JPH012589A - 高度不飽和脂肪酸含有ジアシルグリセロ−ルの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は高度不飽和脂肪酸（以下、ＰＵＦＡという）を
Ｓｎ−２位に含有するジアシルグリセロール（以下、Ｄ
Ｇという）の製造方法に関するものである。

〔従来の技術〕

天然ＤＧは脂質の代謝過程で生成され、生体脂質から必
ず発見される微量成分である。ＤＧは立体特異性からＳ
ｎ−１・２型、２・３型、１・３型が存在することが知
られている。これらの個々の立体特異的異性体の合成や
分離が従来から検討されてきた。Ｓｎ−１・２型と２・
３型はβ−ＤＧと一般に呼ばれ、この両者は旋光度でも
識別することは困難とされている。

しかもこの両者は分析的にも分離できない。Ｓｎ−１・
３型はα−ＤＧと一般に呼ばれ、β−ＤＧとの分離は容
易であり、　β−ＤＧのＳｎ−２位の脂肪酸のアシル転
移により生成する。

天然に存在するＤＣはＳｎ−１・２型であり、構成する
脂肪酸は多成分であるため、ＤＧの分子種は複雑であり
、特定の分子種のみを単離することは難しい。

このＤＧは総脂質中でトリアジルグリセロール（以下、
ＴＧという）、モーノアシルグリセロール（以下、ＭＧ
という）、コレステロールエステルおよび遊離コレステ
ロール等とともに単純脂質中に見出される。特に最近の
生化学の進歩により、これらの単純脂質もリン脂質や糖
脂質等の極性脂質とともに細胞膜を形成していることが
知られ、ＤＧも細胞表面で刺激に対応して細胞の活性化
因子として働くことも明らかになっている。そのため従
来の蓄積脂肪であるＴＧの前駆体としてのＤＧの役割の
他に。

新しい生理活性の検討が行われている。現在までに発見
されている生理活性には神経細胞のリン脂質合成能の回
復、ガン細胞の正常誘導などが認められている。

生理活性を有するＤＧは、細胞膜に共存して複雑な生理
機能を支配しているリン脂質とグリセロール骨格の立体
特異性が共通である。すなわち生理活性を有するＤＧは
Ｓｎ−１・２型であり、Ｓｎ−１位はパルミチン酸やオ
レイン酸のような飽和またはモノエン酸が主体で、　Ｓ
ｎ−２位はアラキドン酸、　ＥＰＡ（エイコサペンタエ
ン酸）、ＤＨＡ　（ドコサヘキサエン酸）のようなＰＵ
ＦＡが主体となる分子種である。

ＰＵＦＡは水産動物の脂肪組織、哺乳動物の臓器や血球
に見出されるが、主にＴＧやリン脂質として存在し、Ｄ
Ｇとしての存在量は非常に少ないので、ＰＵＦＡを含有
するＤＧを分画する原料には不適である。

一方、Ｓｎ−１位とＳｎ−２，位にそれぞれ別の脂肪酸
が組み込まれたＳｎ−１・２０Ｇを合成する方法がすで
に知られている（桑田勉、改稿油脂化学、合波文庫、Ｐ
、１１１〜１１７．１９６３、合波書店）。この方法に
よりグリセロールのＳｎ−２位にＰＵＦＡを結合した混
酸基ＤＧ（以下、２Ｐ−ＤＧという）の合成を行うとす
れば、次のような方法となる。まずα−モノクロルヒド
リンの一級水酸基をＰＵＦＡ以外の脂肪酸のクロライド
でアシル化し１次いでＰＵＦＡクロライドでＳｎ−２位
をアシル化する。さらにこのアシル化物を硝酸銀処理、
希酸処理を経由して目的物を合成する。

〔発明が解決しようとする問題点〕

しかし、このような従来法では次の問題点がある。

■脱りロライドで生成する水酸基がＳｎ−２位に転位し
、多量のＳｎ−１・３０Ｇを生成する。

■目的物中にＳｎ−１・２０ＧとＳｎ−２・３０Ｇが混
在し、両者を識別できない。

■脂肪酸のクロライド化に際し、化学変化に弱いＰＵＦ
Ａのクロライド化に対する配慮がなされていないので、
目的物中のＰＵＦＡの二重結合に異性化が生じ易い。

そのため得られるＤＧは細胞レベルの実験で、厳しい立
体構造の識別を行う酵素やレセプターに対して正確に認
識されない。

現在、脂質の生合成過程でＳｎ−２位にＰＵＦＡを含有
するＤＧが絶えず産生されていることは証明されている
が、この立体特異性を保持して生理作用を発揮できるＤ
Ｇの効率良い合成法や単離法は見当らない。

本発明の目的は、高収率で、できるだけ簡単な工程によ
りＰＵＦＡをＳｎ−２位に含むＤＧを製造する方法を提
案することにある。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明は、 （Ａ）グリセロホスホコリンと飽和脂肪酸またはモノエ
ン脂肪酸を反応させて１．２−ジアシル−Ｓｎ−３−グ
リセロホスホコリンを得る工程、 （Ｂ）　１．２−ジアシル−Ｓｎ−３−グリセロホスホ
コリンをホスホリパーゼＡ２により処理してｌ−アシル
−Ｓｎ−３−グリセロホスホコリンを得る工程、（Ｃ）
　ｔ−アシル−Ｓｎ−３−グリセロホスホコリンと高度
不飽和脂肪酸を反応させて１−アシル−２−高度不飽和
脂肪酸−３ｎ−３−グリセロホスホコリンを得る工程、
および （Ｄ）１−アシル−２−高度不飽和脂肪酸−３ｎ−３−
グリセロホスホコリンをホスホリパーゼＣにより処理し
て１−アシル−２−高度不飽和脂肪酸ジアシルグリセロ
ールを得る工程 を含む高度不飽和脂肪酸含有ジアシルグリセロールの製
造方法である。

本発明で用いるグリセロホスホコリン（以下、ＧＰＣと
いう）は一般にＬ−α−ＧＰＣと呼ばれるもので、系統
名はＳｎ−グリセロール−３−ホスホリルコリンであり
、立体特異的（Ｓｎ番号）にグリセロールの３位がホス
ホリルコリンによって覆われており、１位、２位は遊離
水酸基となっている。このようなＧＰＣは天然ＰＣをテ
トラブチルアンモニウムヒドロキシドで脱アシル化し、
遊離状態ではメタノール溶液として、また結晶状態では
塩化カドミウム複合体として回収することができる。こ
のＧＰＣのアシル化は遊離状態でも結晶状態でも反応は
進行するので、化学構造や」ノに料としての入手からも
好ましい原料である。

また飽和脂肪酸またはモノエン脂肪酸は炭素数１０以上
のものが好ましく５例えばカプリン酸からメリシン酸ま
での飽和脂肪酸やミリストオレイン酸からネルボン酸ま
でのモノエン脂肪酸などがあげられるが、生体組織中に
見出されるミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸
、オレイン酸などが特に好ましい。このような飽和脂肪
酸やモノエン脂肪酸は純度９０％以上の工業製品が市販
されており、特に生理活性を有するＤＧのＳｎ−１位か
ら見出されるパルミチン酸やオレイン酸は純度９９％以
上の市販品が市販されている。

本発明で使用するＰＵＦＡは炭素数１８以上、不飽和結
合が３個以上のものが好ましく、例えばγ−リルン酸、
ジホモーγ−リルン酸、アラキドン酸、ＥＰＡ、ドコサ
ペンタエン酸、ＤＩＩＡ等があげられる。

これらのＰＵＦＡの内、ジホモ−Ｙ−リルン酸、アラキ
ドン酸等も高純度品が市販され、また脳、肝臓。

血球等にも存在し、その分離法も数多く提案されている
。ＥＰＡ、ドコサペンタエン酸、ＤＩＩＡ等は魚油、卵
黄リン脂質、脳等に存在し、加水分解、尿素付加、分子
蒸留、カラムクロマトグラフィー等を組合せることによ
り、高純度品が単離できる。

上記の各脂肪酸は酸無水物、Ｍ塩化物、酸イミダゾール
塩等に変換して用いられる。また上記の各脂肪酸を用い
て、後述の製造工程を経ても、不飽和脂肪酸は二重結合
の位置異性化や幾何異性化を生ぜず、■−飽和脂肪階ま
たはモノエン脂肪酸−２−ＰＩＪＦＡ・ＯＧが得られる
。特にＰＵＦＡは誘導化に際して二重結合のマイグレー
ションが生じ易いため２反応生成物のチエツクを行った
ところ、マイグレーションは認められなかった。出発原
料から目的物までの二重結合のマイグレーションのチエ
ツクは。

ＩＲ（１０５６〜！Ｊ４０ｃｍ−’　：孤立トランス異
性体量）　、　ＵＶ（２３３ｍμ＝共役ジエン酸量、２
６８ｍμ：共役トリエン酸）で行い、目的物はＦＡロー
託〔に十旧“で分子量を確認後、加水分解して得たｒ’
ＵＦＡは、ジアゾメタンでエステル化し、キャピラリー
カラムＧＣで二重結合のマイグレーションに基因するア
ーティファクト（人工的生成物）のないことを確認した
。

１’ＵＦＡ含有ＤＧは次の製造工程で製造される。まず
（Ａ）工程において、　ＧＰＣ単独またはＧＰＣ−塩化
カドミウム複合体と、Ｓｎ−１位に組込みたい飽和脂肪
酸またはモノエン脂肪酸の酸無水物、酸塩化物、酸イミ
ダゾール塩等とを、例えばジメチルアミノピリジン等の
塩基性アミン触媒下で反応させ、精製して１．２−ジア
シル−Ｓｎ−３−ＧＰＣ（以下、　０ＡＰＣという）を
得る。次に（８）工程において、上記の０ＡＰＣをヘビ
毒ホスホリパーゼＡ２により処理して、Ｓｎ−２位を特
異的に加水分解し、精製後ｌ−アシル−Ｓｎ−３−Ｇｆ
’Ｃ（リゾＰＣ）を得る。次に（Ｃ）工程において、上
記のリゾｐｃと、Ｓｎ−２位に組込みたいＰＵＦＡとを
、　（Ａ）工程と同様に反応させ、精製してｌ−アシル
−２−ＰＵＦＡ−Ｓｎ−３−ＧＰＣ（以下、ＰＵＦＡ−
ＰＣという）を得る。さらに（Ｄ）工程として、上記の
ＰＵＦＡ−ＰＣをＰＣ分解型のホスホリパーゼＣにより
処理して、　Ｓｎ−３位のグリセロールの水酸基とホス
ホコリン基を結ぶリン酸ジエステル結合を加水分解し、
これを精製してＳｎ−１−アシル−２−ＰＵＦＡ−ＤＧ
を得る。

本発明において用いるホスホリパーゼＣは一種のホスホ
ジェステラーゼで、グリセロリン脂質やスフィンゴミエ
リンのリン酸ジエステル結合を加水分解し、ＤＧやセラ
ミドとリン酸モノエステルを生成する一群の酵素の総称
である。この酵素は基買時異性からｐｃ分解型、スフィ
ンゴミエリン分解型およびホスファチジルイノシトール
分解型の３種が存在するが、細菌が菌体外酵素として分
泌するｐｃ分解型を使用するのが好ましい。ｐｃ分解型
のホスホリパーゼＣの起源としては、Ｃｌｏｓｔｒｉｄ
ｉｕｍｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓや［１ａｃｉｌｌｕｓ　
ｃｅｒｅｕｓ等が知られ、市販品もある。

本発明において製造する２Ｐ−ＤＧはＳｎ−１位および
Ｓｎ−２位の組合せにより種々の化合物があり、代表的
な化合物として、　Ｓｎ−１−オレイル−２−ドコサヘ
キサエン、Ｓｎ−１−バルミトイル−２−ドコサヘキサ
エン、Ｓｎ−１−ステアロイル−２−アラキドン、Ｓｎ
−１−ミリストイル−２−エイコサペンタエン、Ｓｎ−
１−バルミトイル−２−アラキドンなどがあげられる。

本発明によって製造される２Ｐ−ＤＧは、細胞賦活効果
の他に未分化細胞（例えば癌細胞等）の正常細胞への分
化誘導作用や神経細胞のリン脂質台−成能の加齢低下に
対する合成能回復作用等を有しており、いずれも細胞膜
流動性を変化させる薬剤として利用できる。

〔発明の効果〕

本発明の方法によれば、細胞内でホルモン刺激に応じて
産生され、カルシウムイオン存在下に蛋白リン酸化酵素
を活性化させホルモン作用を発現するＳｎ−２位にＰＵ
Ｆ＾を有するＳｎ−１・２０Ｇを天然の立体特異性を維
持したまま、高収率で製造することができる。

〔実施例〕

以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。

実施例１ オレイン酸５．０　ｇ　（１７，７ａ＋Ｍ）を無水四塩
化炭素３０ｖａｎに溶解後、ジシクロへキシルカルボジ
イミド１．６　ｇ　（７，８ｍＭ）を添加し、４０℃で
４時間攪拌した。

析出したジシクロへキシルウレアを濾過して除き、濾液
を減圧下、室温にて除去し、油状の無水オレイン酸４．
１ｇを得た。得られた無水オレイン酸全量にジメチルス
ルホキシド５０ｍｆｌを添加した液に、ＧＰＣ１ｇ　（
３，９＋ａＭ）およびジメチルアミノピリジン１．０５
　ｇ　（８，６ｍＭ）を加え、５０℃で４時間激しく攪
拌した。反応後洗澱物を濾別し、四塩化炭素を留去して
得られた粗ＰＣをメタノール／クロロホルム混合溶媒に
溶解し、イオン交換樹脂アンバーライトＩＲＣ−５０、
ＩＲＡ−４５（ローム・アンド・ハース社製、商品名）
を各５ｇ加えて触媒を除去した。メタノールを留去して
再び粗ＰＣを得て、この粗ＰＣをシリカゲルカラムに付
し、クロロホルム／メタノール／水（６５／２５／４、
Ｖ／Ｖ／Ｖ）混液にて溶出し、ジオレイ／Ｉ／ＰＣ３，
０ｇを得た。このものの分析値は次の通りである。

ＦＡＢ−ＭＳ　：　　（阿＋ＩＩ）”　　７８５ＴＬＣ
：クロロホルム／メタノール／水（６５／２５／４、Ｖ
／Ｖ／Ｖ）　Ｒｆ値＝０．３０ 上記のジオレイルＰＣ３ｇを脱水ジクロルメタン１５−
に溶解し、この溶液にハブ毒ホスホリパーゼＡ２（Ｔｒ
ｉｍｅｒｅｓｕｒｕｓ　ｆｌａｖｏｖｉｒｉｄｉｇ、和
光紬薬工業（株）ｆｌｌ）　６　ｍｇ、０．１Ｍ塩化カ
ルシウム溶液２ｍ（１，０，２阿トリス−塩酸緩衝液３
ａＱを添加して、３７℃で振盪しながら一品夜反応させ
た。エタノールで反応を止め、Ｂｌｉｇｈ−Ｄｙｅｒ法
により抽出した。抽出液を留去した後、アセトンで洗っ
て遊離脂肪酸を除き粗リゾＰＣ２，８ｇを得た。粗リゾ
ＰＣをシリカゲルカラムに付し、クロロホルムｌメタノ
ール／水（６５／２５／４）混液にて溶出し、Ｓｎ−１
−オレイル−ＧＰＣ２，５ｇを得た。このものの分析値
は次の通りである。

ＦＡＲ−ＭＳ　：　（Ｍ＋１１）”　５１９ＴＬＣ：ク
ロロホルム／メタノール／水（６５／２５／４、Ｖ／Ｖ
／Ｖ）　Ｒｆ値＝０．１２ ＤＨＡ　１０　ｇ　（３０，５ｍＭ）にジメチルホルム
アミド１．１ｇ　（１５，３ｍＭ）とオキシ塩化リン３
．３　ｇ　（２１，３１）の混液を３８℃に保持しなが
ら１時間かけて滴下した。

さらに窒素気流下で３０分間反応させた。窒素気流下、
８０−１００℃で減圧蒸留して叶Ａクロライド８ｇを得
た。このものの分析値は次の通りである。

ＩＲ：　１０５０〜９４０ｃｍ−’　　トランス酸痕跡
ＵＶ　：　２３３ｍ　ｐ　共役ジエン酸４％２６８ｍμ
共役トリエン酸痕跡 過酸化物量：電位差滴定法　２２ｍｅｑ／ｋｇキャピラ
リーカラムＧＣ二カーボワックス２０Ｍ液相、５０ｍ、
２００℃ 加水分解して得たＤＨＡをジアゾメタンでメチル化して
測定した。二重結合のマイグレーションに基因するアー
ティファクトは認められなかった。

■−オレイルーＧＰＣＩ　ｇ　（１，９ｍＭ）　を、Ｄ
■Ａクロライド１．２６　ｇ　（３，６ｍＭ）を溶かし
た脱水ジクロルメタン溶液１５−中に加え、さらにジメ
チルアミノピリジン０．２５６　ｇ　（２，１ｍＭ）を
加え、３７℃で振盪しながら一昼夜反応させた。室温放
冷後、脱水アセトン４０＋ａＱを添加して振り混ぜると
白色沈澱が生じた。得られた白色沈澱はクロロホルム／
メタノール（２／１、Ｖ／Ｖ）混液５０ｍＱに溶解して
シリカゲルカラムに付し、クロロホルム／メタノール／
水（６５／２５／４、Ｖ／Ｖ／Ｖ）混液にて溶出し、Ｓ
ｎ−１−オレイル−２−ＤＩＩＡ−（ｉＰｃ　１．５　
ｇを得た。このものの分析値は次の通りである。

ＦＡＩＩ−ＭＳ　：　（Ｍ＋旧＋８３ｉＴＬＣ：クロロ
ホルム／メタノール／水（６５／２５／４、Ｖ／Ｖハ）
　Ｒｆ値＝０．３２ 得られたＳｎ−１−オレイル−２−ＤＩＩＡ−ＧＰＣの
一部７００゜を８００μＱのメチルアルコールに溶解し
、この溶液に細菌ホスホリパーゼＣ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄ
ｉｕｍｐｓｒｆｒｉｎｇｅｎｓ起源、生化学工業（株）
１１）を４００ｕｎｉｔ、０．２Ｍトリス−塩酸緩衝液
（Ｐ１１７．４）を６＠Ｑ、０．０５Ｍ塩化カルシウム
を３．５ｍ＋１１、エチルエーテルを４＠Ｑ加えた。反
応混合物をスクリューキャップ付２０＋＋Ｑの試験管中
にテフロンスターターバーと共に加えて３５℃で１時間
激しく攪拌しながらインキュベートした。反応混合物に
エチルエーテルを１２＠Ｑ加えてから分液ロートに移し
、抽出後、窒素気流下で濃縮した。この中にアセトン１
ｖＱ加えて沈澱除去し、硫酸ナトリウムで脱水し、窒素
気流下で脱溶媒して、Ｓｎ−１−オレイル−２−ＤＨＡ
−ＤＧ　５５０．を得た。このものの分析値は次の通り
である。

外ｌｌ！：淡黄色透明の油状液体 溶解状態：ヘキサン、クロロホルムに可溶水に不溶 ＴＬＣ：■クロロホルム／メタノール／水（６５／２５
／４゜Ｖ／Ｖ／Ｖ）　Ｒｆ値＝０．８ ■クロロホルム／アセトン／メタノール（９０／９１１
、Ｖ／Ｖ／Ｖ）　Ｒｆ値＝０．６５（Ｒｆ値０．６５は
標準体の未蒸留胚中のＳｎ−１、２０Ｇ　；−般名β−
ＤＧの位置に相当した。〕 ■、■の呈色反応はドラーゲンドルフ試薬とディトマー
・レスター試薬に対し陰性で、ヨウ素、過マンガン酸カ
リ、硫酸に対し陽性であった。

ＨＰＬＣ：　ＯＤＳカラム、メタノール１　ａｈａ／ｗ
ｉｎ単一ピーク キャピラリ−ＧＣ：カーボワックス　２０Ｍ液相、５０
ｍ、２００℃ 加水分解した得た脂肪酸をジアゾメタンでメチル化して
測定した。オレイン酸とＤＨＡが主成分であり、二重結
合のマイグレーションに基因するアーティファクトは認
められなかった。

過酸化物址：電位差滴定法　３８ｍｅｑ／ｋｇ実施例２ パルミチン酸６．０　ｇ　（２３，６ｍＭ）　を無水ト
リフルオロ酢酸９．８　ｇ　（４６，７ｍＭ）に添加し
、３８℃で１時間攪拌した。窒素気流下、攪拌しながら
徐々に加熱し。

温度が８５℃に達してから５〜５０ｍ１１ｇで無水トリ
フルオロ酢酸を除去して白色粉末の無水パルミチン酸５
．６ｇを得た。得られた無水パルミチン酸全量にジメチ
ルスルホキシド５０１Ｑを添加した液に、ＧＰＣ−塩化
カドミウムコンプレックス１．６　ｇとジメチルアミノ
ピリジン１．０５ｇ（８，６鵬Ｍ）を力■え、５０℃で
４時間激しく攪拌した。室温放冷後、脱水アセトン８０
ｍｆｌを添加すると白色沈澱が生じた６得られた白色法
Ｒ５ｇはクロロホルム／メタノール（２／ｌ、Ｖ／Ｖ）
混液１００ｍｍに溶解し、これを分液ロートに移して、
　ＩＮ塩酸２０−Ｑで３回洗滌を行い、中性になるまで
水に洗滌した。クロロホルム層を回収して脱溶媒後、′
粗ＰＣ４，６ｇを回収してシリカゲルカラムに付し、ク
ロロホルム／メタノール／水（６５／２５／４、Ｖ／Ｖ
／Ｖ）混液にて溶出し、ジパルミトイルＰＣ３ｇを得た
。このものの分析値は次の通りである。

ＦＡＢ−ＭＳ　：　（阿＋Ｈ）”７３３ＴＬＣ：クロロ
ホルム／メタノール／水（６５／２５／４゜Ｖ／Ｖ／Ｖ
）　Ｒｆ値＝０．２９ ジパルミトイルＰＣ３ｇを脱水ジクロルエタン１５＋＋
＋Ωに溶解し、この溶液にヘビ毒ホスホリパーゼＡｔ（
Ｃｒｏｔａｌｕｓ　ａｄａｍａｎｔｅｕｓ、シグマ社製
、）７■、０．１Ｍ塩化カルシウム溶液２ｒＭＱ、０．
２Ｍ）−リス−塩酸緩衝液３＋ａＱを添加して３７℃で
振盪しながら一昼夜反応させた。エタノールで反応を止
め、Ｂｌｉｇｈ−Ｄｙｅｒ法により抽出した。抽出液を
留去した後、アセトンで洗って遊離脂肪酸を除き粗リゾ
ＰＣ２，６ｇを得た。粗リゾＰＣをシリカゲルカラムに
付し、クロロホルム／メタノール／水（６５／２５／４
、Ｖ／Ｖ／Ｖ）混液にて溶出し、　　Ｓｎ−１−バルミ
トイル−ＧＰＣ２，４ｇを得た。

このものの分析値は次の通りである。

ＦＡＢ−ＭＳ　：　（阿＋Ｉ１１”４９６丁１４Ｃ：ク
ロロホルム／メタノール／水（６５／２５／４、Ｖ／Ｖ
／Ｖ）　Ｒｆ値＝０．１２ １−バルミトイル−ＧＩ’Ｃ１ｇ　（２，Ｏｎ＋Ｍ）を
アラキドン酸１．２６　ｇ　（４，１ｍＭ）を溶かした
脱水ジクロルメタン溶液１５ｍｆｆ中に加え、さらにジ
メチルアミノピリジン０．２５６　ｇ　（２，１ｍＭ）
とジシクロへキシルカルボジイミド２．６　ｇ　（１，
３ｍＭ）を加え、３７℃で二昼夜反応させた。室温放冷
後、沈澱物を濾過し、脱水アセトン４０社を添加して振
り混ぜると白色沈澱が生じた。

得られた白色沈澱はクロロホルムｌメタノール（２／ｌ
、　Ｖ／Ｖ）混液５０ｍＲに溶解してシリカゲルカラム
に付し、クロロホルム／メタノール／水（６５／２５／
４゜Ｖ／Ｖ／Ｖ）混液にて溶出し、Ｓｎ−１−パルミト
−２−アラキトニル−ＧＰＣ１，４ｇを得た。このもの
の分析イ１ａは次の通りである。

ＦＡＤ−ＭＳ　：　（阿＋ｌ−１）”７８１ＴＬＣ：ク
ロロホルム／メタノール／水（６５／２５／４゜Ｖ／Ｖ
／Ｖ）　Ｒｆ値＝０．３３ ＩＲ：　１０５０〜９４０ｃｎ＋−１トランス酸痕跡Ｕ
Ｖ　：　２３３■μ共役ジ工ン酸３％２６８ｍμ共役ト
リエン酸痕跡 過酸化物量−電位差滴定法　３３＋ａｅｑ／　ｋｇキャ
ピラリー〇〇：カーボワックス　２０Ｍ液相、５０ｍ、
２００℃ 加水分解して得た脂肪酸をジアゾメタンでメチル化して
測定した。二重結合のマイグレーションに基因するアー
ティファクトは認められなかった。

得られたＳｎ−１−パルミト−２−アラキトニル−ＧＰ
Ｃの一部７００■を８００μ党のメチルアルコールに溶
解し。

この溶液に細菌ホスホリパーゼＣ（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃ
ｅｒｅｕｓシグマ社製）を４００ｕｎｉｔ、０．２Ｍ　
トリス−塩酸緩衝液（Ｐ）１７．４）を６−〇、　０．
０５Ｍ塩化カルシウムを３．５ｍＬエチルエーテルを４
■Ｑ加えた０反応混合物をスクリューキャップ付２０ｍ
Ｑの試験管中にテフロンスターターバーと共に加・えて
３５℃で１時間激しく攪拌しながらインキュベーション
した０反応混合物にエチルエーテルを１２ｍ１２加えて
から分液ロートに移し、抽出後、窒素気流下で濃縮した
。

この中にアセトンｌａ＋ｊｌ加えて沈澱除去し、硫酸ナ
トリウムで脱水し、窒素気流下で脱溶媒して、Ｓｎ−１
−パルミト−２−アラキトニルＤＧ　５１０■を得た。

このものの分析値は次の通りである。

外ｗｌ：淡黄色の半固体 溶解状態：ヘキサン、クロロホルムに可溶水に不溶 ＴＬＣ：■クロロホルムｌメタノール／水（６５／２５
／４、Ｖ／Ｖ／Ｖ）　Ｒｆ値＝＝０．７７ ■クロロホルムｌアセトンｌメタノール（９０／９／１
．　Ｖ／Ｖ／Ｖ）　Ｒｆ値＝０．６５（Ｒｆ値０．６５
は標準体の未蒸留肛中のＳｎ−１、２０Ｇ　ニー般名β
−ＤＧの位置に相当した。〕 ■、■の呈色反応はドラーゲンドルフ試薬とディトマー
・レスター試薬に対し陰性で、ヨウ素、過マンガン酸カ
リ、硫酸に対し陽性であった。

ＦＡＢ−ＭＳ　：　（（Ｍ＋Ｎａ）”　：　６３９）分
子量６１６比旋光度：〔α〕２０℃−４，７（Ｃ＝０．
２１　（ｊｌｃｌａ）ＨＰＬＣＳ　ＯＤＳカラム、メタ
ノール　１　ｍＱ／ｗｉｎ単一ピーク キャビラリー〇〇：カーボワックス２０Ｍ液相、５０ｍ
、２００℃ 加水分解して得た脂肪酸をジアゾメタンでメチル化して
測定した。パルミチン酸とアラキドン酸が主成分であり
、二重結合のマイグレーションに基因するアーティファ
クトは認められなかった。

過着化物量：ｆｆｉ位差滴定法　４９ａｅｑ／ｋｇ実施
例３ ミリスチン酸１０．３　ｇ　（４５，２ｍＭ）を無水四
塩化炭素４０膳Ωに溶解後、ジシクロへキシルカルボジ
イミド３−７　ｇ　（１７，９ｍＭ）を添加し、４０℃
で４時間攪拌した。

析出したジシクロへキシルウレアを濾過して除き、濾液
を減圧下、室温にて除去し、白色結晶の無水ミリスチン
ｆｉ８．２ｇを得た。得られた無水ミリスチン酸全量に
ジメチルスルホキシド６０ｄを添加した液に、ＧＰＣ２
，０ｇ　（７，８ｍＭ）およびジメチルアミノピリジン
１．６ｇ（１３，４１１ＩＭ）を加え、５０℃で４時間
激しく攪拌した。反応後沈殿物を濾別し、四塩化炭素を
留去して得られた粗ＰＣをメタノール／クロロホルム（
１／２、Ｖ／Ｖ）に溶解し、イオン交換樹脂アンバーラ
イトＩＲＣ−５０、ＩＲＡ−４５を各８ｇ加えて触媒を
除去した。メタノール／クロロホルムを留去して再び粗
ＰＣを得、この粗ＰＣをシリカゲルカラムに付してクロ
ロホルム／メタノール／水（６５／２５／４、ｖ／ｖ／
ｖ）混液にて溶出し、シミリストイルＰＣ５，１ｇを得
た。

このものの分析値は次の通りである。

ＦＡＢ−ＭＳ：　（Ｍ＋ｌ＋）”　６７７ＴＬＣ：　ク
ロロホルム／メタノール／水（６５／２５／４、ｖ／ｖ
／ｖ）　Ｒｆ値＝０．２９ シミリストイルＰＣ５ｇを脱水ジクロルメタン１５ｒａ
Ｑに溶解し、この溶液にハブ毒ホスホリパーゼＡ２（Ｔ
ｒｉａ＋ｅｒｅｓｕｒｕｓ　ｆｌａｖｏｖｉｒｉｄｉｓ
和光純薬工業（株）製）７ｍｇ、０．１Ｍ塩化カルシウ
ム溶液２ｍＱ、　０．２Ｍトリス−塩酸緩衝液３ｍＱを
添加して、３７℃で攪拌しながら一昼夜反応させた。エ
タノールで反応を止め、Ｂ］、ｉｇｈ−Ｄｙｅｒ法によ
り抽出した。抽出液を留去した後、冷アセトンで洗浄し
て遊離脂肪酸を除き、粗リゾＰＣ４，６ｇを得た。粗リ
ゾＰＣをシリカゲルカラムに付し、クロロホルム／メタ
ノール／水（６５／２５／４．　ｖ／ｖ／ｖ）混液にて
溶出しＳｎ−１−ミリストイル−〇ＰＣ４，０ｇを得た
。このものの分析値は次の通りである。

ＦＡＢ−ＭＳ：　（Ｍ＋ｌ（）”　４２８ＴＬＣ：　ク
ロロホルム／メタノール／水（６５／２５／４、ｖ／ｖ
／ｖ）　Ｒｆ値＝０．１ １ＥＰＡ　１０ｇ（３３，１ｍＭ）にジメチルホルムア
ミド１．２）Ｗ（１６”、６＋ａＭ）とオキシ塩化リン
３．５ｇ（２３，１ｍＭ）の混液を３８℃に保持しなが
ら１時間かけて滴下した。さらに窒素気流下で３０分間
反応させた。窒素気流下、８０〜１００℃で減圧蒸留し
てＥＰＡクロライド８．２ｇを得た。このものの分析値
は次の通りである。

ＩＲ：　１０５０〜９４０ｃｍ−’　　トランス酸痕跡
ＵＶ：　２３３ｎ＋　ｐ　共役ジエン酸３．７％２６８
ｍμ共役トリエン共役ジ エン酸痕跡電位差滴定法２５ｍｅｑ／ｋｇキャピラリー
カラｌ、ＧＣ：　カーボワックス２０Ｍ液相、５０ｍ、
２００℃ 加水分解して得たＥＩＩＡをジアゾメタンでメチル化し
て測定した。二重結合のマイグレーションに基因するア
ーティファクトは認められなかった。

１−ミリストイル−ＧＰＣｌ　ｇ（２，３ｍＭ）とＥＰ
Ａクロライド１．４８ｇ（４，６ｍＭ）を溶かした脱水
ジクロルメタン溶液１５ｍＱ中に加え、さらにジメチル
アミノピリジン０．２８ｇ（２，３ｍＭ）を加え、３７
℃で攪拌しながら一昼夜反応させた。室温放冷後、脱水
冷アセ！−ン４０ｍＱを添加して振り混ぜると白色沈殿
が生じた。得られた白色沈殿はクロロホルム／メタノー
ル（２／１．　ｖ／ｖ）混液５０−に溶解してシリカゲ
ルカラムに付し、クロロホルム／メタノール／水（５５
／２５／４、ｖ／ｖ／ｖ）混液にて溶出し、Ｓｎ−１−
ミリストイル−２−ＩＥＰＡ−ＧＰＣ］、ｈを得た。こ
のものの分析値は次の通りである。

ｔ’Ａ１１−ＭＳ：　［阿＋１１］”　７５２ＴＬＣ：
　クロロホルム／メタノール／水（６５／２５／４、ｖ
／ｖ／ｖ）　Ｒｆ値＝０．３ 得られたＳｎ−１−ミリストイル−２−ＩＥＰＡ−ＧＰ
Ｃの一部７００ｍｇを８００μＱのメタノールに溶解し
、この溶液に細菌ホスホリパーゼＣ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄ
ｉｕｍ　ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ起源、生化学工業（株
）製）を４００ｕｎｉｔ、０．２阿トリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ＝７．４）を６＋＋＋Ｑ、０．０５Ｍ塩化カルシ
ウムを３．５ｍＱ、エチルエーテルを４ｍＱ加えた。反
応混合物をスクリューキャップ付２０ｍ＜１の試験管中
にテフロンスターターバーとともに加えて３５℃で１時
間激しく攪拌しながらインキュベートした。

反応混合物にエチルエーテルを１２ｍ１２加えてから分
液ロートに移し、抽出後、窒素気流下で濃縮した。

この中に水冷アセトン１社を加えて沈殿除去し、硫酸ナ
トリウムで脱水し、窒素気流下で脱溶媒して、Ｓｎ−１
−ミリストイル−ＥＰＡ−ＤＧ　５４８ｍｇを得た。こ
のものの分析値は次の通りである。

外ｖＡ：淡黄色透明の油状液体 溶解状態：ヘキサン、クロロホルムに可溶、水に不溶 ＴＬＣ：■クロロホルム／メタノール／水（６５／２５
／４、ｖ／ｖ／ｖ）　Ｒｆ値＝０．８ ■クロロホルム／アセトン／メタノール（９０／９／ｌ
、　ｖ／ｖ／ｖ）　Ｒｆ値＝０．６５〔［げ値０．６５
は標準体の未蒸留肛中のＳｎ−１，２０Ｇ’。

一般名β−ＤＧの位置に相当した。〕 ■、■の呈色反応はドラーゲンドルフ試薬とディトマー
・レスター試薬に対し陰性で、ヨウ素。

過マンガン酸カリ、硫酸に対し陽性であった。

ＦＡローＭＳ　：　　（（Ｍ＋Ｎａ）”　　：　　６０
９）比旋光度：［α）２０℃−４，７℃（Ｃ＝０．２２
　ＣｌＩＣｌ２）υ ＋１１’Ｌｃ　：　ＯＤＳカラム、メタノールｌａ＋Ｒ
／＋ａｉｎ単一ピーク キャピラリ−〇Ｃ二カーボワックス２０Ｍ液相、５０ｍ
、　２００℃ 加水分解して得た脂肪酸をジアゾメタンでメチル化して
測定した。ミリスチン酸とＥＰＡが主成分であり、二重
結合のマイグレーションに基因するアーティファクトは
認められなかった。

過酸化物：ｌ：ｔｌｔ位差滴定法　３３ｍｅｑ／　ｋｇ
代理人　弁理士　柳　原　　　成 手続補正書 昭和６３年２月２５日 特許庁長官　　小　川　邦　夫　　殿 １、事件の表示 昭和６２年特許願第１５８７２６号 ２、発明の名称 高度不飽和脂肪酸含有ジアシルグリセロールの製造方法
３、補正をする者 事件との関係　　特許呂願人 代表者　　岡　本　甲　子　男 ４、代理人　〒１０５電話４３６−４７００６、補正の
対象　　明細書の発明の詳細な説明の欄７、補正の内容 （１）明細書第１４頁第３行ｒ２．５Ｊをｒｌ、７」に
訂正する。

（２）同第１５頁第１２行ｒｔ、ｓ」ヲｒ１．ＩＪ　ニ
訂正する。

（３）同第１６頁第１０行ｒ５５０Ｊをｒ　５００　Ｊ
に訂正する。

（４）同第１９頁第８行ｒ２．４Ｊをｒｌ、８Ｊに訂正
する。

（５）同第２１頁第１１行ｒ５１０Ｊをｒ４１０」に訂
正する。

（６）同第２４頁第６行ｒ４．６Ｊをｒ３．６Ｊに訂正
する。

（７）同第２４頁第９行ｒ４．ＯＪを「３」に訂正する
。

（８）同第２６頁第１６行ｒ５４８Ｊをｒ５００Ｊに訂
正する。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）（Ａ）グリセロホスホコリンと飽和脂肪酸または
   モノエン脂肪酸を反応させて１，２−ジアシル−Ｓｎ−
   ３−グリセロホスホコリンを得る工程、 （Ｂ）１，２−ジアシル−Ｓｎ−３−グリセロホスホコ
   リンをホスホリパーゼＡ＿２により処理して１−アシル
   −Ｓｎ−３−グリセロホスホコリンを得る工程、 （Ｃ）１−アシル−Ｓｎ−３−グリセロホスホコリンと
   高度不飽和脂肪酸を反応させて１−アシル−２−高度不
   飽和脂肪酸−Ｓｎ−３−グリセロホスホコリンを得る工
   程、および （Ｄ）１−アシル−２−高度不飽和脂肪酸−Ｓｎ−３−
   グリセロホスホコリンをホスホリパーゼＣにより処理し
   て１−アシル−２−高度不飽和脂肪酸ジアシルグリセロ
   ールを得る工程を含む高度不飽和脂肪酸含有ジアシルグ
   リセロールの製造方法。
2. （２）飽和脂肪酸およびモノエン脂肪酸は炭素数１０以
   上のものである特許請求の範囲第１項記載の方法。
3. （３）高度不飽和脂肪酸は炭素数１８以上、不飽和結合
   が３個以上のものである特許請求の範囲第１項または第
   ２項記載の方法。