JPH01233297A - ペプチド、その抗体およびエンドセリンの定量 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、主として、血管収縮性ベプタイドであるエン
ドセリン（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ　）の免疫学的定量に
関するものであり、特に臨床診断の分野において有用で
ある。

従来技術と解決課題 本発明の発明者の一人である眞崎らは、ヒト上皮細胞培
養上清中に見い出される血管収縮性ペプチドを単離精製
し、その構造を決定し、これをエンドセリンと名付けた
［血管　第１１巻１号ＢＳ２頁１９８８年］。エンドセ
リ／は次式で表わされ、２１個エンドセリンは循環系調
節に関与する内因性因子であると予想され、その体内勤
回は本通性高血圧序などの病態生理の一端を担うと考え
られる。

また、エンドセリンのこのような生理活性の発現には、
そのＮ末端から中央部にかけての環状部分ならびにＣ末
端付近の疎水性部位の全部が必要と考えられる。

生体体液中のエンドセリンの量が追跡できれば、このよ
うな病変の診断が可能と考えられる。しかし、工７ドセ
リ／の定量についての報告はない。

そこで本発明者らはエンドセリンおよびその関連化合物
を合成し、これに対する抗体をｆｉｌｌ製し、との抗体
を利用したエンドセリンまたはその類縁体の定量法を確
立して本発明を完成した。

課履を解決するめの手段 本発明の１つは、エンドセリンまたはその類縁体を認識
する抗体を調製するためのハプテ／として有用な一般式
（１） ％式％（１） （式中２は、 １１、 Ｃｙｓ１ Ｐｈｅ−Ｃｙｓｘ 丁ｙｒ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓｓ Ｖａｌ−Ｔｙｒ−１’ｈｅ−Ｃｙｓ。

Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ。

Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ。

Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｖａｔ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｃ
ｙｓ。

＾５ｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｖａｔ−Ｔｙｒ−Ｐ
ｈｅ−Ｃｙｓ。

１１１ｅｔ−＾５ｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ
−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ。

Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−＾５ｐ−Ｌｙｓ−Ｇ　Ｉｕ−Ｃｙｓ−
Ｖａ　Ｉ　−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−ＣｙｓｓＳｅｒ　−Ｌｅ
ｕ−Ｍｅｔ　−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｇ　ｌ　ｕ−Ｃｙｓ−
Ｖａ　ｌ　−Ｔｙｒ　−Ｐｈｅ−ＣｙｓｓＳｅｒ−Ｓｅ
ｒ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｇ　Ｉｕ−Ｃｙ
ｓ−Ｖａ　Ｉ　−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ。

Ｃｙｓ−８ｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−＾ｓｐ−Ｌ
ｙｓ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｍａｌ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｃｙ
ｓｌＳｅｒ−Ｃｙｓ−５ｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−１１１
ｅｔ−＾ｓｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｍａｌ−Ｔｙ
ｒ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ、Ｃｙｓ−Ｓａｒ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ
−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−！１ｌｅｔ−＾５ｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌ
ｕ−Ｃｙｓ−Ｖａｔ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ。

のいずれかである。Ｙは水ａ基または免疫原性夕／バク
と結合し得る官能基を意味する。但し、複数のＣｙｇが
含まれているときは、これらが相互に−５−８−により
架橋されていてもよい。） または−形式（２） ％式％ （式中・Ｘは、 Ｌｅｕ−ＯＨｓ Ｌｅｕ−１ｉ１ｓｔ−ＯＨ１ Ｌｅｕ−Ｒ４ｅｔ−＾５ｐ−０１１、 Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−＾５ｐ−Ｌｙｓ−０１１、Ｌｅｕ−Ｍ
ｅｔ−Ａｓｐ　−Ｌｙｓ−Ｇ　Ｉｕ−ＯＨ１のいずれか
である。） で表わされるペプチドおよびその塩ならびにその製造方
法に関する。

なお、本発明明細書において、アミノ酸残基を意味する
記号は具体的には次のアミノ酸残基を意味する。

Ｃｙｓ　：システィ７ Ｓｅｒ：セリ７ Ｌｅｕ　：ロイシン Ｍｅｔ　：メチオニン ＾ＳＰ：アスパラギ／酸 Ｌｙｓ　：リシン Ｇｌｕ　：グルタミン酸 Ｖａｌ　　：バリ／ Ｔｙｒ　：チロシン Ｐｈｅ　：フェニルアラニン ｆｌｙｓ：ヒスチジン １１ｅ：インロイシン Ｔｒｐ：）リプトフ７ン 一般式（１）または（２）で表わされるペプチドおよび
その塩は、アミノ酸を１個ずつ縮合せしめる方法、複数
のアミノ酸からなる縮合物同士を縮合せしめる方法また
はこれらを組み合せた方法により製造できる。このよう
な縮合は、例えばアジド法、混合酸無水物法、ジシクロ
へキシルカルボジイミド法、活性エステル法などの常法
により、液相や固相において、好ましくは固相において
行える。

固相法は、反応に関与せしめる必要のない官能基を保護
したアミノ酸とパム（ｐａ■）樹脂の如き不溶性担体と
を、アミノ酸のカルボキシル基を通して結合させ、保護
基を脱離し、これに反応に関与せしめる必要のない官能
基を保護したアミノ酸をカップルさせ、所望のペプチド
鎖になるまでこの操作を繰り返し、次いでフッ化水素処
理などにより不溶性担体との結合を切断し、保護基が残
存するときはこれを脱離して目的とするペプチドを得る
方法である。通常、フッ化水素処理により大部分の保護
基が脱離されるので、大抵は保護基膜Ｎ操作を独立して
行う必要がない。

反応に関与せしめる必要のない官能基としては、アミ７
基、水酸基、カルボキシル基、ＳＩ［基、インドールや
イミダゾール環における：Ｎ■■基などがある。これら
の基は、通常、保護ハで保護される。アミ／保護基とし
ては陸と略称されるｔ−ブチルＡキシカルボニルやＣＩ
Ｚ　　と略称される２−クロルベンジルオキシ力ルボニ
ルなどが、水１’ｉ！１基保護基きしてはｌ１ｚｌと略
称されるベンジルやｎｒＺと略称されるｐ−プロムベ／
ジルオキシカルボニルなどが、カルボキシル保護基とし
ては０ｃｌｌｃｘ　七略称されるンクＬ１ヘキシルエス
テルが、ＳＨ保護基とては八〇−と略称されるアセタミ
ドメチルや４−　ＭｅＯ２，１と略称される４−メチル
ベンジルなどが、更にはインドール環やイミダゾール環
における二ＮＨ保護基としてはＦｏｒと略称されるホル
ミルやＴｏｓと略称すれるｐ−トルエンスルホニルなど
が、保護基の例として挙げられる。

一般式（１）で表わされるペプチドの内、４個のＣｙｇ
を含み、これらが−５−結合で相互に結合している一般
式（４） ％式％（４１ （式中、Ｙは前掲と同じものを意味する。

Ａ１は反応に関与せしめる必要のない官能基が保護され
ていてもよい１個のアミノ酸残基を意味し、Ａ２は反応
に関与せしめる必要のない官能基が保護されていてもよ
いＳｅｒ、　Ｌｅｕ、　Ｍｅｔ、＾ｓｐ、　Ｌｙｓまた
はＧｌｕのいずれか１ないし７個を含むペプチド残基を
意味し、Ａ３は反応に関与せしめる必要のない官能基が
保護されていてもよいＶａｔ、　ＴｙｒまたはＰｈｅの
いずれか１ないし３個を含むペプチド残基を意味し、Ａ
４は反応に関与せしめる必要のない官能基が保護されて
いてもよい１１ｉｓ１Ｌｅｕ、＾ｓｐ％ｌｌｅまたはＴ
ｒｐのいずれか工ないし６個を含むペプチド残基を意味
する。

但し、各Ｃｙｓは他のＣｙｓ、ＪニーＳＳ−結合してい
る。） で表わされるペプチドは、−形成（３）（式中ＮＹ％＾
１、Ａ２、Ａ３およびＡ４は前掲と同じである。また、
ＰＩ％　Ｐ２、Ｐ３およびＰ４はいずれもＳ　Ｈ基の保
護基であり、その内の２個は残り２個のＳ　Ｈ保護基に
影響を与えることなく選択的に脱離できる保護基を意味
する。） で表わされるペプチドを第１保護基脱離反応に付して２
個のＳ　Ｔ（基を形成させた後これを一８Ｓ−結合に誘
導せしめ、次いで第２保護基脱離反応に付して２個のＳ
Ｈ基を形成させた後これを−ＳＳ−結合に誘導せしめる
ことにより製造できる。更に具体的には、例えば−形成
（３）のＰｌ、Ｐ４がＡｃｍであり、Ｐ２％　Ｐ３が４
−ＭｅＢｚｌであるペプチドを固相法により得、これを
フプ化水素処理して保護基４−ｈＡ’ｌｌを除去して２
個のＳ　ＩＩ基を形成させてから、これを−８Ｓ−に４
き、次にヨウ索処理してＳ　Ｌ！保護基八へｌを除去し
て２個のＳ　Ｈ基を形成させ、これを−５Ｓ−となすこ
とにより所望の−お一体が容易に得られる。

このようにして２個のジスルフィド結合の導入は任意の
位置で行える。

本発明は、また、エンドセリンまたはその類縁体を４虜
する抗体に関する。ここにおけるエンドセリン類縁体は
、エンドセリ／と一部共通ずるアミノ酸配列を存するペ
プチドであって、その構成アミノ酸数がエンドセリンよ
り多いものもしくは少ないもの、またはエンドセリンの
構成゛ｒアミノ酸他のアミノ酸で置換されたもの、ある
いはエンドセリンと同等の生理活性を有するものであり
、例えばエンドセリンの３位から１０位のアミノ酸から
構成されるエンドセリ／の環状部分のペプチドやエンド
セリンの１５位から２１位のアミノ酸から構成されるエ
ンドセリンのＣ末端付近のペプチドなどが挙げられる。

本発明のｕ体は、−形成（１）または■で表わされるペ
プチド己免疫原性タンパクとの結合物（ハブテン抗原）
を適当なアジュバントとともにウサギやモルモット、山
羊、羊などの動物に非経口投与（免疫）シ、その血清を
採取し、公知の処理をなすことによって容易に得られる
。ここにおける免疫原性タンパクとしてはアルブミ７、
グロブリ／、サイログロブリン、貝ヘモシアニン、エデ
スチンなどが挙げられる。これらの免疫原性タンパクと
一般式（１）または（２）で表わされるペプチドとの結
合は、結合剤を用いる常法に従って行える。結合剤とし
ては、ペプチド（１）または■のアミ７基と免疫原性タ
ンパクのアミン基の間を化学的に結合するグルタルアル
デヒドやトルエンジインシアネート、ジハロゲン化ジニ
トロベンゼン、またはペプチド（１１＊たは■のＳ　Ｊ
（基と免疫原性タンパクのアミツノ基または逆に免疫原
性タンパクのＳ　Ｈ基とペプチド（１）または（２）の
アミノ基とを架橋する例えば特公昭５８−８３９５に記
載のｍ−ＭＢＳと略称されるマレイミド誘導体、更にペ
プチドのアミノ基またはカルボキシル基と免疫原性タン
パクのカルボキシル基またはアミ７基との間を結合する
水溶性カルボジイミドの如きカルボジイミド誘導体など
が挙げられる。Ｓ　Ｈ基が存在しないペプチド（りや免
疫原性タンパクは、特りｎ昭５７−１４２９０７に開示
されている例えばＮ−（アセチルメルカプトアセトキシ
）サクシ／イミドを用いでにＳＨ！を導入してから結合
に供することができる。

かくして得られるペプチド（１）または（２）と免疫原
性タンパクとの結合物で動物を十分免疫することにより
、所望の抗体が得られる。モノクローナル抗体は、この
ように免疫された動物の抗体生産細胞を＊、ａより採取
し、以下常法に従って、ミエローマ細胞との融合、クロ
ーン性細胞のスクリ一二ノグなどの操作を経て創製でき
る。

なお、抗エンドセリン抗体は、２個のジスルフィド結合
をｉＬ、Ａ４が１〜６個、好ましくは４〜６個のアミノ
酸残基である一般式（４）のペプチド、好ましくはエン
ドセリフと免疫原性タンパクとの結合物を抗原として調
製するのが好ましい。

このようなペプチドと免疫脳性タンパクとの結合がＣ末
端付近においてなされるときは、その抗体はエンドセリ
フのＮ末端を玉として認讃し、結合がＮ末端付近におい
てなされるときは、その抗体はエンドセリフのＣ末端を
主として２職する。また２個のジスルフィド結合を持た
ないペプチド（１）または■、特に構成アミノ酸数が３
〜１ｏのペプチドに対する抗体はエンドセリ／￥４縁体
、特にエンドセリンの分解産物たるフラグメントの定量
に任用である。

本発明は、また、上記の抗体を用いるエンドセリンまた
はその類縁体の免疫学的定量用キットに関する。エンド
セリンまたはその類縁体の定量は、次の試薬 （３）標識物で標識された一般式（１１または（２）の
ペプチド （ｂ）先に説明した抗体そのものまたはその不溶化物 （ｃ）試ａ　（ｂ）が抗体そのものであるときは、これ
と試ｇ　（ａ）とを反応させたときの反応物と残余とを
分離するための試薬 から構成されるキットを用いることにより容易に実施で
きる。

試薬（ａ）は、標識物と一般式（１１または（２）で表
わされるペプチドとの結合物（標識抗原）であり、先に
述べたペプチド（１）または■と免疫原性タンパクとの
結合の場合と同様にして調製できる。エンドセリンを定
量するときは、−形式（１）で表わされるペプチドとし
てはエンドセリフそのものが好ましい。標識物としては
酵素、放射性物質、蛍光物質、スピン化合物などが挙げ
られ、特に酵素が好ましい。酵素としてはβ−ガラクト
シダーゼ、アルカリフォスファターゼ、リパーゼ、パー
オキシダーゼ、グルコース−６−ホスフェートデヒドロ
ゲナーゼなどが用いられる。

試薬（ｂ）は本発明の抗体そのものか、または本発明の
抗体と不溶性担体とを結合させた不溶化抗体である。不
溶性担体と抗体との結合も前記と同様にして行える。不
溶化担体としては本分野で用いられるものであればいず
れでもよいが、米国特許４，１６８，７６７に開示の細
菌細胞壁片が特に好ましく用いられる。

試薬（ｃ）として′ｒ！Ｉ通に用いられるのは試薬（ｂ
）たる抗体に対する抗体（第２抗体）であって、不溶化
されたらのく第２不溶化抗体）である。第２抗体は、例
えばウサギ血Ｉｎから得られたＩｇＧ分画を抗原として
、他の動物、例えばモルモットを免疫することにより：
Ｊ１製できる。

このほか、緩衝化剤、標識活性測定用試薬、検量線作成
用標準エンドセリ／溶液などの試薬が用いられる。

これらの試薬を用いるエンドセリンまたはその類縁体の
定量は、 ■　検体と試ａ　（ａ）および試薬（ｂ）とを反応させ
、■　試ｕ　（ｂ）として不溶化抗体を用いたときは、
反応混液を遠心して、遊離の試薬（ａ）（ｆ。

清）とその他のもの（沈殿）とを分［（Ｂ／Ｐ分離）し
、 ■　試Ｅｌ　（ｂ）として本発明の抗体そのものを用い
たときは、更に試薬（ｃ）を反応させてからＢＩＦ５’
ｊ　ｆｆｌを行い、 ■　■または■で分離した上清または沈殿中の１１！！
癲物の活性を測定する、 ことにより容易に実施できる。このような工程■ないし
■の実施条件は、通常のＥＩＡ法と変りはない。

具体例 次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明する。

実施例　１　　　ペプチドｆ１１または（２）の製造１
−Ａ　　　　　　エンドセリンの！！８！造１１ｏｃ−
Ｔｒｐ（Ｆｏｒ）−０Ｃｌ−［２−バム樹脂（０，５０
ｍ１ｉｌ　）を出発原料とし、アプライド・バイオシス
テム社のＤｏｃ　−アミノ酸誘導体カートリッジ（２，
０ｍＭ　）を用い、トリフルオロ酢酸による駄の脱Ｍ後
、対称酸無水物法にて順次Ｃ末端側からペプチド鎖を延
長する。但し、Ｂｏｅ−Ａｓｐ（Ｏｃｌｌｅｘ）、ｆｌ
ｏｅ−Ｇｌｕ（Ｏｃｌｌｅｘ）、Ｈｏｅ−１１ｉｓ（Ｔ
ｏｓ）、Ｈｏｅ−Ｃｙｓ（Ａｃｔ）は■ペプチド研究新
製の粉末を専用カートリッジに封入後使用した。このよ
うにして次式で表されるペプチド−樹脂の結合物を得る
。

１１ｏｅ−Ｃｙｓ（Ａｃｌ）−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）−Ｃｙ
ｓ（４−Ｍｅ’Ｂｚｌ　）−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）−５ｅｒ
（［ｌｚｊ’　）−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ（Ｏｃｌｌ
ｅｘ）−Ｌｙｓ（ｆＪ　Ｚ）−Ｇｌｕ（ＯｃＨｅｘ）−
Ｃｙｓ（４−ＭｅＢｚｌ　）−Ｖａｌ−Ｔｙｒ（ＢｒＺ
）−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ（Ａｃｌ）−Ｈｉｓ（Ｔｏｓ）−Ｌ
ｅｕ−Ａｓｐ（Ｏｃｌｌｅｘ）−１ｌｅ−１１ｅ−Ｔｒ
ｐ（Ｆｏｒ）−０ＣＨ２−樹脂 このペプチド結合樹脂１．０　ｇをｐ−クレゾール３．
０■！の存在下、無水フッ化水素１２ｍ　ｌで一２℃、
１時間処理し八〇ｌとＦｏｒ以外の全保護基を脱離する
。

フッ化水素を減圧留去し、残渣にジエチルエーテルを加
えて固化させ、これを４取し、エーテル洗浄後、減圧乾
燥する。これをトリフルオロ酢酸２゜１１に溶解し、樹
脂を濾去し、濃縮する。残渣にエーテルを加え析出した
沈殿を濾取し、エーテル洗浄後、減圧乾燥し、２個のＡ
ｃｌ、２個のＳ　Ｈ基、１個のＴｒｐ（Ｆｏｒ）を任す
るペプチドを得る。これを０．５−Ｍになるように０．
１　Ｍ酢酸アンモニウム（Ｐ１１７．２）−８Ｍ尿素緩
衝液に溶解し、撹拌下、フェリシア／化カリウム水溶液
（１，５当量）を滴下する。

４０分後、反応混液を２００ｍＡ！のダイアイオンＩＩ
Ｉ’−２０のカラムに添加し水で洗浄後、アセトニトリ
ル／トリフルオロ酢酸／水（７５：０．１：２５）で溶
出する。

パクリ反応陽性分画を減圧濃縮し凍結乾燥してエンドセ
リンの１位と１５位のＣｙｓが八Ｃ１で保護され、その
３位と目位の間でジスルフィド結合をもつペプチドを得
る。これをＩＮｋＭ酸水（１５当量）含有メタノール−
水（↓：Ｉ）に１．０−Ｍになるように溶解し、０．０
５　Ｍ　Ｅつ素−メタノール（１６当量）を漱しく１党
拌しながら一度に加える。室温で１時間反応後、０．０
５　Ｍアスコルビン酸水溶液（１０当量）を加えて反応
を停止する。反応混液を濃縮し、ダイアイオフ　１１Ｐ
−２０に吸着させ水で十分洗浄しアセトニトリル／トリ
フルオロ酢ａ／水　（７５：０．１：２５）で溶出し、
エンドセリ／のＴｒｐがＦｏｒで保護されたものを得る
。これを濃縮し残渣を５０■ｊの水に溶解し、水冷下、
ＩＮ水酸化ナトリウム水溶液５　■ｌを加えてＦｏｒを
脱離する。２公役ｌＮｌ４Ｘ酸水溶液５ｍ！で中和し、
ウォーターズＰｒｅｐ／ＬＣシステム５００およびカー
トリッジカラム（ｃ＋ａ　、３００＾）を用いてアセト
ニトリル／トリフルオロ酢！！［／水（２０：０．１：
８（１）から（４５：０．１：５５）の濃度直線勾配法
により精製し、エンドセリンＩＯＢを得る。

本品は、１０〜６０％アセトニトリル−０，１％トリフ
ルオロ酢酸を溶出液とする高速液体クロマトグラフィ（
グラジェント）に付した場合、１８．０分に溶出する。

また、３０％アセトニトリル−０，１％トリフルオロ酢
酸によるインクラチックな溶出では１６．８分に溶出し
、この溶出位置はヒトの工７ドセリンと完全に一致する
とともにラットの肺動脈標本を用いる収縮活性もヒトエ
ンドセリンと同等であった。６Ｎ塩酸で＋００°Ｃ２２
時間加水分解後のアミノ酸分析値は次のとおりである。

（カッコ内は理論値） Ｔｒｐ　０．２８（１）　、　Ｌｙｓ　Ｏ，９７（＋）
、Ｈａｓ　１．０１（＋）　、＾ｓｐ　２．００（２）
、Ｓｅｒ　２．５５（：Ｊ）　、Ｇｌｕ　１．０４（１
）　、ｌ／２（ｃｙｓ）２１．９２（４）　、　Ｖａｌ
　Ｏ，９３（＋）　、Ｎｅｔ　０．８０（１）、１１ｅ
　Ｏ，９８（２）　、Ｌｅｕ　１．９２（２）、Ｔｙｒ
　Ｏ，９７（１）　、Ｐｈｅ　１．００（１）１−Ｂ　
　　　エンドセリンの異性体の製造１−八に準じて、２
個のジスルフィドの結合の位置のみがエンドセリンと異
なるペプチドを得る。

このペプチドは、１０〜６０％アセトニトリル−０，１
％トリフルオロ酢酸を溶出液とする高速液体クロマトグ
ラフィ（グラジェント）に付した場合エンドセリンと同
じ位置（１８分）に溶出されるが、３０％アセトニトリ
ル−０，１％トリフルオロ酢酸のインクラチック条件に
よる溶出では１５．４分に溶出され、この溶出位置は１
−八で得たヒトエンドセリンと一致せず、またその生理
活性はヒトエンドセリンの１０分の１以下であった。

１−Ｃその他のペプチドの製造 ト＾と同様にして次のペプチドを得る。これらのペプチ
ドのアミノ酸分析は理論値と一致した。

なお、下記において、Ｃｙｓ（Ｓ１１）はＳＨ基を有す
るＣｙｓを意味し、また、＾Ｃ■を付したＣｙｓのＳＨ
基は保護されている。

Ｃｙｓ（Ｓ１１）−１１ｉｓ−Ｌｅｕ−＾５ｐ−Ｉｌｅ
−１１ｅ−Ｔｒｐ　　　（１−１）Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｃ
ｙｓ（ＳＨ）−１１ｉｓ−Ｌｅｕ−＾５ｐ−１１ｅ−１
１ｅ−Ｔｒｐ　　　　（１−２）Ｇｌｕ−Ｃｙｓ（Ｓｌ
ｌ）−Ｖａｔ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｈ
ｉｓ−Ｌｅｕ−＾５Ｐ−１１８−１１ｅ−Ｔｒｐ　　　
　（＋−３） Ｍｅｔ−＾５ｐ−Ｌｙｓ−Ｇ　１ｕ−Ｃｙｓ（Ｓｌｌ）
　−Ｖａ　ｌ　−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ　）
−ＩＩ　１ｓ−Ｌｅｕ−＾ｓｐ−＋１ｅ−１１ｅ−Ｔｒ
ｐ　　　　（＋−４）Ｃｙｓ（Ｓｌｌ）−５ｅｒ−Ｓｅ
ｒ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−＾５ｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ
（八ｃｍ）−Ｖａｔ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ
）−Ｉｌｉｓ−Ｌｅｕ−＾５ｐ−１１ｅ−１１ｅ−Ｔｒ
ｐ　　　　（ト５）Ｃｙｓ（Ｓｌｌ）−８ｅｒ−３ｅｒ
−Ｌｅｕ−Ｍｅｕ−＾５ｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ　　　　（
２−１）実施例　２　　　　ハプテン抗原の調製−Ａ ブタサイログロブリン７．８　ｍｇと実施例１で製造し
た工／ドセリン３．０　ｍｇを０．１　Ｍリン酸緩衝液
（ｐｌ＋　７　）　１　ｍｌに溶解する。この混液に撹
拌しながら１％グルタルアルデヒド水溶液２５０μ！を
加え、室温で２時間撹拌する。この反応混液を０．９％
ＮａＣ１の２！に対して４℃４８時間透析した後、透析
内液の全量を０．９％ＮａＣ１でＩｏｎ　ｌに希釈懸濁
し、１園！　ずつに小分けし、凍結保存する。

エンドセリン２．０ｍｇとブタサイログロブリン６．７
１ｇトを１　ｍｌ　ノ０．１　Ｍ　！Ｊ　７＠ｒＡ衝ｍ
　（ｐＨ７’）　ニｍ解し、４℃で冷却しながら水溶性
カルボジイミド塩酸塩３０■Ｇを加える。、１０℃で一
夜反応させた後に反応混液を４℃で０．９％ＮａＣ１に
対して透析し、透析内液の全量を０．９％Ｎ＆ＣＩでＩ
Ｏ園！に希釈懸濁し、その１■Ｉずつを小分けし、凍結
保存する。

−Ｃ 口ＳＡ（ウシ血清アルブミ／）１４冒ｇを１ｍｇの０．
１　Ｍリノｌ！ＩＩ緩衝液（ｐｔ１７）に溶解し、撹拌
下で冷却しながらｍ−ＭＤＳのテトラヒドロフラン溶液
（１１，６ｍｇ／　０．５ｍｆｆ１　）を加えて、室温
で２時間反応させる。反応混液をエーテルで洗浄し、過
剰のｍ−ＭＩＩＳを除去する。水溶液層部分を凍結乾燥
し、これを２１１の純水に溶解し、実施例！−Ｃで得た
ｌ！、５■ｇのペプチド（２−１）を加え、−夜１０℃
で反応させ、次いで反応混液を純水で十分透析し、凍結
乾燥してペプチド（２−１）とｌｌ５Ａとの結合物１９
．０ｍｇを得る 同様にしてペプチド（１−１＞とｌｌｌ５Ａとの結合物
を調製する。

実施例　３　　　　　　抗体の調製 ３−Ａ　　　　　　抗エンドセリン抗体実施例２−Ａで
製造したエンドセリンーブタサイログロプリン結合物を
０．９％ＮａＣｌ溶液に１％Ｏ度になるように溶解し、
等量のフロインド完全アジ、バットを加えて＊ｉｏ　ｍ
エマルシヨンをつくり、ウサギの足筐２カ所、背部皮下
８カ所に０．１■ｉずつ注射する。　２週間後に背部皮
下５カ轡に０、ｌｓｌずつ注射する。以後同様な追加免
疫を２週間毎に６回行う。最終免疫後、１０日０に頚動
脈より全血を採取する。この血清５■ｒに等量の０．１
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）を加え、水冷下、飽和硫安溶
液１０＋＋１を加え、　２０分間撹拌する。これを遠心
（１２０００Ｘ　ｇ、１０分間）し、沈殿を分離する。

この沈殿を同すン酸暖？３ｉｉ＆５ｍＮ　　に溶解し等
量の飽和硫安を加え、同様にして沈殿を遠心分離する。

沈殿を５ＩＩｌの０．！ＭリンＭ緩８ｉ液（ｐＨ７）に
溶解し０．９％Ｎゐ０１含仔（１，０２ＭリンＷＪ緩衝
液（Ｐｌｌ７）の２！に対して４℃２４時間透析し、抗
体含有溶液を得る、 ３−Ｉ３　　　その他のペプチドに対する抗体実施例２
−１１または２−Ｃの結合物を用いるほかは３−八と同
様にして、それぞれの抗体を得る。

実施例　４　　　不溶化第２抗体の調製ラクトバチルス
　プランタルム＾ＴＣＣ８０１４の細Ｗ細胞壁片（以下
、ＬＰ細胞壁片という）　４０ｖｇを精製水１ｍｌに懸
濁させ、七分に均一化した後に１１の抗つザギＩｇＧモ
ルモット抗体を加え、撹拌下、１５μｌの１Ｍ酢酸ナト
リウム緩衝液　（Ｐｌｌ、１）、５％水溶ｔ１カルボジ
イミド水溶液３０μ！および２５％グルタルアルデヒド
１５ｔｔｌを順次加え、室温で１時間撹拌する。反応混
液を遠心（１５００Ｘｇ、１０分間）して−Ｆ清を捨て
、沈殿に５諺βの緩衝液Ａ（０，１％ＢＳＡ−０，１％
ＮａＮ３　０．９％　ＮａＣ１−０，０４Ｍリン酸緩衝
液、ｐＨ７）を加えて遠心洗浄する。これを５回くりか
えし、ＬＰ細胞壁片０．５％を合Ｙｆする２０００　ｖ
ｌの緩衝液Ａに懸濁する。

実施例　５　　　　酵索標識抗際の調製（＾−１）　エ
ンドセリンとｍ　−Ｍ　ｎ　Ｓとの結合＋００　＃ｇＱ
）ｘンＦセ’）　７ヲ含む１　＊（！　（７）０．１　
Ｍ　’Ｊ／酸緩衝液（ｐＨ７）にｍ　−Ｍ　Ｂ　Ｓ　Ｉ
００μｇ含有ジメチルホルムアミド溶ｉ！１００μｊを
加え、室温で３０分間撹拌する（Ｉ液）つ （＾−２）　結合 一方、５００μｇのβ−ガラクトシダーゼ（以下、β−
Ｇａｌと略ｔ。ベーリ／ガーマ／ハイム社、大腸菌由来
）を含む４００μ！の０．１　Ｍす／ｆｆｉ緩衝液（ｐ
Ｈ７）己飽和硫安溶液４００μＩの混液を調製し、これ
を上記■液と混合撹拌し、室温で１時間撹けする（■液
）。

緩衝液Ａで十分洗浄したセファローズＯＢ（ファルマシ
ア社、２．７８４０　ｃ■）に上記■液を流し、緩衝液
Ａｉ？ｉｆｆ出し、４曹！ずっ分画し、Ｎｏ、Ｉ３〜＋
５の分画をプールしたものを緩衝液Ａで希釈して酵素標
謂抗涼とする。

（Ｂ） ５ｍｇのβ−Ｇａｌ含有０．０２Ｍす／酸緩衝液ｃｐ＋
＋７）のＩＯ＋＋　１にマレイミド５００１１ｇを含む
水１ｍｌを加金１、室温で１時間撹拌した後、同緩衝液
５をｒで２同透析する。その内液３ｉｔ！に璽−Ｍ　Ｂ
　Ｓ　１００μｇ八有ジメチルスルホキシド溶液２５０
μｌを加え、室温で２時間撹拌４−る。これに実施例１
−Ｃで得たペプチド（２−１）　　の１００μ匹を含む
水溶液２５０μＩを加え、さらに２時間撹拌し、反応混
液娶セファＩｊ−ズ６Ｂカラム（１，ｆ３　Ｘ　９２０
　ｃｍ）にかけて緩衝液Ａで溶出し、４■ｉ　ずつ分画
しβ−Ｇａｌ−ベプチド（２−１）を含む分画２４ｍｊ
！を得る。

実施例　６　　　　エンドセリンの定量（１）試薬 ■　標準抗ねｉｆｆ液 種々０度のエンドセリン緩衝液Ａ溶液 ■　酵素標識抗原溶液 ■　抗エンドセリン抗体（第１抗体）溶液■　不溶化第
２抗体ツ濁液 ■　０．９％ＮａＣｌｔ８液 ■　緩衝液Ａ ■　酵素基質溶液 ０．３１Ｍ４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラ
クトシド−１ｍＭＭｇＣＩ２−４０％エチレングリコー
ル−０．１％　ＮａＮ３■　酵素反応停止液 ０、１Ｍ　Ｋ２ＨＰＯ４　ＮａＯＩ−１　（　ｐＨ　Ｉ
＋）■　定量操作 ■　　　　　第１抗涼抗体反応 検量線作成用および検体用の試験管（ＩＸＩＯＣ■）に
標準抗原溶液または検体（血清など）１００μ！を入れ
、さらに第１抗体を加え撹拌後、３７°Ｃで６０分間温
５する。次に酵素標識抗原溶液１００μ！を加え、３７
℃３０分間温置する装■　　　第２抗原抗体反応とＥｌ
／Ｆ分離反応混液に不溶化第２抗体懇濁液２００μ！を
加え、３７℃で１５分間温２した後、全試験管に０、９
％　Ｎ＆ＣＩＷＪ液２ｍｌを加Ｌ、遠心（　＋５ｏｏｘ
ｇ，］θ分間）し上清を除去する。この洗７争操作をさ
らにもう１回くりかえす。

■　酵素反応 沈殿に０．５ｍ　ｌの緩衝液入を加え、ミキサーで撹拌
して沈殿を完全に分散させた後、３７℃で３分間予熱し
、これに蛍光基質溶液１００μｊを加える．同温度で５
置し、２０分後、酵素反応停止液１．５　ａｌｌを加え
て撹拌する。

■　　　　　　酵素活性の測定 反応混液の蛍光強度を測定する。

■　　　　エンドセリ／量の算出 標や抗原量と吸光度との関係を片対数グラフにプロット
し、得られる検ｆｆｉ線より検体中のエンドセリ／量を
求める。

実施例　７　　　　　　　検ｆｆｉ線 下記試薬を用いるほかは実施例６に従って、第１図のエ
ンドセリ／の検量線を作成した。

酵素標識酵素〜エンドセリ／ーβーＧａｌ結合物標中抗
原〜エンドセリン 抗体〜エンドセリ／から調製した抗体 実施例　８　　　　　　　検量線 下記試薬を用いるほかは実施例６に従って、第２図のペ
プチドの倹ｆｆｉ腺を作成した。

酵素標識酵素〜ペプチド（２−１）−β−Ｇａｌ結合物
標準抗原〜ペプチド（２−１） 抗体〜ペプチド（２−１）から調製した抗体実施例　９
　　　　　　　倹ｆｆｉ腺 下記試薬を用いるほかは実施例６に従って、第１図と同
様なエンドセリンの検量線を作成した。

酵素標識酵素〜ペプチド（＋−１）−β−Ｇａｌ結合物
標準抗原〜エンドセリン 抗体〜ペプチド（＋−１）から調製した抗体

【図面の簡単な説明】

第１図および第２図はペプチドの検ｆｆｉ腺を示す。 第　　１　　図 ε ０、５　２　８　３２　１２５　５００エンドセリン量
　（ｎｇ／■ｌ）

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）一般式（１） ▲数式、化学式、表等があります▼（１） （式中Ｚは、 ▲数式、化学式、表等があります▼、 のいずれかである。Ｙは水酸基または免疫原性タンパク
   と結合し得る官能基を意味する。但し、複数のＣｙｓが
   含まれているときは、これらが相互に−Ｓ−Ｓ−により
   架橋されていてもよい。） で表わされるペプチドおよびその塩。
2. （２）一般式（２） ▲数式、化学式、表等があります▼（２） （式中Ｘは、 ▲数式、化学式、表等があります▼、 のいずれかである。） で表わされるペプチドおよびその塩。
3. （３）一般式（３） ▲数式、化学式、表等があります▼（３） （式中、Ｙは前掲と同じである、Ａ＿１は反応に関与せ
   しめる必要のない官能基が保護 されていてもよい１個のアミノ酸残基を意味し、Ａ＿２
   は反応に関与せしめる必要のない官能基が保護されてい
   てもよいＳｅｒ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｐ、Ｌｙｓまた
   はＧｌｕのいずれか１ないし７個を含むペプチド残基を
   意味し、Ａ＿３は反応に関与せしめる必要のない官能基
   が保護されていてもよいＶａｌ、ＴｙｒまたはＰｈｅの
   いずれか１ないし３個を含むペプチド残基を意味し、Ａ
   ＿４は反応に関与せしめる必要のない官能基が保護され
   ていてもよいＨｉｓ、Ｌｅｕ、Ａｓｐ、ＩｌｅまたはＴ
   ｒｐのいずれか１ないし６個を含むペプチド残基を意味
   する。 また、Ｐ＿１、Ｐ＿２、Ｐ＿３およびＰ＿４はいずれも
   ＳＨ基の保護基であり、その内の２個は残り２個のＳＨ
   保護基に影響を与えることなく選択的に脱離できる保護
   基を意味する。） で表わされるペプチドを第１保護基脱離反応に付して２
   個のＳＨ基を形成させた後これを−ＳＳ−結合に誘導せ
   しめ、次いで第２保護基脱離反応に付して２個のＳＨ基
   を形成させた後これを−ＳＳ−結合に誘導せしめること
   を特徴とする一般式（４） ▲数式、化学式、表等があります▼（４） （式中、Ｙ、Ａ＿１、Ａ＿２、Ａ＿３およびＡ＿４は前
   掲と同じである。但し、各Ｃｙｓは他のＣｙｓと−ＳＳ
   −結合している。） で表わされるペプチドおよびその塩の製造方法。
4. （４）式 ▲数式、化学式、表等があります▼ で表わされるエンドセリンまたはその類縁体を認識する
   抗体。
5. （５）抗体が単クローン性である請求項４記載の抗体。
6. （６）少なくとも下記の試薬から構成されてなるエンド
   セリンまたはその類縁体の免疫学的定量用キット； （ａ）標識物で標識された請求項１または２記載の一般
   式（１）または（２）で表わされるペプチド （ｂ）請求項４または５記載の抗体そのものまたはその
   不溶化物 （ｃ）試薬（ｂ）が抗体そのものであるときは、これと
   試薬（ａ）とを反応させたときの反応物と残余とを分離
   するための試薬。
7. （７）試薬（ａ）が酵素標識エンドセリンであり、試薬
   （ｂ）がエンドセリン−免疫原性タンパク結合物を抗原
   として調製された抗体であり、試薬（ｃ）が試薬（ｂ）
   の抗体に対する不溶化第２抗体である請求項６記載のキ
   ット。