JPH02129551A

JPH02129551A - α１‐酸性糖蛋白質の定量方法

Info

Publication number: JPH02129551A
Application number: JP63282394A
Authority: JP
Inventors: Masaki Odagiri; 優樹小田切
Original assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Current assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Priority date: 1988-11-10
Filing date: 1988-11-10
Publication date: 1990-05-17
Anticipated expiration: 2012-07-16
Also published as: JP2631885B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、血液、リンパ液、尿等に含有されるα１−酸
性糖蛋白質の定量方法に関し、特に蛍光光度法を利用し
た簡便で、かつ高感度・高精度の定量方法に関する。

（従来の技術） α１−酸性糖蛋白質は血清中に存在する糖蛋白質の一種
で、分子量が約４０．０００〜ｓｏ、ｏｏｏ、等電点が
２．８〜３．４　ｐｒを示す。α１−酸性Ｉ！蛋白質は
、血清１００−中に５０〜１００■含有されており、健
康状態や疾患に伴って変動する。例えばリューマチ患者
では１５０〜２００■／１００ｍ！、感染症患者では１
００〜１４０　ｍｇ／１００ｍｊ、癌患者１２０〜２０
０　ｇ／１００＋ｄと上昇し、肝硬変や肝炎では２０〜
６０■／１００−と低下することが知られている。疾患
とα１−酸性糖蛋白質の血中濃度の変動は良く知られて
いる（ＪｏｓｅｐｈｉｎａＨ６■、Ｋｒｅｍｅｒ他、Ｐ
ｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗｓ、　ｖ
ｏｌ。

４０、ｐｉ〜４７．１９８８）。さらにα１−酸性糖蛋
白質は強い抗腫瘍活性を有することも知られており、特
開昭６２−５６４３０号公仰には、この抗腫瘍剤として
有用なα１−酸性糖蛋白質を哺乳動物血清より多量に得
る方法が開示されている。

又、α１−酸性糖蛋白質は、血清アルブミンと同様にそ
の立体構造上に、薬剤を安定的に結合するポケット構造
が存在しており、薬剤の体内輸送にも関与していること
が明らかになっている。

これらのことから、血清など体液中のα１−酸性糖蛋白
質を高感度で、かつ精度良く定量することは、臨床上、
有意義であると考えられている。

α、−酸性糖蛋白質の測定は、従来はセルロースアセテ
ート電気泳動法により、α１−両分を測定することが主
に行われていたが、この方法ではα１−酸性糖蛋白質の
電気泳動位置に、類似の蛋白質も泳動するために、正確
な定量には至らなかった。

また測定感度も低かった。

最近、免疫学の進歩により抗原抗体反応を利用した定量
法が開発され、ポリクローナル抗体、若しくは抗血清を
使用した一元放射状免疫拡散法による測定キットが市販
されている。また特開昭６２−４４１９９号公報には、
α、−酸性糖蛋白質に対するモノクローナル抗体と、そ
の製法が開示されており、更に該モノクローナル抗体を
使用したＥＬＩＳＡ法による測定例が開示されている。

（発明が解決しようとする課題）周知の通り免疫学的な手法による測定は、その特異性が
高いことが特長としてあげられるが、生物学的な特性を
利用するため、精度上の信鯨性には不満足であるとの指
摘がなされる例が多い。また免疫測定用の専用器具が必
要であり、かつ測定コストも高価であるため、より優れ
た測定方法の開発が望まれていた。

一方、前述の通りα、−酸性糖蛋白質には、薬剤結合ポ
ケットが存在し、この部位に特異的に結合する化合物を
指標として測定することが可能である。これを応用して
１．８−アニリノナフタレンサルフェートを蛍光プロー
ブとして測定する例が開示されている（Ｂｉｏｃｈｉｍ
、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、八ｃｔａ＋　ｖｏｌ、８７Ｌ６１
〜７１頁（１９８６）、旧ｏｃｈｅｍ、　Ｊ、、　ｖｏ
ｌ、　２３２．８６３〜８６７頁（１９８５）。しかし
、この薬剤は他の蛋白質に対しても結合性を有しており
、特に血清中に共存するアルブミンの影響が大きいため
測定精度は高くない。

本発明は、α、−酸性糖蛋白質の定量方法に於いて、蛍
光プローブを使用し、今までにない高精度、高感度で、
かつ簡便な測定方法を提供することを課題とする。

（課題を解決するための手段）本発明に於けるα１−酸性糖蛋白質の定量法は、α１−
酸性糖蛋白質に結合し、励起光の照射により蛍光を発す
る２−（２−（４−ジメチルアミノ）フェニル〕エテニ
ル−１−エチルキノリニウムハライドを試料中に添加し
、生成したα１−酸性ｆｌ！！蛋白質−２−（２−（４
−ジメチルアミノ）フェニル〕エテニル−Ｌ−エチルキ
ノリニウムハライド複合体の蛍光強度を、蛍光光度計に
より測定することを特徴とする。

本発明に用いる２−（２−（４−ジメチルアミノ）フェ
ニル〕エテニル−１−エチルキノ□リニウムハライドは
、下記の構造を有する化合物である。

（Ｎ）にヨウ素（Ｉ）または塩素（ａ　）がイオン結合
したものが特に好ましく、市販の試薬が使用し得る。

α１−酸性糖蛋白質を定量するに当り、蛍光プローブと
して必要な条件は、測定対象であるα１−酸性糖蛋白質
に対し、選択的な結合性を有することである。例えば、
キナルジンレンドｒ２−　（２−（４−ジメチルアミノ
）フェニル〕エテニル−１−エチルキノリニウムアイオ
ダイド」を６Ｘ１０−’Ｍの濃度で溶解後、血清中の蛋
白質濃度に併せて溶解した各蛋白質液に混合し、その後
、蒸留水を透析外液として平衡に達するまで透析を行い
、透析膜内の色素量を測定することができる。表１に示
す通り、血清中の蛋白質に対しては、α１−酸性糖蛋白
質が特に結合性が高いことが明らかである。

（但し、Ｘはハロゲンを示す。）本発明に使用する２−（２−（４−ジメチルアミノ）フ
ェニル〕エテニル−１−エチルキノリニウムハライドは
、キナルジン環の１位の窒素原子キナルジンレッドのフ
リーフラクション＾ＧＰ：　α１−酸性糖蛋白質ｌｌ５Ａ＝ヒト血清アルブミンｒ　−ＧＢ：　γ−グロブリンフリーフラクション：平衡透析法により算出。

さらに、キナルジンレッドはα、−酸性糖蛋白質と結合
して安定的に存在しており、第１図に示す通り、ヒト血
清アルブミンのような蛋白質が存在しても蛍光強度、蛍
光スペクトルに変化が認められないことが確認されてお
り、α１−酸性糖蛋白質定量用プローブとしては最適で
ある。

測定にあたっては以下の方法が採用し得る。

まず、キナルジンレッドをｌＸｌ０−’〜２Ｘ１０−３
Ｍの濃度に、更に好ましくは１．５Ｘ１０−”Ｍの濃度
にメタノールに溶解し、測定試薬とする。

測定用サンプルは、血清、リンパ液、関節液、尿等が対
象となるが、必要に応じ、遠心、濾過等の前処理を行っ
た後、リン酸緩衝液により、稀釈し、測定を行う。測定
試薬８０ｐ！と測定試料４−を混合し、その後、蛍光光
度計により蛍光強度を測定する。同様にしてα１−酸性
糖蛋白質を１〜１０００■／　ｍｌの濃度範囲に稀釈し
て測定作成した検量線に外挿して、定量を行うことがで
きる。

上記の通り本発明による測定は、その操作が非常に簡便
な点が特長である。現在市販利用されている従来の一元
放射状免疫拡散法と比較した場合、次の表２に示す点を
本発明の利点としてあげることができる。

表２（実施例）以下、実施例に基づき本発明を具体的に説明する。

実施例１ α１−酸性糖蛋白質の検量線の作製６．５■のキナルジンレッド（シグマ社製）を秤量し１
０−のメタノールに溶解し、１．５　Ｘｌ０−’Ｍのキ
ナルジンレッド試液を得た。一方、α１−酸性糖蛋白（
シグマ社製）を５■秤量し、１−の１／１５Ｍリン酸緩
衝液（ｐＦ１７．４）に溶解し、表３に示す稀釈率で稀
釈して、所望の濃度系列を得た。各試験管に緩衝液３．
９−ずつ加え、全量を４−とした後、キナルジンレッド
試液をマイクロシリンジで８０１１！ずつ加え、ポルテ
ックスミキサーで約３秒間混合した後、蛍光光度計（日
本分光ＦＰ７７０型）により測定した。第２図に示す直
線性の高い検量線が得られた。さらにα１−酸性糖蛋白
質を測定する場合に夾雑する蛋白質として最も多量に含
まれる血清アルブミンの検量線に与える影響について、
上述の各濃度系列にヒト血清アルブミンを８００■／１
０〇−の濃度になるように添加して、同様に検量線を作
製した。第３図に示す通り、第２図とほぼ同一の回帰式
を示す直線が得られた。このことから、血清等のサンプ
ル中に含まれるアルブミンの測定に与える影響は極小さ
いことが判明した。

実施例２一元放射状免疫拡散法との比較従来法として使用されている一元放射状免疫拡散法と本
発明方法の比較を、人血清を試料として行った。−元放
射状免疫拡散法としては、ＮＯＲパルチゲンα１−アシ
ッドグリコプロティンキット（日本ヘキスト製）を使用
した。

成人男子５名より、ｌｄずつ採血し、遠心分離により血
清を得た。この血清１００μｌを小試験管にとり、リン
酸緩衝液３．９−を加え、全量を４−とした。ここへ実
施例１記載のキナルジンレッド試液を８０μ！添加して
、ポルテックスミキサーで５秒間振盪し、日本分光製Ｆ
Ｐ７７０型分光蛍光光度計で励起波長４９６ｎｍで励起
し、５８０ｎｍの光強度を測定した。

又、ＮＯＲバルチゲンの使用方法に従い、被検血清５μ
ｌを抗原孔に加え、４８時間後の沈降輪の直径を測定し
た。

第４図に示す通り、本発明による測定結果と、従来法に
よる測定結果とは高い相関を示した。

（発明の効果）本発明によれば、α１−酸性糖蛋白質を煩雑な操作を必
要とせず、かつ高精度で測定する方法が提供される。特
に、抗血清等の入手が必要ないため、常に安定な測定が
可能となる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、キナルジンレッド（５Ｘ１０−ｈＭ）の蛍光
スペクトルを示すグラフであり、実線はα１−酸性糖蛋
白質（ＡＧＰ、２０■／１００ｍｆｆ１）存在下、点線
はα１−酸性糖蛋白質（ＡＧＰ、２０■／１００ｍｆｆ
１）及びヒト血清アルブミン（Ｉ　Ｓ　Ａ、　８００ｍ
ｇ／１００ｍｅ）存在下における相対蛍光強度と波長と
の関係を示す。第２図は、ヒト血清アルブミン非存在下でのキナルジン
レフト−ＡＧＰ系の検１ｔｖＡを示すグラフであり、相
対蛍光強度とＡ　ａ　ｐ　ｔＭ度との関係を示す。第３図は、ヒト血清アルブミン存在下でのキナルジンレ
ッド−ＡＧＰ系の検量線を示すグラフであり、相対蛍光
強度とＡ　ｃ　Ｐ　？Ｍ度との関係を示す。第４図は、本発明による蛍光プローブ法と従来法による
放射状免疫拡散法とのＡ　Ｇ　Ｐ　ｔａ度の相関性を示
すグラフである。第１図第３図第４図第２図

Claims

【特許請求の範囲】 α＿１−酸性糖蛋白質を含む試料に２−〔２−（４−ジ
メチルアミノ）フェニル〕エテニル−１−エチルキノリ
ニウムハライドを加え生成する、α＿１−酸性糖蛋白質
−２−〔２−（４−ジメチルアミノ）フェニル〕エテニ
ル−１−エチルキノリニウムハライド複合体の蛍光強度
を測定することを特徴とするα＿１−酸性糖蛋白質の定
量方法。