JPH02136733A - バイオマス・プロセスの光学密度測定の装置および方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、例えば発酵、嫌気性または好気性微生物プロ
セスのような動的バイオマス・プロセス装置を正確に監
視する手段として光学密度の測定値を得る装置と方法ま
たはその改良に関するものである。さらに詳しくいえば
１本発明は一動的プロセス装置の全動作範囲にわたる直
接光学密度を一次妨害因子を補償することによって測定
する方法に関するものである。

〔従来の技術〕

細胞密度の測定は、発酵プロセスのプログラムを監視す
るときに重要である。これまで細胞密度を測定する多数
の方法および付随装置があった。

従来の方法および装置は、どれも本発明以前には、成功
し、満足であったと立証されなかった。好ましくは、細
胞密度の測定をするための発酵槽または栄養培地に直接
挿入できる滅菌可能なプローブを用いることが望ましく
、プロセスの進行を監視するときに価値ある情報を与え
るであろう。通常は、生成物濃度が細胞密度の測定値か
ら導出された細胞債量と関連している。

従来は、細胞密度は、発酵槽から試料を引き出すことに
よってとびとびの間隔で測定される。この手法は生成物
の直接で迅速な測定を行うことができないで、試料が発
酵槽から引き出された時点での生成物の濃度の指示であ
る細胞質量の推測値を得ることになった。直接測定方式
を利用して満足で正確なプロセス制御を達成するために
は、オンライン測定方式が望ましい。

間接制御測定値は、種々のプロセス・パラメータに基づ
き、細胞生長、基質消費および生成物形成の数学的モデ
ルの精度によって制限される。定収量、保全係数および
化学量論を仮定することは、基質の消耗１代謝した状態
になることのある中間物の蓄積および阻害性生成物の形
成のために全プロセス範囲にわたっては妥当でないこと
がある。

細胞密度の測定の離散的間隔法においては、せいぜいこ
ｆｌＨ１密度の近似技術である。滅菌した試料口から、
小量の培養肉汁が試料口を清めたことを確めた後に引き
出される。試料は、実験台に運ばれて、試料の適当な稀
釈液が作られる。やけ９間隔をおいて試料をとる他の作
業者間などでのピペット計量技術や機器の精度と一貫性
に特別の注意を払う必要がある。最後に、光学密度金、
測定して稀釈係数を掛けて、その値全記録する。この試
料収集から値記録までの時間中、プロセス全体を最適化
するために、次に必要な適当なプロセス段階は必要であ
るかが分っていない。

細胞密度測定の離散的間隔法は、自動化の助けにならな
い。何らかの間接に測定されたパラメータ、代謝的また
は物理的のものが信頼できなければならない。動的装置
における測定値は、種々の欠点がある。微生物発酵培養
の物理的複雑さは、培地の％性、生物の大きさ、形およ
び種別、ならびにプロセスにおけるＴ”　ｓ　’ｌｒｍ
度、圧力、攪拌などの変化によって影響される。生長培
養の代謝的複雑さは物理的環境に応する微生物の生長の
段階によって影響される。これは、細胞の大きさ、重複
二重型、錯形成、細胞含有物１体形成などに影響を与え
る。複雑な栄養肉汁の中で生長する微生物の場合も、ど
の栄養素がプロセスの各発生段階に訃いて用いられるか
が確かでない。従って、生長のモデルを作ることは困難
である。

従来は、プロセス流体を通過する光の量の測定には光学
センサが好都合なことがよくあった。しかし、どんな特
定のプロセス流体でもそれを透過した光の量は、懸濁固
体、溶解固体および乳剤形成などの糧々の因子によって
減少させられることがある。懸濁固体と乳剤は、また光
を散乱することによって光の透過率を減少させる。好気
性システムでは、光学Ｖ度は、泡の数と泡の大きさによ
って影響されると思われる。大きな気泡、例えば、空気
の泡は、大きな粒子と丁度同じように光を散乱するが、
それでもなおいくらかの光の透明度を残している。攪拌
速度を大きくすると、生成する泡が小さくなり、光の散
乱を弱める効果が出て、透明度が上がる。従って、バイ
オマス・システムには、光センサによる測定値と関連し
た固有の問題がある。

〔発明が解決しようとする課題〕

従って本発明の目的は、生物が成長しつつある動的バイ
オマスプロセス・システムの直接光学密度を測定する装
置と方法を提供することであり、この装置と方法では、
細胞密度の迅速な直接測定を必要とし、測定値は、オン
ラインすなわちプロセスに関して実時間で行われ、現場
測定が増分的離散的標本化に関連した諸間覇、例えば、
間隔試料を得る詳細の立案、滅菌、プロセスを乱す危険
、試料取得から測定値の記録までの経過時間３本化の発
生時における適当なプロセス段階の迅速な決定などを避
けるために用いられる。

本発明のもう一つの目的は、気泡などのすべての妨害因
子を補償して、全範囲にわたって測定値の直線性を確実
にする光学密度によって好気性または嫌気性バイオマス
・システムの濃度を決定する方ｅｋ提供することである
。

もう一つの目的は、プロセスの全自動化をもたらす発酵
プロセスの自動的オンライン実時間監視を容易にする光
学密度測定装置を提供することである。

本発明の一般的目的は、従来の技術の欠点を克服するこ
とである。なおそのほかの目的は、後述の詳細な説明に
おいて以後間らかになる。

〔課題を解決するための手段〕

これらの目的は本発明において、反応するバイオマス流
体が通過するセルのある長さの開口部または通路を有し
、かつファイバーオプティック光源およびファイバーオ
プティック光検出器を有する滅菌可能なファイバーオプ
ティック・グローブを用いることによって達成される。

動作時にファイバーオプティック光源からの光をセル穴
の中の試料培地を通過させ、次に透過光をファイバーオ
プティック管路の受光端を通して発信機へ送る。

前記発信機は、信号増幅器および信号出力を線形化する
計算機プログラムから成っている。光学グローブは、発
酵槽または同様の装置の中に制御計装と着脱可能に密封
さｒしる。

一般に、このプローブ内の光学センサは、セル開口部に
あるプロセス流体を通過する光の量を測定する。本装置
は、セル開口部における気泡の存在を自動的に補償でき
る。

〔実施例〕

図面、そして特に第２図を参照すると、参胛数字２は本
発明によるプローブを表わしている。プローブ２は、処
理装置内の媒質に対して非腐食性の任意の材料で作るこ
とができる。しかし、プローブ２は、ステンレス鋼で作
るのが好ましい。このプローブ２は、プローブ２を発酵
タンクなどの反応器１の本体または壁に挿入してそれに
着脱可能にしっかりとはめることができるインゴールド
管継手４を備えている。インゴールド管継手４と０リン
グ組立体５によってプローブ２を反応器１の壁に接続さ
れたアクセス管うを通して密封可能にはめることができ
る。アクセス管５はインゴールド管継手４と共同作動す
る接続管継手をもっている。

プローブ２の内部には、放射光源ｉｌｔおよび検知用光
検出器１６がある。放射光源１４と検出器１６の各々は
それぞれ電気導体１７および１８に接続されている。放
射光源１４は、導体１７によって電流を供給される。光
検出器１６Ｆｉ、電流導体１８″ｆ：通して信号を増幅
し、記録する手段に信号インパルスを送る。放射光源Ｉ
ＩＩおよび光検出器１６は、光源光を伝導するファイバ
ーオプティックス１２と検出光を伝導するファイバーオ
プティックス１５を用いてプロセス培地から離されてい
る。プローブの端には反応器およびその中の反応培地の
中に突き出ているセル開口部があり、ファイバーオプテ
ィックス１２と１５が終って、窓１０と１１が適所に密
封されている試料ギャップ６がある経路長をもって形成
されている。窓１０と１１？′ｉ、それぞれのファイバ
ーオプティックス１２と１５の端末部分であり、光ファ
イバーの端を保護する作用をする。窓１０と１１は、試
料ギャップの中で大体において向かい合っている。さら
に、これらの窓１０と１１は、必要な光を試料ギャップ
６の中に放射でき、同様に、試料セルの中にある物質を
透過する光を検出できるようにする透光性の任意の材料
で作ることができる。窓はパイレックスガラスまたは石
英で作るのが好まし℃１゜ ピックアップ・ファイバー・オプティックス１５は、電
流導体１８に接続されている光検出器１６に接続されて
いる。８５０ｎｍ以下のすべての光の波長を除くので、
周囲の光の妨害を除く光学フィルタ１５が光検出器にか
ぶさっている。フィルタによって低い波長をカットオフ
することはまた色の妨害を除く。従ってたいていの粒子
がこの高い方の波長では同じように見える。

プロセスの間、発酵槽内の溶液は、はとんど透明な肉汁
溶液として始まって、プロセスの間に非常に黒い溶液に
移ってゆく。プローブがプロセスの全範囲にわたって調
べることができる最適光路長を試料ギャップ６において
選択する。この測定範囲は、経路長に逆比例し、分解能
は経路長に正比例する。従って、光学プローブの試料ギ
ャップ６における経路長が小さければ小さいほど、観測
可能な範囲は大きくなるが、分解能は小さくなる。

代表的測定単位は、吸収単位（Ａ、Ｕ、）　　である。

これはゼロＡ、Ｕ、は、細胞成長のないときの澄んだ栄
養培地において吸収される光の電であるとして用いられ
て定義される任意単位である。各追加単位は、吸収され
た光の童の１桁変化（１０の係数、すなわち対数変化）
であって、光検出器によって電流出力に相関される。

このようなシステムにおいて生ずる一つの問題は、光吸
収の読み値の間の相関であり、実際の濃度測定は全範囲
にわたって線形でないことがある。

吸収曲線内の任意の無限に小さな線分においては、プロ
セスの光出力に対する直線関係がある。しかし、大きな
範囲を測定する場合には、線形関係が存在せず、澄んだ
領域における変化が黒い領域における変化と等しいか等
価にならないことを意味する。しかし、この不均衡また
は不等変化を第２図および第５図のプログラムド発信磯
内で線形化できる。この発信機は、数字キーバッド・エ
ントリソースと文字表示装置のついたマイクロプロセッ
サ制御発信機である。従って、粒子間の挙動関係を理解
し、濃度に関する光の性質についてのある現象ヲ知るこ
とによってたった二つの入力点から正礒な線形化曲線を
外挿することが可能である。

必要な制御計装全備えた標塾微生物発酵器を用いたとき
は１発酵器の内部には、放射状に配位された一連のバッ
フルおよび一つの熱交換装置が配置されている。バッフ
ルは渦発生を防止して通気効率を向上する。また小さな
泡を培地中に効率よく分散させる手段、例えば、発酵器
の攪拌器軸に取付けた５円板タービン羽根車も用いられ
る。組合せオリフィス噴霧器／羽根車（穴あき管）が発
酵器全体にわたって小さな気泡を発生し、分散させる。

１１００ｒｐまで可変に調節できる攪拌の速度が発酵器
内に与えられた。

攪拌の機能は、培養肉汁の中に小さな泡の形の空気を分
散することによって酸素転移に利用できる領域を犬きく
することである。攪拌はまた。液体から気泡の逃げるの
を遅らせる、すなわち、気泡の液体中の滞在時間を大き
くし、融合を防止する。攪拌は、培養場に乱流を生じさ
せることによって気体と液体の界面における液体膜の厚
さを減らす。一般に、説明したこの装置は、発酵器内に
多数の小さな気泡を発生するのに非常に有効である。

上に定義した好気性発酵装置において、攪拌速度（乱流
）は、正確で代表的な細胞密度の測定値を得るときの主
な妨害要因である。空気流量および空気の圧力の影響は
小さい。制御されない泡立ちの問題は、泡滞在時間が増
大することによって生ずる。泡立ちが続くにつれて、泡
の大きさと数が量的に増加する。

ステンレス鋼プローブは、発酵器の側面を貫通して着脱
式かつ密封可能に取付けられるので、光源オプティック
ファイバー、光検出器オプティックファイバーおよび密
度測定セルを含むプローブの検知部分は一発酵培地中に
直接に挿入される。

発酵が進むにつれて、液体培地の溶液は、はとんど透明
な浴液から非常に透明な溶液にわたることができる。グ
ローブ内で光経路を、プローブがプロセスの全範囲を検
知できるように選択する。大範囲の測定の場合に、観測
された値と実測値との間の相関は、線形でないことがあ
る。これは、透明領域での変化が不透明領域における等
しい変化を示さないことを意味する。従って、プローブ
は、大範囲にわたって測定値を線形化するようにプログ
ラムされている発信機に接続されている。

攪拌の速度が観測されたオンライン細胞密度に影響を与
えることが発見された。プローブからの信号の変化は、
攪拌速度に比例し、細胞密度に反比例する。従って、プ
ローブ信号は、ａ）細胞密度と溶液粘性、ｂ）１１００
ｒｐｍを超える場合、攪拌速度、およびＣ）液体媒質内
の泡の大きさと数に関係する合成値である。

生の密度データを調節する相関モデルは、二つの直線方
程式である。各方程式はオンライン細胞密度値を特定の
攪拌速度（ｒｐｍ）で光学密度に相関させる。各直線方
程式の交さ点は、攪拌が信号に影響を与えない点である
。すなわち、この点より下では、攪拌が増大すると泡の
数と大きさに影響されて溶液をより黒く、すなわちより
不透明に（より高い光学密度）見えさせ、この点より上
では、攪拌が増大すると溶液をより明るく（より低い光
学密＃）見えさせる。この現象は、グローブからくる総
合信号に対する培地内の泡の影響に帰因する。すなわち
、この点で、透過効果は１発酵培地内に泡があることに
よる散乱効果に等しい。

線形化方程式に組込まれたもう一つの因子は、泡に及ぼ
す攪拌速度の周知の効果である。交さ点以外のところで
は、攪拌速度の変化と信号変化との間の非線形相関があ
る。２０　Ｏｒｐｍと１００゜ｒｐｍとの間の現象を最
もよく近似する方程式が選択される。２０　Ｏｒｐｍ未
満では空気混入がほとんどまたは全く起らず、同様に、
１１０００ｒｐ超でもほとんどまたは全く空気混入が起
らず、１１０００ｒｐ超で空気混入プロセスは、−数的
プロセスおよび機器設計の制限条件によって横ばいにな
り始める。

プローブ信号は、攪拌速度の関数であると分った。応答
はまた攪拌速度に比較される相対細胞対気泡濃度に依存
する。すなわち、同一条件下でに、低細胞密度のときに
信号は、高い攪拌速度で高い細胞密度のときよりも大き
いのである。低攪拌領域における曲線が発酵プロセスに
最も重要な範囲において最も正確になるように選択され
た。その曲線全表わす多頂式の誘導が所与のまたは選択
された光学密度における信号の強さに及ぼす攪拌速度の
効果から収集されたデータから決定された。

その曲線は 百分率光学密度の変化＝に０＋に、Ａ９＋に２Ａ、　＋
に３Ａ、３の形であって、こ＼で、Ｋは定数でＡｙＦｉ
攪拌速度である。発信機は、濃度範囲内の現象すなわち
線形変化に厳密に近似する応答曲線を発生して、その曲
線を実際のプロセス流体に合せるために調節する。

発信機は、オンラインまたは試料容器内で読みを取り、
その読みを記憶装置内に記憶することによって応答曲線
を発生し、その記憶された読みは、実験室内で決定され
ていた割当て値である。

この器械システムは、流体の濃度または粘稠度を光の吸
収によって測定するプログラムド計算機を用いる。前記
プログラム全実行８！は一つのプロセスを連続的に監視
し、プロセスの標準化曲線と一致した値を出力する。極
小値において、２点標雲化曲線がその出力を線形化する
のに必要である。

従って、オフライン標本化誤差および実験室の誤差が低
減され、結果は、流体の実時間濃度を表わしている。

プログラムド計算機は、回路盤、アナログ出力盤、電子
部品を含み、測定データを解釈するプログラム全実行す
るための中央処理盤、ディジタル通信盤、人間とのイン
ターフェースのための前面パネル盤、線路電圧の損失を
補償してセンサラングに適当な電圧を設定するためのラ
ンプ出力盤からなるモジュール設計ならびに集積器械シ
ステムを形成するためにすべての盤を相互接続するため
の母盤」もったマイクロプロセッサ・ベース・ディジタ
ル器械である。電源が回路構成、リレーおよびセンサ、
ならびに入力全マイクロプロセッサで読めるようにする
ために標準化するようにセンサ信号を調整するセンサス
力盤に対して調整さｎた給電および無調整給電をする。

動作について説明すると、マイクロプロセッサは、様々
なセンサからの測定値を解釈して表示できる。一般に、
光センサは、プロセス流体を通過する光の量を測定する
。透過した光の童は前に検討したように、懸濁固体、溶
解固体および乳濁液によって減少することがおる。懸濁
固体および乳濁液は光の透過率も小石くする。

前述のように、測定の代表的単位に、任意Ａ、Ｕ。

（吸収単位）である。Ａ、Ｕ、は、透明（またはゼロ）
溶液内で吸収される量をゼロＡ、Ｕ・として使用時に定
められる。各追加単位は、吸収した光の量における１桁
の変化であり、従って、光検出器によって電流出力に相
関させることができ、る。

１例として、ゼロＡ、Ｕ、が光検出器による１０ｍ　Ａ
の電流出力にすることができ、次にＬＡ、Ｕ。

が１ｒｎＡで、２Ａ、Ｕ、が０．１　ｍ　Ａの出力など
になる。

〔発明の効果〕

本発明が克服する間浄は、光の読みと線形でないことも
ある実際の細胞密度画定値との間の相関である。結果と
して生じた曲線内のどの小さな切片にも、プロセス細胞
密度と光出力との間に直線関係がある。しかし、より大
きな範囲にわたっては直線関係が存在せず、透明な培地
内での粒子の挙動は、黒い領域または不透明な領域にお
ける等価な挙動変化に相関しない。こｎは、プログラム
ド計算機によって発信機において線形化される。

従って、従来の方法の欠点が除かれる。改良された直接
評価装置が発酵器および同様な反応器内の細胞密度のよ
シ正確で迅速な決定をもたらした。

空気混入または反応器内で起る反応からの泡の存在する
発酵器の乱流環境においてさえ、１００ＯＤ（光学密度
）以上の細胞密度を直接に分解し、システムをプロセス
制御のための計算様システムに直接に結合することが本
発明で可能であった。

上述の要素の各々、または二つ以上を一緒に上述の種類
と異なる他の種類の構成、システムなどにおいて有用な
用途全見出すこともあることが分るであろう。

本発明を微生物が成長している液体の濁度を測定するこ
とに実現されるとして例示説明したが、種々の変更形と
構造上の変更を本発明の精神と範囲からすべての点で逸
脱することなくなしうるので１図示し説明した詳細に限
定されることを考えていない。

【図面の簡単な説明】

第１図は、全プロセスシステムの図解図、第２図は、測
定セルのついたグローブの略図、第５図は、生物学的シ
ステムの反応器−発酵器の略図である。 ２−−７０−フ、 ６−−ギヤツプ、 １０．１１−一窓、 １２．１３−−ファイバーオプティックス、１１１−一
光源。 １６−−光検出器。 ｉｇｕｒｅ ｉｇｕｒｅ 手　　続　　補　　正　　書 平成光 特許庁長官　吉　１）文　毅　殿 （審査官　　　　　　　　　殿） １、事件の表示 平成元年 特　　許　　　願第　２１０２１１号 年１１月７日 λ　発明に）村−の名称、指電商酷の一分バイオマス・
プロセスの光学密度測定の装置および方法３　補正する
者 事件との関係　特許出願人 住所　　アメ、リカ合衆国カリフォルニア用９１１７１
．バークレイ。 アヘニダ・ドライブ１２２ビー ４代理人 ７　補正の対象　明細書の特許請求の範囲の欄特許請求
の範囲 Ｌ　発生培養流体培地を含む生物学的反応器の中の動的
生物学的システムを限定されたセル内の透過光を測定す
ることによって監視する方法で。 ａ）セル内の流体培地に光’ｋｌＮ射する工程、ｂ）培
養流体培地を連続的に攪拌する工程。 Ｃ）透過光を検出する工程。 ｄ）検出された透過光を非線形電気出力信号に変換する
工程、 ｅ）前記非線形電気出力信号を線形化する工程。 ｆ）前記線形化出力信号を攪拌の効果について補償する
工程、および ｇ）前記信号を記録する工程、 を同時に含む動的生物学的システムを監視する方法。 の前記発生培養流体培地の直接光学密度の測定によるこ
とを特徴とする請求項１に記載の方法。 培地の直接光学密度を測定する装置において、検知セル
を有する光学プローブを液体生物学的培地の中に突き出
す手段、および 全備え、 ルの反対側に置かれて、外部増幅器および記録器へ信号
を運ぶファイバーオプティックスに取付けられた光感検
出器を有するプローブである請求項うに記載の装置。 ５、　生物学的システムの細胞、鋼量を発生培養流体を
含む生物学的反応器からの光学密度データおよび攪拌デ
ータについて曲線の当てはめ計算ヲ行うことによって決
定する方法で。 少なくとも２組の攪拌速度と対応する光学密度を選択す
る段階。 細胞質量の飴を攪拌と光学密度の関数として定める段階
。 液体生物学的培地内の直接光学密度測定装置。 ４、　光学的検知セルを有するプローブを液体生物学的
培地内に突き出す前記手段が光をセルに運ぶファイバー
オプティックスを有し、セによって細胞質量を光学密度
に関係づける段階、 を含む、生物学的システムの細胞質量ヲ定める方法。 ６　線形化が各々撹拌の速度および対応する光学密度に
対する２組の少なくとも２点の間の線形関係に対する前
記直線方程式の少なくとも二つの傾きを決定することで
ある請求項５に記載の方法。 ７、線形化の段階がゼロからの距離が少なくとも２０％
異なり、ゼロでない離れた２点に基づき、ゼロは生物学
的反応器に背景流体を表わしている請求項６に記載の方
法。 まる定数値として選択される請求項５に記載の方法。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、発生する培養流体培地を含む生物学的反応器の中の
   動的生物学的システムを限定されたセル内の透過光を測
   定することによつて監視する方法で、 ａ）セル内の流体培地に光を照射する工程、ｂ）培養流
   体培地を連続的に撹拌する工程、ｃ）透過光を検出する
   工程、 ｄ）検出された透過光を出力信号に変換する工程、 ｅ）前記出力信号を線形化する工程、 ｆ）前記出力信号を撹拌の効果について補償する工程、
   および ｇ）前記信号を記録する工程、 を同時に含む動的生物学的システムを監視する方法。 ２、前記監視することがセル内の培養流体培地の直接光
   学密度の測定によることを特徴とする請求項１に記載の
   方法。 ３、生物学的反応器内で撹拌され、発生し、成長する生
   物学的種を含む液体生物学的培地の直接光学密度を測定
   する装置において、 検知セルを有する光学プローブを液体生物 学的培地の中に突き出す手段を備え、前記光学プローブ
   は光源および前記セルと共同作動する光検出器を有し、
   前記反応器の外にあつて前記光検出器に接続された導体
   を有し、さらに 前記検出器出力信号を線形化する手段、 前記出力信号を反応器内の液体培地を攪拌 することによつて生じた妨害について補償する手段、 セル内の光学密度の結果を記録する手段 を備えてなる液体生物学的培地内の直接光学密度測定装
   置。 １１、光学的検知セルを有するプローブを液体生物学的
   培地内に突き出す前記手段が光をセルに運ぶファイバー
   オプティックスを有し、セルの反対側に置かれて、外部
   増幅器および記録器へ信号を運ぶファイバーオプティッ
   クスに取付けられた光感検出器を有するプローブである
   請求項３に記載の装置。 ５、生物学的システムの細胞質量を発生する培養流体を
   含む生物学的反応器からの光学密度データおよび撹拌デ
   ータについて曲線の当てはめ計算を行うことによつて決
   定する方法で、少なくとも２組の撹拌速度と対応する光
   学 密度を選択する段階、 結果を線形化する段階、 細胞質量の値を撹拌と光学密度の関数とし て定める段階、 撹拌の効果を補償し、それによつて細胞質 量を光学密度に関係づける段階、 を含む、生物学的システムの細胞質量を定める方法。 ６、線形化が各々撹拌の速度および対応する光学密度に
   対する２組の少なくとも２点の間の線形関係に対する少
   なくとも二つの傾きを決定することである請求項５に記
   載の方法。 ７、線形化の段階がゼロからの距離が少なくとも２０％
   異なり、ゼロでない２点に基づき、ゼロは生物学的反応
   器に背景流体を表わしている請求項６に記載の方法。 ８、撹拌速度が定数値として選択される請求項５に記載
   の方法。