JPH01501117A - コンピテント真核生物遺伝子生産物の生産について改良された熱ショック制御方法および系 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 コンピテント真核生物遺伝子生産物の生産について改良された熱ショック制御方 法および系導入部 種々の細胞型（タイプ）中熱ショック制御下での注目している遺伝子生産物の生 産に対する熱シヨツク発現要素の使用および好都合は、ドレアノ（ＤＲＥＡＮＯ ）等によりジーン（ｇｅｎｅ）、（１９８６年、印刷中）に記載されている。

この技術は、有効で一般的かつ高度に誘導可能な特性を有する真核生物発現系と して固有の好都合を有している。これらの因子は、医薬的におよび他に注目され る蛋白質の商業的生産に対して大いに興味深いものである。これらの蛋白質が複 雑であり、変形されており、不安定でありまたは生産細胞に対して潜在的に毒性 である場合にとりわけ興味深い。

生きている細胞中の天然の熱シヨツク系は、とりわけ、複雑でまだ十分には定義 されていない保護機能の役割を果たす。

熱シヨツク転写および翻訳の熱シヨツク制御要素の性質は、おそらく、それらの 要素に関連した遺伝子生産物の生理学的役割の最適化に至るように進化したので あろう。熱シヨツクメツセンジャーＲＮＡおよび蛋白質の生産および安定性の特 徴は、それらの生理学的役割に特異的であり、従って注目している蛋白質の熱シ ヨツク制御される生産に対して必ずしも最適に望ましいものであるとは限らない 。熱ショックプロモーター領域ならびに熱シヨツクＲＮＡリーダー中に含まれる 配列ドメインの数は、例えば、アミン（ＡＭＩＮ）等、モル、セル。

パイオル、　（Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、）　５、（１９８５年）、１９７ 〜２０３に記載されているので、本発明者らには、非コード熱シヨツク制御造成 物における配列変形は注目の蛋白質の生産に好都合な変異配列造成物に至り得る ように思われた。また、実際的な目的に対して、高レベルの発現のために温度ま たは他のストレスの閾値を下げることが好都合となり得る。このような変形は、 熱シヨツク制御下での注目している遺伝子の誘導を大規模培養の状態でより経済 的なものにすることができる。

さらに、より少ない程度のストレスにさらされる生産細胞は、おそらくストレス から生ずる損傷の影響なしに、高レベルの蛋白質合成を一層よく支持することを 可能とし得る。

さらに、熱シヨツク制御要素も、関与している発現系と選ばれた宿主細胞機構と の間の適合性を改善するようにヒトゲノムから選択された。

主ユ勿監！ 請求の範囲第１項によって要約された本発明の方法に導かれる変形は、主として 、独立にまたは組合わせて適用される３つの種類のもの１．すなわち、ヌクレオ チド挿入、ヌクレオチド欠失およびヌクレオチド置換からなっていることができ る。挿入および欠失は単一のヌクレオチドまたはポリヌクレオチドフラグメント を含んでいることができる。３′および／または５′非翻訳配列はｈｓｐ遺伝子 、外来遺伝子または合成りＮＡ、例えば、リンカ−およびアダプターから誘導す ることができ、そしてＡＴＧイニシェークーに隣接したリポソーム結合および翻 訳開始部位配列を含んでいる。一部の変形は、式ＣｎｎＧＡＡｎｎＴＴＣｎｎＧ の、ドロソフイラ・メラノガスタ−（敗匹並肚圏Ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）の ｈｓｐ７０ＫＤａ中の、ペルハム（ＰＥＬＨＡ？Ｉ）等〔トレンズ・ジェネソト （Ｔｒｅｎｄｓ　Ｇｅｎｅｔ）上（１９８５年）、３１〜３４〕によって特定さ れるｈｓコンセンサス配列にも関連している。この配列提案は決して排他的なも のでなく、この時点でこれらの著者に入手可能であったデータに基づ（彼らの提 案である。熱シヨツクコンセンサス配列の本発明者らのデータベースは広がって いるので、本発明者らは記載可能な統計的コンセンサス配列の変化を予想するこ とができる。

本発明のある態様において、５′非翻訳領域中のこのような配列の数を、ｈｓｐ ７０ＫＤａ遺伝子に通常存在している配列数より増加させた。他の態様において 、前記配列の互いに他に対する位置および他のプロモーター要素に対する位置を 変化させた。「熱シヨツク遺伝子制御要素」は、ＲＮＡへのＤＮＡ転写の制御を 可能とする熱シヨツクプロモーターおよび蛋白質への翻訳制御に影響を及ぼす熱 シヨツクＲＮＡリーダー配列の両方から構成されているものとして定義される。

熱シヨツクプロモーターの活性は細胞の型から独立しており、一方特異的熱ショ ック翻訳制御はＲＮＡリーダーのホモロジーおよび発現に用いられる細胞または 生物に大きく依存していることが一般に観察されている。

本発明は、熱シヨツク遺伝子翻訳制御要素、熱シヨツク遺伝子プロモーター配列 およびリーダー配列を含むタイプの熱シヨツク遺伝子制御要素の制御下で、遺伝 子生産物（アミノ酸の配列、すなわち蛋白質を含む）の生産をコードする、遺伝 子の発現を高めおよび誘導する方法を提供する。この方法は、以下の（１）〜（ ４）の工程を含んでなる：（１）プラスミド内へ挿入可能なフラグメント中にデ オキシヌクレオチドの配列を組立て、５′から３′方向に順番に熱シヨツク遺伝 子プロモーター配列、転写開始部位配列、蛋白質生産における翻訳制御のための 転写されるが翻訳されない５′リーダー配列、翻訳開始をコードするコンセンサ ス配列、蛋白質の生産をコードする遺伝子配列、および３′末端の非翻訳配列を 含むようにする工程、 前記熱シヨツク遺伝子プロモーター配列は１５００個以下のデオキシヌクレオチ ドおよび２〜１２個の熱シヨツクプロモーターコンセンサス領域を含んでおり、 前記熱シヨツクプロモーターコンセンサス領域は各々、実質的に下記式：％式％ 〔上式中、１〜４位置および９〜１１位置にある式中の少なくとも５個のデオキ シヌクレオチドが熱シヨツクプロモーターコンセンサスＳＮ域から熱シヨツクプ ロモーターコンセンサス領域まで実質的に保存され、そしてｎは各々独立してＡ 。

Ｔ、ＣまたはＧから選ばれる〕に等しい式で表わされる１１個以下のデオキシヌ クレオチドを含んでいる、翻訳開始をコードするコンセンサス配列は２０個以下 のデオキシヌクレオチドを含んでおりそして実質的に下記式：％式％ 〔上式中、ＣＣおよびＣＣは少なくとも２５％の発生頻度で−１，−２および− ４，−５の位置において優位を占め、Ａは約８０％の発生頻度で−５の位置にお いて優位を占め、ＡＴＧは約９０％の発生頻度で１．２および３の位置において 優位を占め、そしてＧは４０〜６０％の発生頻度で４の位置において優位を占め ており、 ｎはそれぞれ独立してＡ、Ｔ、ＣまたはＧから選ばれ、ｙは０〜１１から選ばれ 、そしてＸは０〜ｙから選ばれる〕を含んでいる、 ３′末端の非翻訳配列は３０００以下のデオキシヌクレオチドの非翻訳遺伝子配 列、ターミネータ−配列およびポリＡ付加配列を含んでいる、 （２）プラスミド内へ前記フラグメントを挿入して、熱シラツク遺伝子プロモー ターで制御されるプラスミドを形成する工程、 （３）蛋白質の生産をコードする遺伝子の発現を許容する（コンピテント）真核 細胞中に、前記熱シヨツク遺伝子プロモーターで制御されるプラスミドを挿入す る工程、および（４）前記真核細胞にストレスを与えて、蛋白質の生産をコード する遺伝子の発現を誘導する工程。

上記工程（１）においておよび請求の範囲において理解されるように、順序は、 示された順序で組立てられるＤＮＡ配列に対して重要であるが、追加の介在ヌク レオチドを、損傷を伴わずに、順序づけられた配列の間に含めることができる。

好ましくは、熱シヨツク遺伝子プロモーターは、ドロソフィラ・メランカスタ一 旦匹肚蛙旦ｎ　懸旦用旦旦旦の熱シッソクゲノムＤＮＡ、とりわけ７０キロダル トンの熱シヨツク蛋白質をコードする遺伝子から誘導される。

熱シヨツク遺伝子制御要素は、ＲＮＡへのＤＮＡ転写を可能とする熱シヨツクプ ロモーター、および蛋白質へのＲＮＡの翻訳制御に影響を及ぼす熱ショックリー ダー配列の両方からなっている。熱シヨツクプロモーターの活性は特定の真核細 胞から独立しているが、一方、熱シヨツク翻訳はＲＮＡリーダーのホモロジーお よびその発現のために使用される細胞性生物に依存している。

ＲＮＡリーダー配列である、転写されるが翻訳されない５′リーダー配列は、転 写開始部位と翻訳開始部位との間にある。

このリーダーは、熱シヨツク温度において翻訳を惹起させ得る熱シヨツクリーダ ーまたは通常の増殖温度においてＲＮＡ翻訳を可能とする別の供給源からのリー ダーであることができる。

厘Ｉｊ」１１ηｌ肌 ここで、本発明を図面を参照して説明する０図面には、ＤＮＡ配列を規定する記 号が示されている（第７図を参照のこと）。

第１ａ図は、ｐＢＲ３２２から誘導されそしてヒトλゲノムライブラリー〔ヴエ ルミー（ＶＯＥＬＬ？’ｌＹ）等、ＰＮＡＳ　ＵＳ＾、８２（１９８５年）４９ ４９〜４９５３年）から単離されたヒト熱シヨツク制御配列を含んでいるＤＮＡ 造成物、プラスミドｐ１７を表わしている。

第１ｂ図は、ポリリンカーフラグメント内にＢａ■ＩＩ制限部位を含むプラスミ ドｐｓｐ　ｓｓ　（二ニー・イングランド・ニエークレア・ラボラトリーズＯｌ ｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））を表わ している。

第１Ｃ図は、ｐ１７からのＥｃｏＲＩ（フィルイン）　−Ｈ１ｎｄｌｌｌフラグ メントをｐｓｐ　６５のＰｖｕｌＩ−ＲｉｎｄＩ１１部位に挿入して得たプラス ミドＰ１７６５ＪＯを表わしている。

第１ｄ図は、ｐ１７６５ＪｏのＢｇｊ！ＩＩ消化およびＢａ５ＨＩを用いた部分 消化および得られた３、４Ｋｂフラグメントの自己連結から得られたプラスミド ｐ１７Ｊｏを表わしている。

第２ａ図は、ヒト成長ホルモン（ｂＣ；Ｈ）のｃ−ＤＮＡフラグメントを含有す るプラスミドｐｈＧＨ（英国、スラウ（Ｓｌｏｕｇｈ）、セルチック社（Ｃｅｌ ｌｔｅｃｈ　Ｌｔｄ、）から入手〕を表わしている。

第２ｂ図は、ｐｈＧＨのＢａ５ＨＩフラグメントをｐｓＰ　６５のＢａ５Ｈ１部 位に挿入して得たプラスミドｐｓＰｈＧＨを表わしている。

第２Ｃ図は、ｐｓＰｈＧＨのＳａｊ！　Ｉ−ＢｉｎｄｌｌｌフラグメントをＰ１ ７ＪＯ（第１ｄ図）のポリリンカーの対応する制限部位に挿入して得たプラスミ ドｐ１７ｈＧｌｌを表わしている。

第３ａ図は、ｈＧＨ翻訳開始部位に先行する配列中の６個のヌクレオチドの欠失 によって得られたプラスミドｐ１７ｈＧＢΔ６を説明している。

第３ｂ図は、ＳＶ４０の初期プロモーター配列の制御下にありＳＶ４０初期ター ミネータ−配列によって終結されるマウスのジヒドロ葉酸塩（ｆｏｌａｔｅ）レ ダクターゼ遺伝子を含有するプラスミドｐｓν２ｄｈｆＴ　（サブラマニ（ＳＵ ＢＲＡ？ＩＩＡＮ１）等、モル、セル、パイオル、　（Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ　Ｂｉ ｏｌ、）　１　（１９８１年）、８５４〜８６４　）を表わしている。

第３ｃ図は、ｐ１７ｈＧＨΔ６の１．２ＫｂのＥｃｏＲＩ　−Ｂａｗｌ　Ｉフラ グメントをｐｓＶ２ｄｈｆｒのＢａｖａＨ１部位およびＥｃｏＲｆ部位中に連結 することによって得られたプラスミドｐ１７ｈＧＨｄｈｆｒΔ６を表わしている 。

第４ａ図は、初期ＳＶ４０プロモーターの制御下にあり初期ＳＶ４０ターミネー タ−配列によって終結されるネオマイシン（ＮＥＯ）耐性遺伝子を含有するプラ スミドｐ５Ｖ２　ＮＥＯｒサザン（ＳＯＵＴＨＥＲＮ）等によってジェイ０モル 、アプル、ジェネフト。

（ＪＩＭｏｌ、Ａｐｐｌ、Ｇｅｎｅｔ、）上（１９８２年）、３２７〜３４１に 開示されている〕を表わしている。

第４ｂ図は、ｐｓｐ　６５から誘導されたＰｖｕｌｌ　−ＢａｍＨ１７ラグメン トと、同じエンドヌクレアーゼ（Ｐｖｕｌｌ−Ｂａｗｌ　Ｉ　）　’ｌｒ用いた ｐＳＶ２　ＮＥＯの部分消化から得られたフラグメントとの連結によって生じた プラスミドｐｓＰＮＥＯ９を表わしている。

第４ｃ図は、ｐ１７ｈＧＨ（第２ｃ図参照）ｈ”１ｇ１さｈ　た１、３ＫｂのＥ ｃｏＲＩフラグメントと、　ＥｃｏＲ１で線状化されたｐｓＰＮＥＯ９との連結 によって生じたプラスミドｐ１７ｈＧＨＮＥＯを表わしている。

第５図は、本発明に従って、選ばれた注目の遺伝子を用いてカエル卵母細胞中で 誘導可能に発現された種々の蛋白質画分を示すアクリルアミドゲルエレクトロフ ェログラム（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏｇｒａ鋼）のオートラジオグラフィーで ある。レーンの特定は以下に示す、Ｃは対照（ｃｏｎｔｒｏｌ）温度を意味する 。

イムノブレシピテーションは抗ｈＧＨ血清を用いて行なう。

Ｍ蛋白質マーカー １　Ｒ１７１ｙｓ　Ｈ３細胞質 ２ｐ１７ｈＧＨＣ〃 ３ｐ１７ｈＧＩＩ　ＨＳ　〃 ４　Ｒ１７ｈＧＨΔ６　Ｃ〃 ５　Ｒ１７ｈｃｏΔ６　Ｈ８〃 ６　Ｒ１７ｈＧＨｄｈｆｒΔ６　Ｃ〃 ７　Ｒ１７ｈＧＨｄｈｆｒΔ６Ｈ３〃 ８　Ｒ１７ｈＧＨＮＥＯＣ〃 ９　Ｒ１７ｈＧＨＮＥＯＨＳ　〃 １０　Ｒ１７１ｙｓ　ＨＳ培養基 １１ｐ１７ｈＧＨ（。

１２　Ｒ１７ｈＧ）Ｉ　ＨＳ　〃 １３　Ｒ１７ｈＧＨΔ６　Ｃ〃 １４　Ｒ１７ｈＧＨΔ６　Ｈ３− １５Ｒ１７ｈＧ）Ｉ　ｄｈｆｒΔ６　Ｃ〃１６　Ｒ１７ｈＧＨｄｈｆｒΔ６　Ｈ ８〃１７　ｐｌｌ　ｈＧＨ−ＮＥＯ−Ｃ− １８Ｒ１７ｈＧＨ−ＮＥＯＨＳ　〃 Ｍ　蛋白質マーカー 第６図は、遺伝子がＣＯ３（モンキー）細胞およびＣＨＯ（ハムスター）細胞に おいて発現される他は第５図で説明されたと同様のデータに当てはまる。

１　Ｒ１７１ｙｓ　ＨＳ　ＣＯ５ ２Ｒ１７ｈＧ）ｌ　ｄｈｆｒΔ６　ＨＳＣＯＳ３　Ｒ１７ｈＧＨｄｈｆｒΔ６　 ’−ＣＣＯＳ１３　Ｒ１７Ｉｙｓ　Ｈ５ＣＨＯ １４Ｒ１７ｈＧＨｄｈｆｒΔ６　ＨＳＣＨＯ１５Ｒ１７ｈＧＨｄｈｆｒΔ６　Ｃ ＣＨＯ蛋白質分子量（キロダルトン、）（Ｄａで表わす）マーカーの位置を図の 右手側に示す。

第７図は、ＤＮＡ配列記号に対する解である。

第８図は、４つのコンセンサス領域配列（−４９〜−６７゜−６４〜−８７，− １３０〜−１９５，−１９１〜−４３０）を有するプロモーターを含む５′非転 写配列および転写部位および翻訳部位を含むドロソフィラ（敗並肚…１ａ）ｈｓ ｐ　７０ＫＤａ遺伝子の領域の塩基配列を説明している。

第１ａ図から第４Ｃ図において特定されるプラスミドは以下の配列および制限部 位を含んでいる（第７図参照）。

プ立五亙ヱ　■■工笠Ｌ ｐ１７　１１：　２．６　；１０：　３．９ｐＳＰ６５　１１　：　３．　Ｏ； 　１５＜　０．１ｐ１７６５　ＪＯ１１：　２．８　；１０：　３．２　；１５ ＜０．１ｐ１７　ＪＯ１１：　２．８　：１０：　０．６　；１５＜０．１ｐｈ ＧＨ１１：　”３；１２：０．７ ｐｓｐ　ｈＧＨ１１：　３．０　：１２：　０．７　；１５＜０．１ｐ１７　ｈ ＧＨ１１：　２．８　：１０：　０．６　：１２＜０．７ｐ１７　ｈＧＨΔ６　 同上 ｐｌｌ２　ｄｈｆｒ　１１　：　２．３　；　１３　（プロモーター）：０．４ １６：　０．７　；１３　（ターミネータ−）：１．６ｐ１７　ｈＧ）Ｉ　ｄｈ ｆｒ　１１　：　２．８　：　１３　（プロモーター）：０．４１６：　０．７ 　：１３　（ターミネータ−）：０．７ｉｏ：　ｏ、ｓ　；１２：　０．７ ｐＳＶ２　ＮＥＯ１１：　２．３　；１３　（プ０−Ｅ−−ター）　：ｏ、４１ ４：　１．５　：１３　（ターミネータ−）：１．６ｐｓｐ　ＮＥＯ９１１：　 ２．８　：１３　（プロモーター）：０．４１４：　１．５　；１３　（ターミ ネータ−）：０．７ｐ１７　ｈＧＨＮＥＯ１１：　２．８　；１３　（プロモー ター）：０．４１２：　０．７　：１３　（ターミネータ−）：０．７１４：　 １．５　：１０：　０．６ ＮＩ＝Ｎｃｏｌ Ｂｌ　”ＢａｍＨＩ ＸＩ＝ＸｂａＩ ＨＩＩＩＭＨｉｎｄＩＩＩ Ｒ１＝ＥｃｏＲＩ ＳＩ−５ａｌＩ ＢＴＩ　−Ｂｇｌｌ！ ＰＩＩ　＝　ＰｖｕＩＩ ２１！」■トロａ監 本発明の第一のＢ様において、プローブとしてドロソフィラ（７）　ｈｓｐ７０ ＫＤａ遺伝子に対するコード配列を用いトｈｓ制御要素を含有するプラスミドｐ １７を得た〔ヴエルミ−（ＶＯＥＬＬＭＹ）等、ＰＮＡＳ　ＵＳＡ　監（１９８ ５年）　４９４９〜４９５３）　、クローニング手順により単離されたＤＮＡ中 の機能的ヒ）ｈｓ制御要素の存在は、ＢＰ−Ａ−１１８３９３および前記ヴエル ミー（ＶＯＥＬＬＭＹ）等（７）　（１９８５年’）　ＰＮＡＳ文献に開示され ティる配列分析によって調べた。３．１５Ｋｂのｈｓ非転写配列および１１５ｂ ｐＲＮＡ　リーダーを含む制限フラグメントを、ｐｓｐ　６５　（第１ｂ図、商 業的に入手可能なプラスミド）からのＰｖｕＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント と連結してプラスミドｐ１７６５Ｊｏ（第１ｃ図）を与えた。小さな５′非転写 配列（０，４５Ｋｂ）を含有する、前記プラスミドｐ１７６５ＪｏからのＢａｗ ｌ　Ｉ　−Ｂｇ　Ｉ　ＩＩ制限フラグメント（３，４Ｋｂ）を自己連結させてプ ラスミドｐ１７ＪＯ（第１ｄ図）を与えた。

ヒト成長ホルモンｃ−ＤＮＡ含有クローン〔英国、スラリ（Ｓｌｏｕｇｈ）、セ ルチック社（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ　Ｌｔｄ）から入手したプラスミドｐｈＧＨ１第 ２ａ図参照〕をｐｓｐ　６５　（第１ｂ図）のポリリンカー中に挿入してプラス ミドｐＳＰｈＧＨ（第２ｂ図）を与えた０次いで、ｈＧＨ配列を含むプラスミド ｐｓＰｈＧ）ｌの旧ｎｄＩＩＩＳａｔ！　Ｉ　Ｏ，７Ｋｂフラグメントを、Ｒ１ ７Ｊｏのポリリンカーの対応する制限部位に挿入してＲ１７ｈＧＨを与えた（第 ２ｃ図）・この造成物において、ｈＧＨ配列は、開始部位の前のＡＴＧトリブレ ットを含むｚ７ｂｐによってｈｓ配列から隔てられている。ＸｂａｌおよびＮｃ ｏ　Ｉを用いた消化およびＤＮＡポリメラーゼラージフラグメントを用いたフィ ルインによって、ＡＴＧ）リプレフト直前の６個のヌクレオチドの欠失を達成し 、引き続いて自己連結を行なって、プラスミドＰ１７ｈＧＨΔ６（第３ａ図）を 与えた。このプラスミドは、ヒトｈｓプロモーターの制御下のｈＧＨ配列を、欠 失によって変形されたＲＮＡリーダー配列と共に含んでいる。このＲＮＡリーダ ー配列は、最適の翻訳開始のための配列を含んでおり、強い真核生物翻訳開始部 位を含む確立されたコンセンサス配列に一致する〔例えば、エム、コザック（Ｍ ＪＯＺＡＫ）　、ネイチャ（Ｎａｔｕｒｅ）３０８　（１９Ｂ４年）　、２４１ 〜２４６をか照されたい〕、実際に、欠失を含まない対照と比べて適当な真核生 物宿主中で欠失変形されたｈＧＨ遺伝子の発現の増大が観察された。このことは 後述する。

第２の態様において、ｈＧＨ遺伝子およびｈｓ配列を含んでいるｐ１７ｈＧＨΔ ６からの１．２Ｋｂ制限フラグメントを、プラスミドｐＳＶ２ｄｈｆｒ　（第３ ｂ図）のＢａｗｌ　１部位およびＥｃｏＲ１部位中に挿入した。なお、このプラ スミドｐＳＶ２ｄｈｆｒは、サブラマニ（ＳＬＩＢＲＡＭＡＮＩ）等、モル、セ ル、パイオル、　（Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、）上（１９８１年）、８５４ 〜８６４に開示のようにして得られたものである。得られたプラスミドｐ１７ｈ ＧＨｄｈｆｒΔ６（第３ｃ図）は、ヒトｈｓプロモーター（Δ６が含まれる）の 制限下にありＳＶ４０後期ターミネータ−（２）によって終結されるｈＧＨ配列 および第２にＳＶ４０初期プロモーター（１）の制御下にあるｄｈｆｒ遺伝子（ 逆の読み取り様式であることに注意）を含んでいた。この！１ｊ様において、以 下の記載かられかるように、３′後期非翻訳配列の存在もストレス下での発現を 高めた。

第３の態様において、プラスミドｐＳＰ　ＮＥＯ９（第４ｂ図）は、ＳＶ４０初 期プロモーターの制御下にあるネオマイシン耐性遺伝子を含みＳＶ４０初期ター ミネータ−（ポリー人付加部位を含む）によッテ終結されるｐＳＶ２　ＮＥＯ（ ｔザ７　（ＳＯＵＴＨＥＲＮ）等、ジェイ。

モル、アプル、ジェネット（Ｊ、Ｍｏ１．Ａｐｐｌ、Ｇｅｎｅｔ、）工（１９８ ２年）、３２７〜３４１　）のＢａＩＩＩＩ　Ｉ　−Ｐｖｕｌｌ制限フラグメン ト、およびｐｓｐ　６５からの対応する制限フラグメントから造成された。

ＥｃｏＲＩを用いたｐ１７ｈＧＨ（第２ｃ図）の消化によって得られた１、３Ｋ ｂフラグメントを、ＥｃｏＲ１で線状化されたｐｓｐ　ＮＥＯ９と連結してプラ スミドｐ１７ｈＧＨＮＥＯ（第４ｃ図）を得た。このプラスミドは２つの転写ユ ニットを含んでいる。その第１は、ＳＶ４０初期プロモーターの制御下にあるＮ ＥＯ遺伝子であり、そしてその第２は、非変形開始部位を有するｈｓプロモータ ーの制御下にあるがＳＶ４０初期ターミネータ−によって終結されるｈＧＨ遺伝 子である。３′非翻訳配列の存在も、ストレス下での適当な宿主細胞においてｈ ｓｉｌＪｌされるｈＧＨ遺伝子の発現を高めた。

発現実験および結果を以下に記載する。別の造成の様態も以下に開示する。

最初の一連の発現実験において、キセノプス（７卵母細胞核中へのＤＮＡ造成物 の注入の一時的発現系を前述〔ヴｓ　７Ｌ／ミー（ＶＯＥＬＩＪＹ）およびラン ガー（ＲＵ）ＩＧＧＥＲ）　、ＰＩＩＩＡＳυＳＡ川、（１９８２年）　、１７ ７６〜１７８０）のようにして用いて、ヒト成長ホルモン（ｈＧ）りの制御され た合成を分析した。前述の態様から得られたプラスミド造成物を用いた０手短か に言えば、注入されたＤＮＡを含有する卵母細胞をストレスに付した〔３６℃で ９０分間、それに続いて５ｓ３−標識されたメチオニン（５００μＣｉ／ｍ１） の存在下で２１℃において１２時間のインキュベーション〕、卵母細胞の細胞質 抽出物中のまたは浮遊培地中のｍｍされた蛋白質生成物の存在を、本質的に前述 （ＥＰ−０，１１８，３９３）のようにイムノプレシピテーシツンによって測定 した。得られた結果を第５図に示す。

レーンＭに示されている蛋白質分子量マーカーの他に、２つのシリーズの免疫吸 着（イムノプレシピテーション）した蛋白質の分析結果が示されている。レーン １〜９は注入された卵母細胞の細胞質抽出物から得られた結果を示しており、一 方、レーン１０〜１８は同じ卵母細胞の浮遊培地から得られた対応する結果を示 している。ｈＧＨ合成に関して得られた結果は２つのシリーズの分析結果につい て本質的に同じであり、分泌された細胞外蛋白質についての結果は実験の部分で さらに記載する。

レーン１１および１２はそれぞれ、対照（コントロール）温度および熱シラツク 温度でプラスミドＰ１７ｈＧＨを用いた結果ヲ示している。レーン１３および１ ４　、１５および１６、そして１７および１８は、プラスミドｐ１７ｈＧＨΔ６ 　：　Ｐ１７ｈＧＲｄｈｆｒΔ６；そしてＰ１７ｈＧＨＮＥＯを用いた比較実験 結果である。これらの結果は、抗ｈＧＨ抗血清によって特異的に免疫吸着（イム ノプレシビテーシッン）された分子量約２１ＫＤａの蛋白質の生産に関して以下 のように要約することができる。

ヒトｈｓｐ　７０クローンから誘導されおよびヒト配列の５個のヌクレオチドを 欠＜　ＲＮ　Ａリーダー配列内のＲＮＡリーダー融合造成物であるプラスミドＰ １７ｈＧＨは、熱ショックの後検出可能量のｈＧＨを生産するが、熱ショックが 存在しない場合には明らかな合成を示さない、プラスミドｐ１７ｈＧＨΔ６は、 理論的により強力な翻訳開始部位を与える５′非翻訳配列変形である。このプラ スミドは、用いられた一時的発現アンセイにおいて前のプラスミドに類似した挙 動を示すように思われる。これらプラスミド造成物は両方とも典型的な３′末端 ターミネータ−およびポリＡ付加シグナルを欠いていることを思い出されたい、 プラスミドｐ１７ｈＧＨＮＥＯは、ネオマイシン耐性遺伝子がｈＧＨ配列に関し て逆方向に挿入されていることによってこのような３′変形を含んでいる。そし て、これは非変形開始配列を有している。ここでは、ある程度の合成効率の増加 が観察される。３′変形および５′変形の２つのタイプの変形がプラスミド造成 物ｐ１７ｈＧ）ｌｄｈｆｒΔ６中で組合わせられた場合、ｈＧＨの発現効率の劇 的増加が観察され、これは熱シヨツク制御下でほとんど完全にそうなる（第５図 、レーン１５および１６を参照されたい）。

７’　ラスミ）’１）１７ｈＧＨｄｈｆｒΔ６も、ＣＯ５−１−１−７キー細胞 の培養物をトランスフエフシランするのに使用した〔グルラマン（Ｇｌｕｚｍａ ｎ）　、セル（Ｃｅｌｌ）２３　（１９８１年）１７５〜１Ｂ２　）　、これら の細胞におけるヒトｈＧＨの発現を、記載されている〔ドレン（ＤＲＥＡＮＯ） 等、ジーン（ｇｅｎｅ）　（１９８６年）印刷中〕と本質的に同じ手順を用いて 分析した。この場合、４３℃で３時間の誘導およびそれに続（３Ｓｓ−メチオニ ンの存在下での３７℃におけるさらに１６時間のインキュベーションを用いた。

熱ストレスを与えなかった対照の培養物を平行して処理した。次いで、両方のセ ントの細胞培養物を、抗ｈＧＨ血清を用いたイムノブレシピテーションによって 処理しそして上述のようにアクリルアミドゲル上で分析した。浮遊培養物の分析 から得られた結果を第６図に示す。

ＣＯ８細胞のトランスフェクションから得られた結果をレーン１，２および３に 示す、ここから理解され得るように、対照ＤＮＡを用いたトランスフェクション およびその後の熱ショック（レーン１）、および最適なｈＧＨ造成物を用いたト ランスフェクションおよび熱シヨツク不存在（レーン３）はいずれも、抗ｈＧ） ！血清によって特異的に沈殿する約２１［１ａの蛋白質の生産および分泌を増加 させない、　ｐ１７ｈＧＨｄｈｆｒΔ６を用いてトランスフェクションされ熱シ ョックに付されたＣＯ８細胞は、ｈＧＨについて予想される分子量を有する単一 の主要な分泌蛋白質バンド（レーン２参照）を生産する。

本質的に同一の結果が、ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣）を用いたト ランスフェクション実験から得られる（第６図、レーン１３．１４および１５を 参照されたい）。

従１て、ここで、熱シ≧フク制御下で異種のヒト蛋白質の合成を導く技術におい て、発現造成物中で用いられる非翻訳配列の比較的限定された変形によって、注 目している遺伝子生成物の生産量を増加させ得るということが証明される。明ら かなように、使用されてきた配列変形は類似し関連した技術を用いてつくること ができる配列変形の例である。新規な配列要素の正確な作用レベルは測定されな かったが、−ｍに、熱ショックに関連した配列の変形はプロモーター活性、ＲＮ 八へ定性および翻訳効率のレベルで作用すると考えることができる。明らかに、 他の配列変形は製造可能でありそれらは注目の蛋白質の生産に対する熱ショック 制御造成物の最適化に同様のまたは相補的な影響を与えることができる。ヒト要 素は非熱ショック蛋白質の制御された合成に対してドロソフィラ（肚並並…ｎ） から誘導された要素と同様にして作用することが証明された（ＥＰ　−０，１１ ８，３９３）、さらに、分泌可能な蛋白質、例えば、ヒト成長ホルモンの生産は ヒト熱シヨツク制御下で可能であること、およびこの生産は、細胞からの蛋白質 の分泌と共に、および同じプラスミド造成物がカエル細胞、モンキー細胞および その他の細胞中に導入された場合に生ずることが証明されている。同一のまたは 同様の造成物は、ヒト細胞を含む多（の種類の細胞型および生物から分泌される 蛋白質を含む多くの蛋白質の生産を可能とするであろうと考えることができる。

次の、Ｑ様は、ドロソフィラ（７）からの７０ＫＤａ　ｈｓ蛋白質遺伝子の５′ 非翻訳領域に存在するコンセンサス配列を含む変形に関する。この１４ｂｐのコ ンセンサス配列は式ＣｎｎＧＡＡｎｎＴＴＣｎｎＧを有しており、そしてドロソ フィラ（敗毀並…ｎ）熱シラ７り蛋白質遺伝子の５′非転写領域の一４９位置と 一６２位置との間にあり、および遺伝子が異種細胞型中に多くのコピー数で存在 している場合に遺伝子の熱調節される発現の原因となっている〔ペルハム（ＰＥ ＬＨＡＭ）セル（Ｃｅｌｌ）３０　（１９８２年）、５１７〜５２８；ミラウル ト（ＭＩＲＡＵＬＴ）等、ＥＭＢＯＪ、上（１９８２年）　、１２７９〜１２８ ５）ということが示唆された〔ペルハム（ＰＥＬＢＡＭ）、トレンズ・ジェネン ト（Ｔｒｅｎｄｓ　Ｇｅｎｅｔ）上（１９８５年）、３１〜３４〕、この配列要 素をｈｓコンセンサス配列と呼ぶ。

いくつかのグループによる実験〔ダドラー（ＤＵＤＬＥＲ）およびトラヴアース （ＴＲＡＶＥＲ５）　、セル（Ｃｅｌｌ）３８　（１９８４年）、３９１〜３９ ８；アミン（ＡＭＩＮ）等、モル、セル、パイオル、　（Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ。

Ｂｉｏｌ、）　５　（１９８５年）、１９７〜２０３　；サイモン（ＳＩＭＯＮ ）等、セル（Ｃｅｌｌ）４０　（１９８５年）、８０５〜８１７　）によって、 ２つのコンセンサス様配列は主として、低コピー数でおよび同種細胞中に存在す る場合ドロソフィラ（肚匹肚ｕｎ）　７０ＫＤａ　ｈｓｐ遺伝子の熱調節される 活性の原因となり得るということが示唆された。さらに、いくつかのｈｓ遺伝子 のプロモーター中の複数のコンセンサス様配列の存在が言及された。ドロソフィ ラ（敗匹肚ｕ圏）　７０ＫＤａ　ｈｓｐ遺伝子のプロモーターは５′非転写配列 の最初の３ｏｏｂｐ中に４つのこのような配列を含んでいる。この４つの要素は 本明細書中で領域１〜４と呼ばれるプロモーターの範囲にある。領域１は−４９ 〜−６７、領域２は−６４〜−８７、領域３は−１３０〜−１９５、そして領域 ４は−１９１〜−４３０にわたっている（第８図のプロモーターのヌクレオチド 配列を参照されたい）。

これらの観察は、ｈｓプロモーターの活性および誘導可能性がｈｓ’Ｑ１節要素 の正確な配列だけでなくこのような配列の数およびそれらの配列の相互および他 のプロモーター要素に関する位置にも依存しているという仮説を導いた０本発明 者らの発見は真に、コンセンサス様配列の位置および数の両方がプロモーター機 能に有意な影響を与えることを示唆している。これらの実験において、真核生物 起源の変形されたｈｓ制御配列下に置かれた試験遺伝子は細菌起源のβ−ガラク トシダーゼ遺伝子であった。

上記発見を支持する造成物は、ドロソフィラ（敗匹並旦ｎ）７０ＫＤａ　ｈｓｐ −イー、コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）β−ガラクトシダーゼハイブリッド遺伝子ｐ６２ ２ｃ　（アミン（ＡＭＩＮ）等、モル、セル、パイオル、（Ｍｏ１．Ｃｅ１１． Ｂｉｏｌ、）　５　（１９８５年）１９７〜２０３を参照されたい；彼らは変異 体遺伝子Ｄ−１９４（ハイブリッド遺伝子６２２ｃ）ならびにＤ　６７　（６２ ２ａ）およびＤ　５０　（６２２ｎ）を報告している〕の５′プロモ一ター欠失 変異体を含んでいた〔Ｄは欠失（Ｄｅｌｅｔｉｏｎ）に対する略称、この略称の 後の数字はプロモーターセグメントの長さくｂ　ｐ）を表す〕。

プロモーターが前記したコンセンサス領域１および２のみを含んでいる第１の制 御変異体ｌＮｌ０は以下のようにして造成された。　Ｄ８７ＤＮＡをＢｓ５ＨＩ Ｉで消化（−６７において切断）し、末端をＤ　Ｎ　Ａポリメラーゼラージフラ グメントによってフィルインし、ＢｇｌＩＩリンカ−（ＡＧＡＴＣＴＡＧＡＴＣ Ｔ）を付加し、この材料を旧ｎｄｌｌＴ　／Ｂｇ　ｌ　ＩＩおよびＣｊ！ａ　Ｉ ／Ｂｇ１１１によって二重消化し次いで１％低融点アガロースゲル上で電気泳動 した。

β−ガラクトシダーゼコード配列の最初の１／３ならびに７０ＸＤａ　ｈｓｐ遺 伝子の領域１およびＲＮＡリーダー領域を含む１．２Ｋｂ　Ｃｊ！ａ　Ｉ／Ｂｇ ｊｉ！ＩＴフラグメントおよびアンピシリン耐性遺伝子および細菌およびＳＶ４ ０の複製起点を含む、ｐｓＶＯｄベクター配列〔メロウ（ＭＥＬＬＯＷ）等、セ ル（Ｃｅｌｌ）２７、（１９８１年）２７９〜２８８〕およびドロソフィラ（Ｄ ｒｏｓｏ　ｈｉｌｉａ）７０ＫＤａ　ｈｓｐ遺伝子のプロモーターの領域２を含 む２．６Ｋｂの旧ｎｄｌＩＩ　／ＢｇｊｌＩフラグメントを単離した。これら２ つのフラグメントを、β−ガラクトシダーゼ遺伝子の残部、熱シヨツク遺伝子３ ′トレーラ−配列および０．３５Ｋｂベクタ一セグメントＣｐｓＶＯｄ中Ｂａｍ ＨＩ　〜ＨｉｎｄＩＩＩ）を含んでいるＤ８７から同様に精製された４、　８　 Ｋｂ　Ｃｊ！ａ　１　／）ｌｉｎｄｌｌｌフラグメントに連結した。

イー、コリ　（Ｅ、ｃｏｌ　ｉ）のトランスフォーメーションおよび組換えプラ スミドの同定を前記のように実施した〔上記アミンＣＡＭＩＮ）等の文献を参照 されたい〕。

プロモーター配列が同様に領域１および２を含んでいる第２の変異体ｌＮ２Ｏを ＩＮＩＱから造成した。　ｌＮｌ０のＤＮＡをＢｇｌｌを用いて部分消化しく領 域１と２との間のＢｇｌＩＩリンカ−を切断し）、ステインキイエンドを前記の ようにフィルインし、そしてＳ＋＋＋ａ　Ｉリンカ−（ＣＣＣＧＧＧ）を付加し た。従って、この配列変形はｌＮｌ０の２つのコンセンサス配列の間に新たな塩 基対を挿入することを含んでいた。

１つの領域１および領域２の２つのコピーを含んでいるノ＼イブリフト試験遺伝 子Ｒ５ａを以下のようにして造成した。

１Ｎ２０　ＤＮＡをＸｈｏ　Ｉで消化し、末端をフィルインし、続いてＤＮＡを 旧ｎｄｌｌｌで消化し、そしてｈｓプロモーター領域、β−ガラクトシダーゼ遺 伝子および３′トレーラ−配列を含む６．ｌＫｂフラグメントを低融点アガロー スゲルから単離した。このフラグメントを、プロモーター領域２および上流ベク ター配列を含んでいる　ｌＮｌ０からの２．６ＫｂのＢｇｌｌ／ＨｉｎｄｌｌＩ フラグメントに連結した。

領域１０１単位および領域２の３つまたは４つのコピーと共にプロモーターを含 んでいるハイブリッド遺伝子Ｒ６ａおよびＲ７ａを以下のようにしてつくった。

Ｒ５ａＤＮＡをＰｓｔｌを用いて消化しおよびＸｈｏ　Ｉを用いて部分消化した 。得られた２００ｂｐ長および２ｓｏｂｐ長のｈｓプロモーターフラグメントを 電気泳動的に単離した。Ｒ５ａからの１、７　Ｋｂ　Ｓｍａ　Ｉ　／　Ｐｓｔ　 Ｉフラグメント（領域２の２つのコピーおよび上流ベクター配列を含有）および ６．９Ｋｂ　Ｐｓｔｌフラグメント（ｈｓ　ＲＮＡリーダー領域、β−ガラクト シダーゼ遺伝子、３′トレーラ−配列およびベクター配列を含有）を単離して上 記プロモーターフラグメントに連結した。

種々の数の合成コンセンサス様配列と共にプロモーターを含有する別の変異体Ｓ ＥＩ〜５Ｅ１２も造成した。

合成リンカ−ＡＧＡＡＧＣＴＴＣＴ　にューイングランドバイオラプス（Ｎｅｗ 　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）　、通常に合成されたもの〕を、Ｘｈｏ　 Ｉで消化されたプラント末端を有するＤ５０　ＤＮＡに予備連結し次いでこれに 連結した。

すべてのプラスミドの構造を、十分な制限分析によって確めた。多くの造成物の 重要領域の塩基配列を決定した〔マキサム（ＭＡＸＡＭ）およびギルバート（Ｇ ＩＬＢＥＲＴ）の方法を使用、ＰＮＡＳ、ＵＳＡ７４　（１９７７年）、５６０ 〜５６４　）　、コンセンサス様配列の数および位置を示す要所（Ｋｅｙ）のプ ロモーター配列を以下で説明する。

発現実験を以下のようにして実施した。

ここで記載の実験において、前述〔ローソン（ＬＡＷＳＯＮ）等、モル、ジエン 、ジェネット、（Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、）　用■１９８４年）、１１６ 〜１２４〕のようにＤＥＡＥ−デキストラン−介在トランスフェクションによっ て種々の造成物をドロソフィラ、メラノガスター（肚匹匹ｕｎｍｅｌａｎｏｇａ ｓｔｅｒ）　Ｓ　３１！Ｉ胞中に導入した・用いたすべてのハイブリッド遺伝子 の共通の生成物、イー。

コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）に特異的なβ−ガラクトシダーゼの一時的合成を、トラン スフェクションの１日後に測定した０通常３６．５℃での熱ショックを、細胞質 抽出物の調製およびβ−ガラクトシダーゼ活性の測定前に適用した。

プロモーター中に合成コンセンサス様配列要素のみを含有する変異体ＳＥ１〜１ ２の活性を、３６．５℃で２時間の熱シヨツク後に、または対照温度２５℃で同 じ長さの時間にわたるトランスフェクションされた細胞のインキュベーションの 後にアッセイした。ハイブリッド遺伝子の活性は明らかに、プロモーター領域に 存在する合成コンセンサス様配列のコピー数の関数であることが見い出された。

有意の熱調節された活性は、少なくとも３つの配列要素と共にプロモーターを含 有している変異体を用いた場合にのみ測定することができた。７つの配列要素を 含有する変異体ＳＥＴは、領域１および２を含む７０ＫＤａ　ｈｓｐ遺伝子のプ ロモーターを含有する対照遺伝子Ｉ　Ｎ２０より熱シｇ７りを受ける細胞におい てかなり活性が高い。

プロモーターがそれぞれ領域２の２つ、３つまたは４つのコピーを含有している ハイブリッド試験遺伝子Ｒ５ａ、Ｒ６ａおよびＲ７ａ（実験の部分を参照された い）を用いた場合に同様の結果が得られた。この結果は、領域２の２つまたはそ れ以上のコピーを有するプロモーターが対照遺伝子の場合より有意により活性が 高いことを示した。

本発明を以下の実験の詳細によってさらに説明する。

ブースミド　ＰＩ３の告 ヒトｈｓ　７０ＫＤａ遺伝子を以下のようにしてファージラムダ（λ）ヒトゲノ ムライブラリーから単離した〔ローン（ＬＡＷＮ）等、セル（ＣｅｌｌＨ５（１ ９７８年）　、１１５７〜１１７４）　、このライブラリーは、ドロソフイラ（ 貼匹並ｕ圏）　ｈｓ７０蛋白質に対する完全コード配列を含んでいるプラスミド ５ａｌＯ［カーチ（ＫＡＲＣＨ）等、ジェイ０モル、パイオル、（Ｊ、Ｍｏ１． Ｂｔｏｌ、）ユ■、（１９８１年）、２１９〜２３０〕からの２ＫｂＳａｌｌフ ラグメントをプローブとして用いたプラークハイブリッド法〔ベントン（ＢＥＮ ＴＯＮ）およびディビス（ＤＡＶＩＳ）　、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）■鉦 、（１９７７年）１８０〜１８２〕によってスクリーニングされる。

このコード配列の任意の他の単離体は、ヒトｈｓｐ　７０遺伝子に対して適切で 実際的なホモロジーの領域を含んでいる限りはプラスミドＳａｌ　Ｏの代わりに 用いることができる。このクローニング手順は、ドロソフイラ（紅姐朋旦圏）カ らヒトヘノ進化の間ｈｓ遺伝子の蛋白質コード配列が高度に保存されているので 可能である〔ヴエルミ−（ＶＯＥＬＬＭＹ）等、ジエイ、パイオル、ケム、　（ Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅａ＋、）　２５８　（１９８３年）　３５１６〜３５２２ ）　。

ハイブリダイズするクローンが増殖されそのＤＮＡが十分な塩基配列分析に付さ れる。単離されたＤＮＡ中の機能的ヒトｈｓｔ＃Ｊ御要素の存在は、エシェリキ ア・コリ　（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）β−ガラクトシダーゼ遺伝子が ｈｓ制御下に置かれた、）ｊＤソフィラ（肚匹並ｕ圏）ｈ　ｓ￥Ａ御ハイブリッ ドプラスミドの同定に対して記載されている手順（ＥＰ　Ｏ，１１８，３９３） と同様の手順によって測定される。ｈｓｌＪ？ｉｌされるハイブリッドプラスミ ドは、キセノブス（狂匹…■卵母細胞核への微量注入法〔ヴ工／Ｌ／　ミ（ＶＯ ＥＬＬＭＹ）等、ＰＮＡＳ、ＬＩＳＡ７９　（１９８２年”）　１７７６〜１７ ８０）を用いた一時的発現実験において同定された。ヒトｈｓ制御配列を支持す るような手順を用いて同定された１つのプラスミドは第１ａ図のプラスミドｐ１ ７である〔ヴエルミ−（ＶＯＥＬＬＭＹ）等、ＰＮＡＳ　ＵＳＡ　（１９８５年 ）４９４９〜４９５３を参照されたい〕。

以下の項において、ヒト成長ホルモンをコードする配列のｃ−ＤＮＡコピーがヒ ）ｈｓｐ　７０制御配列の制御下に置かれている一連のプラスミド造成物を調製 した。

１７　ｈＧ）ｌ　ｄｈｆｒΔ６の゛告 プラスミドｐ１７をＥｃｏＲＩで消化し、ＤＮＡポリメラーゼＡクレノウフラグ メントでフィルインし、そしてさらに旧ｎｄＩＩＩを用いて消化した。ヒト３″ 、１５Ｋｂの非転写配列および１１５　ｂｐのＲＮＡリーダー配列を含有する３ 、２６Ｋｂフラグメントを精製した。第１ｂ図のｐｓｐ　６５　にューイングラ ンド・ラボラトリーズ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ） ）からＰｖｕｌｌ−ＨｉｎｄｌＩＩフラグメントも精製した。これら２つのフラ グメントを連結してプラスミドｐ１７６５ＪＯを与えた。この後者のプラスミド をＢａ１ｌｌを用いて消化しそしてＢａｍＨＩを用いて部分消化した。３．４Ｋ ｂのフラグメントを精製して「自己」連結させた。この新規なプラスミドり１７ ＪＱは、０．５Ｘｂの小さな５′非転写（転写されない）配列および上記したＲ 　Ｎ　Ａリーダー配列を含んでいる。

ＢａｍＨＩフラグメント中に含まれるヒト成長ホルモンのＣ−ＤＮＡクローンを ｐｓｐ　６５のポリリンカーのＢａｗｌ　１部位中に挿入してプラスミドｐｓＰ ｈＧＨを与えた。

次いで、プラスミドｐＳＰｈＧＨを旧ｎｄｌＩＩおよびＳａｃ　Ｉを用いて消化 し、ｈＧＨ配列をｐ１７ＪＯのポリリンカーの同じ制限部位に挿入してｐ１７ｈ ＧＨを与えた（第２ｃ図）、このプラスミド造成物において、ｈＧＨ配列は２７ ｂｐによってｈｓ配列から分離されており、そして開始部位の前の配列は、、、 ＴＣＴＡＧ　ＡＧＧＡＴＣＣＡ…Ｇ０６．であった。

ｐ１７ｈＧＨをＸｂａ　ＩおよびＮｃｏ　Ｉを用いて消化し、ＤＮＡポリメラー ゼクレノウフラグメントを用いてフィルインし、６つのヌクレオチドの特異的欠 失を可能とした。

「自己」連結は、潜在的に変形されたおよび「強力な」開始部位ＣＴＡＧＣＡＴ ＧＧを有するヒトｈｓプロモーターの制御下にｈＧＨ配列を含むプラスミドｐ１ ７ｈＧＨΔ６の造成を可能とした。

この配列は、強力な真核生物の翻訳開始部位に対して記載されている確立された コンセンサス配列とよく一致している。

詳細については下記文献を参照されたい：エム、コザフク（？１．ＫＯＺＡＫ） ニュークル・アシッド・リス（Ｎｕｃｌ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５）、　９　（１９８ １年）　５２３２〜５２５２゜エム、コザフク（Ｍ、ＫＯＺＡＫ）ニュータル・ アシフド・リス（Ｎｕｃｌ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５）、ｌｉ　（１９８４年）８５７ 〜８７２　。

エム、コザック（？１．ＫＯＺＡ）［）ネイチ＋−（Ｎａｔｕｒｅ）、　３０８ 　（１９８４年）２４１〜２４６゜ 最後に、ｐ１７ｈＧＨΔ６をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化した。ｈ ＧＨおよびｈｓ配列を含有する１、２Ｋｂフラグメントを、ｐＳＶ２−　ｄｈｆ ｒのＢａ＠ｌ　Ｉ部位およびＥｃｏＲ１部位に連結によって挿入した〔スブラマ ニ（ＳＵＢＲＡＭＡＮＩ）等、モル、セル・パイオル。

（Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、）±（１９８１年）８５４〜８６４　）。

得られたプラスミドｐ１７ｈＧＨｄｈｆｒΔ６は、第１に、ヒトｈｓプロモータ ーの制御下にありそしてＳＶ４０後期ターミネータ−配列によって終結されるｈ ＧＨ配列を、そして第２に、ＳＶ４０早期プロモーターの制御下にあるｄｈｆｒ 遺伝子を含んでいた。

ブースミド１７ｈＧ）ｌ　ＮＥＯの“告プラスミドｐＳＶ２−ＮＥＯ１０ｐ　ｇ 　（サザー７　（ＳＯＬＩＴＨＥＲＮ）　＆　ヘルプ（ＢＥＲＧ）、ジェイ０モ ル、アブル、ジェネフト（Ｊ、Ｍｏ１．Ａｐｐｌ。

Ｇｅｎｅｔ）、±（１９８２年）　、２３７〜３４１　）をＢａｎ＋）ｌ　１を 用いて消化しそしてＰｖｕＩＩを用いて部分消化した。早期ＳＶ４０プロモータ ーの制御下にネオマイシン耐性遺伝子を含有しそして早期ＳＶ４０ターミネータ −（ポリＡ付加部位を含む）によって終結されるフラグメントを、ｐｓｐ　６５ から誘導されたＰｖｕｌＩ　−Ｂａｇ）ｌ■フラグメントと連結してプラスミド ｐｓｐ　ＮＥＯ９を与えた。

プラスミドｐ１７ｈＧＨ５μｇをＥｃｏＲＩを用いて消化した。得られた１、　 ３　Ｋｂのフラグメントを精製し、そしてＥｃｏＲＩによって「線状化され」そ してホスファターゼを用いて処理されたｐｓｐ　ＮＥＯ９に連結した。

得られたプラスミドｐ１７ｈＧＨＮＥＯは２つの転写ユニット、第１にネオマイ シン耐性遺伝子（上述）および第２にヒ）ｈｓプロモーターの制御下にあり後期 ＳＶ４０ターミネータ−（ポリＡ付加部位を含む）によって終結されるｈＧＨ遺 伝子を含んでいる。開始配列はこのプラスミドにおいて変形されていない、これ らのプラスミド造成に対して用いた設計図は第１ａ〜４０図に示しである。

光里！鋏 この最初の一連の発現実験において、本発明者らは、前述〔ヴｓ　）Ｌｔミー（ ＶＯＥＬＬＭＹ）およびランガー（ＲｔｌＮＧＧＥＲ）　、　Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ。

ＵＳＡ　７９　（１９８２年’）　１７７６〜１７８０）のようにキセノブスー σμ四μ徂）卵母細胞核中へのＤＮＡ造成物の注入の一時的発現系を用いてヒト 成長ホルモンの制御された合成を分析した。その際、上記に記載のプラスミド造 成物を用いた。簡単に述べれば、１Ｑｎｊ！の容量中２〜５　ｎ　ｇのＤＮＡを １０〜２０個ノキセノフス（旦ユニ蛙卵母細胞の注入に対して用いた。微量注入 の１０分後、これらの卵母細胞を、３６℃で９０分間の熱ショックそれに続いて ３８８，９９９１されたメチオニン（５００μＣｆ　／　ｍ　ｌ　；１０〜２０ 個の卵母細胞に対して２００μｍ）の存在において２１℃で１２時間のインキュ ベーションに付した。卵母細胞の細胞質抽出物中または浮遊培地中の標識された 蛋白質性成物の存在を、ラビット抗ｈＧＨ抗血清〔カリフォルニア州すンタバー バラ（Ｓａｎｔａ　Ｂａｒｂａｒａ）在ダコ・コーポレイションから入手；　ｃ ａｔ、ｎｏ　Ａ３７０　）を用いた抽出物のイムノプレシピテーシランによって 測定した。イムノブレシピテーションおよびアクリルアミドゲル電気泳動分析に ついての詳細手順は本質的に前記（ＥＰ　−０，１１８，３９３）と同様であり 、得られた結果を第５図に示す。

レーンＭに示された蛋白質分子量マーカーの他に、イムノブレシビテーシリンさ れた蛋白質の２シリーズの分析結果が示されている。レーン１〜９は注入された 卵母細胞の細胞質抽出物から得られた結果を示しており、一方、レーン１０〜１ ８は同じ卵母細胞の浮遊培地のイムノブレシビテーシッンによりて得られた対応 する結果を示している。ｈＧＨ合成に関して得られた結果は本質的に２シリーズ の分析について同じであり、分泌された細胞外蛋白質の結果はここで詳細に記載 しよう。

ヒナ鶏（ｃｈｉｃｋｅｎ）　リソソーム遺伝子配列（クリーブ（ＫＲＩＥＧ）等 、２１４０モル、パイオル、（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、）　１８０．（１９８４ 年）６１５〜６４３〕をヒ）ｈｓ制御下に置いたという相違点を除いてはＰ１７ ｈＧＨと同等の造成物を使用した、レーン１０は、細胞を上述のように熱シラツ クに付した後でさえ、抗ｈＧＨ血清を用いた沈殿後特異的蛋白質バンドを示さな い。レーン１１および１２はそれぞれ対照温度および熱シヨツク温度でプラスミ ドｐ１７ｂＧＩＩを用いた結果を示している。レーン１３および１４゜１５およ び１６　、１７および１８は、プラスミドｐ１７ｈＧＨΔ６　；　ｐ１７ｈＧＨ ｄｈｆｒΔ６：およびｐ１７ｂＧ）ｌ　ＮＥＯを用いた同等の実験である。結果 は、とりわけ抗ｈＧＨ血清によってイムノプレシビテーションされた、分子量約 ’ｌ　ｌ　［ｌａの蛋白質の生産に関して以下のように要約することができる： ヒトｈｓｐ　７０クローンから誘導されおよびヒト配列の５つのヌクレオチドを 欠いているＲＮＡリーダー配列内のＲＮＡリーダー融合造成物であるプラスミド ｐ１７ｈＧＨは、熱ショック後検出可能な量のｈＧＨを生産するが、熱シヨツク 不存在においては明らかな合成は見られない。プラスミドｐ１７ｈＧＨΔ６は、 理論的により強力なリポソーム結合部位を提供する５′非翻訳配列変形であり、 このプラスミドは用いられた一時的発現アッセイにおいて前のプラスミドと同等 の様式で挙動するように思われる。これらプラスミド造成物は両方とも典型的な ３′末端ターミネータ−およびポリＡ付加シグナルを欠いていることを思い出さ れたい。プラスミドｐ１７ｈＧＨＮＥＯは、開始配列が変形されておらず、ｈＧ Ｈ配列に関して逆方向のネオマイシン耐性遺伝子の挿入による前記のような３′ 変形を含んでいる。ここで、ある程度増大した合成能力が観察される。

３′変形および５′変形の２つの型が組合わせられているプラスミド造成物ｐ１ ７ｈＧＨｄｈｆｒΔ６の場合、ｈＧＨの発現能力の劇的な増加が観察され、そし てこれはほとんど完全に熱シラツク制御下でそうなる（第５図、レーン１５禮よ び１６を参照されたい）。

変形されたｈｓ制御造成物の一般性の証明として、プラスミドｐ１７ｈＧＨｄｈ ｆｒΔ６を、ＣａＣ１ｔ　−ＤＮＡ沈殿法〔グラハム（ＧＲＡＨＡＭ）およびヴ アン　デルニブ（ＶＡＮ　ＤＥＲＥＢＢ）　、ジエイ。

ヴアイロル、（ＪＪｉｒｏｌ、）、５２　（１９７３年）４５６〜４６７　）を 用いてＣＯ５−１モンキー細胞〔グルラマン（ＧＬＵＺＭＡＮ）　、セル（Ｃｅ ｌ　１）２３、　（１９Ｂ１年）１７５〜１８２〕の培養物のトランスフェクシ ョンに使用した。これらの細胞中でのｈＧ）Ｉの発現は、本質的に１／）ずれか において（ＢＰ　−０，１１８，３９３）記載されている手順を用０て分析した 。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）ｌ胞のトランスフェクションに対して 、ｃｏｓｍ胞系中のトランスフェクションされたプラスミドに対して用いられる 増幅の時間を省いた他は同様の手順を使用した。ＣＨＯ細胞に対するトランスフ ェクションの１６時間後、およびＣＯ５細胞に対するトランスフェクションの４ ０時間後、培養物の一部を４３℃で３時間の熱ショックおよびそれに４４（３Ｂ ５−メチオニン（１００＃Ｃｉ／ｍｊ　Ｈ’１ｍ１ｌ　／ＩＱ’細胞）の存在に おける３７℃でさらに１６時間のインキユベーシヨンに付した。熱シラツクを受 けなかった対照の培養物を平行して処理した。

次いで、両方のセットの細胞培養物を以下のように処理した。

簡単に述べると、細胞質抽出物を、ＮＥＴ緩衝液（ＥＰ−０，１１８，３９３） 中での細胞の懸濁（浮遊）それに続く氷上での穏やかなピペッティング操作およ び低速の遠心分離を含む処理を用いて調製した。細胞浮遊培養物は同様の遠心分 離工程し；よって簡単に清澄化された０次いで、試料を抗ｈＧＨ血清を用いてイ ムノブレシピテーションし上述のようにアクリルアミドゲル上で分析した。浮遊 培養物の分析から得られた結果を第６図に示す。

ＣｏＳ細胞のトランスフェクションから得られた結果をレーン１，２および３に 示す、対照のりゾチーム造成物によるトランスフェクションおよびそれに続く熱 ショック（レーン１）、または熱シヨツク不存在における最適ｈＧＨ造成物にヨ ルトランスフエクション（レーン３）はいずれも、特異的に抗ｈＧ）１で沈殿さ れる蛋白質を生産および分泌しないことを認め得る。　Ｐ１７ｈＧＨｄｈｆｒΔ ６によってトランスフェクションされ熱ショックに付されたＣＯ３細胞は、予想 される分子量をもつ単一の主たる分泌蛋白質バンドを生産する（レーン２参照） ０本質的に同じ結果が、ＣＨＯ細胞を用いたトランスフェクション実験から得ら れる（第６図、レーン１３　、１４および１５参照）。

上記プラスミドはすべて、通常の手段を用いて、従来開示されている設計に従っ て製造した０本発明に従って変形された上記変異体プロモーター領域の一部の塩 基の配列を以下に示す。式中、星印はコンセンサス配列の配置を示している。

合成配列はＡＧＡＡＧＣＴＴＣＴであった。

ＣＴＣＧＡＡＴＧＴＴＣＧＣＧＡ Ｎ２０ 斧Ｃ＜　←　○　￥１）ｒ ２Ｊしく狡 すでに前記したように、コンセンサス配列およびそのコピーを含んでいる異なる 造成物を、ローソン（ＬＡＷＳＯＮ）等のＤＥＡＥデキストラン技法〔モル、ジ エン、ジェネント、　（Ｍｏ１．Ｇｅｎ。

Ｇｅｎｅｔ、）　１９Ｂ　（１９８４年）、１１６〜１２４　）によるトランス フェクションの後ドロソフィラ（敗匹並Ｕ圏）Ｓ３細胞中で試験した。

プロモーター中に合成コンセンサス様配列要素のみを含んでいる変異体ＳＥＩ〜 １２の活性を、３６．５℃での２時間の熱シヨツク後または対照温度２５℃で同 じ長さの時間にわたるトランスフェクションされた細胞のインキュベーションの 後にアッセイした。これらの実験の結果を第１表に示す。

第１表 １Ｎ２０　２（対照）　１．００　０．００ＳＥＩ　１　０，０５　０．０５ ＳＥ２　２　０．１０　０．００ ＳＥ３　３　０．４５　０．００ ＳＥ７　７　１，８０　０．０５ ＳＥ９　９　０．６５　０．０５ ハイブリツド遺伝子の活性は、明らかに、それらのプロモーター領域に存在する 合成コンセンサス様配列のコピー数の関数である。有意な熱調節された活性は、 少なくとも３つの配列要素を有するプロモーターを含有する変異体についてのみ 測定することができた。７つの配列要素を含有する変異体ＳＥＴは、対照遺伝子 ｌＮ２Ｏ（このハイブリッド遺伝子は領域ｌおよび２を含む７０ＫＤａ　ｈｓｐ 遺伝子のプロモーターを含んでいる）より、熱ショックを受けた細胞中でかなり 活性である。

プロモーターがそれぞれ領域２の１個、２個、３個または４個のコピーを含んで いる熱シヨツクハイブリッド遺伝子ｌＮ２Ｏ、Ｒ５ａ　、　Ｒ６ａおよびＲ７ａ を用いて同様の実験を行なった。

これらのハイブリッド遺伝子によってトランスフェクションされたドロソフィラ （敗姐圧ｌ圏）細胞を３５℃で９０分間または１２０分間の熱ショックに付する かまたは２５℃でさらにインキュベーションした。プロモーターの活性の差異が より遅い転写後の事象によって不明瞭にされる可能性を排除するために、転写を 熱ショックの１５〜４５分後に（アクチノマイシンＤによって）停止し、一方、 翻訳は熱処理の最後まで継続させた。これらの実験の結果（第２表）は、領域２ ０２個またはそれ以上のコピーを有するプロモーターがこの領域のわずか１個の コピーを含有する制御遺伝子（ＩＮ２０）の場合より３〜５倍活性であることを 強く示唆している。再び、すべての造成物は好ましく熱誘導可能であることが観 察された。これらの造成物は対照温度２５℃において本質的に不活性である。

しかしながら、３４℃において、造成物Ｒ５ａおよびＲ６ａは高レベルで発現さ れることが見い出された。なお、Ｉ　Ｎ２０の活性は３４℃においてわずかに検 出され得るのみである。このように、熱シヨツクプロモーター配列の変形は、対 照温度においては完全に不活性を残存させながら、ストレス誘導の闇値、すなわ ちこの場合には誘導温度を下げることができる。

これらの結果は最小熱ショック調節配列がＣＴＣＧｎｎｎｎＴＴＣであることを 示している。ドロソフィラ（７）　ｈ　ｓ　ｐ　８４プロモ一ター配列に対する 比較は、ＣＴＣＧの逆方向の繰り返し塩基配列、すなわちＣＧＡＧも熱シヨツク コンセンサス要素の受容可能な部分であることを示唆している〔ホルムグレン（ Ｈｏｌｓｇｒｅｎ）等、ＰＮＡＳ　ＵＳＡ、　７８　（１９８１年）　３７７５ 〜３７７８）。

叩上、３０分後ニア’７−Ｆ−／フイ１．００　４．００　３．３５　−ンン添 加 ２５℃でのインキュベーション　ｏ、ｏｏ　−ｏ、ｏ。

これらの実験は、有意なプロモーター活性が多数のコンセンサス様配列の存在を 必要とし、そして天然の活性より高い活性を有するプロモーターが造成され得る ことを証明している。熱誘導性がコンセンサス様配列の数にかかわりなく合成プ ロモーター中で維持されることに注意することは重要である。

ここに記載された実験は、天然の熱シヨツク遺伝子プロモーターの性能がこれら のプロモーターの試験管内配列操作によって高められ得ることを示している。本 明細書において、ドロソフィラ（敗匹匹ｈｉｌａ）熱シヨツクコンセンサス様配 列の次善温度における活性ならびに最大活性は熱シヨツク遺伝子の転写部位の開 始点の近くに位置していることが示された。

おもしろいことには、領域１および２を含むドロソフィラ（Ｄｒ匹並肛圏）　７ ０　ＫＤａ　ｈｓｐ遺伝子のプロモーターへの第３のコンセンサス様配列の付加 は、引き続きの第４要素または第５要素の付加より有意な影響を与えるように思 われる（第２表）。

本発明者らは、新たに付加された熱シヨツク要素と下流のプロモーター要素との 間の距離のプロモーター活性への影響を系統的に試験しなかったが、本明細書に 示した実験はこのパラメーターの重要性を示唆している。Ｒ５ａにおける第３微 生物 エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）エシェリキア・コリ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃ ｈｉａ　ｃｏｌｉ）エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ） 株番号　ＮＣＩＢ番号 ＨＢ１０１ｐ１７ｈＧＨ，ＮＥｏ　１２１２２ＨＢ１０１ｐｌ　７ｈＧＨ１２１ ２３ ＨＢ１０１ｐ１７ｈＧ）ｌ　ｄｈｆｒΔ６　１２１２４ＨＢ１０１ｐ１７ｈＧＨ Δ６　１２１２５特表千１−５０１１１７　（１４） 手続補正書（方式） 平成１年　ノ月２Ｓ日 特許庁長官　吉　１）文　毅　殿 １、事件の表示 ＰＣＴ／ＥＰ８６１００４５１ 、発明の名称 コンピテント真核生物遺伝子生産物の生産について改良された熱シタツク制御方 法および系３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 名称　パテル　メモリアル　インスティチュート４、代理人 住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号５、補正命令の日付 ６、補正の対象 明細書及び請求の範囲の翻訳文 ７、補正の内容 明細書、請求の範囲の翻訳文の浄書 （内容に変更なし） ８、添付書類の目録 明細書及び請求の範囲の翻訳文　各１通国際調査報告 −１１，−＾−―１ｗ＋　Ｔ’ＣＴ／四８６７００４５１ＡＮ！ｆｆｊｃ　Ｔｏ 　？！−：Ｅ　！ＮＴＥＲＮＡτＩＯＮ入Ｌ　Ｓ＝入Ｒ四　ＲＥＰＯＲＴ　０Ｎ ＥＰ−Ａ−０１１８３９３１２１０９／８４　ＪＰ−Ａ−５９）９２０９１３１ ／１０／８４ＡＵ−Ａ−２４２０ａ８４　１７１０４／Ｅ１６

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．適当な真核生物宿主細胞中で注目の真核生物遺伝子の発現を制御可能に誘導 する方法であって、下記の工程ａ）〜ｃ）： ａ）前記注目の遺伝子が真核生物起源の最低１個の熱ショック制御要素の転写お よび／または翻訳制御下に機能的に連結されておりおよび前記注目の遺伝子の５ ′および／または３′側に１個またはそれ以上の非翻訳配列を含んでいる組換え ＤＮＡ遺伝子発現ユニットを提供する工程；ｂ）誘導後前記発現の効率を高める ために前記非翻訳配列中へ１個またはそれ以上の配列変異または変形を導入する 工程；および ｃ）前記変形された遺伝子発現ユニットを適当な真核生物起源の宿主細胞中へ導 入しそしてこの培養物をストレスに付すことによって前記遺伝子の注目の生産物 への発現が誘導される工程 を含んでなる方法。 ２．前記５′配列がｈｓｐ、外来遺伝子または合成ＤＮＡ、例えば、リンカーお よびアダプターから誘導されたものである、請求の範囲第１項記載の方法。 ３．前記配列変異または変形がＡＴＧイニシエーターに隣接した部位および／ま たは配列を含んでいる、請求の範囲第２項記載の方法。 ４．前記配列変異または変形がヌクレオチド挿入／欠失および／または合成ＤＮ Ａの置換を含んでいる、請求の範囲第３項記載の方法。 ５．前記３′非翻訳配列がｈｓｐまたは外来遺伝子のターミネーター領域由来の ものである、請求の範囲第１項記載の方法。 ６．前記５′配列が、ＣｎｎＧＡＡｎｎＴＴＣｎｎＧに近い式で表わされるｈｓ ｐ遺伝子の発現を調節するコンセンサス配列に属している、請求の範囲第２項記 載の方法。 ７．プロモーター領域のコンセンサス配列の数を最初に存在していた数より増や すことおよび／またはコンセンサス配列を隔てている配列の長さを変えることを 含む、請求の範囲第６項記載の方法。 ８．遺伝子発現ユニットが下記のａ）〜ｄ）：ａ）注目の遺伝子、 ｂ）前記注目の遺伝子の発現を制御するための真核生物起源の少なくとも１個の 熱ショック蛋白質遺伝子制御要素、ｃ）注目の遺伝子の発現効率を向上させる変 形を含んでいる５′および／または３′末端非翻訳配列、およびｄ）注目の遺伝 子が前記発現ユニットの転写および／または翻訳制御を受けるように関連付けら れている少なくとも１つの部位、 を含んでなるＤＮＡ造成物であり、および宿主細胞系が、前記注目の遺伝子に機 能的に連結された前記発現制御ユニットが前記遺伝子の蛋白質生産物を生産する ために存在している真核生物起源の細胞または生物として機能する、遺伝子発現 ユニットー宿主細胞組合わせ系。 ９．前記遺伝子発現ユニットがヒトゲノムＤＮＡから誘導されたものである、請 求の範囲第８項記載の遺伝子発現ユニットー宿主細胞組合わせ系。 １０．前記遺伝子発現ユニットが真核細胞または真核生物の７０ＫＤａｈｓ遺伝 子から誘導されたものである、請求の範囲第８項記載の遺伝子発現ユニットー宿 主細胞組合わせ系。 １１．前記遺伝子発現ユニットがヒトゲノムＤＮＡから単離された７０Ｋｄｈｓ 遺伝子から誘導されたものである、請求の範囲第８項記載の遺伝子発現ユニット ー宿主細胞組合わせ系。 １２．前記発現ユニットが選択可能および／または増幅可能な遺伝標識形質と関 連付けられている、請求の範囲第８項記載の遺伝子発現ユニットー宿主細胞組合 わせ系。 １３．新規な組成物としてのプラスミドｐ１７ｈＧＨ。 １４．新規な組成物としてのプラスミドｐ１７ｈＧＨΔ６。 １５．新規な組成物としてのプラスミドｐ１７ｈＧＨｄｈｆｒΔ６。 １６．新規な組成物としてのプラスミドｐ１７ｈＧＨＮＥＯ。 １７．新規な組成物としての変異体プラスミドＳＥ１，ＳＥ２，ＳＥ３，ＳＥ７ ，ＳＥ９，ＳＥ１２，Ｒ６ａ，Ｒ５ａおよびＲ７ａ。 １８．熱ショック遺伝子プロモーターの制御下で、蛋白質の生産をコードする遺 伝子の発現を誘導する、下記工程（１）〜（４）を含んでなる方法： （１）プラスミド中へ挿入可能なフラグメント内へデオキシヌクレオチドの配列 を組み立て、５′から３′方向に順番に熱ショック遺伝子プロモーター配列、転 写開始部位配列、蛋白質生産における翻訳制御のための転写されるが翻訳されな い５′リーダー配列、翻訳開始をコードするコンセンサス配列、蛋白質生産をコ ードする遺伝子配列および３′末端の非翻訳配列を含むようにする工程、 前記熱ショック遺伝子プロモーター配列は１５００個以下のデオキシヌクレオチ ドおよび２〜１２個の熱ショックプロモーターコンセンサス領域を含んでおり、 前記熱ショックプロモーターコンセンサス領域は各々、実質的に下記式：１２３ ４５６７８９１０１１ ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔上式中、１〜４の位置および９〜１１の位置にある式中の少なくとも５個のデ オキシヌクレオチドが熱ショックプロモーターコンセンサス領域から熱ショック プロモーターコンセンサス領域まで実質的に保存され、そしてｎは各々独立して Ａ，Ｔ，ＣまたはＧから選ばれる〕に等しい式で表わされる１１個以下のデオキ シヌクレオチドを含んでいる、翻訳開始をコードするコンセンサス配列は２０個 以下のデオキシヌクレオチドを含んでおりそして実質的に下記式：−５−４−３ −２−１１２３４ ｎｘＣＣＡＣＣＡＴＧＧｎ（ｙ−ｘ） 〔上式中、ＣＣおよびＣＣは少なくとも２５％の発生頻度で−１．−２および− ４，−５の位置において優位を占め、Ａは約８０％の発生頻度で−３の位置にお いて優位を占め、ＡＴＧは約９０％の発生頻度で１，２および３の位置において 優位を占め、そしてＧは４０〜６０％の発生頻度で４の位置において優位を占め ており、 ｎはそれぞれ独立してＡ，Ｔ，またはＧから選ばれ、ｙは０〜１１から選ばれ、 そしてｘはＯ〜ｙから選ばれる〕を含んでいる、 ３′末端の非翻訳配列は３０００個以下のデオキシヌクレオチドの非翻訳遺伝子 配列、ターミネーター配列およびポリＡ付加配列を含んでいる、 （２）プラスミド中へ前記フラグメントを挿入して、熱ショック遺伝子プロモー ターで制御されるプラスミドを形成する工程、 （３）蛋白質の生産をコードする遺伝子の発現を許容する真核細胞中へ、前記熱 ショック遺伝子プロモーターで制御されるプラスミドを挿入する工程、および（ ４）前記真核細胞にストレスを与えて、蛋白質の生産をコードする遺伝子の発現 を誘導する工程。 １９．前記熱ショック遺伝子プロモーターがドロソフィラ・メランガスター（Ｄ ｒｏｓｏｐｙｉｌａｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒ）のゲノムＤＮＡから誘導されたも のである、請求の範囲第１８項記載の方法。 ２０．前記ゲノムＤＮＡがドロソフィラ・メランガスター（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌ ａｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒ）の７０キロダルトンの熱ショック蛋白質をコードす る遺伝子である、請求の範囲第１９項記載の方法。 ２１．さらに工程（１）において、デオキシヌクレオチドの配列中に、形質転換 体プラスミドの選択を可能とするための選択可能なマーカーをコードする配列を 含んでいる、請求の範囲第１８項記載の方法。 ２２．前記選択可能なマーカーが抗生物質耐性である、請求の範囲第２１項記載 の方法。