JPH02124461A - 免疫分析 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、例えば全血、血清、血漿、及び尿などの液体
サンプル中における物質を検出又は測定するための免疫
学的検定法に関する。

（従来の技術） 種々の物質が免疫学的検定法によって検出又は測定され
ている（例えば、ホルモン、抗体、毒素、病原体、及び
ウィルス性粒子のような抗原等）。

但し製膜には、検出される物質又は検出に使用される物
質は必ずしも抗体ではない、従って゛免疫学的検定パと
いう用語が使用されているのである。

抗体はある特異結合対の構成物質であり、結合対の他の
構成物質は抗原又は検体と呼ばれる。抗体−抗原対以外
の、類似の検定法にて測定されかつ使用される他の特異
結合対としては、相互に特異結合親和性を有する分子対
、例えばホルモンとホルモンレセプターの対、及びビオ
チンとアビジンの対などがある。

通常、免疫学的検定は少なくともその一部が固体支持体
（例えば、ガラス繊維メンブレン）上で行われる。固体
支持体を使用した免疫学的検定に対して最も広く適用さ
れている２つのフォーマットは、競合フォーマット（ｃ
ｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ　ｆｏｒｓａｔ）とサントイ７チ
フオーマ７　）　（ｓａｎｄｗｉｃｈ　ｆｏｒｓａｔ）
である０代表的な競合フォーマットがリットマン（Ｌｉ
　ＬＬｍａｎ）らによる米国特許第４，５４０，６５９
号明細書に、そして代表的なサンドインチ検定がデビッ
ト（Ｄａｖｉｄ）　らによる米国特許第４，３７６．１
１０号明細書に説明されている。

サンドインチテストを使用した例としては、免疫蛍光検
定法０ＦＡ）及び酵素結合による免疫吸着剤検定法（Ｅ
ＬＩＳＡ）などがある、どちらの検定法も、猫の通常の
疾患検査や白血病ウィルス（ＦｅＬＶ）の検出に利用さ
れている。

ＦｅＬＶは内生的に自己復製するＣ−タイプのオコーナ
ウイルス（ｏｃｏｒｎａｖｉｒｕｓ）であり、ウィルス
性ゲノムがプロウィルスとして宿主染色体中に組み込ま
れ、ゲノムが翻訳されて完全なとリオンを生成する。ウ
ィルスは感染した猫から病気にかかりやすい猫へと広が
り、を髄！ＩＩｍやリンパ性網内症Ｒ１１から後天的な
免疫不全症候群に至るまで数多くの疾病症候群を引き起
こす。

猫に感染する他のウィルスは、免疫不全のようなｇ、＠
群にかかった１群の猫から最近単離されたレトロウィル
スであり、本ウィルスはフィーラインーＴ−リンフォト
ロフィックレンティウイルス（ｒｅｆｉｎｅ−↑−１ｙ
ｍｐｈｏｔｒｏｐｈｉｃ　１ｅｔｉｖｌｒｕｓ）　（Ｆ
ＴＬν又はＦｎ）と呼ばれている。このウィルスは人間
の免疫不全ウィルス（）ＩＩＶ）　と同じグループに属
し、人間のエイズの原因となる病原体である。　ＰＩＶ
については、ベデルソン（Ｐｓｄａｒｓｏｎ）らによる
“２３５サイエンス７９０．１９８７”に説明されてい
る。　ＦＩＶの抗体は、ＩＦ＾を使用することによって
検出されている。

（課題を解決するための手段） ある１つの、Ｕ様においては、本発明は、生物学的サン
プル中におけるＰＩＶの抗体の有無を検出するための方
法を特徴とする０本方法は、（ａ）前記抗体によって認
知される第１のエピトープを有する検出可能な第１の抗
原を供給する工程；　（ｂ）前記抗体が前記第１抗原と
結合して免疫複合体を形成することができるような条件
下にて、前記第１抗原を前記サンプルに接触させる工程
；及び（ｃ）前記免疫複合体を検出する工程；の各工程
を含む。

ここで言う“検出用「とは、第１抗原が容易に検出しう
るＩ！ａ（例えば、放射性同位元素、酵素、又は蛍光担
体等）で標識付けされているか；又は例えばある標識を
有する分子（例えば当該抗原に対する４１Ｉ識付けされ
た抗体）に第１抗原が容易に結合できる、ということを
意味している。

好ましい実施Ｍ欅においては、本方法はさらに、漆触工
程の前に、抗体を固体支持体に結合させる工程を含む。

前記結合工程は、（ａ）前記抗体によって認知される第
２のエピトープを存する第２の抗原を前記固体支持体に
結合させる工程、このとき前記第２抗原は前記第１抗原
と同じであってもよく、また前記第２エピトープは前記
第１エピトープと同じであってもよい；及び（ｂ）＠記
抗体が前記第２抗原と結合しうる条件下にて、前記第２
抗原と前記サンプルとを接触させる工程：を含むのが最
も好ましい。

＋ｉｌ記の第１抗原及び第２抗原は、ＦＩＶから誘導さ
れるか、又はＦＩＶを含むか、又はＦＩＶから誘導され
るポリペプチドと実質的に同じポリペプチドであるのが
好ましい。ここで言う“実質的に同じ′″とは、当該ポ
リペプチドが天然に存在するアミノ酸配列に比べて、１
０％置換以下のアミノ酸配列を存している、ということ
を意味している。

他の態様においては、本発明は、検出可能な標識を有す
る、ＦＩＶのエピトープを含んだ抗原（抗原はＦＩＶそ
のものでもよい）を特徴とする。さらに抗原は、ＦＩＶ
から単離されるか又はＦＩＶから誘導されるポリペプチ
ドと実質的に同じいかなるポリペプチドでもよい。

さらに他の態様においては、本発明は、生物学的サンプ
ル中における第１の抗体と第１の抗原の有無を同時に検
出するための方法を特徴とし３、本方法は、（ａ）前記
第１抗体によって認知される第１のエピトープを存する
検出可能な第２の抗原を供給する工程；　（ｂ）前記第
１抗原を特異的に認知する検出可能な第２の抗体を供給
する工程；（ｃ）前記第２抗原が前記第１抗体と結合し
て第１の免疫複合体を形成することができ、そして前記
第２抗体が前記第１抗原と結合して第２の免疫複合体を
形成することができるような条件下にて、前記第２抗原
と前記第２抗体を前記サンプルに接触させる工程：及び
（ｄ）前記の第１又は第２免疫複合体を検出する工程；
の各工程を含む。

好ましい実施態様においては、本方法はさらに、前記接
触工程の前に、前記第１抗原と前記第１抗体を固体支持
体に結合させる工程を含む、前記結合工程は、（ａ）前
記第１抗体によって認知される第２のエピトープを有す
る第３の抗原を前記固体支持体に結合させる工程、但し
、前記第３抗原は前記第２抗原と同じであってもよく、
また前記第２エピトープは前記第１エピトープと同じで
あってもよい；　（ｂ）前記第１抗原を特異的に認知す
る第３の抗体を前記固体支持体に結合させる工程；及び
（Ｃ）前記第１抗体が前記第３抗原と結合して第３の免
疫複合体を形成することができ、そして前記第１抗原が
前記第３抗体と結合して第４の免疫複合体を形成するこ
とができるような条件下にて、前記第３抗原と前記第３
抗体を前記サンプルに接触させる工程；の各工程を含む
のが最も好ましい、好ましくは、前記第３抗原と前記第
３抗体が別個の場所において前記固体支持体に結合され
、このとき前記支持体に対して前記第１抗体との結合が
起きているのか、又は前記第１抗原との結合が起きてい
るのかを見分け、ることができ；前記第１抗原はＦｅＬ
Ｖで、前記第１抗体は抗−ＦＩＶであり；前記第１抗原
はＨＩＶ又はヘパティティス抗原で、前記第１抗体は抗
−旧ν又は抗−ヘパティティスである。

さらに他の８４１１においては、本発明は第１の抗原と
第１の抗体を有する固体支持体を特徴とし、このとき曲
記第１抗原と前記第１抗体が、前記第１抗原に対応する
第２の抗体及び前記第１抗体に対応する第２の抗原との
反応に利用できる。

好ましい実施態様においては、固体支持体は、マイクロ
タイターウェル（ｓｉｃｒｏｔｉｔｅｒ　ｗｅｌｌ）　
、ガラスビーズ又はプラスチックビーズ、フィルターマ
トリックス、ポリスチレンラテックスビーズ、及び他の
微粒子から選ばれるものであり；前記第１抗原と前記第
１抗体が、別個の場所において前記フィルターマトリッ
クスに結合され；前記第１抗原がＦＩＶ、　ＰＩＶのエ
ピトープを有するポリペプチド、又は　ＦＩＶから誘導
される物質で、前記第１抗体が抗−Ｆ　ｅ　１．Ｖであ
りｉ前記第１抗原がＨＴＶもしくは　ＨＴＬシー■、Ｈ
ＩＶもしくはＨＴＬＶ−１のエピトープを有するポリペ
プチド、又は■νもしくはＨＴＬＶ−１から誘導される
物質であり、そして前記第１抗体が抗−ヘパティティス
抗原、抗−ＨＩＶ、又は抗−ＨＴＬＶ−１である。

本発明はさらに、（ａ）第１の抗原と第１の抗体を有す
る固体支持体、このとき前記第１抗原とｒｒＩ記第１抗
体が、前記第１抗原に対応する第２の抗体及び前記第１
抗体に対応する第２の抗原との反応に利用できる；及び
（ｂ）前記第２抗体によって認知されるエピトープを有
している検出可能な第３の抗原、又は前記第２抗原と特
異的に反応することができる検出可能な第３の抗体；を
含んだキットを特徴とする。

好ましい実施態様においては、キットは第３の抗原と第
３の抗体を有し；前記固体支持体がマイクロタイターウ
ェル、ガラスビーズ又はプラスチツクビーズ、フィルタ
ーマトリックス、ポリスチレンラテックスビーズ、及び
他の微粒子から選ばれ；前記第１抗原と前記第１抗体が
、別個の場所においてフィルターマトリックスに結合さ
れ：前記第１抗原がＦＩＶＳＦＩＶのエピトープを有す
るポリペプチド、又はＦＩＶから誘導される物質であっ
て、前記第１抗体が抗−ＰｅＬＶであり；前記第１抗原
がＨＩＶ、旧替のエピトープを有するポリペプチド、又
はＨＩＶから誘導される物質であって、前記第１抗体が
抗−ヘバティティス抗原又は抗−旧νであり；そして前
記固体支持体が陽性コントロール・スポット（ｐｏｓｉ
ｔｉｖｅ　　ｃｏｎｔｒｏｌ　５ｐｏｔ）又は陰性コン
トロール・スポット〔これらについては後述する〕を含
んだ部分を有する。

さらに他の態様においては、本発明は生物学的テンプル
中におけるＦＩＶの抗体の有無を検出するための方法を
特徴とし、本方法は、（ａ）精製ＦＩＶ　、　ＦＩＶか
らの精製抗原、又はＦＩＶから単離したポリペプチドと
実質的に同じ精製ポリペプチドを供給する工程、このと
き前記の精製ＦＩＶは、ＰＩシー宿主細胞蛋白質を実質
的に含まず、蛋白質トータルとして少なくとも５％のｐ
２６〔主要なヌクレオカプシド蛋白質であって、クーマ
シー・ブルー（ｃｏｏａａｓｓｉｅ　ｂｌｕｅ）Ｇ−２
５０で染色した５Ｏ５−ＰＡＧＥを濃度計で走査するこ
とにより測定〕を含んでいる；　（ｂ）前記精製ＦＩＶ
　、前記精製抗原、又は前記精製ポリペプチドを固体支
持体に結合させる工程；　（Ｃ）前記抗体が前記精製Ｆ
ＩＶ　、前記精製抗原、又は前記精製ポリペプチドと結
合して第１の免疫複合体を形成することができるような
条件下にて、前記サンプルと前記固体支持体とを接触さ
せる工程：　（ｄ）酵素で４１！ＩＩ付けした検出可能
な抗体が前記第１抗体と第２の免疫複合体を形成するよ
うな条件下にて、前記第１免疫複合体と前記酵素標識抗
体とを接触させる工程；及び（ｅ）前記第２免疫複合体
を検出する工程；の各工程を含む。

好ましい実施態様においては、検出可能な抗体は酵素（
例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼやアルカリホ
スファターゼ等）を含み；検出可能な抗体は抗−フィー
ライン抗体である。

さらに他の態様においては、本発明は、ＦＩＶ−宿生細
胞蛋白質を実質的に含まず、蛋白質トータルとして少な
くとも５％のｐ２６を含んだ精製ＦＩＶを特徴とする。

本発明により、従来のテストより高い特異性及び感度を
有する、生物学的サンプル中におけるＦＩＶを検出する
ためのテストが提供される。抗−ＦＩＶと反応すること
のできる標識付けされた抗原を使用することによって、
多くの４！識分子を有する大きな免疫複合体を形成する
ことが可能となり、従ってテストの感度がアンプする０
本発明のεＬＩＳＡ　ＦＩＶテスト（十分に精製された
ＦＩＶ抗原を使用）を使用すると、Ｆ【νに関する従来
のテスト方法より感度と特異性が向上する。

本発明はさらに、単一のテスト装置を使用することによ
って、抗原と抗体の対を単一の血液サンプルで同時に検
出することのできる方法を提供する。従来の技術を使用
した場合は、このことは不可能である。なぜなら、例え
ば、全血中の抗原を検出するには希釈されていない血液
を使用する必要があり、一方抗体を検出するには希釈さ
れた血液を使用しなければならないからである９本発明
では、標識付けした抗体よりむしろ標識付けした抗原を
使用してサンプル中の抗体を検出することによって、こ
の問題を解消している。従って、ヘパティティスＢ抗原
、ＨＩＶ抗体、及び例えば血液銀行から廃棄されるこう
した疾患原因となる病原体に対して陽性であるような血
液に関して、人間の全血を同時にスクリーニングするこ
とができる。

本方法は、抗原と抗体の所望の混合物に関して、感度の
低下を起こすことなく多数の生物学的サンプルを迅速に
スクリーニングするのに使用することができる。従って
、本発明の方法を使用すれば、従来複数のテストが必要
であったものが単一のテストで済むようになる。

本発明の同時検定法は、ＦｅＬＶ、　ＦＩＶ　、ヘバテ
ィティス抗原、及び１１！ｖのような感染性病原体に関
して、血液や他の生物学的液体を迅速にスクリーニング
するための手段を提供する。抗原と抗体の混合物に対し
て同時スクリーニングを施せば、単一のテストを行うだ
けで、当該生物学的サンプルが有用であるか否か、例え
ば人間の血液を輸血に使用することができるかどうかを
決定することができる。さらに本検定法を使用すれば、
類似した臨床的症状を与える１種以上のウィルス（例え
ばＦｅＬＶやＦｍによる感染の原因を突き止めることが
できる。さらに、同じウィルス性感染につきものの抗原
と抗体（例えばＨＩＶ抗原と坑−ＨＩＶ抗体）に対して
同時検定を行うことも可能となる。〔本検定法の場合、
＃素標識に化学的に結合したＨＩＶ抗原上のエピトープ
を認知するモノクローナル抗体を用意する必要があり、
例えばｐ２４に対するモノクローナル抗体（市販されて
いる）を使用することができる。〕 本発明のＦｅＬＶ−ＦｒＶ同時テストは、“°スイッタ
・キャｙト・シンドローム（Ｓｉｃｋ　Ｃａｔ　Ｓｙｎ
ｄｒｏｍｅ）’の猫が慢性疾、＠（ＦＩＶ又はＦｅＬＶ
）に感染していて、従って他の猫から隔離すべきか；あ
るいはそれほどひどくは感染していなくて、従うで抗生
物質で治療することができるかどうか；を決定するのに
訂用である。このような猫のうちの約１２〜１５％がＦ
ＩＶに感染し、１２〜１５％がＦｅＬＶに感染し、そし
て残りはこれらのウィルスに感染してシ）ない。

同様に、ＦｅＬＶワクチンを子猫に投与すべきかどうか
、また子猫を他の猫と接触させてもよいかどうか、につ
いて子猫を調べるのに本テストを使用することができる
。

本発明の他の特徴及び利点は、以下に記載する好ましい
実施態様の説明から明らかとなろう。

ＰｅＬＶ　　　　　　ＦＩＶ　　　　に　　　る以下の
説明は、単一テストによる抗原と抗体の同時検出の例で
ある。この例では、猫の血清、血漿、又は全血における
ｐｅＬＶｔ７ｔＪｊｔｊとＦＩＶに対する抗体が単一の
テストで同時に測定される。この例にの場合、本検定は
ＦｅＬＶ抗原とＦＩＶ抗体の免疫学的検定に対して固体
相フォーマットを使用するが、他のフォーマットも好適
であり；例えば、１９８７年１１月６日付は提出の、“
二重吸着剤による検体の検出“と題するプルックス（Ｂ
ｒｏｏｋｓ）らによる米国特許出願第１１８．７５０号
明細書（本特許出願と同じ譲受人に譲渡；参照の形でこ
こに引用）に記載のデイツプスティック・フォー・ンマ
・ント（ｄｉｐｓｔｉｃｋｆｒｏｍａｔ）　）　：メン
プレンをベースとしたフォーマット；マイクロタイター
ウェルをベースとしたフォーマ７　）　＋　１９８８年
２月５日付は提出の、”検定用キットと検定方法”と題
するプルツクらによる米国特許出願第１５２．５１５号
明細書（本特許出願と同じ譲受人に譲渡；参照の形でこ
こに引用）に記載のドライ・フォーマット；及び１９８
６年９月ｌＯ日付は提出の、′全血を検定するための方
法と装置”と題するトネリ（Ｔｏｎｅｌｌｉ）による米
国特許出願第９０５　、８５６号明細１！Ｆ（本特許出
願と同じ譲受人に譲渡；参照の形でここに引用）に記載
のフォーマット；等がある。

以下に図面を参照しながら説明する。　ＦＩＶ／ＦｅＬ
Ｖ検定は、抗−ＦｅＬＶモノクローナル抗体で被覆した
ラテックス粒子をポジシラン１９にてガラス繊維フィル
ター１８に付けて行う、同様に、同じフィルター１８上
のポジシラン２０において、ＦＩＶ抗原で被覆したラテ
ックス粒子を付け、これをＦＪＶ抗体の検定に使用する
。陽性コントロール試薬と陰性コントロール試薬をフィ
ルターメンブレン１８上のそれぞれポジシラン２２と２
１にて組み込むことにより、２つの完全なテスト手順を
同時に実施することができ、明確な結果が得られる。

区間についてさらに説明する。ガラス繊維フィルターＩ
８に°はさらに方位スポット２４が設けられており、多
孔質ポリエチレンディスク１６と酢酸セルロース吸着剤
１４に支持された円筒形の使い捨て検定器具１０　（１
９８８年１月１９日付は提出の、“°免疫学的検定法“
と題するマクマホン（ＭｃＭａｈｏｎ）らによる米国特
許出願第１４５，５２２号明細書（本特許出願と同じ譲
受人に譲渡上参照の形でここに引用）に記載〕の中に組
み込まれる。これらの物質の吸い上げ特性が組み合わさ
って、メンブレンを通過するサンプルと試薬の流れを制
御する０本システムは、固体相の表面における溶液の“
撹拌されていない”層をなくす（拡散により、試薬の反
応性粒子結合成分への移送が制限される）という点にお
いて、固体相克疫学的検定につきものの速度論上の問題
点を最小限に抑える９粒状物固体相の設計及び検定器具
内におけるその機能により、他の固体相に比べて試薬の
結合性が増して゛いる０本配置構成は、直情、血漿、又
は全血に対して使用することができる。

シリンダー１２は、フィルター１８の他に付属プレフィ
ルタ−２６を含み、本フィルターは使用時においてサン
プルから不溶性物質を除去するよう作用する。器具ｌＯ
は、上部の円錐形カップ３０に固定されたシリング−１
２の中に、上記した構成部品を配置していくことによっ
て組み立てる。ハンドル３６とスポンジ部分３４を有す
るプランジャー３２を使用して、構成部品のそれぞれを
固定する。

−ａには、フィルター１８上の結合抗原及び結合抗体を
検出するのに使用される複合混合物は、セイヨウワサビ
・ペルオキシダーゼ（ｌ（ＲＰＯ）と複合した、ｐ２７
（ＦｅＵνの主要な核蛋白質）に対するモノクローナル
抗体、及びＨＩ？ＰＯと複合したＦＩＶ抗原を含有して
いる。複合混合物とテストサンプルを混合すると、複合
モノクローナル抗体がｐ２７抗原と結びつき（ｐ２７抗
原が存在する場合）、一方複合ＦＩＶ抗原は抗−ＦＩＶ
抗体と結びつく（抗−ＦＩＶ抗体が存在する場合）０本
市合物を検定器具１０に適用すると、メンブレンに結合
した抗−Ｐ２７抗体がρ２７複合抗体複合体を１７１１
促し、メンブレンに結合したＰＩＶ抗原が抗−ＦＩＶ複
合複合抗原体合体を足する。洗浄を行い、基質と色原体
を加えた後、ＦｅＬνサンプルスポットにおいて色が発
現すればＦｅＬＶ抗原の存在を示しており、またＦＩＶ
サンプルスポットにおいて色が発現すればＦｒν抗体が
存在していることを示している。

本検定法の特徴は、陽性コントロールと陰性コントロー
ルを組み込んだことにある。陽性コントロール粒子が、
ＩＩＲＰＯに対する抗体で被覆される。

検定操作中にメンブレンに施された少量の複合混合物が
、陽性コントロールスポットによって捕捉される。引き
続き陽性コントロールによって色が発現すれば、当該複
合混合物が活性であること示しており、これが検定が有
効であるかどうかの１つの規準となる。陰性コントロー
ル粒子が、非特異性マウス抗体と精製した非感染宿主細
胞抗原で被覆される。これらの粒子に被覆されたマウス
抗体と宿主細胞抗原の量は、どちらかのサンプル粒子で
生じる”非特異性”反応をシミユレートするのに十分で
ある。陰性コントロールスポットが、サンプルスポット
と同じ仕方で全ての検定試薬にさらされる。得られた結
果が有効となるためには、陰性コントロールスポットは
無色のままでなければならないか、あるいは少なくとも
サンプルスポットより着色の程度が小さくなければなら
ない。

陰性コントロールスポットにおいてかなりの１色が起こ
れば、非特異性の問題があることを示しており、従って
テストは無効となる。検定結果に対するユーザーの解釈
は次の通りである：　（１）陽性コントロールスポット
だけが色を発現する一陰性結果；　（２）陽性コントロ
ールスポットとＦｅＬν及び／又はＦＩＶサンプルスポ
ットが色を発現するーそれぞれのサンプルスポットに対
して陽性結果；　（３）陰性コントロールスポットだけ
がサンプルスポットより濃い色を発現する一陰性結果；
　（４）いかなるスポットにおいても色の発現は認めら
れない一無効テスト；　（５）陰性コントロールスポッ
トがサンプルスポットより薄い色を発現するーそれぞれ
のサンプルスポットに対して陽性結果。

以下に、本検定の個々の成分、並びに本検定の詳細な例
について説明する。

ＦＩＶ立ヱ土入坑凰 使用するＦＩＶ抗原はｆｌＶウィルス（粒子）であるか
、又は以下に記載するように、ＦＩＶ　ウィルス粒子か
ら誘導される（本検定には、ＦＩＶ粒子から誘導された
実質的に精製されたポリペプチドのような合成抗原も好
適である）、カリフォルニア大学の二−ルス・ベデルソ
ン（Ｎｉｅｌｓ　Ｐｅｄｅｒｓｏｎ）博士から、培養菌
を生成するマスター・シード・ウィルス（ｍａｓｔｅｒ
　５ｅｅｄ　ｖｉｒｕｓ）を、ＦＩＶアイソレート（Ｆ
ＩＶｌ５ｏｌａｔｅ）Ｎｏ、２４２７　（ベタルマ・ス
トレイン（ＰｅＬａｌｕｓａ　５ｔｒａｉｎ）　）に感
染した連続的フィーライン細胞ラインの形で得た。他の
ウィルス培養菌は、ペデルソンによる前記文献、又はハ
ーバ−（Ｈａｒｂｏｕｒ）らによる’１２２．獣医学記
録８４．１９８８”に記載の手順に従って得ることがで
きる。細胞培養菌を生成するウィルスの種は、培養菌中
へ少なくとも１９回ポスト・インフエクション（ｐｏｓ
ｔ　１ｎｆｅｃｔｉｏｎ）通過を行った後に、ＦＩＶ−
感染したマスターシード細胞培養菌をフリーズ・ダウン
（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｏｗｎ）することによって得た。培
養菌を生成するウィルスのさらに他の種は、ＦＩＶマス
ターシードウィルスを使用して連続的フィーライン細胞
ラインを感染させることによって、あるいは最初の１ｉ
１Ｖ怒染したマスターシード細胞培養菌からの高レベル
のＰＩＶ生成体を単一細胞マイクロウェルでクローンと
して発生させることによって得ることができる。繁殖さ
せるためには、マスターシードウィルスに感染したフィ
ーライン細胞培養菌を、ｍ１ａ細胞培養フラスコ中に植
えつける。細胞を融合性の単層にまで成長させた後、２
〜５日の間隔で組織培養液体を採取する。

ＦＩＶに永久的に感染したマスターシード細胞ラインに
よる繁殖によって、ワーキング・シード・ウィルス（ｗ
ｏｒｋｉｎｇ　５ｅｅｄ　ｖｉｒｕｓ）が生成される。

組織培養フラスコに接種物を加え、培養し、そして費や
された＆ｌ織培Ｗａ体を採取する。一般には、液体と細
胞の採取前に、フラスコが３６〜３８°Ｃで最大７日間
培養される。細胞物質も含めて、採取した液体を高速遠
心分離機〔ソーパル（Ｓｏｒｖａｌ）　ＲＣ−５８又は
ベックマン（Ｂｅｃｋｎａｎ）　Ｊ２−２１　）にかけ
て、上澄み液と細胞ペレット物質とに分離する。細胞ペ
レットを廃棄し、上澄み液培養液体を使用してワーキン
グウィルスを調製する。清浄化した上澄み液に０．５Ｍ
のＮａＣ１及び４〜ｌＯ％のポリエチレングリコール（
ＰＥ６８０００．シグマ）を加える。−晩装置し°ζ沈
澱させた後、ウィルスをベレット化し、緩衝液（トリス
（Ｔｒｉｓ）１０＋ｍＭ、　Ｈａ（：ｌ　３００ｍＭ、
　ＨＤＴＡ　１ｓＭ、　ｐＨ７，５〕中に再びｉＱ濁さ
せる０次いで、本ウィルスを遠心分離にかける（１３，
０００ｘ　ｇ、１５分）、遠心弁＃操作後にペレットを
廃棄し、グリセロールの５０〜９０％不連続濃度勾配で
清浄化上澄み液を遠心分離する。遠心分離操作は？５，
０００ｘｇで３時間行い、界面におけるＦＩＶウィルス
性バンドを捕集する０本バンドを緩衝液中に懸濁させ、
？５，０００ｘ　ｇで１時間遠心分離を行う、得られた
ペレットを緩衝液中に再びＭ濁させ、−７０℃で保管す
る。

ヱユス±ｙｌｈ王 ポリスチレン粒子〔０，２〜２ミクロン、バンデノクス
・ラボラトリーズ（Ｐａｎｄｅｘ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ）社製〕を１０１１＋Ｈのリン酸カリウム緩衝液
（ｐＨ７，２）中に懸濁させ、５０〜！０００μｇの不
活性化ＦＩＶ粒子と混合スる。　ＦＩＶは、０．２５％
のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＯ５）を加え、５６゛Ｃ
で１時間加熱することによって不活性化される。　ＳＯ
３の量は、ＦＩＶ粒子の蛋白質含量に比例して変わる。

一般には、抗原１ｍｇ当たり２．４ｍｇのｓｎｓが使用
される。１５〜３０°Ｃで１〜２４時間培養した後、１
３．０００　ｘ　ｇで１０分、粒子を遠心分離にかける
。１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）　　と１０ｍＭリ
ン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，２）　との混合物中にペ
レットを再び懸濁させ、１５〜３０°Ｃで０．５〜２時
間培養し、上記したように遠心分離を行う、緩衝液中で
ペレットを洗浄し、再び遠心分離を行う０次いで得られ
たペレットを、２．５％スクロースの１ＯＩＩＩ１１リ
ン酸カリウム［ｉ液と０．０５％のツイーン（Ｔｗｅｅ
ｎ）　２０との混合物中に再び懸濁させる。得られた粒
子の１％溶液の２．５〜６μ２を検定器具にスポットす
る。

■Ｌ五亘髪血止 洗剤を加え、６５°Ｃで９０分熱処理することによって
、精製ＦＩＶウィルスを不活性化させる。界面活性剤を
加えることによって、さらにピリオンを崩壊させる。例
えば、４．８町のＳＯＳに２ｄのＰＩν抗原を加え、６
５°Ｃで９０分加熱し、そして４°Ｃで２時間冷却する
。ミクロ遠心分離チューブを使用し、４℃で１０分間遠
心分離を行った後、トリトン（↑ｒｉ　ｔｏｎ）Ｘ−１
００を加えて１．５％の最終濃度とし、本混合物を１５
〜３０°Ｃで３０分間放置する。？９液１ｄ当たりＧ、
にのパイオービーズ（Ｂｉｏ−ｂｅａｄｓ）　（バイオ
−ラッド（Ｂｌｏ−Ｒａｄ）Ｓ−１００，バイオ−ラッ
ド・ラボラトリーズ製］を加え、本混合物を２時間振盪
する。溶液を取り出し、２５１１１ＭのＮａＨＣＯｓ（
ｐＨ９，２）に対して一晩透析する。次いで、ウィルソ
ンらの方法（”免疫蛍光及び関連染色技術′°、クナシ
ブ（Ｋｎａｐｐ）　ら、　ｐ、　２１５．１９７８）に
より、メタベリオデート（ｍｅｔａｐｅｒｉｏｄａＬｅ
）で活性化したセイヨ’７’７サビ・ペルオキシダーゼ
で清浄化した抗原を処理し、複合体をホウ水素化ナトリ
ウムで処理して複合体希釈剤Ｃ１０１１Ｍ　トリス、　
ｐＨ７，２〜７．６　ｉ　０．０５％のツイーン２０．
５０％の子牛血清、　１０％のマウス血清、　０．１　
ｍｇの［１＆Ｌブルー・ダイ（Ｂｌｕｅ　ｄｙｅ）、　
１６ｍｇ／ｌのゲンタマイシン（シグマ）、及び０．２
ｇ／ｌのチメロサール（Ｔｈｉｍｅｒｏｓａｌ）　（シ
グマ）を含有〕で希釈する。

肚は抜止 ＦｅＬシウイルスＰ２１抗原に対するモノクローナル抗
体産生細胞ラインを、カリフォルニア大学獣医学校から
得た。これらの細胞ラインは現在でもカリフォルニア大
学から入手可能である。最初は組ｔｉ培養で細胞ライン
を繁殖させ、次いでブリスタンを十分に摂餌させたＢＡ
ＬＢ／Ｃ又はｆｌ？ｃ／Ｆｆマウスに注射する。アシテ
ス（ａｃｌｔｅｓ）液体を採取し、清浄化する。硫酸ア
ンモニウム沈澱法又は親和ゲルもしくはイオン交換ゲル
を使用したカラムクロマトグラフィーによって、抗体を
ある程度精製する。

ＦＩＶに関して記載したのと同様に粒子を調製する。

彼覆用覆衝液は、ＦｅＬＶに対するマウス抗体を含有し
ている。　ＦｅＬＶに対する他の好適なモノクローナル
抗体は、ＰｅＬＶウィルス性粒子〔メリーランド州シル
バースプリングのエレクトロ・ヌクレオニソクス（Ｅｌ
ｅｃｔｒｏ　　Ｎｕｃｌｅｏｎｉｃｓ）Ｉｎｃ、から入
手可能〕から標準的な方法によって調製することができ
る。

販は複立体 モノクローナル抗−ＦｅＬＶセイヨウワサビペルオキシ
ダーゼは、ＦＩＶ共役物に関して説明した如く調製する
。

ユＺ上二二土葺ヱ ＦＩＶテストのためのコントロールとして、感染してい
ない細胞ラインの抽出物で陰性粒子を被覆する。　Ｆｅ
ＬＶテストのためのコントロールとして、ＦｅＬＶに対
して非反応性のＩｇＧ（シグマから購入）で陰性粒子を
被覆する。

ＦＩＶテスト及びＰｅＬＶテストのためのコントロール
として、上記した抗−セイヨウワサビペルオキシダーゼ
で陽性粒子を被覆する。陽性粒子は、アトランチンク・
アンチボディーズ（Ａｔｌａｎｔｉｃ　Ａｎｔｉ〜ｂｏ
ｄｉｅｓ）又はジャクソン・ラボラトリーズ（Ｊａｃｋ
−ｓｏｎ　ＬａｂｏｒＡｔｏｒｉｅｓ）　　（ペンシル
バニア）から購入した抗−セイヨウワサビペルオキシダ
ーゼを使用して作製する。

秩足器ｌ勿皿袈 前述した検定器具に染色した４ｍ準粒子をスボントし、
位置決めマークを形成させる１次いで、陽性ｔ・シ子、
ＦＩＶ粒子、ＦｅＬν粒子、及び陰性粒子を施す。等８
世のＦｅＬＶ陰性粒子とＦｌν陰性粒子を混合すること
によって、陰性粒子を調製する。

僕定工三上旦亜 ０．５〆のｆｃ浄液（２Ｍ塩化カリウム、２．５χ脱脂
乾燥ミルク、５χＢＳＡ、　０．５χ　ト’Ｊ　）　７
Ｘ−１００，０，１ツイーン８０．０．５χカトン（Ｋ
ａ　ｔｈｏｎ）　＋　及び０．１６ｇ／ｌゲンタマイシ
ン）で検定器具を湿らし、プレフィルタ−を器具に固定
する。　０．１５ｍ１の複合体をサンプルチューブに入
れ、検定すべきサンプルの０．２−を加える。サンプル
チューブに蓋をし、４〜５回上下を逆にすることによっ
て内容物を混合する。チューブを１５〜３０℃で３〜５
分間培養した後、チューブの全内容物を検定器具に加え
、１５〜３０’Ｃで３〜５分間培養する９次いでプレフ
ィルタ−を取り除き、０．５ｍの洗浄液を加えて吸収さ
せる。検定器具に２ｍ１の洗浄液を充填する。洗浄液が
吸収された後、０．１５ｄのＴＭＢｉ質（Ｉｇ／ｌのテ
トラメチルヘンザジン（Ｔ？ＩＢ）を６０％メタノール
と４０％グリセロールの混合物に溶解し、Ｔ？！［１希
釈剤（０，１Ｍ二二塩性性リン酸カリウム０．１Ｍクエ
ン酸、３０％過酸化水素、及び０．１ｇ／ｌ　チメロサ
ール）でｌ：ｌに希釈〕を加える。器具を１５〜３０゛
Ｃで３分間培養し、０．５ａｆｆｉの反応停止溶液（０
，０５〜０．１Ｍのモリブデン酸アンモニウム）を添加
することによって反応を停止させる。結果を読み取る。

ＦＩＶニ　　　るＥＬＩＳＡ−ス 以下の説明は、猫の全血中のＦＩＶ抗体に対するεＬ［
ＳＡテストの例である０本テストでは、バンクグラウン
ド反応を少なくするために、ウィルス性抗原が宿主細胞
蛍白質を含まないよう、ウィルス性抗原を十分に精製す
ることが大切である。一般に、精製ウィルスの純度は、
主要蛋白質のポリアクリルアミドゲル電気泳動によって
確認することができる。ヌクレオカプシド又は」…遺伝
子生成物（最も好ましくは、２２６ヌクレオカプシド蛋
白質）が当該ウィルス調製物中において少なくとも５％
（好ましくは１２〜１５％）のトータル蛋白質を示す場
合、調製物は十分に高純度である。つ・イルス精製法の
１つは、比較的高いイオン強度の緩衝液を含有したグリ
セロール中における密度勾配遠心分離による方法（例え
ば、１０ｍＭのトリス、３００ｍ−のＮａＣＩ、及び１
１のＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ７，５）を含んだ５０〜９０
％グリセロール界面にてウィルスを捕集する）である。

ＥＬ［ＳＡテストの１つのフォーマットにおいてはくテ
ストユニットはメーン州ポートランドのアグリテク・シ
ステムズ（ＡｇｒｉＬｅｃｈ　５ｙｓＬｅ＋ｓｓ）から
入手可能）、マイクロタイターディッシェ（ｍｉｃｒｏ
ｔｉＬｅｒｄｉｓｈ）のウェルに標準法によってＦＩＶ
抗原を被覆し、テストすべきサンプルと共に培養する。

　　ＦＩＶに特異的なサンプル中の抗体が、被覆された
ウィルス抗原と複合体を形成する。洗浄工程を経た後、
抗−フイーラインセイヨウワサビペルオキシダーゼ複合
体をウェルに加えて、被覆されたＦＩＶ抗原に結びつい
たフィーライン抗体と結合するようにする０本検定の最
終工程においては、結合していない抗−フィーライン複
合体を洗い落とし、酵素基質（過酸化水素）と色原体（
テトラメチルベンデシン、　ＴＭＢ）を加える。色の発
現の程度は、サンプル中に存在する特定の抗体の量に比
例する。

コントロールとしては、非−ＦＩＶ反応性の猫血清をリ
ン酸塩緩衝液（ＰＢＳ、　０．０１Ｍリン酸ナトリウム
、　０．１５Ｍ　ＮａＣ１、　ｐＨ７，２〜７．６）に
熔解してなる１００μｌの陰性コントールで処理した抗
原被覆ウェル；及び猫の抗−ＦＩＶ抗体陽性血清をＰＢ
Ｓ及びＦｅ２に溶解してなる１００μｌの陽性コントロ
ールで処理した少な（とも１つの抗原被覆ウェル；を含
む。

本検定においては、１００μｉの希釈血清サンプル又は
血漿サンプルを各ウェル中に分配する。希釈剤はＰＢＳ
とＦｅ２であり、通常サンプルは１００倍に希釈される
。ウェルを１５〜３０℃で３０分培養し、全てのウェル
の液体内容物を廃棄リザーバ中に吸引し、各ウェルを約
３００μｌの希釈洗浄液（ＰＢＳ　＋０．０５χツイー
ン２０）で５回洗浄する。洗浄後、ウェルから液体を吸
引する。最終洗浄に続いて、残留している洗浄液体ウェ
ルから吸収紙へと除去し、１００μｉの抗−フィーライ
ンｕＲｐｏ？Ｊ［合体を各ウェルに加え（０，１〜２．
０μｓ／ｄ）　、１５〜３０℃で３０分培養する。ウェ
ルを吸引して再び洗浄し、各ウェルに５０μβのＴＭＢ
希釈溶液を加え、次いで５０ｕｌｌのＴＭＢ基質を加え
る。　１５〜３０℃で１５分間培養した後、各ウェルに
１００Ｉｌｎ！の停止溶１（フッ化水素酸の１〜４００
倍希釈水溶液）を加える。サンプル及びコントロールに
対して、６５０ｎｍ（Ａｈｓ。）における吸光度を読み
取る。検定が有効であるためには、陽性コントロールと
陰性コントロールとの差が０．２より太き（なければな
らない、さらに、陰性コントロールの吸光度は０．２以
下でなければならない、　　ＦＩＶに対する抗体の有無
は、サンプルのれ５゜・値と陰性コントロールの平均と
を相関付けることによって決定することができる。陰性
コントロールより吸光度が３倍大きいサンプルは陽性サ
ンプルとみなされる。

１皿 ＦＩＶアイツレ−）Ｎｏ、　２４２７　（ペタルマ・ス
トレイン（Ｐｅｔａｌｕｓａ　５ｔｒａｉｎ）　）をＡ
ＴＣＣに寄託して、１９８８年７月１３日にＣＲＬ９？
６１の番号が付されている。

【図面の簡単な説明】

図面は、本発明の使用に通した検定器具の分解斜視図で
ある。 ＩＯ・・・検定器具、　１２・・・シリンダー１４・・
・吸着剤、　　１６・・・ディスク、１８・・・フィル
ター、２６・・・プレフィルタ−３０・・・カップ、　
　３２・・・ブランジャ−飄面の（′？古（内容に変更
なし） 手 続 補 正 ！！（方力 平成 元年１１月２日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、生物学的サンプル中における第１の抗体と第１の抗
   原の有無を同時に検出するための方法であって、 （ａ）前記第１抗体によって認知される第 １のエピトープを含む検出可能な第２の抗原を供給する
   工程； （ｂ）前記第１抗原を特異的に認知する検 出可能な第２の抗体を供給する工程； （ｃ）前記第２抗原が前記第１抗体と結合 して第１の免疫複合体を形成することができ、そして前
   記第２抗体が前記第１抗原と結合して第２の免疫複合体
   を形成することができるような条件下にて、前記第２抗
   原と前記第２抗体を前記サンプルに接触させる工程；及
   び （ｄ）前記の第１及び／又は第２免疫複合 体を検出する工程； の各工程を含む前記方法。 ２、前記の接触工程前に、 前記第１抗原と前記第１抗体を固体支持体に結合させる
   工程； をさらに含む、請求項１記載の方法。 ３、前記の結合工程が、 （ａ）前記第１抗体によって認知される第 ２のエピトープを含んだ第３の抗原を前記固体支持体に
   結合させる工程、但し、前記第３抗原は前記第２抗原と
   同じであってもよく、また前記第２エピトープは前記第
   １エピトープと同じであってもよい； （ｂ）前記第１抗原を特異的に認知する第 ３の抗体を前記固体支持体に結合させる工程；及び （ｃ）前記第１抗体が前記第３抗原と結合 して第３の免疫複合体を形成することができ、そして前
   記第１抗原が前記第３抗体と結合して第４の免疫複合体
   を形成することができるような条件下にて、前記第３抗
   原と前記第３抗体を前記サンプルに接触させる工程； を含む、請求項２記載の方法。 ４、前記第３抗原と前記第３抗体が別個の場所において
   前記固体支持体に結合され、このとき前記支持体に対し
   て前記第１抗体との結合が起きているのか、又は前記第
   １抗原との結合が起きているのかを見分けることができ
   る、請求項３記載の方法。 ５、前記第１抗原がＦｅＬＶであり、前記第１抗体が抗
   −ＦＩＶである、請求項３記載の方法。 ６、前記第１抗原がＨＩＶ、ＨＴＬＶ−Ｉ、又はヘパテ
   ィティス抗原であり、前記第１抗体が抗−ＨＩＶ、抗−
   ヘパティティス、又は抗−ＨＴＬＶ−Ｉである、請求項
   ３記載の方法。 ７、第１の抗原と第１の抗体を含んだ固体支持体であっ
   て、このとき前記第１抗原と前記第１抗体が、前記第１
   抗原に対応する第２の抗体及び前記第１抗体に対応する
   第２の抗原との反応に利用できる、前記固体支持体。 ８、前記支持体が、マイクロタイターウェル、ガラスビ
   ーズ又はプラスチックビーズ、フィルターマトリックス
   、ポリスチレンラテックスビーズ、及び他の微粒子から
   選ばれる、請求項７記載の固体支持体。 ９、前記第１抗原と前記第１抗体が、別個の場所におい
   て前記フィルターマトリックスに結合されている、請求
   項８記載の固体支持体。 １０、前記第１抗原がＦＩＶ、ＦＩＶのエピトープを含
   んだポリペプチド、又はＦＩＶから誘導される物質であ
   り、前記第１抗体が抗−ＦｅＬＶである、請求項７又は
   ９に記載の固体支持体。 １１、前記第１抗原がＨＩＶもしくはＨＴＬＶ−Ｉ、Ｈ
   ＩＶもしくはＨＴＬＶ−Ｉのエピトープを含んだポリペ
   プチド、又はＨＩＶから誘導される物質であり、前記第
   １抗体が抗−ヘパティティス抗原もしくは抗−ＨＩＶ、
   又は抗−ＨＴＬＶ−Ｉである、請求項７又は９に記載の
   固体支持体。 １２、（ａ）第１の抗原と第１の抗体を含んだ固体支持
   体、このとき前記第１抗原と前記第１抗体が、前記第１
   抗原に対応する第２の抗体及び前記第１抗体に対応する
   第２の抗原との反応に利用できる；及び （ｂ）前記第２抗体によって認知されるエ ピトープを有している検出可能な第３の抗原；又は前記
   第２抗原と特異的に反応することができる検出可能な第
   ３の抗体； を含んだキット。 １３、前記第３抗原及び前記第３抗体を含んだ、請求項
   １２記載のキット。 １４、前記固体支持体が、マイクロタイターウェル、ガ
   ラスビーズ又はプラスチックビーズ、フィルターマトリ
   ックス、ポリスチレンラテックスビーズ、及び他の微粒
   子から選ばれる、請求項１３記載のキット。 １５、前記第１抗原と前記第１抗体が、別個の場所にお
   いて前記フィルターマトリックスに結合されている、請
   求項１３記載のキット。 １６、前記第１抗原がＦＩＶ、ＦＩＶのエピトープを含
   んだポリペプチド、又はＦＩＶから誘導される物質であ
   り、前記第１抗体が抗−ＦｅＬＶである、請求項１３記
   載のキット。 １７、前記第１抗原がＨＩＶもしくはＨＴＬＶ−Ｉ、Ｈ
   ＩＶもしくはＨＴＬＶ−Ｉのエピトープを含んだポリペ
   プチド、又はＨＩＶもしくはＨＴＬＶ−Ｉから誘導され
   る物質であり、前記第１抗体が抗−ヘパティティス抗原
   、又はＨＴＬＶ−Ｉもしくは抗−ＨＩＶである、請求項
   １３記載のキット。 １８、前記固体支持体が陽性コントロール・スポット又
   は陰性コントロール・スポットを含んだ部分を有する、
   請求項１２記載のキット。 １９、ＦＩＶ−宿主細胞蛋白質を実質的に含まず、蛋白
   質トータルとして少なくとも５％のｐ２６を含んだ精製
   ＦＩＶ。