JPH0220064B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、フイブリノペプチドＡ（以後、時々
FPAと呼ぶ）の濃度を測定するラジオイムノア
ツセイRIA法、このような方法において利用する
抗凝固試薬、およびこのような方法において利用
する試薬を含有するパツケージテストキツトに関
する。 現在、凝固系中の種々の物質の分析法について
興味が増大してきた。これらの物質のうちの１種
すなわち、FPAは、超凝固能力（hypercoagua
bility）の指示を与えるであろう。凝固系におけ
る一系列の事象は、このプロセスにおける最初の
事象としてFPAを解放させる。フイブリノゲン
へのトロンビンの作用を生ずる。それ以上の作用
はフイブリノペプチドＢを解放させてフイブリノ
モノマーを生成し、このモノマーは他の酵素の助
けをかりて重合して不溶性のクロツトとなる。 FPAの定量に現在用いられている実験室のテ
ストは、不適切である。H.L.Noselが開発した１
つのこのようなRIAテストは、Measurement of
FPA in Human Blood（ヒトの血液中のFPAの
測定）、JJ.clin.Invest.54：43−53（1974）および
Potential Use of FPA Measurements in the
Diagnosis and Measurement of Thrombosis）
血栓症の診断および測定におけるFPA測定の可
能性を包蔵する使用）、Thrombos，Diathes，
haemorrh.（Stuttg）33：426（1975）中に記載さ
れており、これらの両者の文献を引用よつてここ
に加える。このテストは、正常の循環するフイブ
リノゲンの約200ng（約0.09％）の生体内転化に相
当する血漿の１ml当り2ngのFPAより少量の検出
をできる。しかしながら、試料の収集および取り
扱いは非常に重大であり、そしてFPAレベルの
誤まつた増加がしばしば見られる。 本発明の目的は、絶えず一定した信頼性のある
結果を提供する。血漿中のFPAのRIA手順を提
供することである。 本発明によれば、まず血液の試料を集めること
からなる、血漿中のFPAの生体外濃度を測定す
る競合RIA法の改良が提供される。次いで、前記
試料中のトロンビンを抑制量のトロンビン抑制剤
で抑制し、そして血漿を前記試料から分離する。
次に、前記血漿の試料を、ラジオイムノアツセイ
競合結合条件下に、十分な量のFPAに対する抗
体および放射活性で氷識したFPAと接触させ、
その後血漿結合FPAを結合しないFPAから分離
し、そして放射活性を測定する。改良は、トロン
ビンを抑制するためにある種の抑制剤を使用する
ことを含む。 本発明の他の実施態様は、抑制剤の１種、キレ
ート剤および抗タンパク分解剤を含有する、RIA
法において使用する抗凝固試薬に関する。 本発明の他の面は、このようなRIA法において
利用する試薬を含有するパツケージテストキツト
に関する。 本発明において使用できるトロンビン抑制剤
は、作用が速く、すなわち、トロンビンをほとん
ど瞬間的に、たとえば、10秒より短かい時間で抑
制し、血漿中で安定でり、すなわち、FPAをほ
とんどまたはまつたく形成させず。長期間安定で
あり、すなわち、使用前通常の貯蔵寿命を有し、
そしてトロンビンの本質的に不可逆的抑制剤であ
る。このような抑制剤の１種は、Ｄ−フエニルア
ラニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−Ｎ−〔２−（１−クロ
ロ−７−クアニドヘプタン−２−オン）〕（以後、
Ｄ−Phe−Pro−ArgCh₂Clと呼ぶ）およびその適
当な塩類、たとえば、トロンビンを抑制しかつ前
述の性質、すなわち、作用が速く、血漿中で安定
であるなどの性質を有する塩類である。 適当な塩類は、強いまたは弱い無機または有機
の酸類から誘導された酸付加塩類を包含する。適
当な無機酸の例は、ハロゲン含有酸、たとえば、
塩酸、フツ化水素酸または臭化水素酸；リン含有
酸、たとえば、リン酸、亜リン酸、次亜リン酸；
イオウ含有酸、たとえば、硫酸、次亜硫酸または
チオ硫酸；および他の酸、たとえば、硝酸または
マンガン酸である。適当な有機酸の例は、ギ酸、
酢酸、クロロ酢酸、クエン酸、乳酸。酒石酸など
である。 酸付加塩は、適当な酸を含有する水溶液中に遊
離塩基を溶かし、そしてこの溶液を蒸発すること
により塩を単離することによつて、あるいは遊離
塩基と選択した酸とを有機溶媒中で反応させるこ
とによつて、製造し、後者の場合において、塩は
直接分離るかあるいはこの溶液の濃縮により得る
ことができる。２当量またはそれ以上の酸を使用
するとき、多酸付加塩が得られ、その場合分子中
に１個より多い塩基性窒素原子が存在する。１当
量の酸を使用するとき、一酸付加塩が得られる。 Ｄ−Phe−Pro−Arg−Ch₂ClのHF酸付加塩お
よび遊離塩基は、最近の刊行物、Kether，
Thrombosis Research 14：969−993（1979）に
記載されている手順に従つて製造できる。 述べたように、本発明の方法の第１工程は、血
液試料を集め、前記試料中のトロンビンを抑制し
そして前記試料から血漿を分離することからな
る。 血液試料は、通常の手段、たとえば、20ゲージ
の針を用いる静脈穿刺により集めることができ
る。一般に、５〜10mlの血液を集める。 血液試料はその後瞬間的にまたは直ちに抑制量
の前述の抑制剤の１種と合わせて、前記試料中の
トロンビンを抑制する。たとえば、抑制量は、全
血の１ml当り、約0.001mg〜1.0mg、好ましくは約
0.04〜約0.6mgである。有利には、抑制剤と一緒
に、キレート化量、たとえば、全血の１ml当り約
２mg〜６mg、好ましくは約3.5〜4.5mgのキレート
剤、たとえば、エチレンジアミン四酢酸EDTA
またはエチレングリコールビス（Ｂ−アミノエチ
ルエーテル）Ｎ，Ｎ，N′，N′−四酢酸（EGTA）
またはそれらの塩を合わせることによつて、生体
外のトロンビンの発生は実質的にまたは完全に抑
制される。通常、FPAのタンパク分解を実質的
に減少させるかあるいは防止するための抗タンパ
ク分解剤を抗タンパク分解量たとえば、全血の１
ml当り約50〜300KIU（カリクレイン抑制剤単位）
好ましくは約90〜150KIUの量で加える。このよ
うな抗タンパク分解剤の例は、Trasylol（ア
プロチニン）である。有利には、本発明のトロン
ビン抑制剤の１種と一緒にキレート剤および抗タ
ンパク分解剤を使用することによつて、収集の問
題は有意に軽減し、そして室温において数時間、
たとえば、２〜４時間、４℃において数日間、た
とえば、１〜３日間、そして−20℃において数カ
月間、たとえば２〜４カ月間、安定な血漿試料が
得られる。 すべての３種類の物質は、有利には、水溶液、
たとえば、塩化ナトリウムまたは緩衝剤の水溶中
で、便利に結合して抗凝固試薬を形成できる。抗
凝固試薬は十分な量の抑制剤、キレート剤および
抗タンパク分解剤を含有し、これにより各々は、
抗凝固試薬を血液に加えたとき、その意図する機
能を発揮する。通常、水性抗凝固試薬の各１ml中
に、約0.1mg〜約１mg、好ましくは約0.4〜約0.6mg
の抑制剤が存在し、約20mg〜約60mg、好ましくは
約35mg約45mgのキレート剤が存在し、そして約
500〜約3000KIU／mg、好ましくは約900〜約
1500KIU／mlの抗タンパク質剤が存在する。試
薬は抗凝固量で使用、たとえば水性試薬は、全血
１ml当り、約0.05〜約１ml、好ましくは約0.1〜
約0.2mlの量で使用する。試薬のPHは、一般に約
４〜７である。 次に、血漿を常温において遠心分離することに
より、たとえば、1000〜15000Xgにおいて、十分
時間、たとえば、20分間４℃または室温において
遠心分離することにする。好ましくは、これは収
集後できるだけ速やかに実施する。分離した血漿
は適当な温度、たとえば、20℃以下で、本発明に
従うRIAアツセイイにおいて使用するまで、貯蔵
する。 RIA手順において血漿を使用する前に、通常そ
れを前処理して橋かけ反応性のフイブリノゲンお
よびフイブリン（フイブリノゲン）断片を血漿か
ら除去しなくてはならない。これは常法におい
て、たとえば、血漿をアルコールで沈殿させそし
て液を透析することによつて、あるいはベント
ナイトまたは他の同様な作用物質を血漿に十分な
量で添加して妨害物質を血漿から除去することに
よつて、実施できる。通常、ベントナイトのスラ
リーを血漿混合物へ加える。次いで、血漿を混合
し、最小1200Xgにおいて十分な時間、たとえば、
20分間遠心分離する。上澄を取り出し、そしてア
ツセイ法に使用する。 本発明の方法の第２工程は、RIAアツセイを
RIA競結合条件下で常法において、たとえば、前
述のNOSSEL刊行物に記載されるようにして、
実施することからなる。基本的には、これは十分
な量のFPAに対する抗体および放射活性で標識
したFPAを血漿試料に加え、その後抗体結合し
たFPAを結合しないFPAから分離し、そして放
射活性を測定することからなる。 FPA抗体と反応する放射活性で標識したFPA
を使用できる。便利には、放射活性で標識したデ
スアミノチロシルーFPA錯体を使用できる。そ
れは、たとえば、Ｉ−125または他の放射性同位
体でクロラミンＴ法を用いて標識することができ
る。この錯体を製造する詳細な手順は、前述の
NOSSEL刊行物において見いだすことができる。 一般に、FPAをＩ−125または他の放射性同位
体で約800〜約1600マイクロキユリー／マイクロ
グラムの比活性に標識する。この同位体標識
FPAをこの分野で知られているように希釈して、
反応媒質中で抗体と理想的な免疫測定会合を行う
ことができる同位体標識試薬および最適なアツセ
イ感度を得ることができる。この希釈は、PH約４
〜10の適当な水性緩衝液を用いて実施できる。こ
の希釈に用いることができる適当な緩衝液は、ト
リス（Tris）、商業的に入手できる、トリス（ヒ
ドドロキシメチルル）アミノメタンを含有する水
溶液；バルビタール、商業的に入手できる５，５
−ジエチルバルビツル酸の水溶液および他のよく
知られた緩衝液である。希釈度は、用いる場合、
初期の比活性、および所望の最適な計数およびア
ツセイの感度を実現するために要する所望の崩
壊／分（DPM）に依存しうる。 血漿の未知の試料を放射活性で標識したFPA
試薬と混合した後、抗体、たとえば、FPAと免
疫反応しうる抗体と放射活性FPAを含有する抗
体溶液を混合物へ加える。抗体はFPAおよび放
射活性FPAに対する特異性を有する。こうして、
抗体の所定量によつて結合された放射活性FPA
の量は未知の血漿試薬からの標識しないFPAの
存在で減少し、そしてこの効果は標識しない
FPAの濃度に直接関係する。 この分野で既知の方法を、FPAおよび標識
FPAと反応しうる抗体を得るためにいることが
できる。たとえば、抗体は宿主動物、たとえば、
ウサギを接種することによつて製造することがで
きる。接種後、ある期間を経過させ、その間宿主
は抗体を生成し、次いで抗血清をその動物から放
出させて抗体を得る。この抗体を、放射活性で標
識したFPAの希釈に使用したものに類似する緩
衝物質中に、希釈してアツセイにおいて最高の性
能を得る濃度にして第１抗体試薬を形成する。た
とえば、トレーサー量の放射活性FPA（0.01〜
0.09Ci）の20〜80％、好ましくは30〜70％を結合
する程度に抗血清を希釈することが好ましい。抗
体を血漿の混合物へいつたん加えると、得られた
混合物を、抗体結合FPAおよび結合しないFPA
の実質的な平衡を生成する温度において十分な時
間培養する。培養期間中、希釈された抗血清中の
抗体は放射活性FPAおよびFPAと免疫錯体を形
成する。本発明の実施において、培養工程は約15
〜37℃、好ましくは20〜30℃の温度でほぼ40〜
120分間、好ましくは40分間実施することが好ま
しく、その後抗体によるFPAの結合は実質的平
衡に到達することがわかつた。 培養工程が完結したとき、結合しないFPAを
抗体結合FPAから分離する。 分離は、木炭、あるいはイオン交換樹脂から本
質的に成る膜の薄いストリツプを包含する常法に
より便利に実施される。他の分離技術は第２抗体
を使用する技術であり、この第２抗体はFPAに
対して特異的ではないが、FPAと反応する抗体
（第１抗体）に対して特異的である。第２抗体は、
第１抗体を得た動物と異なる動物を、抗体を得た
が測定すべき抗原に対して特異的でない型の正常
動物のガンマグロブリンで、接種することによつ
て製造できる。第２抗体は、同位体標識抗原およ
び第１抗体の試薬の希釈に使用したものに類似す
る緩衝物質中に、希釈して、アツツセイにおいて
最高の性能を得る濃度にすることもできる。 分離を促進するために、ポリエチレングリコー
ルまたは他の適当なポリマーを反応媒質中に、第
２抗体溶液の添加の後に、あるいはその前におい
てさえ、別の試薬として加えることにより、供給
することができる。このポリマーのすべてまたは
主要部分を、第２抗体試薬へ前もつて混入するこ
とにより、反応媒質中に供給することが好まし
い。こうして、典型的には約１〜15重量％、好ま
しくは約３〜12重量％、たとえば約７〜９重量％
のポリマーを第２抗体試薬中に含めて、反応媒質
中のポリマーの濃度を十分にして、同位体標識抗
原または標識しない抗原を有する第１水溶液抗体
の間の免疫沈殿反応を加速することができる。 RIAテストのプロトコールは、因子の数に依存
して変化しうる。しかしながら、一般に、テスト
試薬はすべて室温に平衡化し、次いで前もつて決
定した濃度のFPAを含有する標準の適当量を系
列の管に加えることができ、そして血漿の試料を
他の系列の管に加えることができ、次いで標識
FPA試薬およびFPA抗体試薬を順番に管のすべ
てに加えることができ、次いでこれらの管を渦発
生成させ、ふたをし、そして培養する。第２抗体
を分離に使用するとき、それを次に管へ加えるこ
とができる。典型的には、本発明によれば、管の
培養は第２抗体の添加後不必要であるが、管は必
要に応じて培養することができる。次いで、管を
渦発生させ、遠心分離する。管をデカントし、上
澄を廃棄できる。次いで管を計数し、そして標準
から得られた値を用いて標準曲線を構成できる。
標準曲線上に得られた値をプロツトすることによ
り、未知の試料について平均値を決定することが
できる。未知のFPAを定量するために実施する
計算は、普通の方法に従う。ゼロのFPAを含有
する管における計数を、100％に設定する〔Ｂ零
以下の終止（closing）〕。標準中のFPAが増加す
るにつれて、計数（Ｂ終止として定義）は減少す
る。なぜならこれらの計数はゼロ管における計数
で割つてＢ／Ｂ零以下の値を得るからである。こ
のＢ／Ｂ零以下値を、半対数グラフ用紙上FPA
の濃度に対してプロツトできる。Ｂ／Ｂ零のロジ
ツツト（logit）変換およびFPA濃度を用いて、
曲線に直線に変換できる。 ある場合において、特異抗体を含有しない非特
異性結合対照緩衝液を形成することが望ましいで
あろう。この対照緩衝液を使用して、反応媒質か
ら特別に分離されない同位体標識FPAを確認で
きる。これらの場合、真の合トレーサーは、非特
異計数をすべての試料から減ずることによつて定
量できる。 本発明のRIA法の実施において使用するため、
必要な試薬および物質を含有するパケージテスト
トキツトを準備する。パツケージは３種類以下の
別々の成分を有することができ、ここで同位体標
識FPA試薬、前記FPAに対して特異的である抗
体試薬、および抗凝固試薬を準備する。これらの
試薬の各々をパツケージにおいて別々の成分とし
て準備して３成分のパツケージを形成するか、あ
るいはこれらの試薬の１種またはそれ以上を組み
合わせて、３種類より少ない別々の成分を有する
パツケージを形成できる。また、ストパツケージ
は、３種類またはそれより少ない成分に加えて、
追加の成分、たとえば、標準試料および対照試料
を調製するためのFPA試薬、FPAに対して特異
的でないがFPA抗体に対して特異的である第２
抗体試薬、血漿の前処理試薬、ならびにテストを
実施する装置、たとえば試薬を貯蔵するびん、テ
ストを実施しかつある場合において試薬、たとえ
ば、対照試料および標準試料を貯蔵する小びん、
を含むこともできる。このパツケージ全体を周囲
温度で貯蔵しかつ運搬し、そして使用者はそれを
受け取つた時、冷蔵庫の温度、たとえば、２℃〜
８℃において、使用するまで、貯蔵することがで
きる。 以下の実施例により本発明をさらに説明する
が、本発明はこれらの実施例に限定されれない。 実施例 フイブリノペプチドＡのラジオイムノアツセイ
において使用する試薬を、次のようにして調製す
る： １ 0.1％のエチレンジアミン四酢酸ニナトリウ
ム、0.2％のウマアルブミン、0.04％のシクロ
ヘキシイミド、0.005％のクロルアンフエニコ
ール、0.584％の塩化ナトリウム、および0.005
％のFD＆イエロー＃５を含有する0.05モルの
トリス緩衝液中に、ほぼ６ナノグラムのＮ−チ
ロシルFPA Ｉ−125を含有する、フイブリノ
ペプチドＡ（FPA）Ｉ−125を調製する。この
溶液のPHは、8.40±0.05である。この溶液は10
マイクロCiより少ないＩ−125を含有する。 ２ 0.05モルのトリス緩衝液（0.133W／Ｖ％の
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム、
0.30W／Ｖ％のウマアルブミン、0.04％のシク
ロヘキシイミド、0.005W／Ｖ％のクロルアン
フエニコール、0.584W／Ｖ％の塩化ナトリウ
ムおよび33KIU／ｍのアプロチニンを含有す
る）中で純粋なフイブリノペプチドＡ抗原の適
当な希釈を行うことにつて、フイブリノペプチ
ドＡ標準を調製する。これらの標準は0.1、
1.0、2.0、5.0、10.0、20.0および40.0ナノグラ
ム／mlに等しい。 ３ 純粋なフイブリノペプチドＡ抗原をトリス緩
衝タンパク溶液（標準と同一）に1.3および8.0
ナノグラム／mlの概算濃度で加えることによつ
て、フイブリノペプチドＡ品質対照物質を調製
する。 ４ 接合したフイブリノペプチドＡ−ウシ血清ア
ルブン免疫原を前もつて接種したウサギから放
出させた抗血清から、フイブリノペプチドＡ第
１抗体試薬を調製した。この抗血清を0.05モル
のトリス緩衝液（0.10W／Ｖ％のウマアルブミ
ン、0.04W／Ｖ％のシクロヘキシイミド、
0.005W／Ｖ％のクロルアンフエニコール、
0.0035W／Ｖ％のFD＆ブルーダイ＃１、
0.584W／Ｖ％の塩化ナトリウムおよび
10USPK単位／mlのヘパリンを含有する）で
１：100より大きい比率で希釈する。 ５ 防腐剤を含有する0.1モルのリン酸ナトリウ
ム緩衝液中に6.5W／Ｖ％の分子量6000〜7000
のポリエチレングコールを含有する、ポリエチ
レングリコール第２抗体試薬を調製する。 ６ 0.20W／Ｖ％のウマアルブミン、0.04％のシ
クロヘキシイミド、0.005％のクロルアンフエ
ニコールおよび0.584％の塩化ナトリウムを含
有する0.05モルのトス緩衝液に、75mg／mlのベ
ントナイトを加えることによつて、ベントナイ
トスラリーを調製する。 ７ 非特異結合緩衝液は、これが抗フイブリノペ
プチドＡ抗血清を含有しない以外、第１抗体試
薬と同一である。 ８ 4.0W／Ｖ％のエチレンジアミン四酢酸、
1000KIU／mlのアプロチニン（Trasylol）、
0.3〜0.6mg／mlのＤ−Phe−Pro−ArgCh₂clお
よび0.9W／Ｖ％の塩化ナトリウムを含有する
抗凝固剤溶液を調製する。この溶液のPHは4.5
である。 抗凝固試料管の調製： ５mlの排気した血液収集管中に0.5mlの抗凝固
剤を、気密注射器により注入する。これらの管は
使用するまで４℃で貯蔵すべきである。 血液試料の収集および調製： 20ゲージの一本の試料針を用いて、完全静脈穿
刺により血液を収集する。針を静脈にそう入した
後、止血帯を除く。適当な抗凝固剤を含有する排
気した管中に、５mlの血液を集める。おだやかに
倒立させることにより、血液と抗凝固剤を完全に
混合する。 試料は、収集後できるだけすみやかに、1000〜
1500Xgで４℃または室温において20分間遠心分
離すべきである。血漿を細胞から分離し、アツセ
イを行うまで、−20℃以下の温度において貯蔵す
る。 血漿試料の処置： 12×75のガラス、ポリヌチレンまたはポリエチ
レンの管中に0.5ml（500μ）の血漿を分配する。
渦を発生させかつ最低1200Xgで10分間遠心分離
する。注意して上澄を吸い出し、清浄な管へ移
し、そのときベントナイト粒子を移したりあるい
は吸い出さないように用心する。 アツセイ手順： １ 要求するテスト成分を遠心分離器から取り出
し、そして室温（20〜26℃）に平衡にさせる。 ２ 0.00、1.00、2.00、5.00、10.00、20.00および
40.00ng／mlの標準の各々の200マイクロリツト
ルを、一系列の管に加える。200μの患者の
処理した試料を、他の系列の管へ加える。対応
する反復する組の非特異結合（NSB）管を、
200μの0.00ng／mlの標準の添加により調製す
る。 ３ 100μのフイブリノペプチドＡ Ｉ−125反
応溶液をすべての管中に分配する。 ４ 各管を数秒間おだやかに渦発生させて、完全
な混合を確保する。 ５ 100μのNSB緩衡液を加えたNSB管を除外
して、100μのフイブリノペプチドＡ抗体溶
液をすべての管中に分配する。 ６ 各管を数秒間おだやかに渦発生して、完全混
合を確保する。 ７ 管をおおい、そして室温（20〜26℃）で40〜
120分間培養する。 ８ 工程５における抗体溶液の分散に用いたのと
同じ添加の順序および順次の時限を用いて、
PEG−第２抗体溶液をよく混合し、そして1.0
mlをすべての管へ分配する。数秒間激しく渦発
生する。 ９ すべての管を1200Xg以上において室温で20
分間遠心分離する。 10 管の内容物をデカントし、そして液体を廃棄
する。すべての管を吸取紙上に少くとも５分間
排液する。管のリツプを紙タオル上に軽くとん
とんと打ちつけて、残りの液体を吸収させる。 次いで、各管を最小10000の計数を累積するた
めに十分な期間放射活性について計数し、そして
各濃度の標準および患者の試料の正味の計数／分
（cpm）を測定し、そして記録する。各標準、患
者または対照の血清の管の正味のcpmをゼロ
ng／mlの標準管の平均の正味cpmで割り、そし
て100を掛ける。商は、FPAの不存在下の結合量
に比べたFPAの存在下の抗体へ結合したFPA Ｉ
−125の比率（Ｂ／B₀パーセント）を表わす。 半対数グラフ用紙の一次の軸上に各標準の二重
反復テスト値の平均のＢ／B₀パーセントを、標
準の濃度（ナノグラム／ミリリツトル）の関数と
して、プロツトすることにより、標準曲線を構成
する。各患者の血清および対照血清の二重反復テ
スト値の平均のＢ／B₀パーセントを決定し、そ
してこの標準曲線からの患者または対照の血清の
Ｂ／B₀パーセント値についてのFPAの濃度をも
決定する。FPAの正味のcpm値およびＢ／B₀パ
ーセント値を下表１に記載する。

【表】

【表】 実施例 年令25〜60才の35人の正常な被験者についての
予備データは、血漿の１ml当り0.3〜1.7ナノグラ
ムの値を与えた。 多数のアツセイについて実験内および実験間に
おいて、変動率は10％より小であることが示され
た。0.1ナノグラム／ミリリツトル程度に低い値
を、0.0ナノグラム／ミリリツトルの標準と区別
できる。 種々の量の純粋なフイブリノペプチドＡを加え
た２種類の別々の試料について、精度の研究を実
施した。これらの試料をフイブリノペプチドＡに
ついて測定し、そして回復した値を期待値と比較
した。平均の回復値（recovery volue）は100.8
％であつた。 フイブリノペプチドＡが増大した血漿の試料
（ほぼ30ナノグラム／ミリリツトル）を段階希釈
し、そしてフイブリノペプチドＡについて測定し
た。希釈した試料は、標準曲線全体を通じて直線
的に回復した。 上のデータが示すように、この方法は0.3〜
40.0ナノグラム／ミリリツトルのフイブリノペプ
チドＡのレベルにおいて、非常に精度が高く、感
度が高く、そして再現性がある。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 第１に、血液の試料を集め、前記試料中のト
   ロンビンを抑制量のトロンビン抑制剤で抑制し、
   そして血漿を前記試料から分離し、第２に、前記
   血漿の試料を、ラジオイムノアツセイ競合結合条
   件下に、十分な量のフイブリノペプチドＡに対す
   る抗体および放射活性で標識したフイブリノペプ
   チドＡと接触させ、その後、抗体結合フイブリノ
   ペプチドＡを結合しないフイブリノペプチドＡか
   ら分離し、そして放射活性を測定することからな
   る、血漿中のフイブリノペプチドＡの濃度を測定
   する競合ラジオイムノアツセイ法において、トロ
   ンビンの抑制剤として、Ｄ−Phe−Pro−
   ArgCh₂Cl、その塩酸付加塩、そのフツ化水素酸
   付加塩、その酢酸付加塩およびそのクエン酸付加
   塩から成る群より選ばれた抑制剤を使用すること
   を特徴とする方法。 ２ 血漿をベントナイトで前処理する特許請求の
   範囲第１項記載の方法。 ３ キレート化量のキレート剤および抗タンパク
   分解量の抗タンパク分解剤が、抑制剤によるトロ
   ンビンの抑制の間に、存在する特許請求の範囲第
   ２項記載の方法。 ４ (1)Ｄ−Phe−Pro−ArgCh₂Cl、その塩酸付加
   塩、そのフツ化水素酸付加塩、その酢酸付加塩お
   よびそのクエン酸付加塩から成る群より選ばれた
   トロンビンの抑制剤、(2)キレート剤および(3)抗タ
   ンパク分解剤の水溶液からなり、前記の抑制剤、
   キレート剤および抗タンパク剤の各々は、血液へ
   添加したとき、その意図する機能を発揮するため
   に十分な量で存在する、ことを特徴とするフイブ
   リノペプチドＡの生体外定量に関連して使用する
   トロンビン抑制用抗凝固試薬。 ５ キレート剤はEDTA、EGTAおよびそれら
   のナトリウム塩から成る群より選ばれる特許請求
   の範囲第４項記載の試薬。 ６ 抗タンパク分解剤はアプロチニンである特許
   請求の範囲第５項記載の試薬。 ７ キレート剤はEDTA、EGTAおよびそれら
   のナトリウム塩から成る群より選ばれる特許請求
   の範囲第６項記載の試薬。 ８ 放射性標識フイブリノペプチドＡ試薬、フイ
   ブリノペプチドＡ抗体試薬およびフイブリノペプ
   チドＡの生体外定量に関連して使用するトロンビ
   ン抑制用抗凝固試薬からなり、前記抗凝固試薬
   は、(1)Ｄ−Phe−Pro−ArgCh₂Cl、その塩酸付加
   塩、そのフツ化水素酸付加塩、その酢酸付加塩お
   よびそのクエン酸付加塩から成る群より選ばれた
   トロンビンの抑制剤、(2)キレート剤、および(3)抗
   タンパク分解剤の水溶液からなり、前記の抑制
   剤、キレート剤および抗タンパク分解剤の各々
   は、血液へ添加したとき、意図する機能を発揮す
   るのに十分な量で存在することを特徴とする、血
   漿中のフイブリノペプチドＡの濃度のラジオイム
   ノアツセイ用パツケージテストキツト。 ９ フイブリノペプチドＡに対して特異的でない
   が、フイブリノペプチドＡの抗体に対して特異的
   である第２抗体がさらに存在する特許請求の範囲
   第８項記載のパツケージテストキツト。 １０ 純粋なフイブリノペプチドＡ試薬の標準と
   対照試料をも含む特許請求の範囲第９項記載のパ
   ツケージテストキツト。 １１ 前記試薬はPH約４〜約10の水溶液で提供さ
   れる特許請求の範囲第９項記載のパツケージテス
   トキツト。