　／ｍ
ρ）（生化学工業製）０．０５ｍｆｆｉを添加し、反応
の結果消費される酸素を酸素電極で測定した。ブランク
はヒト血清アルブミンに代わり０．１Ｍリン酸緩衝液（
ｐｌ＋　７．０）を使用し同様に操作し測定した。エン
ドタイププロテアーゼとしてはトリプシン（シグマ社製
，結晶品，７９００ＢＡＥＥ　ｕ／ｍｇ），キモトリプ
シン（シクマ社製，結晶品，５５ＢＴＥＥ　ｕ／ｍｇ）
，バクテリアル・八１−プロテアーゼ（ナガセ生化学工
業製，結晶品，１０００ＰＬＩＮ　／■）を使用した。

結果を第１表に示す。

第１表 エンドタイププロテアーゼとしてバクテリアル・八１−
フ゜ロテアーゼを用いエキソタイフ゜フ゜ロテアーゼと
してはカルボキシペプヂダーゼＷ （３００　Ｕ　／　ｍｌ）　、ロイシンアミノペプチダ
ーゼ（３００Ｕ／ｄ）（シグマ社製）及びカルボキシベ
プチダーゼＢ（３０００／戚）（シグマ社製）を使用し
、試験例１と同様に操作した。その結果を第２表に示す
。

第２表 キモトリプシンのヒト血清アルブミンへの反応性は小さ
く、又トリプシンは反応性は大であるが、ブランク値が
大きくなる傾向を示した。一方バクテリアル・八ｌ−プ
ロテアーゼはヒト血清アルブミンへの反応性は三者の中
で最も良好で、かつブランク値も三者の中で最も小さか
った。

試験例２　エンドタイププロテアーゼとしてバクテリア
ル・ＡＩ−プロテアーゼを用いた場合の各種エキソタイ
ププロテアーゼ のヒト血清アルブミンへの反応挙動 カルボキシペプチダーゼＷを用いた時が最も反応性が良
好であった。

９一 １　〇一 （１００００ｐｕｎ　／ｍＲ）　　０．１ａｌｌを加え
３０’Ｃ，５分反応させた後、カルボキシペプチダーゼ
Ｗ　（１００　Ｕ　／　ｍｌ　）０．１戚を加え３０゜
Ｃ，　　３分反応させる。その後リジンオキシダーゼ２
．ＯＵ，　　４−アミノアンチピリン０．　１８３■，
Ｎ一エチルーＮ一（２−ヒドロキシ−３−スルホブロビ
ル）−１トルイジン０．９６７ｍｇ，ベルオキシダーゼ
６ｕを含有する０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ　７．０）
２．０ｍＲを添加し３０゜Ｃで５分間反応させた後、５
５５ｎｍの吸光度を測定した。ブランクは尿に代わり０
．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ　７．０）を使用し同様に操
作し測定した。別に各種濃度のヒト血清アルブミンを上
記と同様に操作し作製された検量線（第１図）より検体
中のタンパク濃度を求めた結果１５ｍｇ／ｄｌであった
。

実施例２ 尿の代わりにＯ．　ＬＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で
希釈したヒト血清を用いて実施例１と同様に測定した結
果５．３ｇ／ａであった。

（１００００ＰＵＮ＃＋Ｒ）　　０．１ｍｌを加え３０
゜Ｃで５分間反応させた後、カルボキシペプチダーゼＷ
（１００ｕ＃＋＋Ｒ）０．１＋＋ｆｉを加え３０゜Ｃで
３分間反応させる。その後Ｌ−リジンオキシダーゼ（２
０ｕ／ｉｎ）　０．０５雌を添加し消費酸素速度を酸素
電極で測定した。ブランクは尿に代わり０．１Ｍリン酸
緩衝液（ｐ｝Ｉ　７．０）を使用し同様に操作した。別
に各種濃度のヒト血清アルブミンを上記と同様に操作し
作製された検量線（第２図）より検体中のタンパク濃度
を求めた結果１０■／ｄ１であった。

実施例４ 尿の代わりに０，ＩＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で希
釈したヒト血清を用いて実施例３と同様に測定した結果
５．８ｇ／ｄ１であった。

実施例５ 尿０．７５ｄにバクテリアＪレ・八１−フ゜ロテアーゼ
（１０００ｐｕｎ／ｍｌ！）　　０．ＩＩＲ１を加え３
０゜Ｃ，　　５分反応させた後、カルボキシペブチダー
ゼＷ　（１００　Ｕ　／　ｒｄ）ＯＡｍｌを加え３０゜
Ｃ，　　３分反応させる。その後グルタミン酸デヒドロ
ゲナーゼ（０．５　ｕ／　ｍｌ＞，Ｎ八叶１（１．５ｍ
Ｍ）を含有する０．　１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ９．０）
２．０　ｍを添加し、３４０ｎｍの吸光度を測定した。

ブランクは尿の代わりに水を使用して同様に操作して測
定した。別に各種濃度のヒト血清アルブミンを上記と同
様に操作し作製された検量線より検体中のタンパク濃度
を求めた結果１２■／ｄｌであった。

尖隻班ｔ 尿の代わりに０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で希
釈したヒト血清を用いて実施例５と同様に測定した結果
５．１ｇ／ｄであった。

〔発明の効果〕

本発明は生体タンパクを酵素的に測定する方法であり、
本法により生体タンパクが迅速正確にかつ高感度に測定
可能になった。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１におけるヒトアルプミンの検量線を示
すものであり、第２図は実施例３におけるヒトアルブミ
ンの検量線を示すものである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）生体タンパク質にエンドタイププロテアーゼ及びエ
   キソタイププロテアーゼを作用させた後、生じたアミノ
   酸にアミノ酸酸化酵素を作用させ酵素反応で生じた過酸
   化水素あるいは消費された酸素を測定することを特徴と
   する生体タンパク質の酵素的測定法。 ２）生体タンパク質にエンドタイププロテアーゼ及びエ
   キソタイププロテアーゼを作用させた後、生じたアミノ
   酸をアミノ酸脱水素酵素、ＮＡＤあるいはＮＡＤＰの存
   在下で測定することを特徴とする生体タンパク質の酵素
   的測定法。