JP7846631B2 - 低ｐＨ保持によるウイルスクリアランス - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年５月１１日に出願された米国仮特許出願第６３／０２３，１５４号の優先権及び利益を主張し、これは参照により本明細書に組み込まれる。

本発明は、概して、低ｐＨ保持ステップを使用して、タンパク質試料におけるウイルス粒子を不活性化するための方法に関する。いくつかの因子を組み込んだ統計的実験計画法を使用して、ウイルス不活性化のための低ｐＨ保持ステップの影響を評価し、特徴付ける。

背景
生物学的製品は、細菌、真菌、及びウイルスからの汚染（内因性汚染物質及び外因性（外部供給源からの）汚染物質の両方）を受けやすい。ウイルスクリアランス、例えば、ウイルス不活性化は、哺乳動物細胞株を使用して作製されるバイオ医薬製品の製造中の重要なステップである。ウイルス汚染が哺乳動物細胞培養の増殖中に増幅され得るため、世界的な保健当局は、生物学的製品又はバイオテクノロジー製品を製造するためにウイルスクリアランスの評価を必要とする。効果的なウイルスクリアランス研究は、工程検証の重要な部分であり、薬物安全性を保証するためにも重要である。ウイルス汚染はまた、原材料、細胞培養工程、バイオリアクター、及び下流精製工程にも影響を及ぼし得る。

ウイルス検証研究は、ウイルス安全性を保証するために製品品質に関する選択された操作条件を記録するように計画されている。ウイルスクリアランス研究の実験計画は、処理条件の理解を改善し、最悪の場合の条件の選択を正当化するための重要な開発因子を特定する製造工程の特徴付けを含む。ウイルス不活性化又は除去の工程は、ｐＨ処理、熱処理、溶媒／洗剤処理、ろ過、又はクロマトグラフィーを含む。低ｐＨインキュベーションについてのウイルス不活性化の機序は、ウイルスの表面糖タンパク質の不可逆的変性又は脂質エンベロープの崩壊を引き起こすｐＨベースの化学反応を含む。

バイオ医薬製品の製造工程に適合されたｐＨ条件は、ウイルス不活性化には有効ではない場合がある。しかしながら、ウイルス不活性化に必要なｐＨは、他の製造条件において使用されるｐＨ範囲とは顕著に異なる可能性がある。タンパク質試料における効果的なウイルス不活性化を得るために低ｐＨインキュベーションを使用することは、バイオ医薬製品の低ｐＨ曝露がタンパク質の品質又は安定性を変化させる可能性があるため、バイオ医薬製品の製造の場合は困難である。バイオ医薬製品の製造中に、ウイルス不活性化のための低ｐＨ保持ステップの影響を評価し、特徴付けるための方法についての必要性が存在することが理解されるであろう。これらの方法は、精製工程などの製造工程の計画について、ウイルス不活性化を保証するための効果的で堅牢な実験計画を提供する必要がある。

概要
本出願は、ウイルス不活性化のための低ｐＨ保持ステップの影響を評価し、特徴付けるためのいくつかの因子を組み込んだ統計的実験計画法に基づいて、低ｐＨ保持を使用するウイルスクリアランスのための方法を提供する。統計的に計画された実験は、ウイルス不活性化に対するｐＨ条件、イオン強度条件、タンパク質アイソタイプ、温度、酸滴定剤、スパイクタイミング、及びスパイク後ろ過の効果を評価するために使用される。これらの方法を使用して、例えば、低ｐＨ出発材料のイオン強度を操作することによって、ウイルス不活性化ステップが約ｐＨ３．６０～３．９０の範囲で実施される場合の有効クリアランスを予測し得る。

本開示は、ウイルス粒子を含む１つ以上の不純物を含む試料から、抗体などのペプチド又はタンパク質を精製するための方法を提供する。いくつかの例示的な実施形態では、本出願の方法は、試料のイオン強度条件を調整することと、試料のｐＨ条件を酸性ｐＨに調整することと、その後、試料を、そのイオン強度条件及びそのｐＨ条件で少なくとも約１５分間維持して、ある量のウイルス粒子を不活性化することと、を含み、試料は、ウイルス粒子を含む１つ以上の不純物を含む。一態様では、ウイルス粒子不活性化の量は、本出願の方法を使用する場合、少なくとも約３ＬＲＦ（対数減少率）である。一態様では、ウイルス粒子不活性化の量は、本出願の方法を使用する場合、少なくとも約４ＬＲＦである。

一態様では、本出願の方法における試料のｐＨ条件は、約ｐＨ３．９０以下である。一態様では、試料のｐＨ条件は、約ｐＨ３．６０～約ｐＨ３．９０の範囲にある。別の態様では、試料のｐＨ条件は、約ｐＨ３．６５～約ｐＨ３．８０の範囲にある。別の態様では、試料におけるペプチド又はタンパク質は、宿主細胞において作製された抗体である。更に別の態様では、本出願の方法における試料は、その量のウイルス粒子を不活性化するために、少なくとも約３０分間、試料のイオン強度条件及びｐＨ条件で維持される。一態様では、試料は、その量のウイルス粒子を不活性化するために、約１５分間～約３０分間、試料のイオン強度条件及びｐＨ条件に維持される。

一態様では、本出願の方法は、Ｄ－最適実験計画法を実行することによってその量のウイルス粒子の不活性化を最適化することを更に含む。別の態様では、Ｄ－最適実験計画法は、以下の因子、試料のｐＨ条件、及び試料に添加された塩濃度を評価する。一態様では、Ｄ－最適実験計画法は、以下の因子、ペプチド又はタンパク質の種類、試料の温度、試料のｐＨ条件を調整するための酸滴定剤、ウイルス粒子を試料にスパイクするためのスパイクタイミング、又はスパイク後ろ過の存在を更に評価する。

一態様では、本出願の方法における試料は、プロテインＡクロマトグラフィーからの溶出液である。別の態様では、試料のイオン強度は、塩化ナトリウムの添加を使用して調整され、塩化ナトリウムの濃度は、約１ｍＭ～約１００ｍＭ、約１ｍＭ～約５００ｍＭ、約２５ｍＭ、約５０ｍＭ、約７２ｍＭ、約８２ｍＭ、約１００ｍＭ、約１２５ｍＭ、約１５０ｍＭ、約１７５ｍＭ、又は約２００ｍＭの範囲にある。一態様では、試料のｐＨ条件は、リン酸又はグリシンＨＣｌを使用して調整される。別の態様では、本方法の試料におけるペプチド又はタンパク質は、ＩｇＧ１アイソタイプを有するか又はＩｇＧ４アイソタイプを有する抗体である。一態様では、ペプチド又はタンパク質は、モノクローナル抗体又は二重特異性抗体である。更に別の態様では、ペプチド又はタンパク質は、抗体、抗体断片、抗体のＦａｂ領域、抗体－薬物コンジュゲート、融合タンパク質、タンパク質医薬製品、又は薬物である。

本開示は、目的のタンパク質及び感染性ウイルス粒子を有する試料から目的のタンパク質及び減少した量のウイルス粒子を含む調製物を作製する方法を提供する。いくつかの例示的な実施形態では、目的のタンパク質及び感染性ウイルス粒子を有する試料から目的のタンパク質及び減少した量のウイルス粒子を含む調製物を作製する方法は、最大約１００ｍＭの濃度を有する塩の添加によって、試料を、約ｐＨ３．６０超のｐＨ及びイオン強度条件に供することと、目的のタンパク質及び減少した量の感染性ウイルス粒子を含む調製物を作製するために適切な期間、試料をそのｐＨ及びイオン強度条件で維持することと、を含む。

一態様では、試料における目的のタンパク質の濃度は、約２５ｇ／Ｌ未満である。

一態様では、適切な期間は、約１５分、約２０分、約２５分、又は約３０分である。

一態様では、本方法は、試料から感染性ウイルス粒子の量を約３ＬＲＦ（対数減少率）で減少させる。別の態様では、本方法は、試料から感染性ウイルス粒子の量を約４ＬＲＦで減少させる。

一態様では、試料のｐＨ条件は、約ｐＨ３．７０超である。別の態様では、試料のｐＨ条件は、約ｐＨ３．８０超である。更に別の態様では、試料のｐＨ条件は、約ｐＨ３．９０超である。更に別の態様では、試料のｐＨ条件は、約ｐＨ４．０超である。

一態様では、試料のｐＨ条件は、約ｐＨ３．６０～約ｐＨ４．０の範囲にある。別の態様では、試料のｐＨ条件は、約ｐＨ３．７０～約ｐＨ４．０の範囲にある。更に別の態様では、試料のｐＨ条件は、約ｐＨ３．８０～約ｐＨ４．０の範囲にある。

「試料」の例示的な供給源としては、プロテインＡ溶出液などの親和性クロマトグラフィーが挙げられ得、試料は、イオン交換クロマトグラフィー手順のフロースルー画分から得られ得、イオン交換カラムのストリップからも得られ得、試料が得られ得る当業者に周知の精製工程中の他の供給源がある。この実施形態の一態様では、試料は、プロテインＡクロマトグラフィーからの溶出液である。

一態様では、試料のイオン強度は、塩化ナトリウムの添加を使用して調整され、塩化ナトリウムの濃度は、約１ｍＭ～約２００ｍＭの範囲にある。

一態様では、イオン強度条件は、約５０ｍＭ超の濃度の塩化ナトリウムを使用することによって調整される。本実施形態の別の態様では、濃度は、約１００ｍＭ超である。

一態様では、試料のｐＨ条件は、リン酸又はグリシンＨＣｌを使用して調整される。

[本発明１００１]
試料からペプチド又はタンパク質を精製するための方法であって、
前記方法が、
前記試料を、塩の添加によってイオン強度を増加させることに供することと、
前記試料を、酸性ｐＨに供することと、
続いて、前記試料を、前記イオン強度条件及び前記ｐＨ条件で少なくとも約１５分間維持して、ある量のウイルス粒子を不活性化することと
を含み、
前記試料が、前記ウイルス粒子を含む１つ以上の不純物を含む、方法。
[本発明１００２]
前記ウイルス粒子不活性化の量が、少なくとも約３ＬＲＦ（対数減少率）である、本発明１００１の方法。
[本発明１００３]
前記ウイルス粒子不活性化の量が、少なくとも約４ＬＲＦである、本発明１００１の方法。
[本発明１００４]
前記試料の前記ｐＨ条件が、約ｐＨ３．９０以下である、本発明１００１の方法。
[本発明１００５]
前記試料の前記ｐＨ条件が、約ｐＨ３．６０～約ｐＨ３．９０の範囲にある、本発明１００１の方法。
[本発明１００６]
前記試料の前記ｐＨ条件が、約ｐＨ３．６５～約ｐＨ３．８０の範囲にある、本発明１００１の方法。
[本発明１００７]
前記ペプチド又はタンパク質が、宿主細胞において作製された抗体である、本発明１００１の方法。
[本発明１００８]
前記試料が、前記量の感染性ウイルス粒子を不活性化するために、少なくとも約３０分間、前記イオン強度条件及び前記ｐＨ条件に維持される、本発明１００１の方法。
[本発明１００９]
前記試料が、前記量の感染性ウイルス粒子を不活性化するために、約１５分間～約３０分間、前記イオン強度条件及び前記ｐＨ条件に維持される、本発明１００１の方法。
[本発明１０１０]
Ｄ－最適実験計画法を実行することによって、前記量の感染性ウイルス粒子の不活性化のために前記試料の前記イオン強度及び前記ｐＨ条件を最適化すること
を更に含む、本発明１００１の方法。
[本発明１０１１]
前記Ｄ－最適実験計画法が、前記試料の前記ｐＨ条件及び前記試料の前記イオン強度を評価し、かつ前記試料の前記ｐＨ条件及び前記試料の前記イオン強度を調整して、ある量の感染性ウイルス粒子を不活性化する、本発明１０１０の方法。
[本発明１０１２]
前記Ｄ－最適実験計画法が、
前記試料の導電率、
前記ペプチド若しくはタンパク質の種類、
前記試料の温度、
前記試料の前記ｐＨ条件を調整するための酸滴定剤、
前記ウイルス粒子を前記試料にスパイクするための方法、又は
スパイク後ろ過の存在
のうちの１つ以上を、更に評価及び調整する、本発明１０１１の方法。
[本発明１０１３]
前記試料が、プロテインＡクロマトグラフィーからの溶出液である、本発明１００１の方法。
[本発明１０１４]
前記試料の前記イオン強度が、塩化ナトリウムの添加を使用して調整され、
前記塩化ナトリウムの濃度が、約１ｍＭ～約１００ｍＭの範囲にある、
本発明１００１の方法。
[本発明１０１５]
前記塩化ナトリウムの前記濃度が、約１ｍＭ～約５００ｍＭの範囲にある、本発明１００１の方法。
[本発明１０１６]
前記塩化ナトリウムの前記濃度が、約２５ｍＭ、約５０ｍＭ、又は約１００ｍＭである、本発明１００１の方法。
[本発明１０１７]
前記試料の前記ｐＨ条件が、リン酸又はグリシンＨＣｌを使用して調整される、本発明１００１の方法。
[本発明１０１８]
前記ペプチド又はタンパク質が、ＩｇＧ１アイソタイプを有するか又はＩｇＧ４アイソタイプを有する抗体である、本発明１００１の方法。
[本発明１０１９]
前記ペプチド又はタンパク質が、モノクローナル抗体又は二重特異性抗体である、本発明１００１の方法。
[本発明１０２０]
前記ペプチド又はタンパク質が、抗体、抗体断片、抗体のＦａｂ領域、抗体－薬物コンジュゲート、融合タンパク質、タンパク質医薬製品、又は薬物である、本発明１００１の方法。
[本発明１０２１]
目的のタンパク質及び感染性ウイルス粒子を有する試料から、前記目的のタンパク質及び減少した量のウイルス粒子を含む調製物を作製する方法であって、
前記試料を、約３．６超のｐＨに供することと、
前記試料を、出発溶液への塩の添加によって、イオン強度条件の増加に供することと、
前記試料を、前記ｐＨ及びイオン強度条件で適切な期間維持して、前記目的のタンパク質及び前記減少した量の感染性ウイルス粒子を含む前記調製物を作製することと
を含む、方法。
[本発明１０２２]
前記試料における前記目的のタンパク質の濃度が、約２５ｇ／Ｌ超である、本発明１０２１の方法。
[本発明１０２２]
前記適切な期間が、約１５分、約２０分、約２５分、又は約３０分である、本発明１０２１の方法。
[本発明１０２３]
試料から感染性ウイルス粒子の前記量を約３ＬＲＦ（対数減少率）で減少させる、本発明１０２１の方法。
[本発明１０２４]
試料から感染性ウイルス粒子の前記量を約４ＬＲＦ（対数減少率）で減少させる、本発明１０２１の方法。
[本発明１０２５]
前記試料の前記ｐＨ条件が、約ｐＨ３．７０、約３．８０、約ｐＨ３．９０又は約ｐＨ４．０を超える、本発明１０２１の方法。
[本発明１０２６]
前記試料の前記ｐＨ条件が、約ｐＨ３．６０～約ｐＨ４．０の範囲にある、本発明１０２１の方法。
[本発明１０２７]
前記試料が、プロテインＡクロマトグラフィーからの溶出液である、本発明１０２１の方法。
[本発明１０２８]
前記試料の前記イオン強度が、塩化ナトリウムの添加を使用して調整され、
前記塩化ナトリウムの濃度が、約１ｍＭ～約２００ｍＭの範囲にある、
本発明１０２１の方法。
[本発明１０２９]
前記塩の濃度が、約５０ｍＭ又は約１００ｍＭを超える、本発明１０２１の方法。
[本発明１０３０]
前記試料の前記ｐＨ条件が、リン酸又はグリシンＨＣｌを使用して調整される、本発明１０２１の方法。
本発明のこれら及び他の態様は、以下の説明及び添付の図面と併せて考慮される場合、よりよく認識され、理解されるであろう。以下の説明は、その様々な実施形態及び多数の具体的な詳細を示すが、限定ではなく、例証として与えられる。多くの置換、修正、追加、又は再配置は、本発明の範囲内で行われ得る。

調整スパイク再調整方法を示し、例示的な実施形態に従って、試料を標的ｐＨに調整／滴定し、次いで、約ｐＨ７．２においてウイルスストックでスパイクし、続いて試料のｐＨを標的ｐＨに再調整した後、ｐＨ保持の残りの期間、所望の温度で保持する。タイミングは、スパイク時に開始する。 スパイク調整方法を示し、例示的な実施形態に従って、最初に試料をウイルスストック溶液でスパイクし、次いで標的ｐＨに調整／滴定する。タイミングは、試料の標的ｐＨに到達した時に開始する。 例示的な実施形態に従って、ウイルス不活性化のための低ｐＨ保持ステップと関連するいくつかの因子の効果を調査するためのＤ－最適モデル計画の散布図マトリックス及び多変量相関を示す。 各モノクローナル抗体塩状態について実施された中性対照を示す。この対照の目的は、例示的な実施形態に従って、測定されたウイルス活性が、低ｐＨでの化学的不活性化の結果であることを保証することである。 例示的な実施形態に従って、標的ｐＨ３．６５でのＸ－ＭｕＬＶの不活性化動態を示す。例示的な実施形態に従って、時点に対してＬＲＦ値をプロットすることによって標的ｐＨ３．６５でのＬＲＦ曲線を得た。 例示的な実施形態に従って、標的ｐＨ３．７３でのＸ－ＭｕＬＶの不活性化動態を示す。例示的な実施形態に従って、時点に対してＬＲＦ値をプロットすることによって標的ｐＨ３．７３でのＬＲＦ曲線を得た。 例示的な実施形態に従って、標的ｐＨ３．８０でのＸ－ＭｕＬＶの不活性化動態を示す。例示的な実施形態に従って、時点に対してＬＲＦ値をプロットすることによって標的ｐＨ３．８０でのＬＲＦ曲線を得た。 例示的な実施形態に従って、種々の標的ｐＨ条件、例えば、約ｐＨ３．６５、ｐＨ３．７３、又はｐＨ３．８０での、０ｍＭのＮａＣｌでのＸ－ＭｕＬＶの不活性化動態を示す。例示的な実施形態に従って、種々の標的ｐＨ条件について、時点に対してＬＲＦ値をプロットすることによってＬＲＦ曲線を得た。 例示的な実施形態に従って、種々の標的ｐＨ条件、例えば、約ｐＨ３．６５、ｐＨ３．７３、又はｐＨ３．８０での、５０ｍＭのＮａＣｌでのＸ－ＭｕＬＶの不活性化動態を示す。例示的な実施形態に従って、種々の標的ｐＨ条件について、時点に対してＬＲＦ値をプロットすることによってＬＲＦ曲線を得た。 例示的な実施形態に従って、種々の標的ｐＨ条件、例えば、約ｐＨ３．６５、ｐＨ３．７３、又はｐＨ３．８０での、１００ｍＭのＮａＣｌでのＸ－ＭｕＬＶの不活性化動態を示す。例示的な実施形態に従って、種々の標的ｐＨ条件について、時点に対してＬＲＦ値をプロットすることによってＬＲＦ曲線を得た。 例示的な実施形態に従って、約ｐＨ３．７０～３．７５で約２５ｍＭのＮａＣｌを含有する操作条件を評価するためのパラメータ推定値を含む予測されたプロファイラを示す。 例示的な実施形態に従って、約ｐＨ３．７０～３．７５で約５０ｍＭのＮａＣｌを含有する操作条件を評価するためのパラメータ推定値を含む予測されたプロファイラを示す。 例示的な実施形態に従って、約ｐＨ３．７０～３．７５で約８０ｍＭのＮａＣｌを含有する操作条件を評価するためのパラメータ推定値を含む予測されたプロファイラを示す。スパイク後ろ過の効果サイズは最小限であり、全体的な予測プロファイラに含まれなかった。 例示的な実施形態に従って、１５分の時点についてのＬＲＦについての多変量線形回帰モデルの実際の値対予測値を示す。 例示的な実施形態に従って、３０分の時点についてのＬＲＦについての多変量線形回帰モデルの実際の値対予測値を示す。 例示的な実施形態に従って、１５及び３０分の時点の両方の後に４ＬＲＦ超を達成するようにモデルを最適化するために作成された予測プロファイラを示す。例示的な実施形態に従って、予測プロファイラは、Ｄ－最適ＤｏＥで評価された顕著な因子の関数としてＸ－ＭｕＬＶ不活性化を表した。 例示的な実施形態に従って、低ｐＨ保持について、約ｐＨ３．７０～３．７５でのいくつかの既存の操作条件についてのパラメータ推定値を含む予測されたプロファイラを示す。スパイク後ろ過の効果サイズは最小限であり、全体的な予測プロファイラに含まれなかった。 例示的な実施形態に従って、低ｐＨ保持について、約ｐＨ３．６５～３．７０に再計画された操作条件についてのパラメータ推定値を含む予測されたプロファイラを示す。スパイク後ろ過の効果サイズは最小限であり、全体的な予測プロファイラに含まれなかった。 例示的な実施形態に従って、遡及的データに基づいたＩｇＧ１及びＩｇＧ２を含むタンパク質の種類についてのＮａＣｌ、ｐＨ、酸滴定剤、温度、タンパク質の種類（ｍＡｂ、モノクローナル抗体）、スパイクタイミング及びそれらの組み合わせ、並びに３０分の時点でのＸ－ＭｕＬＶのＬＲＦを含む評価された因子についての効果サイズを示す。 例示的な実施形態に従って、遡及的産業データに基づいた種々の温度条件についてのＮａＣｌ、ｐＨ、酸滴定剤、温度、タンパク質の種類（ｍＡｂ、モノクローナル抗体）、スパイクタイミング及びそれらの組み合わせ、並びにレトロウイルスのＬＲＦを含む評価された因子についての効果サイズを示す。 例示的な実施形態に従って、２つの方法についてのＮａＣｌ、ｐＨ、酸滴定剤、温度、タンパク質の種類（ｍＡｂ、モノクローナル抗体）、スパイクタイミング及びそれらの組み合わせ、並びにスパイク／調整の時間を含む評価された因子についての効果サイズを示す。

詳細な説明
ウイルスクリアランスは、バイオ医薬製品、特にチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳動物細胞株を使用して作製されるバイオ医薬製品を製造するために重要である。精製工程を計画する場合、ウイルスクリアランスを保証することが重要である。製造工程のウイルスクリアランスを研究するための典型的なワークフローは、試料負荷をウイルスでスパイクすることと、大スケールのステップを模倣するスケールダウン実験で工程を実行することと、スパイクされたウイルスを除去する能力を記録することと、を含む。ウイルス不活性化又は除去の工程は、ｐＨ処理、熱処理、溶媒／洗剤処理、ろ過、又はクロマトグラフィーを含む。ウイルスクリアランスの評価には、ＣＨＯ細胞のゲノムに固有のレトロウイルス様粒子についての特定のモデルウイルスの除去を実証することを含む必要がある（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｏｒｉｇｉｎ ｏｆ ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ－ｌｉｋｅ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｒｏｍ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８１（１）：３０５－３１１，１９９１）。レトロウイルスは、宿主細胞において逆転写酵素を使用して増殖し、そのＲＮＡゲノムからＤＮＡを作製するエンベロープＲＮＡウイルスである。次いで、作製されたＤＮＡは、複製のために宿主のゲノムに組み込まれる。異種指向性マウス白血病ウイルス（Ｘ－ＭｕＬＶ）は、ＣＨＯ細胞由来の医薬タンパク質におけるウイルス不活性化の評価においてモデルウイルスとして使用され得る。マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）は、レトロウイルスであり、逆転写を介して複製するプラス一本鎖センスＲＮＡを有する。ＭｕＬＶは、接種されたマウスにおいて白血病を誘発し得る。

ウイルス減少又はウイルスクリアランスとは、クロマトグラフィー工程などの、特定の工程ステップを実施した後の、入力試料及び出力試料間における総ウイルス量又は感染性ウイルス量の差を指す。ウイルス減少能力は、工程ステップの対数減少値（ＬＲＶ）又は対数（ｌｏｇ_１０）減少率（ＬＲＦ）として定義され得る。減少率は、クリアランスステップを適用する前の総ウイルス負荷及びクリアランスステップを適用した後の総ウイルス量に基づいて計算される。ウイルス検証研究は、製品と関連する既知のウイルスのクリアランスを記録するため、及び非特異的モデルウイルスを除去する工程の能力を特徴付けることによって潜在的な迷入ウイルス汚染物質を除去する工程の有効性を推定するために実施することができる。

本出願は、タンパク質アイソタイプ、ｐＨ条件、温度、酸滴定剤、イオン強度条件、スパイクタイミング、又はスパイク後ろ過などのいくつかの因子の評価を含む、ウイルス不活性化のための低ｐＨ保持ステップの効果を評価し、特徴付けるために使用され得る統計的に計画された実験を提供する。これらの方法を使用して、低ｐＨ出発材料の導電率を増加させることによってイオン強度を操作することによって、ウイルス不活性化ステップが約ｐＨ３．６０～３．９０の範囲で実施される場合の有効クリアランスを予測し得る。実験から生成されたモデルを使用して、約１５分及び約３０分の時点などの種々の時点での工程条件の範囲にわたって、Ｘ－ＭｕＬＶなどのウイルスのクリアランスを予測し得る。いくつかの例示的な実施形態では、ウイルス不活性化に対するｐＨ条件の効果に加えて、出発溶液の導電率を増加させることにより、ウイルス不活性化を増加させ得る。例えば、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）濃度の増加は、より大きなウイルス不活性化を達成するためにウイルス不活性化動態に影響を及ぼす重要な構成要素であり得る。一態様では、本出願は、Ｘ－ＭｕＬＶの不活性化のための約４ＬＲＦ超などのウイルスの堅牢で効果的な不活性化の利点を提供し、これは、低ｐＨ出発材料のイオン強度の増加を介して達成され得る。

ＩＣＨ Ｑ５Ａ（Ｒ１）（ヒト又は動物起源の細胞株に由来するバイオテクノロジー製品のウイルス安全性評価。Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｈａｒｍｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｕｓｅ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｓｔｅｐ ４ ｖｅｒｓｉｏｎ，Ｓｅｐ ２３，１９９９）に従って、バイオ医薬製品の下流精製工程は、内因性又は外来性ウイルス汚染物質の除去及び／又は不活性化を保証するように開発される。典型的な下流精製工程は、エンベロープウイルスを不活性化するための１つの専用のステップを含む、いくつかの直交ウイルス除去ステップを組み込むことができる。低ｐＨインキュベーションは、カプシドの不可逆的変性などのエンベロープウイルスを不活性化するために使用され得る（Ｂｒｏｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒａｃｋｅｔｅｄ ｇｅｎｅｒｉｃ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｏｄｅｎｔ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ｂｙ ｌｏｗ ｐＨ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｆｏｒ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ８２（３）：３２１－３２９，２００３）。ろ過は、エンベロープ及び非エンベロープウイルスの両方を除去するために使用され得るサイズベースの除去である（Ｌｕｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｇｅ ｐａｓｓａｇｅ ａｆｔｅｒ ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｉｎ ｓｍａｌｌ－ｖｉｒｕｓ－ｒｅｔｅｎｔｉｖｅ ｆｉｌｔｅｒｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ａｐｐｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ４７（Ｐｔ ３）：１４１－１５１，２００７）。クロマトグラフィーステップは、プロテインＡクロマトグラフィー（Ｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｅａｒａｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｒｏｄｅｎｔ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ，ＸＭｕＬＶ，ｂｙ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ １１２（４）：７４３７５０，２０１５）又はアニオン交換クロマトグラフィー（Ｓｔｒａｕｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ａ ｒｏｂｕｓｔ，ｐｒｅｄｉｃｔａｂｌｅ ｐｒｏｃｅｓｓ ｔｏ ｅｎｓｕｒｅ ｖｉｒａｌ ｓａｆｅｔｙ ｏｆ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ １０２（１）：１６８－１７５，２００９ａ）の使用などウイルスクリアランスのためのウイルス減少を提供する可能性を伴って生物製剤を精製するために使用され得る。

低ｐＨウイルス不活性化は、一般的に、モノクローナル抗体などのバイオ医薬製品の精製中にウイルスを不活性化するためのプロテインＡ捕捉ステップの後に実行される。プロテインＡクロマトグラフィーから溶出した製品は、典型的には、低ｐＨであり、これは更に酸性化され、ウイルス不活性化のために少なくとも３０分間保持される。ウイルス不活性化の機序は、主に、ウイルスの表面糖タンパク質の不可逆的変性又は脂質エンベロープの崩壊を引き起こすｐＨベースの化学反応を介している（Ｂｒｏｒｓｏｎら、上記）。ｐＨ保持が完了すると、製品は中和され、更に下流処理に進む。低ｐＨステップは、４ＬＲＦの大型エンベロープウイルスを確実に作製することが観察されている（Ｍｉｅｓｅｇａｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｖｉｒａｌ ｃｌｅａｒａｎｃｅ ｕｎｉｔ ｏｐｅｒａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｂｉｏｅｎｇ．２０１９；１０６：２３８－２４６）。以前の研究は、イオン強度がＸ－ＭｕＬＶの不活性化動態に影響を及ぼす可能性があることを示している。より高い緩衝液濃度又は弱酸の滴定を伴うより高いタンパク質濃度などのイオン強度の増加を有する実験条件は、ｐＨ３．７及び３．８でより高いＬＲＶと相関し得る（Ｃｈｉｎｎｉａｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｐｅｒａｔｉｎｇ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｆｏｒ ＸＭｕＬＶ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｙ ｌｏｗ ｐＨ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ，２０１６．Ｊａｎ－Ｆｅｂ３２，（１），８９－９７，ｄｏｉ：１０．１００２／ｂｔｐｒ．２１８３．Ｅｐｕｂ ２０１５ Ｎｏｖ ５）。

低ｐＨ保持によるウイルスクリアランスを理解するための研究が行われている。これらの研究は、ｐＨ、時間、及び温度によって影響が及ぼされるｐＨベースの化学反応を支持する（Ｂｒｏｒｓｏｎら）。不活性化ステップは堅牢であるため、Ｂｒｏｒｓｏｎらは、Ｘ－ＭｕＬＶの４．６ｌｏｇ_１０以上のクリアランスを一貫して達成するために、ｐＨ３．８以下のｐＨ条件及び１４℃以上の温度で少なくとも３０分間保持して低ｐＨ不活性化が実施される「ひとまとめにした包括的クリアランス」を開発している。ＡＳＴＭ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｔｅｓｔｉｎｇ ａｎｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ）は、ＡＳＴＭ Ｅ２８８８－１２によると、５．０ＬＲＦ以上を達成するために、低ｐＨ保持をｐＨ３．６以下に、及び１５℃以上の温度に、操作スペースを更に減少させた（ＡＳＴＭ．Ｅ２８８８－１２：Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｆｏｒ Ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｏｄｅｎｔ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ｂｙ ｐＨ．Ｗｅｓｔ Ｃｏｎｓｈｏｈｏｃｋｅｎ，ＰＡ：ＡＳＴＭ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；２０１２．ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｓｔｍ．ｏｒｇ）。更に、ＡＳＴＭ Ｅ２８８８－１２によれば、保持時間は３０分以上である。

時間の経過と共に、より大きなＬＲＦを達成するために、保持のｐＨを減少させるようにガイダンスが改訂された。ＡＳＴＭ Ｅ２８８８－１２によって提供される包括的クリアランスを要求するために、目的のタンパク質は、その文書が定義する包括的な型に適合させる必要がある。低ｐＨへのタンパク質の曝露は、タンパク質の質又は安定性を変化させる可能性があるため、効果的なウイルス不活性化は、モノクローナル抗体などのバイオ医薬製品については特に困難であり得る。保健当局は、最悪の場合の条件下で低ｐＨ保持が検証されることを期待している。それは、レトロウイルス不活性化が、実際の製造範囲を超えるｐＨ条件で決定されることを示す。不活性化ステップがこれらの外側で操作されると、ウイルスクリアランスが損なわれる可能性がある。

いくつかの例示的な実施形態では、本出願は、統計的に計画された実験、例えば、種々の時点で、タンパク質の種類、ｐＨ条件、温度、酸滴定剤、ＮａＣｌ含有量、スパイクタイミング、又はスパイク後ろ過がウイルス不活性化に対して及ぼす影響を決定するための、低ｐＨ不活性化ステップに関連する制御された及び制御されていない因子を含む、実験計画を提供する。いくつかの態様では、本出願は、信頼性の高い効果的なウイルスクリアランスのための操作条件を定義するための実験因子及び条件を提供する。いくつかの態様では、Ｘ－ＭｕＬＶは、モデル内因性エンベロープウイルスとして選択される。いくつかの態様では、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４などの２つの種類のモノクローナル抗体は、ｐＨ、温度、酸滴定剤、イオン強度、スパイクタイミング、又はスパイク後ろ過などの様々なパラメータを試験することに供される。

多変量解析のための本出願の実験計画、例えば、実験計画法、つまりＤｏＥは、低ｐＨ保持でのウイルス不活性化の特徴付けを含む。ＤｏＥは、１つの実験設計の文脈内で複数の開発因子の系統的変動を可能にする方法論である。ＤｏＥの結果は、検討されている工程の数理モデルを作成するために使用することができる。検討された工程の真の最適条件は、これらの数理モデルを適用することによって特定することができる。ＤｏＥ結果の適用は、非実質的な開発因子を排除すること、更なる研究のために重要な開発因子を特定すること、及び実験された工程の性能を予測することを含む。ＤｏＥは、目的を述べること、可変因子及びモデルを選択すること、モデルを支持する実験計画を作成すること、計画に基づくデータを収集すること、解析を実行すること、又はモデルをチェックポイントで検証すること、及び結果を報告することを含む、系統的論理フローで実施される。ＤｏＥ及び得られるモデルの結果は、ウイルスクリアランスのための低ｐＨ保持の機序の既存の理解を確認するか、拒否するか、又は改変するために使用され得る。

いくつかの例示的な実施形態では、本出願は、潜在的な感染性ウイルス粒子を含む１つ以上の不純物を含む試料から抗体を精製するための方法を提供し、本出願の方法は、試料のイオン強度条件を調整することと、試料のｐＨ条件を酸性ｐＨに調整することと、その後、試料を、そのイオン強度条件及びそのｐＨ条件で少なくとも約１５分間維持して、ある量のウイルス粒子を不活性化することと、を含む。一態様では、その量のウイルス粒子を不活性化するための本出願の方法の能力は、少なくとも約３ＬＲＦである。一態様では、その量のウイルス粒子を不活性化するための本出願の方法の能力は、少なくとも約４ＬＲＦである。一態様では、試料におけるペプチド又はタンパク質は、宿主細胞において作製された抗体である。一態様では、抗体は、モノクローナル抗体又は二重特異性抗体である。一態様では、本出願の方法における抗体は、プロテインＡクロマトグラフィーからの溶出液である。

一態様では、本出願の方法における試料のｐＨ条件は、約ｐＨ３．９０以下である。一態様では、試料のｐＨ条件は、約ｐＨ３．６０～約ｐＨ３．９０の範囲にある。一態様では、試料のｐＨ条件は、約ｐＨ３．６５～約ｐＨ３．８０の範囲にある。いくつかの態様では、本出願の統計的に計画された実験におけるｐＨ条件は、約ｐＨ３．６５、約ｐＨ３．７３、又は約ｐＨ３．８０などの約ｐＨ３．６５～約ｐＨ３．８０の範囲にあり、これは、製造工程のｐＨ範囲以上である。ｐＨ３．６５～３．８０のｐＨ範囲は、ＡＳＴＭ Ｅ２８８８－１２によって示唆されるｐＨ範囲よりも大きく、外側にあり、例えば、ｐＨ３．６以下である。より低いｐＨ条件は、ウイルスの不活性化をより速く引き起こし得ることが知られている（Ｂｒｏｒｓｏｎら）。いくつかの態様では、本出願の統計的に計画された実験における温度は、約１５℃又は約２０℃などの、約１５℃～約２０℃の範囲にあり、これは、製造工程の温度範囲の下端にあるか、又はそれ未満である。より高い温度は、不活性化をより速く引き起こし得ることが知られている（Ｂｒｏｒｓｏｎら）。約１５℃～約２０℃の温度範囲は、ＡＳＴＭ Ｅ２８８８－１２によって示唆される温度範囲内、例えば、１５℃以上である。いくつかの態様では、本出願の統計的に計画された実験における酸滴定剤は、約０．２５Ｍのリン酸又は約０．２５ＭのグリシンＨＣｌである。いくつかの態様では、本出願の統計的に計画された実験において出発材料に添加されるＮａＣｌ含有量は、約０ｍＭ～約１００ｍＭの濃度範囲にある。

いくつかの態様では、本出願の方法は、試料のｐＨ条件、試料の導電率、ペプチド又はタンパク質の種類、試料の温度、試料のｐＨ条件を調整するための酸滴定剤、試料にウイルス粒子をスパイクするためのスパイクタイミング、又はスパイク後ろ過の存在を含む様々な因子を評価するためのＤ－最適ＤｏＥを実行することによって、ある量のウイルス粒子の不活性化を最適化することを更に含む。いくつかの態様では、本出願の統計的に計画された実験におけるスパイクタイミングは、調整スパイク再調整方法又はスパイク調整方法である。調整スパイク再調整方法は、保持時間全体の間、一定の所望のｐＨ範囲を提供することができる。スパイク調整方法は、内因性レトロウイルス様粒子を含有する工程内中間体が出発ｐＨから酸性化される信頼性のある製造条件を表すことができる。図１Ａに示されるような調整スパイク再調整方法では、試料を標的ｐＨに調整／滴定し、次いで約ｐＨ７．２を有するウイルスストックでスパイクする。ｐＨ保持のタイミングは、スパイク時に開始された。スパイクウイルスストック後のｐＨ増加の観察により、試料のｐＨを標的ｐＨに再調整した後、ｐＨ保持の残りの期間、所望の温度で保持される。図１Ｂに示されるようなスパイク調整方法では、最初に試料をウイルスストック溶液でスパイクし、次いで標的ｐＨに調整／滴定する。標的ｐＨに達すると、ｐＨ保持のタイミングを開始し、試料を所望の温度でインキュベーションする。本出願の統計的に計画された実験のいくつかの態様では、低ｐＨ保持は、約０．２μｍのろ過材などのろ過材を使用するスパイク後ろ過を伴うか、又は伴わず実施され得る。スパイク後ろ過は、内因性レトロウイルス様粒子を含有する工程内中間体をろ過して無菌性を維持する信頼性のある製造操作を表す。ウイルス凝集体を除去し得るろ過ステップは、単分散ウイルスをもたらし得る。

いくつかの例示的な実施形態では、出発材料の導電率は、種々の標的ｐＨ条件で、ウイルス不活性化動態に影響を及ぼす強力な効果を有する。いくつかの例示的な実施形態では、本出願は、工程条件の範囲にわたってウイルスクリアランスを予測するためのモデルを提供する。いくつかの態様では、ウイルス不活性化に対するｐＨの効果に加えて、ＮａＣｌ濃度などのイオン強度又は導電率の増加は、ウイルス不活性化動態に影響を及ぼす重要な構成要素であり得る。一態様では、ｐＨ条件は、負荷材料が低いイオン強度を有する場合の重要な因子である。例えば、Ｘ－ＭｕＬＶ不活性化は、低イオン強度でのｐＨ条件に依存し得る。いくつかの態様では、イオン強度が増加する場合、ウイルス不活性化に対するｐＨ条件の影響が減少する。例えば、Ｘ－ＭｕＬＶは、イオン強度が増加した場合、全ての標的ｐＨ条件で迅速に不活性化され得る。いくつかの態様では、約５０ｍＭ又は約１００ｍＭのＮａＣｌが存在する場合、Ｘ－ＭｕＬＶの不活性化などの完全で有効なウイルスクリアランスは、約ｐＨ３．６５、約ｐＨ３．７３、及び約ｐＨ３．８０での標的ｐＨ条件約３０分の時点で観察される。約ｐＨ３．６５及びｐＨ３．７３でのｐＨ条件については、１５分後にＸ－ＭｕＬＶの完全な不活性化が観察された。一態様では、試料のイオン強度は、塩化ナトリウムの添加を使用して調整され、塩化ナトリウムの濃度は、約１ｍＭ～約１００ｍＭ、約１ｍＭ～約５００ｍＭ、約５０ｍＭ、又は約１００ｍＭの範囲にある。

バイオ医薬製品の製造中の低ｐＨ保持は、モノクローナル抗体などのタンパク質の品質及び安定性に重要な影響を及ぼし得る。本出願のモデルを使用して、低ｐＨ出発材料の導電率を操作することによって、ウイルス不活性化がｐＨ３．６０～ｐＨ３．９０の範囲で操作される場合の有効クリアランスを予測し得る。いくつかの態様では、本出願は、出発材料へのＮａＣｌの添加を介した導電率の増加が、様々な標的ｐＨ条件で迅速で効果的なウイルス不活性化を達成し得ることを提供する。一態様では、本出願の方法における試料は、その量のウイルス粒子を不活性化するために、少なくとも約３０分間、試料のイオン強度条件及びｐＨ条件で維持される。一態様では、試料は、その量のウイルス粒子を不活性化するために、約１５分間～約３０分間、試料のイオン強度条件及びｐＨ条件に維持される。

本出願における低ｐＨ保持のための統計的ＤｏＥの試験結果は、約ｐＨ３．６０未満の５．０ＬＲＦのＸ－ＭｕＬＶ不活性化のためのＡＳＴＭ標準と一致する。結果はまた、約３．６０超のｐＨでの堅牢で効果的な不活性化を実証している。ＡＳＴＭの包括的要求の外側の範囲について、結果は、ＮａＣｌ含有量を増加させることにより、迅速で効果的なＸ－ＭｕＬＶ不活性化を達成し得ることを示している。典型的には、保持のｐＨは、タンパク質の安定性に依存する。本出願のモデルは、低ｐＨ出発材料の導電率を操作することによって、ｐＨ３．６０～ｐＨ３．９０で操作する場合の有効なクリアランスを予測する利点を提供する。

バイオ医薬製品の製品品質、有効性、及び安全性を改善するという要求は、ウイルスの不活性化を保証するための効果的で堅牢な実験計画に対する需要の増加につながっている。本開示は、前述の要求を満たす方法を提供する。本明細書に開示される例示的な実施形態は、ウイルス粒子を含む１つ以上の不純物を含む試料から抗体を精製するための方法を提供することによって前述の要求を満たす。本出願は、低ｐＨ出発材料のイオン強度の増加を介したウイルスの堅牢で効果的な不活性化、及び低ｐＨ出発材料のイオン強度を操作することによる任意のｐＨ操作での有効なクリアランスを予測するためのモデルを提供し、長年にわたる必要性を満たす。

「１つの（ａ）」という用語は、「少なくとも１つ」を意味すると理解されるべきであり、「約」及び「およそ」という用語は、当業者によって理解されるように標準的な変動を可能にすると理解されるべきであり、範囲が提供される場合、エンドポイントが含まれる。本明細書で使用される場合、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、非限定的であることを意味し、それぞれ、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を意味すると理解される。

いくつかの例示的な実施形態では、本出願は、ウイルス粒子を含む１つ以上の不純物を含む試料から、抗体などのペプチド又はタンパク質を精製するための方法を提供する。いくつかの例示的な実施形態では、本出願の方法は、試料のイオン強度条件を調整することと、試料のｐＨ条件を酸性ｐＨに調整することと、その後、試料を、そのイオン強度条件及びそのｐＨ条件で少なくとも約１５分間維持して、ある量のウイルス粒子を不活性化することと、を含む。一態様では、試料におけるペプチド又はタンパク質は、宿主細胞において作製された抗体である。一態様では、ペプチド又はタンパク質は、モノクローナル抗体又は二重特異性抗体である。一態様では、ペプチド又はタンパク質は、抗体、抗体断片、抗体のＦａｂ領域、抗体－薬物コンジュゲート、融合タンパク質、タンパク質医薬製品、又は薬物である。

本明細書で使用される場合、「タンパク質」又は「目的のタンパク質」という用語は、共有結合で連結されたアミド結合を有する任意のアミノ酸ポリマーを含み得る。タンパク質には、概して「ポリペプチド」として当技術分野で既知である１つ以上のアミノ酸ポリマー鎖が含まれる。「ポリペプチド」は、アミノ酸残基、関連する天然に生じる構造バリアント、及びペプチド結合を介して連結されたそれらの合成の天然に生じない類似体、関連する天然に生じる構造バリアント、並びにそれらの合成の天然に生じない類似体からなるポリマーを指す。「合成ペプチド又はポリペプチド」は、天然に生じないペプチド又はポリペプチドを指す。合成ペプチド又はポリペプチドは、例えば、自動化ポリペプチド合成機を使用して合成され得る。様々な固相ペプチド合成方法が、当業者に既知である。タンパク質は、単一の機能的な生体分子を形成するために１つ以上のポリペプチドを含み得る。別の例示的な態様では、タンパク質は、抗体断片、ナノボディ、組換え抗体キメラ、サイトカイン、ケモカイン、ペプチドホルモンなどを含み得る。タンパク質は、生物治療薬タンパク質、研究又は治療において使用される組換えタンパク質、トラップタンパク質及び他のキメラ受容体Ｆｃ融合タンパク質、キメラタンパク質、抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、並びに二重特異性抗体のうちのいずれかを含み得る。タンパク質は、昆虫バキュロウイルス系、酵母系（例えば、Ｐｉｃｈｉａ種）、哺乳動物系（例えば、ＣＨＯ細胞及びＣＨＯ－Ｋ１細胞などのＣＨＯ誘導体）などの組換え細胞ベースの作製系を使用して作製され得る。生物治療薬タンパク質及びそれらの作製を考察する最近のレビューについては、Ｇｈａｄｅｒｉらの「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｐｌａｔｆｏｒｍｓ ｆｏｒ ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ，ｉｍｐａｃｔ，ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｏｆ ｎｏｎ－ｈｕｍａｎ ｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎ」（Ｄａｒｉｕｓ Ｇｈａｄｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｐｌａｔｆｏｒｍｓ ｆｏｒ ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ，ｉｍｐａｃｔ，ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｏｆ ｎｏｎ－ｈｕｍａｎ ｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎ，２８ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＧＥＮＥＴＩＣ ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ ＲＥＶＩＥＷＳ１４７－１７６（２０１２））を参照されたい。いくつかの例示的な実施形態では、タンパク質は、修飾、付加物、及び他の共有結合で連結された部分を含む。これらの修飾、付加物、及び部分は、例えば、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、グリカン（例えば、Ｎ－アセチルガラクトサミン、ガラクトース、ノイラミン酸、Ｎ－アセチルグルコサミン、フコース、マンノース、及び他の単糖類）、ＰＥＧ、ポリヒスチジン、ＦＬＡＧタグ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）ｍｙｃ－エピトープ、蛍光標識、及び他の色素などを含む。タンパク質は、組成及び溶解性に基づいて分類され得、したがって、球状タンパク質及び線維状タンパク質などの単純タンパク質；ヌクレオタンパク質、糖タンパク質、ムコタンパク質、色素タンパク質、リンタンパク質、金属タンパク質、及びリポタンパク質などのコンジュゲートタンパク質；並びに一次由来タンパク質及び二次由来タンパク質などの誘導タンパク質を含み得る。

いくつかの例示的な実施形態では、目的のタンパク質は、組換えタンパク質、抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、抗体断片、モノクローナル抗体、融合タンパク質、ｓｃＦｖ、及びそれらの組み合わせであり得る。

本明細書で使用される場合、「組換えタンパク質」という用語は、宿主細胞に導入されている組換え発現ベクター上で担持される遺伝子の転写及び翻訳の結果として作製されるタンパク質を指す。特定の例示的な実施形態では、組換えタンパク質は、融合タンパク質であり得る。特定の例示的な実施形態では、組換えタンパク質は、抗体、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、又は完全ヒト抗体であり得る。特定の例示的な実施形態では、組換えタンパク質は、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、又はＩｇＥからなる群から選択されるアイソタイプの抗体であり得る。特定の例示的な実施形態では、抗体分子は、完全長抗体（例えば、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４免疫グロブリン）であるか、又は代替的に、抗体は、断片（例えば、Ｆｃ断片又はＦａｂ断片）であり得る。

「抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、ジスルフィド結合によって相互接続された２本の重（Ｈ）鎖及び２本の軽（Ｌ）鎖の４本のポリペプチド鎖を含む免疫グロブリン分子、並びにそれらの多量体（例えば、ＩｇＭ）を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲ又はＶＨと略される）及び重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲ又はＶＬと略される）及び軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（ＣＬ１）を含む。ＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称される、より保存された領域が点在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される、超可変性の領域へと更に細分することができる。各ＶＨ及びＶＬは、以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端へ配置された、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲで構成される。ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４。本発明の種々の実施形態では、抗ｂｉｇ－ＥＴ－１抗体（又はその抗原結合部分）のＦＲは、ヒト生殖系列配列と同一であり得るか、又は天然に若しくは人工的に修飾され得る。アミノ酸コンセンサス配列は、２つ以上のＣＤＲの並列分析に基づいて定義され得る。「抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、完全な抗体分子の抗原結合断片も含む。抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合断片」などの用語は、本明細書で使用される場合、抗原を特異的に結合して複合体を形成する、任意の天然に生じる、酵素処理で入手可能な、合成の、又は遺伝子操作されたポリペプチド又は糖タンパク質を含む。抗体の抗原結合断片は、例えば、抗体可変ドメイン及び任意選択で定常ドメインをコードするＤＮＡの操作及び発現に関連するタンパク質消化又は組換え遺伝子操作技術などの任意の好適な標準的技術を使用して、完全な抗体分子に由来し得る。かかるＤＮＡは既知であり、かつ／又は、例えば、市販の供給源、ＤＮＡライブラリー（例えばファージ抗体ライブラリーを含む）から容易に入手可能であるか、若しくは合成され得る。ＤＮＡは、例えば、１つ以上の可変ドメイン及び／若しくは定常ドメインを好適な構成へと配置するために、又はコドンを導入し、システイン残基を作成し、アミノ酸を修飾、付加、若しくは欠失などするために、化学的に、又は分子生物学技術を使用することによって、配列決定及び操作され得る。

本明細書で使用される場合、「抗体断片」は、例えば、抗体の抗原結合領域又は可変領域などの完全なままの抗体の一部分を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦｖ断片、Ｆｖ断片、ｄｓＦｖダイアボディ、ｄＡｂ断片、Ｆｄ’断片、Ｆｄ断片、及び単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）領域、並びにトリアボディ、テトラボディ、線状抗体、単鎖抗体分子、及び抗体断片から形成された多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。Ｆｖ断片は、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の可変領域の組み合わせであり、ＳｃＦｖタンパク質は、免疫グロブリン軽鎖及び重鎖可変領域がペプチドリンカーによって接続された組換え単鎖ポリペプチド分子である。いくつかの例示的な実施形態では、抗体断片は、親抗体と同じ抗原に結合する断片である親抗体の十分なアミノ酸配列を含み、いくつかの例示的な実施形態では、断片は、親抗体と同等の親和性で抗原に結合し、及び／又は抗原への結合について親抗体と競合する。抗体断片は、任意の手段によって作製され得る。例えば、抗体断片は、完全なままの抗体の断片化によって酵素的又は化学的に作製され得、かつ／又はそれは、部分的な抗体配列をコードする遺伝子から組換え的に作製され得る。代替的又は追加的に、抗体断片は、完全に又は部分的に、合成的に作製され得る。抗体断片は、任意選択で単鎖抗体断片を含み得る。代替的又は追加的に、抗体断片は、例えば、ジスルフィド連結によって一緒に連結される複数の鎖を含み得る。抗体断片は、任意選択で多分子複合体を含み得る。機能的抗体断片は、典型的には、少なくとも約５０アミノ酸を含み、より典型的には、少なくとも約２００アミノ酸を含む。

「二重特異性抗体」という語句は、２つ以上のエピトープに選択的に結合することができる抗体を含む。二重特異性抗体は、概して、２つの異なる重鎖を含み、各重鎖は、２つの異なる分子（例えば、抗原）上又は同じ分子上（例えば、同じ抗原上）のいずれかで異なるエピトープに特異的に結合する。二重特異性抗体が２つの異なるエピトープ（第１のエピトープ及び第２のエピトープ）に選択的に結合することができる場合、第１の重鎖の第１のエピトープに対する親和性は、概して、第１の重鎖の第２のエピトープに対する親和性より少なくとも１～２、又は３、又は４桁低く、逆も同様である。二重特異性抗体によって認識されるエピトープは、同じ又は異なる標的上（例えば、同じ又は異なるタンパク質上）にあり得る。二重特異性抗体は、例えば、同じ抗原の異なるエピトープを認識する重鎖を組み合わせることによって作製され得る。例えば、同じ抗原の異なるエピトープを認識する重鎖可変配列をコードする核酸配列は、異なる重鎖定常領域をコードする核酸配列に融合され得、かかる配列は、免疫グロブリン軽鎖を発現する細胞で発現され得る。

典型的な二重特異性抗体は、各々が３つの重鎖ＣＤＲを有する２つの重鎖、続いて、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメイン、並びに免疫グロブリン軽鎖を有し、この免疫グロブリン軽鎖は、抗原結合特異性を付与しないが、各重鎖と会合し得るか、又は各重鎖と会合し得、かつ重鎖抗原結合領域によって結合されたエピトープのうちの１つ以上と会合し得るか、又は各重鎖と会合し得、かつ１つ若しくは両方のエピトープへの結合、若しくは重鎖のうちの１つ若しくは両方を可能にするかのいずれかである。ｂｓＡｂは、２つの主要なクラス、Ｆｃ領域を保有するもの（ＩｇＧ様）及びＦｃ領域を欠くものに分けることができ、後者は、通常、Ｆｃを含むＩｇＧ及びＩｇＧ様二重特異性分子よりも小さい。ＩｇＧ様ｂｓＡｂは、これらに限定されないが、トリオマブ、ノブイントゥホールＩｇＧ（ｋｉｈＩｇＧ）、クロスＭａｂ、ｏｒｔｈ－Ｆａｂ ＩｇＧ、二重可変ドメインＩｇ（ＤＶＤ－Ｉｇ）、ツーインワン若しくは二重作用Ｆａｂ（ＤＡＦ）、ＩｇＧ－単鎖Ｆｖ（ＩｇＧ－ｓｃＦｖ）、又はκλボディなどの種々の形式を有し得る。非ＩｇＧ様の種々の形式としては、タンデムｓｃＦｖ、ダイアボディ形式、単鎖ダイアボディ、タンデムダイアボディ（ＴａｎｄＡｂ）、二重親和性再標的化分子（ＤＡＲＴ）、ＤＡＲＴ－Ｆｃ、ナノボディ、又はドックアンドロック（ＤＮＬ）法によって作製される抗体（Ｇａｏｗｅｉ Ｆａｎ，Ｚｕｊｉａｎ Ｗａｎｇ＆Ｍｉｎｇｊｕ Ｈａｏ，Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，８ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＨＥＭＡＴＯＬＯＧＹ＆ＯＮＣＯＬＯＧＹ １３０；Ｄａｆｎｅ Ｍｕｌｌｅｒ＆Ｒｏｌａｎｄ Ｅ． Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ２６５－３１０（２０１４））が挙げられる。ｂｓＡｂを作製する方法は、２つの異なるハイブリドーマ細胞株の体細胞融合に基づくクアドローマ技術、化学的架橋剤を含む化学的コンジュゲーション、及び組換えＤＮＡ技術を利用する遺伝子アプローチに限定されない。ｂｓＡｂの例としては、以下の特許出願に開示されているものが挙げられ、これらは参照により本明細書に組み込まれる。２０１０年６月２５日に出願された米国特許出願第１２／８２３８３８号、２０１２年６月５日に出願された米国特許出願第１３／４８８６２８号、２０１３年９月１９日に出願された米国特許出願第１４／０３１０７５号、２０１５年７月２４日に出願された米国特許出願第１４／８０８１７１号、２０１７年９月２２日に出願された米国特許出願第１５／７１３５７４号、２０１７年９月２２日に出願された米国特許出願第１５／７１３５６９号、２０１６年１２月２１日に出願された米国特許出願第１５／３８６４５３号、２０１６年１２月２１日に出願された米国特許出願第１５／３８６４４３号、２０１６年７月２９日に出願された米国特許出願第１５／２２３４３号、及び２０１７年１１月１５日に出願された米国特許出願第１５８１４０９５号。低レベルのホモ二量体不純物は、二重特異性抗体の製造中のいくつかのステップで存在する可能性がある。かかるホモ二量体不純物の検出は、通常の液体クロマトグラフィー法を使用して実施される場合、ホモ二量体不純物の存在量が少なく、これらの不純物が主な種と共溶出するため、インタクト質量分析を使用して実施される場合困難である可能性がある。

本明細書で使用される場合、「多重特異性抗体」又は「Ｍａｂ」とは、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有する抗体を指す。かかる分子は、通常、２つの抗原のみに結合するが（すなわち、二重特異性抗体、ＢｓＡｂ）、三重特異性抗体及びＫＩＨ三重特異性などの追加の特異性を有する抗体はまた、本明細書に開示される系及び方法によって対処され得る。

「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、ハイブリドーマ技術を介して作製される抗体に限定されない。モノクローナル抗体は、当技術分野で利用可能又は既知の任意の手段によって、任意の真核生物、原核生物、又はファージクローンを含む単一のクローンに由来し得る。本開示で有用なモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え、及びファージディスプレイ技術、又はそれらの組み合わせの使用を含む、当技術分野で既知の多種多様な技術を使用して調製され得る。

いくつかの例示的な実施形態では、目的のタンパク質は、哺乳動物細胞から精製され得る。哺乳動物細胞は、ヒト起源のもの又は非ヒト起源のものであり得、初代上皮細胞（例えば、角化細胞、子宮頸部上皮細胞、気管支上皮細胞、気管上皮細胞、腎臓上皮細胞及び網膜上皮細胞）、確立された細胞株及びそれらの株（例えば、２９３胚性腎細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ子宮頸部上皮細胞及びＰＥＲ－Ｃ６網膜細胞、ＭＤＢＫ（ＮＢＬ－１）細胞、９１１細胞、ＣＲＦＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＢｅＷｏ細胞、Ｃｈａｎｇ細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５６２細胞、ＨｅＬａ２２９細胞、ＨｅＬａＳ３細胞、Ｈｅｐ－２細胞、ＫＢ細胞、ＬＳＩ８０細胞、ＬＳ１７４Ｔ細胞、ＮＣＩ－Ｈ－５４８細胞、ＲＰＭＩ２６５０細胞、ＳＷ－１３細胞、Ｔ２４細胞、ＷＩ－２８ ＶＡ１３、２ＲＡ細胞、ＷＩＳＨ細胞、ＢＳ－Ｃ－Ｉ細胞、ＬＬＣ－ＭＫ２細胞、クローンＭ－３細胞、１－１０細胞、ＲＡＧ細胞、ＴＣＭＫ－１細胞、Ｙ－ｌ細胞、ＬＬＣ－ＰＫｉ細胞、ＰＫ（１５）細胞、ＧＨｉ細胞、ＧＨ３細胞、Ｌ２細胞、ＬＬＣ－ＲＣ２５６細胞、ＭＨｉＣｉ細胞、ＸＣ細胞、ＭＤＯＫ細胞、ＶＳＷ細胞、及びＴＨ－Ｉ、Ｂ１細胞、ＢＳＣ－１細胞、ＲＡｆ細胞、ＲＫ細胞、ＰＫ－１５細胞又はこれらの誘導体）、任意の組織又は器官由来の線維芽細胞（心臓、肝臓、腎臓、結腸、腸、食道、胃、神経組織（脳、脊髄）、肺、血管組織（動脈、静脈、毛細血管）、リンパ組織（リンパ腺、アデノイド、扁桃腺、骨髄、及び血液）、脾臓、並びに線維芽細胞及び線維芽細胞様細胞株（例えば、ＣＨＯ細胞、ＴＲＧ－２細胞、ＩＭＲ－３３細胞、Ｄｏｎ細胞、ＧＨＫ－２１細胞、シトルリン血症細胞、デンプシー細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５５１細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５１０細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５２５細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５２９細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５３２細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５３９細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５４８細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５７３細胞、ＨＥＬ２９９細胞、ＩＭＲ－９０細胞、ＭＲＣ－５細胞、ＷＩ－３８細胞、ＷＩ－２６細胞、Ｍｉｄｉ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＶ－１細胞、ＣＯＳ－１細胞、ＣＯＳ－３細胞、ＣＯＳ－７細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＤＢＳ－ＦｒｈＬ－２細胞、ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞、Ｆ９細胞、ＳＶ－Ｔ２細胞、Ｍ－ＭＳＶ－ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞、Ｋ－ＢＡＬＢ細胞、ＢＬＯ－１１細胞、ＮＯＲ－１０細胞、Ｃ３Ｈ／ＩＯＴＩ／２細胞、ＨＳＤＭｉＣ３細胞、ＫＬＮ２０５細胞、ＭｃＣｏｙ細胞、マウスＬ細胞、株２０７１（マウスＬ）細胞、Ｌ－Ｍ株（マウスＬ）細胞、Ｌ－ＭＴＫ’（マウスＬ）細胞、ＮＣＴＣクローン２４７２及び２５５５、ＳＣＣ－ＰＳＡ１細胞、Ｓｗｉｓｓ／３Ｔ３細胞、インドキョン細胞、ＳＩＲＣ細胞、Ｃｎ細胞、及びＪｅｎｓｅｎ細胞、Ｓｐ２／０、ＮＳ０、ＮＳ１細胞又はその誘導体）が含まれ得る。

いくつかの例示的な実施形態では、目的のタンパク質は、ＶＥＧＦ拮抗薬であり得る。本明細書で使用される場合、「ＶＥＧＦ拮抗薬」は、ＶＥＧＦに結合又は相互作用し、その受容体（ＶＥＧＦＲ１及びＶＥＧＦＲ２）へのＶＥＧＦの結合を阻害し、かつ／又はＶＥＧＦの生物学的シグナル伝達及び活性を阻害する任意の薬剤である。ＶＥＧＦ拮抗薬には、ＶＥＧＦと天然ＶＥＧＦ受容体との間の相互作用に干渉する分子、例えば、ＶＥＧＦ又はＶＥＧＦ受容体に結合し、ＶＥＧＦとＶＥＧＦ受容体との間の相互作用を防止するか、又はそうでければ妨害する分子が含まれる。具体的な例示的なＶＥＧＦ拮抗薬としては、抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、ラニビズマブ［ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標）］）、抗ＶＥＧＦ受容体抗体（例えば、抗ＶＥＧＦＲ１抗体、抗ＶＥＧＦＲ２抗体など）、並びにアフリベルセプト、ｚｉｖ－アフリベルセプト、及び配列番号４２を有するアミノ酸を有するタンパク質などのＶＥＧＦ受容体ベースのキメラ分子又はＶＥＧＦ阻害融合タンパク質（本明細書では、「ＶＥＧＦ－トラップ」又は「ＶＥＧＦミニトラップ」とも称される）が挙げられる。ＶＥＧＦ－トラップの他の例は、ＡＬＴ－Ｌ９、Ｍ７１０、ＦＹＢ２０３及びＣＨＳ－２０２０である。ＶＥＧＦ－トラップの追加の例は、米国特許第７，０７０，９５９号、同第７，３０６，７９９号、同第７，３７４，７５７号、同第７，３７４，７５８号、同第７，５３１，１７３号、同第７，６０８，２６１号、同第５，９５２，１９９号、同第６，１００，０７１号、同第６，３８３，４８６号、同第６，８９７，２９４号及び同第７，７７１，７２１号に見出すことができ、これらは、参照によりそれらの全体が本明細書に具体的に組み込まれる。

ＶＥＧＦ受容体ベースのキメラ分子には、ＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ１とも称される）及び／又はＶＥＧＦＲ２（Ｆｌｋ１又はＫＤＲとも称される）などのＶＥＧＦ受容体の２つ以上の免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメインを含むキメラポリペプチドが含まれ、多量体化ドメイン（例えば、２つ以上のキメラポリペプチドの二量体化などの多量体化を促進するＦｃドメイン）も含む場合がある。例示的なＶＥＧＦ受容体ベースのキメラ分子は、ＶＥＧＦＲ１Ｒ２－ＦｃΔＣ１（ａ）と称される分子である（アフリベルセプトとしても知られ、製品名ＥＹＬＥＡ（登録商標）で市販されている）。

本明細書で使用される場合、「タンパク質医薬製品」という用語は、本質的に完全に又は部分的に生物学的であり得る活性成分を含む。いくつかの例示的な実施形態では、タンパク質医薬製品は、ペプチド、タンパク質、融合タンパク質、抗体、抗原、ワクチン、ペプチド－薬物コンジュゲート、抗体－薬物コンジュゲート、タンパク質－薬物コンジュゲート、細胞、組織、又はそれらの組み合わせを含み得る。いくつかの他の例示的な実施形態では、タンパク質医薬製品は、ペプチド、タンパク質、融合タンパク質、抗体、抗原、ワクチン、ペプチド－薬物コンジュゲート、抗体－薬物コンジュゲート、タンパク質－薬物コンジュゲート、細胞、組織、又はそれらの組み合わせの組換えバーション、操作バージョン、修飾バージョン、変異バージョン、又は切断バージョンを含み得る。

例示的な実施形態
本明細書に開示される実施形態は、ウイルス粒子を含む１つ以上の不純物を含む試料から、抗体などのペプチド又はタンパク質を精製するための方法を提供する。本明細書に開示される実施形態はまた、統計的実験計画法に基づいて、低ｐＨ保持を使用するウイルスクリアランスのための方法を提供する。

いくつかの例示的な実施形態では、本出願は、ウイルス粒子を含む１つ以上の不純物を含む試料から、抗体などのペプチド又はタンパク質を精製するための方法を提供する。いくつかの例示的な実施形態では、本出願の方法は、試料のイオン強度条件を調整することと、試料のｐＨ条件を酸性ｐＨに調整することと、その後、試料を、そのイオン強度条件及びそのｐＨ条件で少なくとも約１５分間維持して、ある量のウイルス粒子を不活性化することと、を含む。

一態様では、本出願の方法における試料のｐＨ条件は、酸性ｐＨ、約ｐＨ７以下、約ｐＨ６以下、約ｐＨ５以下、約ｐＨ４以下、約ｐＨ３．９０以下、約ｐＨ３．８０以下、約ｐＨ３．７０以下、約ｐＨ３．６０～約ｐＨ３．９０、又は約ｐＨ３．６５～約ｐＨ３．８０である。

一態様では、本出願の方法における試料は、その量のウイルス粒子を不活性化するために、試料のイオン強度条件及びｐＨ条件で、少なくとも約３０分間、少なくとも約１５分間、約１５分間～約３０分間、少なくとも約１０分間、少なくとも約２０分間、少なくとも約２５分間、少なくとも約３５分間、約１０分間～約３０分間、約１５分間～約３５分間、約２０分間～約３０分間、約２０分間～約３５分間、又は約２５分間～約４０分間、維持される。

一態様では、試料のイオン強度は、塩化ナトリウムの添加を使用して調整され、塩化ナトリウムの濃度は、約１ｍＭ～約２００ｍＭ、約１ｍＭ～約５００ｍＭ、約５ｍＭ、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、約５５ｍＭ、約６０ｍＭ、約６５ｍＭ、約７０ｍＭ、約７２ｍＭ、約８０ｍＭ、約８２ｍＭ、約９０ｍＭ、約１００ｍＭ、約１５０ｍＭ、約２００ｍＭ、約２５０ｍＭ、約３００ｍＭ、約３５０ｍＭ、約４００ｍＭ、約４５０ｍＭ、又は約５００ｍＭの範囲にある。

本方法は、前述のペプチド、タンパク質、抗体、Ｄ－最適実験計画法、ウイルス、レトロウイルス、ウイルス不活性化、ウイルスクリアランス、イオン強度、又はｐＨ条件のうちのいずれかに限定されないことが理解される。

本明細書で提供される方法ステップの数字及び／又は文字での連続した標識は、方法又はその任意の実施形態を特定の指示された順序に限定することを意味しない。特許、特許出願、公開特許出願、受入番号、技術論文、及び学術論文を含む、様々な刊行物が、本明細書全体を通して引用される。これらの引用される参考文献の各々は、参照によって、その全体及び全ての目的のために、本明細書に組み込まれる。別段記載されない限り、本明細書で使用される全ての技術及び科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本開示は、本開示をより詳細に説明するために提供される以下の実施例を参照することによって、より完全に理解されるであろう。それらは、例示することを意図しており、本開示の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。

材料及び試薬
１．モデルタンパク質及び緩衝液
ＣＨＯ細胞において発現したモノクローナル抗体の異なるアイソタイプを、モデルタンパク質、ＩｇＧ４アイソタイプを示すｍＡｂ１、及びＩｇＧ１アイソタイプを示すｍＡｂ２として使用した。モデルタンパク質の等電点は、ｍＡｂ１については８．８、ｍＡｂ２についてはｐＨ９．３と推定された。モノクローナル抗体を、標準的なプロテインＡクロマトグラフィーを使用して精製し、４０ｍＭの酢酸で溶出し、約ｐＨ４．２のプールを得た。モノクローナル抗体の濃度は、約１５ｇ／Ｌであった。

２．スパイク及び感染性アッセイのためのウイルスストック
ウイルス不活性化を評価するために、Ｘ－ＭｕＬＶを使用した。ＷｕＸｉ ＡｐｐＴｅｃ（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）によって、Ｘ－ＭｕＬＶウイルスストックを調製した。Ｘ－ＭｕＬＶウイルスストック溶液の１ロットは、およそ１０^７ＰＦＵ／ｍＬの力価を有した。全ての実行について、ウイルスストック溶液を超音波処理し、ろ過した後、負荷材料にスパイクした。１５分の時点で０．５ｍＬのアッセイ体積の感染性試料を取り出し、分析した。３０分の時点で７ｍＬの大きいアッセイ体積の感染性試料を取り出し、試験した。全ての試料を、ＰＧ４インジケーター細胞を使用して、Ｘ－ＭｕＬＶ感染性について定量化した。播種前に、試料をｐＨ６．５～７．５に中和した。式１に記載のとおり、負荷に存在するスパイクウイルスの量とプールに存在するウイルスの量とを比較することによって、ウイルスＬＲＦを計算する。式中、Ｃ（ウイルス、負荷）は負荷におけるウイルス濃度を示し、Ｃ（ウイルス、プール）はプールにおけるウイルス濃度を示し、Ｖ（負荷）は負荷体積を示し、Ｖ（プール）はプール体積を示す。
式１．ウイルスｌｏｇ_１０減少率（ＬＲＦ）の計算
試料を、研究の実行前の感染性アッセイのインジケーター細胞株に対する試料マトリックスの細胞傷害効果について評価した。低ｐＨ保持の存在によりウイルスの不活性化が生じ、タンパク質マトリックス自体と関連付けられていないことを保証するためにスパイキング研究中に追加の対照を実施した。

方法及びデバイス
１．ｐＨ滴定及びスパイクのための方法：
試料を、０．２５Ｍのリン酸又は０．２５ＭのグリシンＨＣｌのいずれかを使用して、所望のｐＨ値に滴定した。酸性試料を、２ＭのＴｒｉｓ塩基を使用して中和した。各不活性化実験は、実験計画によって誘導される、２つのスパイク法のうちの１つを使用して実施された。スパイク法１、例えば、調整スパイク再調整方法では、試料を標的ｐＨに調整／滴定し、次いでｐＨが約７．２であるウイルスストックでスパイクした。ｐＨ保持のタイミングは、スパイク時に開始された。スパイクウイルスストック後のｐＨ増加の観察により、試料のｐＨを標的ｐＨに再調整した後、ｐＨ保持の残りの期間、所望の温度で保持される。スパイク法２、例えば、スパイク調整方法では、最初に試料をウイルスストック溶液でスパイクし、次いで標的ｐＨに調整／滴定した。酸添加は、大規模製造を代表する適切な混合時間及び速度を有するシリンジポンプを使用して実施された。標的ｐＨに達すると、ｐＨ保持のタイミングを開始し、試料を所望の温度でインキュベーションした。

スパイク方法１及び２の両方について、出発負荷材料に２％のＸ－ＭｕＬＶウイルスストック（ｖ／ｖ）をスパイクした。スパイク後ろ過を実験計画における因子として示す場合、０．２μｍＰＥＳろ過材（ポリエーテルスルホンろ過材）を使用した。バルク材料を、ｐＨ保持期間中、水浴中でインキュベーションした。水浴の温度は、実験計画における因子であり、較正済み温度計を使用して監視された。全てのｐＨ測定は、バイオセーフティキャビネット内のバルク材料から２ｍＬの試料を取り出してオフラインで行った。

２．ｐＨ測定用デバイス
Ｉｎ Ｌａｂ Ｅｘｐｅｒｔ Ｐｒｏ ｐＨプローブ及びＳｅｖｅｎＣｏｍｐａｃｔ Ｓ２２０ ｐＨ計測器（Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ，ＯＨ）を使用して、ｐＨ値の測定を実施した。計測器は、直線較正モード、厳密なエンドポイント形式、及び自動温度補正に設定された。ｐＨ計測器は、結果を小数点以下２桁で表示するように設定されている。プローブを使用前に３０～６０分間電極貯蔵溶液中で平衡化した。ｐＨ１．６８、ｐＨ４．０１、又はｐＨ７．００を有する緩衝液を使用して、プローブ（ＶＷＲ、Ｒａｄｎｏｒ，ＰＡ）を較正した。３点較正傾斜率の基準は、９７．０～１０３．０％の範囲内であった。較正に成功した後、ｐＨ３．００及びｐＨ６．００における独立した緩衝液標準物質を測定して、精度が緩衝液ｐＨの±０．０３ｐＨ単位内にあることを確認した。独立した標準物質を再測定し、毎日、最終試料の完了後、ｐＨが標的ｐＨに維持されたことを確認した。新しいｐＨプローブを同じ基準と一致させて較正し、試験実施の各日に使用して、経時的なプローブ可変性を最小限に抑えた。

３．低ｐＨ保持のための統計的実験計画法（ＤｏＥ）
統計的実験計画法（ＤｏＥ）を使用して、レトロウイルス不活性化のための低ｐＨ保持ステップの効果を評価し、特徴付けた。タンパク質の種類、ｐＨ、温度、酸滴定剤、ＮａＣｌ含有量、スパイクタイミング、及びスパイク後ろ過を含む、低ｐＨ保持ステップと関連するいくつかの因子の効果を評価した。これらの因子の影響を調査するために、ソフトウェアを使用して統計的ＤｏＥを計画した。１５回実行又は３０回実行などのＤ－最適モデル計画を、ＪＭＰソフトウェアｖ．１３（ＳＡＳ、Ｃａｒｙ ＮＣ）を使用して生成した。Ｄ－最適計画の散布図マトリックス及び多変量相関を図２Ａに示す。表１に示される、以下を含む７つの因子が、研究計画に組み込まれた。異なるアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４の２つのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）などのタンパク質の種類；ｐＨ３．６５、ｐＨ３．７３又はｐＨ３．８０などのｐＨ；１５℃又は２０℃などの温度；０．２５Ｍのリン酸又は０．２５ＭのグリシンＨＣｌなどの酸滴定剤；０ｍＭ、５０ｍＭ又は１００ｍＭなどの出発溶液中のＮａＣｌ含有量；調整スパイク調整方法又はスパイク調整方法などのスパイクタイミング；及び、例えば、スパイク後ろ過の有無にかかわらずスパイク後ろ過。スパイク溶液は、２％ｖ／ｖスパイクのためのＸ－ＭｕＬＶ精製ストックを含有する。表１は、各因子の特定のレベル又は種類を含む計画マトリックスへのこれら７つの因子の実装を示している。

（表１）実験計画法において使用される因子

計画は、全ての主な効果及びいくつかの相互作用を評価した。２回の再現を伴う１５の条件、合計３０回の実行を、４日間にわたって同じ分析者によって実行した。３つレベルのＮａＣｌ含有量、例えば、０ｍＭ、５０ｍＭ又は１００ｍＭのＮａＣｌで、各モノクローナル抗体についての追加の対照が含まれた。感染性アッセイを使用して、１５又は３０分などの２つの時点（Ｔ）で試料を分析した。応答は、１５及び３０分で、Ｘ－ＭｕＬＶ ＬＲＦであった。ＪＭＰ（登録商標）（ＳＡＳからの統計ソフトウェア）を使用して、最小二乗推定値によるモデリングを実施した。分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して、統計的に有意な（Ｐ＜０．０５）因子及び相互作用を特定した。全ての非有意因子（Ｐ＞０．０５）、共線因子（ＶＩＦ＞５）、及び外れ値実行（ジャックナイフ距離によって決定）を除去した。

全てのモノクローナル抗体条件について、図２Ｂに示される中性対照を実施した。測定されたウイルス活性が低ｐＨでの化学的不活性化の結果であることを保証するために、中性対照を実施した。負荷材料のｐＨを、約ｐＨ６．５～７．５に調整した。ウイルス不活性化がタンパク質マトリックス単独から生じないことを実証するために、クリアランスが観察されないことが期待された。試料をろ過前及びろ過後のステップから取得して、ろ過材に対する潜在的なウイルス損失を監視した。モノクローナル抗体の各条件は、データ分析のための負荷材料として機能する代表的な中性対照を有した。環境の温度は、ｐＨ測定に影響を及ぼす可能性がある。全てのウイルス処理、調整、及びｐＨ測定は、室温で行われた。バルク試験品を、２つの異なる温度条件で、水浴中でインキュベーションした。測定には、Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ Ｅｘｐｅｒｔ Ｐｒｏを使用した。

実施例１．低ｐＨ保持に対して影響を及ぼす因子を調査する
表１に示すように、低ｐＨ保持のためのＸ－ＭｕＬＶ不活性化に対する、タンパク質の種類、ｐＨ、温度、酸滴定剤、ＮａＣｌ含有量、スパイクタイミング、及びスパイク後ろ過の影響を、Ｄ－最適実験計画法を介して調査した。二重での１５回の実行を、同じウイルスストック、人員、緩衝液、及び機器を用いて４日間連続して実施した。中性対照は、各モノクローナル抗体（ｍＡｂ）条件（ｍＡｂの種類及びＮａＣｌ含有量、Ｎ＝６）について実施され、データ分析のための負荷試料として機能した。各実行条件並びに１５及び３０分の時点の両方で得られたＬＲＦ値を表２に列挙する。実験計画法についてのデータの要約を表２に示す。３０分後の３０回の実行のうちの２２回でウイルスは検出されなかった。３０分後の再現実行の各々についてのＬＲＦは、データ分析中に外れ値として除去された２つの実行を除いて、互いに０．５ＬＲＦ内にあった。ｐＨ測定、酸添加、又は負荷材料に基づくデータセットには、日ごと又は実行ごとに顕著な可変性はない。

表２において、標的ｐＨに関して、試料を、±０．０２ｐＨ単位の範囲内で標的ｐＨに調整した。ＮａＣｌ含有量に関しては、酸を用いて低ｐＨに滴定を実施する前に、ＮａＣｌをバルク材料に添加した。「＞」の記号は、ウイルスがアッセイの検出限界を下回って減少したことを示す。Ｐは、リン酸を示す。Ｇは、グリシンＨＣｌを示す。いくつかの特定の実行は、ジャックナイフ距離によって外れ値として決定され、更なるデータ分析の前に除去された。感染性アッセイの前に、非干渉希釈を特定することができるように、試料マトリックスを、インジケーター細胞株におけるウイルス増殖に対する干渉について評価した。観察された干渉に基づいて、実行を３倍希釈で報告した。１つの再現実行は、３倍希釈で感染性アッセイに予期せず干渉し、報告された値は、干渉を防止した１０倍希釈であった。この実行は、ジャックナイフの距離によって外れ値であることが決定され、データ分析から削除された。

（表２）実験計画法についてのデータ要約

実施例２．種々の標的ｐＨでのＸ－ＭｕＬＶ不活性化動態の分析
統計的実験計画法（ＤｏＥ）を使用して、タンパク質の種類、ｐＨ条件、温度、酸滴定剤、出発溶液のイオン強度、スパイクタイミング、及びスパイク後ろ過などのいくつかの因子の評価を含む、ウイルス不活性化のための低ｐＨ保持ステップの効果を評価し、特徴付けた。統計的ＤｏＥを使用して、ウイルス不活性化のための低ｐＨ保持ステップの効果を評価し、特徴付けた。種々の標的ｐＨを考慮して、Ｘ－ＭｕＬＶの不活性化動態を分析した。１５分及び３０分の時点での試料を、Ｘ－ＭｕＬＶ感染性について試験し、低ｐＨ保持の初期不活性化（例えば、１５分）及び終了時での不活性化（例えば、３０分）を評価した。図３Ａ～３Ｃは、標的ｐＨ３．６５、ｐＨ３．７３又はｐＨ３．８０でのＸ－ＭｕＬＶの不活性化動態を示す。各ｐＨ値について、時点に対してＬＲＦ値をプロットすることによってＬＲＦ曲線を得た。図３Ａ～３Ｃに示されるように、白丸は、試料中にウイルスが検出されなかったことを示し、×印は、試料中でウイルスが検出されたことを示す。赤色の線は、ｐＨ３．６５±０．０２で実施された各実行に対応し、緑色の線は、ｐＨ３．７３±０．０２で実施された各実行に対応し、青色の線は、ｐＨ３．８０±０．０２で実施された各実行に対応する。図３Ａに示されるように、ｐＨ３．６５の実行について、１５分の時点での試料のうちのいずれにおいてもウイルスは検出されず、これは、ウイルスの迅速な不活性化（検出限界は約２．５ＰＦＵ／ｍＬ）を示した。ｐＨ３．６５の実行について、３０分の時点で、２つの実行はウイルスの検出を示した。しかしながら、これらの２つの実行の結果は、アッセイの検出限界（約１．０ＰＦＵ／ｍＬ）に近づいていた。ｐＨ３．６５±０．０２では、全てのＬＲＦは３０分間の時点で５．０超であった。ｐＨ３．７３及びｐＨ３．８０の実行について、実行間で不一致が生じたため、図３Ｂ及び図３Ｃに示されるように、いくつかの不一致が存在した。ｐＨ３．７３又はｐＨ３．８０でのいくつかの実行は、ｐＨ３．６５の実行と同様の迅速な不活性化を示した。ｐＨ３．７３又はｐＨ３．８０での１つ又は２つの実行は、３０分で不完全な不活性化を示した。これらの実行の変動性は、別の因子がｐＨ条件よりも強い効果を有し得ることを示唆した。

実施例３．種々のＮａＣｌ含有量でのＸ－ＭｕＬＶ不活性化動態の分析
表２における３０分の時点で検出されたレトロウイルスを示した実行について更なる分析を実施した。３０分後にウイルスを検出していたこれらの実行中の一般的な因子、例えば、ＮａＣｌ含有量を分析した。出発負荷材料にＮａＣｌを添加せずに実行を実施した。添加されたＮａＣｌの各レベルについて、時点に対してＬＲＦ値をプロットすることによってＬＲＦ曲線を得た。図４Ａ～４Ｃは、０ｍＭ（図４Ａ）、５０ｍＭ（図４Ｂ）又は１００ｍＭ（図４Ｃ）のＮａＣｌ含有量でのＸ－ＭｕＬＶの不活性化動態を示す。図４Ａ～４Ｃに示されるように、白丸は、試料中にウイルスが検出されなかったことを示し、×印は、試料中でウイルスが検出されたことを示す。赤色の線は、約ｐＨ３．６５±０．０２で実施された各実行に対応し、緑色の線は、約ｐＨ３．７３±０．０２で実施された各実行に対応し、青色の線は、ｐＨ３．８０±０．０２で実施された各実行に対応する。

出発溶液の導電率が、種々の標的ｐＨ条件でのＸ－ＭｕＬＶ不活性化動態に影響を及ぼす強力な結果が示された。ＮａＣｌ含有量は、レトロウイルス不活性化に最も大きな影響を及ぼすと決定された。図４Ａに示されるように、負荷材料が低イオン強度を有する場合、又は追加のＮａＣｌが出発材料に添加されなかった場合、ｐＨ条件は重要な因子であった。データは、Ｘ－ＭｕＬＶ不活性化が、低イオン強度でのｐＨに依存することを示唆した。しかしながら、イオン強度を増加させた、例えば、ＮａＣｌ濃度を増加させた場合、３つの標的ｐＨ条件全てでＸ－ＭｕＬＶが迅速に不活性化されたため、種々の標的ｐＨ条件の効果は観察されなかった。言い換えれば、ＮａＣｌの濃度が増加した場合、Ｘ－ＭｕＬＶ不活性化に対するｐＨ条件の影響が減少した。５０ｍＭ又は１００ｍＭのＮａＣｌを添加した場合、それぞれ図４Ｂ（５０ｍＭのＮａＣｌ）又は図４Ｃ（１００ｍＭのＮａＣｌ）に示されるように、ｐＨ３．６５、ｐＨ３．７３、及びｐＨ３．８０の標的ｐＨ条件について３０分の時点での全ての実行についてＸ－ＭｕＬＶの完全で有効なクリアランスが観察された。低導電率（例えば、低ＮａＣｌ含有量）では、ｐＨは、Ｘ－ＭｕＬＶ不活性化に対して強い効果を有する。より高い導電率（例えば、より高いＮａＣｌ含有量）では、ｐＨは、Ｘ－ＭｕＬＶ不活性化に対して影響を及ぼさない。０．２５ＭのグリシンＨＣｌは、０．２５Ｍのリン酸と比較して、Ｘ－ＭｕＬＶ不活性化の増加を示した。

実施例４．多変量線形回帰モデルの生成
種々の因子の影響を調査するために、多変量線形回帰モデルを生成して、評価された因子の主な効果、二次性、及び相互作用を調査した。更に、１５及び３０分の時点の両方でのＸ－ＭｕＬＶ不活性化に対するイオン強度の影響を定量化した。生成されたモデルは、表３に示されるように、０．１５ＬＲＦ未満の誤差の推定値を含む約９９％の調整されたＲ^２値を有していたが、一方で感染性アッセイの報告される可変性は０．５ＬＲＦである（ＩＣＨＱ５Ａ（Ｒ１））。表３において、Ｒ^２は、相関係数を示し、調整されたＲ^２は、モデルによって説明される変動の量を示し、ＲＭＳＥは、方法における誤差の推定についての平均の平方根誤差を示す。表４は、各モデルについての有意な（Ｐ＜０．０５）因子の一覧を示す。実際のプロット対予測プロットを図５Ａ及び図５Ｂに示す。２つの時点についてのＬＲＦの多変量線形回帰モデルの実際の値対予測値のプロットを、図５Ａ及び図５Ｂ、例えば、１５分（図５Ａ）又は３０分（図５Ｂ）に示す。図５Ａ及び図５Ｂにおいて、赤色の線は、適合線を示し、青色の線は、平均線を示し、赤色の影付き線は、９５％信頼区間を示す。

（表３）各時点についての適合させた有意な多変量線形回帰モデル

（表４）各時点について生成されたLRF多変量線形回帰モデルから決定される有意な因子

１５及び３０分について生成されたＬＲＦモデルの有意なパラメータは同じであり、効果サイズの同様の傾向を示した。しかしながら、ｍＡｂとｐＨとの間の相互作用は、３０分のＬＲＦモデルについてのみ有意であったため、例外的であった。ｐＨ条件は、ウイルス不活性化に重要であることが既知であった。しかしながら、モデルは、ＮａＣｌが、１５及び３０分の時点の両方でＸ－ＭｕＬＶ不活性化に最も強い効果を示したことを示した。ＮａＣｌ濃度が増加した場合、イオン強度が不活性化に影響を及ぼさなくなるまで、Ｘ－ＭｕＬＶのＬＲＦは、それに応じて増加した。重要であることが決定された他の因子は、ＮａＣｌ含有量の二次性、ｐＨとＮａＣｌ含有量との間の相互作用、及びｐＨ条件であった。不活性化動態に対するＮａＣｌ濃度の効果は、図６に従って説明することができる。ＮａＣｌ濃度が増加した場合、Ｘ－ＭｕＬＶ不活性化に対するｐＨの影響は減少した。

温度、ｍＡｂ、スパイク後ろ過、酸滴定剤、スパイク法、並びにｐＨとｍＡｂとの間の相互作用の主な効果は全て、線形回帰モデル内で有意であった。しかしながら、これらの因子の効果サイズは、報告された感染性アッセイの可変性（例えば、０．５ＬＲＦ）よりも小さかった。これらの因子は、生成されたモデル内で有意であったが（Ｐ＜０．０５）、効果サイズが感染性アッセイの可変性よりも小さいため、実質的に有意ではなかった。温度の低下は不活性化動態の減少と相関するため、温度はウイルス不活性化に既知の効果を有した。しかしながら、このデータセットは、１５℃～２０℃の範囲の操作による不活性化の最小の差を支持した。

図６に示されるように、１５及び３０分の時点の両方の後に４ＬＲＦ超を達成するようにモデルを最適化するために予測プロファイラを作成した。図６は、Ｄ－最適ＤｏＥにおいて評価された有意な因子の関数としてＸ－ＭｕＬＶ不活性化を表す予測プロファイラを示す。赤色の線は適合線を示し、青色の線は平均線を示し、赤色の影付き線は９５％信頼区間を示し、Ｐはリン酸を示し、ＧはグリシンＨＣｌを示す。他の全ての因子が一定のままである場合、約ｐＨ３．６０～３．９０の範囲のウイルス不活性化の操作でのＮａＣｌの添加を介した導電率の増加が、より大きなレトロウイルスＬＲＦをもたらし得る。

本出願における低ｐＨ保持のための統計的ＤｏＥの試験結果は、ｐＨ３．６０未満での５．０ＬＲＦのＸ－ＭｕＬＶ不活性化のためのＡＳＴＭ標準と一致した。結果はまた、３．６０超のｐＨでの堅牢で効果的な不活性化を実証した。ＡＳＴＭの包括的要求の外側の範囲について、結果は、ＮａＣｌ含有量を増加させることにより、迅速で効果的なＸ－ＭｕＬＶ不活性化を達成し得ることを示した。典型的には、保持のｐＨは、タンパク質の安定性に依存する。本出願のモデルを使用して、低ｐＨ出発材料の導電率を操作することによって、ｐＨ３．６０～３．９０の範囲でウイルス不活性化を操作する場合の有効クリアランスを予測し得る。

２５ｇ／Ｌ超などの高いタンパク質濃度は、Ｘ－ＭｕＬＶ不活性化に負の影響を及ぼすと報告されている（ＡＳＴＭ）。しかしながら、以前のＲｅｇｅｎｅｒｏｎ研究は、不活性化が完了しない場合がある条件下で、より高いタンパク質濃度がＸ－ＭｕＬＶ不活性化動態を潜在的に改善し得ることを実証した。より高い緩衝液濃度、弱酸の滴定、又はより高いタンパク質濃度などのイオン強度が増加した条件は、より高いｐＨでより高いＬＲＦと相関した（Ｃｈｉｎｎｉａｈら）。本出願のデータセットは、同様の濃度を有する２つのモノクローナル抗体を使用したが、データからの結論は、タンパク質濃度の増加が不活性化を増加させるという結論に一致した。所望のｐＨを達成するために必要とされた酸滴定剤の増加により、滴定中により多くのイオンが添加された。その結果、溶液のイオン強度が増加し、この実験は、より大きな不活性化動態を示唆するであろう。

タンパク質濃度の影響と同様に、酸滴定剤についてモデルによって有意差が観察され、グリシンＨＣｌ酸滴定剤（より弱い酸）が、リン酸滴定剤（より強い酸）のより高いＬＲＦ値と相関した。この結論は、効果サイズが０．５ＬＲＦ未満であったため、実質的に有意ではなかった。結果は、溶液中のイオン濃度の増加による不活性化の増加を支持した。以前の研究では、ウイルス不活性化の熱力学による低温でのクリアランスの低下が示された。生成された線形回帰モデルにおいては、温度は統計的に有意であったが、研究範囲（１５～２０℃）内では最小限の効果サイズであった。以前の研究では、１５℃と１６＋℃との間でウイルスの不活性化に対して統計的に有意な差はないと結論づけられている（Ｍａｔｔｉｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｔｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｏｗ－ｐＨ ｖｉｒｕｓ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｖｉｒａｌ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｄａｔａ ｆｒｏｍ ａ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｏｍｐａｎｙ ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｏｎ，ＰＤＡ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７０．３（２０１６）：２９３－２９９）。本出願の実験は、ＡＳＴＭの包括的ウイルスクリアランスの要求並びにｐＨ３．６０超でのレトロウイルスの効果的な不活性化を達成するための溶液の特定を支持した。より高いｐＨでは、溶液のイオン強度を増加させると、ウイルス分散を促進することができる。低導電率溶液では、レトロウイルス糖タンパク質は、潜在的に低ｐＨで凝集し、化学的損傷から自らを保護することができる。５０ｍＭ及び１００ｍＭのＮａＣｌを添加した場合、全てのｐＨ設定点での全ての実行は、３０分後に完全で有効なクリアランスを示した。要約すると、ＡＳＴＭモジュールが要求する外側のｐＨで実験が操作される場合、効果的なＸ－ＭｕＬＶ不活性化のために操作スペースが定義され得る。

実施例５．既存及び再計画された操作条件を評価する
統計的実験計画法（ＤｏＥ）を使用して、タンパク質の種類、ｐＨ条件、温度、酸滴定剤、ＮａＣｌ含有量、スパイクタイミング、及びスパイク後ろ過などのいくつかの因子の評価を含む、ウイルス不活性化のための低ｐＨ保持ステップの効果を評価し、特徴付けた。低ｐＨ保持ステップについてのＤｏＥを使用して、低ｐＨ保持について、ｐＨ３．７０～３．７５でのいくつかの既存の操作条件を評価した。図７に示すように、パラメータ推定値を含む予測されたプロファイラを生成した。

低ｐＨ保持ステップについてのＤｏＥを使用して、低ｐＨ保持について、ｐＨ３．６５～３．７０でのいくつかの既存の操作条件も評価した。図８に示すように、パラメータ推定値を含む予測されたプロファイラを生成した。約ｐＨ３．６５～３．７０での再計画された操作条件は、１．５％の失敗率での３０分間の時点で、４ＬＲＦのＸ－ＭｕＬＶのクリアランスを満たすことができなかった。

実施例６．タンパク質の種類の因子を評価する
統計的ＤｏＥを使用して、タンパク質の種類、ｐＨ条件、温度、酸滴定剤、ＮａＣｌ含有量、スパイクタイミング、及びスパイク後ろ過などのいくつかの因子の評価を含む、ウイルス（Ｘ－ＭｕＬＶ）不活性化のための低ｐＨ保持ステップの効果を評価し、特徴付けた。図９に示されるように、モノクローナル抗体のアイソタイプなどのタンパク質の種類の多変量モデルの予測において、ＤｏＥは統計的有意性を示したが、ＩｇＧ１及びＩｇＧ４などのタンパク質の種類間の差は、研究範囲において有意ではなかった。図９は、ＮａＣｌ、ｐＨ、酸滴定剤、温度、タンパク質の種類（ｍＡｂ、モノクローナル抗体）、スパイクタイミング、及びそれらの組み合わせを含む、評価された因子についてのスケーリングされた推定ＬＲＦを示す。既存の操作条件についての遡及的データは、ＩｇＧ１及びＩｇＧ４などのモノクローナル抗体のアイソタイプ間の有意な差を示した。しかしながら、これらの差は、ｐＨ範囲の操作における差に起因する可能性がある。図９はまた、遡及的データに基づいて、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２を含むタンパク質の種類についての３０分の時点でのＸ－ＭｕＬＶ ＬＲＦを示す。

実施例７．温度の因子を評価する
統計的ＤｏＥを使用して、タンパク質の種類、ｐＨ条件、温度、酸滴定剤、ＮａＣｌ含有量、スパイクタイミング、及びスパイク後ろ過などのいくつかの因子の評価を含む、ウイルス（Ｘ－ＭｕＬＶ）不活性化のための低ｐＨ保持ステップの効果を評価し、特徴付けた。図１０に示されるように、ＤｏＥは、温度についての多変量モデルの予測において統計的有意性を示したが、種々の温度条件間の差は、研究範囲におけるＸ－ＭｕＬＶクリアランスに対して最小限の効果である。図１０は、ＮａＣｌ、ｐＨ、酸滴定剤、温度、タンパク質の種類（ｍＡｂ、モノクローナル抗体）、スパイクタイミング、及びそれらの組み合わせを含む、評価された因子についてのスケーリングされた推定ＬＲＦを示す。１５℃～２０℃の範囲での産業操作条件からの遡及的データ（Ｍａｔｔｉｌａら）では、１５±１℃と１６＋℃との間に統計的に有意な差は示されなかった。図１０はまた、遡及的産業データに基づいて、種々の温度条件のレトロウイルスＬＲＦを示す。

実施例８．スパイクタイミングの因子を評価する
統計的ＤｏＥを使用して、タンパク質の種類、ｐＨ条件、温度、酸滴定剤、ＮａＣｌ含有量、スパイクタイミング、及びスパイク後ろ過などのいくつかの因子の評価を含む、ウイルス（Ｘ－ＭｕＬＶ）不活性化のための低ｐＨ保持ステップの効果を評価し、特徴付けた。本出願の統計的なＤｏＥにおけるスパイクタイミングは、調整スパイク再調整方法又はスパイク調整方法である。調整スパイク再調整方法では、試料を標的ｐＨに調整／滴定し、次いでｐＨ７．２を有するウイルスストックでスパイクする。ｐＨ保持のタイミングは、スパイク時に開始された。スパイクウイルスストック後のｐＨ増加の観察により、試料のｐＨを標的ｐＨに再調整した後、ｐＨ保持の残りの期間、所望の温度で保持される。スパイク調整方法では、最初に試料をウイルスストック溶液でスパイクし、次いで標的ｐＨに調整／滴定する。標的ｐＨに達すると、ｐＨ保持のタイミングを開始し、試料を所望の温度でインキュベーションする。

図１１に示されるように、２つの異なる方法についてのスパイクタイミングの差は、研究範囲におけるＸ－ＭｕＬＶクリアランスに対して有意な差はない。図１１は、ＮａＣｌ、ｐＨ、酸滴定剤、温度、タンパク質の種類（ｍＡｂ、モノクローナル抗体）、スパイクタイミング、及びそれらの組み合わせを含む、評価された因子についてのスケーリングされた推定ＬＲＦを示す。図１１はまた、２つの方法のスパイク調整時間を示す。

Claims (26)

1. ペプチド又はタンパク質およびウイルス粒子を含む試料を精製するための方法であって、
   前記方法が、
   前記試料を、塩化ナトリウムの添加によってイオン強度条件に供する工程であって、該塩化ナトリウムの濃度が、５０ｍＭ～１００ｍＭの範囲にある、工程と、
   前記試料を、３．６５～３．８の範囲の酸性ｐＨ条件に供する工程と、
   続いて、前記試料を、前記イオン強度条件及び前記酸性ｐＨ条件で少なくとも１５分間維持して、ある量のウイルス粒子を不活性化する工程と
   を含み、
   前記ウイルス粒子が、レトロウイルスを含み、前記ペプチド又はタンパク質が、抗体、抗体断片、抗体のＦａｂ領域、抗体－薬物コンジュゲート、または融合タンパク質を含む、
   方法。
2. 不活性化された前記ウイルス粒子の量が、少なくとも３ＬＲＦ（対数減少率）に相当する、請求項１に記載の方法。
3. 不活性化された前記ウイルス粒子の量が、少なくとも４ＬＲＦ（対数減少率）に相当する、請求項１に記載の方法。
4. 前記ペプチド又はタンパク質が、宿主細胞において作製された抗体である、請求項１に記載の方法。
5. 前記試料が、前記量のウイルス粒子を不活性化するために、少なくとも３０分間、前記イオン強度条件及び前記酸性ｐＨ条件に維持される、請求項１に記載の方法。
6. 前記試料が、前記量のウイルス粒子を不活性化するために、１５分間～３０分間、前記イオン強度条件及び前記酸性ｐＨ条件に維持される、請求項１に記載の方法。
7. Ｄ－最適実験計画法を実行することによって、前記量のウイルス粒子の不活性化のために前記試料の前記イオン強度条件及び前記酸性ｐＨ条件を最適化する工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
8. 前記Ｄ－最適実験計画法が、前記試料の前記酸性ｐＨ条件及び前記試料の前記イオン強度条件を評価し、かつ前記試料の前記酸性ｐＨ条件及び前記試料の前記イオン強度条件を調整して、前記量のウイルス粒子を不活性化する、請求項７に記載の方法。
9. 前記Ｄ－最適実験計画法が、
   前記試料の導電率、
   前記ペプチド若しくはタンパク質の種類、
   前記試料の温度、
   前記試料の前記酸性ｐＨ条件を調整するための酸滴定剤、
   前記ウイルス粒子を前記試料にスパイクするための方法、又は
   スパイク後ろ過の存在
   のうちの１つ以上を、更に評価及び調整する、請求項８に記載の方法。
10. 前記試料が、プロテインＡクロマトグラフィーからの溶出液である、請求項１に記載の方法。
11. 前記塩化ナトリウムの濃度が、５０ｍＭである、請求項１に記載の方法。
12. 前記塩化ナトリウムの前記濃度が、１００ｍＭである、請求項１に記載の方法。
13. 前記試料の前記酸性ｐＨ条件が、リン酸又はグリシンＨＣｌを使用して調整される、請求項１に記載の方法。
14. 前記ペプチド又はタンパク質が、ＩｇＧ１アイソタイプを有するか又はＩｇＧ４アイソタイプを有する抗体である、請求項１に記載の方法。
15. 前記ペプチド又はタンパク質が、モノクローナル抗体又は二重特異性抗体である、請求項１に記載の方法。
16. 目的のタンパク質及びウイルス粒子を有する試料から、前記目的のタンパク質及び減少した量のウイルス粒子を含む調製物を作製する方法であって、該方法が、
    前記試料を、３．６５～３．８の範囲のｐＨに供する工程と、
    前記試料を、該試料への塩化ナトリウムの添加によって、イオン強度条件の増加に供する工程であって、該塩化ナトリウムの濃度が、５０ｍＭ～１００ｍＭの範囲にある、工程と、
    前記試料を、３．６５～３．８の範囲の前記ｐＨ及び前記イオン強度条件で適切な期間維持して、前記目的のタンパク質及び前記減少した量のウイルス粒子を含む前記調製物を作製する工程と
    を含み、
    前記ウイルス粒子が、レトロウイルスを含む、
    方法。
17. 前記試料における前記目的のタンパク質の濃度が、２５ｇ／Ｌ超である、請求項１６に記載の方法。
18. 前記適切な期間が、１５分、２０分、２５分、又は３０分である、請求項１６に記載の方法。
19. 前記試料中のウイルス粒子の量を３ＬＲＦ（対数減少率）で減少させる、請求項１６に記載の方法。
20. 前記試料中のウイルス粒子の量を４ＬＲＦ（対数減少率）で減少させる、請求項１６に記載の方法。
21. 前記試料が、プロテインＡクロマトグラフィーからの溶出液である、請求項１６に記載の方法。
22. 前記塩化ナトリウムの濃度が、５０ｍＭである、請求項１６に記載の方法。
23. 前記試料の前記ｐＨが、リン酸又はグリシンＨＣｌを使用して調整される、請求項１６に記載の方法。
24. 前記目的のタンパク質が、ＩｇＧ１アイソタイプを有するか又はＩｇＧ４アイソタイプを有する抗体である、請求項１６に記載の方法。
25. 前記試料を、３．６５～３．８の範囲の前記ｐＨに供する工程が、０．２５Ｍのリン酸又はグリシンＨＣｌの濃度を導入する工程を含む、請求項１６に記載の方法。
26. 前記試料を、前記酸性ｐＨ条件に供する工程が、０．２５Ｍのリン酸又はグリシンＨＣｌの濃度を導入する工程を含む、請求項１に記載の方法。