JPH02111723A - 二本鎖ｒｎａを含有する医薬組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ウィルスがその宿主域を変更し又は抗ウィル
ス療法もしくは免疫療法に対するその感受性を間接的に
変える過程であるウィルスの逃避（ｙｉｒａｌ　ｅｓｃ
ａｐｅ）の現象から生ずる生物学的結果を防止するため
のｄｓＲＮＡの使用に関する。

〔従来の技術〕

抗原ドリフト（ａｎｔｉｇｅｎｉｒ　ｄｒｉｆｔ）は、
ウィルス粒子のゲノム含有の基本的な変化に基く、ウィ
ルスの構造、例えば内部蛋白質、糖脂質、糖蛋白質等の
変化である。ゲノムは、ヘルペスウィルス・タイプｌ又
はタイプ２等のごとく、ＲＮＡ分子から成るであろう。

変化する宿主細胞域、疾患の状態等はウィルス粒子の所
与の群の組成における不可避的な基本的構造変化である
。

後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の病原体であるヒト
免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）は宿主のＴ−リンパ球のヘ
ルパーサブセットに選択的に感染しそしてそれを破壊し
、これによって深刻な日和見感染及びある種の癌を生じ
させる（１）、単球もまた、ＨＩＶ感染のための主たる
標的であると同定されており、そしてＡＩＤＳに伴う頻
繁な２．性脳疾患の原因となるであろう（２）。種々の
ＨＩＶ単離体の比較によりゲノムの高度な多様性が明ら
かになった。）ＩＴＬＶ　　ｌｌｌ５及びＬＡＶのごと
き単離体は２％未満異り、Ｈａｉｔｉａｎ単離体ＨＴＬ
Ｖ　　ＩＩ［ＦＩＦは非常に大きな差異を示す（３）。

ＨＩＶゲノムのほとんどの可変領域はエンベロブ（ｅｎ
ｖ）遺伝子であり、そしてこの領域の可変性が宿主の免
疫応答を回避するための機構である（４）。しかしなが
ら、この変化及びゲノムの他の部分に生ずる変化はまた
ＨＩＶの多（の変異体に対する抗ウィルス剤の異る効力
の可能性に反映する。従って、有用に予見するためには
、抗−ＨＩＶ薬剤試験は種々のＨＩＶ単離体を含まなけ
ればならない。さらに、潜在的に有用な抗−ＨＩＶ薬は
単球及びヘルパーＴリンパ球に対する活性についてスク
リーニングすることができ、なぜなら、両系統は一般に
ヒトウィルスのための主たる標的として機能し、そして
両者はインビボでの亜急性／慢性感染の病原として役割
を演するからである。ＨＩＶ−２（ＬＡＶ−２とも称す
る）は、過去の中間時点で共通の祖先から分かれた旧Ｖ
−１とおよそわずか６０％の相同性（又は類似性）を有
する。

二本鎖ＲＮＡ　（ｄｓＲＮＡ）は、インターフェロン（
ＩＦＮ）の誘導、２−５Ａシンセターゼのごときある種
のＩＦＮ−誘導酵素の活性化、ナシュラルキラー活性及
び単球活性の増強、並びにβ及びＴ細胞マイトジェン活
性の増強を含む多相遺伝（ｐｒｅｉｏ−ｔｒｏｐｉｃ）
活性を有する強力な生物返答モディファイア゛−である
。確かに、本発明者は、式ｒ（１）ｎ・ｒ（Ｃ＋ｚ−Ｕ
）ｎの合成ミスマツチｄｓＲＮＡ　（アンブリゲン；Ｈ
ＥＭ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ社の商標；ロックビル、メ、リ
ーランド、米国）がインビトロで抗−ＨＩＶ活性を有す
ることを示した。本発明者のヨーロッパ特許出願Ｎ（Ｌ
　Ｏ，２１３，９２１を参照のこと。さらに、アンブリ
ゲン及びアジドチミジン（ＡＺＴ）は類似の感染アッセ
イにおいてＨＩＶに対して相乗的に作用した。

本発明者の係属中の米国特許出願Ｎ１１０７１０２８，
８２３を参照のこと、そこに記載されているように、本
発明者は、ＡＩＤＳ−関連併合症（ＡＲＣ）、リンパ腺
症候群（ＬＡＳ）又はＡＩＤＳを有する１０人の患者、
の臨床状態が、まれな穏和な副作用のみを伴ってアンブ
リゲンにより改善されたことを示した。

ＨＩＶ感染の治療におけるｄｓＲＮＡ及び関連ミスマツ
チｄｓＲＮ＾の十分な潜在的効力を特徴付けるための継
続する努力において、本発明者は先行する研究を拡張す
ることにより、高度に分岐したＨ１■単離体）ＩＴＬＶ
　　ＩＩ［ＲＦ　（５）　、並びにＴ−リンパ芽球様セ
ルライン）（９（６）　、ＭＴＬＶ−１−形質転換Ｔセ
ルラインＭＴ−２（７）及び単球／マクロファージセル
ライン０９３７（８）を含む３種類の追加の標的細胞系
を含めた。これらの研究から、本発明者は、ある状況下
でｄｓＲＮＡがプロトタイプのウィルスと同様にＨＩＶ
のウィルス逃避（ｖｉｒａｌ　ｅｓｃａｐｅ）を防止す
ることができると結論した。おそらくさらに重要なこと
には、本発明者は次のことを決定した。　ｄｓＲＮＡは
動物ウィルスの種々のゲノム変異体から成る環境におい
て、そしてウィルスの逃避を促進する因子、例えばウィ
ルスの複製、そしてそれ故にウィルスの逃避の可能性を
実際に増強する抗体の存在下で、効果的であり続けるこ
とができる。

一般にレトロウィルス、そして特にＨｒＶは宿主により
生産される抗体依存性ウィルス増強（ＡＤＨ）因子を生
じさせる。ＨＩＶ惑染の抗体依存性増強は感染を悪化せ
しめ、そして患者の衰えの速度を加速する。このＡＤＨ
は宿主の免疫系が侵入ウィルスに対して効果的な抗体を
生じさせるのを防止し、そして効果的な治療のために適
切に制御されなければならない。ＡＤＥの存在が病原体
に対して適切であるか又は有効である抗体を動物が生成
するのを防止する場において、本発明者の発明は重要な
価値を有する。なぜなら、ＡＤＥの効果に対して動物を
保護することにより、それは適切なレベルの中和抗体が
生産されるのを可能にするからである。

他のレトロウィルスと同様、ＨＩＶは高い抗原変化及び
ゲノムの不均一性により特徴付けられる。

抗原ドリフト、及びその結果としてのウィルスの高度な
多形変異体が、宿主の免疫防御機構を回避することを可
能にし、そして効果的な異種ワクチンの開発を悪くしそ
して遅延せしめるであろう。

免疫された動物におけるＨＩＶに対する増強因子の生産
はヒトにおけるワクチン注射により惹起され得る抗体の
タイプについて深刻な懸念を生じさせる。予備的な観察
が示すところによれば、幾つかの単離体は他のものより
増強に対して感受性である。これらのウィルスは、ワク
チン調製物から除去されるべき抗体依存性増強のもとに
なるエピトープを同定するために価値があることが明ら
かにされ得る。

ヒト血清の少なくとも２つの成分がヒト免疫不全ウィル
スタイプ１　（ＨＩＶ−１）感染を増強し、そしてＨＩ
Ｖ−１中和抗体活性をマスクする（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ等
、Ｌａｎｃｅｔ　　１９８８年４月９日、７９０頁）。

第１は熱安定性の、旧Ｖ−１に対してユニークな血清型
陽性（ｓｅｒｏｐｏｓｉｔｉｖｅ）血・清であり、そし
てプロティン−Ａクロマトグラフィーにより除去される
。第２は熱不安定性でありそして遍在している。これは
正常血清中に見出され、そして６０″Ｃにて１時間加熱
することにより、又はコプラ毒抗相補的蛋白質による処
理により除去される。さらに、補体成分Ｃ３欠損血清は
不安定な活性に欠け、他方Ｃ１ｑ欠損血清は不安定因子
を含有する。データーが示唆するところによれば、２種
類の成分は抗体、及び補正固定の他の経路である。作用
の機構は補体介在サイトロシス（ｃｙｔｏｌｏｓｉｓ）
又は合胞体（ｓｙｎｃｙ　Ｌｉｕｍ）形成の増加を含ま
ない、活性は、今まで試験された患者の多くにおいて同
定されている。

インビトロにおけるヒト免疫不全ウィルスタイプ１　（
ＨＩＶ−１）感染の抗体依存性増強（ＡＤＥ）が最近記
載されており、そして補体の他の経路の関与又はＦｃ受
容体介在機構を含むことが示されている。補体介在ＡＤ
Ｅは標的細胞の細胞変性効果の促進をもたらし、これは
中和抗体の保護効果を廃止し得る（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ等
、Ｌａｎｃｅｔ　ｉ　：　６９３−６９９゜１９８７　
；　Ｒｏｂｉｎｓｏｎ等、Ｌａｎｃｅｔ　ｉ　：　７９
０−７９５．１９８８）。

この研究はＭＴ−２細胞培養物を用いて次のことを明ら
かにした。すなわち、旧Ｖ−１１染のＡＤＥは、間接免
疫蛍光により検出する場合のＨＩＶ−１抗原の合成、溶
液ハイブリダイゼーションにより測定されるｍＲＮＡの
蓄積、逆転写酵素の放出及び子孫ウィルスの生産を含む
、旧Ｖ−１感染を示す幾つかのパラメーターの促進を惹
起する。すなわち、インビトロ旧ｖ−を感染のＡＤＥは
旧Ｖ−１感染の真正な促進された速度により特徴付けら
れた。

ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ−１）をインビトロで中
和する抗体の存在にもかかわらず、この抗体は、後天性
免疫不全症候群を導き、そして最終的には死を導く免疫
学的結果から感染された固体を保護することに失敗する
。最近、ロビンソン等は、旧ソ−１血清型陽性個体の６
０％以上の血清中の免疫グロブリンの存在を報告し、こ
れは補体の代替継路との組み合わせにおいてより急速な
ウィルス誘導細胞変性効果を導びき得ることを報告した
。

彼等が証明したところによれば、旧Ｖ−１惑染のこの抗
体依存性増強において観察される細胞変性効果（ＣＰＥ
）は、旧Ｖ−１による標的細胞系のより急速な感染の結
果である。ＨＩＶ−１惑染のこのＡＤＥは、旧Ｖ−１特
異的ＲＮＡのより迅速な蓄積並びに検出可能なウィルス
蛋白質のより早い発現及び感染性ウィルス粒子の加速さ
れた生産により表わされる。ＨＩＶ患者の多くがこの抗
体依存性増強を有することが観察されている。抗原ドリ
フト及び／又はＡＤＥもしくは類似の機構を介しての感
染性ウィルス逃避を示す、インフルエンザ、デング熱及
び関連脳炎のごとき他のウィルスの多くが類似の因子を
示す。

免疫蛍光及びウェスタンプロット（デュポン、ウイルミ
ントン、ＤＥ）によりＨＩＶ抗体陽性であることが確認
された匿名提供者からＡＤＥ　（手入源は＃１１０と称
する血清）が得られた。このＡＤＥ血清を６０’Ｃにて
０，５時間熱失活せしめ、次に増殖培地に１．５倍希釈
した後に旧Ｖ−１惑染のＡＤＥについてアッセイした。

血清＃１１０及びヒト補体血清の存在下で対照感染に対
して生存細胞の％の減少により示さ、れるＨＩＶ−１の
細胞変性効果をＡＤＨが促進した。同じ量の旧Ｖ−１及
びｌ：２０ヒト補体血清の存在下での１００％の細胞の
生存に比較して、高い抗体濃度（１：２（ｌ釈）におい
て、ＭＴ−２細胞の生存は２０％未満であった。

ウィルス細胞変性効果のこの増強を１４．８６０の稀釈
まで拡張し、ここではＭＴ−２細胞の生存は３０％低下
した。

位相差顕微鏡観察が示すところによれば、増強血清及び
旧Ｖ−１の存在下での細胞の生存の低下は、巨大細胞形
成の増加を伴った。ＩＩＩＶ−１感染のＡＤＥがＣＰＨ
の促進のみならず、ウィルス抗原及びＲＮＡ抗原、子孫
ウィルスの生産並びに逆転写酵素（ＲＴ）放出を含む旧
ｖ−ｉ感染の他のパラメーターの進行をも促進すること
を本発明者は示した。

）１１Ｖ−１１７）み、ＨＩＶ及びヒト補体血清（１：
２０　）　、ＨＩＶ−１及び増強血清＋１：２０ヒト補
体血清、又はウィルス不含Ｈ９培地及び増強血清＋ｌ：
２０ヒト補体血清の存在下で、ＣＤ４　”セルラインＭ
Ｔ−２からの細胞を培養することにより実験が行われた
。ＣＤ４　’細胞は、Ｔヘルパー細胞のＴ４と称される
胸腺由来リンパ球の特異的サブセットと反応するモノク
ローナル抗体ＣＤ４と反応する（陽性に）細胞である。

チャレンジの１２時間後、細胞を洗浄し、そして血清又
はウィルスの添加を伴わない培養培地中に再懸濁した。

感染後２４　、４８゜６０及び７０時間後に細胞懸濁液
を取り出した。培養上清を感染性ウィルス及びＲＴ活性
についてアッセイし、他方細胞をＨＩＶ−１特異的抗原
及び旧シー１特異的ＲＮＡについてアッセイした。

ウィルス抗原陽性細胞の蓄積の速度は増強血清の存在下
で旧Ｖ−１によりチャレンジされた細胞において増加し
た６例えば、チャレンジ後４８時間で９５％のＭＴ−２
細胞が間接免疫蛍光によりウィルス抗原を示し、これに
対し、それぞれ旧Ｖ−１及び補体又は旧Ｖ−１のみによ
りチャレンジされた細胞のわずかに１５％及び１０％が
ウィルス抗原を示した。

模倣感染細胞は旧Ｖ−１抗原を発現しなかった。従って
、旧Ｖ−１感染のＡＤＨは検出可能なウィルス抗原合成
への時間の短縮により特徴付けられた。

ＨＩＶ−１のみ、又はＨＩＶ−１及び補体に暴露された
細胞におけるよりも増加する抗体に暴露された細胞にお
いて一層早く、旧Ｖ−１特異的ＲＮＡの増加が起こるこ
とを、本発明者は観察した。前者の２つの例について特
異的ＲＮＡ及びＩＩ　Ｉ　Ｖ−１の最大量は、増加する
抗体の存在下でＨＩＶ−１により感染された対応する細
胞程高くはなかった。例えば、６０時間で、ＡＤＥ培養
における標的細胞からのＲＮＡにハイブリダイズするプ
ローブのｃｐｍは３６３１であるのに対して、旧Ｖ−１
のみでは３４７であり、そして旧Ｖ−１及び補体培養に
ついては３７４であった。なお、ＡＤＥ培養における最
大ＣＰＥは６０時間後に起こり、７２時間の時点での細
胞数は他の培養又は他の時間におけるよりも小さかった
。生存細胞数の減少は、ＡＤＨ培養において６０時間に
比べて７２時間後の旧Ｖ−Ｉ　ＲＮＡの減少により反映
された。

増強血清が旧Ｖ−１特異的ＲＮＡ及び抗原をより早く生
じさせるのであれば、増加した感染性ウィルスの生成も
一層早くなると予想されよう。

ＨＩＶ−１のみ、旧Ｖ−１と補体、及び補体を伴う増強
血清と旧Ｖ−１の存在下で感染された細胞の培養上清か
ら得られる感染性ウィルスの収量を評価した。

ウィルスチャレンジの後２４時間から７４時間の終点ま
で、感染性ウィルスの収量は、増強血清＋補体及びＨＩ
Ｖ−１の存在下でチャレンジされた培養物中で多数倍多
かった。７２時間目において、ＡＤＨ培養から得られた
−当りの感染性粒子は１．３Ｘ１０６であるのに対して
、ＩＩＩＶ−１のみでは１．２ＸｌＯ’でありそして旧
Ｖ−１＋補体培養からは１．６Ｘ１０’であった。これ
らのデーターが示すところによれば、ＡＤＥは標的細胞
からの感染性ウィルスの出現の加速及び増加を生じさせ
た。

ウィルス生産の最終評価として、培養上清を感染細胞か
ら放出される逆転写酵素についてアッセイした。再び、
ＡＤＨ培養は感染されたＭＴ−２細胞からのＲＴ活性の
最も早い放出を示した。検出可能なＲＴ活性はウィルス
チャレンジ後２４時間という早期に存在し、最大はアッ
セイの終点である７２時間目に達成された。７２時間目
において、ＡＤＥ培養からの上清中のＲＴ活性は３．２
Ｘ１０’ｃｐｓ／ｄであり、他方旧Ｖ−１のみに暴露さ
れた細胞はわずかに８．８　Ｘ　１０’ｃｐ−／　ｔｄ
を生じさせた。

ＨＩＶ−１及び補体に暴露された細胞は後者に匹敵し９
、６　Ｘ　１０’ｃｐａ＋／　ｒｔｒｌを生じせしめた
。

補体血清のみがインビトロで旧ｖ−ｔピリオンを活性化
する能力を有していたことが注目される。

本発明者は、正常ヒト補体血清の存在下での旧Ｖ−１特
異的ＣＰＥへの時間のわずかな短縮を常に観察した。こ
の知見をデーターが支持している。なぜなら、旧ｖ−１
及び補正に暴露されたＭＴ−２細胞は旧Ｖ−１のみに暴
露された細胞に比べて、旧Ｖ−１抗原の合成、ＲＴＴａ
２及び感染性粒子の合成のわずかな促進を示したからで
ある。７２時間目において、旧Ｖ−１のみによりチャレ
ンジされた細胞はＨＩＶ−１及び補体に暴露された細胞
に比べて高レベルのＲＮＡを示したが、より早い時点に
おいて旧Ｖ−１特異的ＲＮＡについての同じ知見が観察
された。これは、旧ｖ−１及び補体血清に暴露された細
胞がその時点で溶解を始め、他方旧Ｖ−ｔのみに暴露さ
れた細胞はそうでなかったからである。

ウィルスのチャレンジの１２時間後にウィルス、抗体及
び補体が除去され、そして細胞が洗浄されるから、増強
抗体及び補体がウィルスに対して有するすべての効果は
ＭＴ−２細胞へのウィルスの暴露の最初の１２時間に生
じなければならない。増強抗体を伴わないＨＩＶ感染培
養物の両者（すなわち、旧Ｖ−１のみ、及び旧Ｖ−１及
び補体血清）は１１１Ｖ−１抗原について１００％陽性
になったとしても、これらは決して、増強抗体の存在下
でウィルスに暴露されたＭＴ−２細胞から放出された感
染性ウィルス又はＲＴ活性のログ内には入らない。

特定の理論に拘束されることを望まないが、これらのデ
ーターは、ＡＤＥが感染細胞での検出可能な抗原の発現
速度を増加するのみならず、感染された細胞での旧Ｖ−
ｔゲノム又はｍＲＮＡのコピーを増加せしめることがで
きることを示唆していると解釈することができる。これ
は各？１Ｔ−２細胞に感染するピリオンの数の増加によ
って、又は増強血清の存在下でのウィルスの転写効率の
増加により起こるかもしれない。後者ではない檄である
。なぜなら、旧Ｖ−１感染のＡＤＥを付与する抗体はウ
ィルスｅｎｖ遺伝子生成物ｇｐ４１及びｇｐ１２０に対
して向けられることを予備的データーが示唆するからで
ある。

本発明の詳細な検討（後記）において、本発明者はヒト
レトロウィルスの種々の抗原単離体に対するｄｓＲＮＡ
の有効性を示す。本発明者はまた、ウィルス感染及びウ
ィルス逃避の前記の抗体依存性補体介在エンハンサ−に
対向して作用するｄｓＲＮＡの能力を示す。

ＨＩ　Ｖに対するワクチンを開発する最近の試みは成功
していない。今までチンパンジー（動物モデル）におい
て試験されたすべての旧Ｖ−１候補ワクチンはそれに続
く旧Ｖ−１チャレンジからの保護を与えることに失敗し
ている。インビトロでの旧Ｖ−１惑染の抗体依存性増強
（ＡＤＥ）を記載する最近の報告はチンパンジーにおけ
るワクチンの失敗についての当悪させる可能性を提供し
ている。

記載されたように、ＡＤＥについてのＭＴ−２細胞アツ
セイを用いて、補体依存性増強抗体が旧Ｖ−１により感
染されたチンパンジーにより生産されることを示してい
る。さらに、ＨＩＶ抗体陰性の新鮮なチンパンジー血清
はＩ（ＩＶ−１惑染を増強する。データーはさらに、高
い旧Ｖ−１中和活性を含有するヒトＩｇＧ画分によるチ
ンパンジーの受動免疫の失敗を説明する補体介在ＡＤＥ
機構を示唆している。

１−型ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ−１）により感染
された個体の多くが、他の補体経路と共にＭＴ−２標的
細胞の旧ｖ−１感染をインビトロで促進する抗体を示す
。抗体依存性増強（ＡＤＨ）として知られるこの現象は
他のウィルス感染過程において記載されており（例えば
、Ｐｏｒｔｅｒｆｉｅｌｄ、Ａｄｖ、ＶｉｒｕｓＲｅｓ
、、Ｖｏｌ　３１，３３５頁、１９８６　、及びＨａｌ
ｓｔｅａｄ、５ｃｉｅｎｃｅ。

Ｖｏｌ、２３９．４７６頁、１９８８を参照のこと）、
そして最近末梢血リンパ球における旧Ｖ−１感染の補体
依存性ＡＤＥについて確認され、そして旧Ｖ−Ｉ　ＡＤ
Ｅの見かけ上のＦｃ受容体依存性機構を包含するように
拡張された。Ｆｃ受容体依存性機構は、ＨＩＶ−１に感
染した個体から得られた血清においてのみならず、モル
モット及びチンパンジーから得られた８１シー１誘導抗
血清においても示された。ワクチンの開発にとって特に
重要なことは、補体依存性ＡＤＥ力（同じ血清内及び非
相同ヒト血清間での中和抗体の保護効果を低下せしめ又
は完全に廃止し得るという観察である。中和抗体の存在
にもかかわらず、チンパンジーを感染から保護すること
に候捕旧ｖ−１エンベロープワクチンが失敗する（Ｂｅ
ｒｍａｎ、Ｐｒｏ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｊ、１Ｊ
ＳＡ＋νｏ１．８５．５２００頁、１９８８）ことは、
中和抗体の存在下でＡＤＥを促進する抗体の同時的誘導
に対して二次的である。同様に、高力価ヒト中和免疫グ
ロブリンの受動移行による旧ｖ−１感染からのチンパン
ジーの保護の失敗はＡＤＥの結果である。ＨＩＶ−１感
染性研究のために使用し得る唯一の代用動物はチンパン
ジーであるので、チンパンジーにおける補体依存ＡＤＥ
の証明はＡＤＥを誘導する能力について候補ワクチンを
評価するために必須である。本発明者はチンパンジーに
おけるＡＤＨの１＋　１　Ｖ−１誘導を用いる発明によ
り研究を行い、そして血清陰性及び血清陽性対象の両者
による応答の変更におけるチンパンジ一対ヒト補体の比
較的役割を示した。

ヒトワクチン要求を予測するモデルとしてチンパンジー
を用いた。

抗体陰性チンパンジー血清が確かにＨＩＶ−１感染の増
強を惹起し、それによってチンパンジー血清が補体源と
して使用された場合に観察される高いバックグラウンド
ＣＰＥを導くか否かを研究するため、本発明者は新鮮な
抗体陰性チンパンジー血清の２倍稀釈を行った。ヒト補
体血清が旧ｖ−ｉの感染性をわずかに増強することがで
きるが、しかしわずか１：１６までであり、従って１：
２０の稀釈においては旧シー１に対する抗体の追加の存
在なくしては感染の増強は起こり得ないことを、本発明
者は示した。対照チンパンジーＸ９５からの血清は１：
２５６稀釈までウィルス誘導細胞溶解の速度の上昇を惹
起したが、チンパンジーＸ３５からの血清は１：５１２
より大きな稀釈まで感染を増強することができた。抗体
陰性チンパンジー血清Ｘ３５が補体介在機構を介して旧
Ｖ−１惑染を増強しているか否かを決定するため、本発
明者は、チンパンジー血清の増強活性を廃棄するコブラ
毒抗補体性蛋白質の能力を試験した。チンパンジー血清
とコブラ毒因子との１時間のインキュベーションが血清
Ｘ３５を完全に失活せしめること、すなわちヒト血清に
よる旧ｖ−を感染のＡＤＥに類似する態様でＨＩＶ−１
惑染の増強をブロックすることを、本発明者は見出した
。従ってその後のすべての研究は、補体源と、して６０
°Ｃにて１時間熱失活されたチンパンジー血清及び新鮮
なヒト血清を用いた。ＣＰＥの増強がＩＩＶ−１惑染の
速度の上昇と関連するか否かを決定するため、逆転写酵
素（ＲＴ）の蓄積及び免疫蛍光（ＩＦＡ）に対するチン
パンジー補体血清の効果を決定した。チンパンジー補体
血清、及びチンパンジー補体血清＋チンパンジーＸ９１
からの血清が、ウィルスチャレンジ後１２時間において
、ＲＴ活性及びＩＦＡ陽性細胞のパーセントを非常に上
昇せしめた。チンパンジーＸ９１からの血清単独ではこ
れらのパラメーターを上昇せしめなかった。チンパンジ
ー補体血清＋熱不活性化血清Ｘ９１はチンパンジー補体
血清単独に比べて低下したＲＴ活性を示した。Ｘ９１は
この濃度（１：１００）で中和するからである。ヒト補
体血清単独はＩＦＡ陽性細胞の％及びＲＴ活性をわずか
に上昇せしめたが、この上昇はチンパンジーＸ９１から
の熱不活性化血清の添加により大きく増強された。

従って、チンパンジー補体血清、並びにチンパンジー抗
体及びヒト補体血清によるＨＩＶ−１感染の増強はＣＰ
Ｅの増強と関連した。

〔図面の説明〕

第１図は１連の６個のグラフから成り、３個は逆転写酵
素活性を示しそして３個は免疫蛍光を示し、単球セルラ
インＵ９３７におけるＨＩＶ単離体ＨＴＬＶ　　ｌｌｌ
５及びＩＩＴＬＶ　　ｍａｒに対するプロトタイプｄｓ
ＲＮＡであるｒＩｎ−ｒ（Ｃｔｚ、Ｕ）ｎの抗ウィルス
活性を証明するものである。この試験においては、ＩＪ
９３７ｍ胞の培養物をｒＩｎ−ｒ（Ｃｔｚ、１１）ｎ（
５０ｓｇ／　ｍＱ）の存在下又は非存在下で１８時間前
インキュベートし、ソシテ次ニＨＴＬＶ　　Ｉ［！＋又
はＨＴＬＶ　　ｍ　ＩＩＦによるチャレンジを行った。

ウィルス源として使用したセルラインをカッコ内に示す
。示されたインキュベーションの日において間接免疫蛍
光及び逆転写酵素アッセイのために同盟の培養物を収得
した。

これらのグラフにおいて、黒丸はｒｌｎ−ｒ（Ｃｔｚ、
ＩＪ）ｎによるものであり、そして白丸はｒＩｎ・ｒ（
Ｃ＋ｚ＋Ｕ）ｎを用いない場合である。

第２図は、ｒｌｎ−ｒ（Ｃｔｚ、Ｕ）ｎ抗−ＨＩＶ活性
（％）に対する種々の前インキュベーション時間（時）
の効果を示す。２５ＣＴ１培養フラスコ中ＭＴ−２細胞
（５Ｘ１０’細胞／ｄ）の培養物を、示された種々の時
間にわたってｒｌｎ　・ｒ（Ｃ＋ｚ＋υ）ｎ　（５０／
／ｇ／　ｍｌ　）を伴って、又は伴わないで前インキュ
ベートした。

各培養物の半分からの細胞をＲＰ旧−１６４０により洗
浄してｒｌｎ−ｒ（Ｃｔｚ、Ｌｌ）ｎを除去し、そして
ｒｌｎ−ｒ（Ｃｔｚ、ＩＩ）ｎを含まない等容量の増殖
培地に！Ｑ’（Ｑした。次に、各セットの培養物からの
細胞に）ＩＴＬＶ　　ｍ　ｇ　（１１９）をｍ、ｏ、　
ｉ、　１〜５で、９６−ウェルのミクロタイタープレー
ト中でチャレンジした。

４０のインキュベージジンの後、プレートを細胞変性効
果についてアッセイした。このグラフの白丸においては
、第１図と同様、ｒＩｎ−ｒ（Ｃ＋ｚ＋口）ｎが連続し
て存在せず、黒丸はｒｒｎ−ｒ（Ｃ＋□ｔ　Ｕ　）　ｎ
が前インキュベーションの後除去されたことを示してい
る。

第３図は、ｄｓＲＮＡＯ量とウィルスＣＰＥに対する保
護の関係をプロットしたグラフであって、ｄｓＲＮＡが
、ゲノム的に又は抗原的に相互にドリフトした動物ウィ
ルスの増幅及びその結果としてのＣＰＥをいかに阻害す
るかを示す。アッセイ条件は第１図及び第２図に関して
記載した通りである。

これらのデーグーによって示されるように、ｄｓＲＮＡ
は約６０ｎ／ｒｔｄｌにおいて旧Ｖ−１からのＣＰＥに
対し９０％以上保護し、そして同じ薬物レベルにおいて
旧Ｖ−２に対して約７５〜８０％保護する。

第４図はまた、ｄｓＲＮＡの量についてウィルスＣＰＥ
に対する保護の％を比較している。この研究において、
ｄｓＲＮＡが抗体依存性エンハンサ−（ＡＤＥ）の存在
下においてさえウィルス逃避を阻害することが示される
。これらのデーターが示すところによれば、これらの異
る実験条件下、すなわち（ａ）ヒト増強活性＋補体の存
在下（四角で示す）？　　（ｂ）ヒト増強活性を伴わな
い補体の存在下（黒丸で示す）；及び（ｃ）補体及びヒ
ト増強活性の両者の非存在下で、ｄｓＲＮＡがウィルス
誘導ＣＰＥに対して保護する。

これらの図のいずれにお、Ｓでも、使用したｄｓＲＮＡ
はｒｌｎ−ｒ（Ｃｔｚ、Ｕ）ｎである。

〔本発明の詳細な検討〕

本発明は、抗原ドリフト〔ウィルス粒子構造の再構成（
ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎ　ｔ）によって証明される〕
及びゲノム再構成（ｇｅｎｏｍｉｃ　ｒｅａｒｒａｎｇ
ｅＩＩＩｅｎｔ）の両者に対して二次的であるウィルス
−誘導疾患に対してウィルス感染に感受性のヒトを含む
動物を保護する方法を含む、保護されるべき動物、又は
保護されるべき動物から単離された細胞が、ウィルス粒
子構造中の分子再構成に対して二次的であるウィルス逃
避を防止し又は少なくとも実質的に最小にするｄｓＲＮ
Ａに暴露される。保護の第二の段階において、ｄｓＲＮ
Ａは、ゲノム的及び／又は抗原的再構成（ｒｅａｒｒａ
ｎｇｅａ＋ｅｎ　ｔ）により逃避するウィルス粒子の組
織病理を妨害し又は改善する。保護の第三の段階におい
て、ｄｓＲＮＡはＡＤＥ因子等の効果を妨害する能力に
よる効果的な中和抗体生産のための環境を与える。粒子
の分子再構成所定の限界に維持しながらウィルス粒子構
造の分子再構成を固定しそして単離する方法も記載され
る。

ｒ（Ｉ）ｎ−ｒ（Ｃ＋ｚ、Ｕ）ｎ形の二本鎖ＲＮＡ　（
アンプリヂン）は、非常に類似するＨＩＶ単離体ｔｌＴ
ＬＶ　−■１及びＬＡＶ（９）による感染のための標的
としてＣＥＭ及びＣ３細胞を用いて、プロトタイプ慢性
ヒト疾患、すなわちヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）に
対して活性であることが示されており、そして本発明者
のヨーロッパ特許出願ｋ　Ｏ，２１３，９２１の対象で
ある。遺伝的に非常に異るＨＩＶ単離体ＨＴＬＶ　　ｍ
ｖｉｔ、　２種Ｒｔｖ追加の標的Ｔ−細胞系Ｈ９及びＭ
Ｔ−２、並びに単球／マクロファージセルラインｕ９３
７を用いて、アンプリゲンの抗−ＨＩＶ活性の範囲が本
発明者のこの研究において試験される。

間接免疫蛍光、逆転写酵素活性及び活性な色素の取り込
みにより判断する場合、ｄｓＲＮ＾は、ｕ９３７細胞中
でＨＴＬＶ　　ＩＩ［ｍに対して活性であるのに加えて
、Ｈ９，ＭＴ−２，Ｃ３及びｕ９３７中のＨＴＬＶ　　
ｎ１ｍｔニ対しても活性である。最大活性のためには、
細胞とアンプリヂンとの少なくとも１時間の前インキュ
ベーションが必要である。これは典型的な６０ｋｇの個
体について約５０〜１０００■のｄｓＲＮＡの静脈内投
与により容易に達成することができる。これらの結果が
示すところによれば、ｄｓＲＮＡの潜在的な臨床的効力
は、ＨＩＶ、インフルエンザ、デング熱等の種々の動物
ウィルスの非常に変化しやすい性質又は宿主域により限
定されないであろう。これらの性質は、米国及びその他
の国において今日まで開発されたすべての他の抗ウィル
ス薬の用途を限定してきた。“非常に変化しやすい性質
′”という表現は、確立された免疫監視及び調節機構を
回避する抗原／ゲノムドリフト及び／又はＡＤＥのごと
き因子の生産を含む機能的用語である。

従って、本発明者は今やｄｓＲＮＡの妥当な使用により
ウィルス逃避の一般的現象を回避することができるとい
う予想外の広い用途を有する現象を発見した。このウィ
ルス逃避においては、変異もしくは選択のごとき過程又
は抗体依存性増強（ＡＤＥ）因子により、ウィルスが経
時的にその宿主域を変更しそして／又は変化する性質を
発現し、次にこれが所与のもしくは特定の抗ウィルス及
び／又は免疫増強療法に対するその感受性を変え、そし
て／又は生物活性中和抗体の出現に対して保護する。本
発明は、もし生産されればこの様な因子の効果を中和す
るか、又は抗体依存性増強因子の宿主による生産を調節
することを含む。

後に詳細に記載する実験は、亜急性／慢性疾患の後にそ
して“抗原ドリフト”と関連するウィルスに対するｄｓ
ＲＮＡの活性にウィルスゲノム変化又は宿主細胞域が影
響するか否かを取り扱う。これらはヒトレトロウィルス
を使用する場合に重要な事項である。なぜなら、これら
は実質的にすべてのヒトウィルスの潜在的に最大のゲノ
ム変化を示し、そしてこれらはＴ−レルパーリンパ球に
加えて単球／マクロファージ系の細胞に感染して、ウィ
ルスを無限に撒き散らすことができる慢性的巣（を域）
を提供するからである。従って、このプロトトロープレ
トロウィルス感染における効果的な療法的介入は、幾分
低い抗原ドリフト又は変異的能力を有する他の病原ウィ
ルス及び細胞内病原体への広い適用を意味するであろう
。

実現しているか又は提案されている他の治療形態とは異
り、ＨＩＶゲノム変化はｄｓＲＮＡの抗ウィルス活性に
対する大きな障害ではない様である。

なぜなら、これは異る単離体ＨＴＬＶ　　ＩＩｓ　　（
これは実際は少なくとも２種類の類似の変異体の混合物
である）及び）ＩＴＬＶ　　ｍａｙに対して活性である
からであり、これを支持するデーターに第１図〜第３図
に与えられており、後に検討する。本発明者は、ｄｓＲ
ＮＡがフレンチ（Ｆｒｅｎｃｈ）単離体ＬＡＶに対して
活性であることを示す。さらに、このものは２種類の非
常に異るセルラインＨ９及びＩＪ９３７　（第１図）に
対して効果的であり、他方本発明者はまた、このものが
ＣＥＭ及びＣ３細胞中で生産されるＨＴＬＶ■８並びに
Ｈ９、ＣＥＭ及びＣ３細胞中で生産されるＬＡＶに対し
て特に効果的であることを見出した。これらの後者の結
果は、ｄｓＲＮＡの抗−Ｈ１■活性に対する細胞タイプ
の変化、すなわち蛋白質のグリコジル化のごとき細胞特
異的変化の最も驚（べき欠落を示す。

本発明者はまた、３種類の異るヘルパーニー細胞系（Ｃ
ａ、ＭＴ−２及びＨ９）並びに単球／マクロファージセ
ルライン（Ｕ９３７）におけるｄｓＲＮＡの有効性を試
験した。前記報告したＣａ及びＣＭＥ細胞中のＬＡＶ並
びにＣ３細胞中のＨＴＬＶ　　ｍｙｒに対するｄｓＲＮ
Ａの活性に加えて、本発明者はこのものがＭＴ−２、Ｈ
９及びＵ９３７中（７）ＨＴＬＶ　　ｍａｔ並びニ１１
９３７細胞中のＨＴＬＶ　　ｍｍに対しても有効である
ことを見出した。やはり第１表及び第１図を参照のこと
。

従って、あらゆる動物ウィルスの宿主域範囲はｄｓＲＮ
Ａの抗−ウィルス活性に対して障害ではないようである
。単球／マクロファージ系の細胞かへ１０３−関連脳疾
患の原因であるという最近の証拠に輝らして、Ｕ９３７
細胞がｄｓＲＮＡの抗−ＨＩＶ活性を担当するという知
見は重要である。

この発明の他の観点は、ｄｓＲＮＡの抗ウィルス活性に
対する種々の前インキュベーション時間の効果である。

すでに、本発明者は、活性が検出され得る前にＩＦＮが
合成され、分泌されそして培地中に蓄積される必要があ
ることを予期して１８〜２４時間の前インキュベーショ
ンを許容した。゛しかしながら、本発明者は今や、次の
ことを報告する。

十分な活性はＭＴ−２細胞において短時間（６０分間以
下）のみ観察されたが、部分的活性はウィルスチャレン
ジ前５分間という短い前インキュベーションをもって観
察された。第２図を参照のこと。

“ミスマツチｄｓＲＮＡ”とは、相手方鎖との間の水素
結合（塩基重層）が比較的無傷であり、すなわち、連続
する２９の塩基対ごとに平均−個未満の塩基対により中
断されているｄｓＲＮＡを意味する。

“ミスマツチｄｓＲＮ＾”は従ってこのように理解され
るべきである。

ｄｓＲＮＡはポリイノシン酸とポリシチジル酸との複合
体であって一定比率のウラシル塩基又はグアニジン塩基
、例えばこれらの５塩基中１塩基〜３０塩基中１塩基を
含有するもの（ｐｏｌｙ！　’　（Ｃ４−４９Ｘ＞Ｕ又
はＧ））であることができる。

ｄｓＲＮＡは一般式ｒＩｎ　・（Ｃ１１−＋４＋Ｕ）ｎ
　％又はｒｌｎ・（Ｃｔｚ、Ｕ）ｎであることができる
。ｎの値は４〜２９である。ｄｓＲＮＡの他の適当な例
は下に記載する。

本発明において使用するのに好ましいミスマツチｄｓＲ
ＮＡは、ポリ（Ｃｎ、Ｇ）（式中ｎは４〜２９の値を有
する整数である）から選択されるコポリヌクレオチドに
基礎を置き、そしてポリリボシチジル酸ト（ｒＣｎ）鎖
にそって不対塩基（ウラシル又はグアニジン）を導入し
てｒＩｎ　ＨｒＣｎを変形することにより形成されたポ
リリボイノシン酸とポリリボシチジル酸との複合体のミ
スマツチ類似体である。あるいは、ｄｓＲＮＡは、ポリ
リボイノシン酸（ｒｌｎ）を例えば２′−〇−メチルリ
ボシル残基を含めることによって変形してｐｏｌｙ（１
）・ｐｏｌｙ（ｃ）から誘導することができる。ｒｌｎ
−ｒｃｎのこれらのミスマツチ類似体は、その好ましい
ものは一般式ｒｌｎ−ｒ（Ｃ１１−＋ｎ＋Ｕ）ｆｌ及び
ｒＩｎ　・ｒ（Ｃｇｚ、Ｇ）ｎであり、Ｃａｒｔｅｒ及
びＴｓ’ｏにより米国特許阻４．１３０．６４１及び隘
４．０２４．２２２に記載されている。

そこに記載されているｄｓＲＮＡは一般にこの発明に従
って使用するために適当である。

好ましいミスマツチｄｓＲＮ＾、すなわちｒｌｎ　・（
Ｃｔｚ、１１）ｎにおいて、６〜１２塩基追、すなわち
ＲＮＡヘリックスの０．５〜１回転、の中断されない−
続きからなる領域は、天然ウィルス経路を構成する酵素
の必須の細胞内コーファクターとして、リンホカインの
放出を生じさせるバイオトリツガ−（ｂｉｏｔｒｉｇｇ
ｅｒ）としての両方の作用を有する。ウラシル残基から
成るミスマツチ領域はポリピリミジン鎖中に規則的に挿
入され、ｄｓＲＮＡの加水分解を加速しそして毒性を回
避する。

この発明において使用されるミスマツチｄｓＲＮＡの他
の例には次のものが含まれる。

ｐｏｌｙ（１）　・ｐｏ　ｙ（Ｃｎ、Ｕ）ｐｏ　ｙ（１
）　・ｐｏ　ｙ（Ｃｔ、Ｕ）ｐｏ　ｙ（Ｉ）　・Ｉ）Ｏ
Ｖ（Ｃｔ３．０）ｐｏｌｙ（Ｉ）　Ｈｐｏｌｙ（Ｃｇｚ
、Ｕ）ｐｏ　ｙ（Ｉ）　・ｐｏ　ｙ（Ｃｔｏ、Ｇ）ｐｏ
　ｙ（１）　・ｐｏ　ｙ（Ｃｇｚ、Ｇ）及びｐｏ　ｙ（
１）　・ｐｏ　ｙ（Ｃｐ）２３　Ｇ＞ｐ次の研究は、抗
原ドリフト及びゲノムドリフト並びにＡＤＥに対して保
護するｄｓＲＮＡの能力、並びにその結果としての動物
ウィルスの宿主細胞域の性質を記載する。おそらく最も
多く変化する宿主細胞域を有するＨＩＶをこの研究のた
めのプロトタイプウィルスとして選択した。下記の材料
及び方法を使用した。

Ｌ　　Ｕ’）　４　）ｋ’Ａ　　８９　、　ＭＴ−２、
０９３７、Ｈ９／ＨＴＬＶ１１Ｌ　、　Ｈ９／ＨＴＬＶ
　Ｉ［Ｉａｒ　、　ＩＪ９３７／ｆｌＴＬＶ　’Ｊｉｍ
　、及び！ＩＴＬＶ−１１−形質転換ＴセルラインＣ３
を、１６％の熱不活性化ウシ胎児血清及び５０■／ｄの
ゲンタマイシンを含有するｌ？ＰＭＩ−１６４０中で３
７℃にて増殖せしめそして維持した。）ＩＴＬＶ　　ｌ
ｌｌ５及びＨＴＬＶ　　ｍａｙ（Ｄｍ製物をＨ９／ＨＴ
ＬＶ−ＩＩｌｌ　　、０９３７／ＨＴＬシー■１、又は
Ｈ９／ＨＴＬＶ　　Ｉ［ＩＩＦ（Ｄ条件化培養液から得
た。旧Ｖ−２（ＬＡＶ−２とも称される）は最近の医学
文献によく記載されている。低速遠心及び０．４５ｎ濾
過により条件下培養液から細胞を除去した。２日ごとに
培地を取り替え、そして細胞密度を低下せしめて細胞の
連続的な指数的増加を可能にした。

インビトロ感　ア・・セイ　感染アッセイは２５ｃｄフ
ラスコ又は９６−ウェルミクロタイタープレートのいず
れかで行った。フラスコ培養での感染アッセイのため、
標的細胞にＨＴＬＶ　　ｍｕ又はＨＴＬνｍ　０を１〜
５の多重感染度（ａ＋、ｏ、　ｉ、）においてチャレン
ジした。ウィルスを３時間吸収され、そして次にＲＰＭ
Ｉ−１６４０で洗浄することにより除去した。

次に、培養物を前記のようにｄｓＲＮＡを含むか又は含
まない２０ｍｆｔの新鮮な増殖培地中でインキュベート
した。２日ごとに培地を取り替え、そして細胞密度を同
様に低下せしめた。間接免疫蛍光（ＩＩＦ）、逆転写酵
素（ＲＴ）活性及び活性色素取り込みのためのサンプル
をこれらの時点で得た。培養液中のＲＴ活性は、鋳型プ
ライマーとしてのｐｏｌｙ（Ａ）　・（ｄＴ）　＋Ｓ、
及び反応当り２５μＣ１の〔メチル−’　Ｈ）　ｄＴＴ
Ｐ　（８０，ＩＣｉ　／　ＩＩｌｗｏｎ　）を用いて決
定した。Ｆｉｎｔｅｒのニュートラルレッドを用いる活
性色素の取り込みは細胞変性効果を示すものとして使用
した。

ミクロタイター感染アッセイは９６−ウェルプレート中
で行った。要約すれば、ＭＴ−２細胞を２×１０’細胞
／　０．２　ｍｌ　／ウェルの密度で接種し、そしてＨ
ＩＶにより１〜５のｍ、ｏ、ｉ、において（ウェル当り
２〜１０　Ｘ　１０’の８染性粒子を含有する条件化Ｈ
９／　）ＩＴＬＶ　−Ｉ［１ｍ培養液５０Ｉ）チャレン
ジした。

プレートを、空気中５％ＣＯ７によりフラッシェされた
モジュールインキュベーター室中でインキュベートし、
そして４日後に細胞変性効果について測定した。細胞変
性効果をポリーＬ−リジン付着細胞の活性色素にニュー
トラルレッド）により定量した。保護（％）を、非感染
（細胞対照）ウェルと感染Ｆ（ウィルス対照）ウェルと
の間のＡ　５４゜値の差に対する％として定義する。感
染性ウィルスの力価は、９６−ウェルプレート中ＭＴ−
２細胞上での終点力価（ｅｎｄｐｏｉｎｔ　＋ｍ１ｃｒ
ｏｔｉｔｒａｔｉｏｎ）により得れる５０％組織培養惑
染感染ＩＣＩＤ、。）から決定した。

持来　Ｃ３，？ＩＴ−２及びＨ９標的細胞における典型
的なｄｓＲＮＡの抗ウィルス活性を第１表に示す。

Ｃ３及びＭＴ−２細胞におけるウィルスチャレンジの４
日後、並びにＨ９細胞におけるウィルスチャレンジの６
日後において、ｄｓＲＮ＾の非存在下ではすべての細胞
が旧Ｖｐ２４抗原を発現している。これは培養液中の高
レベルのＲＴ活性及び生存細胞の劇的な減少と関連した
。これに対して、ｄｓＲＮ＾の存在下では、非常に少数
の細胞が旧Ｖ９２４発現について陽性であり、ＲＴ活性
レベルは低いか又は検出不能であり、そして細胞変性効
果の有意な徴候は存在しなかった。

卯ユ」−一表 アンプリゲンの抗−１１ＴＬＶ　　Ｉ［ｌＲＦ活性＊細
胞を、ウィルスチャレンジの前１８時間にわたりアンプ
リゲン（５０ａｖ／ｄ）の存在下又は非存在下で前イン
キュベートした。ウィルスチャレンジに続き、アンプリ
ゲンと共に前インキュベートされた細胞は増殖培地中で
アンブリゲンと共にインキュベーションを続けた。

１１Ｌは強い細胞溶解を示す。

Ｕ９３７細胞中ＨＩＶ単離体１（ＴＬＶ　　Ｉ［［ｌ及
びＩＩＴＬＶ　−■□に対するｄｓＲＮＡの抗ウィルス
活性を第１図に示す。ＨＩＶによるＵ９３７細胞の感染
はＣ３、ＭＴ−２及びＨ９細胞におけるより非常にゆっ
くりと進行する。従って、ＩＩＦ及びＲＴ活性のサンプ
ルはインキュベーションの６日、８日、１０日及び１２
日後に得た。さらに、ＨＩＶ−誘導細胞変性効果はＵ９
３７細胞において穏和であり、従ワて、感染の決定因子
として活、性色素の取り込みは使用しなかった。ｄｓＲ
ＮＡの非存在下で、Ｈ９細胞中で生産された）ＩＴＬＶ
　　ｕｌｍについては１２時間後、旧νｐ２４発現につ
いてＩＦＦ陽性であった。さらに、ｄｓＲＮＡの非存在
下でＨＩＶｐ２４の発現はＲＴ活性の劇的な上昇と平行
した。　ＨＴＬＶ−Ｉ［１１（ｕ９３７）又はＨＴＬＶ
　　ＩＩＩ　ＩＩＦ（Ｈ９）により感染されたυ９３７
培養物中に１０日後に生ずるＲＴ活性の低下は、感染の
初期に観察される穏和な細胞変性効果の結果であった。

全く対照的に、ｄｓＲＮＡの存在は感染からの有意な保
護をもたらした。これは、ＨＴＬＶ　　ＩＩＩ　ｍ　０
１９）又はＨＴＬＶ　　ｍ　ａｙ（Ｈ９）によりチャレ
ンジされた細胞の５％未満、及びＨＴＬシーＩＩ１．　
（０９３７）によりチャレンジされた細胞の２０％未満
が１ｌＩＶｐ２４抗原発現について陽性であるインキュ
ベーションの１２日後に明らかであった。さらに、ｄｓ
ＲＮＡの存在下で感染されたすべての培養物においてＲ
Ｔ活性は非常に低下しており又は検出不能であった。本
発明者は他のヒトレトロウィルスを用いて類偵の実験を
行い、そして同じ結論を得た。さらに、他のＲＮＡを用
いての結果は、試験された投与量範囲での感受性の現象
の普遍性及びウィルス粒子自体の抗原量の独立性を示し
た。

最大抗ウィルス活性を達成するために細胞がｄｓＲＮＡ
と共に前インキュベーションされるべき最短時間を決定
するために分析が行われた。標的としてＭＴ−２細胞を
用いそしてウィルスとしてＨＴＬＶＩ［１，（Ｈ９）を
用いたこの分析の結果を第２図に示す。

ここでは、−セットの培養物がｄｓＲＮＡと共にインキ
ュベートされ、次にウィルスチャレンジの直後にｄｓＲ
ＮＡを除去し、抗ウィルス活性が前インキュベーション
のみの関数であるようにした。第二セントの培養物をｄ
ｓＲＮＡと共に前インキュベートし、そして次にウィル
スチャレンジに続きｄｓＲＮＡと共にインキュベートを
続けた。いずれの場合にも、抗ウィルス活性は５分間と
いう短い前インキュベーションで観察され、前インキュ
ベーションのみで２１％の保護が得られ、そして前イン
キュベーション及びそれに続（ｄｓＲＮＡとのインキュ
ベーションにより４９％の保護が得られた。いずれの場
合にも、１時間の前インキュベーションで最大抗ウィル
ス活性が認められた。

結論として、本発明者は次の証拠を明らかにした。すな
わち、ｄｓＲＮＡの抗ウィルス活性は、単独で又は他の
（抗原的に及び／又はゲノム的に異る）ヒトウィルスと
共に機能する抗原ウィルス又は細胞内寄生体の非常に変
化しやすい性質又は宿主細胞域により限定されない。こ
れは、異る）ＩＩＶ単離体ＨＴＬＶ　　ｍｍ及びＨＴＬ
Ｖ　　ｍａｖＫ対すルｄｓＲＮＡ　（７）活性、並びに
３種類の異るレルバーＴ−細胞系（Ｃ３、ＭＴ−２及び
Ｈ９）並びに単球／マクロファージ細胞系において抗ウ
ィルス状態を確立する能力により示される。さらに、８
〜２４時間の前インキュベーションが必要であろうとい
う従来の知見に反シて、インビトロでの十分な抗ウィル
ス活性のためにｄｓＲＮＡとの５〜６０分間という短時
間のインキュベーションが必要であった。これらのイン
ビトロ研究において観察される非常に変異しやすいウィ
ルス（及び／又は、ＡＤＥを生成してその潜在的な病原
性を上昇せしめるウィルス）に対する有効性スペクトル
は、多くのヒトウィルス感染、特にその病原性が亜急性
又は慢性であるものの治療におけるｄｓＲＮＡの臨床的
有効性を明瞭に示すものである。

〔参照文献〕

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ｆｏｒ　１ｌｅｌｐｅｒ　Ｉｎｄｕｃｅｒ　Ｔ−１ｙｍ
ｐｈｏｃｙ−ｔｅｓ、５ｃｉｅｎｃｅ　２２５＋５９−
６３゜２、　　Ｋｏｅｎｉｇ、Ｓ、、Ｇｅｎｄｅｌａ＋
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Ｊ、Ｍ、、ＤａｌＣａｎｔｏ、Ｍ、Ｃ，、Ｐｅｚｅｓｈ
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５ｓｕｅ　ｆｒｏａ＋　ＡＩＤＳ　Ｐａｔｉｅｎｔｓｗ
ｉｔｈ　Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ、５ｃｉｅｎｃ
ｅ　２３３＋１０８９−１０９３゜３、　　Ｈａｈｎｌ
Ｂ−Ｈ，、Ｇｏｎｄａ、Ｍ、Ａ、、Ｓｈａｗ、Ｇ、Ｍ、
、Ｐｏｐｏｖｉｃ＋　Ｍ、、Ｈｏ５ｉｅ、Ｊ、Ａ、、Ｇ
ａ１ｌｏＪ、Ｃ，、及びＷｏｎｇ−５ｔａ１１．Ｆ、１
９８５；Ｇｅｎｏｓ＋ｉｃ　　Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　　
ｏｆ　　ｔｈｅ＾ｃｑｕｉｒｅｄ　　Ｉｍｍｕｎｅ　　
Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　　Ｓｙｎｄｒｏｍｅ　　ｖｉｒ
ｕｓＨＴＬＶ−１１１：Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　Ｖｉｒｕ
ｓｅｓ　Ｅｘｈｉｂｉｔ　ＧｒｅａｔｅｓｔＤｉｖｅｒ
ｇｅｎｃｅ　ｉｎ　Ｔｈｅｉｒ　Ｅｎｖｅｌｏｐｅ　Ｇ
ｅｎｅｓ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）８２．４８１３−４８１
７゜４、　　Ｓｈａｗ＋Ｇ、Ｍ、、ＨａｈｎｌＢ、１１
．、Ａｒｙａ、Ｓ、に、、Ｇｒｏｏｐｍａｎ、Ｊ、Ｅ、
、Ｇａ１ｌｏ＋Ｒ，（：、、及び−ｏｎｇ−５ｔａ１１
．Ｆ。

１９８４；Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉ
ｚａｔｉｏｎ　　ｏｆ　　Ｈｕｍａｎ　　Ｔ−ｃｅｌｌ
　Ｌｅｕｋｅｍｉａ（ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ）Ｖｉ
ｒｕｓ　Ｔｙｐｅ　　ｍ　　１ｎｔｈｅ　Ａｃｑｕｉｒ
ｅｄ　　ｆｍｕｎｅ　Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　Ｓｙｎｄ
ｒｏｍｅ。

５ｃｉｅｎｃｅ　２２６．１１６５−１１７１゜５、　
　Ｐｏｐｏｖｉｃ、Ｍ、、Ｓａｒｎｇａｄｈａｒａｎ＋
Ｍ、Ｇ、、Ｒｅａｄ、Ｅ、、及びＧａ１１ｏ、Ｒ，Ｃ，
１９８４；Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ、　ｌ５ｏｌａｔｉｏｎ
＋ａｎｄＣｏｎｔｉｎｕｏｕｓ　　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏ
ｎ　ｏｆ　　ＣｙＬｏｐａｔｈｔｃ　Ｒｅｔｒｏｖｉｒ
−ｕｓｅｓ（ＨＴＬＶ−１１［）Ｐｒｏｉ　Ｐａｔｉｅ
ｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ＡＩＤＳ　ａｎｄ　ｐｒｅ−ＡＩＤ
Ｓ、５ｃｉｅｎｃｅ　２２４，４９７−５００゜６、　
　ｔｌａｒａｄａ、Ｓ、、　Ｋｏｙａｎａｇｉ、Ｙ、、
及びＹａ＋＊ａｍｏｔｏ＋Ｎ。

１９８５；　夏ｎｆｅｃｔｉｏｎ　　ｏｆ　　ｔｈｅ　
　Ｈｕ１１＋ａｎ　　Ｔ−１ｙｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃＶ
ｉｒｕｓ　Ｔｙｐｅ−１（ＨＴＬＶ−Ｉ）−Ｂｅａｒｉ
ｎｇ　ＭＴ−４Ｃｅ１ｌｓ　ＷｉｔｈＨＴＬＶ−［［［
（ＡＩＤＳ　ｖｉｒｕｓ）：Ｃｈｒｏｎｏｌｏｇｉｃａ
ｌ　　５ｔｕｄｉｅｓ　ｏｆ１！ａｒｌｙ　ｌ１ｉｖｅ
ｎｔｓ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　　１４６＋２７２＋２８１
゜７、　　Ｓｕｎｄｓｔｒｏｍ＋Ｃ，、及びＮｉ１ｓｓ
ｏｎ、　Ｋ、　１９７６；Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｓ＋ｅｎ
ｔ　　ａｎｄ　　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　
　ｏｆ　　ａ　　ＨｕｍａｎＨｉｓｔｉｏｃｙｔｉｃ　
　Ｌｙｍｐｈｏｍａ　　Ｃｅ１ｌ　　Ｌｉｎｅ（０９３
７）、Ｉｎｔ、Ｊ。

Ｃａｎｃｅｒ　１７．５６５−５７７゜８、　　Ｐｏ１
ｅｓｚ、Ｂ、Ｊ、、Ｒｕ５ｃｅｔｔｉ、Ｆ、Ｗ、、Ｇａ
ｚｄａｒ、Ａ。

Ｆ６、Ｂｕｎｎ、　Ｐ、Ａ、、Ｍｉｎｎａ、Ｊ、Ｄ、、
及びＧａ１ｌｏ、Ｒ，Ｃ，１９８０；Ｄｅｔｅｃｔｉｏ
ｎ　ａｎｄ　　ｌ５ｏｌａｔｉｏｎ　　ｏｆ　　Ｔｙｐ
ｅ　ＣＲｅｔｒｏｖｉｒｕｓＰａｒｔｉｃｌｅｓ　Ｆｒ
ｏｍ　Ｆｒｅｓｈ　ａｎｄ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｄ　Ｌｙｍ
ｐｈｏｃｙｔｅｓｏｆ　ａ　Ｐａｔｉｅｎｔ　Ｗｉｔｈ
　Ｃｕｔａｎｅｏｕｓ　Ｔ−ｃｅｌｌ　　Ｌｙｍｐｈｏ
ｍａ。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　（ＵＳ＾）
７７．７４１５−７４１９゜９、　　Ｍｏｎｔｅｆｉｏ
ｒｉ＋Ｄ、Ｃ０、及びＭｉｔｃｈｅｌｌ、Ｗ、Ｍ、１９
８７；Ａｎｔｉｖｉｒａｌ　　Ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ
　Ｍｉｓｍａｔｃｈｅｄ　ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ
ｅｄ　　ＲＮＡ　　Ａｇａｉｎｓｔ　　ｔｌｕａ＋ａｎ
　　Ｉｍｏ＋ｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙＶｉｔｒｏ、
Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　（ＵＳ＾）
　８４　、２９８５−２９８９゜

【図面の簡単な説明】

第１図は、ｒｌｎ−ｒ（Ｃ＋ｚ、ＩＩ）ｎの存在下（−
−−）又は非存在下（−０−）での各種のウィルス感染
細胞の逆転写酵素活性及び免疫蛍光の結果を示す。 第２図は、ｒｌｎ−ｒ（Ｃ＋ｚ、Ｕ）ｎの存在下（−０
−）又は非存在下（−・−）で細胞を前インキュベート
した場合のウィルスに対する保護効果を示す。 第３図は、ｄｓＲＮＡの濃度とウィルスＣＰＥに対する
細胞の保護効果との関係を示すグラフである。 第４図は、ｄｓＲＮＡの濃度とウィルスＣＰＨに対する
細胞の保護効果との関係を示すグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ウィルス粒子構造中の分子再構成によって証明され
   る抗原ドリフトに対して二次的なウィルス誘導疾患に対
   して、ウィルス感染に対して感受性の動物を保護するた
   めの組成物であって、ウィルス粒子構造中の分子再構成
   に対して二次的なウィルスの逃避を防止又は最小にする
   のに有効な量の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を含んで成
   る組成物。 ２、ウィルス粒子の分子再構成所定の限界に維持しなが
   らウィルス粒子構造の分子再構成を固定しそして分離す
   るための組成物であって、ウィルス粒子構造の分子再構
   成を前記限界に維持するために十分な量のｄｓＲＮＡを
   含んで成る組成物。 ３、前記ウィルスが動物細胞内に含まれているものであ
   る、請求項２に記載の方法。 ４、ウィルスに感染した動物を抗ウィルス療法又は免疫
   療法に対して感受性にし又はその様に維持するための組
   成物であって、ウィルス−安定化量のｄｓＲＮＡを含ん
   で成る組成物。 ５、前記ｄｓＲＮＡがミスマッチｄｓＲＮＡである、請
   求の範囲第１項、第２項又は第３項に記載の方法。 ６、前記ミスマッチｄｓＲＮＡがポリイノシネート及び
   ポリシチジレートの複合体であり、これが５個中１個〜
   ３０個中１個のウラシル又はグアニジン塩基を含有して
   いる、請求項５に記載の組成物。 ７、前記ミスマッチｄｓＲＮＡがｒＩｎ・ｒ（Ｃ＿２＿
   ９，Ｇ）ｎである、請求項５に記載の組成物。 ８、前記ミスマッチｄｓＲＮＡがｒＩｎ・ｒ（Ｃ＿１＿
   １＿−＿１＿４，Ｕ）ｎである、請求項５に記載の方法
   。 ９、前記ｄｓＲＮＡが結合破損領域を含有し、そしてｄ
   ｓＲＮＡがｒＩｎ・ｒ（Ｃ＿１＿１＿−＿１＿４，Ｕ）
   ｎの好都合な療法的比率の性質を示す、請求項５に記載
   の方法。