JP7849049B2 - 機能性のイオン化可能なリン脂質 - Google Patents

機能性のイオン化可能なリン脂質

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、引用することにより本明細書の一部をなすものとする、「機能性のイオン化可能なリン脂質（FUNCTIONAL IONIZABLE PHOSPHOLIPIDS）」と題される２０２０年８月２１日に出願された米国仮特許出願第６３／０６８，９４４号に基づく優先権を主張する。
政府支援の自認
本発明は、アメリカ国立衛生研究所によって与えられた、認可番号ＥＢ０２５１９２の下で、政府支援を受けてなされた。政府は本発明における一定の権利を有する。
電子的に提供される配列表の引用による組み込み
配列表の電子版が本明細書に添えて提出され、その内容全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとする。電子ファイルは、サイズが２キロバイトであり、１０６５４６－６９７６７８＿ＵＴＳＤ ３７５９＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔと題される。
本開示は、機能性のイオン化可能な合成リン脂質、開示されるイオン化可能な合成リン脂質を含む医薬組成物、ならびに数ある用途の中でも、対象における遺伝子編集、選択的タンパク質発現、ｍＲＮＡ送達、および／または医薬品有効成分送達のための方法に関する。本開示はまた、カーゴを搭載した脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を含む医薬組成物に関する。
ゲノム編集技術は、ヒト疾患を処置するための高精度医療治療を設計する特有の機会を提供する多くの望ましい治療的特徴を有する。しかしながら、生物学的障壁を克服することが、依然として所望の細胞および組織標的へのこれらの治療剤の有効な送達における大きな課題である。現在、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）が、細胞膜を横切って遺伝子編集治療を送達するための最も一般的に使用されているビヒクルである。遺伝子送達のための最も有効なＬＮＰは、重要な生理化学的パラメータとしてイオン化可能アミンに依拠するが、多くのＬＮＰは依然としてエンドソーム脱出能力が不十分であるので、有意な量の遺伝子治療用カーゴが非機能性になる。よって、遺伝子編集治療を送達するための改善されたＬＮＰが当技術分野で必要とされている。
本明細書に開示される主題の性質を示すために以下の簡単な説明を提供する。本開示のある特定の態様が以下に記載されるが、この要約は本開示の範囲を限定することを意図するものではない。
本開示は、少なくとも部分的に、ナノ粒子および脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）に使用するためのイオン化可能な合成リン脂質の特定に基づく。一部の実施形態では、イオン化可能な合成リン脂質が、式（Ｉ）：
（式中、Ｒ１は、Ｃ２～Ｃ２０非置換アルキル、Ｃ２～Ｃ２０置換アルキル、Ｃ２～Ｃ２０非置換アルケニル、Ｃ２～Ｃ２０置換アルケニル、Ｃ２～Ｃ２０非置換アルキニル、Ｃ２～Ｃ２０置換アルキニル、Ｃ４～Ｃ２０非置換シクロアルキル、およびＣ４～Ｃ２０置換シクロアルキルからなる群から選択され；Ｒ２、およびＲ３は、Ｈ、Ｃ１～Ｃ２０非置換アルキル、Ｃ１～Ｃ２０置換アルキル、Ｃ１～Ｃ２０非置換アルケニル、Ｃ１～Ｃ２０置換アルケニル、Ｃ１～Ｃ２０非置換アルキニル、Ｃ１～Ｃ２０置換アルキニル、Ｃ４～Ｃ２０非置換シクロアルキル、およびＣ４～Ｃ２０置換シクロアルキルからなる群から独立して選択され；Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７は、Ｈ、Ｃ１～Ｃ８非置換アルキル、Ｃ１～Ｃ８置換アルキル、Ｃ１～Ｃ８非置換アルケニル、Ｃ１～Ｃ８置換アルケニル、Ｃ１～Ｃ８非置換アルキニル、およびＣ１～Ｃ８置換アルキニルからなる群から独立して選択され；Ｒ８は、Ｃ３～Ｃ２１非置換アルキル、Ｃ３～Ｃ２１置換アルキル、Ｃ３～Ｃ２１非置換アルケニル、Ｃ３～Ｃ２１置換アルケニル、Ｃ３～Ｃ２１非置換アルキニル、およびＣ３～Ｃ２１置換アルキニルからなる群から選択され；ｎは１～４の整数である）を含み得る。一部の実施形態では、本明細書のイオン化可能な合成リン脂質が、Ｒ１が、Ｃ２～Ｃ１６非置換アルキル、Ｃ２～Ｃ１６置換アルキル、またはＣ４～Ｃ１２置換シクロアルキルからなる群から選択され；Ｒ２、およびＲ３が、Ｈ、Ｃ１～Ｃ１６非置換アルキル、Ｃ１～Ｃ１６置換アルキル、またはＣ４～Ｃ１６置換シクロアルキルからなる群から独立して選択され；Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７が、Ｈ、Ｃ１～Ｃ４非置換アルキル、またはＣ１～Ｃ４置換アルキルからなる群から独立して選択され；Ｒ８がＣ３～Ｃ１８非置換アルキルから選択され；ｎが１～３の整数である、式（Ｉ）を含み得る。一部の実施形態では、本明細書のイオン化可能な合成リン脂質が、Ｒ１がＣ２～Ｃ１５非置換アルキルであり；Ｒ２およびＲ３が、Ｈ、Ｃ１～Ｃ１６置換アルキル、またはＣ４～Ｃ１６置換シクロアルキルからなる群から独立して選択され；Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７が、Ｈ、メチル、またはエチルからなる群から独立して選択され；Ｒ８がＣ４～Ｃ１６非置換アルキルから選択され；ｎが１～２の整数である、式（Ｉ）を含み得る。
一部の実施形態では、本明細書のイオン化可能な合成リン脂質が、式（ＩＩ）：
（式中、Ｒ１およびＲ２は、Ｈ、Ｃ１～Ｃ８置換アルキル、またはＣ１～Ｃ８非置換アルキルからなる群から独立して選択され；Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６は、Ｈ、Ｃ１～Ｃ８非置換アルキル、またはＣ１～Ｃ８置換アルキルからなる群から独立して選択され；Ｒ７は、Ｃ３～Ｃ２１非置換アルキルまたはＣ３～Ｃ２１置換アルキルからなる群から選択され；ｎは１～４の整数である）を含み得る。一部の実施形態では、本明細書のイオン化可能な合成リン脂質が、Ｒ１およびＲ２が、Ｈ、Ｃ１～Ｃ６置換アルキル、またはＣ１～Ｃ６非置換アルキルからなる群から独立して選択され；Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６が、Ｈ、Ｃ１～Ｃ４非置換アルキル、またはＣ１～Ｃ４置換アルキルからなる群から独立して選択され；Ｒ７が、Ｃ３～Ｃ１８非置換アルキルまたはＣ３～Ｃ１８置換アルキルからなる群から選択され；ｎが１～３の整数である、式（ＩＩ）を含み得る。一部の実施形態では、本明細書のイオン化可能な合成リン脂質が、Ｒ１およびＲ２が、Ｈ、Ｃ１～Ｃ４置換アルキル、またはＣ１～Ｃ４非置換アルキルからなる群から独立して選択され；Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６が、Ｈ、メチル、またはエチルからなる群から独立して選択され；Ｒ７が、Ｃ３～Ｃ１５非置換アルキルまたはＣ３～Ｃ１５置換アルキルからなる群から選択され；ｎが１～２の整数である、式（ＩＩ）を含み得る。
一部の実施形態では、本明細書のイオン化可能な合成リン脂質が、Ｒ１およびＲ２が、Ｈ、Ｃ１～Ｃ８置換アルキル、Ｃ１～Ｃ８非置換アルキル、Ｃ２～Ｃ８非置換アルケニル、Ｃ２～Ｃ８置換アルケニル、Ｃ２～Ｃ８非置換アルキニル、またはＣ２～Ｃ８置換アルキニルからなる群から独立して選択され；Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６が、Ｈ、Ｃ１～Ｃ８置換アルキル、Ｃ１～Ｃ８非置換アルキル、Ｃ１～Ｃ８非置換アルケニル、Ｃ２～Ｃ８置換アルケニル、Ｃ２～Ｃ８非置換アルキニル、またはＣ２～Ｃ８置換アルキニルからなる群から独立して選択され；Ｒ７が、Ｃ３～Ｃ２１非置換アルキル、Ｃ３～Ｃ２１置換アルキル、Ｃ３～Ｃ２１非置換アルケニル、Ｃ３～Ｃ２１置換アルケニル、Ｃ３～Ｃ２１非置換アルキニル、またはＣ３～Ｃ２１置換アルキニルからなる群から選択され；ｎが１～４の整数である、式（ＩＩ）を含み得る。一部の実施形態では、本明細書のイオン化可能な合成リン脂質が、Ｒ１およびＲ２が、Ｈ、Ｃ１～Ｃ６置換アルキル、Ｃ１～Ｃ６非置換アルキル、Ｃ２～Ｃ６非置換アルケニル、Ｃ２～Ｃ６置換アルケニル、Ｃ２～Ｃ６非置換アルキニル、またはＣ２～Ｃ６置換アルキニルからなる群から独立して選択され；Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６が、Ｈ、Ｃ１～Ｃ４非置換アルキル、Ｃ１～Ｃ４置換アルキル、Ｃ２～Ｃ４非置換アルケニル、Ｃ２～Ｃ４置換アルケニル、Ｃ２～Ｃ４非置換アルキニル、またはＣ２～Ｃ４置換アルキニルからなる群から独立して選択され；Ｒ７が、Ｃ３～Ｃ１８非置換アルキルまたはＣ３～Ｃ１８置換アルキルからなる群から選択され；ｎが１～３の整数である、式（ＩＩ）を含み得る。一部の実施形態では、本明細書のイオン化可能な合成リン脂質が、Ｒ１およびＲ２が、Ｈ、Ｃ１～Ｃ４置換アルキル、またはＣ１～Ｃ４非置換アルキルからなる群から独立して選択され；Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６が、Ｈ、メチル、またはエチルからなる群から独立して選択され；Ｒ７が、Ｃ３～Ｃ１５非置換アルキルまたはＣ３～Ｃ１５置換アルキルからなる群から選択され；ｎが１～２の整数である、式（ＩＩ）を含み得る。
一部の実施形態では、本明細書のイオン化可能な合成リン脂質が、式（ＩＩＩ）：
（式中、Ｒ１は、Ｃ２～Ｃ２０非置換アルキル、Ｃ２～Ｃ２０置換アルキル、Ｃ２～Ｃ２０非置換アルケニル、Ｃ２～Ｃ２０置換アルケニル、Ｃ２～Ｃ２０非置換アルキニル、Ｃ２～Ｃ２０置換アルキニル、Ｃ４～Ｃ２０非置換シクロアルキル、またはＣ４～Ｃ２０置換シクロアルキルからなる群から選択され；Ｒ２、およびＲ３は、Ｈ、Ｃ１～Ｃ２０非置換アルキル、Ｃ１～Ｃ２０置換アルキル、Ｃ１～Ｃ２０非置換アルケニル、Ｃ１～Ｃ２０置換アルケニル、Ｃ１～Ｃ２０非置換アルキニル、Ｃ１～Ｃ２０置換アルキニル、Ｃ４～Ｃ２０非置換シクロアルキル、またはＣ４～Ｃ２０置換シクロアルキルからなる群から独立して選択され；Ｒ４およびＲ５は、Ｈ、Ｃ１～Ｃ８非置換アルキル、Ｃ１～Ｃ８置換アルキル、Ｃ１～Ｃ８非置換アルケニル、Ｃ１～Ｃ８置換アルケニル、Ｃ１～Ｃ８非置換アルキニル、またはＣ１～Ｃ８置換アルキニルからなる群から独立して選択され；Ｒ６は、Ｃ３～Ｃ２１非置換アルキル、Ｃ３～Ｃ２１置換アルキル、Ｃ３～Ｃ２１非置換アルケニル、Ｃ３～Ｃ２１置換アルケニル、Ｃ３～Ｃ２１非置換アルキニル、またはＣ３～Ｃ２１置換アルキニルからなる群から選択され；ｎは１～４の整数であり；ｍは１～４の整数である）を含み得る。一部の実施形態では、本明細書のイオン化可能な合成リン脂質が、Ｒ１が、Ｃ２～Ｃ１６非置換アルキル、Ｃ２～Ｃ１６置換アルキル、Ｃ２～Ｃ１６非置換アルケニル、Ｃ２～Ｃ１６置換アルケニル、Ｃ２～Ｃ１６非置換アルキニル、Ｃ２～Ｃ１６置換アルキニル、Ｃ４～Ｃ１６非置換シクロアルキル、またはＣ４～Ｃ１６置換シクロアルキルからなる群から選択され；Ｒ２、およびＲ３が、Ｈ、Ｃ１～Ｃ１６非置換アルキル、Ｃ１～Ｃ１６置換アルキル、Ｃ１～Ｃ１６非置換アルケニル、Ｃ１～Ｃ１６置換アルケニル、Ｃ１～Ｃ１６非置換アルキニル、Ｃ１～Ｃ１６置換アルキニル、Ｃ４～Ｃ１６非置換シクロアルキル、またはＣ４～Ｃ１６置換シクロアルキルからなる群から独立して選択され；Ｒ４およびＲ５が、Ｈ、Ｃ１～Ｃ６非置換アルキル、Ｃ１～Ｃ６置換アルキル、Ｃ１～Ｃ６非置換アルケニル、Ｃ１～Ｃ６置換アルケニル、Ｃ１～Ｃ６非置換アルキニル、またはＣ１～Ｃ６置換アルキニルからなる群から独立して選択され；Ｒ６が、Ｃ３～Ｃ１８非置換アルキル、Ｃ３～Ｃ１８置換アルキル、Ｃ３～Ｃ１８非置換アルケニル、Ｃ３～Ｃ１８置換アルケニル、Ｃ３～Ｃ１８非置換アルキニル、またはＣ３～Ｃ１８置換アルキニルからなる群から選択され；ｎが１～３の整数であり；ｍが１～３の整数である、式（ＩＩＩ）を含み得る。一部の実施形態では、本明細書のイオン化可能な合成リン脂質が、Ｒ１がＣ２～Ｃ１５非置換アルキルであり；Ｒ２およびＲ３が、Ｈ、Ｃ１～Ｃ１６置換アルキル、またはＣ４～Ｃ１６置換シクロアルキルからなる群から独立して選択され；Ｒ４およびＲ５が、Ｈ、メチル、またはエチルからなる群から独立して選択され；Ｒ６がＣ４～Ｃ１６非置換アルキルから選択され；ｎが１～２の整数であり；ｍが１～２の整数である、式（ＩＩＩ）を含み得る。
一部の実施形態では、本明細書のイオン化可能な合成リン脂質が、少なくとも１つのリン酸基と、少なくとも１つの双性イオンとを含み得、少なくとも１つの双性イオンが、ｐＨ切替可能な双性イオンおよび／または不可逆性双性イオンを含む。一部の実施形態では、本明細書のイオン化可能な合成リン脂質が、少なくとも１つの第三級アミンをさらに含み得る。
一部の実施形態では、本明細書のイオン化可能な合成リン脂質が、疎水性ドメインをさらに含み得る。一部の実施形態では、本明細書のイオン化可能な合成リン脂質が、１つまたは複数の疎水性尾部をさらに含み得る。一部の実施形態では、本明細書の１つまたは複数の疎水性尾部を含むイオン化可能な合成リン脂質が１つの疎水性尾部からなり得る。一部の実施形態では、本明細書の１つまたは複数の疎水性尾部を含むイオン化可能な合成リン脂質が２つの疎水性尾部からなり得る。一部の実施形態では、本明細書の１つまたは複数の疎水性尾部を含むイオン化可能な合成リン脂質が３つの疎水性尾部からなり得る。一部の実施形態では、本明細書の１つまたは複数の疎水性尾部を含むイオン化可能な合成リン脂質が４つの疎水性尾部からなり得る。一部の実施形態では、本明細書の１つまたは複数の疎水性尾部を含むイオン化可能な合成リン脂質が５つの疎水性尾部からなり得る。一部の実施形態では、本明細書の１つまたは複数の疎水性尾部を含むイオン化可能な合成リン脂質が６つの疎水性尾部からなり得る。一部の実施形態では、本明細書の１つまたは複数の疎水性尾部を含むイオン化可能な合成リン脂質が７つの疎水性尾部からなり得る。一部の実施形態では、本明細書の１つまたは複数の疎水性尾部を含むイオン化可能な合成リン脂質が８つの疎水性尾部からなり得る。一部の実施形態では、本明細書の１つまたは複数の疎水性尾部を含むイオン化可能な合成リン脂質が９つの疎水性尾部からなり得る。一部の実施形態では、本明細書の１つまたは複数の疎水性尾部を含むイオン化可能な合成リン脂質が１０個の疎水性尾部からなり得る。
一部の実施形態では、本明細書の１つまたは複数の疎水性尾部を含むイオン化可能な合成リン脂質が、８個の炭素～１６個の炭素のアルキル鎖長を含むアルキル尾部を有する１つまたは複数の疎水性尾部を含み得る。一部の実施形態では、本明細書の１つまたは複数の疎水性尾部を含むイオン化可能な合成リン脂質が、８個の炭素～１０個の炭素のアルキル鎖長を含むアルキル尾部を有する１つまたは複数の疎水性尾部を含み得る。一部の実施形態では、本明細書の１つまたは複数の疎水性尾部を含むイオン化可能な合成リン脂質が、９個の炭素～１２個の炭素のアルキル鎖長を有する１つまたは複数の疎水性尾部を含み得る。一部の実施形態では、本明細書の１つまたは複数の疎水性尾部を含むイオン化可能な合成リン脂質が、１３個の炭素～１６個の炭素のアルキル鎖長を有する１つまたは複数の疎水性尾部を含み得る。一部の実施形態では、本明細書の１つまたは複数の疎水性尾部を含むイオン化可能な合成リン脂質が、８個の炭素～１６個の炭素のアルキル鎖長を有する１つまたは複数の疎水性尾部を含み得る。一部の実施形態では、本明細書の１つまたは複数の疎水性尾部を含むイオン化可能な合成リン脂質が、８個の炭素～１０個の炭素のアルキル鎖長を含むアルキル尾部を有する１つまたは複数の疎水性尾部を含み得る。一部の実施形態では、本明細書の１つまたは複数の疎水性尾部を含むイオン化可能な合成リン脂質が、９個の炭素～１２個の炭素のアルキル鎖長を含むアルキル尾部を有する１つまたは複数の疎水性尾部を含み得る。一部の実施形態では、本明細書の１つまたは複数の疎水性尾部を含むイオン化可能な合成リン脂質が、１３個の炭素～１６個の炭素のアルキル鎖長を含むアルキル尾部を有する１つまたは複数の疎水性尾部を含み得る。
一部の実施形態では、本開示は医薬組成物を提供する。一部の実施形態では、本明細書の医薬組成物が、本明細書に開示されるイオン化可能な合成リン脂質のいずれか１つを含み得る。
一部の実施形態では、本明細書の組成物（例えば、医薬組成物、ナノ粒子、ＬＮＰ）が、少なくとも１つのヘルパー脂質をさらに含み得る。一部の実施形態では、本明細書の組成物が、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、Ｎ－メチルジオクタデシルアミン（ＭＤＯＡ）、１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＤＡＰ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウム臭化物塩（ＤＤＡＢ）、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）、またはこれらの任意の組合せからなる群から選択される少なくとも１つのヘルパー脂質をさらに含み得る。一部の実施形態では、本明細書の組成物が、双性イオン性ヘルパー脂質、イオン化可能カチオン性ヘルパー脂質、永久カチオン性ヘルパー脂質、またはこれらの任意の組合せからなる群から選択される少なくとも１つのヘルパー脂質をさらに含み得る。一部の実施形態では、本明細書の組成物が、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含み得る双性イオン性ヘルパー脂質を含み得る。一部の実施形態では、本明細書の組成物が、Ｎ－メチルジオクタデシルアミン（ＭＤＯＡ）、１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＤＡＰ）、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される少なくとも１つの脂質を含む少なくとも１つのイオン化可能カチオン性ヘルパー脂質をさらに含み得る。一部の実施形態では、本明細書の組成物が、ジメチルジオクタデシルアンモニウム臭化物塩（ＤＤＡＢ）、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される少なくとも１つの脂質を含む少なくとも１つの永久カチオン性ヘルパー脂質をさらに含み得る。
一部の実施形態では、本明細書の組成物が、コレステロールおよび／またはコレステロール誘導体をさらに含み得る。一部の実施形態では、本明細書の組成物が、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシ（ポリ（エチレングリコール－２０００））（ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００）をさらに含み得る。一部の実施形態では、本明細書の組成物が、５５：３０：４５モル比の１つまたは複数のマルチテールのイオン化可能なリン脂質と、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）と、コレステロールとをさらに含み得る。一部の実施形態では、本明細書の組成物が、２５：３０：３０モル比の１つまたは複数のマルチテールのイオン化可能なリン脂質と、Ｎ－メチルジオクタデシルアミン（ＭＤＯＡ）と、コレステロールとをさらに含み得る。一部の実施形態では、本明細書の組成物が、２５：３０：３０モル比の１つまたは複数のマルチテールのイオン化可能なリン脂質と、１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＤＡＰ）と、コレステロールとをさらに含み得る。一部の実施形態では、本明細書の組成物が、２５：３０：３０モル比の１つまたは複数のマルチテールのイオン化可能なリン脂質と、５Ａ２－ＳＣ８と、コレステロールとをさらに含み得る。一部の実施形態では、本明細書の組成物が、６０：３０：４０モル比の１つまたは複数のマルチテールのイオン化可能なリン脂質と、ジメチルジオクタデシルアンモニウム臭化物塩（ＤＤＡＢ）と、コレステロールとをさらに含み得る。一部の実施形態では、本明細書の組成物が、６０：３０：４０モル比の１つまたは複数のマルチテールのイオン化可能なリン脂質と、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）と、コレステロールとをさらに含み得る。一部の実施形態では、本明細書の組成物が、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシ（ポリ（エチレングリコール－２０００））（ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００）をさらに含み得る。
一部の実施形態では、本明細書の組成物が少なくとも１つのカーゴをさらに含み得る。一部の実施形態では、本明細書の組成物が少なくとも１つのカーゴをさらに含み得、カーゴがｍＲＮＡである。一部の実施形態では、本明細書の組成物が少なくとも１つのカーゴをさらに含み得、カーゴが、医薬品有効成分、核酸、ｍＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＤＮＡ配列、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｓＤＮＡ、塩基エディター、ペプチド、タンパク質、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される。
一部の実施形態では、本明細書の組成物が、非経口投与用に製剤化され得る。一部の実施形態では、本明細書の組成物が、静脈内投与用に製剤化され得る。一部の実施形態では、本明細書の組成物が、局所投与用に製剤化され得る。
一部の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物が、カーゴを搭載した脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を含み得、ＬＮＰが、本明細書に開示される任意のイオン化可能なリン脂質、または１つもしくは複数の本明細書に開示されるマルチテールのイオン化可能なリン脂質を含み、１つまたは複数のマルチテールのイオン化可能なリン脂質が、ｐＨ切替可能な双性イオンおよび３つの疎水性尾部を含む。
一部の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物が、１つの第三級アミン、１つのリン酸基、および３つのアルキル尾部を含む１つまたは複数のマルチテールのイオン化可能なリン脂質を含み得る。一部の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物が、３つの疎水性尾部または３つのアルキル尾部が８個の炭素～１６個の炭素のアルキル鎖長を有し得る１つまたは複数のマルチテールのイオン化可能なリン脂質を含み得る。一部の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物が、３つの疎水性尾部または３つのアルキル尾部が８個の炭素～１０個の炭素のアルキル鎖長を有し得る１つまたは複数のマルチテールのイオン化可能なリン脂質を含み得る。一部の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物が、３つの疎水性尾部または３つのアルキル尾部が９個の炭素～１２個の炭素のアルキル鎖長を有し得る１つまたは複数のマルチテールのイオン化可能なリン脂質を含み得る。一部の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物が、３つの疎水性尾部または３つのアルキル尾部が１３個の炭素～１６個の炭素のアルキル鎖長を有し得る１つまたは複数のマルチテールのイオン化可能なリン脂質を含み得る。
一部の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物がカーゴを含み得、カーゴがｍＲＮＡであり、医薬組成物が肝臓での選択的タンパク質発現を提供する。一部の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物がカーゴを含み得、カーゴがｍＲＮＡであり、医薬組成物が脾臓での選択的タンパク質発現を提供する。一部の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物がカーゴを含み得、カーゴがｍＲＮＡであり、医薬組成物が肺での選択的タンパク質発現を提供する。一部の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物がカーゴを含み得、カーゴがｍＲＮＡであり、医薬組成物が皮膚での選択的タンパク質発現を提供する。一部の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物がカーゴを含み得、カーゴがｍＲＮＡである。一部の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物がカーゴを含み得、カーゴがＬＮＰのコア内に配置されている。
一部の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物が１つまたは複数のマルチテールのイオン化可能なリン脂質を含み得、１つまたは複数のマルチテールのイオン化可能なリン脂質が、カーゴを実質的に封入するナノ粒子構造を形成する。
一部の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物が対象における遺伝子送達用であり得る。一部の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物が対象における遺伝子編集用であり得る。一部の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物が対象における薬物送達用であり得る。一部の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物が対象におけるｍＲＮＡ送達用であり得る。一部の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物が対象におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集用であり得る。一部の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物が対象におけるジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）遺伝子編集用であり得る。一部の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物が対象における塩基エディター遺伝子編集用であり得る。一部の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物が対象における転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）遺伝子編集用であり得る。一部の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物が対象における組織特異的ｍＲＮＡ送達用であり得る。一部の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物が対象における組織特異的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集用であり得る。
一部の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物が少なくとも１つのカーゴを含み得、少なくとも１つのカーゴが、医薬品有効成分、核酸、ｍＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＤＮＡ配列、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｓＤＮＡ、塩基エディター、ペプチド、タンパク質、ｃｉｒＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択され得る。
一部の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物が少なくとも１つのナノ粒子を含み得る。一部の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物が少なくとも１つのＬＮＰを含み得る。一部の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物が少なくとも１つのＬＮＰを含み得、少なくとも１つのＬＮＰが少なくとも１つのヘルパー脂質をさらに含む。
一部の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物が少なくとも１つのＬＮＰを含み得、少なくとも１つのＬＮＰが臓器選択的送達用の多成分ＬＮＰであり、多成分ＬＮＰがマルチテールのイオン化可能なリン脂質と１つまたは複数のヘルパー脂質とを含む。一部の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物が、少なくとも１つのＬＮＰと、カーゴと、１つまたは複数のヘルパー脂質とを含み得、カーゴがｍＲＮＡであり、１つまたは複数のヘルパー脂質が、皮膚、脾臓、肝臓、および／または肺での選択的タンパク質発現を可能にし得る。
一部の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物が、少なくとも１つのＬＮＰと、カーゴと、１つまたは複数のヘルパー脂質とを含み得、１つまたは複数のヘルパー脂質が、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、Ｎ－メチルジオクタデシルアミン（ＭＤＯＡ）、１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＤＡＰ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウム臭化物塩（ＤＤＡＢ）、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択され得る。一部の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物が、少なくとも１つのＬＮＰと、カーゴと、１つまたは複数のヘルパー脂質とを含み得、１つまたは複数のヘルパー脂質が、双性イオン性ヘルパー脂質、イオン化可能カチオン性ヘルパー脂質、および永久カチオン性ヘルパー脂質からなる群から選択され得る。一部の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物が、少なくとも１つのＬＮＰと、カーゴと、１つまたは複数のヘルパー脂質とを含み得、双性イオン性ヘルパー脂質が１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含み得る。一部の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物が、少なくとも１つのＬＮＰと、カーゴと、１つまたは複数のヘルパー脂質とを含み得、イオン化可能カチオン性ヘルパー脂質が、Ｎ－メチルジオクタデシルアミン（ＭＤＯＡ）、１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＤＡＰ）、５Ａ２－ＳＣ８、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される少なくとも１つの脂質を含み得る。一部の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物が、少なくとも１つのＬＮＰと、カーゴと、１つまたは複数のヘルパー脂質とを含み得、永久カチオン性ヘルパー脂質が、ジメチルジオクタデシルアンモニウム臭化物塩（ＤＤＡＢ）、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される少なくとも１つの脂質を含み得る。一部の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物が、少なくとも１つのＬＮＰと、カーゴと、１つまたは複数のヘルパー脂質とを含み得、ＬＮＰがコレステロールまたはコレステロール誘導体をさらに含み得る。一部の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物が、少なくとも１つのＬＮＰと、カーゴと、１つまたは複数のヘルパー脂質とを含み得、ＬＮＰが１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシ（ポリ（エチレングリコール－２０００））（ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００）をさらに含み得る。一部の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物が、少なくとも１つのＬＮＰと、カーゴと、１つまたは複数のヘルパー脂質とを含み得、ＬＮＰが、５５：３０：４５モル比の１つまたは複数のマルチテールのイオン化可能なリン脂質と、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）と、コレステロールとを含み得る。一部の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物が、少なくとも１つのＬＮＰと、カーゴと、１つまたは複数のヘルパー脂質とを含み得、ＬＮＰが、２５：３０：３０モル比の１つまたは複数のマルチテールのイオン化可能なリン脂質と、Ｎ－メチルジオクタデシルアミン（ＭＤＯＡ）と、コレステロールとを含み得る。一部の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物が、少なくとも１つのＬＮＰと、カーゴと、１つまたは複数のヘルパー脂質とを含み得、ＬＮＰが、２５：３０：３０モル比の１つまたは複数のマルチテールのイオン化可能なリン脂質と、１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＤＡＰ）と、コレステロールとを含み得る。一部の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物が、少なくとも１つのＬＮＰと、カーゴと、１つまたは複数のヘルパー脂質とを含み得、ＬＮＰが、２５：３０：３０モル比の１つまたは複数のマルチテールのイオン化可能なリン脂質と、５Ａ２－ＳＣ８と、コレステロールとを含み得る。一部の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物が、少なくとも１つのＬＮＰと、カーゴと、１つまたは複数のヘルパー脂質とを含み得、ＬＮＰが、６０：３０：４０モル比の１つまたは複数のマルチテールのイオン化可能なリン脂質と、ジメチルジオクタデシルアンモニウム臭化物塩（ＤＤＡＢ）と、コレステロールとを含み得る。一部の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物が、少なくとも１つのＬＮＰと、カーゴと、１つまたは複数のヘルパー脂質とを含み得、ＬＮＰが、６０：３０：４０モル比の１つまたは複数のマルチテールのイオン化可能なリン脂質と、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）と、コレステロールとを含み得る。一部の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物が、少なくとも１つのＬＮＰと、カーゴと、１つまたは複数のヘルパー脂質とを含み得、ＬＮＰが１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシ（ポリ（エチレングリコール－２０００））（ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００）をさらに含み得る。
一部の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物が、少なくとも１つのＬＮＰと、カーゴと、１つまたは複数のヘルパー脂質とを含み得、ＬＮＰが、標的細胞中でエンドソームからのカーゴ放出を引き起こすことができ得る。
一部の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物が、少なくとも１つのＬＮＰと、カーゴと、１つまたは複数のヘルパー脂質とを含み得、医薬組成物が非経口投与用に製剤化され得る。一部の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物が、少なくとも１つのＬＮＰと、カーゴと、１つまたは複数のヘルパー脂質とを含み得、医薬組成物が非経口投与用に製剤化され得、非経口投与が、皮下投与、皮内投与、腹腔内投与、髄腔内投与、および筋肉内投与からなる群から選択される少なくとも１つを含む。
一部の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物が、少なくとも１つのＬＮＰと、カーゴと、１つまたは複数のヘルパー脂質とを含み得、医薬組成物が静脈内投与用に製剤化され得る。一部の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物が、少なくとも１つのＬＮＰと、カーゴと、１つまたは複数のヘルパー脂質とを含み得、医薬組成物が経口投与用に製剤化され得る。一部の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物が、少なくとも１つのＬＮＰと、カーゴと、１つまたは複数のヘルパー脂質とを含み得、医薬組成物が局所投与用に製剤化され得る。
一部の実施形態では、本開示は、医薬品有効成分を対象に送達する方法を提供する。一部の実施形態では、医薬品有効成分を対象に送達する本明細書の方法が、本明細書に開示されるカーゴを含む、治療有効量の任意の医薬組成物を対象に投与するステップを含み得、カーゴが医薬品有効成分である。
一部の実施形態では、本開示は、対象における遺伝子編集用のｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ／ｓｇＲＮＡを対象に送達する方法を提供する。一部の実施形態では、対象における遺伝子編集用のｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ／ｓｇＲＮＡを対象に送達する本明細書の方法が、本明細書に開示されるカーゴを含む、治療有効量の任意の医薬組成物を対象に投与するステップを含み得、カーゴがｍＲＮＡである。
一部の実施形態では、本開示は、対象の肝臓での選択的タンパク質発現を引き起こす方法を提供する。一部の実施形態では、対象の肝臓での選択的タンパク質発現を引き起こす方法が、治療有効量の本明細書の医薬組成物を対象に投与するステップを含み得、カーゴがｍＲＮＡであり得、３つの疎水性尾部または３つのアルキル尾部が９個の炭素～１２個の炭素のアルキル鎖長を有し得る。一部の実施形態では、本開示は、対象の脾臓での選択的タンパク質発現を引き起こす方法を提供する。一部の実施形態では、対象の脾臓での選択的タンパク質発現を引き起こす方法が、治療有効量の本明細書の医薬組成物を対象に投与するステップを含み得、カーゴがｍＲＮＡであり得、３つの疎水性尾部または３つのアルキル尾部が１３個の炭素～１６個の炭素のアルキル鎖長を有し得る。一部の実施形態では、本開示は、対象の脾臓、肝臓、皮膚および／または肺での選択的タンパク質発現を引き起こす方法を提供する。一部の実施形態では、対象の脾臓、肝臓、皮膚および／または肺での選択的タンパク質発現を引き起こす方法が、治療有効量の本明細書の医薬組成物を対象に投与するステップを含み得、カーゴがｍＲＮＡである。
一部の実施形態では、本開示は、対象における遺伝子送達の方法であって、治療有効量の本明細書に開示される医薬組成物を対象に投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、対象における遺伝子編集の方法であって、治療有効量の本明細書に開示される医薬組成物を対象に投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、対象における薬物送達の方法であって、治療有効量の本明細書に開示される医薬組成物を対象に投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、対象におけるＲＮＡ送達の方法であって、治療有効量の本明細書に開示される医薬組成物を対象に投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、対象におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集の方法であって、治療有効量の本明細書に開示される医薬組成物を対象に投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、対象におけるジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）遺伝子編集の方法であって、治療有効量の本明細書に開示される医薬組成物を対象に投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、対象における塩基エディター遺伝子編集の方法であって、治療有効量の本明細書に開示される医薬組成物を対象に投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、対象における転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）遺伝子編集の方法であって、治療有効量の本明細書に開示される医薬組成物を対象に投与するステップを含む方法を提供する。
一部の実施形態では、本開示は、対象における組織特異的ｍＲＮＡ送達の方法であって、治療有効量の本明細書に開示される医薬組成物を対象に投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、対象における組織特異的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集の方法であって、治療有効量の本明細書に開示される医薬組成物を対象に投与するステップを含む方法を提供する。
一部の実施形態では、本明細書の方法が、非経口投与によって本明細書に開示される任意の組成物を対象に投与するステップを含み得る。一部の実施形態では、本明細書の方法が、静脈内投与によって本明細書に開示される任意の組成物を対象に投与するステップを含み得る。一部の実施形態では、本明細書の方法が、局所投与によって本明細書に開示される任意の組成物を対象に投与するステップを含み得る。
一部の実施形態では、キットが本明細書で提供される。本明細書に開示されるキットは、本明細書に開示される組成物のいずれかと共に、および／または本明細書に開示される方法のいずれかを実施するために使用され得る。
追加の実施形態および特徴は、以下の説明に部分的に示され、明細書を調べると当業者に明らかになるか、または本開示の実施によって学習され得る。本開示の性質および利点のさらなる理解は、本開示の一部を形成する明細書の残りの部分および図面を参照することによって実現され得る。
特許または出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含有する。カラー図面（複数可）を含むこの特許または特許出願公開のコピーは、要求および必要な手数料の支払いで特許庁によって提供される。
本明細書は、本開示の様々な実施形態として提示され、本開示の範囲の完全な列挙として解釈されるべきではない以下の図面およびデータグラフを参照してより完全に理解される。
化学的に合成され、試験され、強化されたエンドソーム脱出についての物理的作用機序の解明もたらしたｉＰｈｏｓ脂質のコンビナトリアルライブラリーを示す図である。図１Ａは、有効なｉＰｈｏｓ脂質が、１つのイオン化可能アミン、１つのリン酸基、および３つの疎水性アルキル尾部で構成されていたこと；ならびに酸性エンドソーム／リソソームに入ると、第三級アミンのプロトン化が、膜に容易に挿入することができる双性イオン性頭部基を誘導したことを示している。 化学的に合成され、試験され、強化されたエンドソーム脱出についての物理的作用機序の解明もたらしたｉＰｈｏｓ脂質のコンビナトリアルライブラリーを示す図である。図１Ｂは、ほとんどの生体膜リン脂質が双性イオンを保有し、ラメラ相を採用すること；ならびにｉＰｈｏｓ脂質が混合され、エンドソーム膜に挿入されると、小さなイオン対頭部および複数の疎水性尾部によって形成される円錐形状がヘキサゴナル相転換を可能にしたことを示している。 化学的に合成され、試験され、強化されたエンドソーム脱出についての物理的作用機序の解明もたらしたｉＰｈｏｓ脂質のコンビナトリアルライブラリーを示す図である。図１ＣはｉＰｈｏｓの合成経路を示している。アルキル化ジオキサホスホランオキシド分子（Ｐｍ）をアミン（ｎＡ）にコンジュゲートしてｉＰｈｏｓ（ｎＡｘＰｍ）（「ｎＡｘＰｍ」中の「ｘ」は１つのアミン分子上の修飾されたＰｍ分子の数を示す）を得た。 化学的に合成され、試験され、強化されたエンドソーム脱出についての物理的作用機序の解明もたらしたｉＰｈｏｓ脂質のコンビナトリアルライブラリーを示す図である。図１Ｄは、ｉＰｈｏｓ合成に使用される２８個のアミンｎＡおよび１３個のアルキル化ジオキサホスホランオキシドＰｍ分子を示している。 １つのｐＨ切替可能な双性イオンおよび３つの尾部を有するｉＰｈｏｓ脂質がインビトロでのルシフェラーゼｍＲＮＡ送達に最も有効であったことを示す図である。図２Ａは、ＩＧＲＯＶ１細胞におけるｉＰＬＮＰ（５０ｎｇ ｍＲＮＡ、ｎ＝３）の処置後のルシフェラーゼ発現のヒートマップを示している。ＲＬＵ＞１００００をヒット率計算のためにカウントした。 １つのｐＨ切替可能な双性イオンおよび３つの尾部を有するｉＰｈｏｓ脂質がインビトロでのルシフェラーゼｍＲＮＡ送達に最も有効であったことを示す図である。図２Ｂは、酸性エンドソーム環境における異なる数の双性イオンおよび尾部を有するｉＰｈｏｓの代表的な化学構造を示している。 １つのｐＨ切替可能な双性イオンおよび３つの尾部を有するｉＰｈｏｓ脂質がインビトロでのルシフェラーゼｍＲＮＡ送達に最も有効であったことを示す図である。図Ｃは、単一の双性イオンおよび複数の双性イオンを有するｉＰｈｏｓの相対的ヒット率を示している。 １つのｐＨ切替可能な双性イオンおよび３つの尾部を有するｉＰｈｏｓ脂質がインビトロでのルシフェラーゼｍＲＮＡ送達に最も有効であったことを示す図である。図２Ｄは、単一の双性イオンおよび異なる数の尾部を有するｉＰｈｏｓ（１Ａ１Ｐ４～１８Ａ１Ｐ１６）の相対的ヒット率を示している。 １つのｐＨ切替可能な双性イオンおよび３つの尾部を有するｉＰｈｏｓ脂質がインビトロでのルシフェラーゼｍＲＮＡ送達に最も有効であったことを示す図である。図２Ｅは、効率的なｉＰｈｏｓ（７Ａ１Ｐ４～１３Ａ１Ｐ１６）の中で、出発アミンの尾部長が最終的なインビトロ有効性に影響を及ぼしたことを示している。 エンドソーム脱出のモデル膜試験が化学構造に相関したｉＰｈｏｓ脂質媒介ＲＮＡ送達の機序を実証したことを示す図である。図３Ａは、ｐＨ５．５での１７Ａおよび１０Ａ１Ｐ１０の溶血；ならびに双性イオンがエンドソーム脱出に有意に役立ち得ることを示している；統計学的有意性：＊＊＊、Ｐ＜０．００１；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊、Ｐ＜０．０５。 エンドソーム脱出のモデル膜試験が化学構造に相関したｉＰｈｏｓ脂質媒介ＲＮＡ送達の機序を実証したことを示す図である。図３Ｂは、異なるｐＨでの９Ａ１Ｐ９および１０Ａ１Ｐ１０の溶血を示している；統計学的有意性：＊＊＊、Ｐ＜０．００１；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊、Ｐ＜０．０５。 エンドソーム脱出のモデル膜試験が化学構造に相関したｉＰｈｏｓ脂質媒介ＲＮＡ送達の機序を実証したことを示す図である。図３Ｃは、異なるｐＨでのｉＰＬＮＰの溶血を示している；統計学的有意性：＊＊＊、Ｐ＜０．００１；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊、Ｐ＜０．０５。 エンドソーム脱出のモデル膜試験が化学構造に相関したｉＰｈｏｓ脂質媒介ＲＮＡ送達の機序を実証したことを示す図である。図３Ｄは、ｐＨ５．５でＦＲＥＴアッセイによって決定された１０Ａ１Ｐ１０およびｉＰＬＮＰの脂質融合および膜破裂を示している；統計学的有意性：＊＊＊、Ｐ＜０．００１；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊、Ｐ＜０．０５。 エンドソーム脱出のモデル膜試験が化学構造に相関したｉＰｈｏｓ脂質媒介ＲＮＡ送達の機序を実証したことを示す図である。図３Ｅは、ｐＨ５．５で１０分間のアニオン性エンドソーム模倣物との混合後のＦＲＥＴ特性評価によるｉＰＬＮＰ解離；ならびに単一の双性イオンが複数の層性イオンよりも高い脂質融合およびｉＰＬＮＰ解離有効性を示したことを示している；統計学的有意性：＊＊＊、Ｐ＜０．００１；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊、Ｐ＜０．０５。 エンドソーム脱出のモデル膜試験が化学構造に相関したｉＰｈｏｓ脂質媒介ＲＮＡ送達の機序を実証したことを示す図である。図３Ｆは、ｐＨ５．５での異なる時間間隔の１０Ａ１Ｐ１０ ｉＰＬＮＰ解離を示しており、データは平均±ＳＤとして示される；ｎ＝３。 エンドソーム脱出のモデル膜試験が化学構造に相関したｉＰｈｏｓ脂質媒介ＲＮＡ送達の機序を実証したことを示す図である。図３Ｇは、ｐＨ５．５での異なる時間間隔の１０Ａ１Ｐ１０ ｉＰＬＮＰ解離を示している；統計学的有意性：＊＊＊、Ｐ＜０．００１；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊、Ｐ＜０．０５。図３Ｂ～図３Ｇのデータは平均±ｓ．ｄ．として提示される（ｎ＝３の生物学的に独立した試料）。 ｉＰｈｏｓ脂質の化学構造およびアルキル長がインビボ有効性および臓器選択性を制御したことを明らかにする構造－活性試験を示す図である。図４Ａは、低Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡ用量（０．１ｍｇ／ｋｇ）での５１個のｉＰｈｏｓ脂質のインビボ評価を示しており；様々な臓器の生物発光画像をＣ５７ＢＬ／６マウスのＩＶ注射の６時間後に記録した；Ｈ：心臓、Ｌｕ：肺、Ｌｉ：肝臓、Ｋ：腎臓、Ｓ：脾臓。 ｉＰｈｏｓ脂質の化学構造およびアルキル長がインビボ有効性および臓器選択性を制御したことを明らかにする構造－活性試験を示す図である。図４Ｂは、有効な１０Ａ１Ｐ４～１２Ａ１Ｐ１６ ｉＰｈｏｓの中で、アミン側の疎水性鎖長がインビボｍＲＮＡ送達有効性に劇的に影響を及ぼしたことを示している。 ｉＰｈｏｓ脂質の化学構造およびアルキル長がインビボ有効性および臓器選択性を制御したことを明らかにする構造－活性試験を示す図である。図４Ｃは、リン酸基側で異なるアルキル鎖長を有するｉＰｈｏｓによる肝臓でのｍＲＮＡ発現；および９～１２個の炭素長が最も効率的であったことを示している。 ｉＰｈｏｓ脂質の化学構造およびアルキル長がインビボ有効性および臓器選択性を制御したことを明らかにする構造－活性試験を示す図である。図４Ｄは、リン酸基側で異なるアルキル鎖長を有するｉＰｈｏｓによる脾臓でのｍＲＮＡ発現；および１３～１６個のアルキル鎖長が最も効率的であったことを示している。 ｉＰｈｏｓが、臓器選択的ＲＮＡ送達を可能にするために異なるヘルパー脂質を有するｉＰＬＮＰで適用することができる、伝統的に使用されているリン脂質に対する優位性を有するプラットフォーム技術であることを示す図である。図５Ａは、酸性エンドソーム環境におけるｉＰｈｏｓ ９Ａ１Ｐ９の提案される構造を示している。 ｉＰｈｏｓが、臓器選択的ＲＮＡ送達を可能にするために異なるヘルパー脂質を有するｉＰＬＮＰで適用することができる、伝統的に使用されているリン脂質に対する優位性を有するプラットフォーム技術であることを示す図である。図５Ｂは、ｉＰｈｏｓ ９Ａ１Ｐ９がｍＲＮＡ送達に関して基準のＤＯＰＥおよびＤＳＰＣより性能が優れていたことを示す、記録された肝臓でのルシフェラーゼ発現の画像を示している（Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡ、０．２５ｍｇ／ｋｇ）；Ｈ：心臓、Ｌｕ：肺、Ｌｉ：肝臓、Ｋ：腎臓、Ｓ：脾臓。 ｉＰｈｏｓが、臓器選択的ＲＮＡ送達を可能にするために異なるヘルパー脂質を有するｉＰＬＮＰで適用することができる、伝統的に使用されているリン脂質に対する優位性を有するプラットフォーム技術であることを示す図である。図５Ｃは、ｉＰｈｏｓ ９Ａ１Ｐ９がｍＲＮＡ送達に関して基準のＤＯＰＥおよびＤＳＰＣより性能が優れていたことを示す、記録された肝臓でのルシフェラーゼ発現の定量化を示している（Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡ、０．２５ｍｇ／ｋｇ）；データは平均±ＳＤとして示される；ｎ＝３；統計学的有意性：＊＊＊、Ｐ＜０．００１；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊、Ｐ＜０．０５。 ｉＰｈｏｓが、臓器選択的ＲＮＡ送達を可能にするために異なるヘルパー脂質を有するｉＰＬＮＰで適用することができる、伝統的に使用されているリン脂質に対する優位性を有するプラットフォーム技術であることを示す図である。図５Ｄは、脾臓でのｍＲＮＡ発現を媒介した双性イオン性ヘルパー脂質を含有するｉＰＬＮＰ；およびヘルパー脂質ＤＯＰＥを有する９Ａ１Ｐ９が脾臓において効率的であったことを示すインビボ評価を示している（Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡ、０．２５ｍｇ／ｋｇ）。 ｉＰｈｏｓが、臓器選択的ＲＮＡ送達を可能にするために異なるヘルパー脂質を有するｉＰＬＮＰで適用することができる、伝統的に使用されているリン脂質に対する優位性を有するプラットフォーム技術であることを示す図である。図５Ｅは、脾臓でのｍＲＮＡ発現を媒介した双性イオン性ヘルパー脂質を含有するｉＰＬＮＰおよびヘルパー脂質ＤＯＰＥを有する９Ａ１Ｐ９ ｉＰＬＮＰが脾臓において効率的であったことを示すインビボ定量化を示している（Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡ、０．２５ｍｇ／ｋｇ）。 ｉＰｈｏｓが、臓器選択的ＲＮＡ送達を可能にするために異なるヘルパー脂質を有するｉＰＬＮＰで適用することができる、伝統的に使用されているリン脂質に対する優位性を有するプラットフォーム技術であることを示す図である。図５Ｆは、肝臓でｍＲＮＡ翻訳をもたらしたイオン化可能カチオン性ヘルパー脂質を含有するｉＰＬＮＰ、およびアッセイされる異なるイオン化可能カチオン性ヘルパー脂質を有する９Ａ１Ｐ９ ｉＰＬＮＰによるＦｌｕｃ ｍＲＮＡ発現の臓器選択性を示している（Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡ、ＭＤＯＡおよびＤＯＤＡＰについて０．２５ｍｇ／ｋｇ；５Ａ２－ＳＣ８について０．０５ｍｇ／ｋｇ）。 ｉＰｈｏｓが、臓器選択的ＲＮＡ送達を可能にするために異なるヘルパー脂質を有するｉＰＬＮＰで適用することができる、伝統的に使用されているリン脂質に対する優位性を有するプラットフォーム技術であることを示す図である。図５Ｇは、肝臓でｍＲＮＡ翻訳をもたらしたイオン化可能カチオン性ヘルパー脂質を含有するｉＰＬＮＰ、およびアッセイされる異なるイオン化可能カチオン性ヘルパー脂質を有する９Ａ１Ｐ９ ｉＰＬＮＰによるＦｌｕｃ ｍＲＮＡ発現の定量化を示している（Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡ、ＭＤＯＡおよびＤＯＤＡＰについて０．２５ｍｇ／ｋｇ；５Ａ２－ＳＣ８について０．０５ｍｇ／ｋｇ）。 ｉＰｈｏｓが、臓器選択的ＲＮＡ送達を可能にするために異なるヘルパー脂質を有するｉＰＬＮＰで適用することができる、伝統的に使用されているリン脂質に対する優位性を有するプラットフォーム技術であることを示す図である。図５Ｈは、肺でのｍＲＮＡ翻訳を誘導した永久カチオン性ヘルパー脂質を含有するｉＰＬＮＰ、および評価される永久カチオン性ヘルパー脂質ＤＤＡＢおよびＤＯＴＡＰを使用した９Ａ１Ｐ９ ｉＰＬＮＰによるＦｌｕｃ ｍＲＮＡ発現の臓器画像を示している（Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡ、０．２５ｍｇ／ｋｇ）。 ｉＰｈｏｓが、臓器選択的ＲＮＡ送達を可能にするために異なるヘルパー脂質を有するｉＰＬＮＰで適用することができる、伝統的に使用されているリン脂質に対する優位性を有するプラットフォーム技術であることを示す図である。図５Ｉは、肺でのｍＲＮＡ翻訳を誘導した永久カチオン性ヘルパー脂質を含有するｉＰＬＮＰ、および評価される永久カチオン性ヘルパー脂質ＤＤＡＢおよびＤＯＴＡＰを使用した９Ａ１Ｐ９ ｉＰＬＮＰによるＦｌｕｃ ｍＲＮＡ発現の定量化を示している（Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡ、０．２５ｍｇ／ｋｇ）。 ｉＰｈｏｓが、臓器選択的ＲＮＡ送達を可能にするために異なるヘルパー脂質を有するｉＰＬＮＰで適用することができる、伝統的に使用されているリン脂質に対する優位性を有するプラットフォーム技術であることを示す図である。図５Ｊは、ｉＰＬＮＰが肝臓または肺において選択的にＣｒｅ ｍＲＮＡ送達を可能にしたこと、ならびにＣｒｅレコンビナーゼｍＲＮＡをＣｒｅタンパク質に翻訳することによってｔｄＴｏｍａｔｏを発現して、肝臓および肺においてそれぞれ媒介されたｔｄＴｏｍａｔｏ発現のストップを削除することができるＣｒｅ－ＬｏｘＰマウスモデルの概略図を示している（Ｃｒｅ ｍＲＮＡ、０．２５ｍｇ／ｋｇ）。 ｉＰｈｏｓが、臓器選択的ＲＮＡ送達を可能にするために異なるヘルパー脂質を有するｉＰＬＮＰで適用することができる、伝統的に使用されているリン脂質に対する優位性を有するプラットフォーム技術であることを示す図である。図５Ｋは、肝臓において選択的にＣｒｅ ｍＲＮＡ送達を可能にした９Ａ１Ｐ９－５Ａ２－ＳＣ８ ｉＰＬＮＰを示している。 ｉＰｈｏｓが、臓器選択的ＲＮＡ送達を可能にするために異なるヘルパー脂質を有するｉＰＬＮＰで適用することができる、伝統的に使用されているリン脂質に対する優位性を有するプラットフォーム技術であることを示す図である。図５Ｌは、肺において選択的にＣｒｅ ｍＲＮＡ送達を可能にした９Ａ１Ｐ９－ＤＤＡＢ ｉＰＬＮＰを示している。 ｉＰｈｏｓが、臓器選択的ＲＮＡ送達を可能にするために異なるヘルパー脂質を有するｉＰＬＮＰで適用することができる、伝統的に使用されているリン脂質に対する優位性を有するプラットフォーム技術であることを示す図である。図５Ｍは、陽性対照ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ ＬＮＰよりもはるかに高いｍＲＮＡ送達有効性を示した９Ａ１Ｐ９－５Ａ２－ＳＣ８ ｉＰＬＮＰ、および記録される肝臓でのルシフェラーゼ発現の画像を示している（Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡ、０．０５ｍｇ／ｋｇ）。 ｉＰｈｏｓが、臓器選択的ＲＮＡ送達を可能にするために異なるヘルパー脂質を有するｉＰＬＮＰで適用することができる、伝統的に使用されているリン脂質に対する優位性を有するプラットフォーム技術であることを示す図である。図５Ｎは、陽性対照ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ ＬＮＰよりもはるかに高いｍＲＮＡ送達有効性を示した９Ａ１Ｐ９－５Ａ２－ＳＣ８ ｉＰＬＮＰ、および記録される肝臓でのルシフェラーゼ発現の定量化を示している（Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡ、０．０５ｍｇ／ｋｇ）；データは平均±ＳＤとして示される；ｎ＝３；統計学的有意性：＊＊＊、Ｐ＜０．００１；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊、Ｐ＜０．０５。 Ｃａｓ９ ｍＲＮＡとｓｇＲＮＡを共送達して、肝臓および肺で選択的にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集を達成したｉＰＬＮＰを示す図である。図６Ａは、ストップカセットを削除し、ｔｄＴｏｍａｔｏタンパク質を活性化したＣａｓ９ ｍＲＮＡとｓｇＴｏｍ１の共送達の概略図を示している Ｃａｓ９ ｍＲＮＡとｓｇＲＮＡを共送達して、肝臓および肺で選択的にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集を達成したｉＰＬＮＰを示す図である。図６Ｂは、肝臓で特異的に遺伝子編集を可能にした９Ａ１Ｐ９－５Ａ２－ＳＣ８ ｉＰＬＮＰを示している。 Ｃａｓ９ ｍＲＮＡとｓｇＲＮＡを共送達して、肝臓および肺で選択的にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集を達成したｉＰＬＮＰを示す図である。図６Ｃは、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよびｓｇＴｏｍ１を含有する９Ａ１Ｐ９－５Ａ２－ＳＣ８ ｉＰＬＮＰのＡｉ９マウスへのＩＶ投与後に、ｔｄＴｏｍａｔｏ陽性細胞が肝臓で観察されたことを示している。スケールバー、５０μｍ。 Ｃａｓ９ ｍＲＮＡとｓｇＲＮＡを共送達して、肝臓および肺で選択的にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集を達成したｉＰＬＮＰを示す図である。図６Ｄは、肺で特異的に遺伝子編集を可能にした９Ａ１Ｐ９－ＤＤＡＢ ｉＰＬＮＰを示している。 Ｃａｓ９ ｍＲＮＡとｓｇＲＮＡを共送達して、肝臓および肺で選択的にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集を達成したｉＰＬＮＰを示す図である。図６Ｅは、９Ａ１Ｐ９－ＤＤＡＢ ｉＰＬＮＰの投与後の肺におけるｔｄＴｏｍａｔｏ陽性細胞を示す共焦点蛍光画像を示している。スケールバー、５０μｍ。 Ｃａｓ９ ｍＲＮＡとｓｇＲＮＡを共送達して、肝臓および肺で選択的にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集を達成したｉＰＬＮＰを示す図である。図６Ｆは、それぞれ肝臓および肺でのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集を可能にする、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよびｓｇＰＴＥＮを含有する９Ａ１Ｐ９－５Ａ２－ＳＣ８および９Ａ１Ｐ９－ＤＤＡＢ ｉＰＬＮＰをＣ５７ＢＬ／６マウスにＩＶ投与した臓器選択的遺伝子編集のＴ７Ｅ１アッセイを示している。全てのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集アッセイについて、４：１のＣａｓ９ ｍＲＮＡ／ｓｇＲＮＡ重量比および０．７５ｍｇ／ｋｇの全ＲＮＡ用量を使用した。 Ｃａｓ９ ｍＲＮＡとｓｇＲＮＡを共送達して、肝臓および肺で選択的にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集を達成したｉＰＬＮＰを示す図である。図６Ｇは、ｉＰＬＮＰサイズの減少ならびに有効性および臓器選択性の保存をもたらした、制御されたマイクロ流体混合によって調製された９Ａ１Ｐ９－５Ａ２－ＳＣ８ ｉＰＬＮＰ（肝臓特異的、Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡ、０．０５ ｍｇ／ｋｇ）を示している。 Ｃａｓ９ ｍＲＮＡとｓｇＲＮＡを共送達して、肝臓および肺で選択的にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集を達成したｉＰＬＮＰを示す図である。図６Ｈは、９Ａ１Ｐ９－５Ａ２－ＳＣ８ ｉＰＬＮＰが小さなサイズを示し、正確な臓器選択性を完全に保持したことを示している。 Ｃａｓ９ ｍＲＮＡとｓｇＲＮＡを共送達して、肝臓および肺で選択的にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集を達成したｉＰＬＮＰを示す図である。図６Ｉは、９Ａ１Ｐ９－５Ａ２－ＳＣ８ ｉＰＬＮＰ（Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡ、０．０５ｍｇ／ｋｇ）が有効性を喪失することなく繰り返し投与を可能にしたことを実証する、各注射の６時間後に実施した全身イメージングを示している。 Ｃａｓ９ ｍＲＮＡとｓｇＲＮＡを共送達して、肝臓および肺で選択的にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集を達成したｉＰＬＮＰを示す図である。図６Ｊは、９Ａ１Ｐ９－５Ａ２－ＳＣ８ ｉＰＬＮＰ（Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡ、０．０５ｍｇ／ｋｇ）が有効性を喪失することなく繰り返し投与を可能にしたことを実証する、各注射の６時間後に実施したルシフェラーゼ発現の定量化を示している。 Ｃａｓ９ ｍＲＮＡとｓｇＲＮＡを共送達して、肝臓および肺で選択的にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集を達成したｉＰＬＮＰを示す図である。図６Ｋは、９Ａ１Ｐ９－５Ａ２－ＳＣ８および９Ａ１Ｐ９－ＤＤＡＢ ｉＰＬＮＰがインビボで忍容性が高かったことを実証する、肝臓マーカー測定（ＢＵＮ）を示している。 Ｃａｓ９ ｍＲＮＡとｓｇＲＮＡを共送達して、肝臓および肺で選択的にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集を達成したｉＰＬＮＰを示す図である。図６Ｌは、９Ａ１Ｐ９－５Ａ２－ＳＣ８および９Ａ１Ｐ９－ＤＤＡＢ ｉＰＬＮＰがインビボで忍容性が高かったことを実証する、肝臓マーカー測定（ＣＲＥＡ）を示している。 Ｃａｓ９ ｍＲＮＡとｓｇＲＮＡを共送達して、肝臓および肺で選択的にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集を達成したｉＰＬＮＰを示す図である。図６Ｍは、９Ａ１Ｐ９－５Ａ２－ＳＣ８および９Ａ１Ｐ９－ＤＤＡＢ ｉＰＬＮＰがインビボで忍容性が高かったことを実証する、肝臓マーカー測定（ＡＴＬ）を示している。 Ｃａｓ９ ｍＲＮＡとｓｇＲＮＡを共送達して、肝臓および肺で選択的にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集を達成したｉＰＬＮＰを示す図である。図６Ｎは、９Ａ１Ｐ９－５Ａ２－ＳＣ８および９Ａ１Ｐ９－ＤＤＡＢ ｉＰＬＮＰがインビボで忍容性が高かったことを実証する、肝臓マーカー測定（ＡＳＴ）を示している。データは平均±ｓ．ｄ．として提示され、統計学的有意性は両側の対応のないｔ検定によって分析した。＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１；＊＊＊、Ｐ＜０．００１；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊、Ｐ＜０．０５；ＮＳ、Ｐ＞０．０５。全てのデータはｎ＝３の生物学的に独立したマウスからのものである。 アルキル化ジオキサホスホランオキシド分子Ｐ４～Ｐ１６の１Ｈ ＮＭＲスペクトル（ＣＤＣｌ３）を示す図である。対応するアルコールの生成物への変換収率は90.8% (P4; FIG. 7A)であった。変換収率は、ピークａ（４Ｈ、Ｐｍ分子の－ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ－）およびピークｅ（３Ｈ、Ｐｍと対応するアルコール分子の両方の－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）の積分から計算した。 アルキル化ジオキサホスホランオキシド分子Ｐ４～Ｐ１６の１Ｈ ＮＭＲスペクトル（ＣＤＣｌ３）を示す図である。対応するアルコールの生成物への変換収率は96.8% (P5; FIG. 7B)であった。変換収率は、ピークａ（４Ｈ、Ｐｍ分子の－ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ－）およびピークｅ（３Ｈ、Ｐｍと対応するアルコール分子の両方の－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）の積分から計算した。 アルキル化ジオキサホスホランオキシド分子Ｐ４～Ｐ１６の１Ｈ ＮＭＲスペクトル（ＣＤＣｌ３）を示す図である。対応するアルコールの生成物への変換収率は96.8% (P6; FIG. 7C)であった。変換収率は、ピークａ（４Ｈ、Ｐｍ分子の－ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ－）およびピークｅ（３Ｈ、Ｐｍと対応するアルコール分子の両方の－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）の積分から計算した。 アルキル化ジオキサホスホランオキシド分子Ｐ４～Ｐ１６の１Ｈ ＮＭＲスペクトル（ＣＤＣｌ３）を示す図である。対応するアルコールの生成物への変換収率は96.0% (P7; FIG. 7D)であった。変換収率は、ピークａ（４Ｈ、Ｐｍ分子の－ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ－）およびピークｅ（３Ｈ、Ｐｍと対応するアルコール分子の両方の－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）の積分から計算した。 アルキル化ジオキサホスホランオキシド分子Ｐ４～Ｐ１６の１Ｈ ＮＭＲスペクトル（ＣＤＣｌ３）を示す図である。対応するアルコールの生成物への変換収率は93.0% (P8; FIG. 7E)であった。変換収率は、ピークａ（４Ｈ、Ｐｍ分子の－ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ－）およびピークｅ（３Ｈ、Ｐｍと対応するアルコール分子の両方の－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）の積分から計算した。 アルキル化ジオキサホスホランオキシド分子Ｐ４～Ｐ１６の１Ｈ ＮＭＲスペクトル（ＣＤＣｌ３）を示す図である。対応するアルコールの生成物への変換収率は87.0% (P9; FIG. 7F)であった。変換収率は、ピークａ（４Ｈ、Ｐｍ分子の－ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ－）およびピークｅ（３Ｈ、Ｐｍと対応するアルコール分子の両方の－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）の積分から計算した。 アルキル化ジオキサホスホランオキシド分子Ｐ４～Ｐ１６の１Ｈ ＮＭＲスペクトル（ＣＤＣｌ３）を示す図である。対応するアルコールの生成物への変換収率は93.0% (P10; FIG. 7G)であった。変換収率は、ピークａ（４Ｈ、Ｐｍ分子の－ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ－）およびピークｅ（３Ｈ、Ｐｍと対応するアルコール分子の両方の－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）の積分から計算した。 アルキル化ジオキサホスホランオキシド分子Ｐ４～Ｐ１６の１Ｈ ＮＭＲスペクトル（ＣＤＣｌ３）を示す図である。対応するアルコールの生成物への変換収率は95.3% (P11; FIG. 7H)であった。変換収率は、ピークａ（４Ｈ、Ｐｍ分子の－ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ－）およびピークｅ（３Ｈ、Ｐｍと対応するアルコール分子の両方の－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）の積分から計算した。 アルキル化ジオキサホスホランオキシド分子Ｐ４～Ｐ１６の１Ｈ ＮＭＲスペクトル（ＣＤＣｌ３）を示す図である。対応するアルコールの生成物への変換収率は93.8% (P12; FIG. 7I)であった。変換収率は、ピークａ（４Ｈ、Ｐｍ分子の－ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ－）およびピークｅ（３Ｈ、Ｐｍと対応するアルコール分子の両方の－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）の積分から計算した。 アルキル化ジオキサホスホランオキシド分子Ｐ４～Ｐ１６の１Ｈ ＮＭＲスペクトル（ＣＤＣｌ３）を示す図である。対応するアルコールの生成物への変換収率は87.8% (P14; FIG. 7J)であった。変換収率は、ピークａ（４Ｈ、Ｐｍ分子の－ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ－）およびピークｅ（３Ｈ、Ｐｍと対応するアルコール分子の両方の－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）の積分から計算した。 アルキル化ジオキサホスホランオキシド分子Ｐ４～Ｐ１６の１Ｈ ＮＭＲスペクトル（ＣＤＣｌ３）を示す図である。対応するアルコールの生成物への変換収率は95.3% (P13; FIG. 7K)であった。変換収率は、ピークａ（４Ｈ、Ｐｍ分子の－ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ－）およびピークｅ（３Ｈ、Ｐｍと対応するアルコール分子の両方の－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）の積分から計算した。 アルキル化ジオキサホスホランオキシド分子Ｐ４～Ｐ１６の１Ｈ ＮＭＲスペクトル（ＣＤＣｌ３）を示す図である。対応するアルコールの生成物への変換収率は92.3% (P15; FIG. 7L)であった。変換収率は、ピークａ（４Ｈ、Ｐｍ分子の－ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ－）およびピークｅ（３Ｈ、Ｐｍと対応するアルコール分子の両方の－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）の積分から計算した。 アルキル化ジオキサホスホランオキシド分子Ｐ４～Ｐ１６の１Ｈ ＮＭＲスペクトル（ＣＤＣｌ３）を示す図である。対応するアルコールの生成物への変換収率は88.5% (P16; FIG. 7M)であった。変換収率は、ピークａ（４Ｈ、Ｐｍ分子の－ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ－）およびピークｅ（３Ｈ、Ｐｍと対応するアルコール分子の両方の－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）の積分から計算した。 異なるアミン出発物質を使用したｉＰｈｏｓ合成を示す図である。１つの第一級、第二級、または第三級アミン基を有するアミンは単一の双性イオンを導入した。いくつかのアミン基を有するアミンは複数の双性イオンを導入した。 Ｐ１０（ＤＭＳＯ－ｄ６）および選択されたｉＰｈｏｓ（ＣＤＣｌ３）の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す図である。Ｐ１０のスペクトルは、７０℃においてＤＭＳＯ－ｄ６中で攪拌した後に記録され、ほとんど変化しないままであった。ｉＰｈｏｓについては、反応がＤＭＳＯ－ｄ６中７０℃で３日間行われ、反応後のメチレン基の消失したピークａ（４．４ｐｐｍ）は、ほとんど全てのＰ１０がアミン基によって消費されたことを示した。さらに、あまり活性でないＰ１６もアミンと完全に反応することができた。 Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡを含有するｉＰＬＮＰで処置したＩＧＲＯＶ１細胞の細胞生存率を示す図である。ｉＰｈｏｓの大部分が無視できる細胞傷害性を示した。 本開示のある実施形態による、ＣＤＣｌ３中の９Ａ１Ｐ９; 1H NMR (CDCl3, ppm) δ 0.87 (m, 9H, -CH2CH2CH2CH3), 1.25 (m, 32H, -OCH2CH2(CH2)6CH3 and -N(CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH3)2), 1.55-1.84 (m, 6H, -OCH2CH2(CH2)6CH3 and -N(CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH3)2), 2.80 (m, 4H, -N(CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH3)2), 3.87 (m, 2H, -NCH2CH2O-), 3.96-4.28 (m, 4H, -NCH2CH2O- and -OCH2CH2(CH2)6CH3).13C NMR (CDCl3, ppm) δ 14.08, 14.10, 22.61, 22.66, 26.00, 27.00, 27.03, 29.16, 29.22, 29.25, 29.32, 29.45, 29.49, 29.62, 31.73, 31.77, 47.72. 31P NMR (CDCl3, ppm) δ -0.91, 0.94の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す図である。計算質量ｍ／ｚ４９１．４、実測［Ｍ＋Ｈ］＋（ＬＣ－ＭＳ）ｍ／ｚ４９２．４。 本開示のある実施形態による、ＣＤＣｌ３中の１０Ａ１Ｐ１０; 1H NMR (CDCl3, ppm) δ 0.87 (t, 9H, -CH2CH2CH2CH3), 1.25 (m, 42H, -OCH2CH2(CH2)7CH3 and -N(CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH3)2), 1.57-1.85 (m, 6H, -OCH2CH2(CH2)7CH3 and -N(CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH3)2), 2.81 (m, 4H, -N(CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH3)2), 3.87 (m, 2H, -NCH2CH2O-), 3.94-4.30 (m, 4H, -NCH2CH2O- and -OCH2CH2(CH2)7CH3).13C NMR (CDCl3, ppm) δ 14.10, 22.68, 26.00, 27.01, 27.05, 29.28, 29.32, 29.35, 29.46, 29.51, 29.57, 29.62, 31.86, 31.89, 47.61. 31P NMR (CDCl3, ppm) δ -1.08, 0.86の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す図である。計算質量ｍ／ｚ５６１．５、実測［Ｍ＋Ｈ］＋（ＬＣ－ＭＳ）ｍ／ｚ５６３．６。 本開示のある実施形態による、ＣＤＣｌ３中９Ａ１Ｐ１５の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す図である；カラムフラッシュクロマトグラフィーにより、わずかなＤＭＳＯが生成物中に残っていたが、９Ａ１Ｐ１５の効果に影響を及ぼさなかっただろう；1H NMR (CDCl3, ppm) δ 0.86 (m, 9H, -CH2CH2CH2CH3), 1.24 (m, 44H, -OCH2CH2(CH2)12CH3 and -N(CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH3)2), 1.56-1.86 (m, 6H, -OCH2CH2(CH2)12CH3 and -N(CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH3)2), 2.81 (m, 4H, -N(CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH3)2), 3.86 (m, 2H, -NCH2CH2O-), 3.94-4.30 (m, 4H, -NCH2CH2O- and -OCH2CH2(CH2)12CH3).13C NMR (CDCl3, ppm) δ 14.07, 14.11, 22.61, 22.68, 25.87, 26.96, 27.01, 29.16, 29.19, 29.23, 29.35, 29.47, 29.65, 29.70, 31.72, 31.76, 47.49. 31P NMR (CDCl3, ppm) δ -0.95, 0.80；計算質量ｍ／ｚ５７５．５、実測［Ｍ＋Ｈ］＋（ＬＣ－ＭＳ）ｍ／ｚ５７６．６。 本開示のある実施形態による、ＣＤＣｌ３中の１０Ａ１Ｐ１６; 1H NMR (CDCl3, ppm) δ 0.87 (t, 9H, -CH2CH2CH2CH3), 1.25 (m, 54H, -OCH2CH2(CH2)13CH3 and -N(CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH3)2), 1.54-1.78 (m, 6H, -OCH2CH2(CH2)13CH3 and -N(CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH3)2), 2.76 (m, 4H, -N(CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH3)2), 3.85 (m, 2H, -NCH2CH2O-), 3.95-4.28 (m, 4H, -NCH2CH2O- and -OCH2CH2(CH2)13CH3).13C NMR (CDCl3, ppm) δ 14.11, 22.68, 25.91, 27.10, 27.20, 29.31, 29.34, 29.56, 29.59, 29.64, 29.66, 29.72, 31.88, 31.91, 47.78. 31P NMR (CDCl3, ppm) δ -1.00, 0.76の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す図である；計算質量ｍ／ｚ６４５．６、実測［Ｍ＋Ｈ］＋（ＬＣ－ＭＳ）ｍ／ｚ６４６．６。 選択されたｉＰＬＮＰの粒径および多分散指数（ＰＤＩ）（図１５Ａ）、ゼータ電位（図１５Ｂ）、ならびにｍＲＮＡ結合有効性（図１５Ｃ）を示す図である。９Ａ１Ｐ９、１０Ａ１Ｐ１０、９Ａ１Ｐ１５および１０Ａ１Ｐ１６を精製したところ、それらのｉＰＬＮＰは約１５０ｎｍのサイズを示した。 図１６Ａが９Ａ１Ｐ９、９Ａ１Ｐ１５、１０Ａ１Ｐ１０、１０Ａ１Ｐ１６を示し、図１６Ｂが１６Ａ１Ｐ１０および２５Ａ３Ｐ９を示す、選択されたｉＰＬＮＰのｐＫａを示す図である。 ｉＰｈｏｓのアミン基側の異なる尾部長がインビボｍＲＮＡ発現有効性に影響を及ぼしたことを示す図である。図１７Ａは、注射６時間後の様々な臓器の生物発光イメージングを示している。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに０．１ｍｇ／ｋｇ ＦＬｕｃ ｍＲＮＡでｉＰＬＮＰによってＩＶ注射し、発光を注射６時間後に定量化した。図１７Ｂは、７Ａ１Ｐ１１～１１Ａ１Ｐ１１の構造を示している。図１７Ｃは、インビボでのｍＲＮＡ送達有効性に対するアミン基側のアルキル鎖長の効果を示している。短すぎる（４～６）炭素長と長すぎる（１０超）炭素長は共に肝臓における有効性を低下させた。８個および１０個の炭素長が、高いＦｌｕｃ ｍＲＮＡ発現を示す傾向があった。 ｉＰｈｏｓのリン酸基側の異なる尾部長が臓器選択的ｍＲＮＡ発現に影響を及ぼしたことを示す図である。図１８Ａは、注射６時間後の様々な臓器の生物発光イメージングを示している。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに０．１ｍｇ／ｋｇ ＦＬｕｃ ｍＲＮＡでｉＰＬＮＰによってＩＶ注射した。 ｉＰｈｏｓのリン酸基側の異なる尾部長が臓器選択的ｍＲＮＡ発現に影響を及ぼしたことを示す図である。図１８Ｂは、１０Ａ１Ｐ４～１０Ａ１Ｐ１６の構造を示している。 ｉＰｈｏｓのリン酸基側の異なる尾部長が臓器選択的ｍＲＮＡ発現に影響を及ぼしたことを示す図である。図１８Ｃは、臓器選択性に対するリン酸基側のアルキル鎖長の効果を示している。短い炭素長（４～８）はインビボで有効性を示さなかった。９個および１０個の炭素長は主に肝臓で高いＦｌｕｃ ｍＲＮＡ発現を媒介する傾向があった。興味深いことに、より長い炭素長（１３～１６）は、Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡ発現の大部分を脾臓に変化させた。 １０Ａ１Ｐ４～１０Ａ１Ｐ１６ ｉＰＬＮＰの粒径（図１９Ａ）、ゼータ電位（図１９Ｂ）、およびｐＫａ（図１９Ｃ）を示す図である。１０Ａ１Ｐ４～１０Ａ１Ｐ１６ ｉＰＬＮＰは一般に負に帯電しており、約２００ｎｍのサイズを示した。これらのナノ粒子は６．０～６．５のｐＫａを示した。 ９Ａ１Ｐ１５および１０Ａ１Ｐ１６ ｉＰＬＮＰのインビボ評価を示す図である。図２０Ａは、酸性エンドソーム環境における９Ａ１Ｐ１５および１０Ａ１Ｐ１６の構造を示している。 ９Ａ１Ｐ１５および１０Ａ１Ｐ１６ ｉＰＬＮＰのインビボ評価を示す図である。図２０Ｂは、０．２５ｍｇ／ｋｇ ＦＬｕｃ ｍＲＮＡでｉＰＬＮＰによってＩＶ注射したＣ５７ＢＬ／６マウスおよび注射６時間後に定量化した発光を示している。 ９Ａ１Ｐ１５および１０Ａ１Ｐ１６ ｉＰＬＮＰのインビボ評価を示す図である。図２０Ｃは、平均放射輝度によって記録される、様々な臓器でのルシフェラーゼ発現の定量化を示している。 ９Ａ１Ｐ９／ｍＲＮＡ重量比がインビボ有効性に影響を及ぼしたことを示す図である。図２１Ａは、酸性エンドソーム環境における９Ａ１Ｐ９の構造を示している。 ９Ａ１Ｐ９／ｍＲＮＡ重量比がインビボ有効性に影響を及ぼしたことを示す図である。図２１Ｂは、９：１（モル比１１６２２：１）および１８：１（モル比２３２４４：１）の重量比を有する９Ａ１Ｐ９／ｍＲＮＡの評価を示している。ｉＰｈｏｓ：ＭＤＯＡ：ｃｈｏｌ：ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００モル比を２５：３０：３０：１で固定した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに０．２５ｍｇ／ｋｇ ＦＬｕｃ ｍＲＮＡでｉＰＬＮＰによってＩＶ注射し、発光を注射６時間後に定量化した。 ９Ａ１Ｐ９／ｍＲＮＡ重量比がインビボ有効性に影響を及ぼしたことを示す図である。図２１Ｃは、平均放射輝度によって記録される、肝臓でのルシフェラーゼ発現の定量化を示している（ｎ＝３）。 ヘルパー脂質の構造を示す図である。イオン化可能カチオン性脂質はＭＤＯＡ、ＤＯＤＡＰ、および５Ａ２－ＳＣ８を含んでいた；永久カチオン性脂質はＤＤＡＢおよびＤＯＴＡＰを含んでいた。双性イオン性脂質ＤＯＰＥをヘルパー脂質として使用した。 異なるヘルパー脂質を有する９Ａ１Ｐ９ ｉＰＬＮＰの特性評価を示す図である。異なるヘルパー脂質を有する９Ａ１Ｐ９ ｉＰＬＮＰの粒径、ＰＤＩを評価した。全ての製剤について、９Ａ１Ｐ９：ＭＤＯＡ（ＤＯＤＡＰまたは５Ａ２－ＳＣ８）：ｃｈｏｌ：ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００（モル比）＝２５：３０：３０：１。９Ａ１Ｐ９：ＤＤＡＢ（またはＤＯＴＡＰ）：ｃｈｏｌ：ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００（モル比）＝６０：３０：４０：０．４。９Ａ１Ｐ９：ＤＯＰＥ：ｃｈｏｌ：ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００（モル比）＝５５：３０：４５：０．２。９Ａ１Ｐ９：ｍＲＮＡ（ｗ／ｗ）＝１８：１。 異なるヘルパー脂質を有する９Ａ１Ｐ９ ｉＰＬＮＰの特性評価を示す図である。異なるヘルパー脂質を有する９Ａ１Ｐ９ ｉＰＬＮＰのゼータ電位を評価した。全ての製剤について、９Ａ１Ｐ９：ＭＤＯＡ（ＤＯＤＡＰまたは５Ａ２－ＳＣ８）：ｃｈｏｌ：ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００（モル比）＝２５：３０：３０：１。９Ａ１Ｐ９：ＤＤＡＢ（またはＤＯＴＡＰ）：ｃｈｏｌ：ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００（モル比）＝６０：３０：４０：０．４。９Ａ１Ｐ９：ＤＯＰＥ：ｃｈｏｌ：ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００（モル比）＝５５：３０：４５：０．２。９Ａ１Ｐ９：ｍＲＮＡ（ｗ／ｗ）＝１８：１。 異なるヘルパー脂質を有する９Ａ１Ｐ９ ｉＰＬＮＰの特性評価を示す図である。異なるヘルパー脂質を有する９Ａ１Ｐ９ ｉＰＬＮＰのｍＲＮＡ結合有効性を評価した。全ての製剤について、９Ａ１Ｐ９：ＭＤＯＡ（ＤＯＤＡＰまたは５Ａ２－ＳＣ８）：ｃｈｏｌ：ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００（モル比）＝２５：３０：３０：１。９Ａ１Ｐ９：ＤＤＡＢ（またはＤＯＴＡＰ）：ｃｈｏｌ：ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００（モル比）＝６０：３０：４０：０．４。９Ａ１Ｐ９：ＤＯＰＥ：ｃｈｏｌ：ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００（モル比）＝５５：３０：４５：０．２。９Ａ１Ｐ９：ｍＲＮＡ（ｗ／ｗ）＝１８：１。 異なるヘルパー脂質を有する９Ａ１Ｐ９ ｉＰＬＮＰの特性評価を示す図である。異なるヘルパー脂質を有する９Ａ１Ｐ９ ｉＰＬＮＰのｐＫａを評価した。全ての製剤について、９Ａ１Ｐ９：ＭＤＯＡ（ＤＯＤＡＰまたは５Ａ２－ＳＣ８）：ｃｈｏｌ：ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００（モル比）＝２５：３０：３０：１。９Ａ１Ｐ９：ＤＤＡＢ（またはＤＯＴＡＰ）：ｃｈｏｌ：ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００（モル比）＝６０：３０：４０：０．４。９Ａ１Ｐ９：ＤＯＰＥ：ｃｈｏｌ：ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００（モル比）＝５５：３０：４５：０．２。９Ａ１Ｐ９：ｍＲＮＡ（ｗ／ｗ）＝１８：１。 異なるヘルパー脂質を有する９Ａ１Ｐ９ ｉＰＬＮＰの特性評価を示す図である。異なるヘルパー脂質を有する９Ａ１Ｐ９ ｉＰＬＮＰのＩＧＲＯＶ－１細胞におけるインビトロｍＲＮＡ送達有効性（２５ｎｇ ｍＲＮＡ）を評価した。全ての製剤について、９Ａ１Ｐ９：ＭＤＯＡ（ＤＯＤＡＰまたは５Ａ２－ＳＣ８）：ｃｈｏｌ：ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００（モル比）＝２５：３０：３０：１。９Ａ１Ｐ９：ＤＤＡＢ（またはＤＯＴＡＰ）：ｃｈｏｌ：ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００（モル比）＝６０：３０：４０：０．４。９Ａ１Ｐ９：ＤＯＰＥ：ｃｈｏｌ：ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００（モル比）＝５５：３０：４５：０．２。９Ａ１Ｐ９：ｍＲＮＡ（ｗ／ｗ）＝１８：１。 Ｃｙ５－ｍＲＮＡの臓器分布を示す図である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに０．２５ｍｇ／ｋｇ Ｃｙ５－ｍＲＮＡでＰＢＳ（図２４Ａ）またはｉＰＬＮＰ ９Ａ１Ｐ９－５Ａ２－ＳＣ８（図２４Ｂ）または９Ａ１Ｐ９－ＤＤＡＢ（図２４Ｃ）をＩＶ注射し、６時間後に画像化した。ｉＰＬＮＰ製剤については、２５：３０：３０：１の９Ａ１Ｐ９：５Ａ２－ＳＣ８：ｃｈｏｌ：ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００モル比および６０：３０：４０：０．４の９Ａ１Ｐ９：ＤＤＡＢ：ｃｈｏｌ：ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００モル比を使用した；９Ａ１Ｐ９／ｍＲＮＡ（ｗ／ｗ）を１８／１で固定した。 それぞれ、肝臓および肺での高いｍＲＮＡ送達有効性を示した、９Ａ１Ｐ９－５Ａ２－ＳＣ８（図２５Ａ）および９Ａ１Ｐ９－ＤＤＡＢ（図２５Ｂ）ｉＰＬＮＰを示す図である。２５：３０：３０：１の９Ａ１Ｐ９：５Ａ２－ＳＣ８：ｃｈｏｌ：ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００（モル比）（Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡ、０．０５ｍｇ／ｋｇ）および６０：３０：４０：０．４の９Ａ１Ｐ９：ＤＤＡＢ：ｃｈｏｌ：ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００（モル比）（Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡ、０．２５ｍｇ／ｋｇ）を使用した。９Ａ１Ｐ９：ｍＲＮＡ重量比を１８：１で固定した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスにｉＰＬＮＰによってＩＶ注射し、６時間後に画像化した。 異なる臓器選択的ｉＰＬＮＰによるＦｌｕｃタンパク質発現の速度論分析を示す図である。９Ａ１Ｐ９－５Ａ２－ＳＣ８（肝臓特異的、０．０５ｍｇ／ｋｇ ＦｌｕｃｍＲＮＡ；図２６Ａ）、９Ａ１Ｐ９－ＤＤＡＢ（肺特異的、０．２５ｍｇ／ｋｇ Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡ；図２６Ｂ）および１０Ａ１Ｐ１６－ＭＤＯＡ（脾臓特異的、０．２５ｍｇ／ｋｇ Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡ；図２６Ｃ）ｉＰＬＮＰをＣ５７ＢＬ／６マウスにＩＶ投与した。臓器を３時間後、６時間後、１２時間後、および２４時間後に画像化した。データは平均±ｓ．ｄ．として提示される（ｎ＝３の生物学的に独立したマウス）。 ９Ａ１Ｐ９－５Ａ２－ＳＣ８ ｉＰＬＮＰが肝細胞で約９１％のｔｄＴｏｍａｔｏ編集を達成したことを示す図である。図２７Ａは、Ａｉ９マウスにＩＶ投与した９Ａ１Ｐ９－５Ａ２－ＳＣ８ ｉＰＬＮＰ（Ｃｒｅ ｍＲＮＡ、０．２５ｍｇ／ｋｇ）を示している。４８時間後に、肝細胞を単離し、フローサイトメトリーによって分析した。図２７Ｂは、Ａｉ９マウスにＩＶ注射したＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ ＬＮＰ（Ｃｒｅ ｍＲＮＡ、０．２５ｍｇ／ｋｇ）を示している。４８時間後に、肝細胞を単離し、フローサイトメトリーによって分析した。図２７Ｃは、９Ａ１Ｐ９－５Ａ２－ＳＣ８ ｉＰＬＮＰおよびＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ ＬＮＰの併合した結果を示している。全てのデータがｎ＝３の生物学的に独立したマウスからのものである。 ｔｄＴｏｍａｔｏ陽性肺細胞の百分率を示す図である。肺細胞でのｔｄＴｏｍａｔｏ発現を分析するためのＦＡＣＳゲーティング戦略を使用した。手短に言えば、Ｇｈｏｓｔ Ｒｅｄ ７８０を利用して生細胞と死細胞を区別した。ＥｐＣａｍ＋を使用して上皮細胞を定義し、ＣＤ４５＋およびＣＤ３１－を使用して免疫細胞を定義し、ＣＤ４５－およびＣＤ３１＋を使用して内皮細胞を定義した。細胞型におけるｔｄＴｏｍａｔｏ＋のゲートを、ＰＢＳを注射した対照Ａｉ９マウスに基づいて引いた。Ａｉ９マウスに９Ａ１Ｐ９－ＤＤＡＢ ｉＰＬＮＰ（Ｃｒｅ ｍＲＮＡ、０．２５ｍｇ／ｋｇ）によってＩＶ注射し、所与の細胞型のｔｄＴｏｍａｔｏ＋を４８時間後にフローサイトメトリーによって検出した。データは平均±ｓ．ｄ．として提示される（ｎ＝３の生物学的に独立したマウス）。 ｔｄＴｏｍａｔｏ陽性脾細胞の百分率を示す図である。脾細胞でのｔｄＴｏｍａｔｏ発現を分析するためのＦＡＣＳゲーティング戦略を使用した。手短に言えば、Ｇｈｏｓｔ Ｒｅｄ ７８０を利用して生細胞と死細胞を区別した。ＣＤ４５＋を使用して免疫細胞を区別し、次いで、ＣＤ３＋およびＣＤ１１ｂ－をＴ細胞に使用し、ＣＤ３－およびＣＤ１１ｂ＋をマクロファージ細胞に使用し、ＣＤ１９＋およびＣＤ１１ｂ－をＢ細胞に使用した。細胞型におけるｔｄＴｏｍａｔｏ＋のゲートを、ＰＢＳを注射した対照マウスに基づいて引いた。Ａｉ９マウスに１０Ａ１Ｐ１６－ＭＤＯＡ ｉＰＬＮＰ（Ｃｒｅ ｍＲＮＡ、０．５ｍｇ／ｋｇ）によってＩＶ注射し、所与の細胞型のｔｄＴｏｍａｔｏ＋を４８時間後にフローサイトメトリーによって検出した。データは平均±ｓ．ｄ．として提示される（ｎ＝３の生物学的に独立したマウス）。 どのようにＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒマイクロ流体混合システムを使用してｉＰＬＮＰサイズを減少させることができるかを示す図である。ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒマイクロ流体混合システムを使用して１０Ａ１Ｐ１６－ＭＤＯＡ ｉＰＬＮＰを調製したところ、１００ｎｍ未満の小さなサイズを示した。ｉＰＬＮＰ直径を減少させた後でも高いインビボｍＲＮＡ送達有効性および正確な臓器選択性が完全に保持された（図３０Ａ）。１０Ａ１Ｐ１６－ＭＤＯＡ ｉＰＬＮＰ（Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡ、０．２５ｍｇ／ｋｇ）は、脾臓でのｍＲＮＡ翻訳を媒介した（図３０Ｂ）。（ｎ＝３の生物学的に独立したマウス）。 ｍＲＮＡを搭載する１０Ａ１Ｐ１６－ＭＤＯＡ ｉＰＬＮＰがインビボで忍容性が高いことを実証する、肝臓マーカー測定（ＢＵＮ（図３１Ａ）；ＣＲＥＡ（図３１Ｂ）；ＡＴＬ（図３１Ｃ）；およびＡＳＴ（図３１Ｄ））を示す図である。１０Ａ１Ｐ１６－ＭＤＯＡ（脾臓特異的）ｉＰＬＮＰをＣ５７ＢＬ／６マウスに静脈内（ＩＶ）投与した（０．２５ｍｇ／ｋｇ）。リポ多糖（ＬＰＳ、５ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ）を陽性対照として使用し、ＰＢＳ（ＩＶ）を陰性対照として調べた。注射２４時間後に、腎機能（ＢＵＮおよびＣＲＥＡ）および肝機能（ＡＬＴおよびＡＳＴ）を評価した。ＬＰＳ処置マウスは重度の腎および肝傷害を示した。１０Ａ１Ｐ１６－ＭＤＯＡ ｉＰＬＮＰ群とＰＢＳ群との間で有意差はなかった。データは平均±ｓ．ｄ．として提示される（ｎ＝３の生物学的に独立したマウス）。統計学的有意性を両側の対応のないｔ検定によって分析した。＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１；＊＊＊、Ｐ＜０．００１；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊、Ｐ＜０．０５。 ｐＤＮＡおよびｓｉＲＮＡの効率的な送達のｉＰＬＮＰ可能化を示す図である。図３２Ａは、ｐＣＭＶ－Ｌｕｃ ｐＤＮＡを送達するために使用した９Ａ１Ｐ９－５Ａ２－ＳＣ８ ｉＰＬＮＰおよび９Ａ１Ｐ９－ＤＤＡＢ ｉＰＬＮＰを示している。１ウェル当たり１２．５ｎｇおよび２５ｎｇのｐＤＮＡを適用した。結果を未処置細胞に正規化した。図３２Ｂは、ｓｉＬｕｃ（ｓｉＲＮＡ）を効率的に送達した９Ａ１Ｐ９－５Ａ２－ＳＣ８ ｉＰＬＮＰおよび９Ａ１Ｐ９－ＤＤＡＢ ｉＰＬＮＰを示している。１ウェル当たり１２．５ｎｇおよび２５ｎｇのｓｉＲＮＡを利用した。データは平均±ｓ．ｄ．として提示される（ｎ＝３の生物学的に独立した試料）。 ｍＲＮＡの皮下組織への効率的な送達のｉＰＬＮＰ可能化を示す図である。図３３Ａは、Ｃｒｅレコンビナーゼ（ＣＲＥ）ｍＲＮＡを含有するＰＢＳ、９Ａ１－Ｐ９、９Ａ１－Ｐ１５、および１０Ａ１－Ｐ１６のＡｉ９マウスへの皮下注射後に、ｔｄＴｏｍａｔｏ陽性細胞が注射４４時間後にＩＶＩＳを介して観察されたことを示している。図３３Ｂは、Ｃｒｅレコンビナーゼ（ＣＲＥ）ｍＲＮＡを含有するＰＢＳ、９Ａ１－Ｐ９、９Ａ１－Ｐ１５、および１０Ａ１－Ｐ１６の皮下注射の４４時間後のＡｉ９マウスの皮下組織（例えば、皮膚）でのｔｄＴｏｍａｔｏ発現の定量化を示している。
以下の詳細な説明は、本開示の様々な実施形態を例示する付随する図面を参照する。図面および説明は、当業者が本開示を実施することを可能にするのに十分詳細に本開示の態様および実施形態を説明することを意図している。本開示の範囲から逸脱することなく、他の成分を利用することができ、変更を行うことができる。したがって、以下の説明は限定的な意味で解釈されるべきではない。本開示の範囲は、特許請求の範囲が権利を与えられる等価物の全範囲と合わせて添付の特許請求の範囲によってのみ定義される。
本開示は、少なくとも部分的に、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）に使用するためのイオン化可能な合成リン脂質の特定に基づく。したがって、本開示は、イオン化可能な合成リン脂質組成物およびその調製方法、本明細書のイオン化可能な合成リン脂質を含むＬＮＰ組成物およびその調製方法、本明細書に開示される組成物を使用する方法、ならびに本明細書に開示される方法の実施に使用されるキットを提供する。
Ｉ．イオン化可能な合成リン脂質
本開示は、新たなクラスのイオン化可能な合成リン脂質を提供する。一部の実施形態では、本明細書で提供されるイオン化可能な合成リン脂質が、式（Ｉ）：
（式中、Ｒ１は、Ｃ２～Ｃ２０非置換アルキル、Ｃ２～Ｃ２０置換アルキル、Ｃ２～Ｃ２０非置換アルケニル、Ｃ２～Ｃ２０置換アルケニル、Ｃ２～Ｃ２０非置換アルキニル、Ｃ２～Ｃ２０置換アルキニル、Ｃ４～Ｃ２０非置換シクロアルキル、およびＣ４～Ｃ２０置換シクロアルキルからなる群から選択され；Ｒ２、およびＲ３は、Ｈ、Ｃ１～Ｃ２０非置換アルキル、Ｃ１～Ｃ２０置換アルキル、Ｃ１～Ｃ２０非置換アルケニル、Ｃ１～Ｃ２０置換アルケニル、Ｃ１～Ｃ２０非置換アルキニル、Ｃ１～Ｃ２０置換アルキニル、Ｃ４～Ｃ２０非置換シクロアルキル、およびＣ４～Ｃ２０置換シクロアルキルからなる群から独立して選択され；Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７は、Ｈ、Ｃ１～Ｃ８非置換アルキル、Ｃ１～Ｃ８置換アルキル、Ｃ１～Ｃ８非置換アルケニル、Ｃ１～Ｃ８置換アルケニル、Ｃ１～Ｃ８非置換アルキニル、およびＣ１～Ｃ８置換アルキニルからなる群から独立して選択され；Ｒ８は、Ｃ３～Ｃ２１非置換アルキル、Ｃ３～Ｃ２１置換アルキル、Ｃ３～Ｃ２１非置換アルケニル、Ｃ３～Ｃ２１置換アルケニル、Ｃ３～Ｃ２１非置換アルキニル、およびＣ３～Ｃ２１置換アルキニルからなる群から選択され；ｎは１～４の整数である）
を有し得る。
少なくとも一部の例では、Ｒ１が、Ｃ２～Ｃ１６非置換アルキル、Ｃ２～Ｃ１６置換アルキル、またはＣ４～Ｃ１２置換シクロアルキルからなる群から選択され；Ｒ２、およびＲ３が、Ｈ、Ｃ１～Ｃ１６非置換アルキル、Ｃ１～Ｃ１６置換アルキル、またはＣ４～Ｃ１６置換シクロアルキルからなる群から独立して選択され；Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７が、Ｈ、Ｃ１～Ｃ４非置換アルキル、またはＣ１～Ｃ４置換アルキルからなる群から独立して選択され；Ｒ８がＣ３～Ｃ１８非置換アルキルから選択され；ｎが１～３の整数である。
他の例では、Ｒ１がＣ２～Ｃ１５非置換アルキルであり；Ｒ２およびＲ３が、Ｈ、Ｃ１～Ｃ１６置換アルキル、またはＣ４～Ｃ１６置換シクロアルキルからなる群から独立して選択され；Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７が、Ｈ、メチル、またはエチルからなる群から独立して選択され；Ｒ８がＣ４～Ｃ１６非置換アルキルから選択され；ｎが１～２の整数である。
一部の実施形態では、本明細書で提供されるイオン化可能な合成リン脂質が、式（ＩＩ）：
（式中、Ｒ１およびＲ２は、Ｈ、Ｃ１～Ｃ８置換アルキル、またはＣ１～Ｃ８非置換アルキルからなる群から独立して選択され；Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６は、Ｈ、Ｃ１～Ｃ８非置換アルキル、またはＣ１～Ｃ８置換アルキルからなる群から独立して選択され；Ｒ７は、Ｃ３～Ｃ２１非置換アルキルまたはＣ３～Ｃ２１置換アルキルからなる群から選択され；ｎは１～４の整数である）
を有し得る。
一部の例では、Ｒ１およびＲ２が、Ｈ、Ｃ１～Ｃ６置換アルキル、またはＣ１～Ｃ６非置換アルキルからなる群から独立して選択され；Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６が、Ｈ、Ｃ１～Ｃ４非置換アルキル、またはＣ１～Ｃ４置換アルキルからなる群から独立して選択され；Ｒ７が、Ｃ３～Ｃ１８非置換アルキルまたはＣ３～Ｃ１８置換アルキルからなる群から選択され；ｎが１～３の整数である。
一部の例では、Ｒ１およびＲ２が、Ｈ、Ｃ１～Ｃ４置換アルキル、またはＣ１～Ｃ４非置換アルキルからなる群から独立して選択され；Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６が、Ｈ、メチル、またはエチルからなる群から独立して選択され；Ｒ７が、Ｃ３～Ｃ１５非置換アルキルまたはＣ３～Ｃ１５置換アルキルからなる群から選択され；ｎが１～２の整数である。
他の例では、Ｒ１およびＲ２が、Ｈ、Ｃ１～Ｃ８置換アルキル、Ｃ１～Ｃ８非置換アルキル、Ｃ２～Ｃ８非置換アルケニル、Ｃ２～Ｃ８置換アルケニル、Ｃ２～Ｃ８非置換アルキニル、またはＣ２～Ｃ８置換アルキニルからなる群から独立して選択され；Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６が、Ｈ、Ｃ１～Ｃ８置換アルキル、Ｃ１～Ｃ８非置換アルキル、Ｃ１～Ｃ８非置換アルケニル、Ｃ２～Ｃ８置換アルケニル、Ｃ２～Ｃ８非置換アルキニル、またはＣ２～Ｃ８置換アルキニルからなる群から独立して選択され；Ｒ７が、Ｃ３～Ｃ２１非置換アルキル、Ｃ３～Ｃ２１置換アルキル、Ｃ３～Ｃ２１非置換アルケニル、Ｃ３～Ｃ２１置換アルケニル、Ｃ３～Ｃ２１非置換アルキニル、またはＣ３～Ｃ２１置換アルキニルからなる群から選択され；ｎが１～４の整数である。
そのうえ他の例では、Ｒ１およびＲ２が、Ｈ、Ｃ１～Ｃ６置換アルキル、Ｃ１～Ｃ６非置換アルキル、Ｃ２～Ｃ６非置換アルケニル、Ｃ２～Ｃ６置換アルケニル、Ｃ２～Ｃ６非置換アルキニル、またはＣ２～Ｃ６置換アルキニルからなる群から独立して選択され；Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６が、Ｈ、Ｃ１～Ｃ４非置換アルキル、Ｃ１～Ｃ４置換アルキル、Ｃ２～Ｃ４非置換アルケニル、Ｃ２～Ｃ４置換アルケニル、Ｃ２～Ｃ４非置換アルキニル、またはＣ２～Ｃ４置換アルキニルからなる群から独立して選択され；Ｒ７が、Ｃ３～Ｃ１８非置換アルキルまたはＣ３～Ｃ１８置換アルキルからなる群から選択され；ｎが１～３の整数である。
さらに他の例では、Ｒ１およびＲ２が、Ｈ、Ｃ１～Ｃ４置換アルキル、またはＣ１～Ｃ４非置換アルキルからなる群から独立して選択され；Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６が、Ｈ、メチル、またはエチルからなる群から独立して選択され；Ｒ７が、Ｃ３～Ｃ１５非置換アルキルまたはＣ３～Ｃ１５置換アルキルからなる群から選択され；ｎが１～２の整数である。
一部の実施形態では、本明細書で提供されるイオン化可能な合成リン脂質が、式（ＩＩＩ）：
（式中、Ｒ１は、Ｃ２～Ｃ２０非置換アルキル、Ｃ２～Ｃ２０置換アルキル、Ｃ２～Ｃ２０非置換アルケニル、Ｃ２～Ｃ２０置換アルケニル、Ｃ２～Ｃ２０非置換アルキニル、Ｃ２～Ｃ２０置換アルキニル、Ｃ４～Ｃ２０非置換シクロアルキル、またはＣ４～Ｃ２０置換シクロアルキルからなる群から選択され；Ｒ２、およびＲ３は、Ｈ、Ｃ１～Ｃ２０非置換アルキル、Ｃ１～Ｃ２０置換アルキル、Ｃ１～Ｃ２０非置換アルケニル、Ｃ１～Ｃ２０置換アルケニル、Ｃ１～Ｃ２０非置換アルキニル、Ｃ１～Ｃ２０置換アルキニル、Ｃ４～Ｃ２０非置換シクロアルキル、またはＣ４～Ｃ２０置換シクロアルキルからなる群から独立して選択され；Ｒ４およびＲ５は、Ｈ、Ｃ１～Ｃ８非置換アルキル、Ｃ１～Ｃ８置換アルキル、Ｃ１～Ｃ８非置換アルケニル、Ｃ１～Ｃ８置換アルケニル、Ｃ１～Ｃ８非置換アルキニル、またはＣ１～Ｃ８置換アルキニルからなる群から独立して選択され；Ｒ６は、Ｃ３～Ｃ２１非置換アルキル、Ｃ３～Ｃ２１置換アルキル、Ｃ３～Ｃ２１非置換アルケニル、Ｃ３～Ｃ２１置換アルケニル、Ｃ３～Ｃ２１非置換アルキニル、またはＣ３～Ｃ２１置換アルキニルからなる群から選択され；ｎは１～４の整数であり；ｍは１～４の整数である）
を有し得る。
一部の例では、Ｒ１が、Ｃ２～Ｃ１６非置換アルキル、Ｃ２～Ｃ１６置換アルキル、Ｃ２～Ｃ１６非置換アルケニル、Ｃ２～Ｃ１６置換アルケニル、Ｃ２～Ｃ１６非置換アルキニル、Ｃ２～Ｃ１６置換アルキニル、Ｃ４～Ｃ１６非置換シクロアルキル、またはＣ４～Ｃ１６置換シクロアルキルからなる群から選択され；Ｒ２、およびＲ３が、Ｈ、Ｃ１～Ｃ１６非置換アルキル、Ｃ１～Ｃ１６置換アルキル、Ｃ１～Ｃ１６非置換アルケニル、Ｃ１～Ｃ１６置換アルケニル、Ｃ１～Ｃ１６非置換アルキニル、Ｃ１～Ｃ１６置換アルキニル、Ｃ４～Ｃ１６非置換シクロアルキル、またはＣ４～Ｃ１６置換シクロアルキルからなる群から独立して選択され；Ｒ４およびＲ５が、Ｈ、Ｃ１～Ｃ６非置換アルキル、Ｃ１～Ｃ６置換アルキル、Ｃ１～Ｃ６非置換アルケニル、Ｃ１～Ｃ６置換アルケニル、Ｃ１～Ｃ６非置換アルキニル、またはＣ１～Ｃ６置換アルキニルからなる群から独立して選択され；Ｒ６が、Ｃ３～Ｃ１８非置換アルキル、Ｃ３～Ｃ１８置換アルキル、Ｃ３～Ｃ１８非置換アルケニル、Ｃ３～Ｃ１８置換アルケニル、Ｃ３～Ｃ１８非置換アルキニル、またはＣ３～Ｃ１８置換アルキニルからなる群から選択され；ｎが１～３の整数であり；ｍが１～３の整数である。
他の例では、Ｒ１がＣ２～Ｃ１５非置換アルキルであり；Ｒ２およびＲ３が、Ｈ、Ｃ１～Ｃ１６置換アルキル、またはＣ４～Ｃ１６置換シクロアルキルからなる群から独立して選択され；Ｒ４およびＲ５が、Ｈ、メチル、またはエチルからなる群から独立して選択され；Ｒ６がＣ４～Ｃ１６非置換アルキルから選択され；ｎが１～２の整数であり；ｍが１～２の整数である。
一部の実施形態では、本明細書で提供されるイオン化可能な合成リン脂質が、式（ＩＶ）：
ｎＡｘＰｍ 式（ＩＶ）
（式中、「Ｐｍ」はアルキル化ジオキサホスホランオキシド分子を指し、「ｎＡ」はアミンを指し、「ｎＡｘＰｍ」の「ｘ」は１つのアミン分子上の修飾されたＰｍ分子の数を指す）
を有し得る。一部の態様では、本明細書のイオン化可能な合成リン脂質が、Ｐｍが
から選択される１つまたは複数を含み得る、式（ＩＶ）を有し得る。一部の態様では、本明細書のイオン化可能な合成リン脂質が、ｎＡが
から選択される１つまたは複数を含み得る、式（ＩＶ）を有し得る。
一部の実施形態では、ｎＡｘＰｍ 式（ＩＶ）を有する本明細書で提供されるイオン化可能な合成リン脂質が、１ＡｘＰ４、１ＡｘＰ５、１ＡｘＰ６、１ＡｘＰ７、１ＡｘＰ８、１ＡｘＰ９、１ＡｘＰ１０、１ＡｘＰ１１、１ＡｘＰ１２、１ＡｘＰ１３、１ＡｘＰ１４、１ＡｘＰ１５、１ＡｘＰ１６、２ＡｘＰ４、２ＡｘＰ５、２ＡｘＰ６、２ＡｘＰ７、２ＡｘＰ８、２ＡｘＰ９、２ＡｘＰ１０、２ＡｘＰ１１、２ＡｘＰ１２、２ＡｘＰ１３、２ＡｘＰ１４、２ＡｘＰ１５、２ＡｘＰ１６、３ＡｘＰ４、３ＡｘＰ５、３ＡｘＰ６、３ＡｘＰ７、３ＡｘＰ８、３ＡｘＰ９、３ＡｘＰ１０、３ＡｘＰ１１、３ＡｘＰ１２、３ＡｘＰ１３、３ＡｘＰ１４、３ＡｘＰ１５、３ＡｘＰ１６、４ＡｘＰ４、４ＡｘＰ５、４ＡｘＰ６、４ＡｘＰ７、４ＡｘＰ８、４ＡｘＰ９、４ＡｘＰ１０、４ＡｘＰ１１、４ＡｘＰ１２、４ＡｘＰ１３、４ＡｘＰ１４、４ＡｘＰ１５、４ＡｘＰ１６、５ＡｘＰ４、５ＡｘＰ５、５ＡｘＰ６、５ＡｘＰ７、５ＡｘＰ８、５ＡｘＰ９、５ＡｘＰ１０、５ＡｘＰ１１、５ＡｘＰ１２、５ＡｘＰ１３、５ＡｘＰ１４、５ＡｘＰ１５、５ＡｘＰ１６、６ＡｘＰ４、６ＡｘＰ５、６ＡｘＰ６、６ＡｘＰ７、６ＡｘＰ８、６ＡｘＰ９、６ＡｘＰ１０、６ＡｘＰ１１、６ＡｘＰ１２、６ＡｘＰ１３、６ＡｘＰ１４、６ＡｘＰ１５、６ＡｘＰ１６、７ＡｘＰ４、７ＡｘＰ５、７ＡｘＰ６、７ＡｘＰ７、７ＡｘＰ８、７ＡｘＰ９、７ＡｘＰ１０、７ＡｘＰ１１、７ＡｘＰ１２、７ＡｘＰ１３、７ＡｘＰ１４、７ＡｘＰ１５、７ＡｘＰ１６、８ＡｘＰ４、８ＡｘＰ５、８ＡｘＰ６、８ＡｘＰ７、８ＡｘＰ８、８ＡｘＰ９、８ＡｘＰ１０、８ＡｘＰ１１、８ＡｘＰ１２、８ＡｘＰ１３、８ＡｘＰ１４、８ＡｘＰ１５、８ＡｘＰ１６、９ＡｘＰ４、９ＡｘＰ５、９ＡｘＰ６、９ＡｘＰ７、９ＡｘＰ８、９ＡｘＰ９、９ＡｘＰ１０、９ＡｘＰ１１、９ＡｘＰ１２、９ＡｘＰ１３、９ＡｘＰ１４、９ＡｘＰ１５、９ＡｘＰ１６、１０ＡｘＰ４、１０ＡｘＰ５、１０ＡｘＰ６、１０ＡｘＰ７、１０ＡｘＰ８、１０ＡｘＰ９、１０ＡｘＰ１０、１０ＡｘＰ１１、１０ＡｘＰ１２、１０ＡｘＰ１３、１０ＡｘＰ１４、１０ＡｘＰ１５、１０ＡｘＰ１６、１１ＡｘＰ４、１１ＡｘＰ５、１１ＡｘＰ６、１１ＡｘＰ７、１１ＡｘＰ８、１１ＡｘＰ９、１１ＡｘＰ１０、１１ＡｘＰ１１、１１ＡｘＰ１２、１１ＡｘＰ１３、１１ＡｘＰ１４、１１ＡｘＰ１５、１１ＡｘＰ１６、１２ＡｘＰ４、１２ＡｘＰ５、１２ＡｘＰ６、１２ＡｘＰ７、１２ＡｘＰ８、１２ＡｘＰ９、１２ＡｘＰ１０、１２ＡｘＰ１１、１２ＡｘＰ１２、１２ＡｘＰ１３、１２ＡｘＰ１４、１２ＡｘＰ１５、１２ＡｘＰ１６、１３ＡｘＰ４、１３ＡｘＰ５、１３ＡｘＰ６、１３ＡｘＰ７、１３ＡｘＰ８、１３ＡｘＰ９、１３ＡｘＰ１０、１３ＡｘＰ１１、１３ＡｘＰ１２、１３ＡｘＰ１３、１３ＡｘＰ１４、１３ＡｘＰ１５、１３ＡｘＰ１６、１４ＡｘＰ４、１４ＡｘＰ５、１４ＡｘＰ６、１４ＡｘＰ７、１４ＡｘＰ８、１４ＡｘＰ９、１４ＡｘＰ１０、１４ＡｘＰ１１、１４ＡｘＰ１２、１４ＡｘＰ１３、１４ＡｘＰ１４、１４ＡｘＰ１５、１４ＡｘＰ１６、１５ＡｘＰ４、１５ＡｘＰ５、１５ＡｘＰ６、１５ＡｘＰ７、１５ＡｘＰ８、１５ＡｘＰ９、１５ＡｘＰ１０、１５ＡｘＰ１１、１５ＡｘＰ１２、１５ＡｘＰ１３、１５ＡｘＰ１４、１５ＡｘＰ１５、１５ＡｘＰ１６、１６ＡｘＰ４、１６ＡｘＰ５、１６ＡｘＰ６、１６ＡｘＰ７、１６ＡｘＰ８、１６ＡｘＰ９、１６ＡｘＰ１０、１６ＡｘＰ１１、１６ＡｘＰ１２、１６ＡｘＰ１３、１６ＡｘＰ１４、１６ＡｘＰ１５、１６ＡｘＰ１６、１７ＡｘＰ４、１７ＡｘＰ５、１７ＡｘＰ６、１７ＡｘＰ７、１７ＡｘＰ８、１７ＡｘＰ９、１７ＡｘＰ１０、１７ＡｘＰ１１、１７ＡｘＰ１２、１７ＡｘＰ１３、１７ＡｘＰ１４、１７ＡｘＰ１５、１７ＡｘＰ１６、１８ＡｘＰ４、１８ＡｘＰ５、１８ＡｘＰ６、１８ＡｘＰ７、１８ＡｘＰ８、１８ＡｘＰ９、１８ＡｘＰ１０、１８ＡｘＰ１１、１８ＡｘＰ１２、１８ＡｘＰ１３、１８ＡｘＰ１４、１８ＡｘＰ１５、１８ＡｘＰ１６、１９ＡｘＰ４、１９ＡｘＰ５、１９ＡｘＰ６、１９ＡｘＰ７、１９ＡｘＰ８、１９ＡｘＰ９、１９ＡｘＰ１０、１９ＡｘＰ１１、１９ＡｘＰ１２、１９ＡｘＰ１３、１９ＡｘＰ１４、１９ＡｘＰ１５、１９ＡｘＰ１６、２０ＡｘＰ４、２０ＡｘＰ５、２０ＡｘＰ６、２０ＡｘＰ７、２０ＡｘＰ８、２０ＡｘＰ９、２０ＡｘＰ１０、２０ＡｘＰ１１、２０ＡｘＰ１２、２０ＡｘＰ１３、２０ＡｘＰ１４、２０ＡｘＰ１５、２０ＡｘＰ１６、２１ＡｘＰ４、２１ＡｘＰ５、２１ＡｘＰ６、２１ＡｘＰ７、２１ＡｘＰ８、２１ＡｘＰ９、２１ＡｘＰ１０、２１ＡｘＰ１１、２１ＡｘＰ１２、２１ＡｘＰ１３、２１ＡｘＰ１４、２１ＡｘＰ１５、２１ＡｘＰ１６、２２ＡｘＰ４、２２ＡｘＰ５、２２ＡｘＰ６、２２ＡｘＰ７、２２ＡｘＰ８、２２ＡｘＰ９、２２ＡｘＰ１０、２２ＡｘＰ１１、２２ＡｘＰ１２、２２ＡｘＰ１３、２２ＡｘＰ１４、２２ＡｘＰ１５、２２ＡｘＰ１６、２３ＡｘＰ４、２３ＡｘＰ５、２３ＡｘＰ６、２３ＡｘＰ７、２３ＡｘＰ８、２３ＡｘＰ９、２３ＡｘＰ１０、２３ＡｘＰ１１、２３ＡｘＰ１２、２３ＡｘＰ１３、２３ＡｘＰ１４、２３ＡｘＰ１５、２３ＡｘＰ１６、２４ＡｘＰ４、２４ＡｘＰ５、２４ＡｘＰ６、２４ＡｘＰ７、２４ＡｘＰ８、２４ＡｘＰ９、２４ＡｘＰ１０、２４ＡｘＰ１１、２４ＡｘＰ１２、２４ＡｘＰ１３、２４ＡｘＰ１４、２４ＡｘＰ１５、２４ＡｘＰ１６、２５ＡｘＰ４、２５ＡｘＰ５、２５ＡｘＰ６、２５ＡｘＰ７、２５ＡｘＰ８、２５ＡｘＰ９、２５ＡｘＰ１０、２５ＡｘＰ１１、２５ＡｘＰ１２、２５ＡｘＰ１３、２５ＡｘＰ１４、２５ＡｘＰ１５、２５ＡｘＰ１６、２６ＡｘＰ４、２６ＡｘＰ５、２６ＡｘＰ６、２６ＡｘＰ７、２６ＡｘＰ８、２６ＡｘＰ９、２６ＡｘＰ１０、２６ＡｘＰ１１、２６ＡｘＰ１２、２６ＡｘＰ１３、２６ＡｘＰ１４、２６ＡｘＰ１５、２６ＡｘＰ１６、２７ＡｘＰ４、２７ＡｘＰ５、２７ＡｘＰ６、２７ＡｘＰ７、２７ＡｘＰ８、２７ＡｘＰ９、２７ＡｘＰ１０、２７ＡｘＰ１１、２７ＡｘＰ１２、２７ＡｘＰ１３、２７ＡｘＰ１４、２７ＡｘＰ１５、２７ＡｘＰ１６、２８ＡｘＰ４、２８ＡｘＰ５、２８ＡｘＰ６、２８ＡｘＰ７、２８ＡｘＰ８、２８ＡｘＰ９、２８ＡｘＰ１０、２８ＡｘＰ１１、２８ＡｘＰ１２、２８ＡｘＰ１３、２８ＡｘＰ１４、２８ＡｘＰ１５、２８ＡｘＰ１６（式中、「ｎＡｘＰｍ」の「ｘ」は１つのアミン分子上の修飾されたＰｍ分子の数を指す）を含み得る。
一部の態様では、ｎＡｘＰｍ 式（ＩＶ）を有する本明細書で提供されるイオン化可能な合成リン脂質が、７Ａ１Ｐ４、７Ａ１Ｐ５、７Ａ１Ｐ６、７Ａ１Ｐ７、７Ａ１Ｐ８、７Ａ１Ｐ９、７Ａ１Ｐ１０、７Ａ１Ｐ１１、７Ａ１Ｐ１２、７Ａ１Ｐ１３、７Ａ１Ｐ１４、７Ａ１Ｐ１５、７Ａ１Ｐ１６、８Ａ１Ｐ４、８Ａ１Ｐ５、８Ａ１Ｐ６、８Ａ１Ｐ７、８Ａ１Ｐ８、８Ａ１Ｐ９、８Ａ１Ｐ１０、８Ａ１Ｐ１１、８Ａ１Ｐ１２、８Ａ１Ｐ１３、８Ａ１Ｐ１４、８Ａ１Ｐ１５、８Ａ１Ｐ１６、９Ａ１Ｐ４、９Ａ１Ｐ５、９Ａ１Ｐ６、９Ａ１Ｐ７、９Ａ１Ｐ８、９Ａ１Ｐ９、９Ａ１Ｐ１０、９Ａ１Ｐ１１、９Ａ１Ｐ１２、９Ａ１Ｐ１３、９Ａ１Ｐ１４、９Ａ１Ｐ１５、９Ａ１Ｐ１６、１０Ａ１Ｐ４、１０Ａ１Ｐ５、１０Ａ１Ｐ６、１０Ａ１Ｐ７、１０Ａ１Ｐ８、１０Ａ１Ｐ９、１０Ａ１Ｐ１０、１０Ａ１Ｐ１１、１０Ａ１Ｐ１２、１０Ａ１Ｐ１３、１０Ａ１Ｐ１４、１０Ａ１Ｐ１５、１０Ａ１Ｐ１６、１１Ａ１Ｐ４、１１Ａ１Ｐ５、１１Ａ１Ｐ６、１１Ａ１Ｐ７、１１Ａ１Ｐ８、１１Ａ１Ｐ９、１１Ａ１Ｐ１０、１１Ａ１Ｐ１１、１１Ａ１Ｐ１２、１１Ａ１Ｐ１３、１１Ａ１Ｐ１４、１１Ａ１Ｐ１５、１１Ａ１Ｐ１６、１２Ａ１Ｐ４、１２Ａ１Ｐ５、１２Ａ１Ｐ６、１２Ａ１Ｐ７、１２Ａ１Ｐ８、１２Ａ１Ｐ９、１２Ａ１Ｐ１０、１２Ａ１Ｐ１１、１２Ａ１Ｐ１２、１２Ａ１Ｐ１３、１２Ａ１Ｐ１４、１２Ａ１Ｐ１５、１２Ａ１Ｐ１６、１３Ａ１Ｐ４、１３Ａ１Ｐ５、１３Ａ１Ｐ６、１３Ａ１Ｐ７、１３Ａ１Ｐ８、１３Ａ１Ｐ９、１３Ａ１Ｐ１０、１３Ａ１Ｐ１１、１３Ａ１Ｐ１２、１３Ａ１Ｐ１３、１３Ａ１Ｐ１４、１３Ａ１Ｐ１５、１３Ａ１Ｐ１６、またはこれらの任意の組合せを含み得る。一部の態様では、ｎＡｘＰｍ 式（ＩＶ）を有する本明細書で提供されるイオン化可能な合成リン脂質が、９Ａ１Ｐ９、９Ａ１Ｐ１５、１０Ａ１Ｐ１０、１０Ａ１Ｐ１６またはこれらの任意の組合せを含み得る。
一部の実施形態では、本明細書のイオン化可能な合成リン脂質がｐＨ切替可能である。本明細書で使用される場合、「ｐＨ切替可能」は、ｐＨ値の定義される範囲でのプロトン化でコンフォメーションが変化する脂質を指す。一部の態様では、本明細書のイオン化可能な合成リン脂質が、細胞質ｐＨ(例えば、約7.0から約7.5)でｐＨ切替可能である。一部の態様では、本明細書のイオン化可能な合成リン脂質が、エンドソームおよび／またはリソソームルーメンｐＨ(例えば、約6.5から約4.5)でｐＨ切替可能である。一部の実施形態では、本明細書のイオン化可能な合成リン脂質が、約４．０～約８．０の範囲のｐＨ(例えば、約４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０）でｐＨ切替可能である。一部の実施形態では、本明細書のイオン化可能な合成リン脂質が不可逆性である（すなわち、ｐＨ切替可能でない）。
一部の実施形態では、本明細書のイオン化可能な合成リン脂質が、少なくとも１つのリン酸基と少なくとも１つの双性イオンとを含み得る。双性イオンは、分子内塩または双極子イオンとしても知られており、２個以上の原子が反対の形式電荷を保有する全体として中性の種である。一部の実施形態では、本明細書のイオン化可能な合成リン脂質が少なくとも１つの双性イオンを有し得る。一部の実施形態では、本明細書のイオン化可能な合成リン脂質が複数の双性イオン（例えば、２つ以上の双性イオン）を有し得る。一部の実施形態では、本明細書のイオン化可能な合成リン脂質が約１～約１０個(例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０)の双性イオンを有し得る。一部の実施形態では、本明細書のイオン化可能な合成リン脂質が少なくとも１つの不可逆性双性イオンを有し得る。一部の実施形態では、本明細書のイオン化可能な合成リン脂質が少なくとも１つのｐＨ切替可能な双性イオンを有し得る。一部の実施形態では、本明細書のイオン化可能な合成リン脂質が複数のｐＨ切替可能な双性イオン（例えば、２つ以上のｐＨ切替可能な双性イオン）を有し得る。一部の実施形態では、本明細書のイオン化可能な合成リン脂質が、約１～約１０個(例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０)のｐＨ切替可能な双性イオンを有し得る。
一部の実施形態では、本明細書のイオン化可能な合成リン脂質が、少なくとも１つのリン酸基と、少なくとも１つの双性イオンと、少なくとも１つの疎水性ドメインとを含み得る。一部の実施形態では、本明細書のイオン化可能な合成リン脂質が少なくとも１つの尾部を有し得る。一部の実施形態では、本明細書のイオン化可能な合成リン脂質がマルチテールであり得る（すなわち、２つ以上の尾部を有し得る）。一部の実施形態では、開示されるマルチテールのイオン化可能なリン脂質がエンドソーム膜不安定化を有し得る。
一部の実施形態では、本明細書のイオン化可能な合成リン脂質が少なくとも１つの疎水性尾部を有し得る。一部の実施形態では、本明細書のイオン化可能な合成リン脂質が２つ以上の疎水性尾部を有し得る。一部の実施形態では、本明細書のイオン化可能な合成リン脂質が約１～約１０個(例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０)の疎水性尾部を有し得る。一部の実施形態では、本開示は、ｐＨ切替可能な、マルチテールのイオン化可能なリン脂質を提供する。
一部の実施形態では、本明細書のイオン化可能な合成リン脂質が少なくとも１つの疎水性尾部を有し得、疎水性尾部がアルキル尾部である。一部の実施形態では、本明細書のイオン化可能な合成リン脂質が２つ以上のアルキル尾部を有し得る。一部の実施形態では、本明細書のイオン化可能な合成リン脂質が約１～約１０個(例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０）のアルキル尾部を有し得る。一部の実施形態では、本明細書のイオン化可能な合成リン脂質が、約５個の炭素～約２０個（例えば、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０）の炭素のアルキル鎖長を含む少なくとも１つのアルキル尾部を有し得る。一部の態様では、本明細書のイオン化可能な合成リン脂質が、約８個の炭素～約１６個の炭素のアルキル鎖長を含む少なくとも１つのアルキル尾部を有し得る。一部の態様では、本明細書のイオン化可能な合成リン脂質が、約８個の炭素～約１０個の炭素のアルキル鎖長を含む少なくとも１つのアルキル尾部を有し得る。一部の態様では、本明細書のイオン化可能な合成リン脂質が、約９個の炭素～約１２個の炭素のアルキル鎖長を含む少なくとも１つのアルキル尾部を有し得る。一部の態様では、本明細書のイオン化可能な合成リン脂質が、約１３個の炭素～約１６個の炭素のアルキル鎖長を含む少なくとも１つのアルキル尾部を有し得る。一部の実施形態では、本明細書のイオン化可能な合成リン脂質が、全てのアルキル尾部の長さが同じである複数のアルキル尾部を有し得る。一部の実施形態では、本明細書のイオン化可能な合成リン脂質が、全てのアルキル尾部の長さが互いに異なる複数のアルキル尾部を有し得る。
一部の実施形態では、本明細書のイオン化可能な合成リン脂質が、少なくとも１つのリン酸基と、少なくとも１つの双性イオンと、少なくとも１つの疎水性ドメインと、少なくとも１つの第三級アミンとを含み得る。本明細書で使用される場合、第三級アミンは、窒素原子が、カルボニル基炭素であることができないいずれかの混成の３個の炭素に直接結合しているアミンを指す。一部の実施形態では、少なくとも１つの第三級アミンを含む本明細書のイオン化可能な合成リン脂質において、第三級アミンが生理的ｐＨ(例えば、約7.0から約7.5)でプロトン化されない。一部の態様では、本明細書のイオン化可能な合成リン脂質中の第三級アミンのプロトン化の欠如により、イオン化可能な合成リン脂質が負に帯電され得る。一部の態様では、本明細書のイオン化可能な合成リン脂質中の第三級アミンのプロトン化の欠如により、イオン化可能な合成リン脂質が細胞膜に融合するのが困難になり得る。一部の実施形態では、少なくとも１つの第三級アミンを含む本明細書のイオン化可能な合成リン脂質において、第三級アミンがエンドソームｐＨ(例えば、約6.5から約4.5)でプロトン化され得る。一部の態様では、本明細書のイオン化可能な合成リン脂質中の第三級アミンのプロトン化により少なくとも１つの双性イオン性頭部が形成され得る。
一部の実施形態では、本明細書のイオン化可能な合成リン脂質が、１つの第三級アミンと、１つのリン酸基と、３つの疎水性尾部とを含み得る。一部の実施形態では、本明細書のイオン化可能な合成リン脂質が、１つの第三級アミンと、１つのリン酸基と、３つの疎水性尾部とを含み得、疎水性尾部が約１０個の炭素～約１２個の炭素のアルキル鎖長を含み得る。
本開示は、本明細書に開示されるイオン化可能な合成リン脂質を調製する方法を提供する。当業者であれば、化学合成で知られている標準的な技術が本明細書で使用するのに適していることを認識するだろう。一部の実施形態では、本明細書のイオン化可能な合成リン脂質を調製する方法が、アミン（例えば、１Ａ－２８Ａ）とアルキル化ジオキサホスホランオキシド分子（例えば、Ｐ４－Ｐ１６）による直交型反応を通した合成を含み得る。一部の実施形態では、本明細書のイオン化可能な合成リン脂質を調製する方法において、各アルキル化ジオキサホスホランオキシド分子（例えば、Ｐ４－Ｐ１６）が、少なくとも１つのリン酸基および少なくとも１つの疎水性アルキル鎖をイオン化可能な合成リン脂質に導入し得る。一部の実施形態では、本明細書のイオン化可能な合成リン脂質を調製する方法において、第一級、第二級、および／または第三級アミンが、約１当量の本明細書のアルキル化ジオキサホスホランオキシド分子（例えば、Ｐ４－Ｐ１６）を消費し得る。一部の態様では、単一の第一級、第二級または第三級アミンを有する本明細書のアミン（例えば、１Ａ－１８Ａ）を約１．１当量のアルキル化ジオキサホスホランオキシド分子（例えば、Ｐ４－Ｐ１６）と反応させて、本明細書の式ＩＶによるｎＡ１Ｐｍを有するイオン化可能な合成リン脂質を得ることができる。一部の態様では、複数のアミン基を有する本明細書のアミン（例えば、１９Ａ－２８Ａ）を約２．２当量のアルキル化ジオキサホスホランオキシド分子（例えば、Ｐ４－Ｐ１６）と反応させて、本明細書の式ＩＶによるｎＡ２Ｐｍを有するイオン化可能な合成リン脂質を得ることができる。一部の態様では、複数のアミン基を有する本明細書のアミン（例えば、１９Ａ－２８Ａ）を約３．３当量のアルキル化ジオキサホスホランオキシド分子（例えば、Ｐ４－Ｐ１６）と反応させて、本明細書の式ＩＶによるｎＡ３Ｐｍを有するイオン化可能な合成リン脂質を得ることができる。一部の態様では、複数のアミン基を有する本明細書のアミン（例えば、１９Ａ－２８Ａ）を約４．４当量のアルキル化ジオキサホスホランオキシド分子（例えば、Ｐ４－Ｐ１６）と反応させて、本明細書の式ＩＶによるｎＡ４Ｐｍを有するイオン化可能な合成リン脂質を得ることができる。一部の態様では、複数のアミン基を有する本明細書のアミン（例えば、１９Ａ－２８Ａ）を約５．５当量のアルキル化ジオキサホスホランオキシド分子（例えば、Ｐ４－Ｐ１６）と反応させて、本明細書の式ＩＶによるｎＡ５Ｐｍを有するイオン化可能な合成リン脂質を得ることができる。
一部の実施形態では、本明細書のイオン化可能な合成リン脂質を調製する方法が高度極性有機溶媒中で行われ得る。本明細書で使用するための高度極性有機溶媒の非限定的な例としては、水（Ｈ２Ｏ）、メタノール（ＣＨ３ＯＨ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ；Ｃ２Ｈ６ＯＳ）、ジメチルホルムアミド（Ｃ３Ｈ７ＮＯ）、アセトニトリル（Ｃ２Ｈ３Ｎ）などが挙げられる。一部の実施形態では、本明細書のイオン化可能な合成リン脂質を調製する方法がＤＭＳＯ中で行われ得る。
一部の実施形態では、本明細書のイオン化可能な合成リン脂質を調製する方法が、約０．１ｇ／ｍＬ～約１．０ｇ／ｍＬ（例えば、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０ｇｍＬ－１）の出発物質（例えば、アミン（例えば、１Ａ－２８Ａ）およびアルキル化ジオキサホスホランオキシド分子（例えば、Ｐ４－Ｐ１６））を含み得る。一部の態様では、本明細書のイオン化可能な合成リン脂質を調製する方法が、約０．３ｇ／ｍＬの出発物質（例えば、アミン（例えば、１Ａ－２８Ａ）およびアルキル化ジオキサホスホランオキシド分子（例えば、Ｐ４－Ｐ１６））を含み得る。
一部の実施形態では、本明細書のイオン化可能な合成リン脂質を調製する方法が、高度極性有機溶媒中で出発物質（例えば、アミン（例えば、１Ａ－２８Ａ）およびアルキル化ジオキサホスホランオキシド分子（例えば、Ｐ４－Ｐ１６））を約１～約５日間（例えば、約１、２、３、４、５日間）攪拌するステップを含み得る。一部の態様では、本明細書のイオン化可能な合成リン脂質を調製する方法が、高度極性有機溶媒中で出発物質（例えば、アミン（例えば、１Ａ－２８Ａ）およびアルキル化ジオキサホスホランオキシド分子（例えば、Ｐ４－Ｐ１６））を約３日間攪拌するステップを含み得る。
一部の実施形態では、本明細書のイオン化可能な合成リン脂質を調製する方法が、高度極性有機溶媒中で出発物質（例えば、アミン（例えば、１Ａ－２８Ａ）およびアルキル化ジオキサホスホランオキシド分子（例えば、Ｐ４－Ｐ１６））を約６０℃～約８０℃（例えば、約６０、６５、７０、７５、８０°Ｃ）で攪拌するステップを含み得る。一部の態様では、本明細書のイオン化可能な合成リン脂質を調製する方法が、高度極性有機溶媒中で出発物質（例えば、アミン（例えば、１Ａ－２８Ａ）およびアルキル化ジオキサホスホランオキシド分子（例えば、Ｐ４－Ｐ１６））を約７０℃で攪拌するステップを含み得る。
一部の実施形態では、本明細書のイオン化可能な合成リン脂質を調製する方法が精製を含み得る。本明細書で使用するのに適した精製方法の非限定的な例としては、カラムクロマトグラフィー、真空乾燥、凍結乾燥、カラム分別などが挙げられ得る。
ＩＩ．ナノ粒子および脂質ナノ粒子
本開示は、ナノ粒子および／または脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）に使用するための新たなクラスのイオン化可能な合成リン脂質を提供する。「ナノ粒子」という用語は、コアを封入する親水相によって囲まれた親油性コアを含む構造を指す。一部の実施形態では、本明細書のイオン化可能な合成リン脂質を使用して１つまたは複数のナノ粒子を形成することができる。本明細書のナノ粒子の異なる親油性成分および親水性成分から生じるイオン性相互作用が、独立したおよび／または観察可能な物理的特性をもたらし得る。一部の実施形態では、本明細書のナノ粒子が、約１．０μｍ以下（例えば、約１０００ｎｍ、７５０ｎｍ、５００ｎｍ、２５０ｎｍ、１５０ｎｍ １００ｎｍ、７５ｎｍ、５０ｎｍ、２５ｎｍ、１０ｎｍ、７．５ｎｍ、５ｎｍ、２．５ｎｍ、１．０ｎｍ）の平均サイズを有し得る。「平均サイズ」は、親油相および親水相を含むナノ粒子の集団の平均直径として理解される。本明細書のナノ粒子の平均サイズは、当業者によって知られており、例えば、以下の実験部に記載されている標準的な方法によって測定され得る。一部の実施形態では、本明細書のナノ粒子が、１．０μｍ以下、または１．０ｎｍ～１０００ｎｍの間、または１００ｎｍ～３５０ｎｍの間の平均粒径を有し得る。当業者であれば、ナノ粒子の平均サイズが、脂質成分の量（例えば、多量では、得られるサイズが等しいまたはより大きい）、界面活性剤の量（例えば、多量または高分子量では、サイズが等しいまたはより小さい）、および／または調製方法のパラメータ、例えば、それだけに限らないが、攪拌の速度および種類、両相の温度、混合期間の持続時間などによって影響を及ぼされ得ることを認識することができる。
一部の実施形態では、本明細書のナノ粒子が、その大きさが約－５０ｍＶ～約＋８０ｍＶで変化し得る表面電荷を有し得る。本明細書のナノ粒子の表面電荷は、当業者によって知られている標準的な方法によって測定され得る。一部の態様では、本明細書のナノ粒子の表面電荷が、Ｚ電位によって測定され得る。
一部の実施形態では、本明細書のナノ粒子が、１つまたは複数の細胞と接触すると、１つまたは複数の細胞に侵入することができる。一部の実施形態では、本明細書のナノ粒子が、１つまたは複数の細胞と接触すると、１つまたは複数の生物学的に活性な分子、低分子、および／または遺伝子編集治療を１つまたは複数の細胞に投与することができる。一部の実施形態では、本明細書のナノ粒子が、１つまたは複数の組織と接触すると、１つまたは複数の組織に侵入することができる。一部の実施形態では、本明細書のナノ粒子が、１つまたは複数の組織と接触すると、１つまたは複数の生物学的に活性な分子、低分子、および／または遺伝子編集治療を１つまたは複数の組織に投与することができる。一部の実施形態では、本明細書のナノ粒子が、１つまたは複数の臓器と接触すると、１つまたは複数の臓器に侵入することができる。一部の実施形態では、本明細書のナノ粒子が、１つまたは複数の臓器と接触すると、１つまたは複数の生物学的に活性な分子、低分子、および／または遺伝子編集治療を１つまたは複数の細胞に投与することができる。一部の実施形態では、本明細書のナノ粒子が、特異的細胞型、組織型、臓器、またはこれらの任意の組合せに侵入し得る。一部の態様では、本明細書のナノ粒子が、皮膚細胞、肺細胞、肝臓細胞、脾臓細胞、またはこれらの任意の組合せに侵入し得る。一部の態様では、本明細書のナノ粒子が、皮膚組織、肺組織、肝臓組織、脾臓組織、またはこれらの任意の組合せに侵入し得る。一部の態様では、本明細書のナノ粒子が、皮膚、肺、肝臓、脾臓、またはこれらの任意の組合せに侵入し得る。
一部の実施形態では、本明細書のイオン化可能な合成リン脂質を使用して１つまたは複数のＬＮＰを形成することができる。ＬＮＰは、低ｐＨで正に帯電することができ（ＲＮＡ複合体化を可能にする）、生理的ｐＨで中性であり得る（リポソームなどの、正に帯電した脂質と比較して、潜在的な毒性効果を減少させる）、イオン化可能脂質でできた球状小胞である。ＬＮＰは、エンドサイトーシスを介して細胞によって取り込まれ、低ｐＨ（おそらく）での脂質のイオン化可能性がエンドソーム脱出を可能にし、カーゴの細胞質への放出を可能にし得る。
一部の実施形態では、本明細書に開示されるイオン化可能な合成リン脂質のいずれかを使用してＬＮＰを形成することができる。一部の実施形態では、本明細書のＬＮＰが１つまたは複数のマルチテールイオン化可能脂質を含み得る。一部の実施形態では、１つまたは複数のマルチテールのイオン化可能なリン脂質の各々が、１つの第三級アミンと、１つのリン酸基と、２つ以上の疎水性尾部とを含み得る。一部の態様では、１つまたは複数のマルチテールのイオン化可能なリン脂質の各々が、少なくとも１つの第三級アミンと、少なくとも１つのリン酸基と、２つ以上の疎水性尾部とを含み得、疎水性尾部が約５個の炭素～約２０個（例えば、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０）の炭素のアルキル鎖長を含み得る。一部の態様では、１つまたは複数のマルチテールのイオン化可能なリン脂質の各々が、少なくとも１つの第三級アミンと、少なくとも１つのリン酸基と、２つ以上の疎水性尾部とを含み得、疎水性尾部が約１０個の炭素～約１２個の炭素のアルキル鎖長を含み得る。一部の態様では、１つまたは複数のマルチテールのイオン化可能なリン脂質の各々が、少なくとも１つの第三級アミンと、少なくとも１つのリン酸基と、３つの疎水性尾部とを含み得、疎水性尾部が約１０個の炭素～約１２個の炭素のアルキル鎖長を含み得る。
一部の実施形態では、本明細書のＬＮＰが、１ＡｘＰ４、１ＡｘＰ５、１ＡｘＰ６、１ＡｘＰ７、１ＡｘＰ８、１ＡｘＰ９、１ＡｘＰ１０、１ＡｘＰ１１、１ＡｘＰ１２、１ＡｘＰ１３、１ＡｘＰ１４、１ＡｘＰ１５、１ＡｘＰ１６、２ＡｘＰ４、２ＡｘＰ５、２ＡｘＰ６、２ＡｘＰ７、２ＡｘＰ８、２ＡｘＰ９、２ＡｘＰ１０、２ＡｘＰ１１、２ＡｘＰ１２、２ＡｘＰ１３、２ＡｘＰ１４、２ＡｘＰ１５、２ＡｘＰ１６、３ＡｘＰ４、３ＡｘＰ５、３ＡｘＰ６、３ＡｘＰ７、３ＡｘＰ８、３ＡｘＰ９、３ＡｘＰ１０、３ＡｘＰ１１、３ＡｘＰ１２、３ＡｘＰ１３、３ＡｘＰ１４、３ＡｘＰ１５、３ＡｘＰ１６、４ＡｘＰ４、４ＡｘＰ５、４ＡｘＰ６、４ＡｘＰ７、４ＡｘＰ８、４ＡｘＰ９、４ＡｘＰ１０、４ＡｘＰ１１、４ＡｘＰ１２、４ＡｘＰ１３、４ＡｘＰ１４、４ＡｘＰ１５、４ＡｘＰ１６、５ＡｘＰ４、５ＡｘＰ５、５ＡｘＰ６、５ＡｘＰ７、５ＡｘＰ８、５ＡｘＰ９、５ＡｘＰ１０、５ＡｘＰ１１、５ＡｘＰ１２、５ＡｘＰ１３、５ＡｘＰ１４、５ＡｘＰ１５、５ＡｘＰ１６、６ＡｘＰ４、６ＡｘＰ５、６ＡｘＰ６、６ＡｘＰ７、６ＡｘＰ８、６ＡｘＰ９、６ＡｘＰ１０、６ＡｘＰ１１、６ＡｘＰ１２、６ＡｘＰ１３、６ＡｘＰ１４、６ＡｘＰ１５、６ＡｘＰ１６、７ＡｘＰ４、７ＡｘＰ５、７ＡｘＰ６、７ＡｘＰ７、７ＡｘＰ８、７ＡｘＰ９、７ＡｘＰ１０、７ＡｘＰ１１、７ＡｘＰ１２、７ＡｘＰ１３、７ＡｘＰ１４、７ＡｘＰ１５、７ＡｘＰ１６、８ＡｘＰ４、８ＡｘＰ５、８ＡｘＰ６、８ＡｘＰ７、８ＡｘＰ８、８ＡｘＰ９、８ＡｘＰ１０、８ＡｘＰ１１、８ＡｘＰ１２、８ＡｘＰ１３、８ＡｘＰ１４、８ＡｘＰ１５、８ＡｘＰ１６、９ＡｘＰ４、９ＡｘＰ５、９ＡｘＰ６、９ＡｘＰ７、９ＡｘＰ８、９ＡｘＰ９、９ＡｘＰ１０、９ＡｘＰ１１、９ＡｘＰ１２、９ＡｘＰ１３、９ＡｘＰ１４、９ＡｘＰ１５、９ＡｘＰ１６、１０ＡｘＰ４、１０ＡｘＰ５、１０ＡｘＰ６、１０ＡｘＰ７、１０ＡｘＰ８、１０ＡｘＰ９、１０ＡｘＰ１０、１０ＡｘＰ１１、１０ＡｘＰ１２、１０ＡｘＰ１３、１０ＡｘＰ１４、１０ＡｘＰ１５、１０ＡｘＰ１６、１１ＡｘＰ４、１１ＡｘＰ５、１１ＡｘＰ６、１１ＡｘＰ７、１１ＡｘＰ８、１１ＡｘＰ９、１１ＡｘＰ１０、１１ＡｘＰ１１、１１ＡｘＰ１２、１１ＡｘＰ１３、１１ＡｘＰ１４、１１ＡｘＰ１５、１１ＡｘＰ１６、１２ＡｘＰ４、１２ＡｘＰ５、１２ＡｘＰ６、１２ＡｘＰ７、１２ＡｘＰ８、１２ＡｘＰ９、１２ＡｘＰ１０、１２ＡｘＰ１１、１２ＡｘＰ１２、１２ＡｘＰ１３、１２ＡｘＰ１４、１２ＡｘＰ１５、１２ＡｘＰ１６、１３ＡｘＰ４、１３ＡｘＰ５、１３ＡｘＰ６、１３ＡｘＰ７、１３ＡｘＰ８、１３ＡｘＰ９、１３ＡｘＰ１０、１３ＡｘＰ１１、１３ＡｘＰ１２、１３ＡｘＰ１３、１３ＡｘＰ１４、１３ＡｘＰ１５、１３ＡｘＰ１６、１４ＡｘＰ４、１４ＡｘＰ５、１４ＡｘＰ６、１４ＡｘＰ７、１４ＡｘＰ８、１４ＡｘＰ９、１４ＡｘＰ１０、１４ＡｘＰ１１、１４ＡｘＰ１２、１４ＡｘＰ１３、１４ＡｘＰ１４、１４ＡｘＰ１５、１４ＡｘＰ１６、１５ＡｘＰ４、１５ＡｘＰ５、１５ＡｘＰ６、１５ＡｘＰ７、１５ＡｘＰ８、１５ＡｘＰ９、１５ＡｘＰ１０、１５ＡｘＰ１１、１５ＡｘＰ１２、１５ＡｘＰ１３、１５ＡｘＰ１４、１５ＡｘＰ１５、１５ＡｘＰ１６、１６ＡｘＰ４、１６ＡｘＰ５、１６ＡｘＰ６、１６ＡｘＰ７、１６ＡｘＰ８、１６ＡｘＰ９、１６ＡｘＰ１０、１６ＡｘＰ１１、１６ＡｘＰ１２、１６ＡｘＰ１３、１６ＡｘＰ１４、１６ＡｘＰ１５、１６ＡｘＰ１６、１７ＡｘＰ４、１７ＡｘＰ５、１７ＡｘＰ６、１７ＡｘＰ７、１７ＡｘＰ８、１７ＡｘＰ９、１７ＡｘＰ１０、１７ＡｘＰ１１、１７ＡｘＰ１２、１７ＡｘＰ１３、１７ＡｘＰ１４、１７ＡｘＰ１５、１７ＡｘＰ１６、１８ＡｘＰ４、１８ＡｘＰ５、１８ＡｘＰ６、１８ＡｘＰ７、１８ＡｘＰ８、１８ＡｘＰ９、１８ＡｘＰ１０、１８ＡｘＰ１１、１８ＡｘＰ１２、１８ＡｘＰ１３、１８ＡｘＰ１４、１８ＡｘＰ１５、１８ＡｘＰ１６、１９ＡｘＰ４、１９ＡｘＰ５、１９ＡｘＰ６、１９ＡｘＰ７、１９ＡｘＰ８、１９ＡｘＰ９、１９ＡｘＰ１０、１９ＡｘＰ１１、１９ＡｘＰ１２、１９ＡｘＰ１３、１９ＡｘＰ１４、１９ＡｘＰ１５、１９ＡｘＰ１６、２０ＡｘＰ４、２０ＡｘＰ５、２０ＡｘＰ６、２０ＡｘＰ７、２０ＡｘＰ８、２０ＡｘＰ９、２０ＡｘＰ１０、２０ＡｘＰ１１、２０ＡｘＰ１２、２０ＡｘＰ１３、２０ＡｘＰ１４、２０ＡｘＰ１５、２０ＡｘＰ１６、２１ＡｘＰ４、２１ＡｘＰ５、２１ＡｘＰ６、２１ＡｘＰ７、２１ＡｘＰ８、２１ＡｘＰ９、２１ＡｘＰ１０、２１ＡｘＰ１１、２１ＡｘＰ１２、２１ＡｘＰ１３、２１ＡｘＰ１４、２１ＡｘＰ１５、２１ＡｘＰ１６、２２ＡｘＰ４、２２ＡｘＰ５、２２ＡｘＰ６、２２ＡｘＰ７、２２ＡｘＰ８、２２ＡｘＰ９、２２ＡｘＰ１０、２２ＡｘＰ１１、２２ＡｘＰ１２、２２ＡｘＰ１３、２２ＡｘＰ１４、２２ＡｘＰ１５、２２ＡｘＰ１６、２３ＡｘＰ４、２３ＡｘＰ５、２３ＡｘＰ６、２３ＡｘＰ７、２３ＡｘＰ８、２３ＡｘＰ９、２３ＡｘＰ１０、２３ＡｘＰ１１、２３ＡｘＰ１２、２３ＡｘＰ１３、２３ＡｘＰ１４、２３ＡｘＰ１５、２３ＡｘＰ１６、２４ＡｘＰ４、２４ＡｘＰ５、２４ＡｘＰ６、２４ＡｘＰ７、２４ＡｘＰ８、２４ＡｘＰ９、２４ＡｘＰ１０、２４ＡｘＰ１１、２４ＡｘＰ１２、２４ＡｘＰ１３、２４ＡｘＰ１４、２４ＡｘＰ１５、２４ＡｘＰ１６、２５ＡｘＰ４、２５ＡｘＰ５、２５ＡｘＰ６、２５ＡｘＰ７、２５ＡｘＰ８、２５ＡｘＰ９、２５ＡｘＰ１０、２５ＡｘＰ１１、２５ＡｘＰ１２、２５ＡｘＰ１３、２５ＡｘＰ１４、２５ＡｘＰ１５、２５ＡｘＰ１６、２６ＡｘＰ４、２６ＡｘＰ５、２６ＡｘＰ６、２６ＡｘＰ７、２６ＡｘＰ８、２６ＡｘＰ９、２６ＡｘＰ１０、２６ＡｘＰ１１、２６ＡｘＰ１２、２６ＡｘＰ１３、２６ＡｘＰ１４、２６ＡｘＰ１５、２６ＡｘＰ１６、２７ＡｘＰ４、２７ＡｘＰ５、２７ＡｘＰ６、２７ＡｘＰ７、２７ＡｘＰ８、２７ＡｘＰ９、２７ＡｘＰ１０、２７ＡｘＰ１１、２７ＡｘＰ１２、２７ＡｘＰ１３、２７ＡｘＰ１４、２７ＡｘＰ１５、２７ＡｘＰ１６、２８ＡｘＰ４、２８ＡｘＰ５、２８ＡｘＰ６、２８ＡｘＰ７、２８ＡｘＰ８、２８ＡｘＰ９、２８ＡｘＰ１０、２８ＡｘＰ１１、２８ＡｘＰ１２、２８ＡｘＰ１３、２８ＡｘＰ１４、２８ＡｘＰ１５、２８ＡｘＰ１６（式中、「ｎＡｘＰｍ」の「ｘ」は１つのアミン分子上の修飾されたＰｍ分子の数を指す）から選択されるｎＡｘＰｍ 式（ＩＶ）を有する本明細書で提供される１つまたは複数のイオン化可能な合成リン脂質を含み得る。
一部の実施形態では、本明細書のＬＮＰが、７Ａ１Ｐ４、７Ａ１Ｐ５、７Ａ１Ｐ６、７Ａ１Ｐ７、７Ａ１Ｐ８、７Ａ１Ｐ９、７Ａ１Ｐ１０、７Ａ１Ｐ１１、７Ａ１Ｐ１２、７Ａ１Ｐ１３、７Ａ１Ｐ１４、７Ａ１Ｐ１５、７Ａ１Ｐ１６、８Ａ１Ｐ４、８Ａ１Ｐ５、８Ａ１Ｐ６、８Ａ１Ｐ７、８Ａ１Ｐ８、８Ａ１Ｐ９、８Ａ１Ｐ１０、８Ａ１Ｐ１１、８Ａ１Ｐ１２、８Ａ１Ｐ１３、８Ａ１Ｐ１４、８Ａ１Ｐ１５、８Ａ１Ｐ１６、９Ａ１Ｐ４、９Ａ１Ｐ５、９Ａ１Ｐ６、９Ａ１Ｐ７、９Ａ１Ｐ８、９Ａ１Ｐ９、９Ａ１Ｐ１０、９Ａ１Ｐ１１、９Ａ１Ｐ１２、９Ａ１Ｐ１３、９Ａ１Ｐ１４、９Ａ１Ｐ１５、９Ａ１Ｐ１６、１０Ａ１Ｐ４、１０Ａ１Ｐ５、１０Ａ１Ｐ６、１０Ａ１Ｐ７、１０Ａ１Ｐ８、１０Ａ１Ｐ９、１０Ａ１Ｐ１０、１０Ａ１Ｐ１１、１０Ａ１Ｐ１２、１０Ａ１Ｐ１３、１０Ａ１Ｐ１４、１０Ａ１Ｐ１５、１０Ａ１Ｐ１６、１１Ａ１Ｐ４、１１Ａ１Ｐ５、１１Ａ１Ｐ６、１１Ａ１Ｐ７、１１Ａ１Ｐ８、１１Ａ１Ｐ９、１１Ａ１Ｐ１０、１１Ａ１Ｐ１１、１１Ａ１Ｐ１２、１１Ａ１Ｐ１３、１１Ａ１Ｐ１４、１１Ａ１Ｐ１５、１１Ａ１Ｐ１６、１２Ａ１Ｐ４、１２Ａ１Ｐ５、１２Ａ１Ｐ６、１２Ａ１Ｐ７、１２Ａ１Ｐ８、１２Ａ１Ｐ９、１２Ａ１Ｐ１０、１２Ａ１Ｐ１１、１２Ａ１Ｐ１２、１２Ａ１Ｐ１３、１２Ａ１Ｐ１４、１２Ａ１Ｐ１５、１２Ａ１Ｐ１６、１３Ａ１Ｐ４、１３Ａ１Ｐ５、１３Ａ１Ｐ６、１３Ａ１Ｐ７、１３Ａ１Ｐ８、１３Ａ１Ｐ９、１３Ａ１Ｐ１０、１３Ａ１Ｐ１１、１３Ａ１Ｐ１２、１３Ａ１Ｐ１３、１３Ａ１Ｐ１４、１３Ａ１Ｐ１５、１３Ａ１Ｐ１６、またはこれらの任意の組合せから選択されるｎＡｘＰｍ 式（ＩＶ）を有する本明細書で提供される１つまたは複数のイオン化可能な合成リン脂質を含み得る。一部の態様では、本明細書のＬＮＰが、９Ａ１Ｐ９、９Ａ１Ｐ１５、１０Ａ１Ｐ１０、１０Ａ１Ｐ１６またはこれらの任意の組合せから選択されるｎＡｘＰｍ 式（ＩＶ）を有する本明細書で提供される１つまたは複数のイオン化可能な合成リン脂質を含み得る。
ＬＮＰは通常、細胞結合を促進するヘルパー脂質と、脂質間の間隙を埋めるコレステロールと、血清タンパク質によるオプソニン作用および細網内皮クリアランスを減少させるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とを含有する。
一部の実施形態では、本明細書のＬＮＰが、１つまたは複数の本明細書で提供されるイオン化可能な合成リン脂質と少なくとも１つのヘルパー脂質とを含み得る。一部の実施形態では、本明細書のＬＮＰが、１つまたは複数の本明細書で提供されるイオン化可能な合成リン脂質と、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、Ｎ－メチルジオクタデシルアミン（ＭＤＯＡ）、１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＤＡＰ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウム臭化物塩（ＤＤＡＢ）、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）、およびこれらの任意の組合せから選択される少なくとも１つのヘルパー脂質とを含み得る。一部の実施形態では、本明細書のＬＮＰが、１つまたは複数の本明細書で提供されるイオン化可能な合成リン脂質と、少なくとも１つの双性イオン性ヘルパー脂質（例えば、ＤＯＰＥ）、イオン化可能カチオン性ヘルパー脂質（例えば、ＭＤＯＡ、ＤＯＤＡＰ）、永久カチオン性ヘルパー脂質（例えば、ＤＤＡＢ、ＤＯＴＡＰ）、またはこれらの任意の組合せとを含み得る。
一部の実施形態では、本明細書のＬＮＰが、１つまたは複数の本明細書で提供されるイオン化可能な合成リン脂質と、少なくとも１つのコレステロールおよび／またはコレステロール誘導体とを含み得る。本明細書で使用される場合、「コレステロール誘導体」は、その付加、置換および／または欠失を含む、コレステロール構造から本質的になる任意の化合物を指す。本明細書のコレステロール誘導体という用語はまた、当技術分野で一般的に認識されるように、ステロイドホルモンおよび胆汁酸も含み得る。本明細書で使用するのに適したコレステロール誘導体の非限定的な例としては、ジヒドロコレステロール、ｅｎｔ－コレステロール、エピ－コレステロール、デスモステロール、コレスタノール、コレスタノン、コレステノン、シトステロール、コレステリル－２’－ヒドロキシエチルエーテル、コレステリル－４’－ヒドロキシブチルエーテル、３β－［Ｎ－（Ｎ’Ｎ’－ジメチルアミノエチル）カルバモイルコレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）、２４（Ｓ）－ヒドロキシコレステロール、２５－ヒドロキシコレステロール、２５（Ｒ）－２７－ヒドロキシコレステロール、２２－オキサコレステロール、２３－オキサコレステロール、２４－オキサコレステロール、シクロアルテノール、２２－ケトステロール、２０－ヒドロキシステロール、７－ヒドロキシコレステロール、１９－ヒドロキシコレステロール、２２－ヒドロキシコレステロール、２５－ヒドロキシコレステロール、７－デヒドロコレステロール、５α－コレスタ－７－エン－３β－オール、３，６，９－トリオキサオクタン－１－オール－コレステリル－３ｅ－オール、デヒドロエルゴステロール、デヒドロエピアンドロステロン、ラノステロール、ジヒドロラノステロール、ラノステノール、ルミステロール、シトカルシフェロール、カルシポトリオール、コプロスタノール、コレカルシフェロール、ルペオール、エルゴカルシフェロール、２２－ジヒドロエルゴカルシフェロール（２２－ｄｉｈｙｄｒｏｅｇｏｃａｌｃｉｆｅｒｏｌ）、エルゴステロール、ブラシカステロール、トマチジン、トマチン、ウルソール酸、コール酸、ケノデオキシコール酸、チモステロール、ジオスゲニン、フコステロール、フェコステロール、もしくはフェコステロール、またはこれらの塩もしくはエステルが挙げられ得る。
一部の実施形態では、本明細書のＬＮＰが、１つまたは複数の本明細書で提供されるイオン化可能な合成リン脂質と、少なくとも１つのＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質とを含み得る。本明細書で使用される場合、ＰＥＧ修飾脂質、または「ＰＥＧ脂質」は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で修飾された脂質を指す。このような種は、代わりに、ＰＥＧ化脂質と呼ばれ得る。本明細書で使用するのに適したＰＥＧ修飾脂質の非限定的な例としては、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド（ＰＥＧ－ＣＥＲ）、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＡＧ）、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、およびこれらの混合物が挙げられ得る。例えば、それだけに限らないが、本明細書で使用するためのＰＥＧ修飾脂質は、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ（Ｒ－３－［（ω－メトキシポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル］－１，２－ジミリスチルオキシ－プロピル－３－アミンポリ（エチレングリコール））；ＰＥＧ－ＤＭＧ（１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコールポリ（エチレングリコール））；ＰＥＧ－ＤＬＰＥ（１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホリルグリセロールナトリウム塩－ポリ（エチレングリコール））；ＰＥＧ－ＤＭＰＥ（ジメチル－２－（ジメチルホスフィノ）エチルホルフィン－ポリ（エチレングリコール））；ＰＥＧ－ＤＰＰＣ（１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン－ポリ（エチレングリコール））；ＰＥＧ－ＤＳＰＥ（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－ポリ（エチレングリコール））；ＰＥＧ－ＤＰＰＥ（１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［モノメトキシポリ（エチレングリコール））などであり得る。
一部の実施形態では、本明細書で使用するためのＰＥＧ修飾脂質が、約１０００ダルトン～約２００００ダルトンのサイズを有するＰＥＧ部分を含み得る。一部の態様では、本明細書で使用するためのＰＥＧ修飾脂質が、約１０００ダルトン、約２０００ダルトン、約５０００ダルトン、約１００００ダルトン、約１５０００ダルトン、または約２００００ダルトンのサイズを有するＰＥＧ部分を含み得る。一部の態様では、本明細書のＬＮＰが、１つまたは複数の本明細書で提供されるイオン化可能な合成リン脂質と、少なくとも１つのＰＥＧまたはＰＥＧ脂質とを含み得、ＰＥＧ部分が約２０００ダルトンのサイズを有し得る。本明細書に記載されるＬＮＰの調製に使用するのに有用なＰＥＧ脂質の例としては、それだけに限らないが、１，２－ジアシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－３５０］（ｍＰＥＧ ３５０ ＰＥ）；１，２－ジアシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－５５０］（ｍＰＥＧ ５５０ ＰＥ）；１，２－ジアシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－７５０］（ｍＰＥＧ ７５０ ＰＥ）；１，２－ジアシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－１０００］（ｍＰＥＧ １０００ ＰＥ）；１，２－ジアシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］（ｍＰＥＧ ２０００ ＰＥ）；１，２－ジアシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－３０００］（ｍＰＥＧ ３０００ ＰＥ）；１，２－ジアシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－５０００］（ｍＰＥＧ ５０００ ＰＥ）；Ｎ－アシル－スフィンゴシン－１－［スクシニル（メトキシポリエチレングリコール）７５０］（ｍＰＥＧ ７５０セラミド）；Ｎ－アシル－スフィンゴシン－１－［スクシニル（メトキシポリエチレングリコール）２０００］（ｍＰＥＧ ２０００セラミド）；およびＮ－アシル－スフィンゴシン－１－［スクシニル（メトキシポリエチレングリコール）５０００］（ｍＰＥＧ ５０００セラミド）が挙げられる。一部の態様では、本明細書のＬＮＰが、１つまたは複数の本明細書で提供されるイオン化可能な合成リン脂質と、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシ（ポリ（エチレングリコール－２０００））（ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００）とを含み得る。
ＬＮＰを構成するイオン化可能脂質、ヘルパー脂質、コレステロールおよびＰＥＧの相対量は、脂質ナノ粒子の有効性に実質的に影響を及ぼし得る。一部の実施形態では、本明細書のＬＮＰが、５５：３０：４５、２５：３０：３０、または６０：３０：４０モル比の１つまたは複数の本明細書で提供されるイオン化可能な合成リン脂質と、少なくとも１つのヘルパー脂質と、少なくとも１つのコレステロールおよび／またはコレステロール誘導体とを含み得る。当業者であれば、１つまたは複数の本明細書で提供されるイオン化可能な合成リン脂質と、少なくとも１つのヘルパー脂質と、少なくとも１つのコレステロールおよび／またはコレステロール誘導体とのモル比を、特に本明細書のＬＮＰの所与の用途および／または投与経路のために、必要に応じて最適化することができることを認識するだろう。一部の態様では、本明細書のＬＮＰが、５５：３０：４５モル比の１つまたは複数の本明細書で提供されるイオン化可能な合成リン脂質と、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）と、コレステロールとを含み得る。一部の態様では、本明細書のＬＮＰが、２５：３０：３０モル比の１つまたは複数の本明細書で提供されるイオン化可能な合成リン脂質と、Ｎ－メチルジオクタデシルアミン（ＭＤＯＡ）と、コレステロールとを含み得る。一部の態様では、本明細書のＬＮＰが、２５：３０：３０モル比の１つまたは複数の本明細書で提供されるイオン化可能な合成リン脂質と、１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＤＡＰ）と、コレステロールとを含み得る。一部の態様では、本明細書のＬＮＰが、２５：３０：３０モル比の１つまたは複数の本明細書で提供されるイオン化可能な合成リン脂質と、５Ａ２－ＳＣ８と、コレステロールとを含み得る。一部の態様では、本明細書のＬＮＰが、６０：３０：４０モル比の１つまたは複数の本明細書で提供されるイオン化可能な合成リン脂質と、ジメチルジオクタデシルアンモニウム臭化物塩（ＤＤＡＢ）と、コレステロールとを含み得る。一部の態様では、本明細書のＬＮＰが、６０：３０：４０モル比の１つまたは複数の本明細書で提供されるイオン化可能な合成リン脂質と、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）と、コレステロールとを含み得る。
一部の実施形態では、本明細書のＬＮＰが、１つまたは複数の細胞型を標的化するための１つまたは複数の本明細書で提供されるイオン化可能な合成リン脂質を含み得る。一部の実施形態では、本明細書で提供されるイオン化可能な合成リン脂質を含むＬＮＰが、ＬＮＰを１つまたは複数の細胞型に対して選択的にすることができる。一部の実施形態では、本明細書で提供されるイオン化可能な合成リン脂質を含むＬＮＰが、ＬＮＰに１つまたは複数の選択的細胞型でカーゴを降ろさせることができる。一部の実施形態では、本明細書のＬＮＰが、１つまたは複数の細胞型を選択的に標的化し得る。一部の実施形態では、本明細書のＬＮＰが、皮膚細胞、脾臓細胞、肝臓細胞、肺細胞またはこれらの組合せを選択的に標的化し得る。一部の実施形態では、本明細書のＬＮＰが、１つまたは複数の組織型を選択的に標的化し得る。一部の実施形態では、本明細書のＬＮＰが、皮膚、脾臓、肝臓、肺またはこれらの組合せを選択的に標的化し得る。一部の態様では、イオン化可能な合成リン脂質９Ａ１Ｐ９とヘルパー脂質５Ａ２－ＳＣ８とを含む本明細書のＬＮＰが肝臓を選択的に標的化し得る。一部の態様では、イオン化可能な合成リン脂質９Ａ１Ｐ９とヘルパー脂質ＤＤＡＢとを含む本明細書のＬＮＰが肺を選択的に標的化し得る。一部の態様では、イオン化可能な合成リン脂質１０Ａ１Ｐ１６とヘルパー脂質ＭＤＯＡとを含む本明細書のＬＮＰが脾臓を選択的に標的化し得る。
ＬＮＰサイズは、インビボで脂質ナノ粒子の挙動に影響を及ぼし得る。例えば、直径が、測定可能な直径を有する球状および他の形状の小胞などの関連する測定値である一部の説明では、「サイズ」および「直径」という用語が互換的に使用される。本明細書に開示されるＬＮＰのサイズは、動的光散乱法（ＤＬＳ）および／またはナノ粒子トラッキング解析法（ＮＴＡ）によって決定され得る。
一部の実施形態では、本明細書のＬＮＰが、直径またはサイズが約２０ｎｍから約１０００ｎｍであり得る。一部の実施形態では、本明細書のＬＮＰが、サイズが約２０ｎｍから約２００ｎｍであり得る。一部の実施形態では、本明細書のＬＮＰが、サイズが約２０ｎｍから約１９０ｎｍまたは約２５ｎｍから約１９０ｎｍであり得る。一部の実施形態では、本明細書のＬＮＰが、サイズが約３０ｎｍから約１８０ｎｍであり得る。一部の実施形態では、本明細書のＬＮＰが、サイズが約３５ｎｍから約１７０ｎｍであり得る。一部の実施形態では、本明細書のＬＮＰが、サイズが約４０ｎｍから約１６０ｎｍであり得る。一部の実施形態では、本明細書のＬＮＰが、サイズが約５０ｎｍから約１５０ｎｍ、約６０ｎｍ～約１４０ｎｍ、約７０ｎｍから約１３０ｎｍ、約８０ｎｍから約１２０ｎｍ、または約９０ｎｍから約１１０ｎｍであり得る。一部の実施形態では、本明細書のＬＮＰが、サイズまたは直径が約２０ｎｍ、約２５ｎｍ、約３０ｎｍ、約３５ｎｍ、約４０ｎｍ、約４５ｎｍ、約５０ｎｍ、約５５ｎｍ、約６０ｎｍ、約６５ｎｍ、約７０ｎｍ、約７５ｎｍ、約８０ｎｍ、約８５ｎｍ、約９０ｎｍ、約９５ｎｍ、約１００ｎｍ、約１０５ｎｍ、約１１０ｎｍ、約１１５ｎｍ、約１２０ｎｍ、約１２５ｎｍ、約１３０ｎｍ、約１３５ｎｍ、約１４０ｎｍ、約１４５ｎｍ、約１５０ｎｍ、約１５５ｎｍ、約１６０ｎｍ、約１６５ｎｍ、約１７０ｎｍ、約１７５ｎｍ、約１８０ｎｍ、約１８５ｎｍ、約１９０ｎｍ、約１９５ｎｍ、または約２００ｎｍであり得る。
一部の実施形態では、ＬＮＰ組成物または複数のＬＮＰの平均ＬＮＰサイズが、平均サイズの直径が約２０ｎｍから約１０００ｎｍ（例えば、約２０、４０、６０、８０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００）であり得る。一部の実施形態では、ＬＮＰ組成物または複数のＬＮＰのＬＮＰサイズが、サイズの直径が約２０ｎｍから約１０００ｎｍ（例えば、約２０、４０、６０、８０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００）で均質であり得る。一部の実施形態では、ＬＮＰ組成物または複数のＬＮＰのＬＮＰサイズが、平均サイズの直径が約２０ｎｍから約１０００ｎｍ（例えば、約２０、４０、６０、８０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００）で不均質であり得る。一部の実施形態では、ＬＮＰ組成物または複数のＬＮＰのＬＮＰサイズが不均質であり得、ＬＮＰの約５０％～約９９％が、平均サイズの直径が平均で約２０ｎｍから約１０００ｎｍ（例えば、約２０、４０、６０、８０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００）である。
一部の実施形態では、本明細書の１つまたは複数のイオン化可能な合成リン脂質を含むＬＮＰが負電荷を有し得る。一部の実施形態では、本明細書の１つまたは複数のイオン化可能な合成リン脂質を含むＬＮＰが、細胞の外側（例えば、血清中）で負電荷を有し得る。一部の実施形態では、本明細書の１つまたは複数のイオン化可能な合成リン脂質を含むＬＮＰが負の表面ゼータ電位を有し得る。一部の実施形態では、本明細書の１つまたは複数のイオン化可能な合成リン脂質を含むＬＮＰが、約－２０ｍＶ～約－０．５ｍＶの範囲の負の表面ゼータ電位を有し得る。一部の実施形態では、本明細書の１つまたは複数のイオン化可能な合成リン脂質を含むＬＮＰが、約－２０ｍＶ、約－１５ｍＶ、約－１０ｍＶ、約－５ｍＶ、約－２．５ｍＶ、約－１．０ｍＶ、または、約－０．５ｍＶの負の表面ゼータ電位を有し得る。
一部の実施形態では、本明細書の１つまたは複数のイオン化可能な合成リン脂質を含むＬＮＰが電荷を有さなくてもよい（例えば、正味の中性電荷）。一部の実施形態では、本明細書の１つまたは複数のイオン化可能な合成リン脂質を含むＬＮＰが、細胞の内側（例えば、細胞ルーメン中）で電荷を有さなくてもよい。一部の実施形態では、本明細書の１つまたは複数のイオン化可能な合成リン脂質を含むＬＮＰが、細胞の外側では負電荷を有し、ＬＮＰが細胞膜を横切って細胞ルーメンに入った後は電荷を有さなくてもよい。一部の実施形態では、本明細書の１つまたは複数のイオン化可能な合成リン脂質を含むＬＮＰが、細胞の外側では負の表面ゼータ電位を有し、ＬＮＰが細胞膜を横切って細胞ルーメンに入った後は表面電荷を有さなくてもよい。一部の実施形態では、本明細書の１つまたは複数のイオン化可能な合成リン脂質を含むＬＮＰが、細胞の外側では約－２０ｍＶ～約－０．５ｍＶの範囲の負の表面ゼータ電位を有し、ＬＮＰが細胞膜を横切って細胞ルーメンに入った後は表面電荷を有さなくてもよい(例えば、～０ｍＶ)。
一部の実施形態では、本明細書の１つまたは複数のイオン化可能な合成リン脂質を含むＬＮＰが、インビボでの使用に適したｐＫａを有し得る。一部の実施形態では、本明細書の１つまたは複数のイオン化可能な合成リン脂質を含むＬＮＰが、約５．５から約７．５（例えば、約５．５、６．０、６．５、７．０、７．５）の範囲のｐＫａを有し得る。
本明細書に記載されるＬＮＰを調製するために様々な方法を使用することができる。このような方法は当技術分野で公知であるか、または本明細書に開示されており、例えば、Lichtenberg and Barenholz in Methods of Biochemical Analysis, Volume 33, 337-462 (1988) に記載される方法がある。その各々の関連する開示が引用することにより本明細書の一部をなすものとする、 Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467 (1980); U.S. Pat. Nos. 4,235,871, 4,501,728, 4,837,028; Liposomes, Marc J. Ostro, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1983, Chapter 1; and Hope, et al., Chem. Phys. Lip. 40:89 (1986)も参照のこと。
本明細書に記載されるＬＮＰのいずれかを生体分子（カーゴ）を運ぶためのビヒクルとして使用して、生体分子の対象への送達を促進することができる。本明細書に開示されるＬＮＰの他の優れた特徴に加えて、ＬＮＰは、中に搭載されたカーゴを、分解、例えば酵素による消化から保護することができる。よって、診断および／または治療目的で搭載されたカーゴを対象に送達するために使用することができる、カーゴ搭載ＬＮＰも本明細書で提供される。一部の態様では、カーゴが治療剤であり得る。一部の態様では、カーゴが遺伝子編集剤であり得る。
一部の実施形態では、本開示は、カーゴ搭載ＬＮＰまたは治療搭載ＬＮＰを提供する。「カーゴ搭載ＬＮＰ」、「治療搭載ＬＮＰ」または「治療剤搭載ＬＮＰ」という用語は、治療剤、診断剤、および遺伝子編集に使用するための薬剤を含む、１つまたは複数のカーゴの搭載を含むことを意味している。本明細書で使用される場合、「カーゴ搭載ＬＮＰ」、「治療搭載ＬＮＰ」または「治療剤搭載ＬＮＰ」に関して使用される「搭載された」または「搭載」という用語は、（１）ＬＮＰの内側に封入されている；（２）ＬＮＰの脂質膜に会合もしくは部分的に包埋されている（すなわち、ＬＮＰの内部に部分的に突出している）；（３）脂質膜および会合した成分の外側部分に会合もしくは結合している（すなわち、ＬＮＰの外側に部分的もしくは完全に突出している）；または（４）ＬＮＰの脂質膜内に完全に配置されている（すなわち、脂質膜内に完全に含有されている）、１つまたは複数のカーゴ（生体分子、例えば治療剤、診断剤、遺伝子編集に使用するための薬剤であり得る）を有するＬＮＰを指す。
「カーゴ搭載」という用語は、上記（１）～（４）の結果として生じるカーゴ搭載または治療搭載小胞のいずれか１つまたは複数が達成されるように、外因性カーゴまたは治療をＬＮＰに搭載、添加、または包含するプロセスを指す。よって、一部の実施形態では、カーゴがＬＮＰの内側に封入される。一部の実施形態では、カーゴが、ＬＮＰの脂質膜に会合または部分的に包埋している（すなわち、小胞の内部の内側に部分的に突出している）。一部の実施形態では、カーゴが、脂質膜の外側部分に会合または結合している（すなわち、ＬＮＰの外側に部分的に突出している）。一部の実施形態では、カーゴが、小胞の脂質膜内に完全に配置されている（すなわち、脂質膜内に完全に含有されている）。本明細書で使用される場合、「カーゴ」という用語は、例えば、生物製剤（例えば、ペプチド、タンパク質、抗体、アプタマー、核酸、オリゴ）、低分子、治療剤、および／または診断剤を含む、ＬＮＰ中にまたはＬＮＰによって搭載され得る任意の生体分子または薬剤を含むことを意味している。
一部の実施形態では、１つまたは複数のカーゴが、ＬＮＰの内部または内側表面上に存在し得る。一部の実施形態では、ＬＮＰの内部または内側表面上に存在する１つまたは複数のカーゴが、例えば、化学的相互作用、電磁相互作用、疎水性相互作用、静電相互作用、ファンデルワールス相互作用、連結、結合（水素結合、イオン結合、共有結合等）を介して、ＬＮＰに会合し得る。一部の実施形態では、本明細書のＬＮＰが、１つまたは複数のカーゴを封入することができる。
一部の実施形態では、本明細書のＬＮＰが、単一のカーゴ、例えば、単一の治療剤を搭載し得る。一部の実施形態では、本明細書のＬＮＰが、２つ（以上）の異なるカーゴを搭載し得る。一部の実施形態では、本明細書のＬＮＰが、単一のカーゴまたは２つ（以上）の異なるカーゴの２つ以上の分子またはコピーを搭載し得る。一部の実施形態では、本明細書のＬＮＰが、単一のカーゴまたは２つ（以上）の異なるカーゴの３つ以上の分子またはコピーを搭載し得る。一部の実施形態では、本明細書のＬＮＰが、単一のカーゴまたは２つ（以上）の異なるカーゴの２～５個の分子またはコピーを搭載し得る。一部の実施形態では、本明細書のＬＮＰおよび／またはその医薬組成物が、単一のカーゴまたは２つ（以上）の異なるカーゴの１から４，０００、１０から４，０００、５０から３，５００、１００から３，０００、２００から２，５００、３００から１，５００、５００から１，２００、７５０から１，０００、１から２，０００、１から１，０００、１から５００、１０から４００、５０から３００、１から２５０、１から１００、２から５０、２から２５、２から１５、２から１０、３から５０、３から２５、３から２５、３から１０、４から５０、４から２５、４から１５、４から１０、５から５０、５から２５、５から１５、または５から１０個の分子またはコピー、またはその中の任意の増分を搭載し得る。
カーゴをＬＮＰに搭載する方法は当技術分野で公知であり、これらの方法を使用してカーゴを本開示のＬＮＰに搭載することができる。カーゴを本明細書で使用するのに適したＬＮＰに搭載する方法の非限定的な例としては、ｐＨ勾配、金属イオン勾配、経膜勾配、表面搭載、融合搭載などが挙げられる。本明細書に記載されるカーゴ搭載ＬＮＰのカーゴは任意の種類のものであり得る。一部の実施形態では、本明細書のＬＮＰのカーゴが、医薬品有効成分、核酸、ｎｃＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＤＮＡ配列、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ ＤＮＡ配列、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１３配列、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）配列、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、塩基エディター、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）、環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯ）、低分子薬物、タンパク質、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択され得る。
一部の実施形態では、本明細書のカーゴ搭載ＬＮＰのカーゴが生体分子であり得る。本明細書で使用される場合、「生体分子」という用語は、「生物学的治療剤」という用語と互換的に使用される。一部の実施形態では、本明細書のカーゴ搭載ＬＮＰのカーゴが低分子であり得る。一部の実施形態では、本明細書のカーゴ搭載ＬＮＰのカーゴが医薬品有効成分であり得る。
一部の実施形態では、本明細書のＬＮＰが、タンパク質、ペプチド、アプタマー、抗体、抗体断片、またはこれらの任意の組合せであるカーゴ（例えば、生体分子）を含み得る。一部の実施形態では、本明細書のＬＮＰが、核酸であるカーゴ（例えば、生体分子）を含み得る。一部の態様では、核酸カーゴが、例えば、オリゴヌクレオチド治療剤、例えば一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチド治療剤であり得る。一部の例では、オリゴヌクレオチド治療剤が、一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡ、ｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ノンコーディングＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、アンチセンス、例えばアンチセンスＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、モルホリノオリゴヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）もしくはｓｓＤＮＡ（それだけに限らないが、ＬＮＡ、ＢＮＡ、２’－Ｏ－Ｍｅ－ＲＮＡ、２’－ＭＥＯ－ＲＮＡ、２’－Ｆ－ＲＮＡを含む、天然、および修飾ヌクレオチドを有する）、またはこれらのアナログもしくはコンジュゲートであり得る。一部の実施形態では、本明細書のカーゴ搭載ＬＮＰのカーゴがｍＲＮＡであり得る。
一部の実施形態では、本明細書のＬＮＰが、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを送達するために使用され得る。「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ」システムまたは「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介遺伝子編集」は、ゲノム編集／工学のために修飾された、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２）、および／またはＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１３）を指す。これは、典型的には「ガイド」ＲＮＡ（ｇＲＮＡ）および非特異的ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１３、またはこれらの任意のバリアント）で構成される。「ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）」は、本明細書においては「短鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）」または「一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）」と互換的に使用される。ｓｇＲＮＡは、Ｃａｓ結合に必要な「足場」配列と、修飾されるゲノム標的を定義する、使用者によって定義される約２０個のヌクレオチド「スペーサー」または「標的化」配列とで構成される短鎖合成ＲＮＡである。Ｃａｓのゲノム標的は、ｓｇＲＮＡに存在する標的化配列を変化させることによって変化させることができる。一部の実施形態では、本明細書のＬＮＰが、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの１つまたは複数の成分を有するカーゴを含み得る。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの１つまたは複数の成分を有するカーゴが、ｍＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ＤＮＡ配列 ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体、およびこれらの任意の組合せを含み得る。
ＩＩＩ．医薬組成物
本開示はまた、１つまたは複数の同様に本明細書に記載されるカーゴを封入し得る、本明細書に記載されるＬＮＰのいずれかと、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。医薬組成物の担体は、組成物の有効成分と適合性であり、好ましくは、有効成分を安定化することができ、処置される対象に有害ではないという意味で「許容される」ものでなければならない。薬学的に許容される賦形剤（担体）は、当技術分野で周知の緩衝液を含む。例えば、その開示が引用することにより本明細書の一部をなすものとする、Remington:The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed.(2000)Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hooverを参照されたい。
一部の実施形態では、本明細書の医薬組成物が、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤を含むことができる。許容される担体、賦形剤、または安定剤は、使用される投与量および濃度でレシピエントに非毒性であり、リン酸、クエン酸、および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール；メチルもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；およびｍ－クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、もしくはデキストランを含む単糖、二糖、および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロールもしくはソルビトールなどの糖類；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；および／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含み得る。
投与経路、および医薬品の形態に応じて、異なる担体および／または賦形剤が本明細書で使用され得る。本明細書で使用するための賦形剤としては、それだけに限らないが、粘着防止剤、結合剤、コーティング崩壊剤、充填剤、香味剤（例えば、甘味剤）および着色剤、滑剤、潤滑剤、保存剤、吸着剤が挙げられる。本明細書に記載される担体および／または賦形剤はまた、ビヒクルおよび／または希釈剤を含んでもよく、「ビヒクル」は、通常、溶媒または担体として作用する様々な媒体のいずれかを示し；「希釈剤」は、組成物の有効成分を希釈するために支給される希釈剤を示し；適切な希釈剤としては、医薬品調製物の粘度を低下させることができる任意の物質が挙げられる。
担体および／または賦形剤の種類および量は、選択される医薬品形態の機能で選択される；適切な医薬品形態は、溶液、点滴、懸濁液などの液体系；コロイド、ゲル、ペーストまたはクリームなどの半固体系；粉末、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、ペレット、微粒剤、ミニタブレット（ｍｉｎｉｔａｂｌｅｔ）、マイクロカプセル、マイクロペレット、坐剤などの固体系等である。上記系の各々が、当技術分野で周知の技術を使用して、通常放出、遅延放出または加速放出用に適切に製剤化され得る。
本明細書に記載されるＬＮＰを含む医薬組成物は、標準的な技術、ならびに本明細書に記載される技術に従って調製することができる。一部の例では、医薬組成物が、毛細胆管内投与、静脈内投与、皮下投与、皮内投与、腹腔内投与、髄腔内投与、および筋肉内投与を含む非経口投与用に製剤化される。一部の例では、本明細書の医薬組成物が、ボーラス注射または注入によって静脈内投与され得る。本発明で使用するのに適した製剤は、その開示が引用することにより本明細書の一部をなすものとする、Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, Pa., 17th ed.(1985)に見出される。
一部の実施形態では、本明細書の医薬組成物が、静脈内注入などの注射用に製剤化され得る。無菌注射可能組成物、例えば、無菌注射可能水性または油性懸濁液は、適切な分散もしくは湿潤剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ８０）または懸濁化剤を使用して、当技術分野で公知の技術に従って製剤化され得る。無菌注射可能調製物はまた、例えば、１，３－ブタンジオール中溶液としての、非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の無菌注射可能溶液または懸濁液であり得る。使用することができる許容されるビヒクルおよび溶媒の中には、マンニトール、水、リンゲル液および等張性塩化ナトリウム溶液がある。さらに、無菌不揮発性油が、溶媒または懸濁媒として慣用的に使用されている（例えば、合成モノ－またはジグリセリド）。オレイン酸およびそのグリセリド誘導体などの脂肪酸が注射剤の調製に有用であり、特にそのポリオキシエチル化バージョンのオリーブ油またはヒマシ油などの天然の薬学的に許容される油も同様である。これらの油溶液または懸濁液はまた、長鎖アルコール希釈剤もしくは分散剤、またはカルボキシメチルセルロースもしくは同様の分散剤も含有することができる。ＴｗｅｅｎｓもしくはＳｐａｎｓなどの他の一般的に使用される界面活性剤または医薬品の製造に一般的に使用される他の同様の乳化剤もしくはバイオアベイラビリティ増強剤。
一部の実施形態では、本明細書に記載される医薬組成物が、経口、非経口もしくは直腸投与、または吸入もしくは吹送による投与のための、錠剤、丸剤、カプセル剤、粉末、顆粒剤、溶液もしくは懸濁液、または坐剤などの単位剤形であり得る。錠剤などの固体組成物を調製するために、本明細書に開示されるＬＮＰを医薬担体、例えばコーンスターチ、ラクトース、スクロース、ソルビトール、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二カルシウムまたはガム、および他の医薬希釈剤、例えば水と混合して、本発明の化合物、またはその非毒性の薬学的に許容される塩の均質な混合物を含有する固体プレフォーミュレーション組成物を形成することができる。これらのプレフォーミュレーション組成物を均質であると言及する場合、組成物を錠剤、丸剤およびカプセル剤などの等しく有効な単位剤形に容易に細分することができるように、有効成分が組成物の全体にわたって均一に分散していることを意味する。その後、この固体プレフォーミュレーション組成物が、０．１～約５００ｍｇの本発明の有効成分を含有する上記の種類の単位剤形に細分される。新規な組成物の錠剤または丸剤をコーティングまたはその他の方法で調合して、延長された作用の利点を与える剤形を得ることができる。例えば、錠剤または丸剤は、内部投与成分と外部投与成分とを含むことができ、後者は前者の上のエンベロープの形態である。２つの成分は、胃内での崩壊に耐えるのに役立ち、内部成分が十二指腸にインタクトで移り、放出が遅延されることを可能にする腸溶性層によって分離され得る。様々な材料をこのような腸溶性層またはコーティングに使用することができ、このような材料はいくつかのポリマー酸およびポリマー酸とシェラック、セチルアルコールおよび酢酸セルロースのような材料との混合物を含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載される医薬組成物が乳剤であり得る。適切な乳剤は、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（商標）、Ｌｉｐｏｓｙｎ（商標）、Ｉｎｆｏｎｕｔｒｏｌ（商標）、Ｌｉｐｏｆｕｎｄｉｎ（商標）およびＬｉｐｉｐｈｙｓａｎ（商標）などの商業的に入手可能な脂肪乳剤を使用して調製され得る。本明細書のＬＮＰは、予備混合乳剤組成物に添加され得るか、あるいは油（例えば、大豆油、紅花油、綿実油、ゴマ油、コーン油またはアーモンド油）に添加され、リン脂質（例えば、卵リン脂質、大豆リン脂質または大豆レシチン）および水と混合すると乳剤が形成され得る。他の成分、例えばグリセロールまたはグルコースを添加して、乳剤の張度を調整することができることが認識されるだろう。適切な乳剤は、典型的には最大２０％、例えば、５～２０％の間の油を含有する。脂肪乳剤は、０．１～１．０μｍ、特に０．１～０．５μｍの間の脂肪滴を含み、５．５～８．０の範囲のｐＨを有することができる。乳剤組成物は、ＬＮＰをＩｎｔｒａｌｉｐｉｄ（商標）またはその成分（大豆油、卵リン脂質、グリセロールおよび水）と混合することによって調製されるものであり得る。一部の実施形態では、本明細書に記載される医薬組成物が、（例えば、皮膚を処置するための）局所投与用の乳剤であり得る。
ＩＶ．使用方法
ある特定の実施形態では、本開示はまた、１つまたは複数のカーゴ（例えば、核酸分子、医薬品有効成分）を細胞に導入する方法であって、細胞を本明細書に開示される組成物と接触させるステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、本明細書の方法が、細胞または細胞層を本明細書に開示されるＬＮＰと接触させることを含む、１つまたは複数の本明細書のカーゴ（例えば、核酸分子、医薬品有効成分）を細胞に送達するステップを含むことができる。この方法の一部の実施形態では、本明細書のＬＮＰが、１つまたは複数の異種分子を細胞に送達することができる。これらの実施形態によると、本明細書のＬＮＰが、１つまたは複数の治療用異種分子を細胞に送達することができる。一部の例では、本明細書の方法を使用して細胞に送達される１つまたは複数の治療用異種分子が、治療用タンパク質、治療用ＤＮＡ、および／または治療用ＲＮＡであり得る。一部の実施形態では、治療用タンパク質がモノクローナル抗体または融合タンパク質であり得る。一部の実施形態では、治療用ＤＮＡおよび／またはＲＮＡが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡオリゴヌクレオチドなどであり得る。一部の態様では、本明細書のＬＮＰが、１つまたは複数の治療用ｍＲＮＡを細胞に送達することができる。
一部の実施形態では、本開示はまた、カーゴ（例えば、核酸分子、医薬品有効成分）を細胞に導入する方法であって、細胞を本明細書に開示されるＬＮＰおよび／または医薬組成物と接触させるステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、本明細書の方法が、カーゴ（例えば、核酸分子、医薬品有効成分）を特異的細胞型に送達するステップを含むことができる。一部の実施形態では、本明細書の方法が、カーゴ（例えば、核酸分子、医薬品有効成分）を、肝臓細胞、肺細胞、脾臓細胞、および／または皮膚細胞から選択される特異的細胞型に送達するステップを含むことができる。一部の実施形態では、本明細書の方法が、肝臓細胞を本明細書に開示されるＬＮＰと接触させることを含む、カーゴ（例えば、核酸分子、医薬品有効成分）を肝臓細胞に送達するステップを含むことができる。一部の実施形態では、本明細書の方法が、肺細胞を本明細書に開示されるＬＮＰと接触させることを含む、カーゴ（例えば、核酸分子、医薬品有効成分）を肺細胞に送達するステップを含むことができる。一部の実施形態では、本明細書の方法が、脾臓細胞を本明細書に開示されるＬＮＰと接触させることを含む、カーゴ（例えば、核酸分子、医薬品有効成分）を脾臓細胞に送達するステップを含むことができる。一部の実施形態では、本明細書の方法が、皮膚細胞を本明細書に開示されるＬＮＰと接触させることを含む、カーゴ（例えば、核酸分子、医薬品有効成分）を皮膚細胞に送達するステップを含むことができる。ある特定の実施形態では、本開示はまた、カーゴ（例えば、核酸分子、医薬品有効成分）を肺組織、肝臓組織、脾臓組織、皮膚組織またはこれらの任意の組合せに導入する方法であって、細胞を本明細書に開示されるＬＮＰおよび／または組成物と接触させるステップを含む方法を提供する。
本明細書のＬＮＰおよび／または医薬組成物のいずれかを、治療剤、診断剤、または遺伝子編集システムを所望の標的部位に送達するために使用することができる。一部の実施形態では、本明細書のＬＮＰおよび／または医薬組成物を、治療剤、診断剤、または遺伝子編集システムを肺、肝臓、皮膚、および／または脾臓に送達するために使用することができる。
一部の実施形態では、本明細書のＬＮＰおよび／または医薬組成物のいずれかを、治療剤、診断剤、または遺伝子編集システムを送達して対象の疾患、状態、または障害を処置および／または予防するために使用することができる。この使用を実施するために、本明細書のＬＮＰを含む有効量の医薬組成物を、本明細書に記載される経路などの適切な経路を介して、処置を必要とする対象（例えば、哺乳動物対象、ヒト対象）に投与することができる。同様にこの使用を実施するために、治療剤、診断剤、または遺伝子編集システムを封入する、本明細書に記載されるＬＮＰのいずれかを含む有効量の医薬組成物を、本明細書に記載される経路などの適切な経路を介して、処置を必要とする対象（例えば、ヒト対象）に投与することができる。本明細書で使用される「有効量」は、単独でまたは１つもしくは複数の他の活性剤と組み合わせて、対象に対する治療効果を与えるために必要とされる各活性剤の量を指す。有効量は、当業者によって認識されるように、投与経路、賦形剤の使用、および他の活性剤の同時使用に応じて変化する。このような量は、当然、処置される特定の状態、状態の重症度、年齢、健康状態、サイズ、性別および体重を含む個々の患者のパラメータ、処置の持続時間、同時療法（もしあれば）の性質、具体的な投与経路ならびに医療従事者の知識および専門技術の範囲内の同様の因子に依存する。これらの因子は当業者に周知であり、日常的な実験に過ぎないもので対処することができる。個々の成分またはその組合せの最大用量、すなわち、健全な医学的判断による最高の安全用量を使用することが一般的に好ましい。しかしながら、患者が、医学的理由、心理的理由または事実上任意の他の理由でより低い用量または耐用量を要求することができることが当業者によって理解されるだろう。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるイオン化可能な合成リン脂質、ＬＮＰＳ、医薬組成物、および方法を使用して、肺疾患または肺障害を処置することができる。本明細書の方法を介した処置に適した肺疾患および／または肺障害の非限定的な例としては、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、喘息、急性気管気管支炎、肺炎、結核、肺がん、インフルエンザ感染症、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２感染症、サーファクタントタンパク質欠損症、嚢胞性線維症、アルファ－１アンチトリプシン（ＡＡＴ）欠乏症などが挙げられ得る。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるイオン化可能な合成リン脂質、ＬＮＰ、医薬組成物、および方法を使用して、肝臓疾患または肝臓障害を処置することができる。本明細書の方法を介した処置に適した肝臓疾患および／または肝臓障害の非限定的な例としては、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症、アルギナーゼ－１欠損症、アルファ－１アンチトリプシン欠乏症、チロシン血症Ｉ型（ＨＴ１）、ムコ多糖症、血友病、高コレステロール血症、硬変、肝臓がん、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、肝細胞癌（ＨＣＣ）、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）などが挙げられ得る。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるイオン化可能な合成リン脂質、ＬＮＰ、医薬組成物、および方法を使用して、脾臓疾患または脾臓障害を処置することができる。本明細書の方法を介した処置に適した脾臓疾患および／または脾臓障害の非限定的な例としては、遺伝性球状赤血球症、ゴーシェ病、鎌状赤血球症、ベータサラセミアなどが挙げられ得る。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるイオン化可能な合成リン脂質、ＬＮＰ、医薬組成物、および方法を使用して、皮膚疾患または皮膚障害を処置することができる。本明細書の方法を介した処置に適した皮膚疾患および／または皮膚障害の非限定的な例としては、表皮水疱症（ＥＢ）、先天性爪甲厚硬症、黒色腫、魚鱗癬、ヘイリー・ヘイリー病、シェーグレン・ラルソン症候群（ＳＬＳ）、色素性乾皮症（ＸＰ）、創傷治癒、ネザートン症候群などが挙げられ得る。
Ｖ．キット
本開示はまた、治療剤、診断剤、もしくは遺伝子編集システムを標的部位（例えば、細胞もしくは組織）に送達するのに使用するため、またはそれを必要とする対象の疾患、障害、および／もしくは状態を処置／予防するためのキットを提供する。このようなキットは、本明細書に記載される医薬組成物のいずれかを含む１つまたは複数の容器を含むことができる。
一部の実施形態では、キットが、本明細書に記載される方法のいずれかに従って使用するための説明書を含むことができる。含まれる説明書は、中に封入された治療剤、診断剤、もしくは遺伝子編集システムを送達するため、または本明細書に記載される方法のいずれかに従って対象を処置するための医薬組成物の投与の説明を含むことができる。ＬＮＰを含む、本明細書に記載される医薬組成物の使用に関する説明書は、一般に、意図した処置のための投与量、投与スケジュール、および投与経路についての情報を含む。
容器は、ユニットドーズ、バルクパッケージ（例えば、マルチドーズパッケージ）またはサブユニットドーズであり得る。本発明のキットで供給される説明書は、典型的にはラベルまたはパッケージインサート（例えば、キットに含まれる紙シート）に書かれた説明書であるが、機械可読説明書（例えば、磁気または光学記憶ディスクで運ばれる説明書）も許容される。説明書は、本明細書に記載される方法のいずれかを実行するために提供され得る。
本明細書に記載されるキットは適切なパッケージング中にある。適切なパッケージングとしては、それだけに限らないが、バイアル、ボトル、ジャー、フレキシブルパッケージング（例えば、密封Ｍｙｌａｒまたはプラスチックバッグ）などが挙げられる。吸入器、鼻投与装置（例えば、アトマイザー）などの特定の装置、またはミニポンプなどの注入装置と組み合わせて使用するためのパッケージも企図される。一部の実施形態では、適切なパッケージングがオートインジェクターであり得る。オートインジェクターは、１回使用、使い捨て、スプリング式シリンジである。キットは、無菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、静脈内輸液バッグまたは皮下注射針によって穿刺可能なストッパーを有するバイアルであり得る）。容器もまた、無菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、静脈内輸液バッグまたは皮下注射針によって穿刺可能なストッパーを有するバイアルであり得る）。
本明細書に記載されるキットは、場合により緩衝液および説明的情報などの追加の成分を提供し得る。通常、キットは、容器と、容器上のまたは容器に会合したラベルまたはパッケージインサート（複数可）とを含む。一部の実施形態では、本開示は、上記のキットの成分を含む製造品を提供する。
一般的な技術
本発明の実施は、特に指示しない限り、当業者が備えている技能の範囲内にある、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の慣用的な技術を使用する。このような技術は、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook, et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P. E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, and D. G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller and M. P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel, et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis, et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C. A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995)などの文献に完全に説明されている。
さらに詳細に説明することなく、当業者であれば、上記の説明に基づいて、本発明を最大限に利用することができると考えられる。したがって、以下の具体的な実施形態は、単なる例示として解釈されるべきであり、全く開示の残りの部分を限定するものではない。本明細書で引用される全ての刊行物が、本明細書に言及される目的または主題のために引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
以下の実施例は本開示の好ましい実施形態を実証するために含まれるものである。以下の実施例に開示される技術が、本開示の実施において十分機能する本発明者によって発見された技術を表し、よって、好ましい実施のモードを構成するとみなすことができることが当業者によって認識されるはずである。しかしながら、当業者であれば、本開示に照らして、本開示の精神および範囲から逸脱することなく、多くの変更を開示される具体的な実施形態に行うことができ、同様のまたは類似の結果を依然として得ることができることを認識するはずである。
［実施例１］
ｉＰｈｏｓのライブラリーを優れたエンドソーム脱出の機序を不安定化する膜で合理的に設計した
本開示に従って、イオン化可能アミンと、リン酸基と、３つの疎水性尾部とを含有するイオン化可能な合成リン脂質（「ｉＰｈｏｓ脂質」または「ｉＰｈｏｓ」）を合理的に設計した。アミンおよびリン酸基によって構成される小型双性イオンは、異なるｐＨで可逆性であると予想された。生理的ｐＨ（約７．４）では、第三級アミン基がプロトン化されず、負に帯電したｉＰｈｏｓが膜に融合するのが困難になる。対照的に、酸性エンドソームに入ると、第三級アミンがプロトン化されて双性イオン性頭部を形成した（図１Ａ）。基質範囲を試験すると、３つの疎水性尾部体が、２つの鎖よりも膜相転移を媒介するのが容易であることが分かった。したがって、合成ｉＰｈｏｓ脂質は天然リン脂質膜に完全に挿入することができ、好ましい小型イオン対が大型尾部体と連結してコア形状を採用して、ヘキサゴナルＨＩＩ相形成を促進するので、作用機序は、古典的遺伝子送達担体とは異なっていた（図１Ｂ）。
合成経路における以前の制限を克服するために、本発明者らは、上記設計ガイドラインを満たす化学的複雑性を有する多様な生成物をもたらすことができる開環反応に焦点を当てた。アミン（ｎＡ）とアルキル化ジオキサホスホランオキシド分子（Ｐｍ）のコンビナトリアル反応によって、５７２種のｉＰｈｏｓ脂質（ｎＡｘＰｍと呼ばれる）（図１Ｃ）（式中、「ｘ」は１つのアミン分子上の修飾されたＰｍ分子の数を示す）が得られた。Ｐｍ分子を、異なるアルキル鎖長を有する対応するアルコールから２－クロロ－２－オキソ－１，３，２－ジオキサホスホラン（ＣＯＰ）のエステル化を介して合成した（図７Ａ～図７Ｍ）。第一級、第二級、および第三級アミン基は全て、Ｐｍ開環を誘因して異なる双性イオンを導入することができた（図８）。疎水性尾部および双性イオン数を制御するために、異なるアルキル鎖およびアミン基数を有するアミンを使用した（図１Ｄおよび図９）。この戦略を通して、基の数に加えて、双性イオン種（ｐＨ切替可能および不可逆性）が利用可能になり、リン脂質の構造および多様性を大いに広げたので、ｉＰｈｏｓの化学設計は特有であった。
［実施例２］
インビトロスクリーニングは上位ｉＰｈｏｓがｐＨ切替可能な双性イオンおよび３つの尾部を保有することを示した
本開示に従って、ｍＲＮＡ送達の可能性を評価するために、ｉＰｈｏｓ脂質ナノ粒子（ｉＰＬＮＰ）を使用して卵巣がん細胞ＩＧＲＯＶ－１をトランスフェクトした。エタノール希釈法を使用して、ｉＰｈｏｓ、ヘルパー脂質、ｃｈｏｌ、および１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシ（ポリ（エチレングリコール－２０００））（ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００）（２５：３０：３０：１ｍｏｌ／ｍｏｌ）を混合してｉＰＬＮＰを製剤化した。構造的に単純な脂質であるＮ－メチルジオクタデシルアミン（ＭＤＯＡ）を最初にヘルパー脂質として使用して初期スクリーニングでｉＰｈｏｓ機能を実証した。よって、ｉＰＬＮＰは、代わりにモジュールの強調が双性イオン性（機能的に活性なｉＰｈｏｓ）脂質に置かれており、全ての他の脂質がヘルパー脂質になる伝統的なＬＮＰとは異なる概念とみなすことができるだろう。異なる数および種の双性イオンならびに尾部を有する全ての初期ｉＰｈｏｓ脂質が低い毒性を示した（図１０）。インビトロスクリーニングヒートマップから、単一の双性イオンを有するｉＰｈｏｓ（１Ａ１Ｐ４～１８Ａ１Ｐ１６）が、複数の双性イオンのもの（１９Ａ２Ｐ４～２８Ａ５Ｐ１６）よりも高いｍＲＮＡ有効性を示すと結論付けられた（図２Ａ～図２Ｃ）。理由は、どのように複数の双性イオンがより大型の頭部を構築して、膜相転移を困難にしたかに関連している可能性がある。単一の双性イオンを有するｉＰｈｏｓのＳＡＲをさらに調査するために、小型尾部体は天然膜リン脂質で円錐形状を組み立てることができなかったので、２テール材料（１Ａ１Ｐ４～６Ａ１Ｐ１６）は、はるかに低い有効性を示した。ｉＰｈｏｓ １４Ａ１Ｐ４～１８Ａ１Ｐ１６は永久双性イオンを保有しており、エンドソーム内部移行で構造上の柔軟性を欠いていた。励みになるように、１つの第三級アミンと、１つのリン酸基と、３つの疎水性尾部とで構成されるｉＰｈｏｓ（７Ａ１Ｐ４～１３Ａ１Ｐ１６）は、約６０％のヒット率で、予想される最高のｍＲＮＡ送達有効性を示した（図２Ｄ）。小型の双性イオン頭部および大型の尾部体は、膜融合およびラメラからヘキサゴナルＨＩＩへの相転移を促進した。これらのｉＰｈｏｓ脂質の中では、アミン尾部長が非常に重要であり、１０～１２鎖長のヒット率が最大９２％に達した（図２Ｅ）。これらの所見は、有効性が一般にポリアミンコアおよびより多数のアルキル鎖と相関している、以前報告されたイオン化可能アミノ脂質およびリピドイドライブラリーと対照的であった２４～２６。これらの結果は、ｉＰｈｏｓ脂質が、イオン化可能アミノ脂質とは異なる機序によって作用し得ることを示していた。次に、一部の選択された上位ｉＰｈｏｓ脂質（９Ａ１Ｐ９、９Ａ１Ｐ１５、１０Ａ１Ｐ１０および１０Ａ１Ｐ１６）を精製したところ（図１１～図１４）、得られたｉＰＬＮＰはエンドサイトーシスに適した粒径（約１５０ｎｍ）、血清タンパク質抵抗のためにわずかに負の表面ゼータ電位（約－５ｍＶ）、ならびにインビボアッセイに適したｐＫａ（６．０～６．５）を示した（図１５Ａ～図１５Ｃおよび図１６Ａ～図１６Ｂ）。これらの能力は、合成ｉＰｈｏｓ脂質にインビボ用途の大きな可能性を与える。
［実施例３］
モデル膜試験は化学構造と相関したｉＰｈｏｓ媒介エンドソーム破裂の機序を明らかにした
本開示に従って、ｉＰｈｏｓ脂質およびｉＰＬＮＰの膜破裂活性を最初に溶血モデルによって評価した２３、２７。ｐＨ切替可能な双性イオン頭部および３つの尾部を含有する上位ｉＰｈｏｓ脂質（９Ａ１Ｐ９および１０Ａ１Ｐ１０）を調べた。１０Ａ１Ｐ１０は、単一の第三級アミンを有する１７Ａよりも劇的に高い溶血を示し、膜融合および破裂における双性イオンの優位性を確認した（図３Ａ）。また、９Ａ１Ｐ９、１０Ａ１Ｐ１０、および関連するｉＰＬＮＰは、中性の生理的環境と比較して酸性エンドソーム区画で高い膜破裂活性を示した（図３Ｂ～図３Ｃ）。
これに続いて、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）アッセイを利用して、ｉＰｈｏｓ脂質膜融合およびｉＰＬＮＰ解離を評価した。２つのＤＯＰＥコンジュゲートＦＲＥＴプローブである、７－ニトロベンゾ－２－オキサ－１，３－ジアゾール（ＮＢＤ－ＰＥ）およびリサミンローダミンＢ（Ｒｈｏ－ＰＥ）を、単一のエンドソーム模倣リポソームに配合すると、ローダミンへのＦＲＥＴによりＮＢＤ蛍光の減弱がもたらされた。いったん脂質融合が起こると、２つのプローブ間の得られたより大きな距離がＮＢＤシグナル増加をもたらした２８。図３Ｄに示されるように、１０Ａ１Ｐ１０ ｉＰＬＮＰは２５Ａ３Ｐ９ ｉＰＬＮＰより高い脂質融合を示し、小型の単一の双性イオン頭部が、複数の双性イオンと比較してエンドソーム膜に挿入し、これを破壊する強い傾向を示すことを実証した。その後、ＦＲＥＴプローブをさらに使用してｉＰＬＮＰを試験したところ、１０Ａ１Ｐ１０ ｉＰＬＮＰは、いったんエンドソーム模倣リポソームと混合すると、２５Ａ３Ｐ９ ｉＰＬＮＰよりも解体してｍＲＮＡを放出するのが容易であった（図３Ｅ～図３Ｇ）。これらの結果は、大型の尾部体とは別に、ｉＰｈｏｓ脂質のｐＨ切替可能な双性イオン頭部がエンドソーム脱出に必須であることを実証した。
［実施例４］
ｉＰｈｏｓのインビボＳＡＲは化学構造およびアルキル長が有効性および臓器選択性を制御することを実証した
本開示によると、インビボ送達に関する追加の障壁のために、インビトロ活性を有する全ての既知の担体が動物モデルに移されるわけではなかった２９、３０。さらに、ｓｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ（１８～２２ｂｐ）を長鎖ＲＮＡ（１０００～６０００ｎｔ）と比較すると、細胞内部移行後のｍＲＮＡ放出を可能にする、より弱い静電会合が要求された１２。したがって、ｉＰｈｏｓ脂質の化学は、カチオン性脂質に対して固有の利点を有し、ｍＲＮＡ送達システムにおいて重要な役割を果たし得る。
５１種の効率的なｉＰｈｏｓ脂質をインビトロスクリーニングから選択し、０．１ｍｇ／ｋｇの低ｍＲＮＡ用量でインビボ送達を評価した（図４Ａ）。複数の双性イオンを含有するｉＰｈｏｓ脂質はインビボでｍＲＮＡを送達することができなかった。ＳＡＲをさらに確立すると、１つの第三級アミンと、１つのリン酸基と、３つのアルキル尾部とを有するｉＰｈｏｓ脂質が最も有効であった。興味深いことに、アルキル鎖長が有効性および臓器選択性に途方もなく影響を及ぼした。アミン側の鎖長が有効性を決定し、８～１０個の炭素長が高いインビボｍＲＮＡ発現を媒介した（図４Ｂおよび図１７）。驚くべきことに、リン酸基に加えてアルキル長が選択的臓器でのｍＲＮＡトランスフェクションに影響を及ぼすことが発見された（図４Ｃ～図４Ｄ）。短鎖（９～１２個の炭素）は肝臓でのｍＲＮＡ翻訳を示したが、長鎖（１３～１６個の炭素）はタンパク質発現を脾臓に移した。１０Ａ１Ｐ４～１０Ａ１Ｐ１６のインビボ評価もこの推論を明確に支持した（図１８）。これに続いて、これらのｉＰＬＮＰのナノ粒子サイズ、ゼータ電位、およびｐＫａを評価したこところ、明らかな差は観察されなかった（図１９）。次いで、ｉＰｈｏｓに基づくｉＰＬＮＰを高用量（ｍＲＮＡ、０．２５ｍｇ／ｋｇ）で評価した（図２０および図２１）。なお、臓器選択性が達成され、９Ａ１Ｐ９ ｉＰＬＮＰは肝臓で主なｍＲＮＡ発現を示したが、９Ａ１Ｐ１５および１０Ａ１Ｐ１６ ｉＰＬＮＰは脾臓でのｍＲＮＡ翻訳を媒介した。ＳＡＲは、臓器選択性および特異性を有する他の有効なベクター材料を開発するためのガイドラインを提供した。
［実施例５］
合成ｉＰｈｏｓ脂質は様々なヘルパー脂質との広い適合性を示して組織選択的遺伝子送達および編集を媒介した
本開示に従って、単一のヘルパー脂質ＭＤＯＡを含有するｉＰＬＮＰに使用した場合に、最高性能の脂質９Ａ１Ｐ９を最初に特定した。ｉＰｈｏｓ ９Ａ１Ｐ９が最も重要であり、ｉＰＬＮＰの活性成分であることを確認するために、一連の実験を行った。第１に、９Ａ１Ｐ９が、現在最も良く使用されているリン脂質であるＤＯＰＥおよびＤＳＰＣと比較して４０～９６５倍高いインビボ有効性を示すことが分かった（図５Ａ～図５Ｃ）。第２に、様々な他の確立された脂質をヘルパー脂質として本発明者らの９Ａ１Ｐ９ ｉＰＬＮＰ ｍＲＮＡ送達システムで評価すると広い適用性を示した。双性イオン性脂質（ＤＯＰＥ）、イオン化可能カチオン性脂質（ＭＤＯＡ、ＤＯＤＡＰ、および５Ａ２－ＳＣ８２６）、および永久カチオン性脂質（ＤＤＡＢおよびＤＯＴＡＰ）をヘルパー脂質として調査した（図２２）。組成物のモル比を直交設計方法論１２、３１によって決定し、表１に示した。全ての製剤化ｉＰＬＮＰが、適切な直径、ゼータ電位、ｍＲＮＡ結合、ｐＫａ、および高いインビトロｍＲＮＡ送達有効性を示した（図２３）。
様々なヘルパー脂質とカップリングした９Ａ１Ｐ９が臓器選択性を達成した。双性イオン性、イオン化可能カチオン性、および永久カチオン性ヘルパー脂質を有する９Ａ１Ｐ９ ｉＰＬＮＰが、それぞれ、脾臓、肝臓、および肺での選択的ｍＲＮＡ発現を可能にした（図５Ｄ～図５Ｉ）。２つの極めて有効な製剤をさらに試験したところ、インビボ生体分布結果は、９Ａ１Ｐ９－５Ａ２－ＳＣ８および９Ａ１Ｐ９－ＤＤＡＢ ｉＰＬＮＰが、それぞれ肝臓および肺への高い蓄積を媒介することを明らかにした（図２４Ａ～図２４Ｃ）。ｉＰｈｏｓ脂質は既に有効な製剤をモジュール方式で増強するので、９Ａ１Ｐ９－５Ａ２－ＳＣ８と９Ａ１Ｐ９－ＤＤＡＢの組合せが、それぞれ肝臓（約１０８光子／秒／ｃｍ２／ｓｒ、０．０５ｍｇ／ｋｇ）および肺（約１０８光子／秒／ｃｍ２／ｓｒ、０．２５ｍｇ／ｋｇ）で特異的に超高レベルのｍＲＮＡ発現を示すことが決定された（図５Ｆ～図５Ｉおよび図２５）。ＣｒｅレコンビナーゼｍＲＮＡ（Ｃｒｅ ｍＲＮＡ）を送達すると、高い有効性および臓器選択性が依然として保持された（図５Ｊ～図５Ｌ）。「ゴールドスタンダード」ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＦＤＡによって承認されたＯｎｐａｔｔｒｏに使用される）ＬＮＰと比較して、９Ａ１Ｐ９－５Ａ２－ＳＣ８ ｉＰＬＮＰは、インビボで１３倍高いｍＲＮＡ送達有効性を依然として示した（図５Ｍ～図５Ｎ）。したがって、ｉＰＬＮＰは伝統的なカチオン性脂質ＬＮＰとは異なっており、高い有効性と制御可能な臓器選択性の両方が達成された。速度論分析により、タンパク質発現が急速に起こり、注射後約６時間でピークに達することが明らかになった（図２６Ａ～図２６Ｃ）。
次に、このモデルを使用して、肝臓、肺、および脾臓臓器での特異的細胞型のトランスフェクションを定量化した。Ｃｒｅ ｍＲＮＡの送達後、肝臓選択的９Ａ１Ｐ９－５Ａ２－ＳＣ８ ｉＰＬＮＰは、全肝細胞の約９１％へのｍＲＮＡ送達を媒介した（図２７Ａ～図２７Ｃ）。肺選択的９Ａ１Ｐ９－ＤＤＡＢ ｉＰＬＮＰは全内皮細胞の約３４％、全上皮細胞の約２０％および免疫細胞の約１３％をトランスフェクトした（図２８）。脾臓選択的１０Ａ１Ｐ１６－ＭＤＯＡ ｉＰＬＮＰは、全マクロファージの約３０％および全Ｂ細胞の６％をトランスフェクトした（図２９）。ここで提案されるｉＰＬＮＰは、最も有効なｍＲＮＡ送達システムのうちの１つを表し、臓器選択的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集の大きな可能性を保持していた。
［実施例６］
９Ａ１Ｐ９ ｉＰＬＮＰは肝臓または肺選択的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集を達成した
本開示によると、ｍＲＮＡを送達するためにＬＮＰが利用されてきたが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集のためのインビボＣａｓ９ ｍＲＮＡ／ｓｇＲＮＡ送達の成功についての報告は依然としてほとんどなく、特異的臓器への正確な送達についてはなおさらである１。ｉＰＬＮＰシステムは高いｍＲＮＡ送達有効性および臓器選択性を示したので、次に、これを利用して遺伝子編集のためにＣａｓ９ ｍＲＮＡとｓｇＲＮＡを共送達した。４：１重量比でＣａｓ９ ｍＲＮＡとＴｏｍ１ ｓｇＲＮＡ（ｓｇＴｏｍ１）を含有する９Ａ１Ｐ９－５Ａ２－ＳＣ８および９Ａ１Ｐ９－ＤＤＡＢ ｉＰＬＮＰを、ストップカセットを削除し、ｔｄＴｏｍａｔｏタンパク質を活性化するであろう０．７５ｍｇ／ｋｇの全ＲＮＡ用量でＡｉ９マウスに静脈内（ＩＶ）投与した（図６Ａ）。エキソビボ臓器イメージングによって、９Ａ１Ｐ９－５Ａ２－ＳＣ８ ｉＰＬＮＰ投与後に、蛍光ｔｄＴｏｍａｔｏタンパク質が肝臓で特異的に観察された（図６Ｂ）。共焦点蛍光顕微鏡法による切片化臓器分析は、肝臓組織におけるｔｄＴｏｍａｔｏ陽性細胞を示した（図６Ｃ）。同様に、９Ａ１Ｐ９－ＤＤＡＢ ｉＰＬＮＰは、肺での特異的遺伝子編集を誘導した（図６Ｄ～図６Ｅ）。これに続いて、ＰＴＥＮ ｓｇＲＮＡ（ｓｇＰＴＥＮ）を、内因性遺伝子を標的化して、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに遺伝子編集用のＣａｓ９ ｍＲＮＡと共送達した（Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ／ｓｇＰＴＥＮ重量比、４：１；全ＲＮＡ用量、０．７５ｍｇ／ｋｇ）。Ｔ７Ｅ１アッセイは、それぞれ９Ａ１Ｐ９－５Ａ２－ＳＣ８および９Ａ１Ｐ９－ＤＤＡＢ ｉＰＬＮＰによる肝臓および肺での効率的な標的遺伝子編集を示した（図６Ｆ）。特異的臓器でのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集は、研究および臨床翻訳における長年にわたる課題のままであった。この試験で、極めて効率的で臓器選択的な遺伝子編集が、ｉＰＬＮＰ適用を多様な遺伝子疾患に広げた。
潜在的な前臨床活性を考慮して、制御されたマイクロ流体混合を使用して、リードｉＰＬＮＰをより高いスケールで製造した。混合速度および体積比に対する正確な制御により、より小型の９Ａ１Ｐ９－５Ａ２－ＳＣ８ ｉＰＬＮＰ（７７．２ｎｍ、肝臓特異的）、９Ａ１Ｐ９－ＤＤＡＢ ｉＰＬＮＰ（１０８．１ｎｍ、肺特異的）、および１０Ａ１Ｐ１６－ＭＤＯＡ ｉＰＬＮＰ（９６．１ｎｍ、脾臓特異的）の調製が可能になった。重要なことに、ｉＰＬＮＰ直径を減少させた後でも、高いインビボｍＲＮＡ送達有効性および正確な臓器選択性が完全に保持された（図６Ｇ～図６Ｈおよび図３０Ａ～図３０Ｂ）。さらに、ｉＰＬＮＰは繰り返し投与を可能にし、各繰り返し注射後に高い有効性が保持された（図６Ｉ～図６Ｊ）。肝機能酵素および組織切片組織学の分析により、これらのｉＰＬＮＰが試験した用量で取るに足らないインビボ毒性を示すことが示された（図６Ｋ～図６Ｎおよび図３１Ａ～図３１Ｄ）。これらの結果は、将来の適用についてのｉＰＬＮＰシステムの可能性を強調するものである。
［実施例７］
ｉＰＬＮＰは皮下注射後に核酸送達を達成した
エタノール希釈法を使用して、ｉＰＬＮＰを製剤化した。各ｉＰＬＮＰについての脂質成分のモル比を、２５：３０：３０：１、ｉＰｈｏｓ脂質：コレステロール：ＤＯＤＡＰ：ＰＥＧ－ＤＭＧとした。ｉＰｈｏｓ脂質とＣｒｅレコンビナーゼ（ＣＲＥ）ｍＲＮＡの重量比を１８：１で固定した。５μｇのＣＲＥ ｍＲＮＡ ｉＰＬＮＰをＡｉ９マウスに皮下注射した。ＣＲＥ ｍＲＮＡ ｉＰＬＮＰの皮下注射の４４時間後にＩＶＩＳを使用して、マウスをｔｄＴｏｍａｔｏシグナルについて画像化した。９Ａ１－Ｐ９、９Ａ１－Ｐ１５、および１０Ａ１－Ｐ１６ ｉＰＬＮＰは、ＣＲＥ ｍＲＮＡを細胞に送達して遺伝子編集を達成することができ、ＤＮＡが編集されて赤色蛍光レポーターｔｄＴｏｍａｔｏタンパク質の発現をオンにした（図３３Ａ～図３３Ｂ）。
実施例１～７の考察
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集システムは、遺伝子疾患処置のとてつもない可能性のためにますます関心を集めている。細胞はリン脂質を使用して膜を構築し、輸送を媒介するが、遺伝子送達のためのほとんど全ての有効な脂質ナノ粒子が、電荷獲得を介してエンドソーム脱出を媒介する重要な物理化学的パラメータとしてイオン化可能アミンに依拠している。担体開発において、合成双性イオン性脂質は、生体膜との相同性のためにエンドソーム膜融合および漏出性を容易に可能にし得るにもかかわらず、ほとんど調査されてこなかった。双性イオンは、ナノ粒子の安定性、ＲＮＡ封入、細胞取り込み、および薬物動態に役立つことが報告されているが、現在のリン脂質は、化学構造の柔軟性の欠如によって制限されている。
したがって、本開示は、化学合成を使用して新たなリン脂質を開発することを目指し、エンドソームからの効率的なカーゴ脱出のために生体膜に挿入する極めて魅力的な候補を明らかにした。一方、リン脂質の構造および機能はしっかり調整され、酸性エンドソーム破裂を特異的に可能にし、生理的環境で血液溶血効果を予防することができた。ｉＰｈｏｓ脂質の合理的設計は、ｐＨ切替可能な双性イオン頭部および３尾部体を伴っていた。このユニークな構造により、天然に存在する膜リン脂質に挿入し、エンドソームからＲＮＡを放出するために相転移を誘導することが容易になる。ＳＡＲは、ｉＰｈｏｓ鎖長が、インビボｍＲＮＡ送達有効性および臓器選択性を制御し得ることを明らかにした。さらに、多様な既存の双性イオン性、イオン化可能カチオン性、および永久カチオン性ヘルパー脂質を本発明者らのｉＰＬＮＰシステムで評価したところ、脾臓、肝臓、および肺で選択的にｍＲＮＡ翻訳を媒介した。最終的に、上位９Ａ１Ｐ９－５Ａ２－ＳＣ８および９Ａ１Ｐ９－ＤＤＡＢ ｉＰＬＮＰを利用してｍＲＮＡとｓｇＲＮＡを共送達してレポーター遺伝子および内因性遺伝子を編集し、長期の課題であった臓器選択的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集を達成した。さらに、これらのｉＰＬＮＰは、プラスミドＤＮＡおよびｓｉＲＮＡを含む他の核酸を送達するための広い適用性を示した（図３２Ａ～図３２Ｂ）。これらのプロファイルは、イオン化可能な合成リン脂質に、最小限の副作用で多様な遺伝子疾患を処置する大きな見込みを与える。
実施例１～７で使用した材料および方法
材料－合成用の化学物質および試薬。２－クロロ－２－オキソ－１，３，２－ジオキサホスホラン（ＣＯＰ）およびトリエチルアミン（ＴＥＡ）はＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。アミン、アルコール、コレステロール（ｃｈｏｌ）、およびＮ－メチルジオクタデシルアミン（ＭＤＯＡ）はＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－Ｌ－セリン（ナトリウム塩）（ＤＯＰＳ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－（７－ニトロ－２－１，３－ベンゾオキサジアゾール－４－イル）（アンモニウム塩）（ＮＢＤ－ＰＥ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－（リサミンローダミンＢスルホニル）（アンモニウム塩）（Ｎ－Ｒｈ－ＰＥ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＤＡＰ）、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（塩化物塩）（ＤＯＴＡＰ）およびジメチルジオクタデシルアンモニウム（臭化物塩）（ＤＤＡＢ）はＡｖａｎｔｉ Ｌｉｐｉｄｓから購入した。１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシ（ポリ（エチレングリコール－２０００））（ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００）はＮＯＦ Ａｍｅｒｉｃａから入手した。イオン化可能カチオン性脂質５Ｓ２－ＳＣ８は本発明者らの以前の文献レポートにより調製した。ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡはＭｅｄＫｏｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入し、文献によって報告される配合詳細により使用した。有機溶媒はＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。
材料－生物学的アッセイ用の試薬。ダルベッコ改変リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ＲＰＭＩ－１６４０培地、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、およびトリプシン－ＥＤＴＡ（０．２５％）はＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。ホタルルシフェラーゼメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、Ｃｒｅ ｍＲＮＡ、およびＣａｓ９ ｍＲＮＡはＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。Ｑｕａｎｔ－ｉＴ ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ ＲＮＡアッセイキットはＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。ＯＮＥ－Ｇｌｏ＋ＴｏｘルシフェラーゼアッセイキットはＰｒｏｍｅｇａから購入した。ホタルＤ－ルシフェリン、ナトリウム塩一水和物はＧｏｌｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。
アルキル化ジオキサホスホランオキシド分子Ｐ４～Ｐ１６の合成。Ｐ４～Ｐ１６は、異なるアルキル鎖長を有する対応するアルコールによる２－クロロ－２－オキソ－１，３，２－ジオキサホスホラン（ＣＯＰ）のエステル化を介して合成した。例えば、Ｐ４を調製するために、１－ブタノール（３０ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（ＴＥＡ、３０ｍｍｏｌ）を無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）２５ｍＬに溶解した。次いで、ＴＨＦ１０ｍＬ中ＣＯＰ（３０ｍｍｏｌ）溶液を－１５℃で混合物に滴加した。その後、反応を２５℃で１２時間続けた。混合物を濾過してトリエチルアミン塩酸塩を除去し、濾液を回転蒸発によって濃縮してＰ４を得た。Ｐ５～Ｐ１０分子は、それぞれのアルコールを使用し、上記の一般的なプロトコルに従って合成した。Ｐ１１～Ｐ１６合成については、ＣＯＰを０℃で対応するアルコールに添加し、他の手順は同じままとした。Ｐ４～Ｐ１６合成の全てが９０％超の収率をもたらした。
イオン化可能なリン脂質（ｉＰｈｏｓ）ライブラリーの一般的な合成。ｉＰｈｏｓ（ｎＡｘＰｍ）は、アミン（１Ａ～２８Ａ）とアルキル化ジオキサホスホランオキシド分子（Ｐｍ、ｍ＝４～１６）による直交型反応を通して合成した。「ｘ」は１つのアミン分子上の修飾されたＰｍ分子の数を示し、各Ｐｍ分子は１つのリン酸基および１つの疎水性アルキル鎖をｉＰｈｏｓに導入することができた。各第一級、第二級、または第三級アミンを、１当量のアルキル化ジオキサホスホランオキシド分子Ｐｍを消費するよう設計した。単一の第一級、第二級または第三級アミンを有するアミンｎＡ（ｎ＝１～１８）については、１．１当量のＰｍをアミンと反応させてｎＡ１Ｐｍを得た。複数のアミン基を有するｎＡ（ｎ＝１９～２８）については、各アミン基を、最大でも１つの双性イオンを導入するよう設計した。手短に言えば、アミンを２．２当量、３．３当量、４．４当量および５．５当量のＰｍと反応させてそれぞれｎＡ２Ｐｍ、ｎＡ３Ｐｍ、ｎＡ４ＰｍおよびｎＡ５Ｐｍ ｉＰｈｏｓを得た。全ての反応を、０．３ｇ／ｍＬの出発物質濃度で、無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で行った。混合物を７０℃で３日間攪拌し、次いで、真空乾燥を通してＤＭＳＯを除去した。
粗ｉＰｈｏｓを使用して、初期ｍＲＮＡ送達（インビトロおよびインビボスクリーニング）実験を行った。選択された上位ｉＰｈｏｓ（例えば、９Ａ１Ｐ９、１０Ａ１Ｐ１０、９Ａ１Ｐ１５、及び１０Ａ１Ｐ１６）をカラムフラッシュクロマトグラフィーによって精製し、追加の特性評価（サイズ、ゼータ電位、ｍＲＮＡ結合、ｐＫａ、溶血、ＦＲＥＴ試験等を含む）およびインビボ評価に使用した。生成物を、メタノール中３％クロロホルムからメタノール中１０％クロロホルムの溶媒勾配を用いて溶出および分別した。最終的なｉＰｈｏｓを回転蒸発によって濃縮し、真空下で２４時間乾燥させた。
インビトロｉＰｈｏｓナノ粒子（ｉＰＬＮＰ）製剤化および特性評価。ｉＰＬＮＰをエタノール希釈法によって調製した。ｍＲＮＡをクエン酸／クエン酸ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ４．４）に希釈した。合成ｉＰｈｏｓ、ＭＤＯＡ、コレステロール、およびＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含有する脂質混合物をエタノール中で調製した。２つの溶液を、３：１の水性：エタノール体積比でピペットによって迅速に混合した。１５分間のインキュベーション後、ナノ粒子をインビトロｍＲＮＡ送達のために１×ＰＢＳ緩衝液で３倍希釈した。
粒径およびＲｉｂｏｇｒｅｅｎ ｍＲＮＡ結合測定のために、ナノ粒子を１×ＰＢＳ緩衝液で５倍希釈した。１×ＰＢＳ緩衝液で１０倍希釈したナノ粒子でゼータ電位を記録した。Ｈｅ－Ｎｅレーザー（λ＝６３２ｎｍ）を備えたＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ）を粒径およびゼータ電位測定に使用した。粒径を動的光散乱法（ＤＬＳ）によって測定し、ゼータ電位を電気泳動光散乱法によって決定した。
２－（ｐ－トルイジノ）－６－ナフタレンスルホン酸（ＴＮＳ）アッセイを使用したｐＫａ決定。各ｉＰＬＮＰのｐＫａをＴＮＳアッセイによって決定した。合成ｉＰｈｏｓ／ＭＤＯＡ／ｃｈｏｌ／ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００（２５／３０／３０／１ ｍｏｌ％）で構成されるｉＰＬＮＰを、０．６ｍＭ全脂質の濃度で、ＰＢＳ中で製剤化した。ＴＮＳをｍｉｌｌｉＱ水中１００μＭストック溶液として調製した。ナノ粒子を１０ｍＭ ４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、１０ｍＭ ４－モルホリンエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、１０ｍＭ 酢酸アンモニウムおよび１３０ｍＭ ＮａＣｌを含有する緩衝液（ｐＨは２．５～１１の範囲であった）により、９６ウェルプレート中、１ウェル当たり１００μＬ体積の６μＭ全脂質まで希釈した。ＴＮＳストック溶液を各ウェルに添加して最終濃度５μＭを得た。その後、それぞれ３２１ｎｍおよび４４５ｎｍの励起波長および発光波長を使用してプレートを読み取った。シグモイドフィット分析を蛍光データに適用し、ｐＫａを、最大半量の蛍光強度をもたらすｐＨとして測定した。
溶血アッセイ。マウス赤血球（ＲＢＣ）を、１００００×ｇで５分間遠心分離することによって新たに回収した全血から単離し、次いで、ＲＢＣをＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）で５回洗浄した。その後、ＲＢＣをそれぞれｐＨ７．４および５．５のＰＢＳに懸濁した。上に概説されるインビトロｉＰＬＮＰ製剤化法を使用してｉＰＬＮＰを製剤化した。脂質をクロロホルムに溶解し、回転蒸発させ、さらに２時間真空乾燥させて、薄い脂質膜を得た。次いで、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を添加し、２０分間超音波処理して、粒子懸濁液を得た。ＲＢＣ懸濁液を９６ウェルプレートに添加し、計算されたｉＰＬＮＰまたは脂質をウェルに添加した。３７℃で１時間インキュベートした後、ＲＢＣ溶液を１００００×ｇで５分間遠心分離し、ヘモグロビンを含有する上清を回収した。マイクロプレートリーダーにより、５４０ｎｍの波長で、ヘモグロビン含有量を評価した。ＰＢＳ中でインキュベートしたそのＲＢＣ懸濁液を陰性対照として設定し、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ溶液（１重量％）中でインキュベートしたＲＢＣ懸濁液を陽性対照として設定した。
蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）アッセイによる脂質混合および融合特性評価。エンドソーム模倣アニオン性リポソームとの脂質混合および融合をＦＲＥＴアッセイによって決定した。ＤＯＰＥコンジュゲートＦＲＥＴプローブであるＮＢＤ－ＰＥおよびＮ－Ｐｈ－ＰＥを、同じエンドソーム模倣ナノ粒子に製剤化して、ローダミンへのＦＲＥＴによるＮＢＤ蛍光の減弱をもたらした。いったん脂質融合が起こったら、２つのプローブ間の距離が大きくなることにより、ＮＢＤシグナルが増加するだろう。ＤＯＰＳ：ＤＯＰＣ：ＤＯＰＥ：ＮＢＤ－ＰＥ：Ｎ－Ｐｈ－ＰＥ（モル比２５：２５：４８：１：１）をクロロホルム中で混合し、引き続いて回転蒸発させ、さらに２時間真空乾燥させて薄い脂質膜を得ることによって、エンドソーム模倣アニオン性リポソームを調製した。その後、乾燥膜を２０分間超音波処理することによってＰＢＳ（ｐＨ７．４）に再懸濁し、全脂質濃度を１ｍＭで固定した。１ｍＭのｉＰｈｏｓ濃度で上に概説されるインビトロｉＰＬＮＰ製剤化法を使用してｉＰＬＮＰを製剤化した。ｉＰｈｏｓ １０Ａ１Ｐ１０をクロロホルムに溶解し、回転蒸発させて薄い脂質膜を得た。次いで、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を添加し、２０分間超音波処理して粒子懸濁液（１０ｍＭ）を得た。複数の双性イオンを有する２５Ａ３Ｐ１０は、超音波処理後に粒子懸濁液を形成することができなかったので、２５Ａ３Ｐ１０ ｉＰＬＮＰの脂質融合のみを評価した。ＰＢＳ（ｐＨ５．５）を黒色９６ウェルプレートに添加し（１００μＬ／ウェル）、１μＬのエンドソーム模倣アニオン性リポソーム（１ｍＭ）を各ウェルに添加した。次いで、１０μＬのｉＰＬＮＰまたは１μＬの脂質懸濁液をウェルに添加した。３７℃で５分間インキュベートした後、蛍光測定（Ｆ）をＥｘ／Ｅｍ＝４６５／５２０ｎｍにおいてマイクロプレートリーダーで行った。ＰＢＳ中エンドソーム模倣アニオン性リポソームのみを陰性対照（Ｆｍｉｎ）として設定した。Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ溶液（２重量％）とインキュベートしたプローブを含有する脂質を陽性対照（Ｆｍａｘ）として設定した。脂質融合（％）を（Ｆ－Ｆｍｉｎ）／（Ｆｍａｘ－Ｆｍｉｎ）＊１００％として計算した。
ＦＲＥＴアッセイによるｉＰＬＮＰ解離。ｉＰＬＮＰとエンドソーム模倣アニオン性リポソームを混合することによって、ｉＰＬＮＰ解離を測定した。ＤＯＰＥコンジュゲートＦＲＥＴプローブＮＢＤ－ＰＥおよびＮ－Ｒｈ－ＰＥを同じｉＰＬＮＰに製剤化した。ｉＰＬＮＰを、１ｍＭの最終全脂質濃度でｉＰｈｏｓ：ＭＤＯＡ：ｃｈｏｌ：ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００：ＮＢＤ－ＰＥ：Ｎ－Ｒｈ－ＰＥ脂質混合物（モル比２５：３０：３０：１：０．８６：０．８６）を使用して調製した。他の手順は、上に概説されるインビトロｉＰＬＮＰ製剤化法と同じであった。ＤＯＰＳ：ＤＯＰＣ：ＤＯＰＥ（モル比２５：２５：５０）をクロロホルム中で混合し、引き続いて回転蒸発させ、さらに２時間真空乾燥させて薄い脂質膜を得ることによって、エンドソーム模倣アニオン性リポソームを調製した。その後、乾燥膜を２０分間超音波処理することによってＰＢＳ（ｐＨ７．４）に再懸濁し、全脂質濃度を１０ｍＭで固定した。ＰＢＳ（ｐＨ５．５）を黒色９６ウェルプレートに添加し（１００μＬ／ウェル）、１μＬのｉＰＬＮＰを各ウェルに添加した。次いで、１μＬのエンドソーム模倣アニオン性リポソームをウェルに添加した。３７℃で１０分間（または他の言及される時間間隔）インキュベートした後、蛍光測定（Ｆ）をＥｘ／Ｅｍ＝４６５／５２０ｎｍにおいてマイクロプレートリーダーで行った。ＰＢＳ中ｉＰＬＮＰ（ＮＢＤ－ＰＥおよびＮ－Ｒｈ－ＰＥを内側に有する）を陰性対照（Ｆｍｉｎ）として設定した。Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ溶液（２重量％）とインキュベートしたｉＰＬＮＰ（ＮＢＤ－ＰＥおよびＮ－Ｒｈ－ＰＥを内側に有する）を陽性対照（Ｆｍａｘ）として設定した。ｉＰＬＮＰ解離（％）を（Ｆ－Ｆｍｉｎ）／（Ｆｍａｘ－Ｆｍｉｎ）＊１００％として計算した。
細胞培養。ヒト卵巣腺癌細胞（ＩＧＲＯＶ１）を、１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）を含むＲＰＭＩ－１６４０培地で培養した。細胞を加湿雰囲気中３７℃および５％ＣＯ２で培養した。
ｍＲＮＡ送達についてのｉＰｈｏｓのインビトロスクリーニング。ＩＧＲＯＶ１細胞を、白色不透明９６ウェルプレートに１×１０４細胞／ウェル（１０％ＦＢＳおよび１％Ｐ／Ｓを供給した１００μＬのＲＰＭＩ－１６４０培地）の密度で播種した。２４時間後、マルチチャネルピペットを用いて、水相とエタノール相（ｖ／ｖ＝３：１）を迅速に混合することによって、９６ウェルプレートで上に概説されるインビトロｉＰＬＮＰ製剤化法を使用してＦｌｕｃ ｍＲＮＡを含むナノ粒子を調製した。ｉＰＬＮＰを、１１６２２：１の合成ｉＰｈｏｓ：ｍＲＮＡモル比および２５：３０：３０：１の脂質混合物合成ｉＰｈｏｓ：ＭＤＯＡ：ｃｈｏｌ：ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００モル比で調製した。１１６２２：１の合成ｉＰｈｏｓ：ｍＲＮＡモル比を固定すると、１０Ａ１Ｐ４～１２Ａ１Ｐ１６：ｍＲＮＡは１０±２．５の平均重量比を示した。これにより、各ｉＰＬＮＰが同じモルの脂質混合物を有することを保証することができた。他に言及しない限り、これらの比を他の特性評価およびインビボ評価にも使用した。５０ｎｇのｍＲＮＡ／ウェルを使用した。次いで、１５０μＬの新たな細胞培養培地を利用して前の培地と交換し、製剤化したｉＰＬＮＰを細胞に添加した。さらに２４時間のインキュベーション後、ルシフェラーゼ発現および細胞生存率をＯＮＥ－Ｇｌｏ＋Ｔｏｘルシフェラーゼアッセイキットで評価した。全てのトランスフェクションアッセイを３連で実施し、平均＋標準偏差を報告した。
インビボｉＰＬＮＰ製剤化および特性評価。ｍＲＮＡをクエン酸／クエン酸ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ３．２）に希釈した。合成ｉＰｈｏｓ、ＭＤＯＡ、コレステロール、およびＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含有する脂質混合物をエタノール中で調製した。２つの相を３：１水性：エタノール体積比でピペットによって迅速に混合した。１５分間のインキュベーション後、ｉＰＬＮＰを、インビボ使用のために、Ｐｕｒ－Ａ－Ｌｙｚｅｒミディ透析チャンバー（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）中で１×ＰＢＳに対して透析した。
動物実験。全ての実験は、テキサス大学サウスウェスタンメディカルセンターの動物実験委員会によって承認され、該当する場合は地方、州、および連邦規制と矛盾しなかった。雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスをＵＴサウスウェスタン動物飼育コアから購入した。Ｂ６．Ｃｇ－Ｇｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒｔｍ９（ＣＡＧ－ｔｄＴｏｍａｔｏ）Ｈｚｅ／Ｊマウス（Ａｉ９またはＡｉ９（ＲＣＬ－ｔｄＴ）マウスとしても知られている）をＴｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（００７９０９）から入手し、ＣＡＧプロモーターによって駆動される赤色蛍光ｔｄＴｏｍａｔｏタンパク質の転写を妨げるＬｏｘＰ隣接ＳＴＯＰカセットを有するＣｒｅレポーター対立遺伝子のホモ接合型発現を維持するよう飼育した。Ｃｒｅ媒介組換え後、Ａｉ９マウスはｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光を発現する。Ａｉ９マウスは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ遺伝的背景でコンジェニックである。
インビボルシフェラーゼｍＲＮＡ送達。ｉＰｈｏｓインビボスクリーニングのために、Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡを含有するナノ粒子を上記のインビボｉＰＬＮＰ製剤化法のように調製した。特に言及しない限り、製剤の比はインビトロスクリーニングの比に従った。手短に言えば、ｉＰＬＮＰを、１１６２２：１の合成ｉＰｈｏｓ：Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡモル比および２５：３０：３０：１の脂質混合物合成ｉＰｈｏｓ：ＭＤＯＡ：ｃｈｏｌ：ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００モル比で調製した。次いで、ナノ粒子を、静脈内（ＩＶ）注射を介して雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（６～８週齢）に投与した。６時間後、ルシフェラーゼ発現を生きた動物の生物発光イメージングによって評価した。手短に言えば、マウスをイソフルラン下で麻酔し、１００μＬのＤ－ルシフェリン（ＧｏｌｄＢｉｏ、ＰＢＳ中３０ｍｇ／ｍＬ）基質を腹腔内注射した。麻酔下で５分後、ルシフェラーゼ活性をＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａシステム（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で画像化した。その後、臓器を単離し、同じ方法で画像化した。画像をＬｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ分析ソフトウェア（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で処理した。
ｉＰｈｏｓ ９Ａ１Ｐ９を使用して市販のリン脂質であるＤＯＰＥおよびＤＳＰＣと比較した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに０．２５ｍｇ／ｋｇ Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡでナノ粒子によってＩＶ注射し、注射６時間後に発光を定量化した。２５：３０：３０：１の９Ａ１Ｐ９：ＭＤＯＡ：ｃｈｏｌ：ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００モル比および１８：１の９Ａ１Ｐ９／ｍＲＮＡ重量比を使用した。市販のリン脂質との比較のために、等モルのＤＯＰＥまたはＤＳＰＣを利用して９Ａ１Ｐ９と交換した。他の手順は上に言及されるのと同じように行った。
異なるヘルパー脂質を有する９Ａ１Ｐ９ ｉＰＬＮＰについては、５５：３０：４５：０．２の９Ａ１Ｐ９：ＤＯＰＥ：ｃｈｏｌ：ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００（モル比）、２５：３０：３０：１の９Ａ１Ｐ９：ＭＤＯＡ（ＤＯＤＡＰまたは５Ａ２－ＳＣ８）：ｃｈｏｌ：ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００（モル比）および６０：３０：４０：０．４の９Ａ１Ｐ９：ＤＤＡＢ（またはＤＯＴＡＰ）：ｃｈｏｌ：ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００（モル比）を使用した。全ての製剤について、９Ａ１Ｐ９：ｍＲＮＡ重量比を１８：１で固定した。他の手順は上に言及されるのと同じように行った。
インビボＣｒｅ ｍＲＮＡ送達。Ｃｒｅ ｍＲＮＡを含有するナノ粒子を、上に言及されるインビボｉＰＬＮＰ製剤化法のように調製した。その後、ナノ粒子を、ＩＶ注射を介してＡｉ９マウスに投与した。４８時間後、マウスを屠殺し、臓器を単離し、ＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍインビボイメージングシステム（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で画像化した。
インビボ生体分布。Ｃｙ５標識Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡ（Ｃｙ５－ｍＲＮＡ、０．２５ｍｇ／ｋｇ）を含有するナノ粒子を上に言及されるインビボｉＰＬＮＰ製剤化法のように調製した。ｉＰＬＮＰを、ＩＶ注射を介して雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（６～８週齢）に投与した。６時間後、マウスを屠殺し、臓器を単離し、ＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍインビボイメージングシステム（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で画像化した。
遺伝子編集のためのＣａｓ９ ｍＲＮＡとｓｇＴｏｍ１のインビボ共送達。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよび改変ｓｇＴｏｍ１（ｍＲＮＡ／ｓｇＲＮＡ重量比４：１、全ＲＮＡ用量０．７５ｍｇ／ｋｇ）を含有するナノ粒子を上記のインビボｉＰＬＮＰ製剤化法のように調製した。２５：３０：３０：１の９Ａ１Ｐ９：５Ａ２－ＳＣ８：ｃｈｏｌ：ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００（モル比）および６０：３０：４０：０．４の９Ａ１Ｐ９：ＤＤＡＢ：ｃｈｏｌ：ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００（モル比）をそれぞれ９Ａ１Ｐ９－５Ａ２－ＳＣ８ ｉＰＬＮＰおよび９Ａ１Ｐ９－ＤＤＡＢ ｉＰＬＮＰに使用した。９Ａ１Ｐ９／ＲＮＡ重量比を１８：１で固定した。その後、ｉＰＬＮＰを、ＩＶ注射を介してＡｉ９マウスに投与した。ＰＢＳ群を陰性対照として使用した。１０日後、マウスを屠殺し、臓器を単離し、ＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍインビボイメージングシステム（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で画像化した。次いで、組織を最適切断温度（ＯＣＴ）化合物に包埋し、１０μｍ切片に切断した。これらの切片をＲＴにおいて２０分間、４％パラホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳで３回洗浄した。その後、ＤＡＰＩを含む１滴のＰｒｏＬｏｎｇ Ｇｏｌｄ Ｍｏｕｎｔａｎｔを適用し、カバーガラスをこれらのスライド上に被せた。次いで、これらのスライドを共焦点顕微鏡法（Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ７００）によって画像化した。
Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける遺伝子編集のためのＣａｓ９ ｍＲＮＡとｓｇＰＴＥＮのインビボ共送達。インビボでの内因性遺伝子編集を調べるためにＰＴＥＮを選択した。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよび改変ｓｇＰＴＥＮ（ｍＲＮＡ／ｓｇＲＮＡ重量比４：１、全ＲＮＡ用量０．７５ｍｇ／ｋｇ）を含有するｉＰＬＮＰを上に言及されるインビボｉＰＬＮＰ製剤化法のように調製した。２５：３０：３０：１の９Ａ１Ｐ９：５Ａ２－ＳＣ８：ｃｈｏｌ：ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００（モル比）および６０：３０：４０：０．４の９Ａ１Ｐ９：ＤＤＡＢ：ｃｈｏｌ：ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００（モル比）をそれぞれ９Ａ１Ｐ９－５Ａ２－ＳＣ８ ｉＰＬＮＰおよび９Ａ１Ｐ９－ＤＤＡＢ ｉＰＬＮＰに使用した。９Ａ１Ｐ９／ＲＮＡ重量比を１８：１で固定した。その後、ｉＰＬＮＰを、ＩＶ注射を介して野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウス（６～８週齢）に投与した。１０日後、組織を回収し、ゲノムＤＮＡをＰｕｒｅＬｉｎｋ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で抽出した。ＰＴＥＮ ＰＣＲ産物を得た後、標準的なプロトコルによって、Ｔ７Ｅ１アッセイ（ＮＥＢ）を実施して遺伝子編集有効性を確認した。さらに、ＰＴＥＮの遺伝子編集有効性を、インデル（％）＝１００×（１－（１－切断分率）＾０．５）（式中、切断分率＝（断片１＋断片２）／（断片１＋断片２＋親断片）である）の式に基づいてＩｍａｇｅ Ｊによって評価した。本明細書で使用されるｓｇＲＮＡ配列およびＰＣＲプライマーをそれぞれ表２および表３に提供する。
統計分析。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン７（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して統計分析を実施した。両側の対応のないスチューデントのｔ検定を使用して２つの群を比較し、一元配置ＡＮＯＶＡを利用して複数の複製群を比較した。Ｐ値＜０．０５（＊）、Ｐ＜０．０１（＊＊）およびＰ＜０．００１（＊＊＊）を統計学的に有意であるとみなした。
実施例１～７で使用した引用
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出願時の特許請求の範囲は以下の通り。

［請求項１］
式（Ｉ）：
（式中、
Ｒ１は、Ｃ２～Ｃ２０非置換アルキル、Ｃ２～Ｃ２０置換アルキル、Ｃ２～Ｃ２０非置換アルケニル、Ｃ２～Ｃ２０置換アルケニル、Ｃ２～Ｃ２０非置換アルキニル、Ｃ２～Ｃ２０置換アルキニル、Ｃ４～Ｃ２０非置換シクロアルキル、およびＣ４～Ｃ２０置換シクロアルキルからなる群から選択され；
Ｒ２、およびＲ３は、Ｈ、Ｃ１～Ｃ２０非置換アルキル、Ｃ１～Ｃ２０置換アルキル、Ｃ１～Ｃ２０非置換アルケニル、Ｃ１～Ｃ２０置換アルケニル、Ｃ１～Ｃ２０非置換アルキニル、Ｃ１～Ｃ２０置換アルキニル、Ｃ４～Ｃ２０非置換シクロアルキル、およびＣ４～Ｃ２０置換シクロアルキルからなる群から独立して選択され；
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７は、Ｈ、Ｃ１～Ｃ８非置換アルキル、Ｃ１～Ｃ８置換アルキル、Ｃ１～Ｃ８非置換アルケニル、Ｃ１～Ｃ８置換アルケニル、Ｃ１～Ｃ８非置換アルキニル、およびＣ１～Ｃ８置換アルキニルからなる群から独立して選択され；
Ｒ８は、Ｃ３～Ｃ２１非置換アルキル、Ｃ３～Ｃ２１置換アルキル、Ｃ３～Ｃ２１非置換アルケニル、Ｃ３～Ｃ２１置換アルケニル、Ｃ３～Ｃ２１非置換アルキニル、およびＣ３～Ｃ２１置換アルキニルからなる群から選択され；
ｎは１～４の整数である）
を含むイオン化可能な合成リン脂質。
［請求項２］
Ｒ１が、Ｃ２～Ｃ１６非置換アルキル、Ｃ２～Ｃ１６置換アルキル、またはＣ４～Ｃ１２置換シクロアルキルからなる群から選択され；
Ｒ２、およびＲ３が、Ｈ、Ｃ１～Ｃ１６非置換アルキル、Ｃ１～Ｃ１６置換アルキル、またはＣ４～Ｃ１６置換シクロアルキルからなる群から独立して選択され；
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７が、Ｈ、Ｃ１～Ｃ４非置換アルキル、またはＣ１～Ｃ４置換アルキルからなる群から独立して選択され；
Ｒ８がＣ３～Ｃ１８非置換アルキルから選択され；
ｎが１～３の整数である、
請求項１に記載のイオン化可能な合成リン脂質。
［請求項３］
Ｒ１がＣ２～Ｃ１５非置換アルキルであり；
Ｒ２およびＲ３が、Ｈ、Ｃ１～Ｃ１６置換アルキル、またはＣ４～Ｃ１６置換シクロアルキルからなる群から独立して選択され；
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７が、Ｈ、メチル、またはエチルからなる群から独立して選択され；
Ｒ８がＣ４～Ｃ１６非置換アルキルから選択され；
ｎが１～２の整数である、
請求項１に記載のイオン化可能な合成リン脂質。
［請求項４］
式（ＩＩ）：
（式中、Ｒ１およびＲ２は、Ｈ、Ｃ１～Ｃ８置換アルキル、またはＣ１～Ｃ８非置換アルキルからなる群から独立して選択され；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６は、Ｈ、Ｃ１～Ｃ８非置換アルキル、またはＣ１～Ｃ８置換アルキルからなる群から独立して選択され；
Ｒ７は、Ｃ３～Ｃ２１非置換アルキルまたはＣ３～Ｃ２１置換アルキルからなる群から選択され；
ｎは１～４の整数である）
を含むイオン化可能な合成リン脂質。
［請求項５］
Ｒ１およびＲ２が、Ｈ、Ｃ１～Ｃ６置換アルキル、またはＣ１～Ｃ６非置換アルキルからなる群から独立して選択され；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６が、Ｈ、Ｃ１～Ｃ４非置換アルキル、またはＣ１～Ｃ４置換アルキルからなる群から独立して選択され；
Ｒ７が、Ｃ３～Ｃ１８非置換アルキルまたはＣ３～Ｃ１８置換アルキルからなる群から選択され；
ｎが１～３の整数である、
請求項４に記載のイオン化可能な合成リン脂質。
［請求項６］
Ｒ１およびＲ２が、Ｈ、Ｃ１～Ｃ４置換アルキル、またはＣ１～Ｃ４非置換アルキルからなる群から独立して選択され；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６が、Ｈ、メチル、またはエチルからなる群から独立して選択され；
Ｒ７が、Ｃ３～Ｃ１５非置換アルキルまたはＣ３～Ｃ１５置換アルキルからなる群から選択され；
ｎが１～２の整数である、
請求項４に記載のイオン化可能な合成リン脂質。
［請求項７］
式（ＩＩＩ）：
（式中、
Ｒ１は、Ｃ２～Ｃ２０非置換アルキル、Ｃ２～Ｃ２０置換アルキル、Ｃ２～Ｃ２０非置換アルケニル、Ｃ２～Ｃ２０置換アルケニル、Ｃ２～Ｃ２０非置換アルキニル、Ｃ２～Ｃ２０置換アルキニル、Ｃ４～Ｃ２０非置換シクロアルキル、またはＣ４～Ｃ２０置換シクロアルキルからなる群から選択され；
Ｒ２、およびＲ３は、Ｈ、Ｃ１～Ｃ２０非置換アルキル、Ｃ１～Ｃ２０置換アルキル、Ｃ１～Ｃ２０非置換アルケニル、Ｃ１～Ｃ２０置換アルケニル、Ｃ１～Ｃ２０非置換アルキニル、Ｃ１～Ｃ２０置換アルキニル、Ｃ４～Ｃ２０非置換シクロアルキル、またはＣ４～Ｃ２０置換シクロアルキルからなる群から独立して選択され；
Ｒ４およびＲ５は、Ｈ、Ｃ１～Ｃ８非置換アルキル、Ｃ１～Ｃ８置換アルキル、Ｃ１～Ｃ８非置換アルケニル、Ｃ１～Ｃ８置換アルケニル、Ｃ１～Ｃ８非置換アルキニル、またはＣ１～Ｃ８置換アルキニルからなる群から独立して選択され；
Ｒ６は、Ｃ３～Ｃ２１非置換アルキル、Ｃ３～Ｃ２１置換アルキル、Ｃ３～Ｃ２１非置換アルケニル、Ｃ３～Ｃ２１置換アルケニル、Ｃ３～Ｃ２１非置換アルキニル、またはＣ３～Ｃ２１置換アルキニルからなる群から選択され；
ｎは１～４の整数であり；
ｍは１～４の整数である）
を含むイオン化可能なリン脂質。
［請求項８］
Ｒ１が、Ｃ２～Ｃ１６非置換アルキル、Ｃ２～Ｃ１６置換アルキル、Ｃ２～Ｃ１６非置換アルケニル、Ｃ２～Ｃ１６置換アルケニル、Ｃ２～Ｃ１６非置換アルキニル、Ｃ２～Ｃ１６置換アルキニル、Ｃ４～Ｃ１６非置換シクロアルキル、またはＣ４～Ｃ１６置換シクロアルキルからなる群から選択され；
Ｒ２、およびＲ３が、Ｈ、Ｃ１～Ｃ１６非置換アルキル、Ｃ１～Ｃ１６置換アルキル、Ｃ１～Ｃ１６非置換アルケニル、Ｃ１～Ｃ１６置換アルケニル、Ｃ１～Ｃ１６非置換アルキニル、Ｃ１～Ｃ１６置換アルキニル、Ｃ４～Ｃ１６非置換シクロアルキル、またはＣ４～Ｃ１６置換シクロアルキルからなる群から独立して選択され；
Ｒ４およびＲ５が、Ｈ、Ｃ１～Ｃ６非置換アルキル、Ｃ１～Ｃ６置換アルキル、Ｃ１～Ｃ６非置換アルケニル、Ｃ１～Ｃ６置換アルケニル、Ｃ１～Ｃ６非置換アルキニル、またはＣ１～Ｃ６置換アルキニルからなる群から独立して選択され；
Ｒ６が、Ｃ３～Ｃ１８非置換アルキル、Ｃ３～Ｃ１８置換アルキル、Ｃ３～Ｃ１８非置換アルケニル、Ｃ３～Ｃ１８置換アルケニル、Ｃ３～Ｃ１８非置換アルキニル、またはＣ３～Ｃ１８置換アルキニルからなる群から選択され；
ｎが１～３の整数であり；
ｍが１～３の整数である、
請求項７に記載のイオン化可能なリン脂質。
［請求項９］
少なくとも１つのリン酸基と、少なくとも１つの双性イオンとを含むイオン化可能な合成リン脂質であって、前記少なくとも１つの双性イオンがｐＨ切替可能な双性イオンを含む、イオン化可能な合成リン脂質。
［請求項１０］
疎水性ドメインをさらに含む、請求項９に記載のイオン化可能な合成リン脂質。
［請求項１１］
１つまたは複数の疎水性尾部をさらに含む、請求項９または請求項１０に記載のイオン化可能な合成リン脂質。
［請求項１２］
少なくとも１つの第三級アミンをさらに含む、請求項９から１１のいずれか１項に記載のイオン化可能な合成リン脂質。
［請求項１３］
前記１つまたは複数の疎水性尾部が１個の疎水性尾部～１０個の疎水性尾部からなる、請求項９から１２に記載のイオン化可能な合成リン脂質。
［請求項１４］
前記１つまたは複数の疎水性尾部の各々が、８個の炭素～１６個の炭素、８個の炭素～１０個の炭素、９個の炭素～１２個の炭素、１３個の炭素～１６個の炭素、８個の炭素～１６個の炭素、またはこれらの任意の組合せのアルキル鎖長を含むアルキル尾部である、請求項９から１３のいずれか１項に記載のイオン化可能な合成リン脂質。
［請求項１５］
前記１つまたは複数の疎水性尾部の少なくとも１つが、８個の炭素～１６個の炭素、８個の炭素～１０個の炭素、９個の炭素～１２個の炭素、１３個の炭素～１６個の炭素、８個の炭素～１６個の炭素、またはこれらの任意の組合せのアルキル鎖長を含むアルキル尾部である、請求項９から１３のいずれか１項に記載のイオン化可能な合成リン脂質。
［請求項１６］
請求項１から１５に記載のイオン化可能な合成リン脂質のいずれか１つを含む医薬組成物。
［請求項１７］
ヘルパー脂質をさらに含む、請求項１６に記載の組成物。
［請求項１８］
前記ヘルパー脂質が、双性イオン性ヘルパー脂質、イオン化可能カチオン性ヘルパー脂質、および永久カチオン性ヘルパー脂質からなる群から選択される、請求項１７に記載の組成物。
［請求項１９］
前記ヘルパー脂質が、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、Ｎ－メチルジオクタデシルアミン（ＭＤＯＡ）、１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＤＡＰ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウム臭化物塩（ＤＤＡＢ）、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項１７に記載の組成物。
［請求項２０］
コレステロールまたはコレステロール誘導体をさらに含む、請求項１６から１９のいずれか１項に記載の組成物。
［請求項２１］
１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシ（ポリ（エチレングリコール－２０００））（ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００）をさらに含む、請求項１６から２０のいずれか１項に記載の組成物。
［請求項２２］
５５：３０：４５モル比の１つまたは複数のマルチテールのイオン化可能なリン脂質と、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）と、コレステロールとをさらに含む、請求項１６から２１のいずれか１項に記載の組成物。
［請求項２３］
２５：３０：３０モル比の１つまたは複数のマルチテールのイオン化可能なリン脂質と、Ｎ－メチルジオクタデシルアミン（ＭＤＯＡ）と、コレステロールとをさらに含む、請求項１６から２１のいずれか１項に記載の組成物。
［請求項２４］
２５：３０：３０モル比の１つまたは複数のマルチテールのイオン化可能なリン脂質と、１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＤＡＰ）と、コレステロールとをさらに含む、請求項１６から２１のいずれか１項に記載の組成物。
［請求項２５］
２５：３０：３０モル比の１つまたは複数のマルチテールのイオン化可能なリン脂質と、５Ａ２－ＳＣ８と、コレステロールとをさらに含む、請求項１６から２１のいずれか１項に記載の組成物。
［請求項２６］
６０：３０：４０モル比の１つまたは複数のマルチテールのイオン化可能なリン脂質と、ジメチルジオクタデシルアンモニウム臭化物塩（ＤＤＡＢ）と、コレステロールとをさらに含む、請求項１６から２１のいずれか１項に記載の組成物。
［請求項２７］
６０：３０：４０モル比の１つまたは複数のマルチテールのイオン化可能なリン脂質と、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）と、コレステロールとをさらに含む、請求項１６から２１のいずれか１項に記載の組成物。
［請求項２８］
カーゴをさらに含む、請求項１６から２７のいずれか１項に記載の組成物。
［請求項２９］
前記カーゴが、医薬品有効成分、核酸、ｍＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＤＮＡ配列、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｓＤＮＡ、塩基エディター、ペプチド、タンパク質、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項２８に記載の組成物。
［請求項３０］
非経口投与、静脈内投与、経口投与、局所投与、またはこれらの任意の組合せ用に製剤化される、請求項１６から２９のいずれか１項に記載の組成物。
［請求項３１］
カーゴを搭載した脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を含む医薬組成物であって、
前記ＬＮＰが、
請求項１から１５のいずれか１項に記載のイオン化可能なリン脂質；または
１つもしくは複数のマルチテールのイオン化可能なリン脂質
を含み、前記１つまたは複数のマルチテールのイオン化可能なリン脂質がｐＨ切替可能な双性イオンおよび３つの疎水性尾部を含む、医薬組成物。
［請求項３２］
前記カーゴが前記ＬＮＰのコア内に配置されている、請求項１６から３１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
［請求項３３］
前記１つまたは複数のマルチテールのイオン化可能なリン脂質が、前記カーゴを実質的に封入するナノ粒子構造を形成する、請求項１６から３１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
［請求項３４］
前記カーゴが、医薬品有効成分、核酸、ｍＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＤＮＡ配列、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｓＤＮＡ、塩基エディター、ペプチド、タンパク質、ｃｉｒＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項１６から３３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
［請求項３５］
医薬品有効成分を対象に送達する方法であって、治療有効量の請求項１６から３４のいずれか１項に記載の医薬組成物を前記対象に投与するステップを含み、前記カーゴが医薬品有効成分である、方法。
［請求項３６］
対象における遺伝子編集用のｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ／ｓｇＲＮＡのインビボ送達の方法であって、治療有効量の請求項１６から３４のいずれか１項に記載の医薬組成物を前記対象に投与するステップを含む方法。
［請求項３７］
対象の脾臓、肝臓、および／または肺での選択的タンパク質発現を引き起こす方法であって、治療有効量の請求項１６から３４のいずれか１項に記載の医薬組成物を前記対象に投与するステップを含み、前記カーゴがｍＲＮＡである、方法。
［請求項３８］
対象における遺伝子送達、遺伝子編集、薬物送達、ｍＲＮＡ送達、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）遺伝子編集、塩基エディター遺伝子編集、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）遺伝子編集のために、請求項１３から３４のいずれか１項に記載の医薬組成物を前記対象に投与するステップを含む方法。
［請求項３９］
対象における組織特異的カーゴ送達の方法であって、治療有効量の請求項１６から３４のいずれか１項に記載の医薬組成物を前記対象に投与するステップを含む方法。
［請求項４０］
前記カーゴがｍＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、またはこれらの任意の組合せを含む、請求項３９に記載の方法。

Claims (28)

  1. 式（Ｉ）：
    （式中、
    Ｒ１は、Ｃ２～Ｃ１０非置換アルキルであり；
    Ｒ２ は、Ｈ、またはＣ４～Ｃ１２非置換アルキルであり；
    Ｒ３は、Ｃ４～Ｃ１２非置換アルキルであり；
    Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７は、それぞれ独立してＨであり；
    Ｒ８は、Ｃ３～Ｃ１５非置換アルキルであり；
    ｎは１の整数である）
    のイオン化可能な合成リン脂質。
  2. Ｒ１が、Ｃ２、Ｃ４、Ｃ６、Ｃ８、Ｃ９、またはＣ１０非置換アルキルからなる群から選択され；
    Ｒ３が、Ｃ４、Ｃ６、Ｃ８、Ｃ１０、Ｃ１１、またはＣ１２非置換アルキルであり；
    Ｒ ２ 、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７が、それぞれ独立してＨであり；
    Ｒ８がＣ３～Ｃ１８非置換アルキルから選択され；
    ｎが１の整数である、
    請求項１に記載のイオン化可能な合成リン脂質。
  3. Ｒ１がＣ６非置換アルキルであり；
    Ｒ３が、Ｃ８非置換アルキルであり；
    Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７が、それぞれ独立してＨであり；
    Ｒ８がＣ８非置換アルキルであり；
    ｎが１の整数である、
    請求項１に記載のイオン化可能な合成リン脂質。
  4. 式（ＩＩＩ）：
    （式中、
    Ｒ１は、Ｃ２～Ｃ１０非置換アルキルであり；
    Ｒ ３ は、Ｃ４～Ｃ１２非置換アルキルであり；
    Ｒ ２ 、Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立してＨであり；
    Ｒ６は、Ｃ３～Ｃ１５非置換アルキルであり；
    ｎは１の整数であり；
    ｍは１～４の整数である）
    のイオン化可能なリン脂質。
  5. Ｒ１が、Ｃ２、Ｃ４、Ｃ６、Ｃ８、Ｃ９、またはＣ１０非置換アルキルであり；
    Ｒ３が、Ｃ４、Ｃ６、Ｃ８、Ｃ１０、Ｃ１１、またはＣ１２非置換アルキルであり；
    Ｒ ２ 、Ｒ４およびＲ５が、それぞれ独立してＨであり；
    Ｒ ６ が、Ｃ３～Ｃ１５非置換アルキルであり；
    ｎが１の整数であり；
    ｍが１～３の整数である、
    請求項４に記載のイオン化可能なリン脂質。
  6. 請求項１に記載のイオン化可能な合成リン脂質を含む医薬組成物。
  7. ヘルパー脂質をさらに含む、請求項６に記載の組成物であって、前記ヘルパー脂質が、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、Ｎ－メチルジオクタデシルアミン（ＭＤＯＡ）、１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＤＡＰ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウム臭化物塩（ＤＤＡＢ）、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項６に記載の組成物。
  8. コレステロールまたはコレステロール誘導体をさらに含む、請求項６に記載の組成物。
  9. １，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシ（ポリ（エチレングリコール－２０００））（ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００）をさらに含む、請求項６に記載の組成物。
  10. ５５：３０：４５モル比の１つまたは複数のマルチテールのイオン化可能なリン脂質と、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）と、コレステロールとをさらに含み、前記１つまたは複数のマルチテールのイオン化可能なリン脂質が、第三級アミンと、リン酸基と、３つの疎水性尾部とを含む、請求項６に記載の組成物。
  11. ２５：３０：３０モル比の１つまたは複数のマルチテールのイオン化可能なリン脂質と、Ｎ－メチルジオクタデシルアミン（ＭＤＯＡ）と、コレステロールとをさらに含み、前記１つまたは複数のマルチテールのイオン化可能なリン脂質が、第三級アミンと、リン酸基と、３つの疎水性尾部とを含む、請求項６に記載の組成物。
  12. ２５：３０：３０モル比の１つまたは複数のマルチテールのイオン化可能なリン脂質と、１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＤＡＰ）と、コレステロールとをさらに含み、前記１つまたは複数のマルチテールのイオン化可能なリン脂質が、第三級アミンと、リン酸基と、３つの疎水性尾部とを含む、請求項６に記載の組成物。
  13. ２５：３０：３０モル比の１つまたは複数のマルチテールのイオン化可能なリン脂質と、５Ａ２－ＳＣ８と、コレステロールとをさらに含み、前記１つまたは複数のマルチテールのイオン化可能なリン脂質が、第三級アミンと、リン酸基と、３つの疎水性尾部とを含む、請求項６に記載の組成物。
  14. ６０：３０：４０モル比の１つまたは複数のマルチテールのイオン化可能なリン脂質と、ジメチルジオクタデシルアンモニウム臭化物塩（ＤＤＡＢ）と、コレステロールとをさらに含み、前記１つまたは複数のマルチテールのイオン化可能なリン脂質が、第三級アミンと、リン酸基と、３つの疎水性尾部とを含む、請求項６に記載の組成物。
  15. ６０：３０：４０モル比の１つまたは複数のマルチテールのイオン化可能なリン脂質と、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）と、コレステロールとをさらに含み、前記１つまたは複数のマルチテールのイオン化可能なリン脂質が、第三級アミンと、リン酸基と、３つの疎水性尾部とを含む、請求項６に記載の組成物。
  16. カーゴをさらに含む、請求項６に記載の組成物。
  17. 前記カーゴが、医薬品有効成分、核酸、ｍＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＤＮＡ配列、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｓＤＮＡ、塩基エディター、ペプチド、タンパク質、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項１６に記載の組成物。
  18. 非経口投与、静脈内投与、経口投与、局所投与、またはこれらの任意の組合せ用に製剤化される、請求項６に記載の組成物。
  19. カーゴを搭載した脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を含む医薬組成物であって、
    前記ＬＮＰが、
    請求項１に記載のイオン化可能なリン脂質；または
    １つまたは複数のマルチテールのイオン化可能なリン脂質
    を含み、前記１つまたは複数のマルチテールのイオン化可能なリン脂質が、第三級アミンと、リン酸基と、３つの疎水性尾部とを含む、医薬組成物。
  20. 前記カーゴが前記ＬＮＰのコア内に配置されている、請求項６に記載の医薬組成物。
  21. 前記１つまたは複数のマルチテールのイオン化可能なリン脂質が、前記カーゴを実質的に封入するナノ粒子構造を形成し、前記１つまたは複数のマルチテールのイオン化可能なリン脂質が、第三級アミンと、リン酸基と、３つの疎水性尾部とを含む、請求項６に記載の医薬組成物。
  22. 前記カーゴが、医薬品有効成分、核酸、ｍＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＤＮＡ配列、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｓＤＮＡ、塩基エディター、ペプチド、タンパク質、ｃｉｒＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項６に記載の医薬組成物。
  23. 医薬品有効成分の送達における使用のための医薬組成物であって、治療有効量の請求項６に記載の医薬組成物を含み、前記カーゴが医薬品有効成分である、医薬組成物。
  24. 遺伝子編集用のｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ／ｓｇＲＮＡのインビボ送達における使用のための医薬組成物であって、治療有効量の請求項６に記載の医薬組成物を含み、前記カーゴが医薬品有効成分である、医薬組成物。
  25. 対象の脾臓、肝臓、および／または肺での選択的タンパク質発現を引き起こす際の使用のための医薬組成物であって、治療有効量の請求項６に記載の医薬組成物を含み、前記カーゴがｍＲＮＡである、医薬組成物。
  26. 遺伝子送達、遺伝子編集、薬物送達、ｍＲＮＡ送達、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）遺伝子編集、塩基エディター遺伝子編集、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）遺伝子編集における使用のための医薬組成物であって、請求項６に記載の医薬組成物を含む医薬組成物。
  27. 対象における組織特異的カーゴ送達における使用のための医薬組成物であって、治療有効量の請求項６に記載の医薬組成物を含む医薬組成物。
  28. 前記カーゴがｍＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ＤＮＡ配列、またはこれらの任意の組合せを含む、請求項２７に記載の医薬組成物。
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