JPH01213295A - ヌクレオシド類の化学標識法、核酸標識用試薬及び核酸プローブ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （イ）産業上の利用分野 この発明は、核酸、ヌクレオチド及びヌクレオシドのよ
うなヌクレオシド類の化学標識法並びにそれによ役得ら
れる核酸標識用試薬及び核酸プローブ、ことにＤＮＡプ
ローブに関する。さらに詳しくは、ＤＮＡの塩基配列の
決定、遺伝子検出、ニブクトランスレーシタン等に好適
に利用でき、しかも高感度な検出を可能とするヌクレオ
シド類の化学標識法、標識用試薬及びＤＮＡプローブに
関するものである。

（ロ）従来の技術 掟来がら、ＤＮＡの塩基配列の決定手法として、電気泳
動を利用したマキサム・ギルバート法やＭ１３ジデオキ
シ法が知られている［生物化学実験のてびき、「３−核
酸の分離・分析法」７４〜１０６頁、（株）化学同人発
行（１９８６年）］。

これらはｍ識化されたＤＮＡ断片やＤＮＡプローブ、あ
るいは標識化されたヌクレオシド試薬を用いる方法であ
り、かかる標識は、通常、ＤＮＡやヌクレオチドの３′
や５′末縞に放射性リン（１Ｐ）をリン酸エステルの形
態で結合したり（放射性標識）ＤＮＡやヌクレオチドの
核酸塩基に蛍光性基を結合すること（化学標識）により
行われている。

また、コロニー・ハイブリダイゼーションにおける目的
ＤＮＡの検出や遺伝子の同定等においても、目的ＤＮＡ
の塩基配列と相捕的な塩基配列を有するＤＮＡを上記の
ごとき放射性標識や化学標識で標識化したＤＮＡプロー
ブが用いられている。

（ハ）発明が解決しようとする課題 しかしながら、上記した放射性標識用の放射性リン含有
化合物は高価であり、しかもその取扱いに当たっては、
特別な施設や管理者が必要であり、被曝の危険もある。

この点化学標識においてはこのような不都合はないが、
蛍光強度に基づく検出であるので放射標識に比して標識
ＤＮＡの検出感度が低くて誤差も生じ易く、しかも検出
には励起光照射が必要であって検出操作や装置構成が複
雑化するという問題があった。

この発明は、かかる状況に鑑みなされたものであり、こ
とに、安全かつ安価で高感度の検出が行えかつ検出操作
も簡便に行える化学標識法を提供しようとするものであ
る。

（ニ）課題を解決するための手段及び作用上記観点から
本発明者らは鋭意研究、検討を行った結果、■化学発光
可能な化合物であるルミノールがヌクレオシド、ヌクレ
オチド又はＤＮＡの核酸塩基に結合可能であること、■
この結合した物質がアルカリ性下における酸化性条件で
ルミノール残基の酸化に基づいて化学発光すること、並
びに■この化学発光により標識物質の高感度検出が可能
である事実を見出し、この発明に到達した。

かくしてこの発明によれば、ヌクレオシド分子を有する
化合物とルミノールとをアルデヒド又はケトンの存在下
反応させて上記化合物の核酸塩基にルミノール基を導入
することからなるヌクレオシド類の化学標識法が提供さ
れる。

この発明でヌクレオシド類あるいはヌクレオシド分子を
含有する化合物とはＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸自体、ヌク
レオシド及びヌクレオチドを意味する。この発明におい
て、ヌクレオシド類とルミノールとの反応はアルデヒド
又はケトンの存在下、脱水条件下で行われる。通常、ク
ロロホルム、ピリジン等の極性溶媒中に核酸類、ルミノ
ール及びアルデヒド（又はケトン）を溶解し又は分散し
、この状態下で硫酸等の脱水剤を滴加して反応を進行さ
せることにより行うのが適している。これによりヌクレ
オシド類の有する核酸塩基（アデニン、グアニン、シト
シン、チミン、ウラシル等）中のアミノ基と、ルミノー
ル中のアミノ基とがアルデヒド（又はケトン）と脱水縮
合して、ルミノール残基が核酸塩基に結合されることと
なる。以下にアデニンデオキシリボヌクレオシドを標識
対象とした際の反応スキームを示す。

（以下余白） ０Ｈ・・・・・・・・・式（（） （式中、Ｒｔ及びＲ１は各々独立して水素原子又はアル
キル基を示す。） 上記アルデヒド又はケトンにおけるアルキル基としては
、縮合反応を阻害しない種々のアルキル基（Ｃ，−Ｃ，
Ｓ）が挙げられるが、通常、炭素数５程度迄の低級アル
キル基が適している。かかるアルデヒド又はケトンとし
ては、例えばホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、プ
ロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、バレルアルデ
ヒド、アセトン、エチルメチルケトン、エチルプロピル
ケトン、ブチルメチルケトン、ジエチルケトン、ブチロ
ン等が挙げられる。

なお、上記反応は常温で速やかに行われるため、とくに
加温しなくてもよい。反応物は溶媒による沈殿法で容易
に採取可能である。

この発明の化学標識法において、標識対象としてＤＮＡ
を用いた場合には、このＤＮＡを後述する化学発光によ
り追跡することが可能となり、例えばマキサム−ギルバ
ード法によるＤＮＡ塩基配列決定でのＤＮＡ断片標識に
直接適用することができる。また、ある特定の塩基配列
のＤＮＡ　（目的ＤＮＡ）と相捕的な塩基配列を有する
ＤＮＡを標識対象として用いることにより、例えばＭ１
３ジデオキシ法によるＤＮＡ塩基配列決定で用いるＤＮ
Ａプローブや、コロニーハイブリダイゼーションで用い
るＤＮＡプローブを容易に得ることができる。

一方、この発明の化学標識法において、標識対象として
ヌクレオシドやヌクレオチドを用いた場合には、これら
自体が３′末端又は５′末端の水酸基を介してＤＮＡや
ＤＮＡ断片等と縮合可能であるため、ルミノール基を化
学発光基として含有する核酸の標識用試薬を容易に得る
ことができる。

従ってこの発明は、ヌクレオシド分子を有する化合物の
核酸塩基におけるアミノ基に、アルデヒド又はケトンの
残基を介してルミノール基が導入されてなる核酸標識用
試薬又は核酸プローブをも提供するものである。かかる
標識用試薬は前記しｉ二マキサム−ギルバード法でのＤ
ＮＡ断片の標識やＤＮＡプローブの製造用の標識剤とし
て好適に用いることができる。

上述したごと（直接ルミノールを反応させて得られるＤ
ＮＡ断片やＤＮ−Ａプローブ、あるいは上記標識用試薬
との反応により得られる標識ＤＮＡ断片やＤＮＡプロー
ブの化学発光による検出はアルカリ性下、オゾン、次亜
塩素酸塩、過酸化水素のような酸化剤を作用させること
により容易に行える。通常、青白い発光を呈し、４２５
ｎｍに極大発光波長を示す。かかる発光はルミノール残
基が酸化されて下記のごとく３−アミノフタル酸イオン
の励起１重項状聾が生じこれが放出する光による化学発
光である。

Ｈ 従って、この化学発光強度に基づいて、ＤＮＡ断片、Ｄ
ＮＡプローブ等を検出できるが、その発光強度は、従来
の化学標識による蛍光強度に比して著しく高い。しかし
て例えばＤＮＡをフェムト又はアトモルレベルで高感度
検出可能となる。

（ホ）実施例 実施例！（ヌクレオシドの標識化によるＤＮＡ標識用試
薬の作製） アデノシン１７ｍ９及びルミノール１０ｍ９を、アセト
アルデヒドを含有するピリジン（無水）／クロロホルム
混合溶媒（ピリジンニクロロホルム：アセトアルデヒド
＝ｌ：ｌ：１）　６００μｇに混合した後、この混合物
中に濃硫酸を２〜３滴加えて常温上混合した。これによ
り生じた黄色油状物を水で抽出し、この水層１容量部に
酢酸ナトリウム水溶液（３モル濃度）を１７１０容量部
加え、さらにイソプロパツールｌ容量部を加え、−２０
℃下で３０分放置した。これにより生じた沈殿物をガラ
スフィルターで濾取し、乾燥することにより下式で示さ
れるルミノール標識化アデノシン３０ｍｇを針状晶とじ
て得た。

ＯＨ なお、この物質のＵＶスペクトルを第１図にＧＣ−ＭＳ
によるマススペクトルを第２図に示した。

マススペクトルは、マトリクスとしてグリセリンを用い
、溶媒としてメタノールを用い、−次イオンとしてキセ
ノンを用い、−次電圧６ＫＶ下で得たものである。

この物質Ｑ、１ｍｇを、メタノール／クロロホルム混合
溶媒（５：９５）　２０μＱに溶解し、これをセルロー
スアセテート製の薄層クロマト用紙に滴下してスポット
を形成された後、アルカリ性（炭酸ナトリウム）の過酸
化水素水溶液（３％）をスプレーすることにより、スポ
ットから青白い化学発光が認められた。この化学発光は
λｍａｘ４２５ｎＩ＋＋の発光であり、とくに３８５ｎ
ｍの光を照射した際に、肉眼でかなり明確に認識できる
ものであった。

かかるアデノシンのルミノール標識化物は、アデノシン
骨格の３′及び５′の水酸基を介して、ＤＮＡの末端に
通常の縮合反応で結合可能なため、ＤＮＡ標識用の試薬
として用いることができる。

実施例２（ヌクレオチドの標識化によるＤＮＡｅｆｆ識
用試薬の作用試薬それを用いたＤＮＡの標識化）アデノ
シントリフォスフニー）１９ｍ９及びルミノール２０　
ｍ　９を、ブチルアルデヒドを含有するピリジン（無水
）／クロロホルム混合溶媒（ピリジン：クロロホルム：
ブチルアルデヒド＝ｌ：ｌ：１）３００μＱに溶解し、
濃硫酸的２００μＱを加えた。この後生じた油状物をヘ
キサン及び水で抽出し、水層を実施例１と同様にして精
製することにより下式で示されるルミノール標識化アデ
ノシントリフオスフェート２５　ｍ　ｇを針状晶として
得た。

（以下余白） 上記アデノシン誘導体を標識用試薬として用いて、塩基
配列決定用のＤＮＡプライマーの標識を行った。ＤＮＡ
プライマーはＭｌ３−ジデオキシ法による市販のＤＮＡ
塩基配列決定用のキット（東洋紡（株）製）におけるＭ
ｌ　３フγ−ジ用プライマー　（１７＊ｅｒ）を用いた
。また標識化は、公知のニックトランスレーション法に
従って、［α−５ｔｐ］ｄＮＴＰの代わりに上記アデノ
シン誘導体を用いることによってＤＮＡプライマーの３
′−末端水素基に行った。

標識化により得られたＤＮＡプローブは、実施例１と同
様にアルカリ性下、過酸化水素の存在によりλ−ａｘ４
２５ｎｍの青白い明確な化学発光を呈するもめであり、
またＵＶ吸収のλｍａＫは２５６ｎｍであり、光照射に
よる蛍光性（λｗａｘ：１ｇｏｎＩｍ）も有するもので
あった。

実施例３　（ＤＮＡの直接標識化） 実施例２で使用したＭｌ３−ジブオキシン法用のＤＮＡ
プライマー（１７＊ｅｒ）に、ルミノール溶液（１０μ
ｓ／ｇ１２）をｌＯμＱ加えた。次いで、ブチルアルデ
ヒドを含有するピリジン（無水）／クロロホルム混合溶
媒２０μｅ（ビリジン：クロロホルム：ブチルアルデヒ
ド＝１：ｌ：ｌ）を加え、濃硫酸４０μＱを滴加して常
温上反応させた。得られた油状物をクロロホルム：水系
溶媒で抽出後、水層をイソプロパツールで再結晶化させ
て、固型状のルミノール標識化ＤＮＡプライマー（ＤＮ
Ａプローブ）５０μ９を得た。

このＤＮＡプローブ自体をアガロースゲルで電気泳動分
離させ、アルカリ性過酸化水素水をスプレーすることに
より、青白い発光が明確に生じることが明確された。

このＤＮＡプローブを、市販のＭｌ３−ジデオキシン法
用のキット（東洋紡（株））におけるＭ１３ｍｐファー
ジＤＮＡと混合して加熱アニーリング（６５℃）させ、
Ｍ２Ｓ−ジデオキシ法に従って所定のＤＮＡ　（ＡＴＧ
ＣＧＴＡＡＣＧＧＧＴＡＣＣＴＡＧＡＣＧＴＡ）の塩基
配列決定のシーケンスを行った。電気泳動はポリアクリ
ルアミドゲルにより行い、泳動後に酢酸にてＤＮＡを固
定後、アルカリ性（炭酸ナトリウム）過酸化水素水（３
％）をスプレーし生じる発光を３８（ｌｎｍの光の照射
下で観察した。この発光により得られた泳動パターンを
第３図に示した。

このようにこの発明の標識法によれば化学発光に基づく
高感度なりＮＡの検出が行えることが判る。

（へ）発明の効果 この発明の標識法によれば、核酸、ヌクレオシド、ヌク
レオチド等に高感度検出可能な化学標識を行うことがで
きる。そして標識用の化学物質としてルミノールが用い
られるため、安全かつ安価な標識が可能となり、しかも
化学発光に基づいて検出できるので、検出操作が極めて
簡便に行える。

従って、ヌクレオシド類の標識化が必要な種々の分野に
極めて有用である。

また、この発明の標識法によりＡＴＰに標識化したヌク
レオチド誘導体は、ＡＴＰを正常細胞より多くとり込む
性質を有する癌細胞に作用させることにより癌細胞の特
異的診断に利用することも可能である。

【図面の簡単な説明】

第１図はこの発明の実施例で得られた核酸標識用試薬の
ＵＶスペクトル図、第２図は同じくマススペクトル図、
第３図はこの発明の実施例で得られたＤＮＡプローブを
用いたＭ２Ｓ−ジデオキシ法によるゲル電気泳動の泳動
パターン図である。 第１図 誠長（ｎｍ） 第３図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヌクレオシド分子を有する化合物とルミノールとを
   アルデヒド又はケトンの存在下反応させて上記化合物の
   核酸塩基にルミノール基を導入することからなるヌクレ
   オシド類の化学標識法。 ２、ヌクレオシド分子を有する化合物の核酸塩基におけ
   るアミノ基に、アルデヒド又はケトンの残基を介してル
   ミノール基が導入されてなる核酸標識用試薬又は核酸プ
   ローブ。