JPH0150397B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はウリジン二燐酸−Ｎ−アセチルガラク
トサミン（以下UDPGalNAcと称する）の分離、
精製法に関する。さらに詳しくはウリジン二燐酸
−Ｎ−アセチルグルコサミン（以下
UDPGlcNAcと称する）およびUDPGalNAcを
含む溶液にUDPGlcNAcピロホスホリラーゼを
作用させてUDPGlcNAcを酵素的に分解した反
応液からUDPGalNAcを分離、精製するにあた
りペーパークロマトグラフイーを用いることによ
りUDPGalNAcを効率よく分離、精製する方法
に関するものである。 UDPGalNAcは糖脂質や糖蛋白質等複合糖質
の生合成におけるＮ−アセチルガラクトサミンの
供与体であり、糖転移酵素の基質として重要な役
割をはたしている。とりわけ人のABO式血液型
におけるＡ型物質の生合成に関与する糖転移酵素
（Ａ−トランスフエラーゼ）の基質として、本酵
素活性の測定を判定の困難な変異血液型の同定に
利用する試みがなされている。 UDPGalNAcはUDPGlcNAcをバチルス・ズ
ブチリスなどの細菌に含まれるUDPGlcNAc−
４−エピメラーゼを用いたエピメリ化反応によつ
て製造することは公知である。（Agric.Biol.
Chem.371741−1743（1973）、Appl.Environ.
Microbiol.41、392−395（1981））即ちこれらの方
法はUDPGlcNAcを酵素的にUDPGalNAcへ変
換せしめて得られるUDPGlcNAcと
UDPGalNAcの混合液にUDPGlcNAcピロホス
ホリラーゼを作用させUDPGlcNAcをUPTと
GlcNAc一燐酸に分解した後、UDPGalNAcを単
離、精製するものである。従来この最終過程にお
けるUDPGalNAcの分離はピロホスホリラーゼ
反応液から活性炭によつてヌクレオチド成分を単
離した後、イオン交換樹脂によるクロマトグラフ
イーによつてUDPGalNAcを分画し、溶出液を
再び汚性炭処理してUDPGalNAcを単離、精製
していた。しかしながら活性炭を用いて糖ヌクレ
オチドを吸着後、アンモニア性エタノール溶液等
で脱着する方法は操作が煩雑であること、糖ヌク
レオチドの損失が避けられないなど問題点が多
い。またイオン交換樹脂によるクロマトグラフイ
ーも回収率に問題があり、これらの操作により通
算収率が大巾に減少する。 本発明者らはこれらの問題点を解決すべく
UDPGalNAcの分離、精製法について検討を重
ねた結果、ペーパークロマトグラフイーによる分
離および分取が最も効率的であることを見出し、
本発明に到つた。 即ち本発明の目的は酵素的に製造した
UDPGalNAcを効率よく分離、精製する方法を
提供するものであり、その要旨はUDPGlcNAc
およびUDPGalNAcを含む溶液にピロリン酸の
存在下、直径ピロホリホスラーゼを加えて
UDPGlcNAcを酵素的に分解し、分解後の溶液
に塩化マンガンを加えてピロリン酸を析出、除去
した後、該溶液中のUDPGalNAcをペーパーク
ロマトグラフイーにより分離、精製する方法であ
る。本発明によれば活性炭による吸脱着の繰返
し、およびイオン交換クロマトグラフイーによる
UDPGalNAcの損失を避けることができ、一度
のペーパークロマトグラフイーの操作で簡便かつ
高収率でUDPGalNAcを得ることができる。 次にその実施態様を簡単に述べると
UDPGlcNAcとUDPGalNAcの混合溶液に
UDPGlcNAcピロホスホリラーゼを作用させて
UDPGlcNAcをUTPとGlcNAc一燐酸に分解す
る。煮沸により反応を停止し、沈澱物を遠心分離
によつて除去し、上澄を得る。上澄を濃縮後、塩
化マンガンを添加し析出するピロリン酸を除去す
る。さらに濃縮した後ろ紙に帯状に塗布し、常法
により展開する。展開終了後紫外吸収によりろ紙
上のUDPGalNAc部分を検出する。同部分をろ
紙より切取り、水で抽出してUDPGalNAcを得
る。 本発明に用いるろ紙は通常市販されているもの
でよく、試料処理量を考慮すると厚手のものが望
ましい。ろ紙１枚あたり塗布できるヌクレオチド
量は10〜300mg、好ましくは20〜100mgである。試
料を過剰に塗布するとテーリングなどを起こし、
分離が不十分となる。展開溶媒はヌクレオチドの
ろ紙クロマトグラフイーに対して用いられる一般
的なものを使用できる。展開法は上昇法でも下降
法でもよく時間の短縮には下降法が好ましい。ろ
紙上のUDPGalNAc部分は水で容易に抽出する
ことができる。 以下実施例および比較例により本発明をさらに
詳しく説明する。 実施例 UDPGlcNAc1400μモルにトリス塩酸緩衝液
（PH8.0）中で塩化マグネシウム、エチレンジアミ
ンテトラ酢酸存在下にUDPGlcNAc−４−エピ
メラーゼを作用させUDPGalNAcと
UDPGlcNAcの混合物を得た。このものにパン
酵母菌体より調製したUDPGlcNAcピロホスホ
リラーゼをピロリン酸の存在下に作用させ
UDPGlcNAcをUDPとGlcNAc一燐酸に分解し
た。加熱により反応を停止し、沈澱物を遠心分離
により除去して上澄を得た。上澄を濃縮した後塩
化マンガンを添加し、ピロリン酸を析出させ除去
した。さらに濃縮した後、厚手のろ紙に１枚あた
り約100mgのヌクレオチドを帯状に塗布した。こ
れを95％エタノール：1M酢酸アンモニウム＝
7.5：３（ｖ／ｖ）の展開溶媒を用いて展開させた
後、紫外吸収によりろ紙上のUDPGalNAc部分
を検出、同部分を切り取り水で抽出した。得られ
たUDPGalNAcの量は417μモルであり、回収率
は90％であつた。 比較例 UDPGlcNAc1650μモルを実施例と同様にピロ
ホスホリラーゼで処理した後、従来法に従つて活
性炭吸着およびイオン交換クロマトグラフイーに
よつてUDPGalNAcを分離、精製した。得られ
たUDPGalNAcは228μモルであり、回収率は61
％であつた。

【特許請求の範囲】

１ ノカルデイア（Nocardia）種
（ATCC39043）（微工研菌寄第8649号）を資化性
の炭素源および窒素源を含有する水性栄養培地中
で充分な抗生物質活性が得られるまで培養し、単
離の前に、ブロスの中に存在するエリスロマイシ
ンＤエステル類を加水分解し、得られたエリスロ
マイシンＤに富んだ抗生物質複合体を単離するこ
とからなる、エリスロマイシンＤに富んだ抗生物
質複合体を製造する方法。