JPH01174391A - 脂肪酸エステル製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は脂肪酸エステル類の製造方法に関し、詳しくは
有機溶媒中にアルコールおよび脂肪酸を高濃度に溶解せ
しめ、実質的に水を添加せず酵素法により各種脂肪酸エ
ステルを常温で容易に、かつ安価に高い収率で製造する
方法に関する。

［従来の技術および発明が解決しようとする問題点］ 一般に、脂肪酸エステルの化学的製造は熱エネルギーを
利用するため、触媒の存在下で高温に加熱することによ
り行なわれる。しかし、この方法では反応温度が高いた
めに原料となるアルコールや脂肪酸、あるいは生成物の
分解１着色１看香などが生じたり、また化学法に用いる
無機触媒が反応特異性を持たないために、副反応により
副生物ができてしまうことが多かった。特に、分子中に
炭素間の２重結合を多く有するものを原料とした場合、
生成物の分解や過酸化物の生成が進行しやすいため、純
度の高いものを収率よく得るのは難しかった。このよう
な化学法としては、例えばコレスチロール脂肪酸エステ
ルを製造するにあたり、脂肪酸とコレスチロールを１３
０〜２００℃て酸触媒存在下に３〜４時間加熱するＰａ
ｇｅ−Ｒｕｄｙの方法がよく知られている。しかしなが
ら、この方法では不飽和脂肪酸を原料とした場合には副
生物が多量に生じ、収量も非常に悪くなる。また、高温
にするためには高圧条件にしなければならず、高温高圧
に耐え得る特殊容器も必要となるなどの問題があった。

このような問題を解決するために、リパーゼのエステル
合成作用を利用した酵素法による脂肪酸エステルの製造
法が提案された。酵素反応は酵素分子の配座の変化エネ
ルギーを利用するため、常温で進行する上に、反応特異
性が高いという利点を有している。従って、この酵素法
は脂肪酸とアルコールからのエステル合成反応を常温常
圧下で行なうことができるため、原料および生成物の分
解や副生物の生成もないはかりでなく、上記のような特
殊容器も必要としない。それ故、リパーゼによる脂肪酸
エステルの製造は、近年の各種微生物由来のリパーゼの
開発とあいまって盛んに検討されており、例えばアスペ
ルギルス・ニガー（へｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ匣又ゴ）、
リソ”ブス・デレマー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｄｅｌｅｍ
ａｒ）、ゲオトリカム・キャンデイダム（Ｇｅｏｔｒｉ
ｃｈｕｍ　ｃａｎｄｉｄｕｍ）　、ペニシリウム・シク
ロピウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｊｕｍ　ｃｙｃｌｏｐｉｕ
ｍ）由来の４種類のリパーゼを用いて各種アルコールと
脂肪酸とのエステルを合成する方法［Ｂｉｏｃｈｅｍ、
　Ｂｉｏｐｈｙｓ。

Ａｃｔａ、　５７５．１５６　（１９７９）など］が報
告されている。また、微生物由来のリパーゼを用いた脂
肪酸エステルの製法としては特公昭５１−７５５４号公
報、同５７−２３５３５号公報、同５Ｂ−３８号公報、
特開昭５６−３２９！１４号公報、同５９−２２０１９
５号公報、同５９−２２０１９６号公報、同８２−６９
９９４号公報などに記載の方法があげられる。しかしな
から、これらの方法はいずれも酵素か水にしか溶けない
ことから水を反応溶媒とするため、反応が水と水不溶性
原料とから成る不均一系において行なわれており、エス
テル合成活性か原料の分散状態に左右されるはかりでな
く、常温固体のものを原料とした場合にはほとんど反応
が起こらないなどの問題があった。さらに、反応系に水
が多く存在するため、脱水縮合反応であるエステル合成
反応が水により阻害され、効率よく高い収率で製造する
のは困難であった。

このような問題を解決するために、水をほとんど含まず
、多くの原料が溶解しつる有機溶媒中でリパーゼを作用
させて脂肪酸エステルを合成する方法が検討されている
。この反応は、有機溶媒中に可能な範囲で水を含ませ、
酵素の安定性に必要な水分を確保（脱水しない）して行
ｔ２う微水系である。このような方法としては、例えば
シクロヘキサン、トルエン、四塩化炭素といった有機溶
媒中でキャンディダ・シリントラシア（Ｃａｎｄｉｄａ
ｃｙｌｊｎｄｒａｃｅａ）のリパーゼを用いてコレスチ
ロールとオレイン酸からコレステリルオレエートを高い
収率で合成する方法（Ｊ、　Ｊｐｎ、　Ｏｉｌ　ＩＪｅ
ｍ、　Ｓｏｃ、。

３５、９５５．１９８６）や、特開昭６１−１０７７９
１号公報に記載されている方法をあげることができる。

しかしながら、これらの方法は用いる原料の量に対して
使用する酵素の量が多い上に反応時間も長いため、実際
に工業的な規模で行なうには経済性の面で問題があった
。

［問題点を解決するための手段］ そこで、本発明者らは水を殆んど含まない微水系におい
て、原料の量に対して極めて少量の酵素を用い、原料が
高濃度に仕込まれた有機溶媒中、短い反応時間で脂肪酸
とアルコールから高い収率でエステルを合成する方法を
開発すべく鋭意研究した。その結果、シュードモナス属
微生物由来のリパーゼ、例えばシュードモナス・フライ
（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｒａｇｉ）　２２．３９
Ｂの培養液から調製したリパーゼを実質的に水を加える
ことなく有機溶媒中に分散させて作用させれば、広範囲
のアルコールと脂肪酸から高濃度のエステルを生成する
ことを見出し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明はスチロール類、テルペンアルコール
類、ビタミンアルコール類およびその他の炭素数１〜３
０の脂肪族アルコール類よりなる群から選ばれた少なく
とも１種のアルコール類および炭素数２〜３２の脂肪酸
を有機溶媒中に混合し、実質的に水を添加することなく
、該混合物にシュードモナス属微生物由来のリパーゼを
加え、作用させることを特徴とする脂肪酸エステルの製
造方法を提供するものである。

本発明に用いるアルコールとしては、スチロール類、テ
ルペンアルコール類、ビタミンアルコール類およびその
他の炭素数１〜３０の脂肪族アルコール類であれば飽和
のもの、不飽和のもの、直鎖のもの、側鎖を有するもの
、環状のもの（炭素数４以上の場合）、水酸基を複数有
するもの、あるいは置換基を有するもののいずれであっ
てもよく、これらのうちから少なくとも１種を用いれば
よい。具体例を示すと、スチロール類としてはコレスチ
ロール、エルゴスチロール、スチグマスチロール、α−
シトスチロール、β−シトスチロール、γ−シトスチロ
ール、ラドスチロール、チモスチロール、デスモスチロ
ール、ブラシカスチロール、カンペスチロール、α−ス
ピナスチロール、ラノスチロール、ルミスチロール、タ
キスチロールなどが、テルペンアルコール類としてはゲ
ラニオール、ファル卑ソール、フィトール、シトロネロ
ール、ソラネソール、デカイソプレノール、リナロール
、ネロール、ラバンズロール、ミルセノール、テルピネ
オール、メントール、ボルネオール、メボール、イソボ
ルニルシクロヘキサノール、ネロリドール、サンタロー
ル、セドロール、パチュリアルコールなどが、ビタミン
アルコール類としてはレチノール、デヒドロレチノール
、エルゴカルシフェロール、コレカルシフェロール、α
−トコフェロール、β−トコフェロール、γ−トコフェ
ロール、δ−トコフェロールなどが挙げられる。また、
その他の炭素数１〜３ｏの脂肪族アルコール類としては
、飽和及び不飽和のものを含め、１価１級のものの具体
例を示すと、直鎖のものでは、メタノール、エタノール
、１−プロパツール、１−ブタノール、１−ペンタノー
ル、１−ヘキサノール、１−オクタツール、１−デカノ
ール、１−ドデカノール、１−テトラデカノール、１−
ヘキサデカノール、１−オクタデカノール、１−エイコ
サノール、１−ドコサノール、１−テトラコサノール、
１−へキサコサノール、１−オクタコサノール、１−ト
リアコンタノール、３−デセン−１−オール、７−ドデ
セン−１−オール、９−テトラデセン−１−オール。

９−へキサデセン−１−オール、９−オクタデセン−１
−オール、９−エイコセン−１−オールなどが、側鎖を
有するものとしては４−メチル−１−ペンタノール、３
−メチル−１−ペンタノール、１０−メチル−１−ヘン
デカノール、９−メチル−１−ヘンデカノール、　１２
−メチル−１−トリデカノール、　１１−メチル−１−
トリデカノール。

１４−メチル−１−ペンタデカノール、１３−メチル−
１−ペンタデカノール、　１６−メチル−１−ヘプタデ
カノール、１５−メチル−１−ペンタデカノール、１−
エチニル−２−メチル−ベンテノールなどが、脂環式の
ものとしてはシクロプロピルカルビノール、シクロペン
タンエタノール、シクロヘキサンメタノール、シクロヘ
キサンエタノールなどが、また置換基としてフェニル基
を有するものとしては、ベンジルアルコール、α−フェ
ニルエチルアルコール、β−フェニルエチルアルコール
、２−フェニル−１−プロパツール、シンナミルアルコ
ールなどが、置換基としてアミノ基を有するものとして
はエタノールアミン、３−アミノ−１−プロパツール、
４−アミノ−１−ブタノールなどが、置換基としてハロ
ゲンを有するものとしては３−クロロ−１−プロパツー
ル、４−クロロ−１−ブタノール、５−クロロ−１−ペ
ンタノールなどが挙げられる。その他イミダゾール基、
ピリジル基、ナフチル基、チエニル基などの置換基を有
するアルコールを例示することができる。次に、１価２
級のものの具体例を示すと、飽和及び不飽和のものを含
め、直鎖のものとしては２−プロパツール、２−ブタノ
ール、２−ペンタノール、２−ヘキサノール、３−オク
タツール。

３−デカノール、３−ドデカノール、２−テトラデカノ
ール、１−ヘキセン−３−オールなどが、側鎖を有する
ものとしては３−メチル−２−ペンタノール、２−メチ
ル−２−ヘキサノール、２−メチル−３−オクタツール
、２−メチル−４−ペンテン−２−オールなどが、脂環
式のものとじてはシクロヘキサノール、２−メチルシク
ロヘキサノール、２−エチルシクロヘキサノール、４−
ｔ−ブチルシクロヘキサノールなどが、また置換基とし
てハロゲンを有するものとしては１−クロロ−２−プロ
パツールなどか、置換基としてフェニル基を有するもの
としては１−フェニルエタノール、１−フェニルプロパ
ツールなどが挙げられる。さらに、２価以上の多価アル
コールの具体例を示すと、１級及び２級のものを含め、
エチレングリコール、１．３−プロパンジオール、１，
２−ブタンジオール、１．３−ブタンジオール、１．４
−ブタンジオール、２．３−ブタンジオール、ｌ、５−
ベンタンジオール、２．４−ベンタンジオール、１．６
−ヘキサンジオール、２．５−ヘキサンジオール。

１．８−オクタンジオール、　１．１０−デカンジオー
ル、　１．１２−ドデカンジオール、　１．１４−テト
ラデカンジオール、　１，１ｌｉ−ヘキサデカンジオー
ル、グリセロール、エリスリトール、　１，２．６−ヘ
キサンジオール、トリメチロールエタン、ペンタエリス
リトール、２−ｎ−ブチル−２−エチル−１，３−ヘキ
サンジオール、ソルビ］・−ル、マンニトール、キシリ
トールなどか、脂環式のものとしては１．２−シクロヘ
キサンジオール、１．３−シクロヘキサンジオール、１
，４−シクロヘキサンジオール、１．４−シクロヘキサ
ンジメタツールなどか、また置換基としてアミノ基を有
するものとしてはトリエタノールアミン、ジェタノール
アミンなどが、置換基としてフェニル基を有するものと
して２−フェニル−２−プロパツールなどが挙げられる
。さらに、分子内にエーテル結合を有するものとしては
ジグリセロール、トリグリセロール、テトラグリセロー
ル、ジエチレングリコール、ジプロピレングリコールや
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）　２００．　ＰＥＧ
４００．　ＰＥＧ　６００．　ＰＥＧ　１０００などが
挙げられる。

また、本発明に用いる脂肪酸は炭素数２〜３２のもので
あれば飽和のもの、不飽和のもの、直鎖のもの、側鎖を
有するもの、置換基を有するもの。

環状のもの、カルボキシル基を複数有するもののいずれ
であってもよい。具体例を示すと、直鎮節和脂肪酸とし
ては酢酸、プロピオン酸、酪酸、カプロン酸、カプリル
酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチ
ン酸、ステアリン酸、アラキシン酸、へヘン酸、リグノ
セリン酸。

セロチン酸、モンタン酸、メリシン酸、ラクセロン酸な
どが、側鎖をもった飽和脂肪酸としてはイソ吉草酸、２
−メチルブタン酸、イソカプリル酸、７−メチルノナン
酸、インラウリン酸、９−メチリ−ウンデカン酸、イン
パルミチン酸、１３−メチルペンタデカン酸１１８−メ
チルノナデカン酸、１７−メチルノナデカン酸、２２−
メチルトリコサン酸、　２１−メチルトリコサン酸、２
６−メチルへブタコサン酸、３．７．１１−トリメチル
ドデカン酸。

２．６，１０．１４−テトラメチルペンタデカン酸など
が、直鎖不飽和脂肪酸としてはクロトン酸、ジヒドロソ
ルビン酸、ウンデシレン酸、デンチセチン酸、フィゼテ
リン酸、ミリストオレイン酸、パルミトオレイン酸、オ
レイン酸、エライジン酸、ガトレイン酸、エルカ酸、ブ
ラシジン酸、ネルホン酸などのモノエン脂肪酸；ソルビ
ン酸、リルン酸などのジエン脂肪酸、α−リルン酸、γ
−リルン酸、エレオステアリン酸などのトリエン脂肪酸
、炭素間２重結合を４つ以上含むアラキドン酸、　５，
８，１１，１４．１７−ニイコサベンタエン酸、７゜１
０．１３，１６．１９−Ｆコサペンタエン酸、　４，７
，１０，１３゜１６−トコサペンタエン酸などが、側鎖
をもった不飽和脂肪酸としてはゲラン酸、ネロン酸１フ
ァルネソン酸などか、シクロプロパンあるいはシクロプ
ロペン環をもった脂肪酸としてはジヒドロステクリン酸
、ステタリン酸、ラクトバシン酸などが、シクロペンテ
ン環をもった脂肪酸としてはアレプリン酸、ヒドソカル
ビン酸、ゴルリン酸などが、また、置換基として水酸基
をもりたヒドロキシ酸としては２−ヒドロキシラウリン
酸、２−ヒドロキシミリスチン酸、２−ヒドロキシパル
ミチン酸、２−ヒドロキシステアリン酸などが、カルボ
キシル基を２つ以上もった二塩基酸としてはアジピン酸
、ピメリン酸、スペリン酸、アゼライン酸、セバシン酸
などが挙げられる。さらに、プロスタグランジン（ＰＧ
）Ｅ、、　ＰＧＦ、ぺ、　ＰＧＥ２．　ＰＧＥ３などの
ブロスタン酸たる炭素数２０のシクロペンタン酸の不飽
和ヒドロキシ−またはケト−誘導体も挙げることができ
る。

上記アルコールと脂肪酸の配合割合は前者：後者＝１〜
１０：１〜１０（モル比）、好ましくは１〜２：１〜２
（モル比）とし、これらを高濃度、たとえば１〜５０％
の割合で有機溶媒に仕込むことができる。

本発明では、上記のアルコール類および脂肪酸を有機溶
媒中に混合して、実質的に水を添加することなく、ここ
にシュードモナス属微生物由来のリパーゼを加えて脂肪
酸エステルを製造する。本発明において「実質的に水を
添加することなく」とは、有機溶媒中に酵素の安定性に
必要な水分を確保（脱水しない）して行なう微水系の状
態を意味する。

本発明において反応溶媒として用いる有機溶媒には特に
制限はなく、具体例を示すとベンゼン。

トルエン、キシレンなどの芳香族炭化水素類；ジクロル
メタン、クロロホルム、テトラクロルメタン、トリクロ
ルエタン、テトラクロルエタンなどのハロゲン化炭化水
素；ｎ−ペンタン、ｎ−ヘキサン、ｎ−へブタン、ｎ−
オクタン、イソヘキサン、イソオクタンなどの脂肪族炭
化水素；シクロペンタン、シクロヘキサンなどの脂環式
炭化水素類の他、エチルエーテル、アセトン、ジオキサ
ンなどを示すことができ、中でもｎ−ヘキサンのような
脂肪族炭化水素が特に好ましい。これら有機溶媒は特級
のもの、１級のものあるいは工業用のものでも任意に使
用できる。ただし、水分含量の多いものはあらかじめ脱
水処理して、水分含量を０．１％以下にしてなるべく乾
燥状態に近いものとすることが好ましい。反応系に水分
がより少ない方が高いエステル合成率を得ることができ
、生成したエステルの再分解の恐れもない上に、リパー
ゼの活性を長く安定的に保持し、さらにリパーゼの再利
用度も高めることができるので、乾燥状態に近い有機溶
媒を用いるべきである。

本発明で用いるリパーゼは、シュードモナス属微生物由
来のものであり、例えばシュードモナス・フライ（Ｐｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓ　葺」ユ）　２２．３９８　（ＦＥ
ＲＭＰ−１３３９）により生成されるものなどがあげら
れ、特開昭６１−２８０２７４号公報に記載の方法など
により製造することができる。このリパーゼの具体例を
示すと、リパーゼＢ（サッポロビール株式会社製）など
を挙げることができる。このほかシュードモナス・フル
オレッセンス（Ｐｓ、　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）によ
り生産されるリパーゼＰ（天野製薬社製）などがある。

このようなリパーゼはそのまま用いてもよいが、リパー
ゼをポリエチレングリコール。

ポリプロピレングリコールなどを主鎖とする光架橋性プ
レポリマー、例えば関西ペイント社製のＥＮＴ−１００
０，ＥＮＴ−２０００，ＥＮＴ−３０００，ＥＮＴＰ−
１０００゜ＥＮＴＰ−２０００，ＥＮＴＰ−３０００，
ＥＮＴＰ−４０００などを用いて包括固定化したものや
、東洋ゴム工業社製のウレタンプレポリマーなどを用い
て包括固定化したもの、さらには各種イオン交換樹脂、
セライト、ベントナイト、アルミナ、ゼオライト、ガラ
スピーズ、シリカゲルなどの無機材料といった固定化担
体を用いて固定化したものを用いることもてきる。これ
らの固定化酵素は比較的大きな粒子となっているので、
カラムにつめてバイオリアクター化する時などには有利
である。本発明で用いるリパーゼの使用量は各々の基質
量０．１〜２モルに対し１ｇ程度（約１４０００単位）
、好ましくは各々の基質量０．５〜１モルに対し１ｇ程
度（約１４０００単位）であり、リパーゼを作用させる
ためには室温で、好ましくは２４時間以内の反応を行な
えばよい。

本発明で用いるリパーゼは、後記実験例に示すように有
機溶媒中でのエステル合成活性能が極めて高く安定して
おり、これは有機溶媒中に原料のアルコールおよび脂肪
酸の量比が１＝１　（モル比）付近において高濃度に仕
込まれていても変わることはないので、従来の酵素法に
比べて脂肪酸エステルを容易に効率よく、かつ高収率で
製造することができる。また、本発明で用いるリパーゼ
は有機溶媒中では不溶状態であり、極めて安定であるの
で酵素反応系から分離が容易で、酵素の再利用を容易に
し、繰り返し使用が可能である。

［実施例］ 次に、本発明を実施例により説明する。

実験例 リパーゼＢ（サッポロビール株式会社製）の粉末０．２
５　ｇを１５ｍｐ用のスクリューキャップ付きの試験管
に取り、ここに第１表に示す各種有機溶媒（いずれも水
分０１％以下）を５ｍｇ加えて充分攪拌し、６０℃で２
時間放置した後、エバポレーターによって有機溶媒を除
去し、乾燥状態の粉末リパーゼ剤を得た。得られたリパ
ーゼ剤の残存活性をリパーゼ力価測定法で測定した。な
お、リパーゼ力価測定法は、山田らのＰＶＡ乳化法（日
本農芸化学会誌、第３６巻、８６０頁、　１９６２年）
を改変した方法である。この結果を第１表に示す。

／ 第１表 ＊未処理のリパーゼＢの活性を１００％としたときの相
対値 第１表から明らかなように、上記リパーゼは各種有機溶
媒中で６０℃という高温下でも極めて高しλ安定性を示
した。

実施例１ スクリューキャップイ」キの５０ｍｎ用三角フラスコに
バルミチン酸０．２５６　ｇ　（約１ミリモル）および
１−ヘキサデカノール（バルミチルアルコール）０．２
４２　ｇ　（約１ミ（ノモル）を入れたものを３個用意
し、その１木にはベンゼンｌＯｍρ、他の１木には１．
１．１−トリクロロエタン、残りの１本にはｎ−ヘキサ
ン１０ｍＦを加えて充分に攪拌し溶解させた後、各々に
リパーゼＢ（サッポロヒール株式会社製）５ｍｇ（活性
にして約７００単位）を加え、２５℃で充分に振とうさ
せながら４時間反応を行なった。なお、酵素の活性は実
験例１の方法で測定し、酵素単位はオリーブ油エマルジ
ョンを基質とし、ｐＨ７，０、３７℃の条件下で作用さ
せて１分間に１マイクロモルの脂肪酸を遊離させる酵素
量を１単位とした。以下、特に記述しない限り活性測定
はこの方法によるものとする。反応開始後１０分、３０
分、１時間、２時間、４時間（反応終了時）の５回、各
々の反応液をシリカゲル薄層プレート（メルク社製、タ
イプ６０．　５　ｘ　１０ｃｍ）に１ｕρづつスポット
し、石を山エーテル：ジエチルエーテル、酢酸−７０：
　３０　：　１　（ｖ／ｖ）の組成から成る展開溶媒に
て展開した。プレート状のスポットの検出は１０％リン
モリブデン酸含有エタノール溶液を噴霧した後、１２０
℃にて加熱することにより発色させて行なった。この結
果を第１図に示す。

なお、図中のＡは有機溶媒がベンゼン、Ｂは有機溶媒が
１．１．１−１−リクロロエタン、Ｃは有機溶媒がｎ−
ヘキサンのものを示す。第１図より明らかなように、い
ずれの有機溶媒を用いた場合でも、反応時間の経過に伴
ってバルミチン酸およびバルミチルアルコールが減少し
、それらのエステルであると思われる物質（パルミチル
パルミテート）か生成して行くことかわかる。

次に、生成した物質かバルミチルパルミテートであるこ
とを確認するために、反応後４時間の各々の反応液を１
０Ｘ　１０ｃｍの上記と同様のシリカゲル薄層プレート
にラインうちし、上記と同様の展開溶媒で展開後、プレ
ートの両端を１．５ｃｍづつ切り離し、これを上記と同
様の方法で発色させてプレート上の生成物の位置を確認
した。発色操作を行なっていない残りのプレートから生
成物をジエチルエーテルで抽出し、エバポレーターで濃
縮乾固させた後、これを四塩化炭素に溶解して、その赤
外線吸収スペクトルを測定した。また、市販されている
パルミチルバルミテート（フナコシ薬品製）について、
同経の方法で赤外線吸収スペクトルを測定し、上記の反
応生成物のものと比較した。この結果を第２図に示す。

なお、赤外線吸収スペクトルの測定は赤外吸収分光光度
計２７０−３０型（日立社製）を用（・、汀なった。

第２図から明らかなように、反応生成物のスペクトルの
１７４０カイザー付近にエステル結合の吸収が見られる
こと、市販品のスペクトルと一致することから反応生成
物がバルミチルバルミテートであることが確認された。

実施例２ ゲラニオール１５．４３　ｇ　（約０．１モル）および
酪酸（ｎ−ブチリックアシッド）　８．８１ｇ　（約０
．１モル）を栓付きの５００ｍ＃用三角フラスコに入れ
、ここにｎ−ヘキサンを総量１００ｍｊ！となるように
加える（原料濃度は各々１モル／−Ｊ２となっている。

）。次に、リパーゼＢを２００ｍｇ　　（活性にして約
２８，０００単位）加え、２５℃で充分に振とうさせな
がら反応を１６時間行なった。反応開始後２時間毎に、
反応生成物であるゲラニルｎ−ブチレートを高速液体ク
ロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）　（ＲＩ　５Ｅ−５１：
昭和電工社製、示差屈折計；カラム：　Ｌｉｃｈｒｏｓ
ｏ篩ＲＰ−１８，４，６Ｘ　２５０ｍｍ、　Ｍｅｒｃｋ
社製；移動相溶媒ニアセトニトリル：水＝９８：２．流
速・１ｍＲ１分：カラム？Ｌ　度：　２５℃）により定
量分析を行ない、エステル合成率を求めた。この結果を
第３図に示す。

第３図から明らかなように、反応開始後１６時間でゲラ
ニルｎ−ブチレートの合成率は９５％に達しており、良
好な結果が得られた。

実施例３ 実施例２において、リパーゼＢの他に一般によく用いら
れているリパーゼ剤のうちリパーゼＰ（天野製薬社製）
　１１４０ｍｇ　（活性にして２８，０００単位）およ
び比較のためリパーゼＯＦ（泡糊産業社製、キャンディ
ダ属微生物由来の酵素）　１５０ｍｇ（活性にして２８
，０００単位）を用いたこと、溶媒をｎ−ヘキサンの他
にシクロヘキサン、ベンゼン。

トルエン、　１，１．１−トリクロロエタンの４種類を
用いたこと以外は実施例２と同様にして１６時間反応を
行ない、生成物の定量を行なった。得られたゲラニオー
ルｎ−ブチレートの合成率を第２表に示す。

第２表 表より明らかなように、リパーゼＢおよびリパーゼＰは
エステルの合成に用いることができ、特にリパーゼＢは
ＩｇｔＡ算で１００　ｇ強のゲラニルｎ−ブチレートを
合成することができる。

”：：１．、：、、、　：、、。９’、ａ２ｇ　（’Ｗ
。。・２．”　−１−＞ｖ、８．。

バルミチン酸８．４１ｇ　（０，０２５モル）を栓付き
の５００ｍｊｔ用三角フラスコに入れ、ここにｎ−ヘキ
サンを総量１００ｍ＃となるように加えた。次に、リパ
ーゼＢを５０ｍｇ　（活性にして７，０００単位）加え
、４０℃で充分に振とうさせながら２４時間反応を行な
った。反応開始後２時間、４時間、８時間。

１６時間、２４時間の時点で反応生成物であるコレステ
リルパルミテートをＨＰＬＣ（カラム：　５ｐｅｅｌｃ
ｏｓｉｌＬＣ−１８、４，６ｘ　２５０ｃｍ　、スペル
コ社製；移動相溶媒：クロロホルム：メタノール；アセ
トニトリル＝１：１：１．その他の条件は実施例２で用
いたＨＰＬＣト同じ）により定量分析を行ない、エステ
ル合成率を求めた。この結果を第４図に示す。

第４図から明らかなように、反応開始後１６時間でコレ
ステリルパルミテートの合成率は９５％に達しており、
良好な結果が得られた。

実施例５ 実施例４において、リパーゼＢの他に実施例３で用いた
リパーゼＰ　２８５ｍｇ　　（活性にしテア、０００単
位）およびリパーゼＯＦ　３７．５ｍｇ　　（活性にし
て７．０００単位）を用いたこと以外は実施例４と同様
の操作により２４時間反応を行ない、生成物の定量を行
なった。得られたコレステリルパルミテートの合成率を
第３表に示す。

第３表 表より明らかなように、リパーゼＢは有機溶媒中で高い
エステル合成率を示した。

実施例６ 実施例４において、それぞれの酵素量を５０ｍｇとした
こと以外は同様の操作で反応を行ない、生成物の定量を
行なった。得られたコレステリルパルミテートの合成率
を第４表に示す。

第４表 表より明らかなように、リパーゼＢは少量でも高い合成
率を示し、リパーゼＢは１ｇ換算で３００ｇ強のコレス
テリルパルミテートを合成することができる。

［発明の効果］ 本発明によれは、用いる酵素が有機溶媒中でも高いエス
テル合成率を示すので、従来の酵素法よりも効率よく容
易に、かつ高い収率で脂肪酸エステルを製造することが
できる。さらに、酵素の添加量が少なくてよいことや、
酵素を繰り返し使用できるため、より安価に工業的スケ
ールで脂肪酸エステルを製造することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１において行なった薄層クロマトグラフ
ィーの結果を示すものである。 第２図は実施例１において反応生成物およびパルミチル
パルミテートの赤外線吸収スペクトルを示し、Ａが対照
試薬、Ｂが本発明の反応生成物の結果を示している。 第３図は実施例２におけるゲラニルｎ−ブチレート合成
率の経時的変化を示すものである。 第４図は実施例４におけるコレステやリルパルミテート
合成率の経時的変化を示すものである。 特許出願人　　サッポロビール株式会社代　理　人　　
弁理士　久保１）藤　部第３図 ０　　２　　４　　６　　８　　１０　１２　　１４　
　曹、６反怠時間（時間） ０　　　５　　　１０　　　１５　　２０、　　２’５
反　克　時間　　（昨開ン

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）スチロール類、テルペンアルコール類、ビタミン
   アルコール類およびその他の炭素数１〜３０の脂肪族ア
   ルコール類よりなる群から選ばれた少なくとも１種のア
   ルコール類および炭素数２〜３２の脂肪酸を有機溶媒と
   混合し、実質的に水を添加することなく、該混合物にシ
   ュードモナス属微生物由来のリパーゼを加え、作用させ
   ることを特徴とする脂肪酸エステルの製造方法。
2. （２）シュードモナス属由来のリパーゼがシュードモナ
   ス・フラギ（￥Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ￥　￥ｆｒａｇ
   ｉ￥）の生産するリパーゼである特許請求の範囲第１項
   記載の方法。