JPH02138974A - アルギニノコハク酸合成酵素の安定化方法及び安定化組成物 - Google Patents
アルギニノコハク酸合成酵素の安定化方法及び安定化組成物Info
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- JPH02138974A JPH02138974A JP29007688A JP29007688A JPH02138974A JP H02138974 A JPH02138974 A JP H02138974A JP 29007688 A JP29007688 A JP 29007688A JP 29007688 A JP29007688 A JP 29007688A JP H02138974 A JPH02138974 A JP H02138974A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野〕
本発明はアルギニノコハク酸合成酵素（以下ＡＳＳと略
記する）の安定化方法及び安定化されたＡＳＳ組成物に
関する。
記する）の安定化方法及び安定化されたＡＳＳ組成物に
関する。
ＡＳＳは肝臓で尿素が合成される際必要な酵素の一つと
して知られている。
して知られている。
近年、このＡＳＳを肝臓病の診断等に利用覆る研究が進
められ、注目されている。
められ、注目されている。
しかし、従来ＡＳＳを利用する場合、ＡＳＳが不安定な
ため、抗原抗体反応により定量する際、抗原性が低下し
てしまう等の問題点があった。
ため、抗原抗体反応により定量する際、抗原性が低下し
てしまう等の問題点があった。
そのためＡＳＳの保存には特別の注意が必要とされてい
たが、従来その保存法としては酵素の保存法としで知ら
れている飽和硫安に熱融して保存する方法がとられてい
たにすぎなかった。
たが、従来その保存法としては酵素の保存法としで知ら
れている飽和硫安に熱融して保存する方法がとられてい
たにすぎなかった。
しかし、上記の保存方法にはＡＳＳの濃度を高くして保
存しなければならないという制約かある他、血清４ノン
プル等の保存の際には共存する他の成分に硫安が影響を
与えるという問題点があり、微量のＡＳＳを含む測定用
標準試薬や血清１ノンプルにおりるＡＳＳを安定化覆る
方法の確立が望まれていた。
存しなければならないという制約かある他、血清４ノン
プル等の保存の際には共存する他の成分に硫安が影響を
与えるという問題点があり、微量のＡＳＳを含む測定用
標準試薬や血清１ノンプルにおりるＡＳＳを安定化覆る
方法の確立が望まれていた。
本発明はこの要望に応えるものであり、悪影響を与える
硫安を用いすに、伯の成分に影響を匂えない物質を少量
用いることにＪ、すＡＳＳ含有溶液中のＡＳＳを安定化
せしめる方法及びぞの組成物を提供しＪ：うと覆るもの
である。
硫安を用いすに、伯の成分に影響を匂えない物質を少量
用いることにＪ、すＡＳＳ含有溶液中のＡＳＳを安定化
せしめる方法及びぞの組成物を提供しＪ：うと覆るもの
である。
本発明者らは上記課題を解決するため鋭意Ｕ１究を行っ
た結果、ＡＳＳの基質及び補酵素を同時に存在せしめる
ことによって目的とするＡＳＳの安定化が達成できるこ
とを見出し本発明を完成した。
た結果、ＡＳＳの基質及び補酵素を同時に存在せしめる
ことによって目的とするＡＳＳの安定化が達成できるこ
とを見出し本発明を完成した。
すなわら本発明は、精製アルキニノコハタ酸合成酵素溶
液又はアルギニノコハク酸合成酵素を含む検体液にアル
ギニノコハク酸合成酵素の基質及び補酵素を存在せしめ
ることを特徴とするアルギニノコハク酸合成酵素の安定
化方法、及びアルギノコハク酸合成酵素にアルギニノコ
ハク酸 合成酵素の基質並びに補酵素を共存せしめてな
る安定化されたアルギニノコハク酸合成酵素組成物を提
供−するものである。
液又はアルギニノコハク酸合成酵素を含む検体液にアル
ギニノコハク酸合成酵素の基質及び補酵素を存在せしめ
ることを特徴とするアルギニノコハク酸合成酵素の安定
化方法、及びアルギノコハク酸合成酵素にアルギニノコ
ハク酸 合成酵素の基質並びに補酵素を共存せしめてな
る安定化されたアルギニノコハク酸合成酵素組成物を提
供−するものである。
本発明で用いるＡＳＳの基質としてはアスパラギン酸、
アルギニノコハク酸、シ１〜ルソンから選ばれた１種以
上のものが用いられる。
アルギニノコハク酸、シ１〜ルソンから選ばれた１種以
上のものが用いられる。
又、ＡＳＳの補酵素としてはアテソシン５′三リン酸（
ＡＴＰ） 、アデノシン５′ −二リン酸（ＡＴＰ）、
リン酸から選ばれた１種以上が用いられる。
ＡＴＰ） 、アデノシン５′ −二リン酸（ＡＴＰ）、
リン酸から選ばれた１種以上が用いられる。
これらのうら特にアルギニノコハク酸とＡＴＰの組合μ
が好ましい。
が好ましい。
本発明・に於ては」二記した基質と補酵素をＡＳＳを含
有している液中に同時に存在せしめること、即ら共存せ
しめることが重要である。
有している液中に同時に存在せしめること、即ら共存せ
しめることが重要である。
存在せしめる量はＡＳＳの溶液の状態及び保存状態によ
って適宜設定されるが、通常は夫々０．００５〜０，０
３モル程度でよい。
って適宜設定されるが、通常は夫々０．００５〜０，０
３モル程度でよい。
なお、ＡＳＳは溶液状態、凍結状態、及び凍結乾燥状態
等のいずれの態様のものも用いることができる。これら
のＡＳＳを上記した本発明の基質及び補酵素を共存せし
めた緩衝液で調整し、そのままで、或いは凍結乾燥後再
溶解して保存する。
等のいずれの態様のものも用いることができる。これら
のＡＳＳを上記した本発明の基質及び補酵素を共存せし
めた緩衝液で調整し、そのままで、或いは凍結乾燥後再
溶解して保存する。
緩衝液としてはＡＳＳの緩衝液として従来から用いられ
ているものならいずれも使用することができる。例を挙
げると０．５％牛血清アルブミン及び０．９％塩化ナト
リウムを含む０．１Ｍホウ酸−水酸化ナトリウム緩衝液
（ｔ）Ｈ８，０＞又は０．０ＩＨアルギニノυクシネー
ト、０，５％牛血清アルブミン、０．９％塩化ナトリウ
ムを含む０．１Ｍホウ酸緩衝液等である。
ているものならいずれも使用することができる。例を挙
げると０．５％牛血清アルブミン及び０．９％塩化ナト
リウムを含む０．１Ｍホウ酸−水酸化ナトリウム緩衝液
（ｔ）Ｈ８，０＞又は０．０ＩＨアルギニノυクシネー
ト、０，５％牛血清アルブミン、０．９％塩化ナトリウ
ムを含む０．１Ｍホウ酸緩衝液等である。
以下実施例で具体的に説明する。
実施例１
（１）ラット肝の精製
ウィスター系の雄のラッ１〜から摘出したラッｊ〜肝を
テフロンホモジナイザーを用いて０．２５８蔗糖分中で
ホモジナイズした後、得られたホモジネトを２７． ｏ
ｏｏｘ ９で３０分遠心分離する。上清液を４５〜６５
％飽和５Ａ酸アンモニウム溶液で分画し、遠心分離する
。沈渣を緩衝液で溶解し、透析する。次に、予め平衡化
したＤＥＡＥセルロースを混合し、不純物を吸着したＤ
ＦＡＥセルロースを遠心分離して除去万る３゜ 次に上清を６〜１２％（Ｗ／Ｖ）ポリエチレングリコー
ルで分画し、沈渣を緩衝液で溶解後、６５°Ｃで熱処理
覆る。次に、不溶性タンパクを遠心分離で除去した後、
ＤＥＡＥ−セファデックス八−５０カラムに通し、次い
でセフアゾ゛ツクス（３−２００カラムに通ず。２つの
活性ピークの中でメインピタを濃縮後、５ｍＨアルキニ
ノザクシネートおよび４５％飽和硫酸アンモニウムを含
む０．０５Ｎ トリス塩酸水溶液（ｐｌ−１＝７．５
）中で結晶化して精製ラットＡＳＳを得る。
テフロンホモジナイザーを用いて０．２５８蔗糖分中で
ホモジナイズした後、得られたホモジネトを２７． ｏ
ｏｏｘ ９で３０分遠心分離する。上清液を４５〜６５
％飽和５Ａ酸アンモニウム溶液で分画し、遠心分離する
。沈渣を緩衝液で溶解し、透析する。次に、予め平衡化
したＤＥＡＥセルロースを混合し、不純物を吸着したＤ
ＦＡＥセルロースを遠心分離して除去万る３゜ 次に上清を６〜１２％（Ｗ／Ｖ）ポリエチレングリコー
ルで分画し、沈渣を緩衝液で溶解後、６５°Ｃで熱処理
覆る。次に、不溶性タンパクを遠心分離で除去した後、
ＤＥＡＥ−セファデックス八−５０カラムに通し、次い
でセフアゾ゛ツクス（３−２００カラムに通ず。２つの
活性ピークの中でメインピタを濃縮後、５ｍＨアルキニ
ノザクシネートおよび４５％飽和硫酸アンモニウムを含
む０．０５Ｎ トリス塩酸水溶液（ｐｌ−１＝７．５
）中で結晶化して精製ラットＡＳＳを得る。
（２）血中ヒトＡＳＳの定量
上記の精製ラットＡＳＳをフロインドアシュパン１〜（
１：１）を加えて乳化した乳化液０．５ｄを家兎の背部
下、皮肉及び足踵部に分割注射して免疫した。１週間後
に同量の乳化液を同様にして追加免疫し、更に初回の免
疫Ｊ：す１ケ月後に倍量の乳化液を再度追加免疫した。
１：１）を加えて乳化した乳化液０．５ｄを家兎の背部
下、皮肉及び足踵部に分割注射して免疫した。１週間後
に同量の乳化液を同様にして追加免疫し、更に初回の免
疫Ｊ：す１ケ月後に倍量の乳化液を再度追加免疫した。
最後の免疫の１週間後Ｊ：り数回にわたって採血し、血
清を分離した。
清を分離した。
この抗血清を硫安処理、ＤＥＡＥセルロースカラムに通
してＩＧに精製する。次にこのＩｇＧを石川等の方法（
Ｊ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 ９２ ： １４１３−１４２
／Ｉ（１９８２） ）を用いて、「ａｂ’に調整後、ベ
ルオキシダ−１を標識したコンジュゲート（標識抗体〉
を作る１゜次に表１に示づ濃度の標準品を脚注に示望緩
雨液で調整し、凍結乾燥する。乾燥後内び精製水−〇−
溶解し、４°Ｃで１ケ月間保存し被検試料どした。
してＩＧに精製する。次にこのＩｇＧを石川等の方法（
Ｊ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 ９２ ： １４１３−１４２
／Ｉ（１９８２） ）を用いて、「ａｂ’に調整後、ベ
ルオキシダ−１を標識したコンジュゲート（標識抗体〉
を作る１゜次に表１に示づ濃度の標準品を脚注に示望緩
雨液で調整し、凍結乾燥する。乾燥後内び精製水−〇−
溶解し、４°Ｃで１ケ月間保存し被検試料どした。
反応は２０μ、Ｑの被検試料と０．４ｄの０．５％牛血
清アルブミン及び０．９％塩化す１〜リウムを含む０．
１閂ホウ酸緩衝液ｐｌ＋８．０を加えた試験管に、常法
により精製Ｉ。Ｇを］−トしたビーズを加え室温で２時
間反応させる。
清アルブミン及び０．９％塩化す１〜リウムを含む０．
１閂ホウ酸緩衝液ｐｌ＋８．０を加えた試験管に、常法
により精製Ｉ。Ｇを］−トしたビーズを加え室温で２時
間反応させる。
上記のＦａｂ’−ベルオキシダーし溶液を０．１威加え
再び室温で１時間反応さける。
再び室温で１時間反応さける。
反応液を洗浄した後、ｐＨ５，りのクエン酸リン酸緩衝
液５０ｍ１中に７１）Ｌ、１−一フエニレンジアミン（
ＯＰＤ） １００ｑ７を溶解させ、市販の過酸化水素
水０．０１５％を添加して作った溶液５００μｇを基質
溶液とし、２Ｎ−１−（２３０４を停止溶液どじで４９
２ ｎｍの波長で吸光度を測定した。
液５０ｍ１中に７１）Ｌ、１−一フエニレンジアミン（
ＯＰＤ） １００ｑ７を溶解させ、市販の過酸化水素
水０．０１５％を添加して作った溶液５００μｇを基質
溶液とし、２Ｎ−１−（２３０４を停止溶液どじで４９
２ ｎｍの波長で吸光度を測定した。
得られた結果を表１に示す。
表
＊脚注）
＊１：Ａ
（）、５％牛血清アルブミン及び０．９％塩化ナトリウ
ムを含む０，１目ホウ酸−ＮａＯ）−１緩衝液ｐ＋−１
８，０＊２：Ｂ Ｏ，０１）１アルギニノ°リクシネ
−１−、０，５％牛血清アルブミン、０，９％塩化ナト
リウムを含む０．１１４ホウ酸緩衝液ｐＨ８，０ 水３：ＣＯ，０１ＦＩアルギニノザクシネ−１〜、 ０
．０１８ Ａ ｒＰ。
ムを含む０，１目ホウ酸−ＮａＯ）−１緩衝液ｐ＋−１
８，０＊２：Ｂ Ｏ，０１）１アルギニノ°リクシネ
−１−、０，５％牛血清アルブミン、０，９％塩化ナト
リウムを含む０．１１４ホウ酸緩衝液ｐＨ８，０ 水３：ＣＯ，０１ＦＩアルギニノザクシネ−１〜、 ０
．０１８ Ａ ｒＰ。
（）、５％牛血清アルブミンおよび０．９％塩化ナトリ
ウムを含む０．ＩＭホウ酸緩衝液ｐＨ８，０表１から明
らかなように、本発明による安定化効果は両者を共存さ
せることにより完全に保持されることがわかる。
ウムを含む０．ＩＭホウ酸緩衝液ｐＨ８，０表１から明
らかなように、本発明による安定化効果は両者を共存さ
せることにより完全に保持されることがわかる。
本発明の方法及び組成物によってＡＳＳは安定的に保存
することが可能となり、従来から望まれていた△ＳＳＳ
Ｓ測定キラ１〜則使用或いは近年注目されている肝疾患
の診断マーカーとしてのルチンアッセイに応用すること
が可能になった。
することが可能となり、従来から望まれていた△ＳＳＳ
Ｓ測定キラ１〜則使用或いは近年注目されている肝疾患
の診断マーカーとしてのルチンアッセイに応用すること
が可能になった。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、精製アルギニノコハク酸合成酵素溶液又はアルギニ
ノコハク酸合成酵素を含む検体液にアルギニノコハク酸
合成酵素の基質及び補酵素を存在せしめることを特徴と
するアルギニノコハク酸合成酵素の安定化方法。 ２、アルギニノコハク酸合成酵素にアルギニノコハク酸
合成酵素の基質及び補酵素を共存せしめてなる安定化さ
れたアルギニノコハク酸合成酵素組成物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP29007688A JPH02138974A (ja) | 1988-11-18 | 1988-11-18 | アルギニノコハク酸合成酵素の安定化方法及び安定化組成物 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP29007688A JPH02138974A (ja) | 1988-11-18 | 1988-11-18 | アルギニノコハク酸合成酵素の安定化方法及び安定化組成物 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02138974A true JPH02138974A (ja) | 1990-05-28 |
Family
ID=17751484
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP29007688A Pending JPH02138974A (ja) | 1988-11-18 | 1988-11-18 | アルギニノコハク酸合成酵素の安定化方法及び安定化組成物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH02138974A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002071841A3 (en) * | 2001-03-09 | 2003-04-24 | Paradigm Genetics Inc | Methods for the identification of inhibitors of argininosuccinate synthase expression or activity in plants |
| JP2010022328A (ja) * | 2008-07-23 | 2010-02-04 | Aisin Seiki Co Ltd | 補酵素結合型酵素の安定化方法、当該安定化方法を利用して調製した組成物、酵素センサー、及び燃料電池 |
-
1988
- 1988-11-18 JP JP29007688A patent/JPH02138974A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002071841A3 (en) * | 2001-03-09 | 2003-04-24 | Paradigm Genetics Inc | Methods for the identification of inhibitors of argininosuccinate synthase expression or activity in plants |
| JP2010022328A (ja) * | 2008-07-23 | 2010-02-04 | Aisin Seiki Co Ltd | 補酵素結合型酵素の安定化方法、当該安定化方法を利用して調製した組成物、酵素センサー、及び燃料電池 |
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