JPH01222784A - 固定化アスコルビン酸酸化酵素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は固定化アスコルビン酸酸化酵素に関し、さらに
詳しくは、水不溶性固体粒子、例えば多孔質ガラスビー
ズに化学的に結合したアスコルビン酸酸化酵素及びこの
固定化アスコルビン酸酸化酵素を用いてアスコルビン酸
含有試料液からアスコルビン酸を除去する方法に関する
。

食品工業において、野菜や果物のジュース等の糖含有量
を測定することは、それらの品質を決める上で重要であ
り、また、医学的診断の分野においても、患者の尿、血
液などの体液中の糖および各種生体物質の含有量を測定
することは患者の病状を知る上で極めて重要である。

そのような試料中の糖および各種生体物質の含有量の測
定法としては、例えば、発色定量法（発色剤を加えるこ
とによって形成される色素を比色定量する方法）や電位
測定法（試料中に含まれる生体物質に特有の電位を電位
差計で測定する方法）等が簡便な方法として多用されて
いる。しかしながら、上記の如き生物試料には通常強力
な還元作用をもつアスコルビン酸が存在しており、この
アスコルビン酸が色素の形成や電位の測定を妨害する。

例えば、血中のカテコールアミンの量を電位測定法によ
って検出しようとする場合、アスコルビン酸の酸化還元
電位がカテコールアミンのそれと極めて近似しているの
で、血中のカテコールアミンの量を正しく測定すること
はできない。また、糖尿病患者が簡単な試験紙によって
自らの尿中のグルコース量を定量する場合、尿中に存在
するアスコルビン酸によって反応が妨害され、グルコー
スの量を実際より低く見積もるということがしばしば起
こる。

そのため、前述した如き生物試料中の糖含有量を発色定
量法や電位測定法で測定する場合には、生物試料から予
めアスコルビン酸を除去しておくことが必要である。生
物試料からアスコルビン酸を除去する簡便な方法として
、従来からアスコルビン酸酸化酵素を用いてアスコルビ
ン酸を不溶性なデヒドロアスコルビン酸に変える方法が
知られており、そのような方法としてアスコルビン酸酸
化酵素を成る種の担体に保持せしめて用いる方法も提案
されている［例えば、特公昭６２−１２９９５号公報参
照」。

本発明者らは取扱が簡便で酵素活性の低下が少なく安定
性に優れしかも繰返し使用できる固定化アスコルビン酸
酸化酵素を開発すべく研究を行ない、本発明を完成する
に至った。

しかして、本発明によれば、表面に多数の水酸基をもつ
水不溶性固体粒子にアミノ基含有シランカップリング剤
を介して共有結合されていることを特徴とする固定化ア
スコルビン酸酸化酵素が提供される。

本発明の固定化酵素において用いられるアスコルビン酸
酸化酵素は市販のものであってもよく、或イハキュウリ
、カポチャ、キャベツなどから抽出、分離したものでも
よく、例えばオリエンタルイースト社製「アスコルビン
酸オキシダーゼ、胡瓜製」、シグマケミカル社製「アス
コルビン酸オキダーゼ」、ベーリンガーマンハイム社製
「アスコルビン酸オキシダーゼ、カポチャ製」等が適し
ている。

一方、かかるアスコルビン酸酸化酵素を保持するのに使
用される水不溶性固体粒子は、表面に多数の水酸基をも
つものであれば有機系のものでも、無機系のものでもよ
く、例えばシリカゲル、アルミナ、ファルマシアファイ
ンケミカル社製セファロース４Ｂ及びセファロース６Ｂ
、多孔質ガラスビーズ、ポリサイエンス社製ガラスビー
ズｌＯ〜３０μ、１０５−１５０μ及び１５０−２１０
μ等が挙げられるが、中でも多孔質ガラスビーズが好適
である。例えばシグマケミカル社製「コントロールトポ
アグラスビーズＪ　ＰＧ３０００−２００、ＰＧｌｏｏ
Ｏ−１２０及びＰＧ２０００−２００などが有利に使用
できる。

本発明においては上記水不溶性固体粒子へのアスコルビ
ン酸酸化酵素の固定化は、アミノ基含有シランカップリ
ング剤を介して共有結合させることにより行なう。その
ために使用しうるアミノ基含有シランカップリング剤と
しては例えば次のものを挙げることができる。

３−アミノプロピルトリエトキシシラン、４−アミノブ
チルトリエトキシシラン、ｐ−アミノフェニルトリエト
キシシラン、４−アミノブチルジメチルメトキシシラン
、３−アミノプロピルジメチルエトキシシランなど。

これらのアミノ基含有シランカップリング剤の中では下
記式 ＯＲ” ■ Ｈ，Ｎ−Ｒ’−５ｉ−ＯＲ”　　　　（１）■ Ｏｆ？’ 式中、Ｒ１は低級アルキレン基を表わし、Ｒ２、Ｒ３及
びＲ１は同一もしくは相異なり、それぞれ低級アルキル
基を表わす、 で示されるアミノアルキルトリアルコキシシランが好適
である。

前述した表面に多数の水酸基をもつ水不溶性固体粒子へ
のアスコルビン酸酸化酵素の結合は、例えば、まず該水
不溶性固体粒子表面の水酸基を利用して該固体粒子に上
記アミノ基含有シランカップリング剤を反応させ、しか
る後、アミノ基と容易に反応する官能基、例えばアルデ
ヒド基、カルボキシル基、無水カルボキシル基、アシル
基などを２個有する二官能性試薬と反応させ、次いでア
スコルビン酸酸化酵素を反応させることにより行なうこ
とができる。

まず、水不溶性固体粒子とアミノ基含有シランカップリ
ング剤との反応は、通常適当な不活性媒体中で、例えば
アセトン、ベンゼン、トルエン等の媒体中で、室温ない
し溶媒の沸点好ましくは６０°Ｃ前後に加熱することに
より行なうことができる。

上記カップリング反応終了後、アミノ基含有シランカッ
プリング剤が結合した固体粒子を分離し、未反応のカッ
プリング剤を除去した後、二官能性試薬と反応させる。

用いうる二官能試薬としては、例えば、グルタルアルデ
ヒド、スクシンアルデヒド、フタルアルデヒド、マロン
アルデヒド、コハク酸、マロン酸、フタル酸、グルタル
酸、アジピン酸、ピロメリット酸無水物、グルタルクロ
ライド、スクシンクロライド、アジピンクロライドなど
が挙げられるが、中でも下記式 ％式％（） 式中　Ｒ４は低級アルキレン基を表わす、で示されるジ
アルデヒド類が好適である。

上記アミノ基含有シランカップリング剤が結合した固体
粒子と二官能性試薬との反応は、該二官能性試薬の官能
基の種類によって異なるが、例えば二官能性試薬として
ジアルデヒドを用いる場合には、反応媒体の不在下又は
適当な反応媒体中、例えば、蒸留水或いはメタノール、
エタノールなどのアルコール類等の中で、通常室温にお
いて、場合により約６０°Ｃまでの温度に加熱すること
により行なうことができる。

このようにして二官能性試薬と反応せしめられた固体粒
子は、未反応の二官能性試薬を除去した後、アスコルビ
ン酸酸化酵素と反応せしめられる。

この反応は適当な反応媒体中、例えば、蒸留水、リン酸
緩衝液、酢酸緩衝液（ｐＨ　４−７）等の中で、二官能
性試薬が導入された固体粒子とアスコルビン酸酸化酵素
とを接触させることにより行なうことができる。反応温
度は厳密に制限されるものではないが、一般にはＯ℃〜
室温、好ましくは０〜ｌＯ°Ｃの温度を用いることがで
きる。

かくして、水不溶性固体粒子にアミノ基含有シランカッ
プリング剤を介して共有結合した本発明の固定化アスコ
ルビン′酸酸化酵素が得られる。

かようにして調製される本発明の固定化アスコルビン酸
酸化酵素は、高い酵素活性を有しており、繰返し使用し
ても酵素活性の低下が少なく、しかも広いｐＨ範囲にわ
たって高い酵素活性を発揮し、さらに熱安定性、保存安
定性等の特性にも優れている。

かくして、本発明の固定化酵素は、例えば、アスコルビ
ン酸含有試料液からアスコルビン酸を除去するために有
利に使用することができる。

従って、本発明によればさらに、表面に多数の水酸基を
もつ水不溶性固体粒子に、アミノ基含有シランカップリ
ング剤を介して共有結合されている固定化アスコルビン
酸酸化酵素が充填された、両端に開口部をもつ小筒状カ
ートリッジの一方の開口部から、アスコルビン酸含有試
料液を導入し、カートリッジを振盪して該試料液中のア
スコルビン酸を上記アスコルビン酸酸化酵素と反応させ
た後、該カートリッジの他方の開口部から該試料液を排
出せしめることを特徴とするアスコルビン酸含有試料液
からアスコルビン酸を除去する方法が提供される。。

上記本発明の方法を、添付の第１図に示す一実施態様を
参照しつつさらに具体的に説明する。

まず、前述した本発明の固定化アスコルビン酸酸化酵素
（１）を、図示のように両端に開口部（３）、（４）を
もつ小筒状カートリッジ（２）に充填する。その場合、
充填した固定化酵素（１）がカートリッジ（２）の開口
部（４）から脱落しないように、開口部（４）は通液性
ストッパー（５）、例えば綿、グラスウール、ナイロン
不織布、炭素繊維、合成繊維等でふさぐことができる。

そして、カートリッジ（２）の他の開口部（３）からア
スコルビン酸含有試料液を導入する。アスコルビン酸含
有試料液の導入は、第１図に示すように、針を付けてい
ない注射器（６）を用いて便利に行なうことができる。

すなわち、注射器の先端（７）がカートリッジ（２）の
開口部（３）にちょうど嵌合するようにしておき、注射
器（６）で試料液を適当量吸引した後、その注射器の先
端（７）をカートリッジ（２）の開口部（３）に嵌め込
み、ピストン（８）を押し下げて試料液をカートリッジ
（２）中に注入し、該試料液をカートリッジ（２）に充
填されている固定化酵素と接触させる。その際両者の間
の接触をよくし反応を促進するため、カートリッジを振
盪するのが実際上は重要である。振盪は例えばポルテッ
クスミキサー、マルチチューブミキサーなどのミキサー
や往復振盪器により行なうことができる。これにより、
固定化酵素の比較的少量の使用によっても効率よく処理
を行なうことができる。勿論、振盪を行なわすとも反応
を行なわせることができるが、その際は固定化酵素を成
る程度大量に充填する必要がある。一定時間経過後、注
射器（６）で今度は空気を送り込み、カートリッジ（２
）中のアスコルビン酸がデヒドロアスコルビン酸として
除去された試料液を開口部（４）から例えば適当な分析
装置（例えば、分光光度計）のキュベツトに送り出す。

なお、カートリッジ（２）の開口端（４）には、第１図
に示されているように、固定化酵素担体の万一の流出を
防ぐためにミリボア社のマイレックスフィルターのよう
なメンブレンフィルター（９）を装着するようにしても
よい。

以上に述べた本発明の方法によれば、極めて簡単な装置
を用いてアスコルビン酸含有試料液、例えば、果汁、尿
、血清等からアスコルビン酸を効率よく不活性なデヒド
ロアスコルビン酸に変えることができる。しかも、本発
明の方法によれば、１回の操作終了後、注射器（６）を
用いて緩衝液を注入して固定化酵素を充分に洗浄するこ
とにより、繰返しカートリッジを使用することができ、
経済的である。

次に実施例により本発明をさらに詳細に説明する。

実施例１：アスコルビン酸酸化酵素のガラスビーズへの
固定 ングマケミカル社の多孔質ガラスビーズ（ＰＧ−３００
０）３ｇを５０ｍＱのアセトンと２ｍ１２の３−アミノ
プロピル−トリエトキシ−シランの混合液に加えて２４
時間還流する。反応したガラスビーズを濾過し、アブデ
ルハルデン等の減圧乾燥器を用い６０°Ｃで乾燥する。

乾燥の後ガラスビーズをｌｏ＋ｎ１２のグルタルアルデ
ヒドに加え、室温で２４時間反応させる。反応後ガラス
フィルターでろ過し、数回水洗して未反応のゲルタール
アルデヒドを除き、適当量のオリエンタルイースト社製
アスコルビン酸酸化酵素（１００〜８００ユニツト）を
含んだ５０ｍＭの燐酸ナトリウム緩衝液に漬けて５°Ｃ
で２４時間反応させる。以上の操作によってアスコルビ
ン酸酸化酵素はガラスビーズ内部表面を含む全表面に共
有結合で固定された。

本実施例において、加えた酵素の８０〜９０％がガラス
ビーズに固定された。回収された活性は３０〜４０％で
あった。

実施例２：酵素反応の測定 酵素反応は、ｌＯ〜４０ユニットの固定化された酵素を
含んだ５０ｍＭのＮａ−燐酸緩衝液（ｐＨ５，６）にｌ
ｏｍＭのアスコルビン酸を加えて行う。反応液の全量は
３　ｍＱであった。酵素反応はアスコルビン酸が持つ２
６５ｎｍにおける吸収の減少を測定することによりモニ
ターした。即ち、実施例１で得られる固定化酵素にアス
コルビン酸を添加した直後に、アスコルビン酸はアスコ
ルビン酸酸化酵素の働きにより、デヒドロキシアスコル
ビン酸に変化し、２６５ｎｍにおける吸収を失う。２６
５ｎｍに於ける吸収減少を高滓自記分光光度計ＵＶ２６
０で測定して初速度を以て反応速度を表した。第２図に
示すごとく、酵素量と反応速度は直線関係を示しいる。

実施例３：最適ｐＨの測定 固定化によって酵素が持っていた種々の酵素学的性質が
変化することはしばしばみられる現象である。そこで酵
素反応の最適水素イオン濃度（ｐＨ）を、実施例１で得
た固定化酵素及び遊離酵素の両方を用いて測定した。遊
離酵素の場合は、第３図Ａに示すように最適イオン濃度
はｐＨ５，６であったが、固定化酵素の場合は、第３図
Ｂに示すように最適イオン濃度は、４．５から７と非常
に幅広くなった。これは酵素反応を行うとき厳密にｐ）
Ｉを決める必要がなく極めて有利なことである。

実施例４：固定化酵素の熱安定性 熱安定性が固定化によってどのように変化するかを調べ
た結果を第４図に示す。固定化酵素及び遊離酵素を、図
に示す時間だけ５０°Ｃの水に浸漬した後酵素反応を行
った。遊離酵素の場合、１００分間浸漬すると８０％の
活性を失ったが、実施例１の固定化酵素の場合は、２０
％の活性を失ったにすぎない。これはアスコルビン酸含
有試料液を予め熱しなければならないような場合にも該
固定化酵素が安定であり、本発明の固定化酵素の利用範
囲は極めて広いことを示すものである。

また、２５〜７０℃の種々の温度に５分間固定化酵素及
び遊離酵素を浸漬して反応を行い、温度変化と熱安定性
との関係を調べた結果を第５図に示す。６０°Ｃ近辺で
、固定化酵素の熱安定性が著しく増していることがわか
る。

さらに、２５℃及び５℃において遊離酵素及び固定化酵
素が何日間安定であるか測定した。その結果を第６図Ａ
、Ｂに示す。７０日間で遊離酵素は完全に活性を失った
が、固定化酵素は１４０日後にも２０％の活性を保持し
ていた。この結果は、固定化酵素を４℃の冷蔵庫に使用
後保存すれば、かなり長期間にわたって活性を維持でき
ること、そして２５°Ｃの室温の保存した場合も、固定
化酵素では３０〜４０日間は使用できることを示してい
る。

実施例５：カートリッジを用いたアスコルビン酸の除去 実施例１と同様にして得た２００ユニツトのアスコルビ
ン酸酸化酵素を固定化保持しているガラスビーズ（ＰＧ
−３０００）約５０ｍｇを第１図に示すカートリッジ（
内径４　ｍｍ、長さ４ｃｍ）に充填し、ｌｏｍＭのアス
コルビン酸を含む２００μＱのＮａ−燐酸緩衝液を注射
器で加える。−定時間経過した後注射器から空気を送り
、カートリッジ中の緩衝液を分光光度計のガラスキュベ
ツトにおくりだす。２６５ｎｍの吸収を測定して残存す
るアスコルビン酸量を計算する。アスコルビン酸量は、
吸収値からアスコルビン酸の原子吸光係数を用いて以下
の式に従って計算される・ｅ＝１４．８　Ｘ　１０’　
ｍＱ　、　ｍｏｌｅｓ−’　、　ｃｍ−’式中、Ａ　２
６５　　＝　　２６５　ｎｍの吸収値ｄ−光路長 Ｅ＝酵素量 Ｖ−反応液量 第７図に示すように、反応液を含んだカートリッジを振
盪しない場合には５０分たっても反応は完結しないが、
ポルテックスミキサーまたはＪＡＳＣＯＭＴ−３０マル
チチユーブミキサー等のミキサーを用い激しく振盪する
と１〜２分内にアスコルビン酸は除去される。振盪しな
い場合に反応が進まないのは厚い境界膜が存在していて
、基質が固定された酵素に近づけないことによると思わ
れる。反応を迅速にかつ完全に行うためには振盪は極め
て重要である。

実施例６：カートリッジを用いてアスコルビン酸の除去
を繰り返し行う方法 実施例５で用いたと同じカートリッジを用いて繰り返し
アスコルビン酸の除去を試みた結果を第８図に示す。−
回の反応が終ると、注射器で空気を送り込み反応液をキ
ュベツトにとり２６５ｎｍの吸収を測定した。その後す
ぐに注射器を用いて、５　ｍＱのＮａ−燐酸緩衝液をゆ
っくりと時々撹拌しながら通すことによってカートリッ
ジを洗浄する。このカートリッジを即座に再び反応に用
いた。

第８図に示すように３０回の使用でも、−回目に観察さ
れたと同じ反応性がみられた。即ち、反応開始後１〜２
分の内に反応液中の全アスコルビン酸はデヒドロキシア
スコルビン酸に変化した。

実施例４に示した固定化による熱安定性の増大の実験に
よって得られた結果を考慮すると、カートリッジは使用
後４℃の冷蔵庫に保存することによって５０回以上の繰
り返し使用が可能と考えられる。

このカートリッジの最も効果的な使用法とじては、多数
のサンプルを各々別の多数のカートリッジに注射器で導
入して、例えばＪＡＳＣＯＭＴ−３０ミキサー等を用い
て数分振盪した後、注射器で空気を導入してサンプルを
押し出し試験管に回収して種々の実験に用いる方法であ
る。或いは市販のオートサンプラーに此のカートリッジ
を接続してサンプルの導入と、洗浄とを自動化すること
も可能である。さらにまた、高速液体クロマトグラフィ
ーのカラムにこのカートリッジを接続して低速でサンプ
ル液を導入してアスコルビン酸を除くこともできる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の固定化酵素を充填したカートリッジの
断面図であり、 第２図は遊離酵素及び固定化酵素の酵素濃度と反応速度
との関係を示すグラフである。 第３図は遊離酵素及び固定化したアスコルビン酸酸化酵
素の最適水素イオン濃度を示すグラフでる。本図は目的
とするｐＨは酢酸緩衝液及び燐酸緩衝液を用いて得たも
ので、曲線Ａは遊離酵素、曲線Ｂは固定化酵素の最適水
素イオン濃度を示す。 第４図は５０°Ｃに酵素を保存した場合の安定性を示す
グラフであり、本図は固定化酵素及び遊離酵素を５０℃
で種々の長さ保存して酵素反応を行った結果を示す。 第５図は２５〜７０°Ｃの種々の温度での酵素の熱安定
性を示すグラフである。 第６図は２５°Ｃ及び５℃に酵素を保存した場合の熱安
定性を示すグラフであり、第６図Ａは５°Ｃでの実験の
結果であり、第６図Ｂは２５℃での実験の結果を示す。 第７図は固定化酵素を含んだカートリッジを用いたアス
コルビン酸の除去の結果を示すグラフであり、黒丸は全
く振盪しない場合、黒三角は振盪器を用いて振幅２．８
ｃｍで１分間に１６０往復した場合の結果、そして白丸
はポルテックスミキサー又はＪＡＳＣＯＵＴ　−３０マ
ルチチューブミキサーを用いて激しく撹拌した場合の結
果を示す。 第８図は固定化酵素を含んだ同一のカートリッジを用い
て、繰り返しアスコルビン酸をデヒドロキシアスコルビ
ン酸に変換した場合の効果を示すグラフである。 第２図 ＠素漢戻　（ＬＪ／ｍＬ　） 第３図へ Ｈ 第３図Ｂ ＋　　　　　３　　　　５　　　　７　　　　９　　　
　１１Ｈ 温度（０Ｃ） 第７図 浸漬時間　（介）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、表面に多数の水酸基をもつ水不溶性固体粒子に、ア
   ミノ基含有シランカップリング剤を介して共有結合され
   ていることを特徴とする固定化アスコルビン酸酸化酵素
   。 ２、該水不溶性固体粒子が多孔質ガラスビーズである特
   許請求の範囲第１項記載の酵素。３、アミノ基含有シラ
   ンカップリング剤がアミノアルキルトリアルコキシシラ
   ンである特許請求の範囲第１項又は第２項記載の酵素。 ４、表面に多数の水酸基をもつ水不溶性固体粒子に、ア
   ミノ基含有シランカップリング剤を反応させた後、アミ
   ノ基と容易に反応する官能基を２個有する二官能性試薬
   と反応させ、次いでアスコルビン酸酸化酵素と反応させ
   ることによつて得られたものである特許請求の範囲第１
   〜３項のいずれかに記載の酵素。 ５、表面に多数の水酸基をもつ水不溶性固体粒子に、ア
   ミノ基含有シランカップリング剤を介して共有結合され
   ている固定化アスコルビン酸酸化酵素が充填された、両
   端に開口部をもつ小筒状カートリッジの一方の開口部か
   ら、アスコルビン酸含有試料液を導入し、カートリッジ
   を振盪して該試料液中のアスコルビン酸を上記アスコル
   ビン酸酸化酵素と反応させた後、該カートリッジの他方
   の開口部から該試料液を排出せしめることを特徴とする
   アスコルビン酸含有試料液からアスコルビン酸を除去す
   る方法。