JP7883239B2 - 自己精製された核酸コードライブラリー - Google Patents

Description

本発明は、核酸コード化学ライブラリー、特に自己精製された核酸コード化学ライブラリー、ならびにその製造方法及び適用に関する。

ＤＮＡコード化学ライブラリー（ＤＥＬ）は、薬物開発のための強力なツールである。ＤＮＡにコードされた化学ライブラリーの生成について提案された最初の方法では、分割サイクル及びプールサイクルで、共通のリンカー（例えば、ビーズ）上でポリマー（例えば、ペプチド）とオリゴヌクレオチド配列（コード配列として機能）を交互に段階的に合成する（Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｓ．ａｎｄ Ｌｅｒｎｅｒ，Ｒ．Ａ．ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８９（１９９２），５３８１－５３８３；米国特許第５，５７３，９０５号；ＷＯ９３／２０２４２）。標的タンパク質に対するアフィニティーキャプチャーの後、選択されたライブラリーメンバーの識別子オリゴヌクレオチドの集団がＰＣＲによって増幅される。化学物質の構造は、ＰＣＲ産物の配列決定によって解読される。コード手順は、化学合成、ＤＮＡ重合、またはＤＮＡ断片のライゲーションを含むさまざまな方法によって実行でされ得ると仮定されていた（Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｓ．ａｎｄ Ｌｅｒｎｅｒ，Ｒ．Ａ．ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８９（１９９２），５３８１－５３８３；米国特許第５，５７３，９０５号；ＷＯ９３／２０２４２）。その後、ＤＮＡにコードされた化学ライブラリーを生成する様々な方法が当該技術分野で記載されている（例えば、Ｍａｎｎｏｃｃｉ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ＵＳＡ １０５（４６）：１７６７０－１７６７５；Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｓ．ａｎｄ Ｌｅｒｎｅｒ，Ｒ．Ａ．ｓｕｐｒａ；Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１５（１９９３）；Ｎｅｅｄｅｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍ．Ｃ．，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９０（１９９３），１０７００－１０７０４；Ｇａｒｔｎｅｒ，Ｚ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０５（２００４），１６０１－１６０５；Ｍｅｌｋｋｏ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２ ５６８－５７４（２００４）；Ｓｐｒｉｎｚ，Ｋ．Ｉ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１５（２００５），ｐｐ．３９０８－３９１１；Ｌｅｉｍｂａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２０１２ Ｊｕｎ １８；１８（２５）：７７２９－３７；Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２００９ Ｓｅｐ；５（９）：６４７－５４；ＷＯ２００９／０７７１７３；ＷＯ２００３／０７６９４３；欧州特許第３２８４８５１号；欧州特許第３１８４６７４号を参照のこと）。

ＤＥＬ技術の確立された使用により、特定の核酸タグによって個別にコードされる多数の化合物（通常は１００万から１億のオーダー）のスクリーニングが可能になり、及び目的のタンパク質に対するＤＥＬ全体の親和性に基づくスクリーニングが１回の実験で実行可能である。ＤＥＬ技術は現在、製薬業界で広く使用されている。

これまで、ＤＥＬの構築における個々の合成ステップの可変収量により、連続する合成ステップの数と、組み込むことができるビルディングブロックの性質が制限されてきた。増大したサイズ及び／または純度のＤＥＬの構築を可能にする方法が有用であろう。

本発明者らは、固体支持体からの選択的開裂により中間体からインタクトまたは完全なライブラリーメンバーを自己精製する、核酸コードライブラリーを生成する方法を開発した。これは、例えば、個々のメンバーが複雑な構造及び／または多数のビルディングブロックを有する、大きな及び／または純粋な核酸コードライブラリー及び／または核酸コードライブラリーの産生を促進し得る。これらの方法によって生成されたライブラリーは、例えば、改善されたスクリーニング性能を示す場合があり、及び／または標的タンパク質の大きな表面に結合できるメンバーを含む場合がある。

本発明の第１の態様は、核酸コード化合物の製造方法であって、以下のステップ：
リンカーによって固体支持体に接続された足場を含む新生化合物を提供することと、
１つ以上の化学ビルディングブロックを新生化合物に共有結合させて、足場に結合した化学部分を形成することと、
１つ以上の化学ビルディングブロックをコードするコーディングオリゴヌクレオチドを新生化合物に共有結合させて、足場に結合したコーディング核酸部分を形成することと、
開裂基を化合物の化学部分、核酸部分、または足場に結合することと、
リンカーが開裂され、化合物が固体支持体から遊離されるように、リンカーと開裂基とを反応させることと、を含む方法を提供する。

本発明の第２の態様は、各ライブラリーメンバーについて、核酸コード化学ライブラリーを生成するための方法であって、以下：
リンカーによって固体支持体に接続された足場を含む新生メンバーを提供することと、
１つ以上の化学ビルディングブロックを新生メンバーに共有結合させて、足場に結合した化学部分を形成することと、
１つ以上の化学ビルディングブロックをコードするコーディングオリゴヌクレオチドを新生メンバーに共有結合させて、足場に結合したコーディング核酸部分を形成することと、
開裂基を化学部分、核酸部分、または足場に結合することと、
リンカーが開裂され、メンバーが固体支持体から遊離されるように、リンカーと開裂基とを反応させることと、を含む方法を提供する。

第１及び第２の態様のいくつかの実施形態では、開裂基を化学部分に結合させ得る（図１Ａ）。固体支持体からの選択的遊離は、完全な化学部分、または化学部分の完全なセグメントの存在によって開始され得る。

第１及び第２の態様の他の実施形態では、開裂基をコーディング核酸部分に結合させてもよい（図１Ｂ）。固体支持体からの選択的遊離は、完全な核酸部分、または核酸部分の完全なセグメントの存在によって開始され得る。

第１及び第２の態様の他の実施形態では、開裂基を足場に結合させてもよい（図１Ｃ）。固体支持体からの選択的遊離は、完全な足場の存在によって開始され得る。

第１及び第２の態様のいくつかの実施形態では、新生化合物またはメンバーの足場は、足場が第１のリンカー及び第２のリンカーによって固体支持体に接続されるように、第２のリンカーによって固体支持体にさらに接続され得る。本方法は、
第１のリンカー及び第２のリンカーによって固体支持体に連結された足場を含む新生化合物またはメンバーを提供することと、
１つ以上の化学ビルディングブロックを新生化合物またはメンバーに共有結合させて、足場に結合した化学部分を形成することと、
１つ以上の化学ビルディングブロックをコードするコーディングオリゴヌクレオチドを新生化合物またはメンバーに共有結合させて、足場に結合したコーディング核酸部分を形成することと、
コーディング核酸部分の化学的部分または足場の１つに第１の開裂基を結合させることと、
第２の開裂基を別のコーディング核酸部分、化学部分または足場に結合させることと、
第１のリンカーが開裂されるように、第１のリンカーと第１の開裂基とを反応させることと、
第２のリンカーが開裂され、化合物またはメンバーが固体支持体から遊離されるように、第２のリンカーと第２の開裂基とを反応させることと、を含み得る。

第１及び第２のリンカーは、任意の順序で順次または同時に開裂されてもよい。

化合物またはメンバーは、もし固体支持体が、（ｉ）完全な化学部分またはその化学部分の完全なセグメントと、完全な核酸部分またはその核酸部分の完全なセグメントとの両方を含む場合、（ｉｉ）完全な化学部分またはその化学部分の完全なセグメント及び完全な足場を含む場合、または（ｉｉｉ）完全なコーディング核酸部分、またはそのコーディング核酸部分の完全なセグメント及び完全な足場の両方を含む場合、固体支持体から遊離される。

いくつかの実施形態では、開裂基または第１の開裂基は、化学部分または足場に共有結合され得る。好ましくは、開裂基は、化学部分の末端化学ビルディングブロックに共有結合される。

他の実施形態では、開裂基は、化学的部分または足場に非共有結合される場合もある。例えば、アンカーオリゴヌクレオチドを化学部分または足場、好ましくは化学部分の末端化学ビルディングブロックに結合させること、及び前記アンカーオリゴヌクレオチドを、開裂基に連結された補助オリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせることによる。例えば、核酸コード化合物または化学ライブラリーを生成する方法は、以下のステップ；
アンカーオリゴヌクレオチドを化学部分または足場に結合させることと、
開裂基に結合した補助オリゴヌクレオチドを提供することと、
結合オリゴヌクレオチドを補助オリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせることと、
リンカーが開裂されるように、リンカーと開裂基とを反応させることと、を含んでもよい。

いくつかの実施形態において、開裂基は、核酸部分に共有結合され得る。好ましくは、開裂基は核酸部分の末端に共有結合される。

他の実施形態では、開裂基は、例えば、開裂基に連結された補助オリゴヌクレオチドと前記コーディング核酸部分とをハイブリダイズすることによって、核酸部分に非共有結合で結合され得る。好ましくは、補助オリゴヌクレオチドはコーディング核酸部分の末端にハイブリダイズされる。例えば、核酸コード化合物または化学ライブラリーを生成する方法は、以下のステップ；
開裂基に共有結合した補助オリゴヌクレオチドを提供することと、
補助オリゴヌクレオチドをコーディング核酸部分にハイブリダイズさせることと、
リンカーが開裂されるように、リンカーと開裂基とを反応させることと、を含み得る。

リンカーは、化学部分、足場、またはコーディング核酸部分への結合後で、かつ開裂基との反応前に、変換されてもまたは活性化されてもよい。

いくつかの実施形態では、開裂基は、化学部分、足場、またはコーディング核酸部分への結合の後で、かつリンカーとの反応の前に、さらなる変換を必要としない場合もある。他の実施形態では、開裂基は、化学部分、足場、またはコーディング核酸部分への結合後で、かつ開裂基との反応前に、活性化され得る。

いくつかの好ましい実施形態では、キャッピングステップは、各化学ビルディングブロックの添加後、及び任意選択で各コーディングオリゴヌクレオチドの添加後に実施され得る。これにより、開裂基が不完全な核酸またはペプチド核酸コード化合物に結合するのを防ぐ。

本明細書に記載の態様では、リンカーを開裂し、化合物またはメンバーを遊離することに加えて、開裂基は、化学部分の末端を足場に連結して大員環を生成する共有結合を形成し得る。例えば、リンカーと開裂基との反応は、メンバーによって提示される化学物質が大環状であるように、化学ビルディングブロックの鎖を足場に共有結合する環化要素または開裂部分を生成し得る。

本発明の第３の態様は、以下のステップを含む核酸コード化合物の製造方法であって：
第１リンカーによって固体支持体に接続された足場を含む新生化合物を提供することと、
１つ以上の化学ビルディングブロックを新生化合物に共有結合させて、足場に結合した化学部分を形成することと、
１つ以上の化学ビルディングブロックをコードするコーディングオリゴヌクレオチドを新生化合物に共有結合させて、足場に結合したコーディング核酸部分を形成することと、
化合物の化学部分を第２のリンカーで固体支持体に接続することと、
第１のリンカーを開裂することと、
化合物が固体支持体から遊離されるように、第２のリンカーを開裂することと、を含む方法を提供する。

第３の態様による第１及び第２のリンカーは、直交開裂可能であり得る。

第３の態様の方法において、完全な化学部分を有する化合物は、第２のリンカーによって固体支持体に共有結合される。不完全な化学部分を有する化合物は、第２のリンカーによって固体支持体に共有結合されない。したがって、不完全な化学部分を有する化合物は、第１のリンカーの開裂によって固体支持体から選択的に遊離される。完全な化学部分を有する化合物は、第２のリンカーによって固体支持体に結合したままである。第２のリンカーの開裂は、これらの化合物を固体支持体から選択的に遊離する。

好ましくは、キャッピングステップは、各化学ビルディングブロックの添加後に実施される。不完全な化学部分を有する化合物は、第２のリンカーへの接続を防ぐためにキャップされたままであってもよい。

本明細書に記載の第１から第３の態様のすべてにおいて、化学ビルディングブロックは、新生メンバーまたは化合物に順次付加されて、末端が新生メンバーに結合された線状化学部分（すなわち、化学ビルディングブロックの鎖）及び遊離端を形成し得る。各化学ビルディングブロックをコードするコーディングオリゴヌクレオチドは、新生メンバーに順次付加されて、直鎖状コーディング核酸部分を形成し得る。本発明の方法は、化学ビルディングブロックを新生化合物またはメンバーに共有結合させること、及び化学ビルディングブロックをコードするコーディングオリゴヌクレオチドを新生メンバーに共有結合させることを含み得る。これを１回以上繰り返して、化学部分及びコーディング核酸部分を生成し得る。化学ビルディングブロックの結合に続いて、結合された化学ビルディングブロックを欠く未反応種は、次の化学ビルディングブロックの添加前にキャッピングされてもよい。

第４の態様は、第１から第３の態様の方法によって生成された核酸コードライブラリーを提供する。

本発明のこれら及び他の態様及び実施形態は、以下でより詳細に説明される。

可能な固体支持体化合物の概略図を示している。（Ａ）、（Ｂ）、及び（Ｃ）の固体支持体化合物はそれぞれ、リンカーによって足場に結合した固体支持体を含む。（Ａ）、（Ｂ）、及び（Ｃ）のそれぞれにおいて、化学的部分ならびに核酸部分が足場に結合している。（Ａ）では、開裂基が化学部分に結合されている。（Ｂ）では、開裂基は核酸部分に結合しており、（Ｃ）では、開裂基は足場に結合している。略語：開裂基（ＣＧ）。 核酸またはペプチド核酸コード化合物または化学ライブラリーメンバーの自己精製の模式図を示す。示された実施形態では、開裂基は、化学部分に結合している。開裂基と化学部分との反応により、固体支持体から自己精製された化合物が遊離される。示されるこの実施形態において、開裂基とリンカーとの反応は、化学部分を足場に接続する生成物（ＣＧ／リンカー生成物；または開裂部分）をもたらす。開裂されたリンカーの一部は、固体支持体化合物に結合したままであってもよい。略語：開裂基（ＣＧ）。 核酸またはペプチド核酸コード化合物または化学ライブラリーメンバーの自己精製の模式図を示す。示された実施形態では、開裂基は化学部分に結合している。開裂基と化学部分との反応により、固体支持体から自己精製された化合物が遊離される。示されるこの実施形態において、開裂基とリンカーとの反応は、化学部分に結合される開裂基生成物（ＣＧ生成物）をもたらす。開裂されたリンカーの一部は、固体支持体化合物に結合したままであってもよい。略語：開裂基（ＣＧ）。 核酸またはペプチド核酸コード化合物または化学ライブラリーメンバーの自己精製の模式図を示しており、別個の化学部分及びコーディング核酸部分の精製のために２つの直交リンカーが使用される。２つの直交開裂基が使用され、開裂基１（ＣＧ１）は、化学部分に結合し、開裂基２（ＣＧ２）は核酸部分に結合する。示される実施形態では、開裂基１（ＣＧ１）はリンカー１と反応してリンカー１を開裂し、化学部分を足場に接続する生成物（ＣＧ１／リンカー１生成物）をもたらす。示される実施形態において、開裂基２（ＣＧ２）はリンカー２と反応してリンカー２を開裂し、核酸部分に結合する開裂基生成物（ＣＧ２生成物）をもたらす。両方のリンカーが開裂されると、自己精製された化合物が固体支持体から遊離される。それぞれの開裂されたリンカーの一部は、固体支持体化合物に結合したままであり得る。略語：開裂基（ＣＧ）、開裂基１（ＣＧ１）、開裂基２（ＣＧ２）。 固体支持化合物中の化学ビルディングブロックの２つの可能な配置の概略図を示している。（Ａ）では、化学ビルディングブロックの線形配置が示されている。（Ａ）では、ビルディングブロック１（化学ビルディングブロック１）が足場に取り付けられている。（Ａ）では、ビルディングブロック２（化学ビルディングブロック２）がビルディングブロック１（化学ビルディングブロック１）に結合されている。（Ａ）において、ビルディングブロックは、末端ビルディングブロック（化学的ビルディングブロックｎ）で終わるビルディングブロックの直鎖を形成するように配置されており、これは次に示される実施形態において開裂基（ＣＧ）に結合される。（Ｂ）では、化学部分の架橋構造が示されており、これは、最初に ３つのビルディングブロックを結合して直鎖を形成すること、次にビルディングブロック４（化学ビルディングブロック４）と、ビルディングブロック３（化学ビルディングブロック３）及びビルディングブロック１（化学ビルディングブロック１）の両方とを結合することによって形成される。（Ｂ）に示される実施形態では、さらなるビルディングブロックがビルディングブロック３（化学ビルディングブロック３）に結合され得、末端ビルディングブロック（化学ビルディングブロックｎ）で終わり、これが次いで開裂基（ＣＧ）に結合される。略語：開裂基（ＣＧ）、ビルディングブロック（化学ビルディングブロック）、ビルディングブロック１（化学ビルディングブロック１）、ビルディングブロック２（化学ビルディングブロック２）、ビルディングブロック３（化学ビルディングブロック３）、ビルディングブロック４（化学ビルディングブロック４）、末端ビルディングブロック（化学ビルディングブロックｎ）。 自己精製された化合物の２つの可能な構造の概略図を示している。自己精製された化合物はそれぞれ、核酸部分に結合した足場、及び化学部分を含む。実施形態（Ａ）では、線状構造の自己精製化合物が示されている。（Ａ）では、ビルディングブロックが直線的に配置されており、自己精製反応により、末端のビルディングブロック（化学ビルディングブロックｎ）に結合した開裂基生成物（ＣＧ生成物）が生じる。（Ａ）では、足場、ビルディングブロック、及び開裂基生成物（ＣＧ生成物）が直線的に配置されている。実施形態（Ｂ）では、環状構造の自己精製化合物が示されている。（Ａ）では、ビルディングブロックが直線状に並んでおり、自己精製反応により末端ビルディングブロック（化学ビルディングブロックｎ）と足場を連結する生成物（ＣＧ／リンカー生成物）が生じる。（Ｂ）では、足場、ビルディングブロック、及び開裂基／リンカー生成物（ＣＧ／リンカー生成物）が環状に配置されている。 自己精製された化合物の２つの可能な構造の概略図を示している。自己精製された化合物はそれぞれ、核酸部分に結合した足場、及び化学部分を含む。実施形態（Ａ）では、分岐構造の自己精製化合物が示されている。（Ａ）では、ビルディングブロック１（化学ビルディングブロック１）、ビルディングブロック２（化学ビルディングブロック２）、ビルディングブロック４（化学ビルディングブロック４）、及び末端ビルディングブロック（化学ビルディングブロックｎ）が直線構造で配置されている。（Ａ）では、ビルディングブロック３（化学ビルディングブロック３）が、付属物として、ビルディングブロック２（化学ビルディングブロック２）に結合されている。（Ａ）では、ビルディングブロックが分岐して配置されており、自己精製反応により、末端のビルディングブロック（化学ビルディングブロックｎ）に結合した開裂基生成物（ＣＧ生成物）が生じる。（Ａ）では、足場、ビルディングブロック、及び開裂基生成物（ＣＧ生成物）が分岐して配置されている。実施形態（Ｂ）では、環状構造の自己精製化合物が示されている。（Ｂ）ではビルディングブロック１から末端ビルディングブロックまでが直線状に配置され、さらにビルディングブロック２（化学ビルディングブロック２）とビルディングブロック４（化学ビルディングブロック４）とが架橋されている。（Ｂ）では、自己精製反応により、ターミナルビルディングブロック（化学ビルディングブロックｎ）を足場に接続する生成物（ＣＧ／リンカー生成物）が生成される。（Ｂ）では、足場、ビルディングブロック、及び開裂基／リンカー生成物（ＣＧ／リンカー生成物）が二環式で配置されている。略語：開裂基（ＣＧ）、ビルディングブロック（化学ビルディングブロック）、ビルディングブロック１（化学ビルディングブロック１）、ビルディングブロック２（化学ビルディングブロック２）、ビルディングブロック３（化学ビルディングブロック３）、ビルディングブロック４（化学ビルディングブロック４））、ターミナルビルディングブロック（化学ビルディングブロックｎ）。 固体支持体からの純粋な核酸またはペプチド核酸コード化合物または化学ライブラリーメンバーの選択的開裂の模式図を示す。リンカーと開裂基（ＣＧ）との間に完全に合成された構造を含む固体支持体化合物は、固体支持体から遊離される（上のパネル）。切断された生成物は、合成でキャップされ、開裂基（ＣＧ）を含まないため、固体支持体から開裂されない（下のパネル）。略語：開裂基（ＣＧ）。 連続核酸コードの選択的ライゲーションの模式図を示す。核酸部分内で、コード１はコード２にのみ結合でき、コード３には結合できない。コード２に連結された完全なコード１を含む化合物は、コード３に結合され得る（上部パネル）。対照的に、コード２のコード１への結合が失敗したせいで切断される化合物は、その後のライゲーションでコード３に連結されない場合がある（下のパネル）。 完全に合成された固体支持体化合物に対するリンカー２の選択的導入の概略図を示している。完全な固体支持体化合物については、化学部分は、固体支持体、または固体支持体とリンカー１との間の分岐領域に、リンカー２を介して連結され得る（上部パネル）。対照的に、リンカー２は、キャップされた化合物（下のパネル）などの不完全な化学部分を有する化合物には正常にインストールされない場合がある。 固体支持体からの不完全な化学部分を有する核酸またはペプチド核酸コード化合物または化学ライブラリーメンバーの選択的遊離の概略図を示す。リンカー１の開裂により、第２のリンカー（リンカー２）を持たない化合物が固体支持体から遊離される。切断された化学部分を有する核酸コード化合物は、リンカー１の開裂によって固体支持体から遊離される（下のパネル）。リンカー１及びリンカー２の両方を含む核酸コード化合物またはライブラリーメンバーは、リンカー１の開裂後も固体支持体に結合したままである（上のパネル）。化学部分が切断またはキャップされた化合物の選択的遊離により、自己精製効果が得られる。 第２のリンカー（リンカー２）の開裂による固体支持体からの核酸またはペプチド核酸コード化合物または完全な化学部分を有する化学ライブラリーメンバーの遊離の模式図を示す。リンカー２は、リンカー１の開裂と固体支持体の洗浄に続き、望ましくない不純物化合物を除去する。 ５’アジド修飾一本鎖オリゴヌクレオチド（実施例１）の調製についての分析ＬＣＭＳデータを示す。（Ａ）では、２６０ｎｍの吸光度を測定するクロマトグラムが、出発物質のオリゴヌクレオチド（配列１）について示されている。デコンボリューションされた（ｄｅｃｏｎ．）質量スペクトルは、出発物質のオリゴヌクレオチド（配列１）について（Ｃ）に示されている。（Ｂ）では、２６０ｎｍの吸光度を測定するクロマトグラムが、生成物である５’－アジド修飾一本鎖オリゴヌクレオチドについて示されている。（Ｄ）は、生成物ピークのデコンボリューションされた質量スペクトルを示している。 新生ライブラリーメンバーの開裂に関する分析ＬＣＭＳデータを示す（実施例２）。（Ａ）、及び（Ｂ）は、２６０ｎｍの吸光度を測定したクロマトグラムを示している。（Ｃ）、及び（Ｄ）は、それぞれ３．８４分での生成物ピークの質量スペクトル、及びデコンボリューションされた質量スペクトルを示している。 核酸コードライブラリーメンバーにおけるＭｅＤｂｚリンカーの活性化を詳述する化学構造を示す（実施例４、実施例５）。変換（Ａ）は、ＭｅＤｂｚとｐ－ニトロフェニルクロロホルメートの反応を示している。反応（Ｂ）は、リンカー活性化の最終ステップを示している。これは、自己精製のためのリンカー活性化ステップの例である。 リポ酸開裂基におけるジスルフィド結合の還元についての化学構造を示す（実施例４、実施例５）。これは、自己精製のための開裂基脱保護ステップの例である。 核酸コードライブラリーメンバーの自己溶出を示す（実施例４、実施例５）。示されている化学構造は、チオールを含む開裂基と活性化されたＭｅＮｂｚリンカーとの反応を示している。これにより、自己溶出したライブラリーメンバーが固体支持体から遊離される。このステップにより、チオエステルを有する環状化合物が得られる。２つの可能な環状化合物が得られ、一方はリンカーと反応した開裂基のいずれかのチオールを有する。 チオエステル結合による環状自己精製ライブラリーメンバーの加水分解の化学構造を示す（実施例４）。チオエステルの加水分解後に得られる生成物は、この場合、線状である。 ＴＣＥＰ還元後のさらなるインキュベーションステップの上清の沈殿後に観察された、自己溶出モデル核酸コードライブラリーメンバーの化学構造及び分析ＬＣＭＳスペクトルを示す（実施例４）。化学構造（Ａ）及び（Ｂ）を、（Ｃ）及び（Ｄ）のＬＣＭＳスペクトルで観察した。（Ｂ）は、環状チオエステル中間体の加水分解によって形成された直鎖状の自己溶出生成物である。（Ａ）は、エタノールによる環状チオエステル中間体の開環によって形成された直鎖状の自己溶出生成物であり、沈殿ステップで追加される。（Ｃ）は、２６０ｎｍの吸光度のクロマトグラムであり、（Ｄ）は、２８０ｎｍの吸光度のクロマトグラムである。 自己溶出モデル核酸コードライブラリーメンバーのＬＣＭＳ分析から得られた質量スペクトルを示す（実施例４）。（Ａ）及び（Ｂ）は、図１９Ａに示す自己溶出ライブラリーメンバー化合物の質量スペクトル及びデコンボリューションされた質量スペクトルをそれぞれ示す。（Ｃ）及び（Ｄ）は、図１９Ｂに示す自己溶出ライブラリーメンバー化合物の質量スペクトル及びデコンボリューションされた質量スペクトルをそれぞれ示す。 実施例５で調製された自己溶出核酸ライブラリーメンバーの化学構造及びＬＣＭＳスペクトルを示す。（Ａ）２つの可能な環状自己溶出核酸コードライブラリーメンバーの構造を示す。（Ｂ）は２６０ｎｍでのクロマトグラムを示し、（Ｃ）は、全イオン電流（ＴＩＣ）である。環状自己溶出ライブラリーメンバーに対応する質量のピークが５．８８分に観察される。 実施例５で調製された自己溶出核酸ライブラリーメンバーの化学構造及びＬＣＭＳスペクトルを示す。（Ａ）２つの可能な環状自己溶出核酸コードライブラリーメンバーの構造を示す。（Ｂ）、及び（Ｃ）は、それぞれ、自己溶出核酸ライブラリーメンバーのピークの質量スペクトル、及び対応するデコンボリューションされた質量スペクトルである。所望の環状自己溶出核酸コードライブラリーメンバーの質量を観察した。 新生ライブラリーメンバーの合成におけるステップの反応スキームを示す（実施例６、実施例７）。最初に、アミン官能化固体支持体をＦｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）－ＯＨ（Ａ）に結合させた。次に、Ｆｍｏｃ脱保護及びＨＭＢＡへのカップリングが続く（Ｂ）。その後、Ｆｍｏｃ－Ｐｒａ－ＯＨへのアミドカップリングが示されている（Ｃ）。 核酸コードライブラリーメンバーの合成におけるステップの反応スキームを示す（実施例６）。最初に、図２３の生成物のＦｍｏｃ脱保護に続いて、１－（１，１－ジメチルエチル）ブタンジオエートビルディングブロック（Ａ）にカップリングした。次に、ビルディングブロックの遠位基をｔＢｕで脱保護し、リジン側鎖をジクロロメタン中のＴＦＡを用いてＭｔｔで脱保護した（Ｂ）。 核酸コードライブラリーメンバーの合成におけるステップの反応スキームを示す（実施例６）。銅触媒アジド－アルキン環化付加（ＣｕＡＡＣ）によるオリゴヌクレオチド結合を（Ａ）に示す。（Ｂ）ＤＮＡの存在下で固体支持体上で行われたアミドカップリング反応を示す。（Ｂ）は、第２のリンカーのインストールの第１のステップである。 核酸コードライブラリーメンバーの合成におけるステップの反応スキームを示す（実施例６）。図２５に示される生成物は、アミドカップリングによってアルキンを有するＤｂｚリンカー誘導体と反応した（Ａ）。次に、環状固体支持体化合物（Ｂ）を得るために、ＣｕＡＡＣ反応を行った。環化化合物は、第１のリンカーであるＨＭＢＡリンカー、及び第２のリンカーであるＤｂｚリンカーを含む。 核酸コードライブラリーメンバーの自己精製における第１ステップの反応スキームを示す（実施例６）。図２６の生成物の第１のリンカーは、塩基性条件で開裂された。このステップでは、非環化化合物が固体支持体から遊離された。このステップでは、望ましくない副生成物を固体支持体から洗い流してもよい。 核酸コードライブラリーメンバーの自己精製のための第２のリンカーの開裂のための反応スキームを示す（実施例６）。まず、亜硝酸イソペンチルを使用して、第２のリンカーであるＤｂｚを活性化した（Ａ）。（Ｂ）では、次いで、活性化されたリンカーが、水及びＤＭＳＯ中の塩基性条件下で開裂された。これにより、自己精製核酸コードライブラリーメンバーが固体支持体から遊離された。 実施例６で調製されたサンプルのＬＣＭＳスペクトルを示す。（Ａ）は、固体支持体からの核酸コードライブラリーメンバーの合成における中間体を開裂することによって得られたＬＣＭＳスペクトルを示す。分析された中間体は、Ｄｂｚリンカー誘導体へのカップリング後であってかつ、ＣｕＡＡＣの前である。ＨＭＢＡリンカーの開裂により、クロマトグラム（Ａ）の４．０１分に示されているように、所望の中間体が得られる。所望の中間体の化学構造を（Ａ）に示す。さらに、分析されたサンプルは、望ましくない中間生成物を含んでいる。これらは、例えば、合成において前のアミドカップリングステップを受けなかった化合物であり得る。（Ｂ）は、核酸コードライブラリーメンバーの合成における最後のＣｕＡＡＣステップの後に、第１のリンカーであるＨＭＢＡリンカーを開裂することによって得られたクロマトグラムを示す（実施例６）。これは、核酸コードライブラリーメンバーの自己精製における第１のステップである。このステップでは、環化されていない望ましくない生成物が固体支持体から遊離される。クロマトグラム（Ｂ）をクロマトグラム（Ａ）と比較すると、（Ａ）の所望の中間体を除いて、すべての化合物が（Ｂ）で固体支持体から開裂されていることが示されている。これは、この化合物がアルキンを含み、（Ｂ）での開裂の前にＣｕＡＡＣを受けたからである。これによって、ＣｕＡＡＣ反応が成功し、このステップで望ましくない生成物のみが固体支持体から遊離されることが示される。（Ｃ）は、第２のリンカーＤｂｚを開裂した後に得られたサンプルのクロマトグラムを示している。クロマトグラムは、自己精製された核酸コードライブラリーメンバーを示している。所望の自己精製核酸コードライブラリーメンバーの構造を（Ｃ）に示す。 実施例６で調製された自己精製核酸コードライブラリーメンバーのＬＣＭＳスペクトルを示す。（Ａ）は、２６０ｎｍ吸光度のクロマトグラムを示す。（Ｂ）２８０ｎｍ吸光度のクロマトグラムを示す。（Ｃ）３．９４分での生成物ピークの質量スペクトルを示す。（Ｄ）３．９４分での生成物ピークのデコンボリューションされた質量スペクトルを示す。所望の自己精製核酸コードライブラリーメンバーに対応する質量が観察される。 モデル核酸コードライブラリーメンバーの合成におけるステップの反応スキームを示す（実施例７）。（Ａ）Ｆｍｏｃ脱保護とそれに続くＦｍｏｃ－Ｄｂｚ－ＯＨへのアミドカップリングを示す。（Ｂ）は、固体支持体化合物中のリジン側鎖のＭｔｔ 脱保護を示している。 モデル核酸コードライブラリーメンバーの合成におけるステップの反応スキームを示す（実施例７）。銅触媒アジド－アルキン環化付加（ＣｕＡＡＣ）によるオリゴヌクレオチド結合を（Ａ）に示す。（Ｂ）ＤＮＡの存在下で固体支持体上で行われたアミドカップリング反応を示す。（Ｂ）は、第２のリンカーのインストールの第１のステップである。 モデル核酸コードライブラリーメンバーの合成におけるステップの反応スキームを示す（実施例７）。図３２に示される生成物のＦｍｏｃ脱保護に続いて、ヘキシン酸へのアミドカップリングが行われた（Ａ）。次に、環状固体担体化合物（Ｂ）を得るために、ＣｕＡＡＣ反応を行った。環化化合物は、第１のリンカーであるＨＭＢＡリンカー、及び第２のリンカーであるＤｂｚリンカーを含む。 核酸コードライブラリーメンバーの自己精製における第１ステップの反応スキームを示す（実施例７）。図３３の生成物の第１のリンカーは、塩基性条件で開裂された。このステップでは、非環化化合物が固体支持体から遊離された。このステップでは、望ましくない副生成物を固体支持体から洗い流してもよい。 核酸コードライブラリーメンバーの自己精製のための第２のリンカーの開裂のための反応スキームを示す（実施例７）。まず、亜硝酸イソペンチルを使用して、第２のリンカーであるＤｂｚを活性化した（Ａ）。（Ｂ）では、次いで、活性化されたリンカーを、水及びＤＭＳＯ中の塩基性条件下で開裂した。これにより、自己精製核酸コードライブラリーメンバーが固体支持体から遊離された。 実施例７で調製された自己精製核酸コードライブラリーメンバーのＬＣＭＳスペクトルを示す。（Ａ）は、２６０ｎｍ吸光度のクロマトグラムを示す。（Ｂ）２８０ｎｍ吸光度のクロマトグラムを示す。（Ｃ）３．９７分での生成物ピークの質量スペクトルを示す。（Ｄ）３．９７分での生成物ピークのデコンボリューションされた質量スペクトルを示す。これらのデータは、所望の自己精製核酸コードライブラリーメンバーが得られたことを示している。これらのデータはさらに、Ｄｂｚリンカーが活性化されていることを示している。 図３７（Ａ）は、固体支持体上でのＤＮＡライゲーションの模式図を示す（実施例８）。コードは、アダプターオリゴヌクレオチド及びＴ４ ＤＮＡリガーゼを使用して、固体支持体に結合したオリゴヌクレオチドに連結される。２６０ｎｍの吸光度のＬＣＭＳ クロマトグラム（Ｂ）は、ライゲーション条件の後にエステルリンカーを開裂することによって得られた。ライゲーション産物は４．４７分で観察された。残りのアダプター、コード、及びライゲーションされていない出発物質をさらに観察した。（Ｃ）は、ライゲーション生成物ピークのデコンボリューションされた質量スペクトルを示している。所望のライゲーション生成物の質量が観察された。 （Ａ）アダプターオリゴヌクレオチド、（Ｂ）コード、及び（Ｃ）図３７Ｂに示されるＬＣＭＳクロマトグラムの出発物質ピークのデコンボリューションされた質量スペクトルを示す。 実施例９で行われた変換の反応スキームを示している。 実施例９で調製したサンプルのＬＣＭＳスペクトルを示す。図４０Ａは、ステップ９．６で調製したサンプルの２６０ｎｍでのクロマトグラム、及び出発物質の化学構造を示す。図４０Ａで観察された主要なピークは、所望の出発物質に対応する。クロマトグラム（図４０Ａ）の主要ピークの保持時間におけるデコンボリューションされた質量スペクトルを図４０Ｃに示す。所望の出発物質に対応する質量が観察される。図４０Ｂは、ステップ９．８で調製したサンプルの２６０ｎｍでのクロマトグラムと、所望の生成物の化学構造を示している。図４０Ｂで観察された主要なピークは、所望の生成物に対応する。クロマトグラム（図４０Ｂ）の主要な生成物の保持時間でデコンボリューションされた質量スペクトルを、図４０Ｄに示す。所望の生成物に対応する質量が観察される。この実施例は、高い変換率でＤＮＡ上の固体支持体上で化学変換を実行できることを示している。

いくつかの態様では、核酸コードライブラリーは、各ライブラリーメンバーについて、リンカーを介して固体支持体に結合した足場、この足場に結合した化学部分、核酸、この足場に結合した核部分を含む固体支持体、ならびに化学部分、足場、または核酸部分に結合した開裂基を調製することを含む方法によって、本明細書で記載されるように生成され得る。この方法は、開裂基をリンカーと反応させて固体支持体から化合物を遊離させてライブラリーメンバーを形成することをさらに含む。

開裂基によるリンカーの開裂により、大環状分子が生成され得る。大環状分子は、化学部分及び足場を含み得る。化学部分の末端は、開裂基と活性化リンカーとの反応によって生成される環化要素によって、大環状分子の足場に共有結合され得る。

完全な化学部分、足場、またはコーディング核酸部分の開裂基を有するメンバー（すなわち、意図される化学的ビルディングブロック、コーディングオリゴヌクレオチド、または他の要素のすべてが存在する種）は、開裂基によってリンカーの開裂を介して固体支持体から選択的に遊離される。例えば、完全な化学部分は、連結された化学ビルディングブロックの鎖（すなわち、意図された化学ビルディングブロックのすべてが化学部分に存在する種）であってもよい。開裂基は、不完全または部分的な化学部分、足場、またはコーディング核酸部分の開裂基（例えば、キャップされた未反応または部分的に反応した中間体）を有する化合物またはメンバーには結合しないため、これらの化合物またはメンバーは固体支持体から遊離されない。例えば、意図した化学ビルディングブロックのすべてを含まない不完全または部分的な化学部分を有するメンバーは、固体支持体から遊離されない。これにより、完全な化合物またはライブラリーメンバーが自己精製され、例えばＨＰＬＣなどのクロマトグラフィー技術を使用して、さらに精製する必要がなくなる場合がある。本明細書に記載の自己精製は、非常に純粋なメンバーの生産を可能にし、多くの合成ステップを伴う複雑なライブラリーメンバーの生産を容易にする。本明細書に記載の方法は、既存のＤＥＬ生産技術と比較して迅速であり得る。それらは自動化に適している可能性があり、非常に多様な高品質のＤＥＬの作成が可能になる。

固体支持体から開裂されていない不完全に合成された化合物から完全なメンバーまたは化合物を分離するプロセスは、本明細書では自己精製と呼んでもよい。リンカー（複数可）の開裂後に固体支持体から遊離され、足場、化学部分、及び核酸部分を含み、ならびに開裂反応で一緒に反応したリンカーの部分及び開裂基の部分を含み得る化合物またはメンバーは、自己精製された化合物またはメンバーと呼ばれてもよい。

他の態様では、核酸コードライブラリーは、各ライブラリーメンバーについて、第１のリンカーを介して固体支持体に結合した足場、この足場に結合した化学部分、この足場に結合した核酸部分、及び化学部分を固体支持体に接続する第２のリンカーを含む固体支持体化合物を調製することを含む方法によって、本明細書に記載のとおり生成され得る。この方法はさらに、第１のリンカーを開裂すること、任意選択で洗浄すること、次いで第２のリンカーを開裂して固体支持体から化合物を遊離してライブラリーメンバーを形成することを含む。

第２のリンカーは、不完全または部分的な化学部分を有する化合物またはメンバー（例えば、キャップされた未反応または部分的に反応した中間体）に結合しない。これらの化合物またはメンバーは、第１リンカーのみによって固体支持体に結合され、第１リンカーの開裂によって固体支持体から遊離される。例えば、意図した化学ビルディングブロックのすべてを含まない不完全または部分的な化学部分を有するメンバーは、第１のリンカーの開裂によって固体支持体から遊離され、除去され得る。完全な化学部分を有するメンバー（すなわち、意図された化学ビルディングブロックのすべてが存在する種）は、第１及び第２リンカーの両方によって固体支持体に結合される。例えば、完全な化学部分は、連結された化学ビルディングブロックの鎖であってもよい（すなわち、意図された化学ビルディングブロックのすべてが化学部分に存在する種）。これらのメンバーは、第２のリンカーの開裂によって固体支持体から選択的に遊離される。これにより、完全な化合物またはライブラリーメンバーが自己精製され、例えば、ＨＰＬＣなどのクロマトグラフィー技術を使用して、さらに精製する必要がなくなる場合がある。本明細書に記載の自己精製は、非常に純粋なメンバーの生産を可能にし、多くの合成ステップを伴う複雑なライブラリーメンバーの生産を容易にする。本明細書に記載の方法は、既存のＤＥＬ生産技術と比較して迅速であり得る。それらは自動化に適している可能性があり、非常に多様な高品質のＤＥＬの作成が可能になる。

第１のリンカーの開裂によって固体支持体から遊離される、不完全に合成された化合物から完全な化合物を分離するプロセスは、本明細書では自己精製と呼んでもよい。第２のリンカーの開裂後に固体支持体から遊離され、足場、完全化学部分、及び核酸部分を含み、ならびに開裂反応で後に保持されたリンカーの部分を含み得る化合物またはメンバーは、自己精製された化合物またはメンバーと呼ばれてもよい。

第１及び第２のリンカーは、直交開裂可能であり得る。例えば、第１のリンカーを開裂するのに必要な反応条件は、第２のリンカーを開裂するのに必要な反応条件とは異なり得る。したがって、第１及び第２のリンカーは、反応条件を変更することによって独立して開裂可能である。第１のリンカー１は、固体支持化合物の合成中に安定でなければならない。第２のリンカーは、第１のリンカーの開裂条件に対して安定でなければならない（すなわち、第２のリンカーは、第１のリンカーの開裂を引き起こす条件下で開裂されてはならない）。第１及び第２のリンカーの開裂条件は、核酸部分の分解または破壊を引き起こしてはならない。

いくつかの実施形態では、第１及び／または第２のリンカーは、開裂前に活性化され得る。

適切な第１及び／または第２のリンカーは、エステルリンカー、光開裂可能、アミノ（メチル）アニリン（ＭｅＤｂｚ）、アミノアニリン（Ｄｂｚ）、マスクされたチオエステル、スルホンアミド、酸化的開裂可能、還元的開裂可能及び酵素的開裂可能リンカーなどの塩基開裂可能リンカーを含み得る。

適切な第１及び／または第２のリンカーは、求核剤によって開裂され得るリンカーを含み得る。求核剤によって開裂され得るリンカーの例としては、チオエステル、スルホンアミド、ベンゾイミダゾロン（例えば、ＭｅＮｂｚ）、及びベンゾトリアゾール（例えば、亜硝酸イソペンチルによって活性化されるＤｂｚリンカー）が含まれ得る。

エステルリンカーなどの適切な塩基開裂可能なリンカーは、高ｐＨで開裂され得る。塩基ベースのリンカーの例としては、エステル、ベンジルエステル、及び４－（ヒドロキシメチル）安息香酸（ＨＭＢＡ）（Ｕｓａｎｏｖ，Ｄ．Ｌ．ｅｔ ａｌ Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．１０，７０４－７１４（２０１８）；Ｓｏｕｒａｌ，Ｍ．ｅｔ ａｌ Ｌｉｎｋｅｒｓ ｆｏｒ Ｓｏｌｉｄ－Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．ｉｎ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｖｏｌ．３ ２７３－３１２（Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ，２０１１））が挙げられる。

光開裂可能なリンカーは、光照射によって開裂され得る。光開裂可能なリンカーの例としては、オルト－ニトロベンジルオキシ及びオルト－ニトロベンジルアミノ、オルト－ニトロベタリル、フェナシル、ピバロイル、ベンゾインリンカー、及び他の光不安定性リンカーが挙げられる（Ｍｉｋｋｅｌｓｅｎ，Ｒ．Ｊ．Ｔ．ｅｔ ａｌ Ｐｈｏｔｏｌａｂｉｌｅ Ｌｉｎｋｅｒｓ ｆｏｒ Ｓｏｌｉｄ－Ｐｈａｓｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．（２０１８）ｄｏｉ：１０．１０２１／ａｃｓｃｏｍｂｓｃｉ．８ｂ０００２８．）。

酸化的に開裂可能なリンカーとしては、Ｌ－酒石酸、セラモックス、及びイソセラモックスリンカーに基づくリンカーなどのジェミナルジオールが挙げられる（Ｕｓａｎｏｖ，Ｄ．Ｌ．ｅｔ ａｌ Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．１０，７０４－７１４（２０１８）；Ｐｏｍｐｌｕｎ ｅｔ ａｌ Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍｉｅ－Ｉｎｔ．Ｅｄ．５９，１１５６６－１１５７２（２０２０）これらは、例えば、過ヨウ素酸ナトリウムなどによって開裂され得る。

他の適切な第１及び／または第２のリンカーは、当該技術分野で入手可能であり、スルホンアミドリンカー（Ｍｅｎｄｅ，Ｆ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３２，１１１１０－１１１１８（２０１０））及び開裂可能なリンカー（Ｓｃｏｔｔ，Ｐ．Ｊ．Ｈ．Ｌｉｎｋｅｒ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ Ｓｏｌｉｄ－Ｐｈａｓｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（２００９）；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（２０１３）；Ｌｅｒｉｃｈｅ，Ｇ．，Ｃｈｉｓｈｏｌｍ，Ｌ．＆ Ｗａｇｎｅｒ，Ａ．，Ｃｌｅａｖａｂｌｅ ｌｉｎｋｅｒｓ ｉｎ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ（２０１２））が挙げられる。いくつかの実施形態では、第１及び第２のリンカーは、単一の化学物質に組み込まれてもよい。例えば、単一の第１及び第２のリンカーは、イミノ二酢酸に基づく場合がある。第１のリンカーは、脱保護媒介環化において開裂されて、ジケトピペラジンの第２のリンカーを生成し得、これは次に高ｐＨで開裂される。（Ｐａ Ｔｅｋ，Ｍ．＆ Ｌｅｂｌ，Ｍ．Ｓａｆｅｔｙ－Ｃａｔｃｈ ａｎｄ Ｍｕｌｔｉｐｌｙ Ｃｌｅａｖａｂｌｅ Ｌｉｎｋｅｒｓ ｉｎ Ｓｏｌｉｄ－Ｐｈａｓｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｂｉｏｐｏｌｙ ｖｏｌ．４７（１９９８）；Ｋｏｃｉｓ，Ｐ．，Ｋｒｃｈｎａｋ，Ｖ．＆ Ｌｅｂｌ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３４，７２５１－７２５２（１９９３））。

他の適切な第１及び／または第２のリンカーは、固体支持体及び足場及び／または化学部分及び／または核酸部分への結合前に２つ以上の結合基を含んでもよい。例えば、リンカーは、第１の結合基を介して固体支持体に結合してもよく、第２の結合基を介して足場及び／または化学部分及び／または核酸部分に結合してもよい。リンカーの結合基は、官能基であってもよい。適切な第１及び／または第２のリンカーは、それらの結合基に関して、ホモ二官能性であっても、またはヘテロ二官能性であってもよい。適切なヘテロ二官能性リンカーとしては、３－［［（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ）カルボニル］アミノ］－４－（メチルアミノ）安息香酸（Ｆｍｏｃ－ＭｅＤｂｚ－ＯＨ）が含まれてもよく、ここで、カルボン酸基は、例えばＦｍｏｃ脱保護後、固体支持体及びアミン基に結合してもよく、例えば、足場に結合してもよい。他の適切なヘテロ二官能性リンカーとしては、４－アミノ－３－［［（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ）カルボニル］アミノ］安息香酸（Ｆｍｏｃ－Ｄｂｚ－ＯＨ）及び ４－（ヒドロキシメチル）安息香酸（ＨＭＢＡ）が挙げられ得る。

ＤＮＡコード化学ライブラリー（ＤＥＬ）は、化学的に多様なライブラリーメンバーのコレクションであり、それぞれ（ｉ）化学的に結合した化学ビルディングブロックのセットから形成される化学部分、及び（ｉｉ）この化学部分を形成する化学ビルディングブロックのセットをコードする核酸を含む。ライブラリー内の異なるメンバーの数は、ライブラリーの複雑さを表し、各化学部分を形成するビルディングブロックの数によって、及び各ビルディングブロックの異なるバリアントの数によって定義される。

化学部分は、ライブラリーメンバーによって表示される化学物質または分子構造であり、１つ、２つ、またはそれ以上の化学ビルディングブロックを含む。化学部分は、足場に共有結合され、かつ１つ以上の化学ビルディングブロックの連続的な共有結合によって生成されて、足場に結合した末端及び遊離端を有する直鎖または主鎖を形成する。開裂基は、化学部分に結合されてもよい。ＤＥＬライブラリーのメンバーによって表示されるさまざまな化学部分は、さまざまな化学ビルディングブロックの組み合わせから形成される。ＤＥＬによって表示される化学部分は、さまざまなサイズの線状、大環状、二環式、多環式、または分枝化合物（例えば、リピンスキー様の小さな化合物及び大きな化合物）であり得る。いくつかの実施形態では、化学部分は、任意の小分子（すなわち、約１，０００ダルトン未満の分子量を有する分子）であり得る。他の実施形態では、化学部分は、任意の中間サイズの分子（すなわち、約５，０００ダルトン未満の分子量を有する分子）であり得る。小分子は、有機または無機、単離されたもの（例えば、化合物ライブラリーまたは天然源由来）であってもよく、または既知の化合物の誘導体化によって得られたものであってもよい。化学部分は、１つ以上の所望の特性、例えば、生物学的標的に結合する能力、溶解度、水素結合供与体及び受容体の利用可能性、結合の回転自由度、正電荷、負電荷、インビボ安定性、細胞透過性、及び／または経口利用可能性を有するように設計されても構築されてもよい。

核酸コード化学ライブラリーに表示される化学部分は、核酸の一本鎖（「単一ファーマコフォアライブラリー」）またはハイブリダイズした核酸の２つの異なる鎖に結合し得、１つ以上のビルディングブロックが各鎖に結合される（「二重ファーマコフォアライブラリー」）。

コーディング核酸部分は、化学部分中の化学ビルディングブロックを識別する核酸タグまたはペプチド核酸タグである。コーディング核酸部分は、化合物またはメンバーに接続された末端及び遊離端を含む線状核酸分子であり得る。好ましくは、コーディング核酸部分は足場に結合している。以前またはその後に導入された化学ビルディングブロックを記録するために、コーディング核酸部分は、コーディングオリゴヌクレオチドを遊離端に共有結合的に付加することによって伸長され得る。コーディング核酸部分は、増幅及び核酸配列決定後に自己精製化合物の同定に使用してもよい。いくつかの実施形態では、開裂基は、例えば遊離端で、核酸部分に結合され得る。

本明細書に記載の方法では、核酸コード化学ライブラリーのメンバーは、新生メンバーへの化学ビルディングブロック及びコーディングオリゴヌクレオチドの付加により固体支持体上に構築され得る。

固体支持体に結合した場合、新生メンバーは固体支持体化合物と呼んでもよい。固体支持体化合物とは、リンカーを介して足場、化学部分、核酸部分、開裂基、及び新生メンバーの他の要素に接続される固体支持体を含む化合物である。

いくつかの実施形態による固体支持体化合物の例を図１に示す。例えば、核酸コード化学ライブラリーは、本明細書に記載のように、以下のステップ；
リンカーによって固体支持体に接続された足場をそれぞれが含む新生メンバーのセットを提供することと、
１つ以上の化学ビルディングブロックをセット内の新生メンバーに共有結合させて、足場に結合した化学部分を形成し、異なる化学部分をセット内の異なる新生メンバーに結合させることと、
セット内の新生メンバーの足場に結合したコーディング核酸部分を形成するために、新生メンバーに結合した１つ以上の化学ビルディングブロックをコードするオリゴヌクレオチドをコードする各新生メンバーに共有結合することと、
新生メンバーの化学的部分、核酸部分、または足場に開裂基を結合させることと、
リンカーが開裂され、ライブラリーのメンバーがそれぞれの固体支持体から遊離されるように、リンカーと各メンバーの開裂基とを反応させることと、を含む方法によって、生成され得る。

自己精製反応（すなわち、開裂基とリンカーとの反応）の例は、図２及び図３に例示されている。図２及び図３では、自己精製は、化学部分に結合された開裂基内の固体支持体化合物を用いて例証される。

開裂基とリンカーとの反応は、リンカーと開裂基（すなわち、開裂基／リンカー生成物、図２を参照）との反応によって形成される開裂部分（環化要素とも呼ばれる）を含む固体支持体からの化合物またはメンバーの遊離をもたらし得る。リンカーの一部（すなわち、開裂されたリンカー）は、固体支持体に結合したままであってもよい。

いくつかの実施形態では、開裂部分は、開裂基が化学部分に接続された場合に化学部分に接続されてもよく、リンカーが足場に接続された場合に足場に接続されてもよい。開裂基とリンカーとの反応は、コーディング核酸部分に結合した環状化合物を生成する環化反応をもたらし得る（図２）。環状化合物は、化学部分、足場、及び開裂部分を含み得る。

他の実施形態では、開裂部分は、開裂基が化学部分に接続された場合、化学部分に接続され得る。開裂基とリンカーとの反応は、開裂部分が足場に接続されないように、自己精製中に環化をもたらさない場合がある（図３を参照）。いくつかの実施形態では、リンカーの全部または一部（すなわち、開裂されたリンカー）が足場に結合したままであってもよい。

他の実施形態による固体支持体化合物の例を図１０に示す。例えば、核酸コード化学ライブラリーは、本明細書に記載のように、以下のステップ；
第１のリンカーによって固体支持体に接続された足場をそれぞれが含む新生メンバーのセットを提供することと、
１つ以上の化学ビルディングブロックをセット内の新生メンバーに共有結合させて、足場に結合した化学部分を形成し、異なる化学部分をこのセット内の異なる新生メンバーに結合させることと、
このセット内の新生メンバーの足場に結合したコーディング核酸部分を形成するために、新生メンバーに結合した１つ以上の化学ビルディングブロックをコードするオリゴヌクレオチドをコードする各新生メンバーに共有結合することと、
新生メンバーの化学部分を第２のリンカーで固体支持体に接続し、第１のリンカーを開裂することと、
ライブラリーのメンバーがそれぞれの固体支持体から遊離されるように、第２のリンカーを開裂することと、
を含む方法によって、生成され得る。

上述のように、第１及び第２のリンカーは、直交的に開裂可能であり得る。

自己精製反応（すなわち、開裂基とリンカーとの反応）の例を図１０～１２に例示する。図１０～１２では、化学部分に結合した第２のリンカーを有する固体支持体化合物を使用した自己精製が例示されている。

第１のリンカーの開裂は、不完全または部分的な化学部分を有する化合物またはメンバーの固体支持体からの遊離をもたらし得る。これらの化合物またはメンバーは、例えば洗浄によって除去され得る。第２のリンカーの開裂は、完全な化学部分を有する化合物またはメンバーの固体支持体からの遊離をもたらし得る。遊離された化合物またはメンバーは、それぞれ第１及び／または第２のリンカーの開裂によって形成される第１及び／または第２の開裂部分（環化エレメントとも呼ばれる）を含み得る。第１及び／または第２のリンカー（すなわち、開裂されたリンカー）の全部または一部は、固体支持体に結合したままであり得る。

いくつかの好ましい実施形態において、核酸コード化学ライブラリーは、連続する分割及びプールステップによって合成され得、各ステップは、コーディングオリゴヌクレオチドの組み込みに先立って、続いて、またはそれと同時に、化学的ビルディングブロックの化学部分への組み込みを含む。

個々の核酸コード化合物またはライブラリーメンバーは、最初に固体支持化合物を調製することを含む方法によって合成され得る。

いくつかの実施形態では、固体支持体化合物は、リンカーを介して足場を固体支持体に結合させ、コーディング核酸部分を足場に結合させ、化学部分を足場に結合させ、開裂基を化学部分、足場、または核酸部分に結合させることによって調製される。固体支持体化合物の調製に続いて、リンカーが開裂され、核酸コード化合物またはライブラリーメンバーが固体支持体から遊離されるように、開裂基をリンカーと反応させる。例えば、核酸コード化合物またはライブラリーメンバーは、本明細書に記載のように、以下のステップ；
リンカーによって固体支持体に接続された足場を含む新生化合物を提供することと、
１つ以上の化学ビルディングブロックを新生化合物に共有結合させて、足場に結合した化学部分を形成することと、
１つ以上の化学ビルディングブロックをコードするコーディングオリゴヌクレオチドを新生化合物に共有結合させて、コーディング核酸部分を形成することと、
開裂基を、化学部分、核酸部分、または足場に結合することと、
リンカーが開裂され、自己精製化合物またはライブラリーメンバーが固体支持体から遊離されるように、リンカーと開裂基とを反応させることと、を含む方法によって、生成され得る。

他の実施形態では、固体支持体化合物は、第１のリンカーを介して足場を固体支持体に結合させ、コーディング核酸部分を足場に結合させ、化学部分を足場に結合させ、第２のリンカーを化学部分に結合させて化学部分を固体支持体に接続することによって調製される。固体支持体化合物の調製に続いて、第１リンカーが開裂され、次いで第２リンカーが開裂され、核酸コード化合物またはライブラリーメンバーが固体支持体から遊離される。例えば、核酸コード化合物またはライブラリーメンバーは、本明細書に記載のように、以下のステップ；
第１のリンカーによって固体支持体に接続された足場を含む新生化合物を提供することと、
１つ以上の化学ビルディングブロックを新生化合物に共有結合させて、足場に結合した化学部分を形成することと、
１つ以上の化学ビルディングブロックをコードするコーディングオリゴヌクレオチドを新生化合物に共有結合させて、コーディング核酸部分を形成することと、
化学部分を第２のリンカーで固体支持体に接続することと、
第１のリンカーを開裂することと、
第２のリンカーが開裂され、自己精製された化合物またはライブラリーメンバーが固体支持体から遊離されるように、第２のリンカーを開裂することと、
を含む方法によって生成され得る。

第１の化学ビルディングブロックは、足場への第１のコーディングオリゴヌクレオチドの結合の前、後、または結合と同時に、足場に結合され得る。

固体支持体化合物は、例えば、最初にリンカーを固体支持体に結合させ、続いて足場を固体支持体上のリンカーに結合させることによって；または、最初に足場をリンカーに結合させて、リンカー－足場コンジュゲートを形成し、続いてリンカー－足場コンジュゲートを固体支持体に結合させることによって、調製され得る。

コーディング核酸部分またはコーディング核酸部分の断片は、固体支持体への足場の結合の前、後、または結合と同時に、足場に結合され得る。

化学ビルディングブロックなどの化学部分または化学部分の断片は、固体支持体への足場の結合の前、後、または結合と同時に、足場に結合され得る。

足場は、化学部分を形成する化学ビルディングブロックが結合する化学部分である。いくつかの実施形態では、好ましくは、同じ化学部分がライブラリーのすべてのメンバーの足場を形成する。足場は、固体支持体、核酸部分、及び化学部分を接続する少なくとも三官能性の化学部分であり得る。

足場は、捕捉基を含み得る。捕捉基は、化学ビルディングブロックと反応して、化学ビルディングブロックを足場に連結する共有結合を形成し得る反応性化学基である。これにより、化学部分を形成する化学ビルディングブロックを足場に結合することが可能になる。

開裂基は、事前の開裂基活性化の有無にかかわらず、リンカーを開裂し得る化学試薬または酵素である。自己精製された化合物またはメンバーを提供するために、いくつかの実施形態では、開裂基は、化学部分、核酸部分、または足場に共有結合または非共有結合のいずれかで連結され得る。開裂基は、組み込み後に活性化する必要がある場合がある。化合物またはメンバーは、開裂基によるリンカーの開裂による固体支持体からの選択的遊離によって精製され得る。

いくつかの実施形態では、開裂基は足場に結合され得る。完全な足場及び開裂基を有する化合物またはライブラリーメンバーは、開裂基によるリンカーの開裂を介して固体支持体から選択的に遊離され得る。

他の実施形態では、開裂基は、化学部分に結合されてもよい。完全な足場、化学部分、及び開裂基を有する化合物またはライブラリーメンバーは、開裂基によるリンカーの開裂を介して固体支持体から選択的に遊離され得る。

他の実施形態において、開裂基は、核酸部分、好ましくは核酸部分の末端に結合され得る。完全な足場、核酸部分及び開裂基を有する化合物またはライブラリーメンバーは、開裂基によるリンカーの開裂を介して固体支持体から選択的に遊離され得る。

他の実施形態では、足場は、２つの異なるリンカー（第１及び第２のリンカー）によって固体支持体に接続され得、２つの異なる開裂基（第１のリンカーを開裂する第１の開裂基及び第２のリンカーを開裂する第２の開裂基）が固体支持体化合物中に存在し得る。開裂基の一方を化学部分または足場に結合させ、他方の開裂基を核酸部分に結合させてもよい。例えば、本方法は、さらに；
第１の開裂基を化学部分または足場に結合することと、
第２の開裂基を核酸部分に結合することと、
第１のリンカーが開裂されるように、第１のリンカーと第１の開裂基とを反応させることと、
第２のリンカーが開裂され、化合物またはメンバーが固体支持体から遊離されるように、第２のリンカーと第２の開裂基とを反応させることと、を含んでもよい。例えば、第１のリンカーは、置換キノキサリン基を含むかまたはそれからなってもよく、第１の開裂基は、オルトジチオフェノールを含むかまたはそれからなってもよい；第２のリンカーは、アミノ（メチル）アニリン（ＭｅＤｂｚ）基を含むか、またはそれからなってもよく、第２の開裂基は、チオール開裂基を含むか、またはそれからなってもよい。

固体支持体からの選択的遊離は、完全な化学部分及び完全な足場の両方、完全なコーディング核酸部分及び完全な足場の両方、またはより好ましくは完全な化学部分及び完全な核酸部分の両方の存在によって開始され得る。

２つの異なるリンカーと２つの異なる開裂基を使用して調製された化合物またはメンバーの選択的遊離の例を図４に示す。図４では、第１の開裂基（ＣＧ１）は、化学部分に結合され、第２の開裂基（ＣＧ２）は核酸部分に結合されている。２つの異なるリンカーが足場を固体支持体に接続する。ＣＧ１は、リンカー１とのみ反応し得るが、一方で、ＣＧ２はリンカー２とのみ反応し得る。ＣＧ１とリンカー１との反応は、ＣＧ２とリンカー２との反応前、反応中、または反応後に起こり得る。両方のリンカーが開裂された場合にのみ、化合物が固体支持体から遊離される。図４に示す例では、ＣＧ１とリンカー１との反応は環化反応であり、その結果、化学部分及び足場に接続される第１の開裂部分（すなわち、ＣＧ１／リンカー１反応生成物）が形成される。ＣＧ２は、リンカー２と反応して、核酸部分に結合した第２の開裂部分（すなわち、ＣＧ２反応生成物）を生成する。

いくつかの実施形態では、化合物またはメンバーは、化学部分の化学ビルディングブロックの完全な鎖と、化学部分のすべての化学ビルディングブロックのコーディングオリゴヌクレオチドを含む完全な核酸分子との両方を含む場合にのみ、固体支持体から遊離され得る。

いくつかの実施形態では、開裂基は、化学的部分または足場に非共有結合され得る。好ましくは、開裂基は、化学部分中の末端化学ビルディングブロックに共有結合され得る（すなわち、化学部分を形成する化学ビルディングブロックの鎖の遊離端において）。これにより、化学部分全体を構成するメンバーまたは化合物の自己精製が可能になる。

他の実施形態では、開裂基は、２つのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションによって、化学部分または足場に非共有結合され得る。アンカーオリゴヌクレオチドは、化学部分または足場、好ましくは化学部分の末端化学ビルディングブロックに共有結合され得る。次いで、開裂基に共有結合している補助オリゴヌクレオチドを、アンカーオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせてもよい。これにより、開裂基が化学部分または足場に非共有結合する。次いで、開裂基はリンカーと反応してリンカーを開裂し、固体支持体からメンバーまたは化合物を遊離し得る。例えば、開裂基は、化学部分または足場に対して、以下；
アンカーオリゴヌクレオチドを化学部分または足場に結合させることと、
開裂基に共有結合した補助オリゴヌクレオチドを提供することと、
補助オリゴヌクレオチドをアンカーオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせることと、
リンカーが開裂されるように、リンカーと開裂基を反応させることと、を含む方法によって、結合され得る。

いくつかの実施形態では、化学部分または足場に結合されたアンカーオリゴヌクレオチドは、それぞれ化学部分または足場上で連続的に合成され得る。アンカーオリゴヌクレオチドは、ペプチド核酸などの核酸類似体であってもよい。ペプチド核酸は、例えば、足場または化学部分で連続的に合成され得る。

好ましくは、アンカーオリゴヌクレオチドは、化学部分の末端化学ビルディングブロックに共有結合され得る。

開裂基に共有結合した補助オリゴヌクレオチドは、アンカーオリゴヌクレオチドに特異的にハイブリダイゼーションし得る一本鎖ポリヌクレオチドであってもよい。好ましくは、開裂基に共有結合した補助オリゴヌクレオチドは、１０以上の塩基対を含む。

いくつかの実施形態では、開裂基は、核酸部分、例えば核酸部分の遊離端に共有結合され得る。

いくつかの好ましい実施形態において、開裂基は、固体支持体化合物中のコーディング核酸部分への開裂基に共有結合した補助オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションによって、コーディング核酸部分に連結され得る。例えば、開裂基は、コーディング核酸部分に対して、以下：
開裂基に共有結合した補助オリゴヌクレオチドを提供することと、
開裂基に共有結合したオリゴヌクレオチドをコーディング核酸部分にハイブリダイズさせることと、
リンカーが開裂されるように、リンカーと開裂基とを反応させることと、を含む方法によって結合され得る。

好ましくは、補助オリゴヌクレオチドは、コード核酸の末端部分（すなわち、足場から最も離れた、または遠位にある核酸の領域、セグメントまたは部分）にハイブリダイズする。これにより、核酸部分全体を含むメンバーまたは化合物の自己精製が可能になる。

補助オリゴヌクレオチドは、コーディング核酸部分に特異的にハイブリダイゼーションできる一本鎖ポリヌクレオチドであってもよい。好ましくは、開裂基に共有結合した補助オリゴヌクレオチドは、１０以上の塩基対を含む。好ましくは、開裂基に共有結合した補助オリゴヌクレオチドは、コーディング核酸部分の末端領域、例えばコーディング核酸部分の遊離端の１０塩基、２０塩基または３０塩基以内にハイブリダイズする。

本明細書に記載のコーディング、結合、アンカー及び補助オリゴヌクレオチド、ならびにコーディング核酸部分は、独立して、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの天然核酸、または核酸類似体、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）、ホスホロチオエートオリゴマー（ＰＴＯ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）またはトレオース核酸（ＴＮＡ）であってもよい。補助オリゴヌクレオチドは、任意の便利な化学によって開裂基に結合され得る。

他の実施形態では、足場は、第１のリンカーによって固体支持体に接続され得、化学部分は、第２のリンカーによって固体支持体に接続され得る。第１及び第２のリンカーは直交的に開裂可能である、すなわち、第１のリンカーは第１の反応条件下で開裂され、第２のリンカーは第２の反応条件下で開裂される。例えば、本方法は、さらに；
第１のリンカーが開裂されるように、固体支持体化合物を第１の反応条件に曝露または供することと、
第２のリンカーが開裂され、化合物またはメンバーが固体支持体から遊離されるように、固体支持体化合物を第２の反応条件に曝露または供することと、を含んでもよい。

適切な第１及び第２のリンカーは、本明細書の別の場所に記載されている。

捕捉基、結合基、及び開裂基などの反応基は、その反応基が反応する必要のない１つ以上のステップの間に保護され得る。反応基は、保護基に共有結合することによって好都合に保護され得る。反応基の反応が必要なステップの前に保護基を除去することにより、反応基を脱保護してもよい。

保護基とは、捕捉基、結合基、開裂基、または他の反応基の反応が必要ではない、１つ以上のステップ中の望ましくない反応に対して、捕捉基、結合基、開裂基、または本明細書に記載の他の反応基を可逆的に保護する化学基である。一般的に使用されている保護基は、Ｇｒｅｅｎｅの「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」，４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００７）で開示されている。適切な保護基の例としては、エステル基（例えば、（メトキシエチル）エステル、イソバレリルエステル、及び－レブリニルエステル）、トリチル基（例えば、ジメトキシトリチル及びモノメトキシトリチル）、キサンテニル基（例えば、９－２０フェニルキサンテン－９－イル及び９－（ｐ－メトキシフェニル）キサンテン－９－イル）、アシル基（例えば、フェノキシアセチル、及びアセチル）、シリル基（例えば、ｔ－ブチルジメチルシリル）、２－ニトロベンジル、アリルオキシカルボニル－アミノメチル、Ａｌｌｏｃａｍ ｏＮｖ、ｔｅｒｔ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチルスルフェニル（ＳｔＢｕ）基、スルホネート基９－フルオレニルメチル基、９－フルオレニルメトキシカルボニル基、または分子内ジスルフィドが挙げられる。

例えば、足場の捕捉基は、例えば、保護基への共有結合によって保護され得る。捕捉基は、例えば保護基を除去することにより、第１の化学ビルディングブロックとの反応前に脱保護され得る。

保護基は、任意の便利な方法で追加及び削除され得る。適切な技術は、当該技術分野で十分に確立されている。いくつかの実施形態では、保護基は、核酸に適合する化学反応、またはより一般的には、コードシステムに適合する反応によって付加及び除去され得る。他の実施形態において、保護基は、酵素変換によって付加または除去され得る。例えば、酵素触媒反応を使用して、新生メンバーの結合基を保護しても、または脱保護してもよい。

好ましくは、化学部分は、化学ビルディングブロックを新生メンバーに連続的に加えて、足場に近位端で結合する化学ビルディングブロックの直線配列（すなわち、鎖）を生成することによって生成される。鎖中の化学ビルディングブロックは、それが結合しているメンバーによって表示される化学部分を形成し得る。例えば、第１の化学ビルディングブロックは、足場の捕捉基に共有結合され得る。第２の化学ビルディングブロックを第１の化学ビルディングブロックに結合させて、２つの化学ビルディングブロックからなる直鎖配列または鎖を形成してもよい。化学ビルディングブロックの鎖は、足場に結合した近位端及び遊離している遠位端を有してもよい。第１の化学ビルディングブロックは近位端位置にあってもよく、第２の化学ビルディングブロックは遠位端位置にあってもよい（すなわち、第２の化学ビルディングブロックは鎖の末端または末端の化学ビルディングブロックである）。鎖は、例えば、末端位置での化学ビルディングブロックとの反応により、さらなる化学ビルディングブロックを鎖の遠位端に連続的に結合させることによって延長され得る。化学ビルディングブロックの鎖の完成に続いて、開裂基は、例えば遠位端での化学ビルディングブロック（末端化学ビルディングブロック）との反応によって、完全な鎖の遠位端に結合され得る。

化学ビルディングブロックとは、ライブラリーメンバーによって表示される化学部分の構造単位を形成する化学基である。化学ビルディングブロックは、１つ、２つ、またはそれ以上の結合基を含む任意の化学基であり得る。化学ビルディングブロックが化学ビルディングブロックの鎖に組み込まれる場合、この化学ビルディングブロックは、２つ以上の結合基を含む任意の化学基であり得る。

好ましくは、化学ビルディングブロックは、足場または他の化学ビルディングブロックへの共有結合を可能にする２つ以上の結合基を含み得る。２つ以上の結合基は、異なるまたは直交する反応性を示し得る。例えば、化学ビルディングブロックは、近位結合基及び遠位結合基（例えば、二官能性ビルディングブロック）を含み得る。例えば、化学ビルディングブロックは、近位結合基を介して新生メンバーに共有結合され得る。化学ビルディングブロックの遠位結合基は、保護されるか、及び／またはさらなる化学ビルディングブロックを新生メンバーに結合するために使用され得る。各結合基は、別の化学ビルディングブロックからの結合基と反応し得る反応性官能基であり得る。２つの異なるビルディングブロックの近位結合基と遠位結合基；またはビルディングブロック上の結合基と足場の捕捉基は相補的であるべきであり、すなわち、互いに反応して共有結合を形成し得るべきである。コードシステム、固体支持体、及びリンカーの完全性に適合する任意の反応を使用し得る。いくつかの実施形態では、任意の適切なＤＮＡ適合化学、例えば、アミド化、薗頭カップリング、鈴木カップリング、または銅（Ｉ）触媒アジドアルキン付加環化（ＣｕＡＡＣ）または他のクリック反応を使用してもよい。例えば、第１及び第２の結合基の一方がカルボキシル基であり、他方がアミン基であってもよい。

適切な結合基には、カルボン酸、アルキン、ハロゲン化アリール、ハロゲン化アルキル、アルデヒド、ケトン、ニトリル、ハロゲン化スルホニル、チオール、アルコール、アセチレン、第１級アミン、第２級アミン、アジド、アミジン、ジアミン、エポキシド、イソシアネート、スルホンアミド、及びボロン酸が挙げられる。２つ以上の結合基を含む適切な化学ビルディングブロックとしては、非天然アミノ酸、Ｄ－アミノ酸、Ｎ－アルキル化アミノ酸、及び酸アルキンが挙げられる。

いくつかの実施形態では、化学ビルディングブロックは、化学ビルディングブロックの鎖内の異なる化学ビルディングブロック間の架橋を可能にする追加の結合基を含み、例えば、大環状、二環式または多環状化学物質を生成し得る。例えば、三官能性ビルディングブロックは、アルキン、アジド、アミン、カルボン酸、チオール、アルコール、またはハロゲン化アルキルなどの官能基を有する側鎖を有するアミノ酸であり得る。いくつかの実施形態では、化学ビルディングブロックは、ＣｕＡＡＣ反応または他のクリック反応を使用して、例えば、アルキン結合基を含む化学ビルディングブロックとアジド結合基を含む化学ビルディングブロックとの間で架橋され得る。

いくつかの好ましい実施形態では、化学ビルディングブロックは、複数回の試薬添加及び洗浄を使用する反応において、新生メンバーまたは化合物に共有結合され得る。例えば、反応混合物を除去するために固体支持体を洗浄してもよく、例えば新鮮な溶媒及び試薬を含む新しい反応混合物を加えてもよい。これは、例えば、化学ビルディングブロックと新生メンバーの反応を完了に向けて推進すること、化学ビルディングブロックの取り込みを増やすこと、ならびに未反応の化学ビルディングブロック及び新生メンバーの割合を減らすことに有用であり得る。複数回の反応により、Ｎ－メチル化アミノ酸など、通常は反応収率が低い化学ビルディングブロックの組み込みが可能になり得る。

化学ビルディングブロックは、その近位結合基を介して新生メンバーに共有結合され得る。化学ビルディングブロックの遠位結合基を使用して、後続のステップでさらなる化学ビルディングブロックまたは開裂基を鎖の末端に結合してもよい。化学ビルディングブロックの近位結合基と新生メンバーとの反応の間、化学ビルディングブロックの遠位結合基は、例えば保護基への共有結合によって保護され得る。例えば、化学ビルディングブロック鎖における次の化学ビルディングブロックの順次付加の前に、例えば保護基を除去することにより、遠位結合基を脱保護してもよい。

各化学ビルディングブロック組み込みステップの後、化学ビルディングブロックの組み込みに失敗した新生メンバーの分子種（ すなわち、未反応メンバー）をキャッピングしてもよい。例えば、開裂基が未反応の捕捉基または遠位結合基に結合するのを防止するために、キャッピング基は、第１の化学ビルディングブロックの組み込み後に未反応の捕捉基に、及びさらなる化学ビルディングブロックの組み込み後に未反応の遠位結合基に共有結合され得る。

キャッピング基とは、本明細書に記載の捕捉基または遠位結合基などの反応基を不可逆的にキャッピングし、それがさらなる化学反応に関与するのを防止する化学基である。キャッピング基は、本明細書に記載の方法の１つのステップからの未反応種が、本方法の後続のステップで反応するのを止めるために、本明細書に記載の方法で使用される。特に、キャッピング基は、開裂基が中間種に結合するのを防ぐ。例えば、化学ビルディングブロックの鎖において、完全な鎖の末端にある化学ビルディングブロックの遠位結合基は、キャップされていないままであり、開裂基と反応するのに利用可能である。これにより、開裂基を化学ビルディングブロックの完全な鎖の末端に選択的に結合させることが可能になる。

適切なキャッピング試薬には、アミンをキャッピングするための、無水酢酸などの単官能性カルボン酸誘導体反応性基；アルキン反応性基をキャッピングするためのアジド；及びカルボン酸反応性基をキャッピングするための単官能性アミン、が含まれ得る。

いくつかの実施形態では、キャッピングは必要ない場合がある。例えば、いくつかの実施形態では、化学ビルディングブロック（例えば、ビルディングブロック１）の遠位結合基は、官能基の性質に起因して、後続のビルディングブロック（例えば、ビルディングブロック２）と反応するためにのみ使用され得る。その後のビルディングブロック（例えば、ビルディングブロック３、ビルディングブロック４など）は、最後から２番目のビルディングブロック（例えば、ビルディングブロック１）への結合に適合する官能基を含まなくてもよい。したがって、中間ビルディングブロック（例えば、ビルディングブロック２）を組み込むことができなかった化合物は、さらなるビルディングブロックを組み込むことができない。これにより、キャッピングと同様の効果が達成され得る。

本明細書に記載の方法は、異なる化学部分を示す多様なメンバーを含むライブラリーを生成するために、化学ビルディングブロックの異なる組み合わせを使用して１回以上繰り返され得る。例えば、化学ビルディングブロックの数、同一性及び／または順序は、ライブラリーの異なるメンバーの化学部分において異なってもよい。

化学ビルディングブロック及びコーディングオリゴヌクレオチドは、本明細書に記載のように、分割及びプール手順によって新生ライブラリーメンバーに便利に追加され得る。あるいは、各ライブラリーメンバーの並列合成はまた、十分に小さいライブラリーに対しても可能である。

核酸コード化学ライブラリー合成のための分割及びプール手順は、以下のステップ；
新生メンバーまたは核酸コードライブラリー中間体を別々のコンパートメントに分割することと、
１つ以上の化学ビルディングブロックを結合することと、
化学ビルディングブロックをコードする１つ以上のコーディングオリゴヌクレオチドを結合することと、
部材または中間体を別々のコンパートメントから１つ以上のコンパートメントにプールすることと、を含み得る。

この手順は、１回以上繰り返してもよい。

好ましくは、新生メンバーに追加された化学ビルディングブロックは、近位端で足場に結合した化学ビルディングブロックの直鎖を形成する。化学ビルディングブロックの完全な鎖を含む化合物及びメンバーは、本明細書に記載の自己精製法によって精製され得る。化学ビルディングブロックの鎖は、化学部分の自己精製を最大限に行うのに最適である。化学ビルディングブロックが化学ビルディングブロックの鎖に組み込まれるためには、それらは少なくとも二官能性でなければならない（すなわち、少なくとも２つの結合基を含む）。化学ビルディングブロックの近位及び遠位の結合基は、異なる反応性または直交する反応性を示す場合がある。ビルディングブロックが直線状に配置された固体支持化合物の例を図５Ａに示す。

他の実施形態では、新生メンバーに付加された化学ビルディングブロックは、足場に結合した分岐構造を形成し得る。足場は、少なくとも四官能性（すなわち、２つ以上の捕捉基を含み得る）であってもよく、または１つ以上の化学ビルディングブロックが少なくとも三官能性であってもよく、分岐構造を形成するための２つ以上の追加の化学ビルディングブロックの結合点が可能になる。

他の実施形態では、新生メンバーに追加された化学ビルディングブロックは、足場に結合した環状または大環状構造を形成し得る。これは、化学部分内の別の化学ビルディングブロックとの、または足場との化学ビルディングブロックの架橋を必要とする場合がある。この環状構造は大環状であってもよい。化学ビルディングブロックと他の化学ビルディングブロックまたは足場とのさらなる架橋は、足場に結合した化学ビルディングブロックによって形成された二環式、大環状または多環式構造を有する化学部分を生じ得る。追加のビルディングブロックである化学ビルディングブロック４を使用して、化学ビルディングブロック１と化学ビルディングブロック３を架橋することによって形成されるビルディングブロックの環状及び分岐配置を有する固体支持化合物の例を図５Ｂに示す。

キャッピングステップは、メンバーまたは固体支持体化合物の合成における合成ステップの後に行ってもよい。好ましくは、キャッピングステップは、各化学ビルディングブロック及び任意選択で各コーディングオリゴヌクレオチドの添加後に実施され得る。化学キャッピングステップは、単官能性部分との反応、またはオリゴヌクレオチドなどの非伸長性核酸分子とのライゲーションを含んでもよい。官能化された固体支持体、リンカー、足場、化学ビルディングブロック、化学部分、開裂基、及びコーディング核酸部分をキャップしてもよい。キャッピングステップは、結合基または捕捉基などの未反応の官能基をキャッピング試薬と反応させて、未反応のキャッピング基を形成することを含んでもよい。適切なキャッピング試薬には、活性化カルボン酸誘導体が含まれる。

固体支持体からの完全な化合物またはメンバーの選択的遊離の例を図８に示す。図８の下部のパネルには、化学部分でキャップされた化合物は、不完全に合成され、キャップされ、したがって開裂基を含まないので、固体支持体から放出されない。

コーディング核酸部分は、直前のコーディングオリゴヌクレオチドとのみ適合し、核酸部分に以前に付加された他のコーディングオリゴヌクレオチドにライゲーションできない末端を有するコーディングオリゴヌクレオチドの使用によってキャップされ得る。コーディング核酸部分の「キャッピング」の例を図９に示す。所望の核酸コード、コード１及びコード２のすべてを含む固体支持体化合物を、さらなるコード、コード３にライゲーションしてもよい。コード１は、コード２にのみライゲーションし得、コード２は、コード３にのみライゲーションし得る。コード１は、コード３とライゲーションし得ない。これは、これらのコードにはライゲーションに適した配列が含まれていない場合があるためである。したがって、この例ではコード１のみを含み、コード２を含まない、不完全に合成された固体支持体化合物は、さらなるコード、この例ではコード３にライゲーションされない場合がある。

本明細書に記載のメンバーまたは化合物の調製は、コードシステム及び固体支持体と適合する任意の反応、ならびにリンカーの完全性を含み得る。いくつかの実施形態では、可能な反応は、ＤＮＡ適合性反応を含み得る。考えられる反応には、アミド結合形成、鈴木カップリング、薗頭カップリング、還元的アミノ化、及び銅触媒によるアルキン－アジド付加環化が含まれ得る。ＤＮＡ適合性反応は、文献、例としては（Ｍａｌｏｎｅ，Ｍ．Ｌ，Ｐａｅｇｅｌ，Ｂ．Ｍ．，ＡＣＳ Ｃｏｍｂ．Ｓｃｉ．２０１６，１８（４），１８２－１８７）に記載される。

いくつかの実施形態において、大環状化反応は、開裂基とリンカーとの反応、第２のリンカーの導入、固体支持体化合物中の他の化学物質の架橋、または固体支持体からの遊離後の溶液中でのさらなる変換中に使用され得る。例えば、いくつかの実施形態では、第２のリンカーを最初に固体支持体に結合させ、次いで大環状化反応において化学部分に接続させてもよい。大環状化反応は、好ましくは、例えば、銅触媒によるアジド－アルキン環化反応など、高収率を示す反応を含み得る。大環状化反応は当該技術分野で公知であり、（Ｗａｎｇ，Ｗ．，Ｋｈｏｊａｓｔｅｈ，Ｓ．Ｃ．＆ Ｓｕ，Ｄ．，Ｍｏｌ．（２０２１）；Ｚｈａｎｇ，Ｒ．Ｙ．，Ｔｈａｐａ，Ｐ．，Ｅｓｐｉｒｉｔｕ，Ｍ．Ｊ．，Ｍｅｎｏｎ，Ｖ．＆ Ｂｉｎｇｈａｍ，Ｊ．Ｐ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（２０１８））に記載の反応を含み得る。

メンバーまたは化合物は、調製中及び調製後にさらに変換されてもよい。例えば、方法は以下を含んでもよい；
例えば、環状または多環状のメンバーまたは化合物を生成するために、２つ以上の化学ビルディングブロック、足場、または開裂基の間を架橋することと、
１つ以上のさらなる化学ビルディングブロックの組み込み、及び／または
１つ以上の化学ビルディングブロック、または足場、リンカー、または開裂基の修飾または変換。

メンバーまたは化合物は、新しい固体支持体上に再捕捉され得る。

いくつかの実施形態では、共有結合形成は、核酸鋳型反応によって媒介され得る。

いくつかの実施形態では、酵素などの変換を媒介し得る高分子を、自己精製化合物の調製中または調製後に使用してもよい。例えば、酵素は、核酸鋳型反応によって動員され得る。

核酸コードライブラリーのメンバーは、核酸部分を含む。

コーディング核酸部分は、一本鎖もしくは二本鎖核酸、または一本鎖及び二本鎖核酸の組み合わせからなり得る。いくつかの実施形態では、足場に連結され得るのは核酸鎖１つだけである。他の実施形態では、二本鎖コーディング核酸部分の両方の核酸鎖を足場に連結してもよい。

足場、化学部分、及び／または開裂基は、核酸部分の１つ以上の核酸鎖中のコード配列によってコードされ得る。コード配列を組み込むためのコーディング核酸部分の伸長は、コーディングオリゴヌクレオチドの酵素的ライゲーション；コーディングオリゴヌクレオチドの化学的ライゲーション；ポリメラーゼ酵素を使用したコーディングオリゴヌクレオチドテンプレート全体の伸長；またはこれら３つの方法のいずれかの組み合わせによって行ってもよい。

足場、化学部分、または開裂基を生成または変換する合成ステップの前または後に、核酸部分へのコーディングオリゴヌクレオチドの付加を行ってもよい。コード配列は、１つの核酸鎖のみに存在してもよいし、２つの核酸鎖に存在してもよい。１本の核酸鎖上のコード配列は、例えばＰＣＲによって好都合に増幅され得る。コード配列は、１つまたは２つの核酸鎖上にあってもよく、ＰＣＲ増幅可能な１つの核酸鎖上に転写されてもよい。コード配列は、足場、１つ以上のビルディングブロック、開裂基、１つ以上のリンカー、またはそれらの組み合わせをコードし得る。

足場、化学部分、または開裂基を生成、伸長または変換する合成ステップの前または後に、コーディング核酸部分へのコーディング配列の付加を行ってもよい。

いくつかの実施形態では、化学ビルディングブロックのみがコードされ得る。他の実施形態では、足場、リンカー、開裂基、または他の実体もコードされ得る。コードされる化学ビルディングブロックを以下に記載するが、下に記載する化学ビルディングブロックがコードされるのと同じ方法で、他の実体もまたコードされ得ることが理解されるべきである。

好ましくは、核酸コードライブラリーのメンバーは、メンバーに結合された化学部分中のすべての化学ビルディングブロックをコードするコーディング核酸部分を含む。メンバーに結合したコーディング核酸部分の配列決定により、メンバーによって表示される化学部分中の化学ビルディングブロックの同定が可能になる。

新生メンバーまたは化合物は、結合オリゴヌクレオチド（ヘッドピースとも呼ばれる）を含んでもよい。いくつかの好ましい実施形態では、結合オリゴヌクレオチドは、新生メンバーの足場に結合している。

結合オリゴヌクレオチドは、核酸部分を形成するために、化学ビルディングブロックをコードするコーディングオリゴヌクレオチドが結合される核酸である。結合オリゴヌクレオチドは、ライブラリーの異なるメンバーにおいて同じヌクレオチド配列を有してもよい（すなわち、定常ヌクレオチド配列）。コーディングオリゴヌクレオチドの組み合わせ、したがってコーディング核酸部分の配列は、ライブラリーの異なるメンバーで異なる場合がある。

結合オリゴヌクレオチドは、新生結合メンバーに結合する末端と、コーディングオリゴヌクレオチドが結合する遊離端とを有し得る。結合オリゴヌクレオチドの遊離端は、コーディングオリゴヌクレオチドの結合に適合し得る。例えば、遊離端は、ライゲーションを容易にするために、短い５’または３’オーバーハング（「粘着末端」）を含み得る。

結合オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡもしくはＲＮＡなどの天然の核酸であってもよく、または核酸類似体、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）、ホスホロチオエートオリゴマー（ＰＴＯ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）またはトレオース核酸（ＴＮＡ）であってもよい。

第１の化学ビルディングブロックをコードする第１のコーディングオリゴヌクレオチドは、結合オリゴヌクレオチドに結合され得る。オリゴヌクレオチドの結合に適した技術は十分に確立されており、酵素的ライゲーションが含まれる。第２及びさらなる化学ビルディングブロックをコードする後続のコーディングオリゴヌクレオチドは、前のコーディングオリゴヌクレオチドに結合して、メンバーに結合した鎖中の化学ビルディングブロックのコーディングオリゴヌクレオチドを含むコーディング核酸を形成し得る。

いくつかの実施形態では、結合オリゴヌクレオチドは二本鎖であってもよい。

二本鎖結合オリゴヌクレオチドは、単一のヌクレオチド鎖（すなわちヘアピン）の分子内ハイブリダイゼーションから形成されてもよく、または２つの別個のヌクレオチド鎖の分子間ハイブリダイゼーションから形成されてもよい。二本鎖ヌクレオチド配列は、リンカーの開裂前に一本鎖核酸を生成するために変性され得る。第１の遊離されたメンバーの一本鎖核酸と第２の遊離されたメンバーの一本鎖核酸とのハイブリダイゼーションは、例えば、ＥＳＡＣライブラリーのメンバーを生成する際に有用であり得る。あるいは、２本のオリゴヌクレオチド鎖が共有結合している二本鎖結合オリゴヌクレオチドを使用してもよい。

二本鎖コーディングオリゴヌクレオチドは、標準的な技術に従って、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼなどのリガーゼを使用するライゲーションによって、二本鎖結合オリゴヌクレオチドに結合され得る。

他の実施形態では、結合オリゴヌクレオチドは一本鎖であってもよい。一本鎖コーディングオリゴヌクレオチドは、標準的な技術に従って、アダプターオリゴヌクレオチドを使用するスプリントライゲーションによって結合オリゴヌクレオチドに結合され得る。

コーディングオリゴヌクレオチドは、化学ビルディングブロック及び任意選択で開裂基、足場及び／またはリンカーをコードするヌクレオチドコード配列を含む核酸分子である。コード配列（またはコード領域）は、特定の化学ビルディングブロックと独自に関連する核酸塩基の任意の配列であり得る。これにより、化学部分の同一性を、コード配列の配列決定またはそうでなければ「読み取り」によって決定することが可能になる。

コード配列には、それがコードしている化学ビルディングブロックを一意的に識別するのに十分なヌクレオチドが含まれている。例えば、化学部分に２０のバリアントがある場合、コーディング配列には少なくとも３つのヌクレオチドが含まれている必要がある（４^２＝１６、４^３＝６４）。コード配列は、必要以上に長い場合がある。必要以上に長いコード配列を使用する利点は、単一のヌクレオチドの違い以上にコードを区別する機会が得られることであり、これにより解読プロセスの信頼性が高まる。例えば、２０の異なる化学ビルディングブロック（２０の化合物）の集団由来の第１の化学ビルディングブロックは、６ヌクレオチドによってコードされ得、２００の異なる部分の集団からの第２の化学ビルディングブロックは、８ヌクレオチドによってコードされ得る。したがって、コード配列のサイズは、コードされる化学ビルディングブロックの数（すなわち、ライブラリー内の異なる化学ビルディングブロックの数）に依存する。ヌクレオチドの配列及び／またはその相補体をコード配列として使用して、化学ビルディングブロックをコードし得る。ライブラリー内の化学ビルディングブロックをコードするための適切な配列は、当該技術分野で周知である。

コーディングオリゴヌクレオチドのコード配列は、定常領域に隣接していてもよい。定常領域は、効率的なハイブリダイゼーション及びライゲーションを可能にするのに十分な長さ、例えば２～２０塩基、好ましくは９～１５塩基であってもよい。

コーディングオリゴヌクレオチドは、ビルディングブロックの組み込みと同時に、メンバーまたは化合物に連続的に付加され、メンバーまたは化合物に存在する、化学ビルディングブロックの組み合わせをコードする一連のコーディングオリゴヌクレオチドを含む核酸分子（すなわち、核酸部分）をもたらす。第１の化学ビルディングブロックをコードする第１のコーディングオリゴヌクレオチドは、結合オリゴヌクレオチドに連結され得、さらなるコーディングオリゴヌクレオチドはそれぞれ、一連の先行するコーディングオリゴヌクレオチドに連結されて、核酸分子（すなわち、核酸部分）を形成し得る。ライブラリーメンバーの核酸部分の配列は、ライブラリーメンバーの化学ビルディングブロックをコードする。したがって、コーディング核酸部分を配列決定することにより、メンバーの化学ビルディングブロックを同定することが可能になる。

第１の化学ビルディングブロック及びコーディングオリゴヌクレオチドは、新生メンバーまたは化合物に対して、以下；
第１の化学ビルディングブロックを新生メンバーまたは化合物の足場に共有結合させることと、
第１の化学ビルディングブロックをコードするコーディングオリゴヌクレオチドを新生メンバーの結合オリゴヌクレオチドに共有結合することと、を含む方法によって結合され得る。

反応後、未反応の種は、さらなる反応を防ぐために洗浄またはキャップによって除去され得る。例えば、この方法は、第１の化学ビルディングブロックに共有結合していない足場をキャッピングすることをさらに含んでもよい。キャッピングの適切な方法は上記に記載されている。

望ましくない反応を防止するために、第１の化学ビルディングブロックを保護してもよい。例えば、第１の化学ビルディングブロックの遠位結合基は、保護基に共有結合されてもよい。第１の化学ビルディングブロックは、その後、例えばコーディングオリゴヌクレオチドの結合後に脱保護され得る。方法は、足場に結合した第１の化学ビルディングブロックの遠位結合基から保護基を除去することを含み得る。これにより、第２の化学ビルディングブロックを付加することが可能になる。

いくつかの実施形態では、第１の化学ビルディングブロックは、新生化合物またはメンバーに対して、以下；
第１の化学ビルディングブロックを新生メンバーの足場に共有結合させることであって、第１の化学ビルディングブロックが、この足場の捕捉基と反応して共有結合及び保護された遠位結合基を形成する近位結合基を含むことと、
第１の化学ビルディングブロックに結合していない未反応の捕捉基をキャッピングすることと、
第１の化学ビルディングブロックをコードする第１のコーディングオリゴヌクレオチドを新生メンバーの結合オリゴヌクレオチドに共有結合してコーディング核酸を形成することと、
第１の化学ビルディングブロックの遠位結合基を脱保護することと、を含む方法によって結合され得る。

遠位結合基の脱保護に続いて、第２の化学ビルディングブロックは、新生メンバーに対して、以下；
第２の化学ビルディングブロックを新生メンバーの第１の化学ビルディングブロックに共有結合させることと、
第２の化学ビルディングブロックをコードするコーディングオリゴヌクレオチドを新生メンバーに共有結合させることと、を含む方法によって結合され得る。

反応後、未反応の種は、さらなる反応を防ぐために洗浄またはキャップによって除去され得る。例えば、この方法は、さらなる化学ビルディングブロックに共有結合していない任意の化学ビルディングブロックの遠位結合基をキャッピングすることをさらに含んでもよい。

望ましくない反応を防止するために、さらなる化学ビルディングブロックを保護してもよい。例えば、さらなる化学ビルディングブロックの遠位結合基は、保護基に共有結合されてもよい。さらなる化学ビルディングブロックは、その後、例えばコーディングオリゴヌクレオチドの結合後に脱保護され得る。方法は、足場に結合したさらなる化学ビルディングブロックの遠位結合基から保護基を除去することを含んでもよい。これにより、追加の化学ビルディングブロックまたは開裂基の結合が可能になる。

いくつかの実施形態では、さらなる化学ビルディングブロックは、新生メンバーに対して、以下；
さらなる化学ビルディングブロックを化学ビルディングブロックの鎖に共有結合させることであって、このさらなる化学ビルディングブロックが近位結合基及び遠位結合基を含み、さらなる化学ビルディングブロックの前記近位結合基が化学ビルディングブロックの遠位結合基と遠位端位置で反応して共有結合を形成して、さらなる化学ビルディングブロックが化学ビルディングブロックの鎖の遠位端に付加されることと、
さらなる化学ビルディングブロックを化学ビルディングブロックの鎖に共有結合させることであって、このさらなる化学ビルディングブロックが、保護された遠位結合基と、その鎖の遠位端で化学ビルディングブロックの遠位結合基と反応して共有結合を形成する近位結合基とを含むことと、
さらなる化学ビルディングブロックに結合していない遠位端で、化学ビルディングブロックの未反応の遠位基をキャッピングすることと、
さらなる化学ビルディングブロックをコードするさらなるコーディングオリゴヌクレオチドをコーディング核酸に共有結合させることと、
さらなる化学ビルディングブロックの遠位結合基を脱保護することと、を含む方法によって結合され得る。

さらなるコーディングオリゴヌクレオチドの共有結合は、遠位結合基の脱保護の前、後、または同時に行ってもよい。

このプロセスを１回以上繰り返して、複数のさらなる化学ビルディングブロックを組み込み、化学部分を生成してもよい。例えば、化学部分は、１、２、３、４、５またはそれ以上の化学ビルディングブロックの鎖を含んでもよい。いくつかの好ましい実施形態では、化学部分は、最大２０個の化学ビルディングブロックを含んでもよい。他の好ましい実施形態では、化学部分は、最大１０個の化学ビルディングブロックを含んでもよい。他の好ましい実施形態では、化学部分は、最大６個の化学ビルディングブロックを含んでもよい。

いくつかの実施形態では、化学ビルディングブロックの鎖の末端の化学ビルディングブロック（すなわち、末端化学ビルディングブロック）は、保護された遠位結合基、例えば、保護基に共有結合された遠位結合基を含んでもよい。方法は、開裂基の結合の前に、化学ビルディングブロックの鎖の末端で化学ビルディングブロックの遠位結合基から保護基を除去することを含み得る。

固体支持体とは、本明細書に記載されているように、産生中に新生メンバーまたは化合物を結合させ得る表面を示す不溶性物体である。適切な支持体の例としては、樹脂、ビーズ、ナノ粒子、及びポリマー類、例えば、ポリスチレン－ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）複合体、ＰＥＧ及びポリ－ε－リジン（ε－ＰＬ）が挙げられる（例えば、Ａｌｂｅｒｉｃｉｏ Ｆ（２０００）を参照のこと）。固相合成：実用ガイド。Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ：ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ）．好都合には、支持体は、ビーズなどの粒子の形態であり得る。いくつかの実施形態では、固体支持体は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）でグラフトされたポリスチレンマトリックスからなるグラフトコポリマーのビーズであり得る。固体支持体は、標準的な技術を使用して生成してもよいし、市販の供給業者（例えば、Ｔｅｎｔａｇｅｌ（登録商標）、Ｒａｐｐ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ ＧｍｂＨ、ＤＥ）から入手してもよい。溶液からの固体支持体上の化合物の分離は、濾過、磁気相互作用（磁気ビーズの場合）、遠心分離などの任意の便利な方法によって達成され得る。

その他の適切な固体支持体としては、ポリスチレンビーズ、架橋ポリスチレンビーズ、ポリマービーズ、ガラスビーズ、コーティングガラスビーズ、制御細孔ガラスビーズ、ビーズ制御細孔ガラスビーズ、シリカ微粒子、コーティングシリカ微粒子、酸化鉄粒子、コーティングされた酸化鉄粒子、ＰＥＧＡ（ポリエチレングリコール－アクリルアミド）樹脂、及び異なるサイズの他の市販もしくはカスタム合成された固体支持体、またはそれらの組み合わせが挙げられる。適切な固体支持体は磁性であってもよい。磁性固体支持体の例としては、Ｍａｇｎｅｆｙ（商標）及びＰｒｏＭａｇ１（登録商標）微小球（Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）が挙げられる。固体支持体の例としては、共重合体、例えば、アクリルアミド－ＰＥＧ共重合体、常磁性または強磁性の材料をさらに含むポリマー粒子、コアシェル粒子、多孔性粒子、非多孔性粒子、または強磁性体の材料と組み合わせた他の有機化学物質が挙げられる。他の適切な固体支持体は、当該技術分野で公知である（例えば、Ｐｏｎ，Ｒ．Ｔ．Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍ．（２０００）；Ｃｈａｕｄｈｕｒｉ，Ｒ．Ｇ．＆ Ｐａｒｉａ，Ｓ．，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．（２０１１）；Ｗｕ，Ｗ．，Ｈｅ，Ｑ．＆ Ｊｉａｎｇ，Ｃ．Ｎａｎｏｓｃａｌｅ Ｒｅｓ．Ｌｅｔｔ．（２００８）；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（２０１３）を参照のこと）。

いくつかの実施形態では、固体支持体上への捕捉のために結合実体を使用してもよい。例えば、固体支持体に結合した化合物を溶液から物理的に分離できるようにするために、小さな有機または無機実体を固体支持体への捕捉に使用してもよい。適切な小さい有機または無機結合実体としては、ビオチン及び磁気量子ドットなどの量子ドットが含まれ得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の核酸コード化合物またはライブラリーの合成における１つ以上のステップは、固体支持体上への捕捉の前または後に溶液中で実施され得る。

いくつかの実施形態において、固体支持体は、線状（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）スペーサー）またはデンドリマー構造（例えば、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマー）によってさらに官能化され得る。デンドリマー及びスペーサーは、（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（２０１３））を含む文献に記載されている。いくつかの実施形態において、固体支持体表面は、小分子によって改変されてもよい。いくつかの実施形態では、例えば、小分子は、固体支持体の一部を第１及び／または第２のリンカーと接続してもよい。

好ましくは、必要に応じて、固体担体粒子の集合を溶液に容易に懸濁して、分割及びプールを可能にし得る。いくつかの実施形態では、多数の別個のメンバーを有するライブラリーの容易な合成のために、小さな固体支持体粒子サイズが好ましい場合がある。例えば、マイクロ粒子またはナノ粒子を使用してもよい。

固体支持体によって、結合メンバーまたは化合物を、本明細書に記載の構築の１つ以上のステップ後に洗浄して、結合していない反応物を除去することが可能になる。自己遊離可能なのは、完全なメンバーのみである。これにより、完全に合成されていないライブラリーメンバーから純粋なライブラリーメンバーを分離することが可能になる場合があり、高純度のＤＥＬの生成が可能になる。いくつかの実施形態では、固体支持体に結合したままの種からの溶液中の遊離されたメンバーの分離によって、完全なメンバーの濃縮または精製が可能になり、高純度のＤＥＬの生成が可能になる。他の実施形態では、溶液中の遊離されたメンバーの分離の後に、固体支持体から不完全に合成された種を遊離するだけの場合もあり、または優先的に遊離する場合もあるステップが続く。その後、固体支持体に結合したままのメンバーを遊離すると、完全なメンバーの濃縮または精製が可能になり、高純度のＤＥＬの生成が可能になる。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のメンバーまたは化合物は、開裂基とリンカーとの反応によって固体支持体から遊離される。求電子開裂基及び求核リンカー、またはより好ましくは求核開裂基及び求電子リンカーを使用してもよい。いくつかの実施形態では、リンカーと開裂基との間の反応は、固体支持体を開裂基で置換する置換反応であってもよい。置換反応は、求核置換反応、例えば求核芳香族置換反応であってもよい。リンカーと開裂基との間の他の適切な反応には、金属触媒反応またはメタセシス反応が含まれてもよい。

いくつかの好ましい実施形態では、リンカー及び開裂基の一方はチオールまたはセレノチオール基であってもよく、他方はカルボニル基であってもよい。この反応により、チオエステル中間体が形成される場合がある。チオエステル中間体はその後、分子間または分子内で開裂される場合があり、ライブラリーメンバーの不可逆的な環化を引き起こす場合がある（図２）。

リンカーは、いくつかの実施形態では、足場を固体支持体に接続し得る開裂可能な化学部分である。リンカーは、足場を固体支持体に直接接続する場合もあるし、または例えばアンカーを介して間接的に接続する場合もある。リンカーは、特定の試薬（例えば、開裂基）または反応条件によって媒介される化学反応によって開裂され得る。

他の実施形態では、第１及び第２のリンカーが存在し得る。第１のリンカーは、足場を固体支持体に共有結合させる開裂可能な化学部分であり得る。第２のリンカーは、化学部分を固体支持体に共有結合させる開裂可能な化学部分であってもよい。第１及び第２のリンカーは直交的に開裂可能であり、すなわち、第１のリンカーは、第２のリンカーを開裂しない、特定の試薬（例えば開裂基）または反応条件によって開裂され得る。

いくつかの実施形態では、リンカーは、開裂基との反応前に固体支持体及び足場に結合した後、さらなる変換または活性化を必要としない場合がある。リンカーは、活性状態で新生メンバーに組み込まれ得る（すなわち、リンカーは、開裂基に反応する形態である）。適切なリンカーとしては、置換キノキサリンまたはその誘導体が含まれ、これらは、さらなる変換または活性化なしに、オルトジチオフェノール開裂基によって開裂され得る。

置換キノキサリンは、１つ以上の置換、例えば２位、３位及び５位または２位、３位及び６位での置換を有するキノキサリン基を含んでもよい。いくつかの実施形態では、置換キノキサリンの２位は、ハロゲン、例えば、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩ、好ましくはＣｌ、または電子求引基であってもよく；３位は、－ＳＲ、－ＯＲ、または－ＮＲであってもよく、５または６位は－ＣＯＯＲ、－ＣＯＮＲ、またはアルキンであってもよい。他の実施形態では、置換キノキサリンの２位は、－ＳＲ、－ＯＲまたは－ＮＲであってもよく；３位は、ハロゲン、例えば、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒもしくはＩ、好ましくはＣｌ、または電子求引基であってもよく、５位または６位は、－ＣＯＯＲまたは－ＣＯＮＲ、またはアルキンであってもよい。Ｒは、水素原子、またはＣ_１－６アルキル基、Ｃ_５－２０ アリール、Ｃ_１－６アルコキシ基、Ｃ_１－６アシルオキシ基、またはＣ_１－６ 逆エステル基から独立して選択され得る；これらのいずれも、直鎖状または分枝状であってもよく、任意選択で置換されていてもよい。適切な置換キノキサリンの例としては、３－クロロ－２－（（２－ヒドロキシエチル）チオ）キノキサリン－６－カルボン酸；３－クロロ－２－（４－（ヒドロキシメチル）フェノキシ）キノキサリン－６－カルボン酸；及びＮ－（３－アミノプロピル）－３－クロロ－２－（４－（ヒドロキシメチル）フェノキシ）キノキサリン－６－カルボキサミドが挙げられ得る。

他の実施形態では、リンカーは、固体支持体及び足場への結合後、開裂基との反応前に活性化を必要とし得る、すなわちリンカーは活性化可能なリンカーであり得る。リンカーは、不活性状態で新生メンバーに組み込まれ得る（すなわち、リンカーは、開裂基に反応しない形態である）。リンカーを活性化すると、非活性化型から活性化型に変換される。リンカーの活性化型は、開裂基によって選択的に開裂されるが、リンカーの非活性化型は開裂基によって開裂されない。例えば、リンカーの不活性型は保護基を含んでもよく、リンカーは保護基の除去によって活性化されてもよい。本明細書に記載の方法は、活性化可能なリンカーを活性化することを含み得る。開裂基が活性化を必要とする実施形態では、リンカーは、開裂基の活性化の前、後、または同時に活性化され得る。

適切な活性化可能なリンカーには、Ｎ－アルキルシステインなどのマスクされたチオエステルが含まれる。マスクされたチオエステルは活性化されて、チオール開裂基によって開裂され得るチオエステルを生成し得る（天然化学ライゲーション）。マスキングされたチオエステル中のチオールは、例えば、ｔｅｒｔ－ブチル基、アリルオキシカルボニルアミノメチル基、２－ニトロベラトリル基、９－フルオレニルメチル基によって、またはＳ－スルホネートとして保護され得る。マスキングされたチオエステルの脱保護後、システイン誘導体は、チオールの脱保護時にＮからＳへの転位を受けて、チオエステルを得てもよい。

他の適切な活性化可能なリンカーには、ジアミノベンゾイル基またはメチルジアミノベンゾイル基などのその誘導体が挙げられる。例えば、活性化可能なリンカーは、アミノ（メチル）アニリン（ＭｅＤｂｚ）であってもよい。ＭｅＤｂｚは、パラ－ニトロフェニルクロロホルメートとの反応によって活性化されて、チオール開裂基によって開裂され得るＮ－アシルＮ’－メチルベンズイミダゾリン（ＭｅＮｂｚ）を生成し得る。適切な活性化可能なリンカーの他の例としては、亜硝酸イソペンチルで活性化してベンゾトリアゾール誘導体を生成し得る、３，４－ジアミノ安息香酸（Ｄｂｚ）及びその誘導体が挙げられる（Ｓｅｌｖａｒａｊ，Ａ．ｅｔ ａｌ，Ｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，２０１８，９，３４５－３４９）。

他の適切な活性化可能なリンカーとしては、酵素基質が挙げられる。例えば、活性化リンカーは、ヌクレアーゼ開裂基によって開裂されるオリゴヌクレオチドであっても、またはペプチダーゼによって開裂されるオリゴヌクレオチドであってもよい。

いくつかの実施形態では、リンカーは、開裂基によって開裂されて、固体支持化合物を遊離する。開裂基とは、リンカーと反応してリンカーを開裂し、新生メンバーを固体支持体から遊離し得る反応性化学基、試薬、または酵素である。自己精製化合物を提供するために、開裂基は、化学部分、核酸部分、または足場に共有結合されてもよいし、または可逆的に会合されてもよい。例えば、開裂基は、化学部分の完成後に、化学ビルディングブロックの鎖の遠位端に結合されてもよい。開裂基は、化学部分における化学ビルディングブロックの鎖の遠位末端位置で、化学ビルディングブロックの遠位結合基に結合され得る。他の実施形態では、開裂基は、化学部分の任意の位置、足場、または核酸部分に結合され得る。

いくつかの実施形態では、開裂基は、化学部分、足場、またはコーディング核酸部分への結合の後で、かつリンカーとの反応の前に、さらなる変換または活性化を必要としない。

他の実施形態では、開裂基は、化学部分、足場、またはコーディング核酸部分への結合後で、かつリンカーとの反応前に活性化を必要とし、すなわち、開裂基は、活性化可能な開裂基であってもよい。開裂基は、開裂基がメンバーまたは化合物に組み込まれると保護され、脱保護後にリンカーを開裂する官能基を含んでもよい。例えば、開裂基は保護基を含んでもよく、保護基を除去することによって活性化されてもよい。

いくつかの好ましい実施形態では、開裂基を保護してもよい。例えば、開裂基は、保護基に共有結合され得る。保護された開裂基は不活性であってもよく、脱保護によって活性化されてもよい。方法は、例えば保護基を除去することにより、開裂基を脱保護することをさらに含んでもよい。開裂基は、リンカーの潜在的な活性化の前、後、または同時に脱保護され得る。適切な保護基は上記に記載されている。

開裂基は、好ましくは、足場に結合した化学部分を形成する化学ビルディングブロックの鎖の末端（すなわち、化学部分の遠位端）であってもよい。あるいは、開裂基は、末端の化学ビルディングブロック以外の鎖内の化学ビルディングブロックに結合してもよいし、または鎖中の２つの化学ビルディングブロックの間に組み込まれてもよい。

いくつかの実施形態では、化合物またはメンバーは、複数の異なる開裂基を含んでもよい。例えば、２つの異なるまたは直交する開裂基が、化学部分の２つの異なる位置に結合され得る。

開裂基の選択は、活性化可能なリンカー次第である。

適切な開裂基は、チオールを含んでもよいし、またはそれからなってもよい。いくつかの実施形態では、チオール開裂基を使用して、チオエステルリンカー、例えば、マスクされたチオエステルまたはマスクされたＮ－アルキルシステインの活性化によって生成されるチオエステルリンカー；またはＭｅＮｂｚリンカーなどのジアミノベンゾイルリンカー、例えば、ＭｅＤｂｚの活性化によって生成されるＭｅＮｂｚリンカー、を開裂してもよい。チオールは、固体支持体化合物への取り込み中に保護され得る。

他の適切な開裂基は、固体支持体上のメンバーまたは化合物への組み込み中に保護され得るセレノチオールを含んでもよいし、またはそれらからなってもよい。セレノチオールは、チオールと比較してリンカーと同様の反応性を示し得る。セレノチオールは、固体支持体化合物への取り込みの間に保護され得る。例えば、開裂基は、システインもしくはその誘導体、またはセレノシステインもしくはその誘導体であり得る。チオールまたはセレノチオールに加えて開裂基中のアミンは、アミンによる開裂基とリンカーとの反応後に形成されるチオエステルまたはセレノエステルの分子内開裂をもたらし得る。

いくつかの実施形態では、開裂基は、複数のチオールまたはセレノチオール基を含んでもよい。

他の適切な開裂基は、オルトジチオフェノールを含んでもよいし、またはそれからなってもよい。オルトジチオフェノール開裂基を使用して、置換キノキサリンリンカーを開裂してもよい。置換キノキサリンリンカーは、上により詳細に記載されている。

他の適切な開裂基は、酵素を含んでもよいし、または酵素からなってもよい。酵素開裂基を使用して、酵素的に開裂可能な構造を含むリンカーを開裂してもよい。例えば、ヌクレアーゼ開裂基を使用してポリヌクレオチドリンカーを開裂してもよく、ペプチダーゼを使用してペプチドリンカーを開裂してもよい。

開裂基によるリンカーの開裂には、他の反応を使用してもよい。本明細書に記載の開裂基及びリンカーの選択的反応に適合する反応を使用してもよい。例えば、リンカーは、Ｎ－及びＯ－置換ヒドロキシルアミンであってもよく、開裂基はα－ケト酸基を含んでもよい。別の例では、リンカーは、芳香環上でさらに誘導体化されたカルボン酸オルトヒドロキシベンズアルデヒドエステルを含んでもよく、開裂基は、化学部分、足場、またはコーディング核酸部分に対して、そのカルボキシル基を介して連結されたセリンまたはその誘導体、またはトレオニンまたはその誘導体を含んでもよい。

自己精製された化合物またはメンバーの合成を不必要に妨害しない限り、同じまたは異なるタイプの保護基を足場、化学ビルディングブロック、及び開裂基に使用してもよい。

例えば、チオール開裂基は、Ｓ－スルホネートの形成、またはジスルフィド結合またはセレンスルフィド結合を介して、アリルオキシカルボニル－アミノメチル基、ｏ－ニトロベンジル基、２－ニトロベラトリル（Ｎｖ）基、ｔｅｒｔ－ブチル（ｔＢｕ）基、９－フルオレニルメチル基に対する共有結合によって、保護され得る。好ましくは、ジスルフィドまたはセレンスルフィド結合による保護は分子内であり得る。

セレノチオール開裂基は、セレンスルフィドまたはジセレニド結合を介して保護され得る。

オルトジチオフェノール開裂基は、各チオールの分子間ジスルフィド結合形成による共有結合によって保護され得る。例えば、オルト－ジチオフェノール開裂基中のチオール基はそれぞれ、Ｓ－ｔｅｒｔ－ブチル基によって保護され得る。いくつかの実施形態において、チオールは、上記の他の保護基によって保護され得る。

いくつかの実施形態では、開裂基中の官能基の保護基は、光不安定性であってもよく、光不安定性結合によって開裂基に結合されてもよい。保護基は、光を当てて光不安定結合を開裂し、開裂基を活性化することによって除去され得る。開裂基は、リンカーの潜在的な活性化の前に、後に、または同時に脱保護されてもよい。適切な光不安定性保護基としては、２－ニトロベラトリル基などの２－ニトロベンジル基が挙げられる。

他の実施形態では、固体支持体メンバーは、開裂基を必要とせずに、メンバーを適切な条件にさらすことによって独立して開裂可能な第１及び第２のリンカーを含み得る。第１のリンカーは、足場を固体支持体に接続し得る。第２のリンカーは、化学部分を固体支持体に接続し得る。第１のリンカーの開裂は、第２のリンカーによって接続もされていないメンバー（すなわち、不完全な化学部分を有するメンバー）を遊離し得る。

１つの酵素または異なる酵素が、本明細書に記載の自己精製化合物またはメンバーの生成に関与する１つの反応または複数の反応を媒介し得る。

選択的に遊離された自己精製ライブラリーメンバーは、化学部分及び任意選択で足場から形成された直鎖状、分岐状、環状、大環状、または多環状の構造、及びリンカーと開裂基の反応から生じる１つ以上の開裂部分、またはリンカーの開裂後に残る１つ以上の部分を含んでもよい。図６Ａは、線形構造を有する自己精製化合物の例を示している。図６Ｂは、環状または大環状構造を有する自己精製化合物の例を示している。図７Ａは、分岐構造を有する自己精製化合物の例を示している。図７Ｂは、二環構造を有する自己精製化合物の例を示している。

自己精製されたライブラリーメンバーが固体支持体から選択的に遊離された後、さらなる反応を行ってもよい。例えば、追加の変換を溶液中で行ってもよく、または自己精製化合物を固体支持体上に再捕捉して、変換とそれに続く自己精製反応を含む追加の変換を行ってもよい。さらなる変換としては、化学ビルディングブロックの組み込み反応、化学ビルディングブロックの架橋、足場への化学ビルディングブロックの架橋、開裂反応、開環反応、及び大環状化反応が挙げられる。例えば、二環構造は、ＣｕＡＡＣ（銅触媒アジド－アルキン付加環化）の２つのビルディングブロックの架橋によって固体支持体から大環状自己精製ライブラリーメンバーが遊離された後に形成され得る。

いくつかの実施形態では、個々の固体支持体連結ライブラリーメンバーは、メンバーが固体支持体から遊離される前に区画化され得る。これにより、自己精製されたライブラリーメンバーの活性ベースのアッセイが可能になる。これによってまた、遊離されたメンバーが、コンパートメント内のコーディングオリゴヌクレオチドを含む核酸分子から物理的に分離されることが可能になる。核酸分子と遊離されたメンバーとが同じコンパートメントに存在することにより、遊離されたメンバーをコードする核酸分子を、同定及び配列決定して、メンバーの化学的部分を形成する化学ビルディングブロックを決定することが可能になる。これは、例えば、活動ベースのアッセイシステムで役立つ場合がある。

メンバーは、固体支持体の各粒子を別々のコンパートメントに分離することによってコンパートメント化され得る。隔離によって、異なる粒子の固体支持体に結合したメンバーが互いに相互作用するのが防がれ、コーディング核酸が、リンカーの開裂によって物理的に分離されている場合でも、遊離されたメンバーと関連付けられたままになることが可能になる。コンパートメントは、隔離された容積または液滴を含んでもよい。例えば、約０．５ｐＬから約１００ｎＬの間の容積または液滴を使用してもよい。しかしながら、より小さなまたはより大きな容積も使用してもよい。コンパートメントは、固体支持体結合メンバーと、リンカーの開裂及び支持体からのメンバーの遊離を容易にする、適切な反応物、緩衝液、及び他の試薬とを含み得る。区画化されたライブラリーは、例えば、アレイ、マイクロ流体またはマイクロパターン化デバイス、またはマルチウェルディッシュなど、任意の適切な形式であってもよい。

いくつかの実施形態では、コーディングオリゴヌクレオチドを含むコーディング核酸部分は、リンカーが開裂され、メンバーが遊離されたときにアンカー及びコーディング核酸部分が固体支持体に連結したままであるように、リンカーと固体支持体との間に位置するアンカーに結合されてもよい。

アンカーとは、結合オリゴヌクレオチドが結合される化学部分である。好ましくは、同じ化学部分がライブラリーのすべてのメンバーのアンカーを形成する。

いくつかの実施形態では、ＤＮＡコードライブラリーを作製する方法は、メンバーごとに、以下のステップ；
足場及びアンカーを含む新生メンバーを提供することであって、この足場はアンカーによってリンカーに接続され；アンカーが結合オリゴヌクレオチドを含み、固体支持体に結合していることと、
１つ以上の化学ビルディングブロックを新生メンバーに共有結合させて、足場に結合した化学部分を形成することと、
１つ以上のコーディングオリゴヌクレオチドを結合オリゴヌクレオチドに共有結合させて、アンカーに結合した核酸部分を形成することと、
開裂基を化学部分または足場に結合することと、
新生メンバーをコンパートメントに分離することと、
リンカーが開裂され、足場に結合した化学部分がコンパートメント内の固体支持体から遊離されるように、リンカーと開裂基を反応させることと、を含み得る。

他の実施形態では、ＤＮＡコードライブラリーを作製する方法は、メンバーごとに、以下のステップ；
足場及びアンカーを含む新生メンバーを提供することであって、ここで足場はアンカーによって第１のリンカーに接続され、このアンカーは結合オリゴヌクレオチドを含み、固体支持体に結合されていることと、
１つ以上の化学ビルディングブロックを新生メンバーに共有結合させて、足場に結合した化学部分を形成することと、
１つ以上のコーディングオリゴヌクレオチドを結合オリゴヌクレオチドに共有結合させて、アンカーに結合した核酸部分を形成することと、
化学部分に第２のリンカーを結合して、化学部分を固体支持体に接続することと、
第１のリンカーを開裂することと、
新生メンバーをコンパートメントに分離することと、
第２のリンカーが開裂され、足場に結合した化学部分がコンパートメント内の固体支持体から遊離されるように、第２のリンカを開裂させることと、を含んでもよい。

化学部分は、核酸部分とコンパートメント的に関連したままであり、核酸部分の配列決定がコンパートメント的に関連した化学部分を同定することを可能にする。

他の実施形態では、コーディングオリゴヌクレオチドを含むコーディング核酸部分は、リンカーが開裂されて、メンバーが遊離されたときにコーディング核酸部分が固体支持体に結合したままであるように、固体支持体に結合され得る。例えば、ＤＮＡコードライブラリーを生成する方法は、メンバーごとに以下のステップ；
リンカーによって固体支持体に接続された足場を含む新生メンバーを提供することであって；この固体支持体は結合オリゴヌクレオチドを含むことと、
１つ以上の化学ビルディングブロックを新生メンバーに共有結合させて、足場に結合した化学部分を形成することと、
１つ以上のコーディングオリゴヌクレオチドを結合オリゴヌクレオチドに共有結合させて、固体支持体に結合したコーディング核酸部分を形成することと、
開裂基を化学部分または足場に結合することと、
新生メンバーをあるコンパートメントに分離することと、
リンカーが開裂され、足場に結合した化学部分がこのコンパートメント内の固体支持体から遊離されるように、リンカーと開裂基を反応させることと、を含み得る。

ＤＮＡコードライブラリーを生成する別の方法は、メンバーごとに以下のステップ；
第１のリンカーによって固体支持体に接続された足場を含む新生メンバーを提供することであって；この固体支持体は結合オリゴヌクレオチドを含むことと、
１つ以上の化学ビルディングブロックを新生メンバーに共有結合させて、足場に結合した化学部分を形成することと、
１つ以上のコーディングオリゴヌクレオチドを結合オリゴヌクレオチドに共有結合させて、固体支持体に結合したコーディング核酸部分を形成することと、
化学部分に第２のリンカーを取り付けて、化学部分を固体支持体に接続することと、
第１のリンカーを開裂し、新生メンバーをあるコンパートメントに分離することと、
第２のリンカーが開裂され、足場に結合した化学部分がコンパートメント内の固体支持体から遊離されるように、第２のリンカーを開裂させることと、
を含み得る。

本発明の上記態様のいくつかの好ましい実施形態では、リンカーの１～１０^１５コピーが、粒子またはビーズなどの１つの固体支持体実体上に存在し得る。

支持体からの遊離に続いて、メンバーまたは化合物をさらに精製してもよい。例えば、自己精製後に追加のＨＰＬＣ精製を行ってもよい。

本明細書に記載の方法によって作製されたライブラリーは、標的分子に結合するメンバーについてスクリーニングされ得る。標的分子に結合するライブラリーメンバーを同定し、核酸分子を配列決定して、同定されたライブラリーメンバーによって提示される化学物質を形成する化学ビルディングブロックを同定し得る。

同定されたライブラリーメンバーの結合は、コード核酸の非存在下で検証され得る。例えば、方法は以下；
（ｉ）リンカーによって固体支持体に接続された標識された足場を含む新生メンバーを提供することと、
（ｉｉ）同定されたライブラリーメンバーの化学部分の化学ビルディングブロックを足場に共有結合させて、前記化学部分を含む標識された新生メンバーを生成することと、
（ｉｉｉ）開裂基を化学部分または足場に結合することと、
（ｉｖ）リンカーを開裂基と反応させ、それによってリンカーを開裂し、固体支持体からメンバーを遊離することと、
（ｖｉ）遊離された標識メンバーの標的分子への結合を決定することと、を含んでもよい。

遊離されたメンバーの標的分子への結合は、標識を使用して決定され得る。足場は、任意の便利な標識、例えば、蛍光標識で標識してもよい。

本発明の他の態様及び実施形態は、「含む」という用語を「からなる」という用語に置き換えた上記の態様及び実施形態、及び「本質的に～からなる」という用語に置き換えた「含む」という用語を含む上記の態様及び実施形態を提供する。

文脈上別段の要求がない限り、本出願は、上記の態様及び上記の実施形態のいずれかのお互いとのすべての組み合わせを開示することを理解されたい。同様に、本出願は、文脈上別段の要求がない限り、好ましい特徴及び／または任意選択の特徴のすべての組み合わせを単独で、または他の態様のいずれかと一緒に開示する。

上記の実施形態の改変、さらなる実施形態及びその改変は、本開示を読めば当業者には明らかであり、したがって、これらは本発明の範囲内である。

本明細書に言及される全ての文書及び配列データベース実体は、あらゆる目的のためにそれらの全体が参照により本明細書に援用される。

優先権は、欧州特許第２０２０３４７５．７号から主張されており、その開示は、すべての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

「及び／または」は、本明細書で使用される場合、お互いが有無である、２つの指定された特徴または構成要素のそれぞれの特定の開示とみなされるべきである。例えば、「Ａ及び／またはＢ」とは、あたかもそれぞれが本明細書において個別に記載されているかのように、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ、及び（ｉｉｉ）Ａ及びＢのそれぞれの特定の開示とみなされるべきである。

実験
材料及び方法
樹脂膨潤
初めて使用する前または－２０℃で保存した後、ＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）ビーズ（Ｒａｐｐ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ ＧｍｂＨ）を適切な溶媒で１０分間インキュベートした。

固形支持体の乾燥及び洗浄
ＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）ビーズ（Ｒａｐｐ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ ＧｍｂＨ）をフリット付きの固相合成反応容器で使用した。ＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）ビーズとインキュベートした溶媒または溶液を除去するために、真空ろ過を使用した。適切な溶媒を添加すること、続いて得られた溶媒または溶液を除去することによってビーズを洗浄した。磁性固体支持体は、磁石を使用して溶液から分離された。

固体支持体の量
各実験で使用される固体支持体の量は、それぞれの表面官能基（ロード量）のミリモル、質量（ｇまたはｍｇ）、または容積（μＬ）として与えられ、ここで、ビーズの容積は、製造業者によって供給されるのと同じ濃度で使用されるビーズ懸濁液の容積を指す。
固体支持体保存
官能化されたＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）ビーズ（Ｒａｐｐ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ ＧｍｂＨ）は、－２０℃で乾燥して保存された。他の固体支持体タイプは、４℃で適切な溶媒または水溶液中の懸濁液として保存された。

オリゴヌクレオチド
購入したカスタムオリゴヌクレオチドは、エタノール沈殿によってさらに精製された。ｍＱに再溶解したオリゴヌクレオチドを、ＬＣＭＳで分析し、ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００ｃ分光光度計を使用してそれらの濃度を測定した。

アミノ修飾一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡ（配列１）：
５’ｄアミノＣ６－ＧＧＡＧＣＴＴＣＴＧＡＡＴＴ３’
分子量＝４４７３．０２Ｄａ、ε_２６０＝１３３７００Ｍ^－１ｃｍ^－１
アミノ修飾二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ（配列２）：
５’ｄ Ｐｈｏｓ－ＧＡＧＴＣＡ－スペーサー９－アミノＣ７－スペーサー９－ＴＧＡＣＴＣＣＣ ３’
分子量＝４９３７．２４Ｄａ、ε_２６０＝１２７８７２Ｍ^－１ｃｍ^－１
アダプター（配列３）：
３’ＣＣＴＣＧＡＡＧＡＣＴＴＡＡＧＡＣＡＣＡＣＧＡＣ５’
コード（配列４）：
５’ｄ Ｐｈｏｓ－ＣＴＧＴＧＴＧＣＴＧＡＣＡＧＣＴＣＧＡＧＴＣＣＣＡＴＧＧＣＧＣ３’
分子量＝９５８４．１６Ｄａ、ε_２６０＝２８０３００Ｍ^－１ｃｍ^－１

オリゴヌクレオチドのエタノール沈殿
エタノール沈殿は、１０％（ｖ／ｖ）５Ｍ ＮａＣｌと３．５倍量のＥｔＯＨを加えることによって行った。サンプルを－２０℃で少なくとも２時間保存した後、４℃で２０８００×ｇで１時間遠心分離した。遠心分離後、上清を廃棄した。沈殿物は、Ｃｈｒｉｓｔ Ａｌｐｈａ ＲＶＣ Ｓｐｅｅｄｖａｃ回転式真空濃縮装置で完全に乾燥させ、ｍＱ（Ｍｉｌｌｉ－Ｑ（登録商標））水に溶解した。

オリゴヌクレオチド溶液の濃度評価
オリゴヌクレオチド溶液の濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００ｃ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ 機器を使用して、２６０ｎｍでのＵＶ 吸光度を測定することにより決定した。各測定に ２μＬのオリゴヌクレオチド溶液を使用した。オリゴヌクレオチドの濃度は、ＤＮＡ配列の既知の吸収係数と２６０ｎｍで測定されたＵＶ吸光度から計算された。

液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣＭＳ）
質量分析（ＬＣＭＳ）スペクトルは、Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ及びＸｅｖｏ Ｇ２－ＸＳ ＱＴｏｆ Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ Ｔｉｍｅ ｏｆ Ｆｌｉｇｈｔ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（四重極飛行時間型質量分析計）（Ｗａｔｅｒｓ）を使用して記録した。オリゴヌクレオチドのＬＣＭＳ分析には、ＸＢｒｉｄｇｅ（登録商標）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＢＥＨ（商標）Ｃ１８、１３０Å、２．５μｍ、２．１ｍｍ×５０ｍｍのカラムまたはＸＢｒｉｄｇｅ（登録商標）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＢＥＨ（商標）Ｃ１８、１３０Å、１．７μｍ、２．１ｍＭ×５０ｍＭのカラムを使用した。低分子のＬＣＭＳ分析には、Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ（登録商標）ＣＳＨ（商標）Ｃ１８、１．７μｍ、２．１ｍＭ×５０ｍＭのカラムを使用した。

一般手順１：アミン官能化固体支持体へのカルボン酸のアミドカップリングの一般手順
官能化ＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）ビーズを、ＤＭＦ（１０ｍＬ）で膨潤させた。アミン官能化 ＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）ビーズ（１等量のアミン負荷量）を、６６．７ｍＭのそれぞれの酸（４等量）、１３３．３ｍＭのＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（８等量）、及び６６．７ｍＭのＮ－［（ジメチルアミノ）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ－［４，５－ｂ］ピリジン－１－イルメチレン］－Ｎ－メチルメタナミニウムヘキサフルオロホスフェートＮ－オキシド（ＨＡＴＵ）（４当量）を含有するジメチルホルムアミド（０．１ｍｍｏｌの負荷量あたり６ｍＬ）を用いて室温で、回転シェーカー上で２時間インキュベートした。官能化されたＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）ビーズをジメチルホルムアミド（３×１０ｍＬ）、ジクロロメタン（３×１０ｍＬ）、次にジメチルホルムアミド（３×１０ｍＬ）で洗浄した。

一般手順２：固体支持体でのＦｍｏｃ脱保護の一般手順
官能化ＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）ビーズをＤＭＦ（１０ｍＬ）で膨潤させた。次に、乾燥した官能化ＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）ビーズを２０％（ｖ／ｖ）ピペリジンを含有するジメチルホルムアミド（０．１ｍｍｏｌの負荷量あたり６ｍＬ）を用いて室温で３０分間、回転シェーカーでインキュベートした。官能化されたＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）ビーズをジメチルホルムアミド（３×１０ｍＬ）、ジクロロメタン（３×１０ｍＬ）、次にジメチルホルムアミド（３×１０ｍＬ）で洗浄した。

一般手順３：アミン官能化磁性固体支持体への酸のアミドカップリングの一般手順
アミン官能化固体支持体（５０μＬ）を、ジメチルホルムアミド（２００μＬ）で洗浄した。アミン官能化ビーズを、５０ｍＭのジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、５０ｍＭのエチルシアノ（ヒドロキシイミノ）アセテート（ＯｘｙｍａＰｕｒｅ）、及び５０ｍＭのそれぞれの酸を含有するジメチルホルムアミド（１５０μＬ）の溶液と共に、室温で４時間、回転シェーカーでインキュベートした。官能化ビーズを、ジメチルホルムアミド（６×２００μＬ）で洗浄した。

一般手順４：磁性固体支持体でのＦｍｏｃ脱保護の一般手順
官能化ビーズ（５０μＬ）を、ジメチルホルムアミド（２００μＬ）で洗浄した。官能化されたビーズを、ジメチルホルムアミド中の２０％（ｖ／ｖ）ピペリジン（２００μＬ）とともに室温で、回転シェーカー上で１時間インキュベートした。官能化ビーズを、ジメチルホルムアミド（６×２００μＬ）で洗浄した。

一般手順５：ＣｕＡＡＣ法１による固体支持体への５’－アジド修飾一本鎖オリゴヌクレオチド（または５’－アジド修飾二本鎖オリゴヌクレオチド）の結合
この手順は、ＭａｃＣｏｎｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ ２０１５から適合された。アルキン官能化ＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）ビーズ（２０ｍｇ）を、０．０３４％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０を含むｍＱ水中の５０％ＤＭＳＯ中の３０ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム ｐＨ８．５で、室温で１５分間、回転シェーカーで膨潤させた。乾燥した固体支持体を、２．６ｍＭの１－（フェニルメチル）－Ｎ，Ｎ－ビス［［１－（フェニルメチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－４－イル］メチル］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－４－メタンアミン（ＴＢＴＡ）、１４．０ｍＭアスコルビン酸ナトリウム、及び２．８ｍＭの硫酸銅を含有する２０ｍＭの酢酸トリエチルアンモニウム（ｐＨ８．５）の溶液中の１～５ｎｍｏｌの５’－アジド修飾一本鎖オリゴヌクレオチド（実施例１で合成）と、０．０３５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０（１９５μＬ）を含むｍＱ水中の４８％のＤＭＳＯ中で、６０℃で３時間、回転シェーカー上で反応させた。固体支持体を、１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０及び１％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ｐＨ７．６（３×０．６ｍＬ）を含む１０ｍＭの２，２’－（１，３－プロパンジイルジイミノ）ビス［２－（ヒドロキシメチル）－１，３－プロパンジオール］、１００ｍＭの塩化ナトリウム、１０ｍＭのＮ，Ｎ’－１，２－エタンジイルビス［Ｎ－（カルボキシメチル）グリシン］（ＥＤＴＡ）の溶液で洗浄した。

一般的な手順６：ＣｕＡＡＣ法２による固体支持体への５’－アジド修飾一本鎖オリゴヌクレオチドの結合
過剰な負荷容量を有するアルキン官能化磁性固体支持体（２５μＬ）を、ｍＱ水（３×２００μＬ）中の５０％のＤＭＳＯで洗浄した。固体支持体を、１～５ｍｍｏｌの５’アジド修飾一本鎖オリゴヌクレオチド（実施例１で合成）と、９９３μＭの１－（フェニルメチル）－Ｎ，Ｎ－ビス［［１－（フェニルメチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－４－イル］メチル］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－４－メタンアミン（ＴＢＴＡ）、９４５μＭ硫酸銅（ＣｕＳＯ_４）、及び５．６７２ｍＭアスコルビン酸ナトリウム（ＮａＡｓｃ）、及び１００ｍＭの塩化リチウム（ｍＱ水（９０μＬ）に含まれる４２％ＤＭＳＯ中）の混合物中で、室温で１時間回転シェーカーで反応させた。固体支持体をｍＱ水（３×２００μＬ）中の５０％のＤＭＳＯで洗浄した。

実施例１：５’－アジド修飾一本鎖オリゴヌクレオチドの調製
アミノ修飾ｓｓＤＮＡ：５’ｄアミノＣ６－ＧＧＡＧＣＴＴＣＴＧＡＡＴＴ３’（配列１）
酸アジド：３－［２－［２－［２－（２－アジドエトキシ）エトキシ］エトキシ］エトキシ］プロパン酸
３－［２－［２－［２－（２－アジドエトキシ）エトキシ］エトキシ］エトキシ］プロパン酸（３００μＬ、ＤＭＳＯ中１００ｍＭ）、１－ヒドロキシ－２，５－ジオキソ－３－ピロリジンスルホン酸（Ｓ－ＮＨＳ）（１４５μＬ、ＤＭＳＯ中３３％（ｖ／ｖ）ｍＱ水に１００ｍＭ）、及びＮ^３－（エチルカルボニミドイル）－Ｎ^１，Ｎ^１－ジメチル－１，３－プロパンジアミン（ＥＤＣ）（１４５μＬ、ＤＭＳＯ中１００ｍＭ）を１ｍＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含むチューブに加え、３７℃の回転シェーカーで３０分間インキュベートした。その間、５０４μＬのｍＱ水に含まれる２５０ｎｍｏｌのアミノ修飾ｓｓＤＮＡを、３５０μＬの２５０ｍＭホウ酸緩衝液ｐＨ９．５と共に回転シェーカー上で３７℃で３０分間インキュベートした。Ｓ－ＮＨＳ、ＥＤＣ、及び３－［２－［２－［２－（２－アジドエトキシ）エトキシ］エトキシ］エトキシ］プロパン酸を含む活性化溶液を、ホウ酸緩衝液中でＤＮＡと混合し、回転シェーカーで、３７℃で４５分間反応させた。反応をＬＣＭＳによりモニターした。２０％（ｖ／ｖ）の５Ｍ ＮａＣｌ、続いて３．５容積の無水エタノールを添加することにより、ＤＮＡを沈殿させた。サンプルを－２０℃で１８時間保存した後、４℃、４０００×ｇで遠心分離した。上澄みを廃棄し、沈殿物をＳｐｅｅｄｖａｃ回転真空濃縮装置で完全に乾燥させた。乾燥した沈殿物を１ｍＬの１００ｍＭ ＴＥＡＡ ｐＨ７．０に溶解した。粗生成物を、Ｗａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ（登録商標）ＢＥＨ Ｃ１８ ＯＢＤ（商標）Ｐｒｅｐ Ｃｏｌｕｍｎ（１３０Å、５μｍ、１０ｍＭ×１５０ｍＭ）及び緩衝液１（１００ｍＭ ＴＥＡＡ ｐＨ ７．０緩衝液）、及び緩衝液２（１００ｍＭ ＴＥＡＡ ｐＨ７．０の８０％アセトニトリルを含むｍＱ水）の勾配を使用するＲＰ－ＨＰＬＣによって精製した。収集した画分を合わせて濃縮し、２０％（ｖ／ｖ）の５Ｍ ＮａＣｌ、続いて３．５容積の無水エタノールを添加してオリゴヌクレオチドを沈殿させた。サンプルを－２０℃で２時間保存した後、４℃、４０００×ｇで遠心分離した。上澄みを廃棄し、沈殿物をＳｐｅｅｄｖａｃ回転真空濃縮装置で完全に乾燥させた。乾燥した沈殿物を５００μＬのｍＱ水に溶解した。ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００ｃ分光光度計で２６０ｎｍのＵＶ吸光度を測定することによる濃度評価では、６１％の収率が示された。生成物をＬＣＭＳによって分析した（図１３）。（図１３Ｂ）では、２６０ｎｍの吸光度を測定するクロマトグラムが、生成物である５’－アジド修飾一本鎖オリゴヌクレオチドについて示されている。所望の生成物は主要な生成物である。（図１３Ｄ）は、生成物ピークのデコンボリューション（ｄｅｃｏｎ．）質量スペクトルを示している。所望の生成物に対応する質量が観察される。比較のために、出発物質のＬＣＭＳスペクトルを（図１３Ａ）及び（図１３Ｃ）に示す。（図１３Ａ）では、２６０ｎｍの吸光度を測定するクロマトグラムが、出発物質のオリゴヌクレオチド（配列１）について示されている。デコンボリューションされた（ｄｅｃｏｎ．）質量スペクトルは、出発物質のオリゴヌクレオチド（配列１）について（図１３Ｃ）に示されている。

実施例２：新生ライブラリーメンバーの調製（リンカー＋開裂基アプローチ）
ＮＨ２官能化１０μｍ ＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）ビーズ（Ｒａｐｐ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ ＧｍｂＨ）（３８５ｍｇ、０．１ｍｍｏｌの負荷量）をフリット付きの固相合成反応容器に加えた。ＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）ビーズを、ジメチルホルムアミド（６ｍＬ）で、室温で１０分間、回転シェーカーで膨潤させた後、ジメチルホルムアミド（３×１０ｍＬ）で洗浄した。

ステップ２．１ コハク酸モノ－ｔｅｒｔ－ブチルへのカップリング
官能化された ＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）ビーズは、一般的な手順１に従って、コハク酸モノ－ｔｅｒｔ－ブチルにカップリングされた。

ステップ２．２キャッピング
官能化されたＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）ビーズを、回転シェーカーで、室温で１０分間、ジクロロメタン（６ｍＬ）で膨潤させ、次にジクロロメタン（３×１０ｍＬ）で洗浄した。官能化されたＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）ビーズを、ジクロロメタン（６ｍＬ）、無水酢酸（２ｍＬ）、及びＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（２ｍＬ）の混合物とともに室温で１時間インキュベートした。官能化されたＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）ビーズを、ＤＣＭ（３×１０ｍＬ）で洗浄した。

ステップ２．３ｔｅｒｔ－ブチル脱保護
官能化ＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）ビーズに、ジクロロメタン（５ｍＬ）中の５０％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸の混合物を添加した。回転振とう機で、室温で１０分後、溶液を除去した。次に、ジクロロメタン（５ｍＬ）中の５０％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸の新鮮な混合物を、室温で２０分間、回転シェーカーでＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）ビーズとインキュベートした。樹脂をジクロロメタン（３×１０ｍＬ）で洗浄し、次にジメチルホルムアミド（３×１０ｍＬ）で洗浄した。

ステップ２．４ Ｎ－Ｂｏｃ－エチレンジアミンへのカップリング
官能化ＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）ビーズを、ＤＭＦ（１０ｍＬ）で膨潤させた。次に、乾燥した官能化ＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）ビーズを、Ｎ－Ｂｏｃ－エチレンジアミン（６３μＬ、０．４ｍｍｏｌ、４当量）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（１３６μＬ、０．８ｍｍｏｌ、８当量）、及びＮ－［（ジメチルアミノ）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ－［４，５－ｂ］ピリジン－１－イルメチレン］－Ｎ－メチルメタナミニウムヘキサフルオロリン酸Ｎ－オキシド（ＨＡＴＵ）（１５２ｍｇ，０．４ｍｍｏｌ，４当量）含有ジメチルホルムアミド（６ｍＬ）と、室温で、回転シェーカー上で２時間インキュベートした。官能化されたＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）ビーズをジメチルホルムアミド（３×１０ｍＬ）、ジクロロメタン（３×１０ｍＬ）、次にジメチルホルムアミド（３×１０ｍＬ）で洗浄した。

ステップ２．５ Ｂｏｃ脱保護
官能化ＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）ビーズに、ジクロロメタン（５ｍＬ）中の５０％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸の混合物を添加した。回転振とう機で、室温で１０分後、溶液を除去した。次に、ジクロロメタン（５ｍＬ）中の５０％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸の新鮮な混合物を、室温で２０分間、回転シェーカーでＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）ビーズとインキュベートした。樹脂をジクロロメタン（３×１０ｍＬ）で洗浄し、次にジメチルホルムアミド（３×１０ｍＬ）で洗浄した。

ステップ２．６ ６－（Ｆｍｏｃ－アミノ）ヘキサン酸へのカップリング
官能化ＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）ビーズを、ＤＭＦ（１０ｍＬ）で膨潤させた。次に、一般手順１に従って、官能化されたＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）ビーズを６－（Ｆｍｏｃ－アミノ）ヘキサン酸にカップリングさせた。

ステップ２．７Ｆｍｏｃ脱保護
官能化された ＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）ビーズを、一般手順２に従ってＦｍｏｃ脱保護した。

ステップ２．８ ３－［［（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ）カルボニル］アミノ］－４－（メチルアミノ）安息香酸へのカップリング
官能化されたＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）ビーズを、一般手順１に従って３－［［（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ）カルボニル］アミノ］－４－（メチルアミノ）安息香酸（Ｆｍｏｃ－ＭｅＤｂｚ－ＯＨ）と反応させた。

ステップ２．９Ｆｍｏｃ脱保護
官能化された ＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）ビーズは、一般手順２に従ってＦｍｏｃ脱保護された。

ステップ２．１０ ６－（Ｆｍｏｃ－アミノ）ヘキサン酸へのカップリング
官能化ＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）ビーズを、一般的手順１に従って、６－（Ｆｍｏｃ－アミノ）ヘキサン酸と反応させた。

ステップ２．１１Ｆｍｏｃ脱保護
官能化されたＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）ビーズは、一般手順２に従ってＦｍｏｃ脱保護された。

ステップ２．１２（２Ｓ）－２－［［（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ）カルボニル］アミノ］－４－ペンチン酸へのカップリング
官能化されたＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）ビーズを、一般手順１に従って（２Ｓ）－２－［［（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ）カルボニル］アミノ］－４－ペンチン酸（Ｆｍｏｃ－Ｐｒａ－ＯＨ）にカップリングさせた。

ステップ２．１３ Ｆｍｏｃ脱保護
官能化されたＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）ビーズを、一般手順２に従ってＦｍｏｃ脱保護された。

ステップ２．１４ オリゴヌクレオチド結合
ステップ２．１～２．１３で合成された化合物は、足場に接続するＭｅＤｂｚリンカーを備えた固体支持体であり、アミン官能基でブロック結合を構築するための部位と、核酸結合のためのアルキンとを含む。５ｎｍｏｌの５’－アジド修飾一本鎖オリゴヌクレオチド（実施例１で合成）を、一般的な手順５に従って、官能化されたＴｅｎｔａＧｅｌ（ステップ２．１～２．１３、２０ｍｇ）に結合させた。

ＬＣＭＳ分析のための新生ライブラリーメンバーの開裂
ステップ２．１５ ＭｅＤｂｚリンカーの活性化ステップ１－ｐ－ニトロフェニルクロロホルメートとのインキュベーション
オリゴヌクレオチドが結合した官能化されたＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）ビーズ（２０ｍｇ）を、室温で３０分間、回転シェーカーでジクロロメタン（６００μＬ）中の１００ｍＭのｐ－ニトロフェニルクロロホルメートとインキュベートした。樹脂をジクロロメタン（３×６００μＬ）で洗浄した。

ステップ２．１６ ＭｅＤｂｚリンカーの活性化 ステップ２－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）とのインキュベーション
オリゴヌクレオチドが結合した官能化ＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）ビーズ（２０ｍｇ）を、８．７％（ｖ／ｖ）Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）を含むジクロロメタン（６００μＬ）とともに、室温で３０分間、回転シェーカーでインキュベートした。樹脂をジクロロメタン（２×６００μＬ）で洗浄した。

ステップ２．１７ システアミンによるＭｅＤｂｚ開裂
オリゴヌクレオチドが結合した官能化ＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）ビーズ（２０ｍｇ）を、０．０１％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）（１５０μＬ）を含むｍＱ水で５０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ中の過剰なシステアミンと、回転シェーカーで、６０℃で１時間インキュベートした。得られた溶液を遠心分離によりビーズから分離し、回収した。回収した溶液をＬＣＭＳで分析した（図１４）。図１４は、新生ライブラリーメンバーの開裂に関する分析ＬＣＭＳデータを示す。（図１４Ａ）、及び（図１４Ｂ）は、２６０ｎｍの吸光度を測定したクロマトグラムを示している。（図１４Ｃ）、及び（図１４Ｄ）は、それぞれ３．８０分での生成物ピークの質量スペクトル、及びデコンボリューションされた質量スペクトルを示している。これらのＬＣＭＳスペクトルによって、所望の新生ライブラリーメンバーが得られたことが示されている。後の保持時間で観察された大きなピークは、その時点でその機械でのすべてのＬＣＭＳ 測定で見られたＬＣＭＳ不純物である。

実施例３：自己溶出モデル化合物ｏｆｆ－ＤＮＡの合成
ステップ２．１～２．１３で調製した官能化固体支持体は、自己溶出モデル化合物ｏｆｆ－ＤＮＡの合成の出発物質として使用された。官能化されたＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）ビーズを、ジメチルホルムアミド（６ｍＬ）で、室温で１０分間、回転シェーカーで膨潤させた後、ジメチルホルムアミド（３×１０ｍＬ）で洗浄した。

ステップ３．１ 樹脂分割
ステップ２．１～２．１３で調製した官能化ＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）ビーズを、０．０５ｍｍｏｌの２つの部分に分割した。２つの部分のうちの１つを用いて、合成を０．０５ミリモル規模で続けた。

ステップ３．２ ６－（Ｆｍｏｃ－アミノ）ヘキサン酸へのカップリング
官能化ＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）ビーズを、一般的手順１に従って、６－（Ｆｍｏｃ－アミノ）ヘキサン酸と反応させた。

ステップ３．３ Ｆｍｏｃ脱保護
官能化されたＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）ビーズは、一般手順２に従ってＦｍｏｃ脱保護した。

ステップ３．４（２Ｓ）－２－（［［（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ］カルボニル］アミノ）－３－（ナフタレン－１－イル）プロパン酸へのカップリング
官能化ＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）ビーズを、一般的な手順１に従い、（２Ｓ）－２－（［［（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ］カルボニル］アミノ）－３－（ナフタレン－１－イル）プロパン酸（Ｆｍｏｃ－１－Ｎａｌ－ＯＨ）と反応させた。

ステップ３．５ 樹脂分割
官能化 ＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）ビーズを、０．０２５ｍｍｏｌの２つの部分に分割した。２つの部分のうちの１つを用いて、合成を０．０２５ミリモル規模で続けた。

ステップ３．６ Ｆｍｏｃ脱保護
官能化されたＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）ビーズは、一般手順２に従ってＦｍｏｃ脱保護された。

ステップ３．７（ＲＳ）－リポ酸へのカップリング
官能化ＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）ビーズを、一般的手順１に従って、（ＲＳ）－リポ酸と反応させた。

実施例４：モデル核酸コードライブラリーメンバーの自己溶出
ステップ４．１ オリゴヌクレオチド結合
一般手順５に従って、５ｎｍｏｌの５’－アジド修飾一本鎖オリゴヌクレオチドを、実施例３で合成した自己溶出モデル化合物（２０ｍｇ）に結合させた。

ステップ４．２ＭｅＤｂｚリンカーの活性化ステップ１－ｐ－ニトロフェニルクロロホルメートとのインキュベーション
オリゴヌクレオチドが結合した官能化されたＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）ビーズ（２０ｍｇ）を、室温で３０分間、回転シェーカーでジクロロメタン（６００μＬ）中の１００ｍＭのｐ－ニトロフェニルクロロホルメートとインキュベートした。樹脂をジクロロメタン（３×６００μＬ）で洗浄した。

ステップ４．３ ＭｅＤｂｚリンカーの活性化ステップ２－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）とのインキュベーション
官能化ビーズを、８．７％（ｖ／ｖ）Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）を含むジクロロメタン（６００μＬ）とともに、室温で３０分間、回転シェーカーでインキュベートした。その樹脂をジクロロメタン（３×６００μＬ）で洗浄した。

ステップ４．４ 開裂基の脱保護
官能化ビーズを、１００ｍＭのＴｒｉｓ（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）の６％（ｖ／ｖ）トリエチルアミン、５３％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）のｍＱ水中の溶液（０．０１％（ｗ／ｖ）（ドデシル硫酸（ＳＤＳ）ナトリウム含有）中で、ｐＨ８～９（１５０μＬ）を、回転シェーカーで、６０℃で１時間インキュベートした。ビーズを遠心分離によって乾燥した。

ステップ４．５ モデル核酸コードライブラリーメンバーの自己溶出
官能化ビーズを、０．０１％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）（１５０μＬ）を含むｍＱ水中、８０％のアセトニトリル中の１０％（ｖ／ｖ）Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）の溶液と６０℃で１時間、回転シェーカーでインキュベートした。得られた溶液を遠心分離によりビーズから分離し、回収した。集めた溶液を、Ｓｐｅｅｄｖａｃ回転真空濃縮装置を用いて濃縮した。

ステップ４．６ 自己溶出モデル核酸コードライブラリーメンバーのエタノール沈殿
ステップ４．５の後に得られた残留物を、ｍＱ水（１５０μＬ）中の５０％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に再懸濁した。サンプルをろ過し、サンプルの１０μＬをＬＣＭＳ分析に使用した。１２５μＬのサンプルを使用して、１０％（ｖ／ｖ）の５Ｍ塩化ナトリウム（１２．５μＬ）、１０％（ｖ／ｖ）の２．５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ ４．７９（１２．５μＬ）、続いて３．５容積の無水エタノール（５２５μＬ）を添加することにより、自己溶出モデル核酸コードライブラリーメンバーをエタノール沈殿させた。サンプルを－２０℃で１８時間保存した後、４℃、２０８００×ｇで１時間、遠心分離した。上澄みを廃棄し、沈殿物をＳｐｅｅｄｖａｃ回転真空濃縮装置で完全に乾燥させた。乾燥した沈殿物を、ｍＱ水（１００μＬ）に溶解した。ＬＣＭＳ分析は、自己溶出モデル核酸コードライブラリーメンバーの質量を示した（図１９、図２０）。化学構造（図１９Ａ）及び（図１９Ｂ）は、２６０ｎｍ（図１９Ｃ）及び２８０ｎｍ（図１９Ｄ）の吸光度のクロマトグラムで観察された。（図１９Ｂ）は、環状チオエステル中間体の加水分解によって形成された直鎖状の自己溶出生成物である。（図１９Ａ）は、沈殿ステップのために追加された、エタノールによる環状チオエステル中間体の開環によって形成された直鎖状の自己溶出生成物である。観察された化合物は、分子内ジスルフィド結合を形成するチオール基の酸化によって形成され得る。（図２０Ａ）及び（図２０Ｂ）は、図１９Ａに示される自己溶出ライブラリーメンバー化合物の質量スペクトル及びデコンボリューションされた質量スペクトルをそれぞれ示す。（図２０Ｃ）及び（図２０Ｄ）は、図１９Ｂに示される自己溶出ライブラリーメンバー化合物の質量スペクトル及びデコンボリューションされた質量スペクトルをそれぞれ示す。これらのデータによって、自己溶出が達成されたことが示される。

実施例５：モデル核酸コードライブラリーメンバーの自己溶出
ステップ５．１ オリゴヌクレオチド結合
一般手順５に従って、５ｎｍｏｌの５’－アジド修飾一本鎖オリゴヌクレオチドを、実施例３で合成した自己溶出モデル化合物（２０ｍｇ）に結合させた。

ステップ５．１ ＭｅＤｂｚリンカーの活性化ステップ１－ｐ－ニトロフェニルクロロホルメートとのインキュベーション
オリゴヌクレオチドが結合した官能化されたＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）ビーズ（２０ｍｇ）を、室温で３０分間、回転シェーカーでジクロロメタン（６００μＬ）中の１００ｍＭのｐ－ニトロフェニルクロロホルメートとインキュベートした。樹脂をジクロロメタン（３×６００μＬ）で洗浄した。

ステップ５．２ ＭｅＤｂｚリンカーの活性化ステップ２－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）とのインキュベーション
官能化ビーズを、８．７％（ｖ／ｖ）Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）を含むジクロロメタン（６００μＬ）とともに、室温で３０～４０分間、回転シェーカーでインキュベートした。その樹脂をジクロロメタン（３×６００μＬ）で洗浄した。

ステップ５．３ 開裂基の脱保護
官能化ビーズを、１００ｍＭのＴｒｉｓ（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）含有の６％（ｖ／ｖ）トリエチルアミン、５３％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）含有のｍＱ水（０．０１％（ｗ／ｖ）（ドデシル硫酸（ＳＤＳ）ナトリウム含有）の溶液中で（ｐＨ８～９）、回転シェーカーで、６０℃で１時間インキュベートした。ビーズを遠心分離によって乾燥した。

ステップ５．４ モデル核酸コードライブラリーメンバーの自己溶出
官能化されたビーズを、１０％（ｖ／ｖ）Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）のジクロロメタン溶液（１５０μＬ）とともに回転シェーカー上で、６０℃で１時間インキュベートした。ついで、ビーズを遠心分離によって乾燥した。ビーズを０．０１％のＳＤＳ、ｐＨ９を含むｍＱ水中の４９％のＤＭＳＯ中の１ｍＭ炭酸ナトリウム（Ｎａ_２ＣＯ_３）の溶液で洗浄し、遠心分離によって収集した得られた溶液をＬＣＭＳで分析した（図２１、図２２）。（図２１Ａ）は、２つの可能な環状自己溶出核酸コードライブラリーメンバーの構造を示す。（図２１Ｂ）は、２６０ｎｍでのクロマトグラムであり、（図２１Ｃ）は、ＴＩＣである。環状自己溶出ライブラリーメンバーに対応する質量のピークが５．８８分に観察される。（図２２Ｂ）、及び（図２２Ｃ）は、それぞれ、自己溶出核酸ライブラリーメンバーのピークの質量スペクトル、及び対応するデコンボリューションされた質量スペクトルである。所望の環状自己溶出核酸コードライブラリーメンバーの質量が観察され、これは自己溶出が達成されたことを示している。

実施例６：モデル核酸コードライブラリーメンバーの自己精製
ステップ６．１ Ｄｂｚリンカー誘導体の合成

４－アミノ－３－［［（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ）カルボニル］アミノ］安息香酸（Ｆｍｏｃ－Ｄｂｚ－ＯＨ）（２００ｍｇ、０．５３４ｍｍｏｌ、１．０当量）を、丸底フラスコで、１０ｍＬのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解した。プロパルギルアミン（６８．３μＬ、１．０６８ｍｍｏｌ、２．０当量）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（３７２μＬ、２．１３７ｍｍｏｌ、４．０当量）、及びＮ－［（ジメチルアミノ）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ－［４，５－ｂ］ピリジン－１－イルメチレン］－Ｎ－メチルメタナミニウムヘキサフルオロホスフェートＮ－オキシド（ＨＡＴＵ）（ ４０７ｍｇ、１．０６８ｍｍｏｌ、２．０当量）を加え、溶液を室温で２時間撹拌した。この反応混合物を水でクエンチした。水性の成分を酢酸エチルで抽出した。合わせた有機成分を、減圧下で濃縮した。粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中７０％（ｖ／ｖ）酢酸エチル）により精製して、白色固体を得た。

上記生成物を、ＴＨＦ（１０ｍＬ）中の２０％（ｖ／ｖ）ジエチルアミン中で、室温で５時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮した。粗反応生成物を固体支持体への結合に使用した。

新生ライブラリーメンバーの調製
ステップ６．２ Ｎ^２－［（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ）カルボニル］－Ｎ^６－［（４－メチルフェニル）ジフェニルメチル］－Ｌ－リジン（Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）－ＯＨ）へのカップリング
アミン官能化固体支持体（官能化ＰｒｏＭａｇ（登録商標）１、Ｂａｎｇｓ Ｌａｂａｒｏｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）（５０μＬ）を、一般的な手順３に従って、Ｎ^２－［（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ）カルボニル］－Ｎ^６－［（４－メチルフェニル）ジフェニルメチル］－Ｌ－リジン（Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）－ＯＨ）に対してカップリングした。

ステップ６．３ Ｆｍｏｃ脱保護
官能化ビーズ（５０μＬ）を、一般的な手順４に従ってＦｍｏｃ脱保護した。

ステップ６．４ ４－（ヒドロキシメチル）安息香酸（ＨＭＢＡ）へのカップリング
一般的な手順３に従って、アミン官能化固体支持体（５０μＬ）を４－（ヒドロキシメチル）安息香酸（ＨＭＢＡ）にカップリングさせた。

ステップ６．５（２Ｓ）－２－［［（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ）カルボニル］アミノ］－４－ペンチン酸（Ｆｍｏｃ－Ｐｒａ－ＯＨ）へのカップリング
アルコール官能化固体支持体（５０μＬ）を、ジメチルホルムアミド（２００μＬ）で洗浄した。官能化ビーズを、１００ｍＭのジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、５．７６ｍＭ ＤＭＡＰ及び８０ｍＭ（２Ｓ）－２－［［（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ）カルボニル］アミノ］－４－ペンチン酸（Ｆｍｏｃ－Ｐｒａ－ＯＨ）含有ジメチルホルムアミド（１５０μＬ）の溶液と、回転シェーカーで、４℃で４時間インキュベートした。官能化ビーズを、ジメチルホルムアミド（６×２００μＬ）で洗浄した。

ステップ６．６ Ｆｍｏｃ脱保護
官能化ビーズ（５０μＬ）は、一般的な手順４に従ってＦｍｏｃ脱保護された。

ステップ６．７ １－（１，１－ジメチルエチル）ブタンジオエートビルディングブロックへのカップリング
アミン官能化固体支持体（５０μＬ）を、一般手順３に従って１－（１，１－ジメチルエチル）ブタンジオエートにカップリングさせた。

ステップ６．８ Ｍｔｔ脱保護及びｔＢｕ脱保護
官能化ビーズ（５０μＬ）を、５０％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸を含むジクロロメタン（６００μＬ）で、室温で、回転シェーカー上で３分間インキュベートした（ステップを３回繰り返した）。官能化ビーズを、ジメチルホルムアミド中の１０％（ｖ／ｖ）Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（３×２００μＬ）で洗浄し、次にジメチルホルムアミド（３×２００μＬ）で洗浄した。

ステップ６．９ 固体支持体へのオリゴヌクレオチドの結合
５ｎｍｏｌ ５’－アジド修飾一本鎖オリゴヌクレオチド（実施例１で合成）を、一般手順６に従って、述べた２倍の量を使用してアルキン官能化ビーズ（５０μＬ）に結合させた。

ステップ ６．１０ 低分子アルキンクエンチング
ＤＮＡ結合後の官能化ビーズ（５０μＬ）を、アジ化ベンジルでＣｕＡＡＣ条件に供し、未反応のアルキン官能基をクエンチした。官能化固体支持体（５０μＬ）を、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（３×２００μＬ）で洗浄した。固体支持体は、５０ｍＭベンジルアジド、９９３μＭの１－（フェニルメチル）－Ｎ，Ｎ－ビス［［１－（フェニルメチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－４－イル］メチル］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－４－メタンアミン（ＴＢＴＡ）、９４５μＭの硫酸銅（ＣｕＳＯ４）、及び５．６７２ｍＭのアスコルビン酸ナトリウム（ＮａＡｓｃ）８９％ ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）含有のｍＱ水（３６０μＬ）の混合物中で、室温で１時間、回転シェーカーでインキュベートした。固体支持体をＤＭＳＯ（３×２００μＬ）で洗浄した。官能化された固体支持体の５μＬを分析用に保管した。

リンカー２のインストール
ステップ６．１１ ５－アジドペンタン酸へのカップリング（固体支持体上の反応ｏｎ－ＤＮＡ）
Ｎ^３－（エチルカルボンイミドイル）－Ｎ^１，Ｎ^１－ジメチル－１，３－プロパンジアミン（ＥＤＣ）及び１－ヒドロキシ－２，５－ジオキソ－３－ピロリジンスルホン酸（Ｓ－ＮＨＳ）の５０ｍｇ／ｍＬのストックを、１００ｍＭの２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液（ｐＨ４．５）中で調製した。各ストックの４０μＬを、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の４５０ｍＭの５－アジドペンタン酸１２０μＬと混合して、最終容積を２００μＬにした。この溶液を、室温で１５分間インキュベートした。次に、この溶液を官能化ビーズ（４５μＬ）に加え、反応物を室温で２時間回転シェーカーに置いておいた。官能化されたビーズを、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を用いて洗浄した（３×２００μＬ）。

ステップ６．１２ 逆Ｄｂｚリンカー２へのカップリング（固体支持体上の反応ｏｎ－ＤＮＡ）
官能化された固体支持体の５μＬを分析用に保管した。官能化された固体支持体の残り（４０μＬ）を、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（２００μＬ）で洗浄した。官能化ビーズは、３６０ｍＭのアミン（ステップ６．１で調製した逆Ｄｂｚリンカー）、３６０ｍＭのＨＡＴＵ、及びジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の１．５０ＭのＤＩＰＥＡ（１００μＬ）の溶液と共に、室温で１時間、回転シェーカー上で、４０℃でインキュベートした。官能化されたビーズを、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を用いて洗浄した（３×２００μＬ）。

ステップ６．１３ ＬＣＭＳ分析のための固体支持体からの１０μＬビーズのオリゴヌクレオチド開裂
官能化された固体支持体（１０μＬ）の一部を、ｍＱ水（６０μＬ）中の２５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中の１００ｍＭの水酸化リチウム（ＬｉＯＨ）とともに、回転シェーカーで、４０℃で１時間インキュベートした。サンプルを濾過し、ＬＣＭＳによって分析した（図２９Ａ）。ＬＣＭＳスペクトルは、クロマトグラムの４．０１分に示されるように、ＨＭＢＡリンカーの開裂が所望の中間体を生成することを示している（図２９Ａ）。所望の中間体の化学構造を示す（図２９Ａ）。さらに、分析されたサンプルは、望ましくない中間生成物を含んでいる。これらは、例えば、合成において前のアミドカップリングステップを受けなかった化合物であり得る。

ステップ６．１４ ＣｕＡＡＣによる環化
残りの官能化固体支持体（３０μＬ）を、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（３×２００μＬ）で洗浄した。固体支持体は、９９３μＭの１－（フェニルメチル）－Ｎ，Ｎ－ビス［［１－（フェニルメチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－４－イル］メチル］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－４－メタンアミン（ＴＢＴＡ）、９４５μＭの硫酸銅（ＣｕＳＯ_４）、及び５．６７２ｍＭのアスコルビン酸ナトリウム（ＮａＡｓｃ）を含有するｍＱ水（２７０μＬ）中の８９％のＤＭＳＯの混合物中で、室温で１時間、回転シェーカーでインキュベートした。固体支持体をＤＭＳＯ（３×２００μＬ）で洗浄した。

自己精製
ステップ６．１５ リンカー１の開裂
官能化された固体支持体（３０μＬ）の場合、ＨＭＢＡリンカー１は、ｍＱ水（６０μＬ）中で、２５％のＤＭＳＯ中の１００ｍＭの水酸化リチウム（ＬｉＯＨ）によって、回転シェーカーで、４０℃で１．５時間、開裂された。この溶液のＬＣＭＳ分析は、このステップ中に固体支持体から開裂された望ましくない生成物を示した（図２９Ｂ）。クロマトグラム（図２９Ｂ）とクロマトグラム（図２９Ａ）との比較は、ステップ６．１２で形成された所望の中間体を除いて、すべての化合物がステップ６．１５で固体支持体から開裂されることを示している。なぜなら、この化合物は、アルキンを含み、ステップ６．１５での開裂の前に、ＣｕＡＡＣ反応を受けているからである。これは、ＣｕＡＡＣ反応が成功し、このステップで望ましくない生成物のみが固体支持体から遊離されることを示している。

ステップ６．１６リンカー２（末端リンカー）の開裂
官能化された固体支持体（３０μＬ）上のＤｂｚリンカー２は、回転シェーカーで、室温で１．５時間、ｍＱ水（２００μＬ）中の３６ｍＭの亜硝酸イソペンチルとのインキュベーションによって活性化された。固体支持体をｍＱ水（２×２００μＬ）で洗浄した。活性化されたリンカーは、ｍＱ水（６０μＬ）中の２５％ＤＭＳＯ中の１００ｍＭ水酸化リチウム（ＬｉＯＨ）で開裂された。ＬＣＭＳ分析は、所望の自己精製された核酸コードライブラリーメンバーを示した（図２９Ｃ、図３０）。図２９Ｃは、第２のリンカーＤｂｚを開裂した後に得られたサンプルのクロマトグラムを示している。クロマトグラムは、自己精製された核酸コードライブラリーメンバーを示している。所望の自己精製核酸コードライブラリーメンバーの構造を示す（図２９Ｃ）。図３０Ａは、２６０ｎｍの吸光度のクロマトグラムを示している。図３０Ｂは、２８０ｎｍの吸光度のクロマトグラムを示している。図３０Ｃは、３．９４分での生成物ピークの質量スペクトルを示す。図３０Ｄは、３．９４分での生成物ピークのデコンボリューションされた質量スペクトルを示す。所望の自己精製核酸モデル核酸コードライブラリーメンバーに対応する質量が観察される。所望の自己精製モデル核酸コードライブラリーメンバーは、ステップ６．１６で得られる主要な生成物である。

実施例７：モデル核酸コードライブラリーメンバーの自己精製
ステップ７．１ Ｎ^２－［（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ）カルボニル］－Ｎ^６－［（４－メチルフェニル）ジフェニルメチル］－Ｌ－リジン（Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）－ＯＨ）へのカップリング
アミン官能化固体支持体（官能化 ＰｒｏＭａｇ（登録商標）１、Ｂａｎｇｓ Ｌａｂａｒｏｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）（５０μＬ）を、一般的な手順３に従って、Ｎ^２－［（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ）カルボニル］－Ｎ^６－［（４－メチルフェニル）ジフェニルメチル］－Ｌ－リジン（Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）－ＯＨ）にカップリングした。

ステップ７．２ Ｆｍｏｃ脱保護
官能化ビーズ（５０μＬ）は、一般的な手順４に従ってＦｍｏｃ脱保護された。

ステップ７．３ ４－（ヒドロキシメチル）安息香酸（ＨＭＢＡ）へのカップリング
一般的な手順３に従って、アミン官能化固体支持体（５０μＬ）を、４－（ヒドロキシメチル）安息香酸（ＨＭＢＡ）にカップリングさせた。

ステップ７．４（２Ｓ）－２－［［（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ）カルボニル］アミノ］－４－ペンチン酸（Ｆｍｏｃ－Ｐｒａ－ＯＨ）へのカップリング
アルコール官能化固体支持体（５０μＬ）を、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（２００μＬ）で洗浄した。官能化ビーズを、１００ｍＭのジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、５．７６ｍＭ のＮ，Ｎ－ジメチル－４－ピリジンアミン（ＤＭＡＰ）及び８０ｍＭ（２Ｓ）－２－［［（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ）カルボニル］アミノ］－４－ペンチン酸（Ｆｍｏｃ－Ｐｒａ－ＯＨ）含有ジメチルホルムアミド（１５０μＬ）の溶液と、回転シェーカーで、４℃で４時間インキュベートした。官能化されたビーズを、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を用いて洗浄した（６×２００μＬ）。

ステップ７．５ Ｆｍｏｃ脱保護
官能化ビーズ（５０μＬ）は、一般的な手順４に従ってＦｍｏｃ脱保護された。

ステップ７．６ Ｆｍｏｃ－Ｄｂｚ－ＯＨへのカップリング
アミン官能化固体支持体（５０μＬ）を、一般手順３に従って４－アミノ－３－［［（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ）カルボニル］アミノ］安息香酸（Ｆｍｏｃ－Ｄｂｚ－ＯＨ）にカップリングさせた。

ステップ７．７ Ｍｔｔ脱保護
官能化ビーズ（５０μＬ）を、５０％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸を含むジクロロメタン（６００μＬ）で、室温で、回転シェーカー上で３分間インキュベートした（ステップを３回繰り返した）。官能化ビーズを、ジメチルホルムアミド中の１０％（ｖ／ｖ）Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（３×２００μＬ）で洗浄し、次にジメチルホルムアミド（３×２００μＬ）で洗浄した。

ステップ７．８ 固体支持体へのオリゴヌクレオチドの結合
５ｎｍｏｌの５’－アジド修飾一本鎖オリゴヌクレオチド（実施例１で合成）を、一般手順６に従って、述べた２倍の量を使用して、アルキン官能化ビーズ（５０μＬ）に結合させた。

ステップ７．９低分子アルキンクエンチング
ＤＮＡ結合後の官能化ビーズ（５０μＬ）を、アジ化ベンジルでＣｕＡＡＣ条件に供し、未反応のアルキン官能基をクエンチした。官能化固体支持体（５０μＬ）を、ＤＭＳＯ（３×２００μＬ）で洗浄した。固体支持体は、５０ｍＭベンジルアジド、９９３μＭの１－（フェニルメチル）－Ｎ，Ｎ－ビス［［１－（フェニルメチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－４－イル］メチル］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－４－メタンアミン（ＴＢＴＡ）、９４５μＭの硫酸銅（ＣｕＳＯ４）、及び５．６７２ｍＭのアスコルビン酸ナトリウム（ＮａＡｓｃ）８９％のＤＭＳＯ含有のｍＱ水（３６０μＬ）の混合物中で、室温で１時間、回転シェーカーでインキュベートした。固体支持体を、ＤＭＳＯ（３×２００μＬ）で洗浄した。官能化された固体支持体の５μＬを分析用に保管した。

ステップ７．１０ ５－アジドペンタン酸へのカップリング（固体支持体上の反応ｏｎ－ＤＮＡ）
Ｎ^３－（エチルカルボンイミドイル）－Ｎ^１，Ｎ^１－ジメチル－１，３－プロパンジアミン（ＥＤＣ）及び１－ヒドロキシ－２，５－ジオキソ－３－ピロリジンスルホン酸（Ｓ－ＮＨＳ）の５０ｍｇ／ｍＬのストックを、１００ｍＭの２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液（ｐＨ４．５）中で調製した。各ストックの４０μＬを、ジメチルホルムアミド中の４５０ｍＭの５－アジドペンタン酸１２０μＬと混合して、最終容積を２００μＬにした。その溶液を、室温で１５分間インキュベートした。次に、この溶液を官能化ビーズ（４５μＬ）に加え、その反応物を室温で２時間回転シェーカーに置いておいた。官能化ビーズをジメチルホルムアミド（３×２００μＬ）で洗浄した。官能化された固体支持体の５μＬを分析用に保管した。

ステップ７．１１ Ｆｍｏｃ脱保護
官能化ビーズ（４０μＬ）は、記載された容積の８０％を使用して、一般手順４に従ってＦｍｏｃ脱保護された。

ステップ７．１２ ５－ヘキシン酸へのカップリング
官能化固体支持体（４０μＬ）を、ＤＭＳＯ（２００μＬ）で洗浄した。固体支持体を、５ｍＭの３－ヒドロキシ－３Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジン（ＨＯＡｔ）、５００ｍＭの５－ヘキシン酸、及び５０ｍＭのＮ^３－（エチルカルボンイミドイル）－Ｎ^１，Ｎ^１－ジメチル－１，３－プロパンジアミン（ＥＤＣ）のＤＭＳＯ（５００μＬ）中の溶液中で、回転シェーカーで、室温で２時間インキュベートした。固体支持体をＤＭＳＯ（３×２００μＬ）で洗浄して、官能化された固体支持体の１０μＬを分析用に保管した。

ステップ７．１３ ＣｕＡＡＣによる環化
アルキン及びアジド官能化固体支持体（３０μＬ）を、ＤＭＳＯ（３×２００μＬ）で洗浄した。

固体支持体は、９９３μＭの１－（フェニルメチル）－Ｎ，Ｎ－ビス［［１－（フェニルメチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－４－イル］メチル］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－４－メタンアミン（ＴＢＴＡ）、９４５μＭの硫酸銅（ＣｕＳＯ_４）、及び５．６７２ｍＭのアスコルビン酸ナトリウム（ＮａＡｓｃ）を含有するｍＱ水（３６０μＬ）中の８９％のＤＭＳＯの混合物中で、室温で１時間、回転シェーカーでインキュベートした。固体支持体を、ＤＭＳＯ（３×２００μＬ）で洗浄した。

自己精製
ステップ７．１４リンカー１の開裂
官能化された固体支持体（３０μＬ）の場合、ＨＭＢＡリンカー１は、回転シェーカーで、４０℃で１．５時間、ｍＱ水（６０μＬ）中の２５％のＤＭＳＯ中の１００ｍＭの水酸化リチウム（ＬｉＯＨ）によって開裂された。

ステップ７．１５リンカー２（末端リンカー）の開裂
官能化された固体支持体（３０μＬ）について、Ｄｂｚリンカー２は、回転シェーカーで、室温で２時間、ｍＱ水（２００μＬ）中の３６ｍＭの亜硝酸イソペンチルとのインキュベーションによって活性化された。固体支持体をｍＱ水（２×２００μＬ）で洗浄した。活性化されたリンカーは、ｍＱ水（６０μＬ）中の２５％ＤＭＳＯ中の１００ｍＭの水酸化リチウム（ＬｉＯＨ）で開裂された。開裂溶液をＬＣＭＳによって分析した（図３６）。図３６Ａは、２６０ｎｍの吸光度のクロマトグラムを示している。図３６Ｂは、２８０ｎｍの吸光度のクロマトグラムを示している。図３６Ｃは、３．９７分での生成物ピークの質量スペクトルを示す。図３６Ｄは、３．９７分での生成物ピークのデコンボリューションされた質量スペクトルを示す。所望の自己精製核酸モデル核酸コードライブラリーメンバーに対応する質量が観察される。この実施例はさらに、開裂前にＤｂｚリンカーが活性化されていることを示している。

実施例８：固体支持体でのＤＮＡライゲーション
アダプター（配列３）：
３’－ＣＣＴＣＧＡＡＧＡＣＴＴＡＡＧＡＣＡＣＡＣＧＡＣ－５’
コード（配列４）：
５’ｄ Ｐｈｏｓ－ＣＴＧＴＧＴＧＣＴＧＡＣＡＧＣＴＣＧＡＧＴＣＣＣＡＴＧＧＣＧＣ３’
分子量＝９５８４．１６Ｄａ、ε_２６０＝２８０３００Ｍ^－１ｃｍ^－１

ステップ８．１ エチレンジアミンへのカップリング
カルボン酸官能化磁性固体支持体（ＰｒｏＭａｇ（登録商標）１、Ｂａｎｇｓ Ｌａｂａｒｏｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）（２５μＬ）を、ＤＭＳＯ（１×１ｍＬ）及びジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（２×１ｍＬ）で洗浄した。官能化ビーズを、３６０ｍＭ ＨＡＴＵ、３６０ｍＭ エチレンジアミン、及び１．１ＭのＤＩＰＥＡのＤＭＦ溶液（２５μＬ、２×３０分）とインキュベートした。官能化されたビーズを、ジメチルホルムアミドを用いて洗浄した（３×２００μＬ）。

ステップ８．２ ４－（ヒドロキシメチル）安息香酸（ＨＭＢＡ）へのカップリング
アミン官能化固体支持体（２５μＬ）を、一般手順３に従って、それぞれの記載された容積の半分を使用して、４－（ヒドロキシメチル）安息香酸（ＨＭＢＡ）にカップリングした。

ステップ８．３ Ｎ^２－［（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ）カルボニル］－Ｎ^６－［（４－メチルフェニル）ジフェニルメチル］－Ｌ－リジン（Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）－ＯＨ）へのカップリング
アミン官能化固体支持体（２５μＬ）を、Ｎ^２－［（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ）カルボニル］－Ｎ^６－［（４－メチルフェニル）ジフェニルメチル］－Ｌ－リジン（Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｍｔｔ））－ＯＨ）に対して、それぞれ記載された容積の半分を使用して、一般手順３に従ってカップリングした。

ステップ８．４ Ｆｍｏｃ脱保護
官能化ビーズ（２５μＬ）は、それぞれ記載された容積の半分を使用して、一般的な手順４に従ってＦｍｏｃ脱保護された。

ステップ８．５ １－（９Ｈ－フルオレン－９－イルメチル）５，８，１１，１４－テトラオキサ－２－アザヘプタデカンジオエート（Ｆｍｏｃ－ＰＥＧ_４－ＯＨ）へのカップリング
アミン官能化固体支持体（２５μＬ）を、一般手順３に従って、それぞれ記載された容積の半分を使用して、１－（９Ｈ－フルオレン－９－イルメチル）５，８，１１，１４－テトラオキサ－２－アザヘプタデカンジオエート（Ｆｍｏｃ－ＰＥＧ_４－ＯＨ）にカップリングさせた。

ステップ８．６ Ｆｍｏｃ脱保護
官能化ビーズ（２５μＬ）は、それぞれ記載された容積の半分を使用して、一般的な手順４に従ってＦｍｏｃ脱保護された。

ステップ８．７ ５－ヘキシン酸へのカップリング
アミン官能化固体支持体（２５μＬ）を、一般手順３に従って、それぞれの記載された容積の半分を使用して、５－ヘキシン酸にカップリングした。

ステップ８．８ Ｍｔｔ脱保護
官能化ビーズ（２５μＬ）を、５０％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸を含むジクロロメタン（３００μＬ）で、室温で、回転シェーカー上で３分間インキュベートした（ステップを３回繰り返した）。官能化ビーズを、ジメチルホルムアミド中の１０％（ｖ／ｖ）Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（３×２００μＬ）で洗浄し、次にジメチルホルムアミド（３×２００μＬ）で洗浄した。

ステップ８．９ 固体支持体へのオリゴヌクレオチドの結合
１ｎｍｏｌの５’－アジド修飾一本鎖オリゴヌクレオチド（実施例１で合成）を、一般手順６に従って官能基化固体支持体（２５μＬ）に結合させたが、塩化リチウムは使用しなかった。

ステップ８．１０ 固体支持体上でのライゲーション
ライゲーションの手順は、Ｐｅｎｇｐｕｍｋｉａｔ ｅｔ ａｌ ２０１６から適合された。官能化された固体支持体を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２Ｍ ＮａＣｌ、及び０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０、ｐＨ７．４（１×２００μＬ）の溶液で洗浄した。次に、官能化された固体支持体をｍＱ水（２×２００μＬ）で洗浄した。官能化された固体支持体（２５μＬ）に、１．９ ｎｍｏｌ アダプター（配列３）を含む９０μＬのｍＱ水と、１００ｍＭのＴｒｉｓ、５００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４の溶液１０μＬを加えた。その混合物を９５℃で１０分間加熱した。サンプルを室温まで１時間放冷した。１．５ｎｍｏｌのコード（配列４）、１７μＬのｍＱ水、２μＬの１０×Ｔ４リガーゼ緩衝液（５００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１００ｍＭのｍｇＣｌ_２、１０ｍＭのＡＴＰ、１００ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ ７．５、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）及び６００ Ｕ（１μＬ）Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を混合物に加え、ライゲーションを室温で１８時間行った。官能化された固体支持体を、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０、ｐＨ７．４）で洗浄した。

ステップ８．１１ ＬＣＭＳ分析のための固体支持体からのオリゴヌクレオチド開裂
官能化された固体支持体（２５μＬ）を、ｍＱ水（６０μＬ）中の２５％のＤＭＳＯ中の１００ｍＭの水酸化リチウム（ＬｉＯＨ）とともに、回転シェーカーで、４０℃で１時間インキュベートした。そのサンプルをろ過し、ＬＣＭＳで分析した（図３７、図３８）。（図３７Ａ）は、固体支持体上でのＤＮＡライゲーションの模式図を示す。コードは、アダプターオリゴヌクレオチド及びＴ４ ＤＮＡリガーゼを使用して、固体支持体に結合したオリゴヌクレオチドに連結される。２６０ｎｍの吸光度のＬＣＭＳクロマトグラム（図３７Ｂ）は、ライゲーション条件の後にエステルリンカーを開裂することによって得られた（ステップ８．１１）。ライゲーション産物は４．４７分で見られる。残りのアダプター、コード、及びライゲーションされていない出発物質をさらに観察した。図３７Ｃは、ライゲーション生成物ピークのデコンボリューションされた質量スペクトルを示している。所望のライゲーション産物の質量が観察された。図３８は、デコンボリューションされた質量スペクトルを、（図３８Ａ）アダプターオリゴヌクレオチド、（図３８Ｂ）コードについて、及び（図３８Ｃ）出発物質ピークを図３７Ｂに示されるＬＣＭＳクロマトグラムについて示す。

実施例９：固体支持体上のｏｎ－ＤＮＡ上の反応
カルボン酸官能化固体支持体（官能化ＰｒｏＭａｇ（登録商標）１、Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用した。

ステップ９．１ Ｎ－Ｂｏｃ－エタノールアミンへのカップリング
カルボン酸官能化磁気固体支持体（５０μＬ）を、ＤＭＳＯ（１×１ｍＬ）及びジメチルホルムアミド（２×１ｍＬ）で洗浄した。官能化ビーズを、３６０ｍＭ ＨＡＴＵ、３６０ｍＭＮ－Ｂｏｃ－エタノールアミン及び１．１ＭのＤＩＰＥＡを含有するＤＭＦ（２５μＬ、２×３０分）とインキュベートした。官能化されたビーズを、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を用いて洗浄した（３×２００μＬ）。

ステップ９．２ Ｂｏｃ脱保護
官能化ビーズ（５０μＬ）を、ジクロロメタン（６００μＬ）中の５０％（ｖ／ｖ）のトリフルオロ酢酸とともに室温で、回転シェーカー上で５分間インキュベートした。次に、ビーズを、室温で回転振とう機上で１５分間、ジクロロメタン中の５０％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸の新鮮な溶液（６００μＬ）と再度インキュベートした。官能化ビーズを、１×ＰＢＳ ｐＨ７．４（３×６００μＬ）で洗浄し、次にジメチルホルムアミド（３×６００μＬ）で洗浄した。

ステップ９．３（２Ｓ）－２－［［（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ）カルボニル］アミノ］－４－ペンチン酸（Ｆｍｏｃ－Ｐｒａ－ＯＨ）へのカップリング
アミン官能化固体支持体（５０μＬ）を、一般手順３に従って（２Ｓ）－２－［［（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ）カルボニル］アミノ］－４－ペンチン酸（Ｆｍｏｃ－Ｐｒａ－ＯＨ）にカップリングさせた。

ステップ９．４Ｆｍｏｃ脱保護
官能化ビーズ（５０μＬ）は、一般的な手順４に従ってＦｍｏｃ脱保護された。

ステップ９．５ 固体支持体へのオリゴヌクレオチドの結合
２ｎｍｏｌの５’－アジド修飾一本鎖オリゴヌクレオチド（実施例１で合成）を、一般手順６に従って、それぞれ記載した容積の２倍を使用して、アルキン官能化ビーズ（５０μＬ）に結合させた。

ステップ９．６ ＬＣＭＳ分析のための固体支持体からの２５μＬビーズのオリゴヌクレオチド開裂
官能化された固体支持体（２５μＬ）の半分を、ｍＱ水（６０μＬ）中の２５％のＤＭＳＯ中の１００ｍＭの水酸化リチウム（ＬｉＯＨ）とともに、回転シェーカーで、４０℃で１時間インキュベートした。サンプルをろ過して、ＬＣＭＳで分析した。図４０Ａは、２６０ｎｍでのクロマトグラム、及び出発物質の化学構造を示す。図４０Ａで観察された主要なピークは、所望の出発物質に対応する。クロマトグラム（図４０Ａ）の主要ピークの保持時間におけるデコンボリューションされた質量スペクトルを図４０Ｃに示す。所望の出発物質に対応する質量が観察される。

ステップ９．７ ５－アジドペンタン酸へのカップリング（固体支持体上の反応ｏｎ－ＤＮＡ）
ステップ９．５で調製した機能化固体支持体（２５μＬ）の残りの半分を使用した。Ｎ^３－（エチルカルボンイミドイル）－Ｎ^１，Ｎ^１－ジメチル－１，３－プロパンジアミン（ＥＤＣ）及び１－ヒドロキシ－２，５－ジオキソ－３－ピロリジンスルホン酸（Ｓ－ＮＨＳ）の５０ｍｇ／ｍＬのストックを、１００ｍＭの２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液（ｐＨ４．５）中で調製した。各ストックの２０μＬを、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の４５０ｍＭの５－アジドペンタン酸６０μＬと混合して、最終容積を１００μＬにした。その溶液を、室温で１５分間インキュベートした。次に、この溶液を官能化ビーズ（２５μＬ）に加え、その反応物を室温で２時間回転シェーカーに置いておいた。官能化されたビーズを、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を用いて洗浄した（３×２００μＬ）。

ステップ９．８ ＬＣＭＳ分析のための固体支持体からのオリゴヌクレオチド開裂
ステップ９．７で調製された官能化された固体支持体（２５μＬ）を、ｍＱ水（６０μＬ）中の２５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中の１００ｍＭの水酸化リチウム（ＬｉＯＨ）とともに、回転シェーカーで、４０℃で１時間インキュベートした。サンプルをろ過し、ＬＣＭＳで分析した。図４０Ｂは、２６０ｎｍでのクロマトグラム及び所望の生成物の化学構造を示している。図４０Ｂで観察された主要なピークは、所望の生成物に対応する。クロマトグラム（図４０Ｂ）の主要な生成物の保持時間でデコンボリューションされた質量スペクトルを図４０Ｄに示す。所望の生成物に対応する質量が観察される。この実施例によって、高い変換率でＤＮＡ上の固体支持体上で化学変換が実行され得ることが示される。

参考文献
（１）Ａｇｏｕｒｉｄａｓ，Ｖ ｅｔ ａｌ Ｎａｔｉｖｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｄｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，Ｃａｔａｌｙｓｉｓ，Ｓｃｏｐｅ，ａｎｄ Ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｊｕｎｅ ２６，２０１９．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ａｃｓ．ｃｈｅｍｒｅｖ．８ｂ００７１２．
（２）Ｌｉ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｌｅａｖａｇｅ ｂｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｏｘａｌｉｎｅｓ ｗｉｔｈ Ｏｒｔｈｏ －Ｄｉｔｈｉｏｐｈｅｎｏｌｓ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍｉｅ ｌｎｔ．Ｅｄ．２０２０，５９（９），３６７１－３６７７．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００２／ａｎｉｅ．２０１９１３６２０．
（３）Ｇｌｅｓｓ Ｂ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．Ｄｉｒｅｃｔ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｏｎｅ－Ｐｏｔ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＭｅＤｂｚ Ｌｉｎｋｅｒ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２０１８，８３（１７），１０５２５－１０５３４．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ａｃｓ．ｊｏｃ．８ｂ０１２３７．
（４）Ｆａｎ，Ｌ．；Ｄａｖｉｅ，Ｃ．Ｐ．Ｚｉｒｃｏｎｉｕｍ（ＩＶ）－Ｃａｔａｌｙｚｅｄ Ｒｉｎｇ Ｏｐｅｎｉｎｇ ｏｆ ｏｎ－ＤＮＡ Ｅｐｏｘｉｄｅｓ ｉｎ Ｗａｔｅｒ．ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ ２０１７，１８（９），８４３－８４７．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００２／ｃｂｉｃ．２０１６００５６３．
（５）Ｓｅｒｒａ，Ｇ．；ｅｔ ａｌ．Ｏｎ－Ｒｅｓｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｃｙｃｌｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｖｉａ Ｔａｎｄｅｍ Ｎ －ｔｏ－Ｓ Ａｃｙｌ Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｌｎｔｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｉｏｌ Ａｄｄｉｔｉｖｅ－Ｆｒｅｅ Ｎａｔｉｖｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌｉｇａｔｉｏｎ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０２０，５６（６），９５６－９５９．
ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３９／ｃ９ｃｃ０７７８３ａ．
（６）Ｋｏｎｄａｓｉｎｇｈｅ，Ｔ．Ｄ．ｅｔ ａｌ Ｄｉｒｅｃｔ Ｐａｌｌａｄｉｕｍ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ ｏｎ－Ｒｅｓｉｎ Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ Ａｌｌｏｃａｍ Ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０１７，１５（１４），２９１４－２９１８．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３９／ｃ７ｏｂ００５３６ａ．
（７）Ｍｅｎｄｅ，Ｆ．；Ｓｅｉｔｚ，０．Ｓｏｌｉｄ－Ｐｈａｓｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｈｉｏｅｓｔｅｒｓ ｗｉｔｈ Ｓｅｌｆ－Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍｉｅ ｌｎｔ．Ｅｄ．２００７，４６（２４），４５７７－４５８０．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００２／ａｎｉｅ．２００７００３５６．
（８）Ｍｅｎｄｅ，Ｆ．；Ｂｅｉｓｓｗｅｎｇｅｒ，Ｍ．；Ｓｅｉｔｚ，Ｏ．Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｆｍｏｃ－Ｂａｓｅｄ Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｈｉｏｅｓｔｅｒｓ ｗｉｔｈ Ｓｅｌｆ－Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｅｆｆｅｃｔ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ＳＨ３ Ｄｏｍａｉｎｓ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１０，１３２（３２），１１１１０－１１１１８．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ｊａ１０１７３２ａ．
（９）Ｌｉｕ，Ｈ．；Ｌｉ，Ｘ．Ｓｅｒｉｎｅ／Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ Ｌｉｇａｔｉｏｎ：Ｏｒｉｇｉｎ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ Ａｓｐｅｃｔｓ，ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２０１８，５１（７），１６４３－１６５５．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ａｃｓ．ａｃｃｏｕｎｔｓ．８ｂ００１５１．
（１０）Ｃｌａｒｋ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ａ．Ｄｅｓｉｇｎ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ－Ｅｎｃｏｄｅｄ Ｓｍａｌｌ－Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２００９，５（９），６４７－６５４．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｎｃｈｅｍｂｉｏ．２１１．
（１１）Ｒｈｏｄｅｓ，Ｃ．Ａ．；Ｐｅｉ，Ｄ．Ｂｉｃｙｃｌｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｓ Ｎｅｘｔ－Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｃｈｅｍ．Ａ Ｅｕｒ．Ｊ．２０１７，２３（５２），１２６９０－１２７０３．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００２／ｃｈｅｍ．２０１７０２１１７．
（１２）Ｍａｌｏｎｅ，Ｍ．Ｌ，Ｐａｅｇｅｌ，Ｂ．Ｍ．，Ｗｈａｔ ｉｓ ａ “ＤＮＡ－Ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ” Ｒｅａｃｔｉｏｎ？，ＡＣＳ Ｃｏｍｂ．Ｓｃｉ．２０１６，１８（４），１８２－１８７．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ａｃｓｃｏｍｂｓｃｉ．５ｂ００１９８．
（１３）Ｄｅｃｕｒｔｉｎｓ，Ｗ．，Ｗｉｃｈｅｒｔ，Ｍ．，Ｆｒａｎｚｉｎｉ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｆｏｒ ｓｍａｌｌ ｏｒｇａｎｉｃ ｌｉｇａｎｄｓ ｕｓｉｎｇ ＤＮＡ－ｅｎｃｏｄｅｄ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ １１，７６４－７８０（２０１６）．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１６．０３９
（１４）Ｓｅｌｖａｒａｊ，Ａ．；Ｃｈｅｎ，Ｈ．－Ｔ．；Ｙａ，Ａ．；Ｈｕａｎｇ，Ｔ．；Ｋａｏ，Ｃ．－Ｌ．Ｅｘｐｅｄｉｅｎｔ Ｏｎ－Ｒｅｓｉｎ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃ－Ｔｅｒｍｉｎｕｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ａ Ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ Ｌｉｎｋｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，２０１８，９，３４５－３４９．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３９／Ｃ７ＳＣ０３２２９Ｃ．
（１５）Ａｎｄｒｅｗ Ｂ．ＭａｃＣｏｎｎｅｌｌ，Ｐａｔｒｉｃｋ Ｊ．ＭｃＥｎａｎｅｙ，Ｖａｌｅｒｉｅ Ｊ．Ｃａｖｅｔｔ，ａｎｄ Ｂｒｉａｎ Ｍ．Ｐａｅｇｅｌ，ＡＣＳ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１５ １７（９），５１８－５３４，ＤＯＩ：１０．１０２１／ａｃｓｃｏｍｂｓｃｉ．５ｂ００１０６
（１６）Ｐｅｎｇｐｕｍｋｉａｔ Ｓ，Ｋｏｅｓｄｊｏｊｏ Ｍ，Ｒｏｗｌｅｙ ＥＲ，Ｍｏｃｋｌｅｒ ＴＣ，Ｒｅｍｃｈｏ ＶＴ（２０１６）．ＰＬＯＳ ＯＮＥ １１（３）：ｅ０１４９７７４．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１４９７７４
（１７）Ｓｃｏｔｔ，Ｐ．Ｊ．Ｈ．Ｌｉｎｋｅｒ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ Ｓｏｌｉｄ－Ｐｈａｓｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｌｉｎｋ．Ｓｔｒａｔｅｇ．Ｓｏｌｉｄ－Ｐｈａｓｅ Ｏｒｇ．Ｓｙｎｔｈ．１－６７７（２００９）．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ／１０．１００２／９７８０４７０７４９０４３．
（１８）Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈ．Ｔｈｉｒｄ Ｅｄ．１－１１４６（２０１３）ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／Ｃ２００９－０－６４２４０－９．
（１９）Ｌｅｒｉｃｈｅ，Ｇ．，Ｃｈｉｓｈｏｌｍ，Ｌ．＆ Ｗａｇｎｅｒ，Ａ．Ｃｌｅａｖａｂｌｅ ｌｉｎｋｅｒｓ ｉｎ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０，５７１－５８２（２０１２）．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｂｍｃ．２０１１．０７．０４８
（２０）Ｃｈａｕｄｈｕｒｉ，Ｒ．Ｇ．＆ Ｐａｒｉａ，Ｓ．Ｃｏｒｅ／Ｓｈｅｌｌ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ：Ｃｌａｓｓｅｓ，Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１１２，２３７３－２４３３（２０１１）．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ｃｒ１００４４９ｎ
（２１）Ｗｕ，Ｗ．，Ｈｅ，Ｑ．＆ Ｊｉａｎｇ，Ｃ．Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｉｒｏｎ Ｏｘｉｄｅ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚａｔｉｏｎ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ．Ｎａｎｏｓｃａｌｅ Ｒｅｓ．Ｌｅｔｔ．２００８ ３１１ ３，３９７－４１５（２００８）．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００７／ｓ１１６７１－００８－９１７４－９
（２２）Ｐｏｎ，Ｒ．Ｔ．Ｓｏｌｉｄ‐Ｐｈａｓｅ Ｓｕｐｐｏｒｔｓ ｆｏｒ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍ．００，（２０００）．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００２／０４７１１４２７００．ｎｃ０３０１ｓ００
（２３）Ｗａｎｇ，Ｗ．，Ｋｈｏｊａｓｔｅｈ，Ｓ．Ｃ．＆ Ｓｕ，Ｄ．Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｍｏｌ．２６，３３３８（２０２１）．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３３９０／ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ２６１１３３３８
（２４）Ｚｈａｎｇ，Ｒ．Ｙ．，Ｔｈａｐａ，Ｐ．，Ｅｓｐｉｒｉｔｕ，Ｍ．Ｊ．，Ｍｅｎｏｎ，Ｖ．＆ Ｂｉｎｇｈａｍ，Ｊ．Ｐ．Ｆｒｏｍ ｎａｔｕｒｅ ｔｏ ｃｒｅａｔｉｏｎ：Ｇｏｉｎｇ ａｒｏｕｎｄ ｉｎ ｃｉｒｃｌｅｓ，ｔｈｅ ａｒｔ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２６，１１３５－１１５０（２０１８）．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｂｍｃ．２０１７．１１．０１７

Claims (54)

1. 核酸コード化合物の製造方法であって、以下のステップ；
   リンカーによって固体支持体に接続された足場を含む新生化合物を提供することと、
   １つ以上の化学ビルディングブロックを前記新生化合物に共有結合させて、前記足場に結合した化学部分を形成することと、
   前記１つ以上の化学ビルディングブロックをコードするコーディングオリゴヌクレオチドを前記新生化合物に共有結合させて、前記足場に結合したコーディング核酸部分を形成することと、
   開裂基を前記化学部分、コーディング核酸部分、または足場に結合することと、
   前記リンカーが開裂され、前記核酸コード化合物が前記固体支持体から遊離されるように、前記リンカーと前記開裂基を反応させることと、
   を含む前記方法。
2. 核酸コード化学ライブラリーを生成するための方法であって、ライブラリーメンバーごとに、以下のステップ；
   リンカーによって固体支持体に接続された足場を含む新生化合物を提供することと、
   １つ以上の化学ビルディングブロックを前記新生化合物に共有結合させて、前記足場に結合した化学部分を形成することと、
   前記１つ以上の化学ビルディングブロックをコードするコーディングオリゴヌクレオチドを前記新生化合物に共有結合させて、前記足場に結合したコーディング核酸部分を形成することと、
   開裂基を前記化学部分、コーディング核酸部分、または足場に結合することと、
   前記リンカーが開裂され、前記ライブラリーメンバーが前記固体支持体から遊離されるように、前記リンカーと前記開裂基とを反応させることと、
   を含む前記方法。
3. 請求項１または２に記載の方法であって、前記新生化合物の前記足場が、第１のリンカー及び第２のリンカーによって前記固体支持体に接続されており、さらに以下；
   第１の開裂基及び第２の開裂基を前記新生化合物の化学部分または足場に結合させることと、
   前記第１のリンカーが開裂されるように、前記第１のリンカーと前記第１の開裂基とを反応させることと、
   前記第２のリンカーが開裂され、前記新生化合物が前記固体支持体から遊離されるように、前記第２のリンカーと前記第２の開裂基とを反応させることと、
   を含む前記方法。
4. 前記開裂基が前記化学部分または足場に結合している、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記開裂基が、前記化学部分の末端に位置する化学ビルディングブロックに共有結合している、請求項４に記載の方法。
6. 請求項４に記載の方法であって、前記開裂基が、前記化学部分または足場に対して、以下；
   アンカーオリゴヌクレオチドを前記化学部分または足場に結合させることと、
   開裂基に共有結合した補助オリゴヌクレオチドを提供することと、
   前記補助オリゴヌクレオチドと前記アンカーオリゴヌクレオチドとをハイブリダイズさせることと、
   前記リンカーが開裂されるように、前記リンカーと前記開裂基とを反応させることと、を含む方法によって結合される、前記方法。
7. 前記開裂基が前記コーディング核酸部分に結合している、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
8. 請求項７に記載の方法であって、前記開裂基が、前記コーディング核酸部分に対して、以下；
   開裂基に共有結合した補助オリゴヌクレオチドを提供することと、
   前記開裂基に対して共有結合された前記補助オリゴヌクレオチドを前記コーディング核酸部分にハイブリダイズさせることと、
   前記リンカーが開裂されるように、前記リンカーと前記開裂基とを反応させることと、を含む方法によって結合される、前記方法。
9. 前記開裂基との反応前に前記リンカーが前記開裂基と反応可能となるように活性化される、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
10. 前記リンカーとの反応前に前記開裂基が前記リンカーと反応可能となるように活性化される、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
11. 核酸コード化合物の製造方法であって、
    第１のリンカーによって固体支持体に接続された足場を含む新生化合物を提供することと、
    １つ以上の化学ビルディングブロックを前記新生化合物に共有結合させて、前記足場に結合した化学部分を形成することと、
    前記１つ以上の化学ビルディングブロックをコードするコーディングオリゴヌクレオチドを前記新生化合物に共有結合させて、前記足場に結合したコーディング核酸部分を形成することと、
    前記新生化合物の前記化学部分を第２のリンカーで前記固体支持体に接続することと、
    前記第１のリンカーを開裂することと、
    前記核酸コード化合物が前記固体支持体から遊離されるように、前記第２のリンカーを開裂することと、を含む前記方法。
12. 核酸コード化学ライブラリーを生成するための方法であって、ライブラリーメンバーごとに、以下のステップ；
    第１のリンカーによって固体支持体に接続された足場を含む新生化合物を提供することと、
    １つ以上の化学ビルディングブロックを前記新生化合物に共有結合させて、前記足場に結合した化学部分を形成することと、
    前記１つ以上の化学ビルディングブロックをコードするコーディングオリゴヌクレオチドを前記新生化合物に共有結合させて、前記足場に結合したコーディング核酸部分を形成することと、
    前記ライブラリーメンバーの前記化学部分を第２のリンカーで前記固体支持体に接続することと、
    前記第１のリンカーを開裂することと、
    前記ライブラリーメンバーが前記固体支持体から遊離されるように、前記第２のリンカーを開裂させることと、を含む、前記方法。
13. 核酸コード化合物の製造方法であって、以下のステップ；
    第１のリンカーによって固体支持体に接続された足場を含む新生化合物を提供することと、
    １つ以上の化学ビルディングブロックを前記新生化合物に共有結合させて、前記足場に結合した化学部分を形成することと、
    前記１つ以上の化学ビルディングブロックをコードするコーディングオリゴヌクレオチドを前記新生化合物に共有結合させて、前記足場に結合したコーディング核酸部分を形成することと、
    前記足場またはコーディング核酸部分を第２のリンカーで前記固体支持体に接続することと、
    前記第１のリンカーを開裂することと、
    前記核酸コード化合物が前記固体支持体から遊離されるように、前記第２のリンカーを開裂することと、を含む前記方法。
14. 請求項２または１２に記載の核酸コード化学ライブラリーを生成するための方法であって、以下のステップ；
    新生化合物または前記核酸コード化学ライブラリーの合成過程で形成される中間体を別々のコンパートメントに分割することと、
    １つ以上の化学ビルディングブロックを前記新生化合物または中間体に結合することと、
    前記化学ビルディングブロックをコードする１つ以上のコーディングオリゴヌクレオチドを前記新生化合物または中間体に結合することと、
    部材または中間体を別々のコンパートメントから１つ以上のコンパートメントにプールすることと、を含む、方法によって生成される、前記方法。
15. 第１のコンパートメント内の新生化合物または中間体に結合した前記化学ビルディングブロック及びコーディングオリゴヌクレオチドが、第２のコンパートメント内の新生化合物または中間体に結合した前記化学ビルディングブロック及びコーディングオリゴヌクレオチドと異なる、請求項１４に記載の方法。
16. 請求項１４または１５に記載の方法において、該方法のステップを１回以上繰り返すことを含む方法。
17. 前記第１及び第２のリンカーが直交的に開裂可能である、請求項１１～１３のいずれか１項に記載の方法。
18. 前記第１及び／または第２のリンカーが開裂前に第１及び／または第２のリンカーが開裂可能となるように活性化される、請求項１１～１３及び１７のいずれか１項に記載の方法。
19. 前記化学ビルディングブロックが前記新生化合物に連続的に結合して前記化学部分を形成する、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。
20. 第１の化学ビルディングブロックを前記足場に共有結合させることを含む、請求項１～１９のいずれか１項に記載の方法。
21. 請求項２０に記載の方法であって、前記足場が捕捉基を含み、第１の化学ビルディングブロックを前記捕捉基と反応させて、前記第１の化学ビルディングブロックを前記足場に共有結合させることを含む、前記方法。
22. 前記第１の化学ビルディングブロックが近位結合基を含み、前記近位結合基を、前記足場の前記捕捉基と反応させて、前記第１の化学ビルディングブロックを前記足場に共有結合させることを含む、請求項２１に記載の方法。
23. 請求項２１または請求項２２に記載の方法であって、前記捕捉基が保護されており、前記化学部分の前記第１の化学ビルディングブロックの結合前に前記足場の前記捕捉基を脱保護することを含む、前記方法。
24. 前記方法が、前記第１の化学ビルディングブロックに共有結合していない未反応の捕捉基をキャッピングすることを含む、請求項２１～２３のいずれか１項に記載の方法。
25. 第２の化学ビルディングブロックを前記第１の化学ビルディングブロックに共有結合させて、末端位置に前記第２の化学ビルディングブロックを有する化学部分を形成することを含む、請求項２０～２４のいずれか１項に記載の方法。
26. 前記第１の化学ビルディングブロックが遠位結合基を含み、前記第２の化学ビルディングブロックを前記第１の化学ビルディングブロックの前記遠位結合基と反応させて、前記第２の化学ビルディングブロックを前記第１の化学ビルディングブロックに共有結合させることを含む、請求項２５に記載の方法。
27. 前記第２の化学ビルディングブロックが近位結合基を含み、前記第２の化学ビルディングブロックの前記近位結合基を前記第１の化学ビルディングブロックの前記遠位結合基と反応させて、前記第２の化学ビルディングブロックを前記第１の化学ビルディングブロックに共有結合させることを含む、請求項２６に記載の方法。
28. 前記第１の化学ビルディングブロックの前記遠位結合基が保護されており、前記第２の化学ビルディングブロックの結合前に前記第１の化学ビルディングブロックの前記遠位結合基を脱保護することを含む、請求項２６または請求項２７に記載の方法。
29. 前記第２の化学ビルディングブロックに共有結合していない前記第１の化学ビルディングブロックの未反応遠位結合基をキャッピングすることを含む、請求項２６～２８のいずれか１項に記載の方法。
30. さらなる化学ビルディングブロックを前記化学部分の前記末端位置で前記化学ビルディングブロックに結合させることを含む、請求項２５～２９のいずれか１項に記載の方法。
31. 請求項３０に記載の方法であって、前記末端位置の前記化学ビルディングブロックが遠位結合基を含み、前記さらなる化学ビルディングブロックを前記末端位置で前記化学ビルディングブロックの前記遠位結合基と反応させて、前記さらなる化学ビルディングブロックを共有結合させて、前記末端位置に前記さらなる化学ビルディングブロックを有する化学ビルディングブロックの鎖を形成することを含む、前記方法。
32. 請求項３１に記載の方法であって、前記さらなる化学ビルディングブロックが近位結合基を含み、前記末端位置で、前記さらなる化学ビルディングブロックの前記近位結合基を前記化学ビルディングブロックの前記遠位結合基と反応させて、前記さらなる化学ビルディングブロックを共有結合させることを含む、前記方法。
33. 請求項３１または請求項３２に記載の方法であって、前記末端位置で前記化学ビルディングブロックの前記遠位結合基が保護されており、前記さらなる化学ビルディングブロックの結合前に、前記末端位置で前記化学ビルディングブロックの前記遠位結合基を脱保護することを含む、前記方法。
34. 前記さらなる化学ビルディングブロックに共有結合していない、未反応の遠位結合基をキャッピングすることをさらに含む、請求項３１～３３のいずれか１項に記載の方法。
35. 請求項３０～３４に記載の方法を１回以上繰り返すことを含む方法。
36. 各化学ビルディングブロックをコードするコーディングオリゴヌクレオチドが前記新生化合物に順次付加されて前記コーディング核酸部分を形成し、前記新生化合物への前記化学ビルディングブロックの付加前、後または付加と同時に、化学ビルディングブロックをコードする前記コーディングオリゴヌクレオチドが前記新生化合物に付加される、請求項２５～２９のいずれか１項に記載の方法。
37. 前記第１の化学ビルディングブロックをコードする第１のコーディングオリゴヌクレオチドを前記足場に共有結合させることを含む、請求項３６に記載の方法。
38. 前記足場が結合オリゴヌクレオチドを含み、前記第１のコーディングオリゴヌクレオチドを前記結合オリゴヌクレオチドに共有結合させて、前記足場に結合したコーディング核酸部分を形成することを含む、請求項３７に記載の方法。
39. 前記第２の化学ビルディングブロックをコードする第２のコーディングオリゴヌクレオチドを前記コーディング核酸部分に共有結合させることを含む、請求項３７又は３８に記載の方法。
40. さらなる化学ビルディングブロックをコードする１つ以上のさらなるコーディングオリゴヌクレオチドを前記コーディング核酸部分に結合させることを含む、請求項３９に記載の方法。
41. 前記化学部分中の２つ以上の化学ビルディングブロックを架橋することを含む、請求項１～４０のいずれか１項に記載の方法。
42. 核酸コード化学ライブラリーを生成する方法であって、それぞれのメンバーについて、以下のステップ；
    リンカーによってアンカーに接続された足場を含む新生化合物を提供することであって、前記アンカーは固体支持体に接続される、前記提供することと、
    １つ以上の化学ビルディングブロックを前記新生化合物に共有結合させて、前記足場に結合した化学部分を形成することと、
    １つ以上の化学ビルディングブロックをコードする１つ以上のコーディングオリゴヌクレオチドを前記新生化合物に共有結合させて、前記アンカーに結合したコーディング核酸部分を形成することと、
    開裂基を前記化学部分に結合することと、
    前記新生化合物をコンパートメントに分離することと、
    前記リンカーが開裂され、前記足場が前記コンパートメントの前記固体支持体から遊離されるように、前記リンカーと前記開裂基とを反応させることと、
    を含む前記方法。
43. 核酸コード化学ライブラリーを生成する方法であって、それぞれのメンバーについて、以下のステップ；
    足場及びアンカーを含む新生化合物を提供することであって、ここで前記足場が第１のリンカーによって前記アンカーに接続され、前記アンカーが結合オリゴヌクレオチドを含み、固体支持体に結合されている、前記提供することと、
    １つ以上の化学ビルディングブロックを前記新生化合物に共有結合させて、前記足場に結合した化学部分を形成することと、
    １つ以上の化学ビルディングブロックをコードする１つ以上のコーディングオリゴヌクレオチドを前記結合オリゴヌクレオチドに共有結合させて、前記アンカーに結合したコーディング核酸部分を形成することと、
    前記化学部分に第２のリンカーを結合させて、前記化学部分を前記固体支持体に接続することと、
    前記第１のリンカーを開裂することと、
    前記新生化合物をコンパートメントに分離することと、
    前記第２のリンカーが開裂され、前記足場に結合した前記化学部分が前記コンパートメント内の前記固体支持体から遊離されるように、前記第２のリンカーを開裂させることと、を含む、前記方法。
44. 前記アンカーが結合オリゴヌクレオチドを含み、各化学ビルディングブロックをコードする前記コーディングオリゴヌクレオチドを前記結合オリゴヌクレオチドに順次付加して、前記アンカーに結合した前記コーディング核酸部分を形成する、請求項４２または４３に記載の方法。
45. 核酸コード化学ライブラリーを生成する方法であって、それぞれのメンバーについて、以下のステップ；
    リンカーによって固体支持体に接続された足場を含む新生化合物を提供することと、
    １つ以上の化学ビルディングブロックを前記新生化合物に共有結合させて、前記足場に結合した化学部分を形成することと、
    １つ以上の化学ビルディングブロックをコードする１つ以上のコーディングオリゴヌクレオチドを前記固体支持体に共有結合させて、前記固体支持体に結合したコーディング核酸部分を形成することと、
    開裂基を前記化学部分に結合することと、
    前記新生化合物をコンパートメントに分離することと、
    前記リンカーが開裂され、前記足場が前記コンパートメントの前記固体支持体から遊離されるように、前記リンカーと前記開裂基とを反応させることと、
    を含む前記方法。
46. 核酸コード化学ライブラリーを生成する方法であって、それぞれのメンバーについて、以下のステップ；
    第１のリンカーによって固体支持体に接続された足場を含む新生化合物を提供することであって、前記固体支持体が結合オリゴヌクレオチドを含む、前記提供することと、
    １つ以上の化学ビルディングブロックを前記新生化合物に共有結合させて、前記足場に結合した化学部分を形成することと、
    １つ以上の化学ビルディングブロックをコードする１つ以上のコーディングオリゴヌクレオチドを前記結合オリゴヌクレオチドに共有結合させて、前記固体支持体に結合したコーディング核酸部分を形成することと、
    前記化学部分に第２のリンカーを結合させて、前記化学部分を前記固体支持体に接続することと、
    前記第１のリンカーを開裂することと、
    前記新生化合物をコンパートメントに分離することと、
    前記第２のリンカーが開裂され、前記足場に結合した前記化学部分が前記コンパートメント内の前記固体支持体から遊離されるように、前記第２のリンカーを開裂させることと、
    を含む、前記方法。
47. 前記固体支持体が結合オリゴヌクレオチドを含み、各化学ビルディングブロックをコードする前記コーディングオリゴヌクレオチドが、前記結合オリゴヌクレオチドに順次付加されて、前記コーディング核酸部分を形成する、請求項４５または４６に記載の方法。
48. 前記コンパートメントが、アレイ上に位置する、請求項４２～４７のいずれか１項に記載の方法。
49. 前記新生化合物をさらに精製することを含む、請求項１～４８のいずれか１項に記載の方法。
50. 前記核酸コード化学ライブラリーをさらに精製することを含む、請求項２、１２、１４～１６、及び、４２～４８のいずれか一項に記載の方法。
51. 化合物またはライブラリーメンバーの多様な集団を生成することと、標的分子への結合について前記多様な集団をスクリーニングすることと、前記標的分子に結合する前記集団中のライブラリーメンバーを同定することと、をさらに含む、請求項１～５０のいずれか１項に記載の方法。
52. 請求項５１に記載の方法であって、
    リンカーによって固体支持体に接続された標識された足場を含む新生化合物を提供することと、
    同定されたライブラリーメンバーの前記化学部分を前記足場に共有結合させて、前記化学部分を含む標識された新生化合物を生成することと、
    開裂基を前記化学部分または足場に結合することと、
    前記リンカーを前記開裂基と反応させ、それによって前記リンカーを開裂し、前記固体支持体から標識されたライブラリーメンバーを遊離することと、
    前記遊離された標識されたライブラリーメンバーの前記標的分子への結合を決定することと、
    を含む、前記方法。
53. 請求項５１に記載の方法であって、
    第１のリンカーによって固体支持体に接続された標識された足場を含む新生化合物を提供することと、
    同定されたライブラリーメンバーの前記化学部分を前記足場に共有結合させて、前記化学部分を含む標識された新生化合物を生成することと、
    前記化学部分を第２のリンカーで前記固体支持体に接続することと、
    前記第１のリンカーを開裂することと、
    前記第２のリンカーを開裂し、前記固体支持体から標識されたライブラリーメンバーを遊離することと、
    前記遊離された標識されたライブラリーメンバーの前記標的分子への結合を決定することと、
    を含む、前記方法。
54. 請求項２、１２及び１４～１６のいずれか１項に記載の方法によって作製された核酸コードライブラリー。