JPH02138208A

JPH02138208A - 新規物質Ｔｒ８８‐ＮＦ、う蝕予防剤及び抗菌剤

Info

Publication number: JPH02138208A
Application number: JP63221526A
Authority: JP
Inventors: Keiji Ikeda; 池田　恵二; Rumiko Katou; 加藤　留美子
Original assignee: Nippon Flour Mills Co Ltd
Current assignee: NIPPN Corp
Priority date: 1988-09-05
Filing date: 1988-09-05
Publication date: 1990-05-28

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、Ｔｒ８８−ＮＦ及びそれを利用した口腔用組
成物、更に詳しくは練り歯暦き、マウスウオッシニ、ト
ローチなどの口腔用組成物等に添加して、歯牙、う蝕の
原因となる歯垢形成阻害効果を付与する事ができろう蝕
予防剤並びに抗菌剤に関する。

〔発明の背景〕

歯垢は、いわば歯牙表面に付着した細菌叢である。う蝕
原因菌であるストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔ
ｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｕｔａｎｓ）は菌体外にグ
ルコシルトランスフェラーゼを分泌し、ショ糖から生成
する水不溶性粘着性のグルカンを合成する。

更にこのグルカンを介して細菌が有機酸を産生じてう軸
歯の原因となる。従って、歯垢形成の原因となる粘着性
グルカンの生成を抑制する事かう蝕の予防上の重要な手
段となる。そこでグルコシルトランスフェラーゼを阻害
すればグルカンは生成しないと考えられており、従来か
らグルコシルトランスフェラーゼ阻害剤について種々研
究がなされてきた。しかしながら、末だ満足すべき効果
を有するグルコシルトランスフェラーゼ阻害剤は見出さ
れていない。

従来のグルコシルトランスフェラーゼ阻害剤としては、
例えば特開昭５８−１２１２１８号公報は、クルコシル
トランスフェラーゼ阻害作用を有する生薬エキスを必須
成分とする、う蝕予防剤（特許請求の範囲第１項）を開
示しているが、具体的には、ウィキョウ、勺薬、ゲンチ
アナ、セン・へ白准、龍胆、黄連、センブリ及び黄苓を
挙げている。またその他のグルコシルトランスフェラー
ゼ阻害剤としては、特開昭５９−１５２３１３号公報に
開示されているモクマオウ、及びオオバヤシャブシから
の抽出物や、特開昭５９−１５２３１１号公報に開示さ
れている縮合型タンニン等を挙げる事ができる。

〔発明の目的〕

本発明の目的は、新規なグルコシルトランスフェラーゼ
阻害物質Ｔｒ８８−ＮＦ、及びそれを利用したう蝕予防
剤並びに抗菌剤に関する。

〔発明の構成〕

本発明者は、グルコシルトランスフェラーゼを効果的に
阻害する物質を見出すべく鋭意研究を行なった結果、Ｔ
ｒ８８−ＮＦがグルコシルトランスフェラーゼの阻害に
極めて有効であることを発見し、本発明を完成するに至
った。

本発明は、下記の理化学的性質を有する新規物質Ｔｒ８
８−ＮＦを提供するものである。

（ｉ）形　状°褐色粉末（ｉｉ）融　点：明瞭な融点を示さない。

（ｉｉｉ　）分解点：約２２０℃ （ｉｖ）元素分析：　（燃焼を用いた通常の測定法）炭
素　４８．７２％水素　　４．１５％窒ｓ　　　Ｏ，６０％（酸化銅を添加剤として使用する測定法）炭素　４８．９３％水素　　４．２６％窒素　　０．５４％（ｖ）分子量：３９６０　（重量平均分子量）ゲル浸透
クロマトグラフ法でポリエチレングリコールを分子量基準とし、移動相にＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（０，０５Ｎ　：　ＬｉＣ１添加）を用い
て測定。

（■１）赤外線吸収スペクトルｖ、、Ｘｃｍ−’　　　：３３７５．１７２０．１６１
０．１５３０．１５１０．１４５０．１３５０．１２０
０．１０３５．８７０　．７６０（ｖｊ）紫外線吸収スペトクルメタノール λｍａ、ｌｎｍ（Ｅ、。）　２８７　（３４２）２８７
肩（１９５）（ｖｉｉｉ　）呈色反応：塩化第■鉄反応　　　　　　　　　陽性アニリン・ジフ
ェニルアミン反応陽性ニンヒドリン反応　　　　　　　　陰性ドラーゲンドル
フ反応　　　　　　陰性ｐ−アニシジン・フタル酸反応
　　陰性（ｉｘ）溶解性：メタノール、水酸化す）　ＩＪウム溶液に可溶、エタノ
ール、水にやや可溶、エーテル、ヘキ÷ン、クロロホル
ム、酢酸エチノペ塩酸溶液に不溶（ｘ）安定性：室温乾燥粉末の状態では安定また本発明
は、上記のＴｒ８８−ＮＦを有効成分とするう蝕予防剤
を提供するものである。

更に本発明は、上記のＴｒ８８−ＮＦを有効成分とする
抗菌剤を提供するものである。

以下、本発明について詳細に説明する。

ｉ）原料本発明のグルコシルトランスフェラーゼ阻害物質の抽出
原料となりうるものは、ヒシ科植物からなる群より選ば
れる少なくとも一種類である。以下にこれらの具体例を
列挙する。

ヒシ科植物ヒシ科植物としては、ヒシ（Ｔｒａｐａ　ｂｉｓｐｉｎ
ｏｓａｖａｒ、　＋ｉｎｕｍａｉ）、ヒメビシ（Ｔｒａ
ｐａ　ｉｎｒ：１ｓａ）、イボビシ（Ｔｒａｐａ　ｂｉ
ｓｐｉｎｏｓａ　ｖａｒ、ｍａｋｉｎｏａ）　、オニビ
シ（Ｔｒａｐａ　ｎａｔａｎｓ　ｖａｒ、　ｊａｐｏｎ
ｉｃａ）　　、めびしくＴｒａｐａｎａｔａｎｓ　ｖａ
ｒ、ｒｕｂｅｏｌａ）　、ｌ角（Ｔｒａｐａ　ｂｉｓｐ
ｉｎｏｓａ）　、曵菱（Ｔｒａｐａ　ｂｉｃｏｒｎｉｓ
　）　、四角菱（Ｔｒａｐａｑｕａｄｒｉｓｐｉｎｏｓ
ａ）と細果野１（Ｔｒａｐａ　ｍａｘｉｍｏｗｉｚｉｉ
）等を挙げることが出来る。

本発明において好ましく用いられる原料は、ヒシの成熟
果実を乾燥したものである。本発明で上記の植物の成熟
果実を抽出原料として用いる場合は、抽出しやすいよう
に、乾燥、粗砕、微砕などの処理をしたものを用いるこ
とが好ましい。また市販されている生薬の形態のものを
用いることが簡使である。

１１）抽出本発明のＴｒ８８−ＮＦはフェノール性物質であり、グ
ルコシルトランスフェラーゼ阻害活性によって特徴づけ
られるので、有膜溶媒、水による抽出、遠心分離や濾過
などによって、これらの阻害活性を指標として適当な精
製手段を適用して精製する事ができる。これらの方法は
必要に応じて単独あるいは任意の順序に組合せ、また反
復して適用できる。以下にＴｒ８８−ＮＦの抽出及び精
製方法の１例を説明する。

イ）メタノール、エタノールなどの高極性有機・容媒で
抽出する。抽出溶媒は原料に対して２〜１０倍の割合で
用い、６０〜８０℃、１〜３時間程度の抽出を２〜数回
くり返す。その都度、熱時に濾過を行ない各抽出液を合
せ全抽出液を得る。

口）得られた全抽出液は減圧で濃縮乾固し、粗抽出物を
得る。

ハ）（ロ）で得られた粗抽出物に水を加え懸濁液とする
。これにエーテル等の非親水性有機溶媒を加え、シェー
カーを用いて振盪を１０〜３０分間程度おこなう。振盪
の後静置し、非親水性有機溶媒層と水層との界面及び水
層部分にエラグ酸等を析出させる。水層部分は３０００
〜５０００ｒｐｍ、１０〜３０分間程度の遠心分離を行
ない浮遊している。析出物を除去する。更にエラグ酸等
を除去するために水層部分は同様の操作を数回行なう。

この操作で同時に非親水性有機溶媒可溶部分をも除去す
る。

二）非親水性有機溶媒可溶部分及びエラグ酸等を除去し
た水層は全量の３分の１程度まで減圧下で濃縮する。

ホ）濃縮の終了した水層は低温状態、例えば４℃程度で
静置し、活性物質を析出させる。活性物質を析出させる
代りに高極性溶媒たとえば酢酸エチル又はｎ−ブクノー
ル等で抽出を行なってもよいが、しかし活性物質と共に
多量の夾雑物も抽出してしまうため活性物質を析出させ
ることのほうが好ましい。析出した活性物質は水層を除
いた後にイオン交換水で３回洗浄の後メタノールで溶解
し、再び濃縮乾固して活性物質を調製する。

本発明者はここで析出する活性物質をＴｒ８８−ＮＦと
命名した。

本抽出操作は、原植物特有の香、色を除去し、目的とす
るグルコシルトランスフェラーゼ阻害物質を得る方法と
して最適である。阻害活性はメタノール抽出物など粗抽
出物でも効果がある。しかし、前述の抽出方法は原植物
特有の香、色を除去し、よりグルコシルトランスフェラ
ーゼ阻害作用の強い物質を得る方法として最適である。

ｉｉｉ　）う蝕予防剤本発明者は、Ｔｒ３３−ＮＦがグルコシルトランスフェ
ラーゼ阻害作用及び抗菌作用を有する事を発見し、本発
明のう蝕予防剤を完成した。

本発明のう蝕予防剤は、本発明のＴｒ３３−ＮＦを公知
の方法で口腔用組成物に添加したものであり、これを用
いることによってう蝕を予防することができる。

口腔用組成物としては、例えば次のようなものを挙げる
ことが出来る。

練り歯磨き、粉歯磨き、マウスウォッシュ、あめ類、チ
ューインガム、各種の甘味菓子類、その他のう蝕の原因
となるあらゆる飲料及び食品類。

ｉｖ）抗菌剤本発明の抗菌剤は、Ｔｒ８８−ＮＦを有効成分とするも
のである。

ａ）投与方法本発明の抗菌剤は、経口、非経口投与のいずれも使用可
能であり、経口投与する場合は、上記のう蝕予防剤同様
に各種の口腔用組成物に添加して用いたり、軟・硬カプ
セル剤又は錠剤、顆粒剤、細粒剤、散剤として投与され
、非経口投与する場合は、注射剤、点滴剤及び固体状又
は懸濁粘稠液状として持続的な粘膜吸収が維持できるよ
うに、坐薬のような剤型で投与され得るが、局所組織内
投与、皮内、皮下、筋肉内、静脈内注射、局所への塗布
、噴霧、串刺、膀胱内注射などの外用的投与法等も用い
ることができる。

ｂ）投与量投与量は、症状により一定したものではないが、大人で
は通常、１日当り有効成分として０．５〜５．０００ｍ
ｇ、小人では通常、０．５〜３，０００ｍｇである。

Ｃ）製剤化の方法本発明の抗菌剤の有効成分の割合は、剤型によって変更
しうるが、通常、経口又は粘膜吸収に投与されるときは
、はぼ０．３〜１５，０重量％が適当であり、非経口投
与されるときは、はぼ０．０１〜１０重量％が適当であ
る。

また、本発明の有効成分を製剤化するに当たっては、常
法に従い、水溶液、油性製剤などにして皮下或いは静脈
注射用製剤とすることができる他、カプセル剤、錠剤、
細粒剤等の剤型に製剤化して経口用に供することができ
る。

ｄ）急性毒性マウス腹腔内投与による方法では、ＬＤ５０＞５００ｍ
ｇ／ｋｇであった。

〔発明の効果〕

本発明のＴｒ８８−ＮＦは、秀れたグルコシルトランス
フェラーゼ阻害作用及び抗菌作用を有し、う蝕予防剤及
び抗菌剤として有用である。

〔実施例〕

以下実施例によって本発明を更に具体的に説明する。各
実験例におけるグルコシルトランスフェラーゼ活性の測
定方法及び菌体付着量の測定方法は次の通りである。

■、グルコシルトランスフェラーゼの測定方法ｉ）グル
コシルトランスフェラーゼの調製ストレプトコッカス・
ミニ−タンス（以下、Ｓ、ミュータンスという）６７１
５株をプレインハートインフニージョン（ＢＨＩ）培地
で２４時間、３７℃で静置培養、培養濾液を、６０００
ｒｐｍで１５分間遠心分離して培養上清を得た。氷中下
、この上清に硫酸アンモニウムを５０％飽和になるまで
添加して塩析し、６０００ｒｐｍで１５分間遠心分離を
して沈殿物を集めた。この沈澱物を５０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ６，５）に溶解し、同一の緩衝液に対して４℃
で一晩透析し、グルコシルトランスフェラーゼ酵素標品
液とした。これを酵素活性の測定に用いた。

ｌｉ）グルコシルトランスフェラーゼ阻害活性の測定５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６，５）　、１％ショ糖及
び０．２％アジ化ナトリウムから成る反応液を調製し、
酵素及び試料を加えガラス試験管中で３７℃、１８時間
酵素反応させる。

この際、酵素量は上記反応系で５５０ｎｍの吸光度が０
．５になるよう調製する。

生成した不溶性グルカンを超音波破砕し、５５０ｎｍの
吸光度を測定する。

１１１）グルコシルトランスフェラーゼ阻害率Ｔｒ８８
−ＮＦの代りに蒸留水を用いて同様の操作を行なってコ
ントロールとし、以下の式からグルコシルトランスフェ
ラーゼ阻害率を計算した。

グルコシルトランスフェラーゼ阻害率（％）＝コントロ
ールの０Ｄ５５゜、、。

■、菌体付着量の測定方法１．５倍濃度のＢＨＩ培地と３０％ショ糖を別々に滅菌
した後、ガラス試験管（滅菌済）に各々２ｍｌ、１ｍｆ
ずつ加えた。

Ｓ、ミュータンスの一晩培養液を１００Ａｔβと試料を
３００μβ加え、試験管を３０°に傾けて３７℃１８時
間培養し、以下のようにして付着率を求める。Ｓ、ミュ
ータンスは６７１５株（ｇ型）及びＭＴ８１４８株（Ｃ
型）を用いた。

ｌ）試験管を３回転した後、付着面を上にして、付着し
ていない菌体ごと新しい試験管（Ｎｏ、１）に移す。

１１）付着面を上のままで脱イオン水３ｄを加え、３回
転させる。

１１１）付着面を上にして、付着していない菌体ごと液
を新しい試験管（Ｎｏ、　２　）に移す。

ｉｖ）付着面を上のままで脱イオン水３ｄを加え、ポル
テックスミキサーでミキシングする。

■）付着面を上にして、付着していない菌体ごと液を新
しい試験管（Ｎｏ、　３　）に移す。

ｖｉ）脱イオン水３ｍＪｌ’を加える。、（Ｎｏ、４）
ｖｉ）各試験管全てを超音波処理し、５５０ｎｍの吸光
度を測定する。試験管Ｎｏ、　２〜４は水を、Ｎｏ、　
ｌはＢＨＩ培地をブランクとした。

付着率の計算は、次の式によって行なった。

（１）ルーズ（分付着量）：（２）ファーム（ミキシングではずれないもの）：実施
例１菱の実５００ｇにメタノール１５００ｍＪ２ヲ加え８０
℃の水浴中で３回抽出した。抽出液をａ縮し抽出物２６
．７　ｇを得た。この抽出物に水を加え懸濁させた後、
エーテルで脱脂した。この水層より析出させた粗活性物
１．９７　ｇを用いて菌体付着率効果を見た。

ｉ）グルコシルトランスフェラーゼに対する５０％阻害
濃度Ｔｒ８８−ＮＦの代りに、蒸留水を用いて同様の操作を
行ってコントロールとし、グルコシルトランスフェラー
ゼに対する５０％阻害濃度を計算した結果、３．４４　
Ｘ　１０−５ｍｍｏｆ／ｍｌであった。

ｉｉ）菌体付着率低下効果Ｓ、ミュータンス６７１５株（ｇ型）及びＭＴ８１４８
株のルース、ファームの各々について菌体付着率低下効
果について検討した。結果を第１表に示す。

第１表実施例２Ｔｒ８８−ＮＦのＳ、ミュータンス６７１５株（ｇ型）
に対する抗菌作用について検討した。

ｉ）Ｓ、　　ミュータンス６７１５株（ｇ型）をＢＨＩ
培地で２４時間、３７℃で培養し、その培養液０．ｌｒ
ｄをＢＨＩ培地９．９社で希釈した。

１ｉ）ｉ）で調製した菌液１．９−に滅菌精製水５０μ
ｌを加えた。更に試料をメタノールに溶解し濃度が各５
００．１００．５０μｇ／−になるように加え全量が２
．０ｍｌになるようにした。コントロールには、′メタ
ノールを加えた。嫌気条件下、３７℃で４８時間培養し
た。

１ｉｉ）０時間培養時の菌数は、ｌｉ）で調製したコン
トロールを用いて菌数を測定した。

ｉｖ）測定方法は、菌液より一定量をとりＢＨＩ培地で
１０倍希釈系列モ調製する。調製した各希釈液より１ｍ
ｊ！をとり、１．５％アガー含有ＢＨＩ培地１５ｄとよ
く混合する。その後、嫌気条件下、３７℃で１５時間培
養しコロニーを数え菌数を算出した。

ｖ）ｉｖ）と同様の方法で２４．４８時間培養後のそれ
ぞれの菌数の測定をおこなった。

測定結果を第２表に示す。

第２表実施例３常法に従い、次の処方の練り歯磨きを製造した。

成分　　　　　　％第ニリン酸カルシウム　　　　　　　　　４５．０クリ
セリンラウリル硫酸ナトリウム香料２０．０１．５１．０サッカリンナトリウム　　　　　　　　　　０．１５Ｔ
ｒ８８−ＮＦ　　　　　　　　　　　　　　　Ｏ，５水
　　　　　　　　　　　　　　１００％に調節実施例４常法に従って下記処方の含漱剤を製造した。

エタノール　　　　　　　　２０．０サツカリンナトリウム　　　０．２香料　　　　　１．０グリセリン　　　　　　　５．０クロルヘキシジン　　　　　０．００５Ｔｒ８８−ＮＦ
　　　　　　　　Ｏ，０１水　　　　　　　　　　　　
　　　７３．７８５実施例５常法に従い下記の配合でトングフートを製造した。

小麦粉コーンフラワー大豆粉ミートミール砂糖３０．０１５．０１５．０２０．０５．０牛脂　　　　　５．０食塩　　　　　１．０リン酸カルシウム　　　　　　１，５ソルビン酸カリウム　　　　０．３香料　　　　　０，６Ｔｒ８８−ＮＦ　　　　　　　　Ｏ，１プロピレングリ
コール　　　６．５上記化合物１００部に対し水４０部を加え１５０℃、ス
クリュー圧縮比ｌ：３でエクストルダーにより押出し成
形した。

実施例６次の配合により原料を計量した。次に植物性ガムを少量
の水で溶解し、酸味料、香料、ビタミンＣを配合した。

次にミキサー中に粉糖、α化澱粉、ハレーショ殿扮及び
植物性ガム、酸味料、香料、ビタミンＣの混合物を入れ
た後、少量の水を加え混合し、更に練り上げた。得られ
た生地を乾燥し乾燥された生地を、ミルにて破砕した。

ここで成型された物に、Ｔｒ８８−ＮＦを１％含量で混
合し、１錠２．０ｇで打錠した。

成分　　　　％砂糖　　　８６．５ α化澱粉　　　　　　　３．３バレーショ澱粉　　　　６．７酸味料　　　　　　　　０．５ビタミンＣ１，３香料　　　　０．２植物性ガム　　　　　　０．２水　　　　　　　　　　　　　　１．３〔参考例〕有効
成分の抽出イ）粗砕、乾燥した菱の実（株式会社　ウチダ和漢薬よ
り購入）５００ｇをメタノール１５００−で水浴中８０
℃の条件で３時間の抽出を行ｉ二つだ。熱時、ろ紙を用
いて濾過しメタノール抽出液を得た。同様の操作を繰返
し３回行ない濾液をあわせ、全抽出液を得た。

口）得られた全抽出液をエバポレーターにて減圧下、５
０℃以下の条件でａ縮乾固し、粗抽出物２６、７　ｇを
得た。

ハ）（ロ）で得られた抽出物２６．７　ｇに、水２００
−を加え懸濁液とした。これにエーテル２００ｍ１を加
えンエーカーを用いて１０分間振盪を行なった。振盪の
後静置し、エーテル層と水層との界面及び水層部分にエ
ラグ酸等を析出させた。

水層部分は３５００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離を行な
い浮遊している析出物を除去した。更に水層部分にエー
テルを加え同様の操作を２回行ないエラグ酸等の析出物
を完全に除去した。

二）この水層はエバポレーターにて減圧下、５０℃以下
の条件で全量の３分の１程度まで濃縮しホ）ａ縮の終了
した水層は４℃で数日間静置し、活性物質を析出させた
。析出した活性物質は水層を除いた後にイオン交換水で
３回洗浄の後メタノールで溶解し、再びａ縮乾固して活
性物質１．９７ｇを得た。

へ）活性物質をトヨパールＨＷ−４０Ｆに付し、メタノ
ール−水（７：　３）混液で溶出をつづけ不用なポリフ
ェノール成分を除去した。更にアセトンを加え、その割
合を徐々に増加させ、メタノールを徐々に減少させ溶出
をつづけ分画をおこなった。分画した各画分のグルコシ
ルトランスフェラーゼ阻害活性を測定した結果、メタノ
ール−水−アセトン（４：　３　：　３）混液て溶出し
た画分に高い阻害活性を示したつその画分を濃縮乾固し
て所望の分子量を有する有効成分を褐色の粉末として得
た。

【図面の簡単な説明】

第１図はＴｒ８８−ＮＦの赤外線吸収スペクトルを示す
。第２図はＴｒ８８−ＮＦの紫外線吸収スペクトルを示す
。

Claims

【特許請求の範囲】（１）下記の理化学的性質を有する新規物質Ｔｒ８８−
ＮＦ：（ｉ）形状：褐色粉末（ｉｉ）融点：明瞭な融点を示さない。（ｉｉｉ）分解点：約２２０℃ （ｉｖ）元素分析：炭素４８．７２％水素４．１５％窒素０．６０％（ｖ）分子量：３９６０（重量平均分子量）ゲル浸透ク
ロマトグラフ法でポリエチレングリコールを分子量基準とし、移動相にＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．０５Ｎ：ＬｉＣｌ添加）を用いて測定。（ｖｉ）赤外線吸収スペクトル ν＾Ｋ＾Ｂ＾ｒ＿ｍ＿ａ＿ｘｃｍ＾−＾１：３３７５、
１７２０、１６１０、１５３０、１５１０、１４５０、
１３５０、１２００、１０３５、８７０、７６０（ｖｉｉ）紫外線吸収スペトクル ▲数式、化学式、表等があります▼ ０．１規定水酸化ナトリウム ▲数式、化学式、表等があります▼ （ｖｉｉｉ）呈色反応：塩化第II鉄反応：陽性アニリン・ジフェニルアミン反応：陽性ニンヒドリン反応：陰性ドラーゲンドルフ反応：陰性ｐ−アニシジン・フタル酸反応：陰性（ｉｘ）溶解性：メタノール、水酸化ナトリウム溶液に可溶、エタノール
、水にやや可溶、エーテル、ヘキサン、クロロホルム、酢酸エチル、塩酸溶液に不溶（ｘ）安定性：室温乾燥粉末の状態では安定（２）請求
項（１）記載のＴｒ８８−ＮＦを有効成分とするう蝕予
防剤。　（３）請求項（１）記載のＴｒ８８−ＮＦを有効成分と
　する抗菌剤。