JPH01230598A - ８―グリシン，１６―ｘ，デエス―１９―ロイシン―カルシトニン - Google Patents

８―グリシン，１６―ｘ，デエス―１９―ロイシン―カルシトニン

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JPH01230598A
JPH01230598A JP63316604A JP31660488A JPH01230598A JP H01230598 A JPH01230598 A JP H01230598A JP 63316604 A JP63316604 A JP 63316604A JP 31660488 A JP31660488 A JP 31660488A JP H01230598 A JPH01230598 A JP H01230598A
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cycle
calcitonin
acid
resin
boc
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JP63316604A
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Ronald Cyril Orlowski
ロナルド　シリル　オーロースキイ
Jay Kenneth Seyler
ジヤイ　ケネス　セイラー
Gary Franklin Burt
ゲリー　フランクリン　バート
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Rorer International Overseas Inc
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/585—Calcitonins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/10—Drugs for disorders of the endocrine system of the posterior pituitary hormones, e.g. oxytocin, ADH
    • A61P5/12—Drugs for disorders of the endocrine system of the posterior pituitary hormones, e.g. oxytocin, ADH for decreasing, blocking or antagonising the activity of the posterior pituitary hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は生物学的活性をもつカルシトニンおよび生物学
に活性なカルシトニンに転化しうるペプチドに関し、ま
たこのようなカルシトニン類似体を製造する方法に関す
る。
〔従来の技術〕
周知の天然カルシトニン・ペプチドのすべては３２個の
アミノ酸から成るアミノ酸系列奢含む。天然のカルシト
ニンはサーモン、うなぎ、牛、豚、羊、ラットおよびヒ
トに含まれるカルシトニンを包含する。たとえはサーモ
ン（さけ）のカルシトニンは次の構造式をもつ。
１ｆ−Ｃ’ｙａ−５ａｙ−Ａａｎ−Ｌｍｓ−５ａｙ−Ｔ
ｈｅ−Ｃｙａ−Ｖａｌ−Ｌｇｓ１２３４５６．７８９ −Ｇｌｙ−Ｌｙｅ−Ｌｍｓ−５ａｙ−ＧＥ　％−ＧＬｓ
−Ｌａｗ−ノハーーＬｙｘ−Ｌａｓ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−
Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｈｅ−Ａｓｓ−Ｔｈｒ−Ｇ
ｌｙ−５ａｒ−ＧＬｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｎｕ。
米国特許／１６３，９２６，９３８．４，０６２，８１
５．３，９２９゜７５８．４，０３３．９４０．４，３
３６，１８７．４，４０１，５９３．４．５２８，１３
２には上ｄピのサーモン・カルシトニンを包含するカル
シトニン類の改良合成法が記載されている。
〔発明が解決しようとする課題とそのための手段〕我々
は周知のカルシトニン類と同じ生物学的活性を４つ３１
個のアミノ酸系列の上記天然カルシトニン・ペプチドの
類縁体を発見した。この類縁体の構造上の主要な相違点
は、我々の新規なペプチドにおいて、（１）　Ｎ−アル
ファ・アミン基はそのまま残すか、アシル化するか又は
除去することができ、（２）位置１９のロイシンは省略
され、（３）バリン−８はグリシンによってｆｉｍされ
、そして（４）位置１６はＬ−アラニン、Ｌ−バリン、
Ｌ−メチオニン、またはＬ−フェニルアラニンの基のう
ちの１つで直換されていることである。これらの新規な
ペプチドはペプチド類の合成変性体のＩＵＰＡＣ’−Ｉ
ＵＰ”６６名法しＢｉｏｃｈａｍ、　／、。
（１９８４）２１９．３４５，３７７）を使用して〔Ｎ
−アルファ・アシル（またはデス−１〜７ミノ）、８−
グリシン、（１６−アミンＩｌｌり、デスー１９−ロイ
シン〕カルシトニンと呼ばれる。
本発明のカルシトニン・ペプチドは次の構造体のうちの
１つである。
−Ｇｌ　ｙ−Ｌｙ　ｍ−Ｌａ５−５　ｅ　ｒ−Ｇｌ　ｎ
−ＧＬ　ｓ−Ｙ　−Ｈｉ　ａ　−Ｌｙ　ａ　−Ｇｉｎｌ
ｏ　　１１　１２　１３　１４　１５１６　１７　１８
　１９イｈｒイｙｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ａｓｓ
イｈｒ−Ｇｌｙ−５ａｒ−Ｇｌ　ｙ−Ｔｈｒ−ｐｒｏ−
！ＶＨ。
〔ただしＸはＢ１１〜アミノ基のＮ−アルファ・アシル
訪導体を表わすか、あるいはｘ−ｔ’ｙａはデス−１〜
アミノ誘導体である。〕 該アシル基はＣ０〜１゜含有カルボン酸であり、好まし
くはＣ１〜１ｏ含有アレアノン酸である。好ましいアシ
ル基として、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、バレリ
ン酸、ヘキサン酸、ヘプタン酸、オクタン酸およびノナ
ン酸またはそれらの異性体たとえばイソ酪酸、インペン
タン酸なト；乳酸；およびマロン酸、コハク酸、グルタ
ール酸、もしくはアジピン酸の半アミドがあげられる。
ＹはＬ−バリン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−アラニン、また
はＬ−フェニルアラニンである。
特に好ましく・新規ペプチドは〔８−グリシン、１６−
アラニン、デス−１９−ロイシン〕カルシトニンでアル
。
本発明のカルシトニン・ペプチドはアミド生成条件下に
アミノ酸または適当なデス−アミノ酸を正しい順序で加
えて式〔Ｎ−アルファ−Ｘ、８−グリシン、（１６−ｙ
）。
デス−１９−ロイシン〕カルシトニンの変性カルシトニ
ンを生成させ〔ただしＸはＢ１またはカルシトニンの１
位のシスティンのＮ−アシルアミノ（該アシルは１〜１
０個の炭素原子をもつカルボン酸；Ｌ−乳酸；またはマ
ロン酸、コハク酸、グルタール酸もしくはアジピン酸の
半アミドである）であるか、またはＸ−Ｃ，、はデス−
１〜アミノであり；Ｙ昏工Ｌ−バリン、Ｌ−メチオニン
、Ｌ−アラニンまたはＬ−フェニルアラニンである〕、
そして任ＸＫに保護基を除去することから成る方法によ
って製造される。
周知のサーモン・カルシトニンと四種の活性をもつ新規
な〔８−グリシン、１６−アラニン、デス−１９−ロイ
シン〕サーモン・カルシトニンの式は次のとおり書（こ
とができる。
−Ｇｌｙ−Ｌｙａ−Ｌｍｓ−５ａｔ−Ｇ１％−ＧＬｕ−
Ａｌａ−バーＬｙａ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ
−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ａｓ％−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−５ｅｔ１
９　２０　２１　２２　２３　２４　２５　２６　２７
　２Ｂ−Ｇｌｙ−Ｔｈｅ−Ｐｒｏ−Ｎｌｉ。
〔８，−グリシン、１６−アラニン、デス−１９−ロイ
シン〕５なざカルシトニンは次のとおり書くことができ
る。
−Ｇｌｙ−Ｌｙｅ−Ｌｅｓ−８ａｔ−Ｇｉｎ−Ｇｊｓ−
Ａｌａ−Ｈｉｍ−Ｌｙｅ　−Ｇｌｓ−Ｔｈｅ−Ｔｙｒ−
Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ａｔｔｐ−Ｖａｔ−Ｇｌｙ−
Ａｌａ−Ｇｌ　ｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ　−Ｎｌｌ１［８−
１’ｌＪシン、１６−アラニン、デス−１９−ロイシン
フチキン・カルシトニンは次のとおり書くことができる
。
−Ｇｌｙ−Ｌｙｅ−Ｌｍｓ−３ａｒ−Ｇｉｎ−Ｇｌｓ−
Ａｌａ−Ｈｉｍ−Ｌｙｍ　−Ｇｌｓ−Ｔｋｒ−Ｔｙｒ−
Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｈｅ−Ａｓ　ｐ−Ｖａ　ｌ　−Ｇｌ
　ｙ−Ａｌａ−Ｇｌ　ｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ　−ＮＨ２上
記の式かられかるように、この式には３１個のアミノ酸
が宮１れ、これらのアミノ酸の位置は前述の命名法によ
り鎖の一端にあるＣ゛ν１の位置ｌで始まり鎖の他端の
Ｐｒ。
の位［３１で終るように番号が付けられている。記述を
簡明にするために、この番号付けＹ合成サイクルの記述
の際に使用する。アミノ酸の組立はスレオニンのカップ
リングを含むサイクル３１で始まる。
一般に、我々は合成の固相方法論を使用し、ベンズヒド
リルアミン樹脂（ＢＨＡ樹脂）と呼ばれる樹脂を使用し
て出発する。この種の樹脂は周知であり、その製造はＰ
ｉａｔｔａらＣＰｉａｔｔａ＋　Ｐ、Ｓ、　ａｎｄ　ｋ
ｌａｒａｈａｌｌ　、　Ｇ、Ｒ，、Ｃｈｕｍ。
Ｃ’ａｍｍｓ％、、６５０（１９７０））、およびオル
ロウスキーら（−Ｊ、　Ｕｒｇ、　Ｃｈｕｍ、　、　４
１．３７０１（１９７６））。によって記述されている
。又差、ｆｉ！Ｉ曾ポリスチレンＢＩｉＡ樹脂は化学薬
品店から入手しうる。我々はこのＢＨＡ樹脂を表現する
ために次の表示を使用する。
〔式中の■はこの樹脂のポリスチレン部分である。〕〔
樹脂ペプチド合成〕 この合成にお−・て、アミノ酸類は全ペプチド系列が樹
脂上に形成されるまで不溶性樹脂に１度に１個づつ加え
る。
アミノ酸の官能基はブロッキング基によって保護する。
アミノ酸のα−アミン基は第３級ブチロキシカーボニル
基またはその均等物によって保護する。このα−第３級
ブチロキシカーボニルｍ’（ＢＯＣと呼ぶ。セリンおよ
びスレオニンのヒドロキシ官能基はベンジル基またはベ
ンジル６４体基（たとえば４−メトキシベンジル、４−
メチルベンジル、３．４−ジメチルベンジル、４−クロ
ロベンジル、　２．６−ジクロロベンジル、４−ニトロ
ベンジル、ベンズヒドリルまたはそれらの均等物）によ
って保護する。このベンジル基またはベンジル誘導体基
を表わすためＫＢｇなるＲを用いる。
チロシンのヒドロキシル官能基は非保護であってもよく
、あるいは上述のＢｓ基のようなベンジル基またはベン
ジル諺導体基で保護して本よ（、あるいはベンジロキシ
カーボニルまたはベンジロキシカーボニル誘導体（たと
えば２−クロロベンジロキシカーボニルまたは２−ブロ
モベンジロキシカーボニル、あるいはそれらの均等物）
で保護してもよい。非保護基、Ｂｓ基、ベンジロキシカ
ーボニル基、またはベンジロキシカーボニル訪導体基の
いづれか’に＆すためにＷなる語を用いる。
システィンのチオール官能基は上記のベンジル基または
ベンジルｄ導体保膿基Ｂａによって又は露−アルキルチ
オ基（たとえばメチルチオ、エテルチオ、Ｓ−プロピル
チオ、爲−ブチルチオまたはそれらの均等物）によって
保護することができる。我々はｎ−アルキルチオ基また
はＢｇを表わすために文字Ｒｖ’ｌ使用し、Ｒ，がｎ−
アルキルチオであるときのＢｇｆ表わすために及びＲ，
がＢｇであるときの５−アルキルチオを表わすために文
字Ｒ，ｆｆ：使用する。
アルギニンのグアニジン官能基はニトロ基、トシル基ま
たはそれらの均等物によって保護することができる。我
々はニトロ基またはトシル基のいづれかを表わすために
文字Ｔを使用する。リジンのイプシロン−アミノ官能基
はベンジロキシカーボニル基またはベンジロキシカーボ
ニル誘導体基（タトえば２１０ロベンジロキシカーボニ
ル、３．４−ジメチルベンジロキシカーボニルまたはそ
れらの均等物）によって保護することができる。我々は
ベンジロキシカーボニル基またはベンジロキシカーボニ
ル誘導体基を表わすために文字Ｖｆ使用する。ヒスチジ
ンのイミダゾール窒素に使用する保護基はヒスチジンに
ついて上述したようなベンジロキシカーボール基および
ベンジロキシカーボニル誘導体基であり、ｍＪ様にｒと
呼ぶ。グルタミン酸のガンマ−カルボン酸基はセリンお
よびスレオニンのヒドロキシ官能基の保護について前述
したようなベンジルまたはベンジル基またはベンジル誘
導体基によって保護され、これらの保護基は文字Ｂｓに
よって表わされる。
サーモン・カルシトニン（例示のためにのみ使用）の合
成の３１サイクルのそれぞれに使用するための好ましい
アミノ酸反応試剤を次の表１に示す。
表　　Ｉ ３１　　　　　　ＨＯＣ’−Ｌ−プロリン３０　　　　
　ＢＯＣ−０−ベンジル−Ｌ−スレオニン２９　　　　
　ＨＵＣ−グリシン ２８　　　　　ＢＯＣ−Ｕ−ベンジル−Ｌ−セリン２７
　　　　　ＨＯＣ−グリシン ２６　　　　　ＢＯＣ−０−ベンジル−Ｌ−スレオニン
２４　　　　　ＢＵＣ−０−ベンジル−Ｌ−スレオニン
ギニン ２２　　　　　　ＢＯＣ−Ｌ−プｏリーフ２１　　　　
　ＢＯＣ’−０−ブロモベンジロキシカーボニル−Ｌ−
チロシン ２０　　　　　ＢＯＣ−０−ヘンシル−Ｌ　−、ｘ、ｖ
７Ｐ二ｙ１７　　　　　ＨＯＣ−Ｎ（ｉｍ）−Ｃ’ＢＺ
−Ｌ−ヒスチジン １６　　　　　ＢＵ（、’−Ｌ−７−ｙニン１３　　　
　　ＢＯＣ−０−ベンジル−Ｌ−＊リン１２　　　　　
ＨＯＣ−Ｌ−ロイシン ベンジロキシカーボニル−ｊ−リジン １０　　　　　ＢＯＣ−グリシン ９　　　　　ＢＯＣ−Ｌ−ロイシン ８　　　　　ＢＯＣ−グリシン ルテオーに一システィン ６　　　　　ＢＯＣ−υ−ベンジルーＬ−スレオニン５
　　　　　Ｂｔ）ｔ”−０−ベンジル−Ｌ−セリン４　
　　　　ＢＯＣ’−Ｌ−ロイシン ２　　　　　ＢＯＣ−０−ベンジル−Ｌ−＋ｔリンーＢ
Ｏ（、’−Ｌ−システイン サイクル　３１ 樹脂ペプチド合成のすべての工程に使用する反応槽は頂
部に物質添加用の入口を備え、底部に可溶性反応混合物
と洗浄浴ｔｓ、を一過によって除去するためのガラス内
板を偏えたガラス槽でありうる。濾過は真空または窒素
圧の使用によって行なうことができる。反応槽内容物は
槽全体をｈｓすることによつ【又は機械的攪拌によって
かきまぜることができる。
サイクル３１において、ＢＢＡ樹脂を反応槽に入れ、溶
媒（たとえばメチレンクロライド、クロロホルム、ジメ
チルホルムアミド、ベンゼン、′またはそれらの均等物
）中に樹脂？当り溶媒３〜１２ｄの割合で懸濁させる。
これにＢＯＣ−Ｌ−プロリンを使用するＢ１１Ａ欄脂の
遊離アミン当蓋当り約１〜６当量の童で加える。５〜１
０分間混合した後、カップリング剤たとえはジシクロへ
キシルカルボジイミド（ＤＣＣ）を加える。他のジイミ
ド・カップリング剤を使用することもできる。ジイミド
・カップリング剤は使用するＢＯＣ−Ｌ−プロリン当蓋
当９０．５〜２．０等量で使用することができる。
ＢＥ）Ｃ−Ｌ−プロリンは七の活性エステル誘導体、そ
のアジド誘導体、その対称無水物誘導体、または適当に
えらはれた混合無水物誘導体馨使用する場合にはカップ
リング剤の不存在下で結合させることができる。使用し
うる活性エステルｕ導体は２−ニトロフェニル−エステ
ル、１４−二トロフェニルーエステル、ペンタフルオロ
フェニル・エステル、Ｎ−ヒドロキシサクシニミド・エ
ステルまたはその均等物である。活性エステルはＢ１１
Ａ樹脂の遊離アミン当量当り１〜ｌＯ当量の蓋で使用さ
れる。
ＢＨＡ樹脂、溶媒、ＢＯＣ−Ｌ−＋）ジン、およびカッ
プリング剤またはＢＯＣ−Ｌ−プロリン活性エステルか
ら成る反応混合物を、試験試料についてのニンヒドリン
試験（Ｅ、Ｉ（ａｉａ＊ｒ＊　ｇｇ　ａｌ、、　Ａｎａ
ｌ、　Ｈゼロｅｈａｍ、　＋　３４．５９５−８（１９
７０））によって示されるように反応が完了するまで、
機械的に攪拌もしくは振盪する。カップリング反応の完
了後、ＢＯＣ−Ｌ−プロリン樹脂を溶媒（たとえばメチ
レンクロライド、クロロホルム、メチルアルコール、ベ
ンゼン、ジメチルホルムアミド、または酢酸）で洗浄す
ることができる。洗浄溶媒は最初に使用したＢＩＩＡ樹
脂２当り５〜２〇−溶媒が好適である。完了前にカップ
リング反応を終結させることを望むならば、洗浄法を使
用することができ、セしてＢＯＣ−Ｌ−プロリン樹脂上
の残存遊離アミノ基は過剰のアセチｈ化剤を用いるアセ
チル化によって更に反応が進むのを阻止することができ
る。このアセチル化法はＢＯＣ−Ｌ−プロリン樹脂をア
セチル化剤溶液と共に０．５〜１２時間かきまぜること
によって行な５ことができる。メチレンクロライド浴液
中のＮ−アセチルイミダゾール、またはクロロホルム中
の無水酢酸とトリエチルアミンとの混合物、のようなア
セチル化剤を使用することができる。アセチル化剤は出
発ＨＭＡ樹脂の遊離アミン当蓋当９０．５〜５．０当量
の量で使用することができる。
Ｂｕｔ’−Ｌ−プロリン樹脂を製造するためのカップリ
ング反応は次の反応式によって表わすことができる。
上記のようｖＣシて製造したＢＯｔ”−Ｌ−プロリン樹
脂は上述のような溶媒で洗浄し、そしてこれ′ｆｔ浴媒
溶媒とえばメチレンクロライド、クロロホルム、ベンゼ
ンまたはその均等物）中のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）
の混合物のような試剤と共にかきまぜることによって保
護基を除去することができる。溶媒中のＴＦＡの債は始
めに使用したＢＨＡ樹脂２当り３〜２０−の範囲で変え
ることができる。反応時間は約１０分〜４時間の範囲で
ありうる。保護基除去工程は濾過してＴ　ＦＡ　ｆｆ４
ｔ／Ｘ’ｌ除去することによって終了する。
残存ＴＦＡはＢＨＡ衝脂Ｖ当り３〜２０−の５〜３０％
トリエチルアミンｆ＠ｉ（メチレンクロライド、クロロ
ホルム、ベンゼン、またはそれらの均等物のような溶媒
中）で洗浄することによってＬ−プロリン樹脂から除去
することができる。トリエチルアミンの代りに他の第３
級または第２級有機アミン（たとえばトリメチルアミン
、Ｎ−エチルピペリジン、ジイソプロピルアミン、また
はそれらの均等物）を使用することもできる。Ｌ−プロ
リン樹脂の遊離アミン量は１）ｏｒｍａｎ滴足法によっ
て測定することができる２３１９−２１）。上記の保護
基除去反応は次の反応式によって表わすことができる。
サイクル　３０ サイクル３１の結果とし【見られたプロリル−Ｂｌｉ　
Ａ樹脂はカップリング溶媒に懸濁させ、ＨＯ（、’−０
−Ｂｚ　−Ｌ−スレオニンを加え、そして混合物を四様
に千両させることができる。カップリング剤ＤＣＣを加
え、イサチン試験によって示される反応の完了後に（Ｅ
、Ｋａ４ｓｍｒｒ　ａｔ　ａｔ・・反応混合物を濾過に
よってＢＯＣ−０−Ｂｍ−スレオニルプロリルＨ１１Ａ
樹脂から除去することができる。ペプチド樹脂を溶媒で
洗浄する。反応試剤の菫、溶媒の量、および反応時間は
サイクル３１において述べたのと同じであってよい。Ｂ
ＯＣ基はサイクル３１において述べた保護基除去法によ
ってペプチド樹脂から除去することができる。生成する
０−Ｈｚ−スレオニルプロリル−Ｈｌ１Ａ樹脂は次いで
サイクル２９に供せられる。サイクル３０の反応は次の
反応式によって宍わすことができる。
ｆｋ ｆｈ 便亘上、この生成樹脂ペプチドを略号を使用して次のよ
うに記述する。
サイクル　２９ サイクル２９において、カップリング反応も保諌基除去
反応もサイクル３０と同様に行なわれるが、Ｂｏｃ−ｏ
−Ｂｇ−Ｌ−スレオニンの代りにＢＯＣ−グリシンが使
用される。カップリングおよび保訛基除去の反応は次の
ように表わされる。
サイクル　２８ サイクル２８において、カップリングと保護基除去の反
応はサイクル３０と同様に行なわれるが、アミン＃１誌
導体としてＢＯＣ−０−Ｂｓ−Ｌ−セリンが使用される
。これは次のように懺わされる。
サイクル　２７ サイクル２７において、カップリングと保護基除去の反
応はサイクル３０と内Ｊｉに行なわれるが、アミノ酸試
剤としてＢＯＣ−グリシンが使用される。これらのカッ
プリングと保護基除去の反応は次のように表わされる。
このサイクルにおいて、四じアミノ酸試剤を使用してサ
イクル３０と同様にカップリングおよび保護基除去の反
応が行なわれ、次の化合物がえられる。
サイクル　２５ サイクル２５において、カップリング反応はＢＯＣ−Ｌ
−アスパラキンの粘性エステル誘導体を使用して行なう
。
ＤＤＣカップリング剤の代りにＢＯＣ−Ｌ−アスパラギ
ンまたはＨＯＣ−Ｌ−グルタミンを用いる活性エステル
法を使用スる。ＢＯＣ−Ｌ−アスパラギンのＩ′６性エ
ステルを使用する反応はＢｌｉ　Ａ樹脂の遊離アミン当
賃当９２〜ｌＯ当゛量の１で、始めに使用したＢＨＡ衛
脂Ｖ当り２〜２０−の量の溶媒（ジメチルホルムアミド
；ジメチルホルムアミドとベンゼン、メチレンクロライ
ド、クロロホルムまたはそれらの均等物との８モ合物）
中で竹なうことができる。
反応時間は１〜７２時間のｌ１ｉＩ［！曲にある。反応
混合物はニンヒドリン試験によって示される反応完了後
に濾過によりてＥＯＣペプチド樹脂から除去することが
できる。使用する活性エステルｕ４体は２−ニトロフェ
ニルエステル、４−ニトロフェニルエステル、ペンタフ
ルオロフェニルエステル、またはそれらの均等物であり
うる。我々は誘導体の活性エステル部分を示すためにＡ
Ｅを使用する。カップリング反応は次のように記述する
ことができる。
ＢＯＣ基を除去するための保護基除去反応はサイクル３
１のようにして行なう。
サイクル２４〜２６のそれぞれにおいて、カップリング
反応および保護基除去反応はＢＯ（、’−０−Ｂｚ−Ｌ
−スレオニン（サイクル２４）、Ｂ　Ｏｔ’−オメガ−
Ｔ−Ｌ−フルギニン（サイクル２３）、ＢＯＣ’−Ｌ−
プロリン（サイクル２２）、ＢＯＣ＃−Ｌ−チロシン（
サイクル２１）およびＢＯＣ−０−Ｂｓ−Ｌ−スレオニ
ン（サイクル２０）を使用して、サイクル３０に述べた
ような方法と反応試剤割合を用いて行なうことができる
。サイクル２０の完了から見られる化合物は次のように
表わされる。
サイクル２０において、カップリング反応および＆ａ基
除去反応はＢＯＣ−０−Ｂｓ−Ｌ−スレオニンをアミ／
ｆＭ導体として使用し、サイクル２５に危べた方法と反
応試剤割合を使用して行なうことができ、次の化合物か
えられる。
サイクル　１９ サイクル１９において、ＢＯＣ”−Ｌ−グルタミン活性
エステルをアミノ酸誘導体として使用し、サイクル２５
に述べたようにして反応を行なう。サイクル１９がらえ
られる化合物は次のとおりである。
サイクル　１８ サイクル１８におい１、ＢＯ（、’−イプシロンーＶ−
Ｌ−リジンをアミノ酸誘導体として使用することができ
る。また、サイクル１８の方法はサイクル３０で述べた
ようにして行なうことができる。次の化合物がえられる
。
サイクル１７〜１５はＢｕｔ’−Ｎ（イ鴨）−Ｖ−Ｌ−
ヒスチジン（サイクル１７　）、ＨＯＣ−Ｌ−アラニン
（サイクル１６）およびＢＯＣ−Ｌ−グルタミンｆｌｌ
Ｈｇエステル（ＢＳはセリンおよびスレオニンについて
表わされるのと同じ基を表わす）（サイクル１５）を使
用して、サイクル３０で述べたようにして行なうことが
できる。サイクル１５から次の化合物がえられる。
サイクル　１４〜８ サイクル１４はＢＯＣ−Ｌ−グルタミン酸をアミノ酸誘
導体として使用し、サイクル１９と同様にして行なうこ
とができる。サイクル１３〜８はＢＯＣ−０−Ｈａ−Ｌ
−セリン（サイクル１３　）、ＢＯＣ−Ｌ−ロイシン（
サイクル１２）、ＢＯＣ−イプシロン−Ｖ−Ｌ−リジン
（サイクル１１）、ＢＯＣ−グリシン（サイクルｌｏ）
、ＢＯＣ”−Ｌ−ロイシン（サイクル９）、およびＢＯ
Ｃ−Ｌ−バリン（サイクル８）を使用し、サイクル３ｏ
で述べたようにして行なうことができる。次の化合物が
えられる。
サイクル　７ サイクル７はＢＯＣ−５−エチルチオ−Ｌ−システィン
またはその均等物をアミノ０誘導体として使用する以外
はサイクル３０で述べたようにして行なうことができる
。サイクル７から見られる化合物は次式によって表わさ
れる。
ＣＲｔはアルキルチオまたはＢｓ基である。〕サイクル
６〜１２はＢ　ＯＣ−０−Ｈｓ−スレオニン（サイクル
６）、ＢＵＣ−Ｕ−Ｂ廖−Ｌ−セリン（サイクル５と２
）、およびＢＯＣ−Ｌ−ロイシン（サイクル４）をアミ
ノ酸誘導体として使用し、サイクル３０のようにして行
なうことができる。サイクル３はＥＯＣ−Ｌ−アスパラ
ギン活性エステルを使用してサイクル２５と同様に行な
うことができる。サイクル２からえられる化合物は次の
とおりである。
ｐｇ　　　　　　Ｅｘ　　Ｂｚ　　Ｒ１Ｓ＃ｒ−Ａｓｓ
−Ｌａｓ−８ａｒ−Ｔｈｒ−Ｃｙａ−Ｇｌｙ−１＃％−
Ｇｌｙ　−サイクル　ｌ このサイクルはＢ　ＯＣ−Ｅｌ　−Ｒ，−Ｌ−システィ
ン誘導体を使用してサイクル７と同様に行なわれる。こ
のシスティンのためＫえらばれるＲ、基はサイクル７で
使用したものと同じであってもよく、あるいは異なって
いてもよい。たとえば、サイクル７についてえらばれた
誘導体がＥＯＣ−’１〜エチルチオーＬ−システィンで
あるならば、サイクル１の誘導体はＢＯＣ−５−４−メ
トキシベンジル−Ｌ−システィンであってもよく、ある
いはＢＯＣ−５−４−メトキシベンジルがサイクル７に
えらばれたならば、この誘導体またはＢＯＣ−５−エチ
ルチオ−Ｌ−システィンをサイクル１に使用してもよい
。サイクルｌから見られる化合物は次式によって表わさ
れる。
（Ｒｔは５−５−アルキル、Ｃｙ　ａまたはＢｇであり
；Ｒ２は５−ｓ−アルキルまたはＢｓであるが、Ｒ２が
ＢｇであるときＲ３は５−ｓ−アルキルまたはＣｙｓで
あり；Ｒ１が５−ｎ−アルキルであるとき）（、はＢｇ
である。〕サイクル１は樹脂ペプチドの完成を表わす。
この樹脂ペプチドは反応槽から取出して真空中で乾燥す
ることができる。樹脂ペプチドの１積は合成の始めに使
用したＢｌｉ　Ａ樹脂の２．０〜３．５倍であると予期
される。
ペプチドは液体弗化水素（ＩｉＦ）による処理によって
、アシル化サイクルから見られる樹脂ペプチドから開裂
される。このＨＦ開裂反応は樹脂ペプチドとアニソール
（樹脂ペプチドを当り０．５〜５−）との混合物を（樹
脂ペプチド１当り２〜２０ｓＩ／の液体１１Ｆで）０．
５〜２０時間−２０℃〜＋１５℃の温度で処理すること
によって行々われる。反応期間の後に、過剰のＨＦを蒸
発によって除き、生成するペプチドと樹脂ビーズとの混
合物を有機溶媒（たとえば工チルアセテート、ジエチル
エーテル、ベンゼンなど）で抽出してアニソールと残存
１１Ｆを除くことができる。ペプチドは抽出によって樹
脂ビーズから水性酢酸中に分離することができる。この
段階でのペプチドは環状ではなく、分子中の位置ｌのシ
スティンと位１１７のシスティンとの間にジサルファイ
ド結合のない非環状生成物の状態にある。
ＨＦ処理は、位置ｌまたは位［７のシスティン残基のチ
オール官能基上のＳ−アルキルチオ保護基を除いて、す
べての保護基をペプチドから除去する。５−ｓ−アルキ
ルチオ−Ｌ−システィン残基はＨＦ開裂法に対して安定
であり、開裂および抽出の操作を通してそのまま残る。
５−Ｈｓ−Ｌ−システィン残基はｌ１Ｆｔｃよって開裂
して遊離チオール官能基をもつシスティン残基を生ずる
。我々の合成過程におい℃、位［１および位置７におい
て両種の保護基を相互に組合せて使用した。
このようにして、ＢＰ開裂後にえられるペプチドは樹脂
ペプチド合成中に使用したシスティン誘導体のチオール
官能基としてえらんだ保護基に応じて４種のうちの１種
でありうる。
ＢＯＣ−５−Ｂｚ−Ｌ−システィン誘導体を樹脂ペプチ
ド合成のサイクル１に使用し、ＢＯＣ−５−ｔｓ−フル
キルチオ−Ｌ−システィンをサイクル７に使用する場合
、ＨＦ開裂恢にえられるペプチドは型！であり、位ｆｉ
ｌにおいて遊離のチオール官能基をもち、位置７におい
てシスティン残基上に５−ｎ−アルキルチオ基をもつ。
我々はこの株のペプチドを型■のペプチドと呼ぶ。この
ものは次式によって表わされる。
−Ｇｌｙ−Ｌｙａ−Ｌａｘ−５ａｒ−Ｇｉｎ−Ｇｌｓ−
Ａｌａ−Ｈ４ｓ−Ｌｙｅ−Ｇｉｎ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｐ
ｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｈｅ−Ａｓｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−５ａ
ｒ−Ｇｌｙ−Ｔｋｒ−Ｐｒｏ−Ｎｉｌ。
逆に、ＢＯＣ−５−ｎ−アルキルチオ−Ｌ−システィン
誘導体がサイクル１ｖｃ使用され、ＢＯＣ−５−Ｂｓ−
Ｌ−システィンが位ｆｆ１ｌｔ７に使用されると、開裂
から生じるペプチドは型■であって次式によって表わさ
れる。
Ｇｌ　ｙ−Ｌｙｅ−Ｌａｇ−５ａｒ−Ｇｉｎ−Ｇｌｓ−
ＡＬａ−１１ｉａ−１４ａ−Ｇｉｎ−Ｔｋｒ−Ｔｙｒ−
Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ａａｓ−Ｔｈｒ−ＧＬｙ−５
ａｒ−ＧＬ　ｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−ＮＨ。
位＆１において保護基５−ｎ−アルキルの代りにＳ−シ
ステイニル基を使用することができる（この場合、この
位置のシステムはシスティン基を形成する）。これを行
なうとき我々は位置７のシスティンを保護するためにＢ
ｓ基を使用する。Ｂｉｇ−ＢＯＣ−Ｌ−シスチンをサイ
クル１の試剤として使用し、ＢＯＣ−５−Ｈｔ−Ｌ−シ
スティンをサイクル７の試剤として使用するならば、開
裂から生ずるペプチドは型■のものであり、次式によっ
て表わされる。
Ｇｉｇ−Ｌｙｌ−Ｌｍｓ−５ｅｔ−Ｇｌｓ−Ｇｌｘ−Ａ
ｌａ−Ｈ４ｓ−Ｌｙｅ−Ｇｉｎイｋｒ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ
−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ａｓｓ−１°ルｒ−Ｇｌｙ−５ａｒ
−ＧＬｙ−Ｔｈｒ−ｐｒｏ−ＮＨ。
ＢＯＣ−５−Ｈｚ−Ｌ−システィンを位置１と位置７の
双方の試剤として使用すると、開裂から生じるペプチド
は型ＩＶＯものであり、次式によって表わされる。
Ｃ’ｙａ−５ａｒ−Δａｎ−Ｌａｓ−５ａｒ−Ｔ　ｈｅ
−Ｃ’ｙａ−Ｇｌ　ｙ−Ｌａｓ−Ｇｌｙ−Ｌｙｅ−Ｌｍ
ｓ−５ａｙ−Ｇｉｎ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｈ４ｓ−Ｌｙｅ
−Ｇ１％−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−
Ａａｓ−Ｔｈｒ−ＧＬｙ−５ａｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐ
ｒｏ−ＮＨ。
型１．１［およびｍのペプチドから環状ジサルファイド
・ペプチドへの変換は、ＨＦ開裂からの粗ペプチドの酢
酸水溶液を蒸留水で、開裂した樹脂ペプチド２当り５０
〜２０〇−の最終谷−１１Ｋまで希釈することによって
行なわれる。この溶液のｐｕは水酸化アンモニウム溶准
の添加により５〜１０に調節することができ、そして混
合物は不活住ガス（たとえば窒素）の流れのもとて約２
〜４８時間密閉容器中で攪拌することができる。ηＣ出
ガス流がもほや鴇−アルキルメルカプタンを含まなくな
ったとき反応を停止させることができる。反応混合物の
ｐＨは氷酢酸の絵加によって約３．５〜５．５に低下す
ることができる。
型■のペプチドから環状ジサルファイド・ペプチドへの
変換は、当業技術にとって周知の古典的方法によって行
なわれ、そこではペプチドが酸化されて位置ｌおよび位
置７においてシスティンを含むように環化される。
中間体ペプチドが型！、［１１１１１〜！たは■のいづ
れであっても、周知の任意のカルシトニンに対応するア
ミノ酸の釦をもつペプチドを合成することができる。こ
こに述べたようにして合成されたこのようなペプチドは
精製することができ、そして周知のカルシトニンと四じ
種類の生物学的活性をもつことがわかった。このように
合成されたカルシトニンは８−グリシン、１６−アラニ
ン、デス−１９−ロイシン−カルシトニンと呼ばれる。
これはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ命名法に準拠している。
上記の合成からのｐＨ５の粗ペプチド浴液はイオン交換
法を使用して濃縮することができる。濃縮物はゲル濾過
法、イオン交換クロマトグラフ法、および分配クロマト
グラフ法の組合せによって精製することができる。最終
の精製物は溶液からの凍結乾燥によって「ふわふわした
」白色固体として見られる。生成物は所望のペプチドの
正しいアミノ酸分析値を与える。
〔実施例〕
下記の実施例によって本発明を更に具体的に説明する。
実施例１゜ 樹脂活性化 ０．６１ｆＩ％ａ　ｑ　／　ｆのアミン滴定麓をもつＢ
ＢＡ樹脂（５ｔ）をペプチド合成器〔米国アリシナ州タ
クソンのベガ・バイオケミカルスから市販〕に入れた。
樹脂を次の溶媒（各２５１１１ｔ）で処理し、それぞれ
の処理後に濾過した。
メチレンクロライド　　　２分間 クロロホルム　　　　　　２分間づつ２回りロロホルム
中１０％トリエチルアミン　５分間づつ２回クロロホル
ム　　　　　２分間 メチレンクロライド　　２分間づつ３回サイクル３１ カップリング：　上記のＢＨＡ樹脂、２５−のメチレン
クロライド、および１．３ｉ（０，００６１モル）のＢ
ＯＣ−Ｌ−プロリンを１０分間かきまぜた。ジシクロへ
キシルカルボジイミドのメチレンクロライド溶液６．１
　ｍ　（浴液１〜当りＤＣＣｌ　ミ！Ｊ当量）を反応器
に加え、混合物′？：６時間かきまぜた。反応混合物を
濾過によって反応器から除き、ＨＯＣ−プロリルＢＨＡ
樹脂を濾過によって反応器から除き、次の溶媒（各２５
−）で次々に２分間づつ処理した。
メチレンクロライド　　　２し１ メチルアルコール　　　　２回 メチレンクロライド　　　３回 アセチル化：　次いでこの樹脂を１．５−のトリエチル
アミン（ＴＥＡ）、１７！の無水的！丸および２５ｍ１
のクロロホルムから成る混合物と２時間かきまぜた。こ
の反応混合物を濾過により除き、樹脂を次の溶媒（各２
５ｍ／）で２分間づつ洗った。
クロロホルム　　　　２回 メチルアルコール　　２回 メチレンクロライド　３回 保護基除去：　　ＢＯＣ保循側脂樹脂５−のトリフルオ
ロ酸ｍｃＴＦＡ）と１５ｔＩｔのメチレンクロライドと
の混合物と５分間かきまぜた。この混合物を濾過によっ
て除き、樹脂を１５−のＴＦＡと１５ｍ１のメチレンク
ロライドとの第２７Ｍ、合物と３０分間かきまぜた。反
応混合物を濾過によって除き、樹脂を次の溶媒（谷２５
−）で洗浄した。
メチレンクロライド　　　　２分間づつ２回メチルアル
コール　　　　　２分間づつ２回クロロホルム　　　　
　　２分間づつ２回りロロホルム中１０％ＴＥＡ　　１
０分間づつ２回クロロホルム　　　　　　　２分間づつ
２回メチレンクロライド　　　　２分間づつ２回このＬ
−プロリンＢＢＡ樹脂を滴定してアミン（プロリン）の
滴定量を求めた。この値は樹脂？当り０．５５　ミＩ）
当量のアミン（プロリン）であった。
サイクル３０ カップリング二　上記の樹脂、２５−のメチレンクロラ
イド、および１．６４ｆ（０，００５３モル）のＢＯＣ
−０−ベンジル−Ｌ−スレオニンを１０分間かきまぜた
。次いでジシクロへキシルカルボジイミドのメチレンク
ロライド浴Ｑ５．５ｄ（ｌ　ミＩＪ当ｉ）を反応器に加
え、混合物を２時間かきまぜた。反応混合物を反応器か
ら除き、樹脂を次の溶媒（各２５ｓｄ）で次々に２分間
づつ洗浄し、洗浄液を濾過により除いた。
メチレンクロライド　　　　２１１．！１メチルアルコ
ール　　　　　２回 メチレンクロライド　　　　３回 イサチン試験は陰性であった。
保護基除去：　サイクル３１に述べた保護基除去操作を
このサイクルについて（りかえした。
これらのサイクルに使用したカップリングおよび保護基
除去の操作はスレオニン誘導体の代りに次のアミノ酸−
導体を使用した以外はサイクル３０と同じであった。
サイクル２９・・・０．９３ｆ（０，００５３モル）の
ＢＵＣサイクル２８・・・１．５５Ｍ（０，００５３モ
ル）のＢＯＣ−０−ベンジル−Ｌ−セリン サイクル２７・・・サイクル３０で使用した試剤と同じ
サイクル２６・・・サイクル３１で使用した試剤と同じ
サイクル２５ カップリング：　サイクル２６でえたペプチド樹脂を各
２５−のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）で２回洗った
。
次いでこの樹脂なりＭＦ３５ｄ中のＢＯＣ−Ｌ−アスパ
ラギン−ｐ−ニトロフェニルエステル２．８２ｆ（０，
００８モル）の溶液と２４時間かきまぜた。反応混合物
を濾過し、樹脂ペプチドを次の溶媒各２５−で各２回次
々に洗浄した：ＤＭ　Ｆ、メチレンクロライド、メタノ
ール、メチレンクロライド。それぞれの個々の溶媒を濾
過によって除いた。ニンヒドリン試験は陰性であった。
保護基除去二　サイクル３１に使用した保護基除去操作
をくりかえした。
サイクル２４ カップリングと保護基除去の操作はサイクル３０で使用
のと同じであり、同じ試剤を同じ量使用した。
サイクル２３ カップリング：　サイクル２４でえた樹脂ペプチドをＤ
ＭＦ各２５−で２回洗った。次いで樹脂ペプチドを３．
４２ｆ（０，００８モル）のＢＯＣ−Ｎ−オメガ−トシ
ル−Ｌ−アルギニンと２５−のＤＭＦとの混合物と１０
分間かきまぜた。次いでメチレンクロライド中のＤＣＣ
８ｔｎｔ（０，００８モルのＤＣＣに相当）を加え、混
合物を６時間かきまぜた。反応混合物を濾過によって除
いた。樹脂ペプチドを次の溶媒（各２５−）で２ｂｊづ
つ次々に洗った：ＤＭＦ、メチレンクロライド、メチル
アルコール、メチレンクロライド。ニンヒドリン試験は
陰性であった。
保護基除去：　サイクル３１で使用した保護基除去操作
をくりかえした。
サイクル２２ カップリング：　サイクル２３でえたペプチド樹脂を１
．７２Ｐ（０，００８モル）のＢ　Ｏ（、’　−Ｌ−プ
ロリンと２５−のメチレンクロライドとの混合物と１０
分間かきまぜた。
メチレンクロライド中のＤＣＣ８ｄ（０，００８モルの
ＤＣＣに相当）を加え、混合物を６時間かきまぜた。反
応混合物を濾過によって除き、樹脂ペプチドを次の溶媒
（各２５ｆＩＬｔ）で２回づつ次々に洗った：メチレン
クロライド、メチルアルコール、メチレンクロライド。
それぞれの個々の洗浄液を濾過によって除いた。ニンヒ
ドリン試ａは陰ａであった。
保護基除去：　サイクル３１で使用した保護基除去操作
をくりかえした。
サイクル２１および２０ このサイクルで使用したカップリングと保護基除去の操
作はカップリング反応においてＢＯ（、’−Ｌ−プロリ
ンの代りに次のアミノ酸誘導体を使用した以外はサイク
ル２２と同じであった。
サイクル２１・・・４．０７ｆ（０，００８モル）のＢ
ＯＣ−０−２−ブロモベンジル−オキシカー ボニル−Ｌ−チロシン サイクル２０・・・２．４７ｆ（０，００８モル）のｎ
ｏｃ−Ｏ−ベンジル−Ｌ−スレオニン サイクル１９ このサイクルの操作はアスパラギン≧＃ｊ４体の代りに
２．９４ｒ（０，００８モル）のＢｔ）Ｃ−Ｌ−グルタ
ミン−ｐ−ニトロフェニルエステルを使用した以外はサ
イクル２５と同じである。
これらのサイクルの操作はスレオニン誘導体の代りに次
のアミノ酸誘導体を使用した以外はサイクル３０と同じ
である。
サイクル１８・・・２．２０ｆ（０，００５３モル）の
Ｈｔ）Ｃ−イプシロン−２−クロロ−ベンジロ キシ−Ｌ−リジン サイクル１７・・・２．０６？（０，００５３モル）の
ＢＵＣ−Ｎ（４％）−カルボベンジロキシ−Ｌ−ヒスチ
ジン サイクル１６・・・１．０６ｆ（０，００５３モル）の
ＢＯＣ−Ｌ−アラニン サイクル１５・・・１．７９ｆ（０，００５３モル）の
ＢＯＣ−クルタミン酸−カンマーベンジルエ ステル サイクル１４ サイクル１９と同じ。
サイクル１３ このサイクルの操作はカップリング反応においてプロリ
ン誘導体の代りに２．３６Ｆ（０，００８モル）のＢＯ
Ｃ−０−ベンジル−Ｌ−セリンを使用した以外はサイク
ル２２と同じである。
このサイクルの操作はカップリング反応においてスレオ
ニン誘導体の代りに次のアミノ酸誘導体を使用した以外
はサイクル３０と同じである。
サイクル１２・・・サイクル１９で使用した試剤と同じ
サイクル１１・・・サイクル１８で使用した試剤と同じ
サイクル１０・・・サイクル２９で使用した試剤と同じ
サイクル９・・・サイクル１９で使用した試剤と同じサ
イクル８ カップリング：　サイクル９からの樹脂ペプチドを１．
４゜ｒ（ｏ、ｏｏｓモル）のＢＯＣ−Ｌ−グリシンおよ
び２５−のメチレンクロライドと１０分１０」かきまぜ
た。次いでメチレンクロライド中のＤＣ”Ｃ’ＢｍｔＣ
０，００８％ルのＤＣＣに相当）を加え、混合物？：１
６時間かきまぜた。反応混合物を濾過によって除いた。
樹脂ペプチドを次の溶媒（各２５−）で２回づつ洗った
：メチレンクロライド、メチルアルコール、メチレンク
ロライド。それぞれの個々の洗浄液を濾過によって除い
た。
保護基除去：　サイクル３０と同じ。
サイクル７ サイクル７の操作はカップリング反応においてスレオニ
ン誘導体の代りに１．５（Ｈ’（０，００５３モル）の
ＢＯＣ−５−エチルチオ−Ｌ−システィンを使用した以
外はサイクル３０と１川じてあった。
サイクル６ 使用した試剤と操作はサイクル３０と同じであった。
サイクル５ 使用した試剤と操作はサイクル２８と同じであった。
サイクル４ 使用した試剤と操作はサイクル１６と同じであった。
サイクル３ 使用した試剤と操作はサイクル２５と同じであった。
サイクル２ 使用した試剤と操作はサイクル２８と１ｍｊじてあった
。
サイクル１ スレオニン誘導体の代りに１．８１？（０，００５３モ
ル）のＢＯＣ−５−ｐ−メトキシベンジル−Ｌ−システ
ィンを使用した以外は使用した試剤と操作はサイクル３
０と同じであった。
サイクルｌの完了後、樹脂ペプチドを最後に各２５艷の
５−へキサンで２回洗った。ペプチド物質を反応器から
除き、真空オープン中で０．１　ｍｍ１ｉｙの圧力、４
０℃の温度で２４時間乾燥した。
乾燥樹脂ペプチド（２ｆ）およびアニソール（２ｄ）を
テフロン反応槽に入れた。テフロン被覆磁石かくはん機
付きの反応槽をドライアイス・アセトン浴に入れ、１５
ｄの弗化水素ガスを反応槽中で凝縮させた。この混合物
を水浴中で０℃に１時間かくはんした。弗化木葉を減圧
で蒸発させて除いた。残渣な２５−づつ６回のエチルア
セテートですりつぶした。０．１モル濃度酢酸水溶液１
２０ｙｄＫよりペプチドを樹脂ビーズから抽出しｔム ベプチドの環化 弗化水素開裂からえられた水性酢酸抽出物を蒸留水８０
ｄの添加により２００−にまで希釈した。濃水酸化アン
モニウムの添加により溶液の、Ｈな７．５に調節した。
この溶液を窒素気流下にそ閉容器中でかくはんした。こ
の時点で流装置素気流中にエチルメルカプタンは検出さ
れなかった。
窒素気流中のエチルメルカプタンは該気流をエルマン試
薬溶液（Ｅｌ　ｊｍａｓ＋　　Ｇ、Ｌ、、Ａｒｃｈ、Ｂ
ｉｏｃｈａｍ、Ｈｉｏｐｈｙａ　。
８２．７Ｏ−７（１９６９）］に通すことによって測定
した。反応混合物の、Ｈは氷酢酸の添加により５．０に
調節した。
上記合成からのｐＨ５，０の浴液２００ｒｎｔを５Ｐ−
２５イオン交換カラムを使用して濃縮した。０．７５モ
ル濃度の塩化ナトリウム溶液を用いてカラムから除いた
２５−の濃縮物をセファデックスＧ−２５＜微細）ゲル
濾過カラムを通すことによって脱塩および精製し、０゜
０３モル濃度の酢酸水浴液で溶離させた。こりカラムか
らの”ｔｔ’＊Ａｌａ”。
ｄａｍ−Ｌａｓｌｌｌ−５ＣＴ留分を水酸化アンモニウ
ム浴液の賂加によｒ）ｐＨ６，０に調節した。この溶液
をＳノ′−セファデックスＣ−２５イオン交換カラムを
使用して濃縮した。
０．７モル濃度の塩化ナトリウム浴液によりカラムから
除いた３０−の濃縮物をセファデックスＧ−２５Ｃ微細
）ゲル濾過カラムを用いて脱塩した。ペプチド留分を集
めて凍結乾燥した。この物質をウォーターズｃ−１ｓミ
ュー・バンドパック１９Ｘ５０冨凰（内径）カラム上で
傾斜溶離を使用して更に精製した。使用した溶媒は（ａ
）水／アセトニトリル／トリフルオロ酢酸（９０／１０
１０．１　）および（６）水／アセトニトリル／トリフ
ルオロ酢酸（９０／６０１０．１　）であった。すべて
の操作について流量は８．０ｍ（７分であった。このペ
プチドを溶媒Ａにとかし、カラムに加えた。カラムを１
２０−の溶媒Ａで洗った。２０分間にわたつ【のＯ％Ｂ
から５０％Ｂへの傾斜を使用してペプチドを溶離した。
溶離液を８−づつの留分に集めた。９５％より大きい相
対面積％純度を示すこれらの部分を集めた。回収したペ
プチドをＨＣｌ塩にイオン交換し、セファデックスＣ−
２５ゲル濾過し、セファデックスＧ−２５処理し、そし
て凍結乾燥した。
生成物を「ふわふわした」白色固体として得た。生成物
のアミノ酸分析はカッコ内に示す理論値に対し１次の比
を与えたｏ　Ａｌａ　１．０（１１、’ｓｐ２．０（２
１、”ｌ’ｈｒ　５．２（５１，５ａｙ３、８　（４１
、Ｇｌ　ｍ　２．８　（３１、Ｐｒｏ　２．０（２１、
Ｇ！１４．０（４１、Ｌａ５３、０　（３１、ＩＮａ　
０．９２（１）、Ｌｙａ　１．９（２）、Ａｒｙ　Ｏ，
９４（１１、Ｃｙｓ　１．９１（２）、Ｔｙｒ　Ｏ，９
１（１１゜８−グリシン、１６−アラニン、デス−１９
−ロイシンーサーモンーカルシトニンの生物学的能力ｆ
　にｊ　ｙ　’　、　Ａｌ　ａ　”　。
ｄａｍ−Ｌｍｓ”−５ＣＴおよび合成サーモン・カルシ
トニン僚準物の等吸付は調剤量の投与後の血清カルシウ
ムａａの減少を比較することによって測定した。ラット
を７匹づつのグループに分け、それぞれのグループに標
準溶液または試験溶液の調剤量をランダムに与えた。調
剤量応答曲線の線状部分から低調剤量および高調剤量な
えらんだ。サーモン・カルシトニン標準物について、こ
れらの値はそれぞれ０．７および２．Ｌ叶ペプチド／１
０ｏｒＢｒであった。これははｉ３および９ＭＵ／１０
０ｆｌＷである。ペプチドを皮下注射（０，２ｍ／１０
０ｆＨＷ）ＶＣよって与え、１時間後に採血して血清カ
ルシウムを測定した。採血後２時間以内に血清を処理し
分析した。結果を２Ｘ２平行線分析（Ｇａｄｄｕｎ、　
Ｊ　、Ｈ，、Ｊ、Ｐｈａｎｍ、　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ　
、　、　６．３４５（１９５３）］によって分析し？Ｑ
ｐ使用した標準サーモン・カルシトニンは独立に４．０
００１ｕＡより多くを含むと測定された。Ａｌｙ″、　
Ａｌａ”、　ｄｉｇ−Ｌａｓｓ”−５ＣＴ　は２．５０
０７　Ｕ／■で分析された。
本発明のある種の具体例を詳細に記述したけれども、多
くの他の特定の具体例が実施しうろこと、多くの変化が
行ないうろこと、およびこれらのすべてが本発明の精神
および特許請求の範囲内にあることが当業者にとって明
らかであろう。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、〔Ｎ−アルファ−Ｘ，８−グリシン，（１６−Ｙ）
    ，デス−１９−ロイシン〕カルシトニンから成ることを
    特徴とする変性カルシトニン〔ただしＸはＨ、Ｎ−α−
    アシル誘導体またはデス−１−アミノ誘導体であり；Ｙ
    はＬ−バリン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−アラニンまたはＬ
    −フェニルアラニンである〕。 ２、アシルが１〜１０個の炭素原子をもつカルボン酸；
    Ｌ−乳酸；またはマロン酸、コハク酸、グルタール酸も
    しくはアジピン酸の半アミドである請求項１記載の変性
    カルシトニン。 ３、次の構造をもつ請求項１記載の変性カルシトニン。 【遺伝子配列があります。】 （サーモン）。 ４、次の構造をもつ請求項１記載の変性カルシトニン。 【遺伝子配列があります。】 （うなぎ）。 ５、次の構造をもつ請求項１記載の変性カルシトニン。 【遺伝子配列があります。】 （チキン）。 ６、ＹがＬ−アラニンである請求項３記載の変性カルシ
    トニン。 ７、アミド生成条件下でα−アミノ酸または適当なデス
    −アミノ酸を正しい順序で加えて式〔Ｎ−アルファ−Ｘ
    ，８−グリシン，（１６−Ｙ），デス−１９−ロイシン
    〕カルシトニンを生成させ〔ただしＸはＨ、またはカル
    シトニンの位置１におけるシステインのＮ−アシル−ア
    ミノ（該アシルは１〜１０個の炭素原子をもつカルボン
    酸；Ｌ−乳酸；またはマロン酸、コハク酸、グルタール
    酸もしくはアジピン酸の半アミド；である）であるか、
    またはＸ−Ｃｙｓはデス−１−アミノであり；ＹはＬ−
    バリン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−アラニンまたはＬ−フェ
    ニルアラニンである〕、そして任意に保護基を除去する
    、ことから成ることを特徴とする変性カルシトニンの製
    造方法。 ８、生成する変性カルシトニンが次の構造をもつ請求項
    ７記載の方法。 【遺伝子配列があります。】 （サーモン）。 ９、生成する変性カルシトニンが次の構造をもつ請求項
    ７記載の方法。 【遺伝子配列があります。】 （うなぎ）。 １０、生成する変性カルシトニンが次の構造をもつ請求
    項７記載の方法。 【遺伝子配列があります。】 （チキン）。 １１、ＹがＬ−アラニンである請求項９記載の方法。 １２、請求項１記載の変性カルシトニンの有効量と医薬
    的に許容しうる担体とから成ることを特徴とする血中カ
    ルシウム濃度の調節用の医薬組成物。 １３、０．７〜２．１ｍｇの変性カルシトニン単位調剤
    量をもつ請求項１２記載の組成物。
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