JPH01500147A - クロマトグラフ装置と方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 クロマトグラフ装置と方法 発明の背景 本発明は分離技術、特に生物学的物質を含めた化学的分離を達成するための技法 に関するものである。さらに具体的にいえば、本発明は薄層クロマトグラフ（ｔ ！ｌｅ　）　プレートを含めて増強されたクロマトグラフ・カラムあるいはカー トリッジを形成するための有機チタネート結合支持体を開示するものであり、か つ、逆相分離およびイオン的バッチ分離のためのカップリングさせた支持体を使 用する方法を開示している。

クロマトグラフィにおけるシラン処理担体物質の使用、特にシラン処理珪酸質支 持体物質の使用はよく確立されている。各種のヒドロキシ含有無機物質は、珪酸 塩、チタン酸化物を含めた金属酸化物、粘土、インドナイト、およびガラスを含 め、支持体物質として知られている。

クロマトグラフ分離はカラムを通る各種成分の移ＮＢ速度の差に基づくことがで きる。分離は固定相を移動相との間の諸成分の分配によって行なわれる。固定相 に対する諸成分の親和度の差のためＫ、それらは異なる速度において溶離される 。

逆相クロマトグラフィーにおいては、固定相は無極性または疏水性にされる。最 も強い収着は極性浴離剤からおこる。逆相はシリカゲルをクロロアルキルシラン またはアルコキシシランと反応させることによって最もしばしばつくられる。

イオン交換クロマトグラフィは共有結合された解離性官能基を近接可能部位にお いてもつ不溶性マトリックスを含む。官能基は代表的には、カチオン交換にはス ルホン基またはカルボキシル基であり、アニオン交換には三級アミノあるいは四 級アンモニウムの基である。分離はイオン交換マトリックス中の対イオンと溶離 剤中忙溶けている対イオンとに対するイオンの親和性の差に基づく。

化学的に変性された支持体物質をつくるためのクロマトグラフ用支持体物質の化 学的変性はシランカップリング剤の使用を含んでいた。これらの物質の使用はか なりの費用が関係する。

有効な代替物質、特に一層入手しやすくかつ経済的である物質の使用は利点があ り商業的意味をもつ。

！！！ｆｋ生物学的物質の大規模分離の場合において、天童のシランな使用する 際の禁止的コストのためＫ、バッチ式処理は実際的ではなかった。本発明による 方法は生物学的物質のバッチ規模分離を、シランを完全に置換えて安価な有機チ タネートを分離において使用することを開示することによって、商業的に可能と する。

関連技術の記述 各種のヒドロキシ含有物質がクロマトグラフィ用のカラムのための充填物質とし て使用されてきたが、カーボンブラック、アルミナ、および最も頻繁には、シリ カとシリカゲルが含まれる。

シリカゲルは、それが高純度でかつ比表面積、細孔容積および細孔寸法を含めた 各種物理的性質で以てつくることができるので、最も頻繁に使用される吸着剤で ある。それは安価であり、その剛性はカラムクロマトグラフィと薄層クロマトグ ラフィ・プレートにおいてそれを有用なものにする。

シリカゲルへ化合物を化学的に結合することＫより、化学的に変性されたクロマ トグラフ用充填物質が考案された。代表的には、これは有機化合物、特にクロロ またはアルコキシシランを結合させて新しい５ｌ−０−８ｌ結合を形成させるこ とを含む。

ジーまたはトリーハロシランまたは相当するアルコキシシランが代表的に用いら れる。

化学的に変性されたシリカゲル・カラムは漱相で以て被積される慣用的粒子より すぐれた利点をもっている。これらの利点は次のことを含む： ａ）溶離剤は液相で以て飽和される必要がない。

ｂ）前カラム（ｐｒｅｃｏｌｕｍｎ）の省略。

Ｃ）溶離剤からの試料単離において、固定相からの汚染が存在しない。

ｄ）固定相ははぎとることができず、従りて扁流速時の機械的侵蝕の問題を克服 する。

ｅ）傾斜溶離のような各種のプログラミング技法を使用できる。

ｆ）カラム平衡が温度または溶離剤水分のような外的効果による中断を受けにく い。

官能基の適切な選択により、クロロあるいはアルコキシシランを使って特定の応 用のための他の化学的結合固定相を形成させることは仰られている。誘導体の段 階的調製はアルキルまたはアリールスルホン酸基をもつカチオン交換体、および 、アミノ基、ジアルキルアミノ基あるいは四級アンモニウム基をもつアニオン交 換体で以て可能である。

多くのシラン化処理剤が化学的変性充填物質について仰られているが、未だこれ らのシラン類は代表的にはかなりの費用を伴う。シリル化剤の代替物質、特に、 コスト的により有効な代替物は当呆における進歩となる。充填物質用の化学的変 性剤は不発明までは、はとんどもっばらシランに開眼されていた。

ポリマーおよび複合体における充填剤の応用のためのチタンカップリング剤の使 用は４，１４１，７５１；４，１６３，００４；および４，３０８，２９８のよ うな特許において開示されている。

二酸化チタンはクロマトグラフィの応用のための支持物質として長い間認められ てきた。

しかし、不発明までは画業におけるどの場所にも、逆相またはイオンクロマトグ ラフィ分離のための有効なりロマトグラフィ支持体を、シラン化処理剤を完全に ｆ換えてチタネートカップリング剤を使用してつくり得る、という開示は存在し ていなかった。

本発明の一つの目的は、シラン化処理剤に代替するもの、特Ｋ、クロマトグラフ ィ・カラムの新しい系列を可能にする逆相およびイオンクロマトグラフィ用の固 体支持体の新規種類を開示することである。

本発明の一つの目的は、シラン化処理剤に代るものを開示し、かくして、逆相お よびイオン交換クロマトグラフィおよび化学的変性クロマトグラフ用支持体を用 いる関連工程のための１機能的であってしかも比較的安価な分能媒体に基づいた 新規のバッチ分離方法を可能にすることである。

図面の簡単な説明 図１はクロマトグラフィ・カラムの図である。

図２は充填物質が挿入可能カートリッジ中にある、クロマトグラフィ・カラムの 図である。

図３は図２のクロマトグラフィ・カラムとカートリッジの分解組立図である。

図４は挿入可能カートリッジをまた使用するクロマトグラフィ・カラムについて の代替設計である。

図５．６．および７は本発明の有機チタネート処理クロマトグラフィ媒体を用い る、混合物のクシマドグラフィ分離のグラフ的打出しである。

発明の要約 本発明は逆相またはイオン交換クロマトグラフィにおいて有用である有機チタネ ートを結合させたヒドロキシ含有固体支持体または充填用物質を基不にした、ク ロマトグラフィ用カラムおよび薄層クロマトグラフィ・プレートの新規種類を開 示するものである。本発明は、シラン化処理をされた化学的変性固体支持体物質 を全部または一部置換えて、有機チタネート結合固体支持体物質により、化学物 質の逆相またはイオン交換クロマトグラフィ分離を行なうための新規の方法を本 質的には開示している。用語「化学物質」とは有機化学品を含み、そしてまた酵 素、補酵素、プロストグランジン、ステロイド、脂質、アミノ酸、および生命過 程の中に含まれあるいはそれから誘導される他のその種の化学品のような生物学 的化学物質を含むものと理解されるが、それらはすべて別荘であって限定を意味 するものではない。

はイオンクロマトグラフィ分離するための新規のクロマトグラフ用カラムを開示 するものであり、それは、内部室をもち入口オリフィスと出口オリフィスとをも つカートリッジ、 多孔質ヒドロキシ含有物質から成る上記室の内部にある固体支持体物質、 疎水的官能性あるいはイオン化性の部分をもちかつヒドロキシル基との縮合反応 によって上記固体支持体物質へ化学的に結合された有機チタネート。

カートリッジを流体混合物の流路の中に設置するための上記の入口および出口オ リフィスにおける結合手段、から成っている。

容易に明らかなとおり、カートリッジのない固体支持体物質は新しい薄層クロマ トグラフィ・プレートに仕立てることができる。

本発明はまた化学的物質をそれらの疎水性またはイオン化性の成分に基づいて分 離する改善方法を開示している。巨大分子を可逆的に固定することができる化学 的変性支持体物質から成る固定相を使用するタイプのイオン交換または逆相クロ マトグラフィによって分離が達成され、その場合、その改良は、ヒドロキシ含有 支持体物質を提供し； 支持体物質を、六価配位化合物である有機チタネート、あるいは式Ｒｎ−Ｔ１− Ｒ’４−ｎの有機チタネートと反応させ、この式において、 Ｔ１は四価であり、 Ｒｎは酸素を通してチタンへ連結される加水分解性の基であり、かつ、アルコキ シ。

Ｒ′　が疎水性有機官能基であり、かつ、アルコキシ、アリールオキシ、アルキ ルエステル、アクリレート、メタクリレート、アミノ芳香族スルホニル、アルキ ル芳香族スルホニル、ピロホスファト、および、アルキルホスファトから成る群 か次に、有機チタネート反応支持体物質を、一つの成分がイオン化性または疎水 性の官能性をもつ化学物質溶液混合物と、その化学物質を有機チタネート反応支 持体物質へ可逆的に固定するように接触させ； そして、 固定された化学物質をイオン含有溶液または疎水性溶剤で以て溶離する： ことから成る。

詳細説明 図１．　２．　３および４は本発明によるクロマトグラフィ・カラムについての いくつかの設計７示しており、この場合、充填用物質は有機チタネートとの縮合 反応によって結合されたヒドロキシ含有物質であり、逆相またはイオン性分離用 に有用であるクロマトグラフィ・カラムまたはカートリッジの新しい種類を生ず る。

クロマトグラフィ・カラムは代表的には充填用物質で以て満たした管またはカー トリッジ１で構成され、装置、工程容器、おける傾向は固定化カートリッジから 離れ、ホルダー中へ挿入してカラムを形成する取換え可能カートリッジの使用へ 向っている。取換え可能カートリッジは代表的には固体支持体または収着体を内 部にもつ管である。カートリッジは慣用的には端末に押しつけて洩れのないシー ルを形成する端末取付は具をもりている。計器、製造装置あるいは他の容器の流 体流路への連結は直接にホルダー管へなされた。クロマトグラフ用カラム中の充 填物質の取換えは挿入可能カートリッジ概念によりて単純化される。

明瞭化のためおよび本発明の目的のために、用語クロマトグラフィ・カートリッ ジは、図１におけるとおりに有機チタネート結合充填用物質を装填した固定管、 および、新たな置換え可能カートリッジまたは他の小変更を行なった設計である 両方のカラムを包含することが考えられている。

図１において、クロマトグラフィ・カラムは固定カートリッジとして描かれてお り、その中へ有機チタネート結合シリカまたはヒドロキシ含有物質が詰められる 。

図３は図２にあるとおりのカートリッジ概念を使う代表的カラムの分解組立て図 である。有機チタネート結合シリカあるいは個のヒドロキシ含有充填剤はカート リッジｌの中へ圧縮シ。

これをホルダー２の中へ次にはめこむ。また、プレフィルターロマトダラフ用カ ラムを描いており、そのカートリッジの中でホルダー２は二つの部品の集成であ り、レバー３の押下げまたは押上げのいずれかによって、−緒に緊圧および保持 されるか解放される。

本発明はチタン結合クロマトグラフィ媒体を基本にしたクロマトグラフィ・カラ ムの新しい種類を開示している。不発明のクロマトグラフ用物質は表面ヒドロキ シ基との反応によって有機チタネート結合剤と結合され疎水性またはイオン交換 性支持体を生ずるヒドロキシ含有支持体物質である。この有機官能性基は官能基 の適切な選択によって逆相またはイオン性クロマトグラフィにおいて有用である ように選ぶことができる。

固体支持体物質へ結合されるチタンカップリング剤は式％式％ によって特徴つけることができ、式中、ｎは１，２．または３゜好ましくは３で あり、Ｒｚ　は酸素を通してチタンへ結合する疎水性またはイオン化性の有機官 能基であり、Ｒは加水分解時にアルコール基へ転化されるアルコキシ基のような 加水分解性基である。

好ましくは、チタンカップリング剤は式ＲＴｉＲ’３のものであり、ここで、Ｒ とＲ′　は上記定義のとおりである。加水分解性基は通常はアルコキシである。

もし１個より多くのアルコキシ基が置換基である場合にはそれらが同じであるこ とが好ましいけれども同じである必要がないことは明らかである。

Ｒは酸素を通してチタンへ連結される加水分解性基であり。

ぶことができる。

好ましくはＲはインプロポオキシである。

Ｒ′　は疎水性またはイオン化性部分をもつ有機官能性基であり、酸素を経てチ タンへ結合される。Ｒ′は逆相応用の次めかあるいはイオン交換のためかの、最 終的クロマトグラフィ媒体の所望特性を基に選ばれる。例えば、Ｒ′は逆相クロ マトグラフィのためにはジオクチルホスファト、トリー（ジオクチルホスファト ）、あるいはイソステアロイルであることができる。

Ｒ′　はアニオン交換にとってはアルキル基またはアリールアミノ基であること ができる。Ｒ′　はカチオン交換にとって、あるいは疎水性すなわち逆相相互反 応のためには、カーボンホスフェート基であることができる。

ヒドロキシ含有無機または有機質物質、すなわちＸ−０Ｈ１は各種のシリカ、ガ ラス、砂、粘土、ファイバーガラス、シリカゲル、あるいはセルロースあるいは デキストランのような炭水化物、アガロース、あるいは金属酸化物を含む。支持 体の選択はヒドロキシ基の豊富さに基づく。

生成する結合された物質はクロマトグラフィ技法、特にイオン交換クロマトグラ フィおよび逆相りｐマトダラフィにおいて有用であり、従って新しいタイプのク ロマトグラフ用カラムおよびカートリッジの構成を可能にすることが発見された のである。特定のクロマトグラフィ技法にとりての適当性はチタンへ結合される 有機官能性基の性状に依存するものであり、例えば次のものである（ここでＸは シリカのような支持体である）：Ｘ−０−７１−（０−ＣＨ２０Ｈ２−ＮＨ−Ｏ Ｈ２ＣＨ２−ＮＨ２）３アニオン交換 チタネート含有の各種有機官能性基は選択されることができるので、これらのカ ップリング剤は化学的変性クロマトグラフィ支持体を形成する際に選択性を与え る。例えば、以下の有機チタネートはヒドロキシ含有物質へ結合されて以下の応 用にとって有用であるクロマトグラフィ媒体を生ずる：ネート アミノーエチルア　アニオン交換 ネート 傾り１記お生りため のジ（ジオクチル。

水素−ホスファイ ト） クロマトグラフィ媒体にとって有用であるチタネートカップリング剤は以下のよ うなモノアルコオキシチタネートン含む：チタネート イオン交換 以下のようなオキシアセテート・キレート・チタネートもまた有用である： 逆相 オキシアセテート 以下のようなＡＢエチレンキレートチタネートもまた有用である： 次のような配位チタネートカップリング剤もまた化学的変性クロマトグラフ用支 持体を形成するのに有用である。

逆　相 アイト　・（１１Ｐ−（ＯＣ□３Ｈ２７）　３　）　２本発明の有機チタネート 結合クロマトグラフ用媒体は慣用的な化学的変性充填用物質よりすぐれた多くの 利点を提供する。

有機チタネート結合剤はしばしば一段階で、かつ塩素化シラン使用時におこるよ うなりＣ１ガス発生を伴うことなく、結合させることができる。ヒドロキシ含有 表面への結合は代表的には表面を有機チタネートで以て被覆する一段階によって 達成される。

有機チタネートはカップリングを行なわせるようヒドロキシ含有表面へ接触させ る前に溶剤中でとかすことができる。カップリングはおだやかな加熱を通して増 進させることができるが。

ただし、ヒドロキシ含有支持体を有機チタネート中に室温において単純に浸漬す ることがたいていの場合においてカップリングを行なわせるのに適当であること が見出された。いくつかの支持体の場合にはそれらな湿りた条件へカップリング の前に露出してカップリングに利用できる可能なヒドロキシ基の最大数を羅保す ることが有利であるかもしれない。

新規カラム、ｔｊｌｃプレートおよび一連のクロマトグラフ・バッチ分離を形成 させる際に使用するための有機チタネート結合支持体物質はヒドロキシ含有支持 体物質な列記した有機チタネートの一つで以て仮覆するか接触させることによっ てつくることができる。好ましくはトルエンのような溶剤またはイソプロパツー ルのような他の溶剤の中の稀釈有機チタネート溶液が用いられる。ヒドロキシ含 有表面への共有結合的、カップリングが室温においてしばしばおこり得るけれど も、支持体を有機チタネート溶液中に浸し約０．５分間煮沸まで加熱することが 有利であることが発見された。回収される処理した支持体物質を次にカラムまた はカートリッジの中へ詰めるかｔｉｃプレートへ施用することができる。ｔ１ｅ プレートの形成はしかし、ｔＩｔｅプレート全体ヶ有機チタネート溶液中に浸し て仕上がりプレートを処理することにより最もよく達成される。

有機チタネートは代表的には、それらがｉｉ換え得るシラン対抗品より安価につ くることができるので、本発明は大容積のバッチ工程を可能にする。このように 、不発明は有機チタネート結合支持体物質に基づいた新しいクロマトグラフィ・ カラムだけでなく逆相またはイオン交換クロマトグラフィの新しい方法も包括す る。

有機チタネートχ結合させた固定相あるいは支持体物質は、クロマトグラフィ・ カラム中Ｋｆｔかないで、反応容器へ直接に添加することができる。代表的工程 、例えばバッチ工程においては、逆相またはイオン的分離は−まとめで以て達成 され得る。

本発明以前には、シランカップリング剤の使用に付随する経済性がパッチ式処理 ｙ＋’県止的に高価なものにした。本発明は、可逆的に巨大分子を固定すること ができる化学的変性支持体物質から成る固定相を使用するタイプの逆相またはイ オン交換クロマトグラフィによって、溶液混合物から化学物質を分離するための 経済的で改善された方法を開示するものであり、その場合、その改良はシリカ、 ガラス、金属酸化物、あるいはセルロースのようなヒドロキシ含有支持体物質火 打ましくは粉または粒子の形で提供し、次にそのヒドロキシ含有固体支持体物質 をさきに本明細誉において規定した有機チタネートのいずれかと反応させること から成る。

有機チタネート結合支持体物質は、一つの構成分が疎水的またはイオン化性の官 能性をもつ化学物質溶液混合物と接触せしめられ、有機チタネート反応支持体物 質へ標的化学物質の可逆的固定をひきおこさせるようにする。

標的化学物質は次に固体支持体物質とともに回収される。固定された標的化学物 質は他の流体から反応容器中で率離させることができる。標的化学物質はイオン 交換におけるＮａ１ｌのようなイオン性溶液で以て、あるいは逆相分離用の疎水 的溶剤で以て、溶離または沈渣することによって回収することができる。

本発明を以下の実施例によってさらに説明する。

ネオアルコキシトリ（Ｎ−エチルアミノ−エチルアミノ）チタネートをイソプロ パツール中に溶かして１％溶液（１００１７中で１９）を得た。１０９のシリカ ゲル（アミコン、ａｉ２０−４５μｍ、２５０Ａ　の細孔）へ３Ｑｄのチタネー ト浴液を添加した。この懸濁液を５分間煮沸まで加熱し、冷却し、フリット円板 Ａ斗を通して濾過し、イソプロパツールで以て洗滌した。

この処理されたシリカゲルなビオ・レッド■エコツカラム（１ｃｍＸ　１．５ｃ ｍ　）の中に詰めた。この処理されたゲルを−６，８においてｌ０ＭＭ燐酸カリ ウム緩衝液で以て平衡化させた。１ｄのうさぎ血清をカラムへ施用し同じ緩衝液 で以て溶離した。

得られた両分をスイクトロモニター■［１（ＬＤＣ）を使って２８０　ｎｍにお いて追跡しかつ捕集した。二つの主要画分が得られた。両分の純度は既知標準物 に対してＳＤＳゲル電気泳動によって評価した。１５個のバンドを画分１におい て見ることができ、一方１画分２においては６個だけを見ることができ、９５チ 以上の蛋白質がアルブミンバンドの中にある。

チタネート処理シリカゲルの装填容量は高（，２，５１１ｔの充填物上で１−の 純血清を収容した。

前の例の粒径２０−４５μｍの処理されたシリカゲルを−６，８の１０ｍＭの燐 酸カリウム中のスラリーに形成し、４．６ｆｉＸ２５ｃｍのステンレス鋼製カラ ムの中へ充填した。

とのカラムを以下の蛋白質混合物の分離に使った：１）大腸菌蛋白質混合物（λ リプレッサー用に誘導される）２）　ミルク蛋白質 ３）ビオ・レッド■蛋白標準物（シトクロムＣ，ミオグロビン、卵アルブミン、 アルブミン、γ−グロブリン）。

チタネート処理シリカゲルは適度に高い分解力で以て蛋白質混合物を分離するこ とを可能にした。銭聚できる背圧はほとんど認めなかった。シリカゲル粒径な２ ０−４５μｍから５または１０Ｂｍへ変更することによって、分解力は商業的Ｈ ＰＬＣ級アニオン交換体と匹敵するよう増進させることができる。

実施例２ 商業的のシリカゲル薄層クロマトグラフィ・プレートをトルエン中の２％イソプ ロピルトリイソステアロイルチタネートの中で５分間浸漬し、空気乾燥した。プ レートを次に５分間トルエン中で洗滌して未反応イソプロピルトリイソステアロ イルチタネートをすべて除いた。この処理されたシリカゲルはｌ’−Ｔ−シル」 とよぶ。フェルトチップ・インのインキを各プレート上につけ、それらのインキ を展開用溶剤としてアセトニトリルと水の混合物を使って分離した。

表１　ハＴ−シルＴＬＧプレート上のいくつかのインキの分離を商業的の正規相 （ｎｏｒｍａｌ　ｐｈａｓｅ）および進相ＴＬＣプレートと比較して示している 。フェルトチップ・イン用の赤インキおよび緑インキは極性成分を含み、それら はクロロホルム／メタノール（９：１）を含む溶剤系の中で正規相シリカゲル上 で移動しなかった。商莱的逆相ＴＬＧプレート上で、赤インキおよび緑インキの 成分は各々、アセトニトリル／水（５：５）を含む溶剤系を使って、それぞれ二 つの成分に分離された。インプロピルトリイソステアロイルチタネートで処理し たシリカゲル・プレートの上での染料成分の分離は、使用溶剤系がアセトニトリ ル／水（２：８）であること以外は商薬的逆相ＴＬ（３プレート上での分離と類 似であるが、より高価な有機溶剤成分の消費がはるかに少ない。

商業的逆相ＴＬＧプレートおよび商莱的正規相ＴＬＣプレートは高水分溶剤系に かけるときに崩壊した。ゲル表面全体に亀裂が入った。ゲルの崩壊は商莱的逆相 ＴＬＧプレートの場合、５０％以下の有様溶剤を含む溶剤系の中でおこった。

この実籏は明らかに、イソプロピルトリイソステアロイルチタネートによってシ リカゲル・プレートが変性されたのちにおける、正規相挙動の逆相挙動への変化 を示している。それはまた、変性シリカゲルは高水分含量の溶剤系の中で使って 同じ分離結果を達成し得ることを示した。そうすることにより、使用者は高価な 有機溶剤の消費の少ないことで節約が可能である。

商業的正規相ＴＬＣＯ，００，０００，９５クロロホルム／メタノール　９　： 　１　０．１５商業的逆相ＴＬＣ０５７０，６００，００アセトニトリル／水　 ５　：　５　０．６１　０．６５新規Ｔ−シル、逆相ＴＬＣ（１７００，７００ ，００イソプロピルトリ（Ｎ−アミノエチル−アミノエチル）チタネートは一級 および二級の両アミンをもつ有機チタネートであり、シリカゲルへ結合され、ア ニオン交換体として示された。

シリカゲル（２０−４５μｍ、２５０Ａ）　をインプロパツール中のイソプロピ ルトリ（Ｎ−アミノエチル−アミノエチル）チタネートの１％溶液と反応させた 。過剰の有様チタネートをイソプロパツールによる洗滌によって除いた。変性さ れたこのシリカゲル＆１ｃｍＸ４．５−のカラムの中に詰めた。蛋白質分離はこ のカラムで以てｐ）１６．８のｌＱｍＭの燐酸ナトリウム緩衝液で以て溶離する ことによりて達成された。蛋白質溶離物を分光血清試料は二つの主要バンドに分 離された。ＳＤＳゲル電気泳動はその第二が血清アルプミｙを９０−以上の純度 で含むことを示した。

もう一つのカラム、４．６ｍＸ２５σ、に同じイソプロピルトリー（Ｎ−アミノ エチル−アミノエチル）チタネートで変性した物質を話めた。甲状勝グロブリン 、ガンマーダロプリン、卵アルブミン、ミオグロブリンおよびビタミンＢ１２の 混合物をカラムへ施用した。四つの主要バンドが回５に示すとおりに分解された 。

大腸菌粗蛋白質抽出物はイソプロピルトリ（Ｎ−アミノエチル−アミノエチル） チタネート・イオン交換カラムによりて少くとも７個のバンドに分離された（図 ６）。

実施例４ シリカゲル（２０−４５ａｍ、２５０Ａ）をトルエン中の１チイソプロピルトリ イソステアロイルチタネートと一緒に１時間還流させることによって変性した。

過剰の有様チタネートをトルエンで以て流部することによって除いた。

２．４．５−）リクロロフェノキシ酢酸（２，４，５−Ｔ、遊離酸の形で）の水 溶液をｏ、５ＩＩ９の化合物を５−の水にとかすことによってつくった。２，４ ．５−Ｔの水溶液′？：ｆ性シリカｙルと一緒に２分間はげしく混合した。次に 遠心分離によって固体を溶液から分離した。吸着されない２．４．５−Ｔを２８ ６１１ｍにおける吸収によって検定した。２８６　ｎｍにおける吸収の減少は溶 液中の２．４．５−Ｔの減少濃度を示す。処理される溶液中の２．４．５−Ｔの 濃度減少は５０から４００■の範囲の添加された変性シリカダルの量に比例した 。８０％をこえる２、４．５−Ｔがこの変性シリカダルによって吸着された。非 変性シリカ２ルによる平行実験は、吸着がおこらないことを示した。ｊｌｉＬｆ ｔ１シリカダルによる水の吸着に基づいて２，４．５−Ｔ濃度の増加すら存在す る。処理されたシリカダルへ吸着された物質は非極性有機溶剤によりて固体から 溶離されてもよい。

実＃Ａ例５　逆相液体クロマトグラフィ５０９のシリカダル（２０−４５ａｍま たは１０ａｍ、２５ＯＡ）を０．１ＭＨＧ１　の２００ｄ中で９０℃において密 封瓶中で少くとも２４時間加熱してシラノール基の蕗出を最大にした。

このシリカダルをフリット円板漏斗を通して炉遇し、中性まで洗滌した。この酸 処理シリカダルを次に１５０℃で少くとも８−１２時間乾燥して水の痕跡を除い た。乾燥シリカダルを乾燥トルエン中の２チイソプロビルトリインステアロイル チタネートで以て速流させた。この処理シリカダルをトルエンで以て洗滌し、乾 燥した。端にキャップをつけた充填物の中で、このシリカダルをトルエン中の２ チクロロトリメチルシランとさらに反応させた。この物質を次にトルエンで洗滌 し乾燥した。この処理されたシリカ２ルをアセトニトリル中でスラリー化し、ア ルテッシスφポンプを使用しりザーバー拳パッカー（ｒｅｓｅｒｖｏｉｒｐａｃ ｋθｒ）で以て４．６冨ＩＸ　２５ｃＩＩＬのカラムの中に詰めた。

ｐ−ニトロベンズアルデヒド、ｍ−ニトロアセトアニド、ｐ−ニトロ−アニソー ルｔモデル化合物として使い１０μｍのイソプロピルトリイソ−ステアロイルチ タネート変性シリカダル（Ｔ−シル）を話めたカラムの性能を評価した。三つの 成分の分離は溶剤系としての水中５チアセトニトリルにおいてｌｄ／分で最もよ く達成された。アセトニトリルを１０チヘ増しあるいは流速を２−７分に減らす ことはに′とアルファ１１Ｙ減少させた（　Ｋ／−溶剤前線と比べた溶質の相対 的移動；アルファ値−二つの溶質の相対的移動） 分離は商業的逆相シリカダル（２０−４５μｍ、アミコン）と商業的の０１８− シリカダルカラム（ラディアルバック、１０μｍ）とで以て比較した。水中で５ ％のア七ト二トリルの溶剤系を用いると、Ｔ−シルカラム上でのモデル化合物の 分離はＣ１８シリル化逆相カラム上の分離と類似であった。商粟的逆相カラム（ ラジアル−パック）上のニトロ化合物の分離はＴ−シル・カラム上で得られる分 離と類似であり、ただしＴ−シルについてははるかに低い有機溶剤比ですんだ（ 商業的逆相充填における場合の５０チに対して２０％のアセトニトリル）。Ｔ− シル（粒径−１０＃）上での分解力はラジアルパック（粒径−２０−４５＃）よ り良好である（図７）。

本発明の原理、好ましい具体化、および操作方式は前記明細中において述べてき た。ここで保護されることを期待する不発明はしかし、開示される特定の形に限 定されるものと考えるさきものではなく、なぜならば、これらは解説用であって −ｊ扼を意味するものではないからである。変形と変更は画架熟練者により不発 明の襦袢と領域からはずれることなくなし得るものである。

ＦＩＧ、　４ 将七器：　ＺａＯゎ□ τ−ンｌしｊｒ！１）：Ｃ＋６−シリル・シリカ’ｒ”ＡＪＨＰＬｃ式＃ｒａ＊ 手続補正書 １、事件の表示 ＰＣＴ／ＵＳ８７１００８９６ ２、発明の名称 クロマトグラフ装置と方法 ３、補正をする者 名　称　バラチル囃ディベロブメント・コーポレーション４、代理人 住　所　東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大手町ビル　２０６号室 ５６補正の対象 国際調査報告 ＡＮＮＥＸ　Ｔｏ　ＴｋｉＸＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡ！、　５ＥＡＲＣＨＲＥ ＰＯＲＴ　０ＮＩＮＴＥＲＮＡＴ！０ＮＡｔ、ＡＰＰ（ＪＣＡＴＩＯＮ　Ｎｏ、 　ＰＣＴ／ＵＳ　Ｉａ７１０Ｏ８９６（ＳＡ　１７１１１）υＳ−＾−４５２０ １２２　２θ７ｏｓ／ａｓ　Ｎｏｎａ

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. １．混合物からの化学物質の逆相クロマトグラフィ分離のためのクロマトグラフ カラムであって、 内部室をもちかつ入口オリフィスと出口オリフィスとをもつカートリッジ、 多孔質ヒドロキシ含有物質から成る、上記室内部の固体支持体物質、 疎水的官能性をもちかつヒドロキシ基との縮合反応によって上記固体支持体物質 へ化学的に結合された有機チタネート、上記カートリッジを流体混合物の流路の 中に設置するための上記の入口オリフィスおよび出口オリフィスにおける結合手 段、 から成るクロマトグラフカラム。
2. ２．有機チタネートが式 Ｒｎ−Ｔｕ−Ｒ′４−ｎ の４価チタネートであり、式中、 ｎは１，２，または３であり、 Ｒｎは酸素を通してチタンへ連結される加水分解性基であり、かつ、アルコキシ 、▲数式、化学式、表等があります▼、および▲数式、化学式、表等があります ▼から成る群から選ばれ、 Ｒ′が酸素を通してチタンへ連結される疎水性の有機官能性基であり、かつ、ア ルコキシ、アリールアルコキシ、アルキルエステル、アクリレート、メタクリレ ート、アルケニルエステル、アルキルホスファト、アルキルピロホスファト、ア ミノアルコキシ、アミノアルキルアリールエステル、アミノアリールスルホニル 、およびアルキルアリールスルホニル、から各々独立に選ばれる、 請求の範囲第１項に記載のクロマトグラフカラム。
3. ３．有機チタネートが式 Ｒ４Ｔｉ・Ｒ′２ の６価配位チタネート化合物であり、式中、Ｒが酸素を通してチタンへ連結され る加水分解性基であり、かつ、アルコキシとアリルオキシアルコキシとから独立 に選ばれ、 Ｒ′がイオン化性有機官能性基でありかつアルキルホスフィットである、 請求の範囲第１項に記載のクロマトグラフィ・カラム。
4. ４．固体支持体物質がシリカ、ガラス、砂、粘土、ファイバーガラス、セルロー ス、および金属酸化物から成る群から選ばれる、請求の範囲第１項に記載のクロ マトグラフカラム。
5. ５．混合物から化学物質をイオン的クロマトグラフィ分離のためのクロマトグラ フカラムであり、 内部室をもちかつ入口オリフィスおよび出口オリフィスをもつカートリッジ、 多孔質のヒドロキシ含有物質から成る、上記室中内の固体支持体物質、 イオン化性官能性をもち、かつ、ヒドロキシ基との縮合反応によって上記固体支 持体物質へ化学的に結合された有機チタネート、 上記カートリッジを流体混合物の流路中に設置するための上記入口オリフィスお よび出口オリフィスにおける結合手段、から成るクロマトグラフカラム。
6. ６．有機チタネートが式 Ｒｎ−Ｔｉ−Ｒ′４−ｎ の４価チタネートであり、式中、 ｎは１，２，または３であり、 Ｒｎは酸素を通してチタンへ結合された加水分解性基であり、かつ、アルコキシ 、▲数式、化学式、表等があります▼、および▲数式、化学式、表等があります ▼から成る群から選ばれ、 Ｒ′は酸素を通してチタンへ連結された疎水性の有機官能性基であり、アルコキ シ、アリールアルコキシ、アルキルエステル、アクリレート、メタクリレート、 アルケニルエステル、アルキルホスファト、アルキルピロホスファト、アミノア ルコキシ、アミノアルキルアリールエステル、および四級アンモニウム塩から各 々独立に選ばれる、請求の範囲第５項に記載のクロマトグラフカラム。
7. ７．固体支持体物質がシリカ、ガラス、砂、粘土、ファイバーガラス、セルロー スおよび金属酸化物から成る群から選ばれる、請求の範囲第５項に記載のクロマ トグラフカラム。
8. ８．混合物から化学物質の逆相クロマトグラフ的分離を行うための薄層プレート であり、 多孔質のヒドロキシ含有物質から成る固体支持体物質、疎水的官能性をもちかつ ヒドロキシ基との縮合反応によって上記固体支持体物質へ化学的に結合された有 機チタネート、から成る薄層プレート。
9. ９．有機チタネートが式 Ｒｎ−Ｔｉ−Ｒ′４−ｎ の４価チタネートであり、 ｎは１，２，または３であり、 Ｒｎは酸素を通してチタンへ連結される加水分解性基であり、かつ、アルコキシ 、▲数式、化学式、表等があります▼、および▲数式、化学式、表等があります ▼から成る群から選ばれ、 Ｒ′は酸素を通してチタンへ連結された疎水性の有機官能性基であり、かつ、ア ルコキシ、アリールアルコキシ、アルキルエステル、アクリレート、メタクリレ ート、アルケニルエステル、アルキルホスファト、アルキルピロホスファト、ア ミノアルコキシ、アミノアルキルアリールエステル、アミノアリールスルホニル 、および、アルキルアリールスルホニルから各々独立に選ばれる、 請求の範囲第８項に記載の薄層クロマトグラフプレート。
10. １０．固体支持体物質がシリカ、ガラス、砂、粘土、ファイバーガラス、セルロ ース、および金属酸化物から成る群から選ばれる、請求の範囲第８項に記載の薄 層クロマトグラフィ・プレート。
11. １１．有機チタネートが式 Ｒ４Ｔｉ・Ｒ′２ の六価配位チタネート化合物であって、式中、Ｒが酸素を通してチタンへ連結さ れる加水分解性の基であり、かつ、アルコキシとアリルオキシアルコキシから独 立に選ばれ、 Ｒ′がイオン化性有機官能基でありかつアルキルホスフィットである、 請求の範囲第８項に記載の薄層クロマトグラフィ・プレート。
12. １２．混合物から化学物質のイオン交換クロマトグラフ的分離を行なうための薄 層プレートであって、 多孔質のヒドロキシ含有物質から成る固体支持体物質、イオン化性官能性をもち かつヒドロキシ基との縮合反応によって上記固体支持体物質へ化学的に結合され た有機チタネート、 上記カートリッジを流体混合物の流路中に設置するための、上記入口オリフィス および出口オリフィスにおける連結手段、から成る薄層プレート。
13. １３．有機チタネートが式 Ｒｎ−Ｔｉ−Ｒ′４−ｎ の４価チタネートであり、式中、 ｎは１，２，または３であり、 Ｒｎは酸素を通してチタンへ結合された加水分解性基でありかつアルコキシ、▲ 数式、化学式、表等があります▼、および▲数式、化学式、表等があります▼か ら成る群から選ばれ、 Ｒ′は酸素を通してチタンへ連結された疎水的有機官能基であり、かつ、アルコ キシ、アリールアルコキシ、アルキルエステル、アクリレート、メタクリレート 、アルケニルエステル、アルキルホスファト、アルキルピロホスファト、アミノ アルコキシ、アミノアルキルアリールエステル、および四級アンモニウム塩から 各々独立に選ばれる、請求の範囲第１２項に記載の薄層クロマトグラフプレート 。
14. １４．固体支持体物質がシリカ、ガラス、砂、粘土、ファイバーガラス、セルロ ースおよび金属酸化物から成る群から選ばれる、請求の範囲第１２項に記載の薄 層クロマトグラフプレート。
15. １５．巨大分子を可逆的に固定することができる化学的に変性された支持体物質 から成る固定相を使用するタイプの逆相クロマトグラフィにより溶液混合物から 疎水性化学物質を分離するための方法において、 ヒドロキシ含有支持体物質を提供し； その支持体物質を式 Ｒｎ−Ｔｉ−Ｒ′４−ｎ の有機チタネートと反応させることによってヒドロキシ含有固体支持体物質を疎 水性的に変性し、この式においてＲｎは酸素を通してチタンへ連結される加水分 解性基であり、かつ、アルコキシ、▲数式、化学式、表等があります▼、および ▲数式、化学式、表等があります▼から成る群から選ばれ、 Ｒ′は酸素を通してチタンへ連結される疎水性有機官能基であり、かつ、アルコ キシ、アリールアルコキシ、アルキルエステル、アクリレート、メタクリレート 、アルケニルエステル、アルキルホスファト、アルキルピロホスファト、アミノ アルコキシ、アミノアルキルアリールエステル、アミノアリールスルホニル、お よびアルキルアリールスルホニルから独立に各々選ばれ； この疎水性に変性された支持体物質を、一成分が疎水官能性を有する化学物質の 溶液混合物と接触させて有機チタネートと反応させた支持体物質へ疎水的官能性 で以て化学物質を可逆的に固定し； 固定された疎水性化学物質を溶離する；ことを特徴とする方法。
16. １６．巨大分子を可逆的に固定することができる化学的に変性された支持体物質 から成る固定相を使用するタイプのイオン交換クロマトグラフィにより溶液混合 物からイオン化性化学物質を分離するための方法であって、 ヒドロキシ含有支持体物質を提供し； 支持体物質を式 Ｒｎ−Ｔｉ−Ｒ′４−ｎ の有機チタネートと反応させ、式中、 Ｒｎは酸素を通してチタンへ連結される加水分解性基であり、かつアルコキシ、 ▲数式、化学式、表等があります▼、および▲数式、化学式、表等があります▼ から成る群から選ばれ、 Ｒ′が酸素を通してチタンへ連結される疎水性有機官能性基であり、かつ、アル コキシ、アリールアルコキシ、アルキルエステル、アクリレート、メタクリレー ト、アルケニルエステル、アルキルホスファト、アルキルピロホスファト、アミ ノアルコキシ、アミノアルキルアリールエステル、および四級アンモニウム塩か ら各々独立に選ばれ；有機チタネートと反応させた支持体物質を、それヘイオン 化性官能性で以て化学物質を可逆的に固定するようイオン化性官能性を構成成分 の一つがもつ化学物質溶液混合物と、接触させ； 固定化された化学物質をイオン性溶液で以て溶離する；ことを特徴とする方法。
17. １７．有機チタネートが式 Ｒ４Ｔｉ・Ｒ′２ の六価配位チタネートであり、式中、 Ｒは酸素を通してチタンへ連結される加水分解性基であり、かつアルコキシおよ びアリルオキシアルコキシから独立に選ばれ、 Ｒ′はイオン化性有機官能性基であり、かつアルキルホスファイトである、 請求の範囲第１６項に記載の方法。