BR122023012686B1 - Métodos de produção de aflibercepte - Google Patents

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BR122023012686B1
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mqd
aflibercept
protein
vegf
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BR122023012686-6A
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Inventor
Shawn Lawrence
Amy Johnson
Meghan Casey
Jaimie Mastrogiacomo
Shunhai Wang
Ning Li
Original Assignee
Regeneron Pharmaceuticals, Inc
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Abstract

A presente invenção refere-se às composições que compreendem proteínas anti-VEGF e métodos para a produção de tais composições.

Description

Dividido do BR112021025769-1, depositado em 18.08.2020. REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[001] Este pedido reivindica prioridade a e o benefício de Pedido de Patente Provisional Norte-americano N°. 63/065,012, depositado em 13 de agosto de 2020, o teor dos quais é incorporado aqui por referência em sua totalidade. Este pedido também reivindica prioridade para, e o benefício de Pedido de Patente Provisional N°. 62/944,635, depositado em 6 de dezembro de 2019.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIA
[002] O presente pedido contém uma Listagem de Sequência que foi depositada eletronicamente em formato ASCII e é pelo qual incorporado por referência em sua íntegra. A referida cópia ASCII, criada em 26 de agosto de 2021, é denominada 070816-02259_SL.txt e e de 148.919 bytes de tamanho.
CAMPO
[003] A presente invenção geralmente refere-se às composições anti-VEGF e métodos para produzir as mesmas.
ANTECEDENTES
[004] Composições biofarmacêuticas com base em proteína têm se destacado como importantes produtos para pesquisa, o tratamento de doenças oftalmológicas, câncer, doença autoimune, e infecção, bem como, outras doenças e distúrbios. Biofarmacêuticos representam um dos segmentos de produtos de crescimento mais rápido da indústria farmacêutica.
[005] Uma classe de mitógenos diméricos derivados de células com seletividade para células endoteliais vasculares foi identificada e designada fator de crescimento de células endoteliais vasculares (VEGF).
[006] A angiogênese persistente pode causar ou agravar certas doenças, como psoríase, artrite reumatoide, hemangiomas, angiofibromas, retinopatia diabética e glaucoma neovascular. Um inibidor da atividade do VEGF seria útil como tratamento para essas doenças e outras condições de angiogênese patológica e permeabilidade vascular induzidas por VEGF, como a vascularização do tumor. As angiopoietinas e membros da família do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) são os únicos fatores de crescimento considerados amplamente específicos para células endoteliais vasculares.
[007] Vários distúrbios oculares estão associados à angiogênese patológica. Por exemplo, o desenvolvimento de degeneração macular relacionada à idade (AMD) está associado a um processo denominado neovascularização coroidal (CNV). O vazamento da CNV causa edema macular e acúmulo de fluido abaixo da mácula, resultando em perda de visão. O edema macular diabético (DME) é outro distúrbio ocular com um componente angiogênico. DME é a causa mais prevalente de perda moderada de visão em pacientes com diabetes e é uma complicação comum da retinopatia diabética, uma doença que afeta os vasos sanguíneos da retina. O DME clinicamente significante ocorre quando o fluido vaza para o centro da mácula, a parte da retina sensível à luz responsável pela visão nítida e direta. O fluido na mácula pode causar perda severa de visão ou cegueira.
[008] Vários inibidores de VEGF, como a armadilha de VEGF EYLEA® (aflibercepte), foram aprovados para tratar esses distúrbios oculares.
SUMÁRIO
[009] A presente invenção refere-se a proteínas anti-VEGF, incluindo a proteína armadilha de VEGF aflibercepte, que é uma proteína de fusão. A presente invenção também pertence a uma nova proteína anti-VEGF, a aflibercepte MiniTrap ou MiniTrap de VEGF (coletivamente referida como MiniTrap, a menos que de outro modo notado). Descritos aqui são métodos de preparar estas proteínas anti- VEGF, incluindo modalidades de produção que fornecem meios eficientes e eficazes para produzir as proteínas de interesse. Em um aspecto, a presente invenção é direcionada ao uso de meios quimicamente definidos (MQD) para produzir proteínas anti-VEGF. Em um aspecto particular, os MQDs de interesse são aqueles que, quando utilizados, produzem uma amostra de proteína em que a amostra tem cor amarelo-marrom e podem compreender espécies oxidadas. Ainda mais no presente pedido, variantes proteicas de aflibercepte e MiniTrap de VEGF são descritas juntamente com métodos de produção concomitantes.
Produção de Aflibercepte
[0010] A presente invenção descreve uma produção de aflibercepte usando um meio de cultura celular. Em uma modalidade, o meio de cultura celular é um meio quimicamente definido ("MQD"). O MQD é frequentemente utilizado porque é uma fórmula quimicamente definida sem proteínas e que não utiliza componentes de origem animal e há certeza quanto à composição do meio. Em outra modalidade, o meio de cultura celular é um meio de hidrolisado de soja.
[0011] Em uma modalidade, um método de produzir uma proteína recombinante compreende: (a) fornecer uma célula hospedeira geneticamente modificada para expressar uma proteína recombinante de interesse; (b) cultivar a célula hospedeira em um MQD sob condições adequadas em que a célula expressa a proteína recombinante de interesse; e (c) colheita de uma preparação da proteína recombinante de interesse produzida pela célula. Em um aspecto, a proteína recombinante de interesse é uma proteína anti-VEGF. Em um aspecto particular, a proteína anti-VEGF é selecionada do grupo consistindo em aflibercepte e MiniTrap recombinante (exemplos dos quais são descritos em Patente Norte Americana N°. 7.279.159), um aflibercepte scFv e outras proteínas anti-VEGF. Em um aspecto preferido, a proteína recombinante de interesse é aflibercepte.
[0012] Em um aspecto da presente modalidade, aflibercepte é expresso em uma célula hospedeira adequada. Exemplos não limitantes de tais células hospedeiras incluem, mas não são limitados a, CHO, CHO K1, EESYR®, NICE®, NS0, Sp2/0, células renais embrionárias e BHK.
[0013] Adequados MQDs incluem meio de Eagle modificado por Dulbecco (DME), mistura de nutriente de Ham, meio Excell, e meio IS CHO-CD. Outros MQDs conhecidos por aqueles versados na técnica são contemplados estarem dentro do escopo da presente invenção. Em um aspecto particular, o adequado MQD é MQD1B (Regeneron) ou meio Excell avançado (SAFC).
[0014] Em uma modalidade, uma amostra de colheita clarificada de uma cultura de MQD compreendendo aflibercepte é submetida a um procedimento de cromatografia de captura. Em um aspecto, a etapa de captura é um procedimento de cromatografia de afinidade usando, por exemplo, Proteína A. Em um outro aspecto, o eluato de procedimento de afinidade exibe uma certa cor, por exemplo, o eluato pode exibir uma cor amarela-marrom. Conforme descrito em mais detalhes infra, a cor pode ser avaliada usando (i) o Padrão Europeu de Cor "BY" em que uma inspeção visual qualitativa é feita ou (ii) um ensaio colorimétrico, CIEL *, a*, b* (ou CIELAB), que é mais quantitativo do que o sistema BY. No entanto, em ambos os casos, a avaliação da cor entre várias amostras deve ser normalizada em relação à concentração de proteína para garantir uma avaliação significativa. Por exemplo, referindo-se ao Exemplo 9 abaixo, um eluato de proteína A tem um valor "b*" de cerca de 2,52 que corresponde a um valor BY de aproximadamente BY5 (quando medido a uma concentração de 5 g/L de proteína em um eluato de proteína A). Se a cor de um eluato de proteína A for comparada com outra amostra, a comparação deve ser feita com a mesma concentração de proteína. O valor b* no espaço de cor CIELAB é usado para expressar a coloração das amostras e cobre o azul (-) para o amarelo (+). Um valor de b* maior de uma amostra comparado a outro indica uma coloração amarelo-marrom mais intensa na amostra comparada com a outra.
[0015] Em uma modalidade, aflibercepte é produzido de uma célula hospedeira geneticamente modificada para expressar aflibercepte usando MQD. Em um aspecto, outras espécies ou variantes de aflibercepte também são produzidas. Essas variantes incluem isoformas de aflibercepte que compreendem um ou mais resíduos de aminoácidos oxidados denominados coletivamente como oxovariantes. Uma amostra de colheita clarificada produzida usando MQD compreendendo aflibercepte, bem como, suas oxovariantes pode ser submetida a um procedimento de cromatografia de captura. Em um aspecto, a etapa de captura é um procedimento de cromatografia de afinidade usando, por exemplo, uma coluna de Proteína A. Quando uma amostra extraída de um eluato de afinidade, que pode ou não manifestar uma cor amarela- marrom, é analisada usando, por exemplo, cromatografia líquida - espectrometria de massa (LC-MS), um ou mais variantes oxidadas de aflibercepte podem ser detectadas. Certos resíduos de aminoácidos de um aflibercepte modificado são mostrados como oxidados, incluindo, porém, não limitados a resíduos de histidina e/ou triptofano. Em um aspecto, as variantes podem incluir a oxidação de um ou mais resíduos de metionina, bem como, de outros resíduos, veja infra.
[0016] Em outro aspecto, as variantes podem incluir oxidação de um ou mais resíduos de triptofano para formar N-formilquinurenina. Em um outro aspecto, as variantes podem incluir oxidação de um ou mais resíduos de triptofano para formar mono-hidroxil triptofano. Em um aspecto particular, as variantes de proteína podem incluir oxidação de um ou mais resíduos de triptofano para formar di-hidroxil triptofano. Em um aspecto particular, as variantes de proteína podem incluir oxidação de um ou mais resíduos de triptofano para formar tri-hidroxil triptofano.
[0017] Em outro aspecto, as variantes podem incluir uma ou mais modificações selecionadas do grupo consistindo em: desamidação de, por exemplo, uma ou mais asparaginas; um ou mais ácidos aspárticos convertidos em iso-aspartato e/ou Asn; oxidação de uma ou mais metioninas; oxidação de um ou mais triptofanos para N- formilquinurenina; oxidação de um ou mais triptofanos para mono- hidroxil triptofano; oxidação de um ou mais triptofanos para di-hidroxil triptofano; oxidação de um ou mais triptofanos para tri-hidroxil triptofano; Arg 3-deoxiglucosonação de uma ou mais argininas; remoção de glicina C-terminal; e presença de um ou mais glicosítios não glicosilados.
[0018] Em outra modalidade, a invenção é direcionada a métodos para produzir aflibercepte. Em um aspecto, uma amostra de colheita clarificada compreendendo aflibercepte e suas variantes são submetidas a uma etapa de captura, tal como, cromatografia de afinidade de Proteína A. Após a etapa de afinidade, um eluato de afinidade pode ser submetido a uma cromatografia de troca de íon. A cromatografia de troca de íon pode ser cromatografia de troca catiônica ou aniônica. São contemplados estarem dentro do escopo da presente modalidade é a cromatografia de modo misto ou multimodal, bem como, outros procedimentos cromatográficos que são descritos mais adiante. Em um aspecto particular, a cromatografia de troca de íon é a cromatografia de troca aniônica (AEX). As condições adequadas para o emprego de AEX incluem, porém, não são limitadas a cloridrato de Tris a um pH de cerca de 8,3 a cerca de 8,6. Após o equilíbrio utilizando, por exemplo, cloridrato de Tris a um pH de cerca de 8,3 a cerca de 8,6, a coluna AEX é carregada com a amostra. Após o carregamento da coluna, a coluna pode ser lavada uma ou mais vezes utilizando, por exemplo, o tampão de equilíbrio. Em um aspecto particular, as condições utilizadas podem facilitar o comportamento cromatográfico diferencial do aflibercepte e suas variantes oxidadas de tal forma que uma fração compreendendo quantidades significativas ausentes de aflibercepte de oxovariantes possa ser coletada em uma fração de fluxo direto enquanto uma porção significativa das oxovariantes é retida na fase sólida da coluna AEX e pode ser obtida ao remover a coluna - veja Exemplo 2 abaixo, FIGURA 11. Com referência à FIGURA 11 e Exemplo 2, alterações nas oxovariantes podem ser observadas entre as diferentes etapas de produção. Por exemplo, esta mudança pode ser ilustrada pelos dados da seção "Nível de Oxidação de Triptofano (%)", especificamente, a coluna "W138 (+16)". Aí pode ser observado que as oxovariantes (especificamente, oxotriptofano) passaram de cerca de 0,131% em uma amostra de carga a cerca de 0,070% em um fluxo através da amostra após cromatografia de AEX (separação de AEX 2), indicando que houve uma redução em oxovariantes de aflibercepte usando AEX.
[0019] O uso de troca iônica pode ser usado para atenuar ou minimizar a cor. Em um aspecto da presente modalidade, uma amostra de colheita clarificada é submetida à cromatografia de captura, por exemplo, usando cromatografia de afinidade de Proteína A. A coluna de afinidade é eluída e tem uma primeira cor com um determinado valor BY e/ou b* atribuído a ela. Este eluato da Proteína A é então submetido a uma cromatografia de troca iônica, tal como, cromatografia troca aniônica (AEX). A coluna de troca de íon é lavada e o fluxo direto é coletado e tem uma segunda cor tendo um valor BY e/ou b* particular atribuído a ela. Em um aspecto particular, o valor da cor ("BY" ou "b*") da primeira cor difere da segunda cor. Em um outro aspecto, a primeira cor de um eluato de proteína A tem uma cor mais amarelada do que a segunda cor do fluxo direto de AEX como refletido pelo respectivo valor de BY e/ou b*. Normalmente, há uma redução na cor amarelo-marrom da segunda cor após AEX quando comparada à primeira cor de um eluato de proteína A. Por exemplo, o uso de troca aniônica reduziu a cor amarelo-marrom observada em uma amostra de eluato de Proteína A de valor b* de cerca de 3,06 (primeira cor) a cerca de 0,96 (segunda cor) após AEX - veja Exemplo 2, Tabela 2- 3 abaixo.
[0020] Em um aspecto da modalidade, o pH de ambos os tampões de equilíbrio e lavagem para a coluna AEX pode ser de cerca de 8,30 a cerca de 8,60. Em outro aspecto, a condutividade de ambos os tampões de equilíbrio e lavagem para a coluna AEX pode ser de cerca de 1,50 a cerca de 3,00 mS/cm.
[0021] Em um aspecto da modalidade, os tampões de equilíbrio e lavagem podem ser cerca de cloridrato de Tris a 50 mM. Em um aspecto, o tampão de tira compreende cloreto de sódio a 2 M ou hidróxido de sódio a 1 N ou ambos (veja Tabela 2-2).
[0022] A presente modalidade pode incluir a adição de uma ou mais etapas, em nenhuma ordem particular, tais como, cromatografia de interação hidrofóbica (HIC), cromatografia de afinidade, cromatografia multimodal, inativação viral (por exemplo, usando pH baixo), filtração viral, e/ou ultra/diafiltração, bem como, outras etapas cromatográficas bem conhecidas.
[0023] Em uma modalidade, a proteína anti-VEGF é glicosilada em uma ou mais asparaginas como segue: glicosilação de G0-GlcNAc; glicosilação de G1-GlcNAc; glicosilação de G1S-GlcNAc; glicosilação de G0; glicosilação de G1; glicosilação de G1S; glicosilação de G2; glicosilação de G2S; glicosilação de G2S2; glicosilação de G0F; glicosilação de G2F2S; glicosilação de G2F2S2; glicosilação de GIF; glicosilação de G1FS; glicosilação de G2F; glicosilação de G2FS; glicosilação de G2FS2; glicosilação de G3FS; glicosilação de G3FS3; glicosilação de G0-2GlcNAc; glicosilação de Man4; glicosilação de Man4_A1G1; glicosilação de Man4_A1G1S1; glicosilação de Man5; glicosilação de Man5_A1G1; glicosilação de Man5_A1G1S1; glicosilação de Man6;glicosilação de Man6_G0+fosfato; glicosilação de Man6+fosfato; e/ou glicosilação de Man7. Em um aspecto, a proteína anti-VEGF pode ser aflibercepte, anticorpo anti-VEGF ou MiniTrap de VEGF.
[0024] Em um aspecto, glicosilação de perfil de uma composição de uma proteína anti-VEGF é como segue: cerca de 40% a cerca de 50% de glicanos fucosilados totais, cerca de 30% a cerca de 55% de glicanos sialilados totais, cerca de 6% a cerca de 15% de manose-5, e cerca de 60% a cerca de 79% de glicanos galactosilados (veja Exemplo 6). Em um aspecto, a proteína anti-VEGF tem glicosilação de Man5 a cerca de 32,4% de 123 resíduos de asparagina e/ou cerca de 27,1% de 196 resíduos de asparagina.
[0025] Em uma modalidade, o processo pode também compreender formulação de uma substância de fármaco usando um excipiente farmaceuticamente aceitável. Em um aspecto da modalidade, o excipiente farmaceuticamente aceitável pode ser selecionado dos seguintes: água, agentes de tamponamento, açúcar, sal, tensoativo, aminoácido, poliol, agente quelante, emulsificante e conservante. Outros excipientes bem conhecidos ao técnico versado estão dentro do alcance desta modalidade.
[0026] Em um aspecto da modalidade, a formulação pode ser adequada para administração a um indivíduo humano. Em particular, administração pode ser efetuada por injeção intravítrea. Em um aspecto, a formulação pode ter cerca de 40 a cerca de 200 mg/mL da proteína de interesse.
[0027] A formulação pode ser usada como um método de tratar ou prevenir distúrbios de olho angiogênico que podem incluir: degeneração macular relacionada à idade (por exemplo, seca ou úmida), edema macular, edema macular após oclusão de veia retiniana, oclusão de veia retiniana (RVO), oclusão de veia retiniana central (CRVO), oclusão de veia retiniana filial (BRVO), edema macular diabético (DME), neovascularização cloroidal (CNV), neovascularização de íris, glaucoma neovascular, fibrose pós cirúrgica em glaucoma, vitreoretinopatia proliferativa (PVR), neovascularização do disco óptico, neovascularização da córnea, neovascularização retiniana, neovascularização vítrea, pannus, pterígio, retinopatia vascular, retinopatia diabética em um indivíduo com edema macular diabético; ou retinopatias diabéticas (por exemplo, retinopatia diabética não proliferativa (por exemplo, caracterizado por um nível de Escala de Gravidade de Retinopatia Diabética (DRSS) de cerca de 47 ou 53) ou retinopatia diabética proliferativa; por exemplo, em um indivíduo que não sofre de DME).
Produção de MiniTrap de VEGF
[0028] A presente invenção descreve a produção de uma versão modificada de aflibercepte em que a porção de Fc é removida ou ausente e é referida como aflibercepte MiniTrap ou MiniTrap de VEGF. Esta MiniTrap pode ser produzida em meio de cultura celular incluindo um meio quimicamente definido (MQD) ou meio de hidrolisado de soja.
[0029] Em uma modalidade, a MiniTrap é produzida usando MQD.Em um aspecto de produção de MiniTrap, aflibercepte de tamanho natural é produzido usando um hospedeiro adequado e sob condições adequadas e é também processado através do qual a porção de Fc é enzimaticamente removida produzindo desse modo MiniTrap. Alternativamente, um gene que codifica MiniTrap (por exemplo, uma sequência de nucleotídeos que codifica aflibercepte na ausência de sua porção Fc) pode ser produzido sob condições adequadas usando uma célula hospedeira adequada.
[0030] Em uma modalidade, um método para fabricar MiniTrap inclui produção de uma proteína de fusão de aflibercepte de tamanho natural seguida pela clivagem da região Fc. Em um aspecto, o método envolve produção de uma proteína recombinante, nomeadamente uma proteína de fusão de aflibercepte de tamanho natural (veja patente Norte Americana N°. 7.279.159, todo o ensinamento do qual é aqui incorporado por referência), compreendendo: (a) fornecer uma célula hospedeira geneticamente modificada para expressar aflibercepte de tamanho natural; (b) cultivar a célula hospedeira em MQD sob condições adequadas em que a célula expressa o aflibercepte de tamanho natural; (c) colheita de uma preparação do aflibercepte de tamanho natural produzido pela célula; e (d) submeter o aflibercepte de tamanho natural à clivagem enzimática específica para a remoção da porção de Fc da proteína de fusão. Em outro aspecto, uma sequência de nucleotídeo que codifica aflibercepte menos sua porção de Fc é expressa de uma célula hospedeira adequada sob condições adequadas bem conhecidas por aqueles versados na técnica (veja Patente Norte Americana N°. 7.279.159).
[0031] Em um aspecto da presente modalidade, o aflibercepte é expresso em uma célula hospedeira adequada. Exemplos não limitantes de tais células hospedeiras incluem, porém, não são limitados a, CHO, CHO K1, EESYR®, NICE®, NS0, Sp2/0, células renais embrionárias e BHK.
[0032] MQDs adequados incluem meio de Eagle modificado por Dulbecco (DME), mistura de nutriente de Ham, meio de EX-CELL (SAFC), e meio IS CHO-CD (Irvine). Outros MQDs conhecidos por aqueles versados na técnica são contemplados estarem dentro do escopo da presente invenção. Em um aspecto particular, o MQD adequado é MQD1B (Regeneron) ou meio Excell (SAFC).
[0033] Em um aspecto, durante a produção de MiniTrap, uma amostra compreendendo uma proteína de interesse (isto é, proteína de fusão de aflibercepte e/ou MiniTrap) juntamente com suas variantes (incluindo oxovariantes) podem exibir certas propriedades de cor - uma cor amarela-marrom. Por exemplo, uma amostra de eluato de uma etapa de cromatografia de afinidade pode exibir uma determinada cor amarelo-marrom medida usando o sistema BY e/ou b* (veja os Exemplos 2 e 9 abaixo). Fontes exemplares para uma "amostra" podem incluir uma cromatografia de afinidade, tal como, eluato de proteína A; uma amostra pode ser obtida de uma fração de fluxo direto por procedimento de cromatografia de troca de íon; também pode ser obtida da tira de uma coluna de troca de íon - há outras fontes durante um processo de produção bem conhecidas por aqueles versados na técnica a partir das quais uma amostra pode ser analisada. Conforme mencionado acima e descrito mais abaixo, a cor pode ser avaliada usando (i) o Padrão Europeu de Cor "BY" em que uma inspeção visual qualitativa é feita ou (ii) um ensaio colorimétrico, CIELAB, que é mais quantitativo do que o sistema BY. No entanto, em ambos os casos, a avaliação da cor entre várias amostras deve ser normalizada, por exemplo, usando a concentração de proteína, a fim de garantir uma avaliação significativa entre as amostras.
[0034] Em um aspecto da presente modalidade, uma proteína de fusão de aflibercepte de tamanho natural pode ser submetida a um processamento enzimático ("atividade de clivagem") para gerar um MiniTrap de VEGF, por exemplo, utilizando digestão proteolítica utilizando uma protease ou variante enzimaticamente ativa da mesma. Em um aspecto desta modalidade, a protease pode ser uma enzima degradadora de imunoglobulinas de Streptococcus pyogenes (IdeS). Em outro aspecto, a protease pode ser trombina tripsina, endoproteinase Arg-C, endoproteinase Asp-N, endoproteinase Glu-C, protease T da membrana externa (OmpT), IdeS, quimiotripsina, pepsina, termolisina, papaína, pronase ou protease de Aspergillus saitoi. Em um aspecto, a protease pode ser uma cisteína protease. Em um aspecto particular da modalidade, a protease pode ser IdeS. Em outro aspecto, a protease pode ser uma variante do IdeS. Exemplos não limitantes de variantes de IdeS são descritos infra e incluem um polipeptídeo possuindo uma sequência de aminoácidos como estabelecido no grupo consistindo em SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 16. Em um aspecto, a protease pode ser imobilizada sobre agarose ou outra matriz adequada.
[0035] Em um aspecto, uma proteína de interesse (juntamente com suas variantes) é produzida usando MQD. Em um aspecto particular, a proteína de interesse inclui aflibercepte ou MiniTrap. As variantes compreendem um ou mais resíduos de aminoácido oxidados, coletivamente oxovariantes. Exemplos de resíduos oxidados incluem, porém, não são limitados a um ou mais resíduos de histidina e/ou triptofano. Outros resíduos oxidados foram também detectados usando LC-MS e são descritos abaixo, tal como, metionina oxidada. Subsequente cromatografia, tal como, AEX pode ser usada para isolar estas oxovariantes da proteína de interesse em uma dada amostra e é descrita aqui.
[0036] Em um aspecto, as variantes podem incluir oxidação um ou mais resíduos de triptofano para formar N-formilquinureninas. Em um outro aspecto, as variantes podem incluir oxidação de um ou mais resíduos de triptofano para formar mono-hidroxil triptofano. Em um aspecto particular, as variantes de proteína podem incluir oxidação de um ou mais resíduos de triptofano para formar di-hidroxil triptofano. Em um aspecto particular, as variantes de proteína podem incluir oxidação de um ou mais resíduos de triptofano para formar tri-hidroxil triptofano.
[0037] Em outro aspecto, as oxovariantes podem incluir uma ou mais modificações selecionadas do grupo consistindo em: desamidação de um ou mais resíduos de asparagina; um ou mais ácidos aspárticos convertidos em isoaspartato e/ou Asparagina; oxidação de um ou mais resíduos de metionina; oxidação de um ou mais resíduos de triptofano para formar N-formilquinurenina; oxidação de um ou mais resíduos de triptofano para formar mono-hidroxil triptofano; oxidação de um ou mais resíduos de triptofano para formar di-hidroxil triptofano; oxidação de um ou mais resíduos de triptofano para formar tri-hidroxil triptofano; Arg 3- deoxiglucosonação de um ou mais resíduos de arginina; remoção de glicina C-terminal; e presença de um ou mais glicosítios não glicosilados.
[0038] Em uma modalidade, o método de fabricar uma proteína MiniTrap compreende (a) capturar uma proteína de fusão de aflibercepte de tamanho natural em uma primeira plataforma cromatográfica e (b) clivar o aflibercepte desse modo formando uma proteína MiniTrap, isto é, aflibercepte ausente de seu domínio Fc. Em um aspecto, o primeiro suporte cromatográfico compreende um meio de cromatografia de afinidade, um meio de cromatografia de troca de íon, ou um meio de cromatografia de interação hidrofóbica. Em um aspecto particular, a primeira plataforma cromatográfica compreende uma plataforma de cromatografia de afinidade, tal como, uma proteína A. Em um outro aspecto, a proteína de etapa de captura (a) é eluída da primeira plataforma de cromatografia antes da etapa de clivagem (b).Em um ainda outro aspecto, uma segunda etapa de captura segue etapa de clivagem (b). Em um aspecto particular, esta segunda etapa de captura pode ser facilitada por cromatografia de afinidade, tal como, cromatografia de afinidade de proteína A. O fluxo direto desta segunda etapa de captura (compreendendo MiniTrap) tem uma primeira cor, por exemplo, uma cor amarela-marrom e medido tendo um particular valor de BY e/ou b* - veja, por exemplo, Exemplo 9 abaixo. Adicionalmente, análise de LC-MS deste segundo fluxo direto de captura pode demonstrar a presença de oxovariantes em que um ou mais resíduos de MiniTrap são oxidados (veja Exemplo 9 abaixo).
[0039] Em um outro aspecto, o segundo fluxo direto de captura pode ser submetido a cromatografia de troca de íon, tal como, AEX. Esta coluna de AEX pode ser lavada usando um adequado tampão e uma fração de fluxo direto de AEX pode ser coletada compreendendo essencialmente MiniTrap. Esta fração de fluxo direto de AEX pode ter uma segunda cor que é de uma coloração amarela-marrom tendo um particular valor de BY e/ou b*. Em um outro aspecto, a primeira cor (fluxo direto da segunda etapa de captura) e segunda cor (fluxo direto do procedimento de troca de íon) têm diferentes cores como medido pelo sistema BY e/ou b*. Em um aspecto, a segunda cor demonstra uma cor amarelo-marrom diminuída quando comparada à primeira cor usando um valor de BY e/ou b* após AEX.
[0040] Em outra modalidade, a atividade de clivagem de etapa (b) pode ser realizada usando uma coluna cromatográfica em que a atividade de clivagem, por exemplo, uma atividade de enzima, é afixada ou imobilizada para uma matriz de coluna. A coluna usada na etapa (b) pode compreender uma ou mais das proteases já aludidas a e mais completamente descritas abaixo.
[0041] Em uma modalidade, o procedimento de cromatografia de troca de íon pode compreender um meio de cromatografia de troca de ânion (AEX). Em outro aspecto, o meio de cromatografia de troca de íon compreende um meio de cromatografia de troca de cátion (CEX). Adequadas condições para empregar AEX incluem, porém, não são limitadas a cloridrato de Tris a um pH de cerca de 8,3 a cerca de 8,6. Após equilíbrio usando, por exemplo, cloridrato de Tris a um pH de cerca de 8,3 a cerca de 8,6, a coluna de AEX é carregada com a amostra. Após o carregamento da coluna, a coluna pode ser lavada uma ou múltiplas vezes usando, por exemplo, o tampão de equilíbrio. Em um aspecto particular, as condições usadas podem facilitar o comportamento cromatográfico diferencial de MiniTrap e suas oxovariantes usando AEX de tal modo que a MiniTrap seja substancialmente na fração de fluxo direto enquanto as oxovariantes sejam substancialmente retidas sobre a coluna de AEX e possam ser coletadas descartando a coluna (veja Exemplo 9 abaixo).
[0042] Em um exemplo, as amostras de diferentes estágios de produção foram analisadas quanto à cor e presença de oxovariantes. Referindo-se ao Exemplo 9, o grupo de fluxo direto de afinidade (fluxo direto de uma segunda etapa de afinidade da Proteína A) teve um primeiro valor b* de cerca de 1,58 (veja Tabela 9-3). Este segundo fluxo direto de afinidade foi submetido a AEX. O fluxo direto de AEX teve um segundo valor de b* de cerca de 0,50, indicando uma redução significante na cor amarelo-marrom após o uso de AEX. O descarte da coluna de AEX produziu uma amostra de tira e um terceiro valor de b* de cerca de 6,10 foi observado, indicando que esta amostra de tira tinha uma cor mais amarelo-marrom quando comparada tanto na carga quanto no fluxo direto.
[0043] Referindo-se novamente ao Exemplo 9, a análise de oxovariante também foi realizada. As amostras analisadas foram grupo de fluxo direto de afinidade (segundo eluato de afinidade da Proteína A), fluxo direto de AEX e tira de AEX. Com referência à Tabela 9-5 e Tabela 9-6, as alterações nas oxovariantes podem ser observadas entre as diferentes etapas de produção. Por exemplo, esta alteração pode ser ilustrada pelos dados na seção "Nível de Oxidação de Triptofano (%)", especificamente, a coluna "W58 (+16)". Aí pode ser observado que as oxovariantes (especificamente, oxotriptofano) passaram de cerca de 0,055% em uma amostra de carga a cerca de 0,038% em uma amostra de fluxo direto após cromatografia de AEX, indicando que houve uma redução em oxovariantes após AEX. A tira de AEX foi analisada e a porcentagem de espécies de oxotriptofano foi encontrada em cerca de 0,089%. Quando este valor de tira foi comparado à carga (bem como o fluxo direto), parecia que uma porção significante desta oxovariante foi retida na coluna de AEX.
[0044] A presente modalidade pode incluir a adição de uma ou mais etapas, em nenhuma ordem particular, tal como, cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia de afinidade, cromatografia multimodal, inativação viral (por exemplo, usando pH baixo), filtração viral, e/ou ultra/diafiltração.
[0045] Uma modalidade da presente invenção é direcionada a um método para regenerar a cromatografia de coluna compreendendo uma resina. Em um aspecto da modalidade, a resina tem um agente de hidrolização imobilizado. Em ainda outro aspecto da modalidade, a resina compreende uma enzima de protease imobilizada. Em ainda outro aspecto da modalidade, a resina é uma resina FabRICATOR® ou um mutante da resina. Em um aspecto da modalidade, o método de regenerar uma coluna compreendendo uma resina melhora a eficiência de reação da resina.
[0046] Em um aspecto da modalidade, um método de regenerar uma coluna compreendendo uma resina inclui incubação da resina de coluna com ácido acético. Em um aspecto, a concentração de ácido acético usada é de cerca de 0,1 M a cerca de 2 M. Em um aspecto, a concentração de ácido acético é cerca de 0,5 M. Em um aspecto, a resina é incubada durante pelo menos cerca de 10 minutos. Em outro aspecto, a resina é incubada durante pelo menos cerca de 30 minutos. Em ainda outro aspecto desta modalidade, a resina é incubada durante pelo menos cerca de 50 minutos. Em ainda outro aspecto desta modalidade, a resina é incubada durante pelo menos cerca de 100 minutos. Em ainda outro aspecto desta modalidade, a resina é incubada durante pelo menos cerca de 200 minutos. Em ainda outro aspecto desta modalidade, a resina é incubada durante pelo menos cerca de 300 minutos.
[0047] Opcionalmente, a resina de coluna é também incubada com cloridrato de guanidina (Gu-HCl). Em um aspecto, Gu-HCl sem ácido acético é usado para regenerar a resina de coluna. A concentração de Gu-HCl utilizada é de cerca de 1 N a cerca de 10 N. Em outro aspecto, a concentração de Gu-HCl é cerca de 6 N. Em um outro aspecto, a resina de coluna pode ser incubada durante pelo menos cerca de 10 minutos com os agentes regenerativos (ácido acético, Gu-HCl). Em ainda outro aspecto, a resina é incubada durante pelo menos cerca de 30 minutos. Em ainda outro aspecto, a resina é incubada durante pelo menos cerca de 50 minutos. Em ainda outro aspecto, referida resina é incubada durante pelo menos cerca de 100 minutos.
[0048] Em uma modalidade, a coluna compreendendo uma resina é armazenada em etanol. Em um aspecto, a coluna é armazenada em etanol, em que a porcentagem de etanol é de cerca de 5% v/v a cerca de 20% v/v. Em um aspecto particular, a coluna é armazenada usando 20% v/v de etanol.
[0049] Em uma modalidade, o processo pode também compreender formulação da MiniTrap de VEGF usando um excipiente farmaceuticamente aceitável. Em um aspecto, o excipiente farmaceuticamente aceitável pode ser selecionado dos seguintes: água, agentes de tamponamento, açúcar, sal, tensoativo, aminoácido, poliol, agente quelante, emulsificante e conservante. Outros excipientes bem conhecidos ao técnico versado estão dento do alcance desta modalidade.
[0050] A formulação da presente invenção é adequada para administração a um indivíduo humano. Em um aspecto da presente modalidade, administração pode ser efetuada por injeção intravítrea. Em um aspecto, a formulação pode ter cerca de 40 a cerca de 200 mg/mL da proteína de interesse. Em um aspecto particular, a proteína de interesse é aflibercepte ou aflibercepte MiniTrap.
[0051] A formulação pode ser usada em um método de tratar ou prevenir distúrbios de olho angiogênico que pode incluir: degeneração macular relacionada à idade (por exemplo, seca ou úmida), edema macular, edema macular após oclusão de veia retiniana, oclusão de veia retiniana (RVO), oclusão de veia retiniana central (CRVO), oclusão de veia retiniana filial (BRVO), edema macular diabético (DME), neovascularização cloroidal (CNV), neovascularização de íris, glaucoma neovascular, fibrose pós cirúrgica em glaucoma, vitreoretinopatia proliferativa (PVR), neovascularização do disco óptico, neovascularização da córnea, neovascularização retiniana, neovascularização vítrea, pannus, pterígio, retinopatia vascular, retinopatia diabética em um indivíduo com edema macular diabético; ou retinopatias diabéticas (por exemplo, retinopatia diabética não proliferativa (por exemplo, caracterizada por um nível de Escala de Gravidade de Retinopatia Diabética (DRSS) de cerca de 47 ou 53) ou retinopatia diabética proliferativa; por exemplo, em um indivíduo que não sofre de DME).
Variantes de IdeS
[0052] A presente invenção descreve o uso de IdeS (FabRICATOR) (SEQ ID NO: 1) ou outros polipeptídeos que são variantes de IdeS (SEQ ID NO: 2 a 16) para produzir um MiniTrap de VEGF. IdeS (SEQ ID NO:1) inclui resíduos de asparagina na posição 87, 130, 182 e/ou 274 (mostrados como " N*" negrito e itálico na SEQ ID NO: 1 abaixo). A asparagina nestas posições pode ser mutada para um aminoácido diferente de asparagina para formar variantes de IdeS (e os aminoácidos mutados são mostrados como aminoácidos em itálico e sublinhados): SEQ ID NO: 1 MRKRCYSTSAAVLAAVTLFVLSVDRGVIADSFSANQEIRYSEVTPYHV TSVWTKGVTPPANFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKTF N*GKDDLL CGAATAGNMLHWWFDQNKDQIKRILEEHPEKQKINF N*GEQMFDVK EAIDTKNHQLDSKLFEYFKEKAFPILSTKHLGVFPDHVIDMFIN*GYRL SLTNHGPTPVKEGSKDPRGGIFDAVFTRGDQSKLLTSRHDFKEKNLK EISDLIKKELTEGKALGLSHTYANVRINHVINLWGADFDS N*GNLKAIY VTDSDSNASIGMKKYFVGVNSAGKVAISAKEIKEDNIGAQVLGLFTLS TGQDSWNQTN SEQ ID NO: 2 MRKRCYSTSAAVLAAVTLFVLSVDRGVIADSFSANQEIRYSEVTPYHV TSVWTKGVTPPANFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKTF D GKDDLLC GAATAGNMLHWWFDQNKDQIKRILEEHPEKQKINF N* GEQMFDVKE AIDTKNHQLDSKLFEYFKEKAFPILSTKHLGVFPDHVIDMFIN* GYRLSL TNHGPTPVKEGSKDPRGGIFDAVFTRGDQSKLLTSRHDFKEKNLKEI SDLIKKELTEGKALGLSHTYANVRINHVINLWGADFDS N*GNLKAIYVT DSDSNASIGMKKYFVGVNSAGKVAISAKEIKEDNIGAQVLGLFTLSTG QDSWNQTN SEQ ID NO: 3 MRKRCYSTSAAVLAAVTLFVLSVDRGVIADSFSANQEIRYSEVTPYHV TSVWTKGVTPPANFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKTF N*GKDDLL CGAATAGNMLHWWFDQNKDQIKRILEEHPEKQKINF R GEQMFDVKE AIDTKNHQLDSKLFEYFKEKAFPILSTKHLGVFPDHVIDMFIN* GYRLSL TNHGPTPVKEGSKDPRGGIFDAVFTRGDQSKLLTSRHDFKEKNLKEI SDLIKKELTEGKALGLSHTYANVRINHVINLWGADFDS N*GNLKAIYVT DSDSNASIGMKKYFVGVNSAGKVAISAKEIKEDNIGAQVLGLFTLSTG QDSWNQTN SEQ ID NO: 4 MRKRCYSTSAAVLAAVTLFVLSVDRGVIADSFSANQEIRYSEVTPYHV TSVWTKGVTPPANFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKTF N*GKDDLL CGAATAGNMLHWWFDQNKDQIKRILEEHPEKQKINF N*GEQMFDVK EAIDTKNHQLDSKLFEYFKEKAFPILSTKHLGVFPDHVIDMFIL GYRLS LTNHGPTPVKEGSKDPRGGIFDAVFTRGDQSKLLTSRHDFKEKNLKE ISDLIKKELTEGKALGLSHTYANVRINHVINLWGADFDS N*GNLKAIYVT DSDSNASIGMKKYFVGVNSAGKVAISAKEIKEDNIGAQVLGLFTLSTG QDSWNQTN SEQ ID NO: 5 MRKRCYSTSAAVLAAVTLFVLSVDRGVIADSFSANQEIRYSEVTPYHV TSVWTKGVTPPANFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKTFN*GKDDLL CGAATAGNMLHWWFDQNKDQIKRILEEHPEKQKINFN*GEQMFDVK EAIDTKNHQLDSKLFEYFKEKAFPILSTKHLGVFPDHVIDMFIN*GYRL SLTNHGPTPVKEGSKDPRGGIFDAVFTRGDQSKLLTSRHDFKEKNLK EISDLIKKELTEGKALGLSHTYANVRINHVINLWGADFDSDGNLKAIYV TDSDSNASIGMKKYFVGVNSAGKVAISAKEIKEDNIGAQVLGLFTLST GQDSWNQTN SEQ ID NO: 6 MRKRCYSTSAAVLAAVTLFVLSVDRGVIADSFSANQEIRYSEVTPYHV TSVWTKGVTPPANFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKTFDGKDDLLC GAATAGNMLHWWFDQNKDQIKRILEEHPEKQKINFRGEQMFDVKEAI DTKNHQLDSKLFEYFKEKAFPILSTKHLGVFPDHVIDMFIN*GYRLSLT NHGPTPVKEGSKDPRGGIFDAVFTRGDQSKLLTSRHDFKEKNLKEIS DLIKKELTEGKALGLSHTYANVRINHVINLWGADFDSN*GNLKAIYVTD SDSNASIGMKKYFVGVNSAGKVAISAKEIKEDNIGAQVLGLFTLSTGQ DSWNQTN SEQ ID NO: 7 MRKRCYSTSAAVLAAVTLFVLSVDRGVIADSFSANQEIRYSEVTPYHV TSVWTKGVTPPANFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKTF D GKDDLLC GAATAGNMLHWWFDQNKDQIKRILEEHPEKQKINF N* GEQMFDVKE AIDTKNHQLDSKLFEYFKEKAFPILSTKHLGVFPDHVIDMFIL GYRLSL TNHGPTPVKEGSKDPRGGIFDAVFTRGDQSKLLTSRHDFKEKNLKEI SDLIKKELTEGKALGLSHTYANVRINHVINLWGADFDS N*GNLKAIYVT DSDSNASIGMKKYFVGVNSAGKVAISAKEIKEDNIGAQVLGLFTLSTG QDSWNQTN SEQ ID NO: 8 MRKRCYSTSAAVLAAVTLFVLSVDRGVIADSFSANQEIRYSEVTPYHV TSVWTKGVTPPANFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKTF D GKDDLLC GAATAGNMLHWWFDQNKDQIKRILEEHPEKQKINF N* GEQMFDVKE AIDTKNHQLDSKLFEYFKEKAFPILSTKHLGVFPDHVIDMFIN* GYRLSL TNHGPTPVKEGSKDPRGGIFDAVFTRGDQSKLLTSRHDFKEKNLKEI SDLIKKELTEGKALGLSHTYANVRINHVINLWGADFDS D GNLKAIYVT DSDSNASIGMKKYFVGVNSAGKVAISAKEIKEDNIGAQVLGLFTLSTG QDSWNQTN SEQ ID NO: 9 MRKRCYSTSAAVLAAVTLFVLSVDRGVIADSFSANQEIRYSEVTPYHV TSVWTKGVTPPANFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKTF N* GKDDLL CGAATAGNMLHWWFDQNKDQIKRILEEHPEKQKINF R GEQMFDVKE AIDTKNHQLDSKLFEYFKEKAFPILSTKHLGVFPDHVIDMFIL GYRLSL TNHGPTPVKEGSKDPRGGIFDAVFTRGDQSKLLTSRHDFKEKNLKEI SDLIKKELTEGKALGLSHTYANVRINHVINLWGADFDS N*GNLKAIYVT DSDSNASIGMKKYFVGVNSAGKVAISAKEIKEDNIGAQVLGLFTLSTG QDSWNQTN SEQ ID NO: 10 MRKRCYSTSAAVLAAVTLFVLSVDRGVIADSFSANQEIRYSEVTPYHV TSVWTKGVTPPANFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKTF N*GKDDLL CGAATAGNMLHWWFDQNKDQIKRILEEHPEKQKINF R GEQMFDVKE AIDTKNHQLDSKLFEYFKEKAFPILSTKHLGVFPDHVIDMFIN* GYRLSL TNHGPTPVKEGSKDPRGGIFDAVFTRGDQSKLLTSRHDFKEKNLKEI SDLIKKELTEGKALGLSHTYANVRINHVINLWGADFDS D GNLKAIYVT DSDSNASIGMKKYFVGVNSAGKVAISAKEIKEDNIGAQVLGLFTLSTG QDSWNQTN SEQ ID NO: 11 MRKRCYSTSAAVLAAVTLFVLSVDRGVIADSFSANQEIRYSEVTPYHV TSVWTKGVTPPANFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKTF N*GKDDLL CGAATAGNMLHWWFDQNKDQIKRILEEHPEKQKINF N*GEQMFDVK EAIDTKNHQLDSKLFEYFKEKAFPILSTKHLGVFPDHVIDMFIL GYRLS LTNHGPTPVKEGSKDPRGGIFDAVFTRGDQSKLLTSRHDFKEKNLKE ISDLIKKELTEGKALGLSHTYANVRINHVINLWGADFDS D GNLKAIYVT DSDSNASIGMKKYFVGVNSAGKVAISAKEIKEDNIGAQVLGLFTLSTG QDSWNQTN SEQ ID NO: 12 MRKRCYSTSAAVLAAVTLFVLSVDRGVIADSFSANQEIRYSEVTPYHV TSVWTKGVTPPANFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKTF D GKDDLLC GAATAGNMLHWWFDQNKDQIKRILEEHPEKQKINF R GEQMFDVKEAI DTKNHQLDSKLFEYFKEKAFPILSTKHLGVFPDHVIDMFIL GYRLSLTN HGPTPVKEGSKDPRGGIFDAVFTRGDQSKLLTSRHDFKEKNLKEISD LIKKELTEGKALGLSHTYANVRINHVINLWGADFDS N*GNLKAIYVTDS DSNASIGMKKYFVGVNSAGKVAISAKEIKEDNIGAQVLGLFTLSTGQD SWNQTN SEQ ID NO: 13 MRKRCYSTSAAVLAAVTLFVLSVDRGVIADSFSANQEIRYSEVTPYHV TSVWTKGVTPPANFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKTF D GKDDLLC GAATAGNMLHWWFDQNKDQIKRILEEHPEKQKINF R GEQMFDVKEAI DTKNHQLDSKLFEYFKEKAFPILSTKHLGVFPDHVIDMFIN*GYRLSLT NHGPTPVKEGSKDPRGGIFDAVFTRGDQSKLLTSRHDFKEKNLKEIS DLIKKELTEGKALGLSHTYANVRINHVINLWGADFDS D GNLKAIYVTD SDSNASIGMKKYFVGVNSAGKVAISAKEIKEDNIGAQVLGLFTLSTGQ DSWNQTN SEQ ID NO: 14 MRKRCYSTSAAVLAAVTLFVLSVDRGVIADSFSANQEIRYSEVTPYHV TSVWTKGVTPPANFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKTF D GKDDLLC GAATAGNMLHWWFDQNKDQIKRILEEHPEKQKINF N* GEQMFDVKE AIDTKNHQLDSKLFEYFKEKAFPILSTKHLGVFPDHVIDMFIL GYRLSL TNHGPTPVKEGSKDPRGGIFDAVFTRGDQSKLLTSRHDFKEKNLKEI SDLIKKELTEGKALGLSHTYANVRINHVINLWGADFDS D GNLKAIYVT DSDSNASIGMKKYFVGVNSAGKVAISAKEIKEDNIGAQVLGLFTLSTG QDSWNQTN SEQ ID NO: 15 MRKRCYSTSAAVLAAVTLFVLSVDRGVIADSFSANQEIRYSEVTPYHV TSVWTKGVTPPANFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKTF N*GKDDLL CGAATAGNMLHWWFDQNKDQIKRILEEHPEKQKINF R GEQMFDVKE AIDTKNHQLDSKLFEYFKEKAFPILSTKHLGVFPDHVIDMFIL GYRLSL TNHGPTPVKEGSKDPRGGIFDAVFTRGDQSKLLTSRHDFKEKNLKEI SDLIKKELTEGKALGLSHTYANVRINHVINLWGADFDS D GNLKAIYVT DSDSNASIGMKKYFVGVNSAGKVAISAKEIKEDNIGAQVLGLFTLSTG QDSWNQTN SEQ ID NO: 16 MRKRCYSTSAAVLAAVTLFVLSVDRGVIADSFSANQEIRYSEVTPYHV TSVWTKGVTPPANFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKTF D GKDDLLC GAATAGNMLHWWFDQNKDQIKRILEEHPEKQKINF R GEQMFDVKEAI DTKNHQLDSKLFEYFKEKAFPILSTKHLGVFPDHVIDMFIL GYRLSLTN HGPTPVKEGSKDPRGGIFDAVFTRGDQSKLLTSRHDFKEKNLKEISD LIKKELTEGKALGLSHTYANVRINHVINLWGADFDS D GNLKAIYVTDS DSNASIGMKKYFVGVNSAGKVAISAKEIKEDNIGAQVLGLFTLSTGQD SWNQTN
[0053] Em uma modalidade, o polipeptídeo tem uma sequência de aminoácido isolada compreendendo pelo menos 70% de identidade de sequência sobre um tamanho natural de uma sequência de aminoácido isolada como estabelecido no grupo consistindo em SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 16. Em um aspecto, a sequência de aminoácido isolada tem pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência sobre um tamanho natural de uma sequência de aminoácido isolada. Em outro aspecto, a sequência de aminoácido isolada tem pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência sobre um tamanho natural da sequência de aminoácido isolada. Em outro aspecto, a sequência de aminoácido isolada tem cerca de 100% de identidade de sequência sobre um tamanho natural da sequência de aminoácido isolada. Em um aspecto, o polipeptídeo pode ser capaz de clivar uma proteína alvo em fragmentos. Em um aspecto particular, a proteína alvo é um IgG. Em outro aspecto, a proteína alvo é uma proteína de fusão. Em ainda outro aspecto, os fragmentos podem compreender um fragmento Fab e/ou um fragmento Fc.
[0054] A presente invenção também inclui uma molécula de ácido nucleico isolada codificando um polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácido isolada compreendendo pelo menos 70% de identidade de sequência sobre um tamanho natural da sequência de aminoácido isolada como estabelecido no grupo consistindo em SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 16. Em um aspecto, a sequência de aminoácido isolada tem pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência sobre um tamanho natural da sequência de aminoácido isolada. Em outro aspecto, a sequência de aminoácido isolada tem pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência sobre um tamanho natural da sequência de aminoácido isolada. Em outro aspecto, a sequência de aminoácido isolada tem cerca de 100% de identidade de sequência sobre um tamanho natural da sequência de aminoácido isolada. Em um aspecto, o polipeptídeo pode ser capaz de clivar uma proteína alvo em fragmentos. Em um aspecto particular, a proteína alvo é um IgG. Em outro aspecto particular, a proteína alvo é uma proteína de fusão. Em ainda outro aspecto particular, os fragmentos podem compreender um fragmento Fab e/ou um fragmento Fc.
[0055] A presente invenção também inclui um vetor que compreende um ácido nucleico codificando um polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácido isolada compreendendo pelo menos 70% de identidade de sequência sobre um tamanho natural da sequência de aminoácido isolada como estabelecido no grupo consistindo em SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 16. Em um aspecto, a molécula de ácido nucleico está ligada de forma operacional a uma sequência de controle de expressão capaz de direcionar sua expressão em uma célula hospedeira. Em um aspecto, o vetor pode ser um plasmídeo. Em um aspecto, a sequência de aminoácido isolada tem pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência sobre um tamanho natural da sequência de aminoácido isolada. Em outro aspecto, a sequência de aminoácido isolada tem pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência sobre um tamanho natural da sequência de aminoácido isolada. Em outro aspecto, a sequência de aminoácido isolada tem cerca de 100% de identidade de sequência sobre um tamanho natural da sequência de aminoácido isolada. Em um aspecto, o polipeptídeo pode ser capaz de clivar uma proteína alvo em fragmentos. Em um aspecto particular, a proteína alvo é um IgG. Em outro aspecto, a proteína alvo é uma proteína de fusão. Em ainda outro aspecto, os fragmentos podem compreender um fragmento Fab e/ou um fragmento Fc.
[0056] Em uma modalidade, o aminoácido isolado pode compreender uma sequência de aminoácido parental definida por SEQ ID NO: 1 com um resíduo de asparagina na posição 87, 130, 182 e/ou 274 mutados para um aminoácido diferente de asparagina. Em um aspecto, a mutação pode conferir uma estabilidade química aumentada nos valores de pH alcalinos em comparação à sequência de aminoácido parental. Em outro aspecto, a mutação pode conferir um aumento em estabilidade química por 50% nos valores de pH alcalinos em comparação à sequência de aminoácido parental. Em um aspecto, o aminoácido pode ser selecionado de ácido aspártico, leucina e arginina. Em um aspecto particular, o resíduo de asparagina na posição 87 é mutado para um resíduo de ácido aspártico. Em outro aspecto, o resíduo de asparagina na posição 130 é mutado para um resíduo de arginina. Em ainda outro aspecto, o resíduo de asparagina na posição 182 é mutado para um resíduo de leucina. Em ainda outro aspecto, o resíduo de asparagina na posição 274 é mutado para um resíduo de ácido aspártico. Em ainda outro aspecto, os resíduos de asparagina nas posições 87 e 130 são mutados. Em ainda outro aspecto, os resíduos de asparagina nas posições 87 e 182 são mutados. Em ainda outro aspecto, os resíduos de asparagina nas posições 87 e 274 são mutados. Em ainda outro aspecto, os resíduos de asparagina nas posições 130 e 182 são mutados. Em ainda outro aspecto, os resíduos de asparagina nas posições 130 e 274 são mutados. Em ainda outro aspecto, os resíduos de asparagina nas posições 182 e 274 são mutados. Em ainda outro aspecto, os resíduos de asparagina nas posições 87, 130 e 182 são mutados. Em ainda outro aspecto, os resíduos de asparagina nas posições 87, 182 e 274 são mutados. Em ainda outro aspecto, os resíduos de asparagina nas posições 130, 182 e 274 são mutados. Em ainda outro aspecto, os resíduos de asparagina nas posições 87, 130, 182 e 274 são mutados.
[0057] Em uma modalidade relacionada, a invenção inclui uma molécula de ácido nucleico isolada codificando um polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácido isolada compreendendo uma sequência de aminoácido parental definida por SEQ ID NO: 1 com resíduos de asparagina nas posições 87, 130, 182 e/ou 274 mutados para um aminoácido diferente de asparagina - veja acima. A mutação pode conferir uma estabilidade química aumentada nos valores de pH alcalinos em comparação à sequência de aminoácido parental.
[0058] Em uma outra modalidade relacionada, a invenção inclui um vetor, que compreende uma molécula de ácido nucleico codificando um polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácido isolada compreendendo uma sequência de aminoácido parental definida por SEQ ID NO: 1 com um resíduo de asparagina na posição 87, 130, 182 e/ou 274 mutados para um aminoácido diferente de asparagina - veja acima. A mutação pode conferir uma estabilidade química aumentada nos valores de pH alcalinos em comparação à sequência de aminoácido parental. Em um aspecto, a molécula de ácido nucleico está ligada de forma operacional a uma sequência de controle de expressão capaz de direcionar sua expressão em uma célula hospedeira. Em um aspecto, o vetor pode ser um plasmídeo.
Produção com base em afinidade
[0059] A presente invenção também fornece métodos para reduzir proteínas de célula hospedeira, bem como, outras proteínas indesejáveis e ácidos nucleico durante a produção de uma proteína anti- VEGF usando cromatografia de afinidade.
[0060] Em uma modalidade, um método de produzir uma proteína recombinante compreende: (a) fornecer uma célula hospedeira geneticamente modificada para expressar uma proteína recombinante de interesse; (b) cultivar a célula hospedeira sob condições adequadas em que a célula expressa a proteína recombinante de interesse; e (c) colheita de uma preparação de uma proteína recombinante de interesse produzida pela célula. Em um aspecto, a proteína recombinante de interesse é uma proteína anti-VEGF. Em um aspecto particular, a proteína anti-VEGF é selecionada do grupo consistindo em aflibercepte, MiniTrap, MiniTrap recombinante (um exemplo dos quais é descrito em Patente Norte Americana N°. 7.279.159), um scFv e outras proteínas anti-VEGF.
[0061] Em um aspecto da presente modalidade, a proteína recombinante de interesse é expressa em uma célula hospedeira adequada. Exemplos não limitantes de células hospedeiras adequadas incluem, porém, não são limitados a, CHO, CHO K1, EESYR®, NICE®, NS0, Sp2/0, células renais embrionárias e BHK.
[0062] Em um aspecto da presente modalidade, a proteína recombinante de interesse é cultivada em um MQD. Um MQD adequado inclui meio de Eagle modificado por Dulbecco (DME), mistura de nutriente de Ham, meio Excell, meio IS CHO-CD, e MQD1B. Outros MQDs conhecidos por aqueles versados na técnica são contemplados estarem dentro do escopo da presente invenção.
[0063] A preparação de produção pode compreender pelo menos um contaminante incluindo uma ou mais proteínas de célula hospedeira além da proteína recombinante de interesse. Pelo menos um contaminante pode ser derivado de substrato celular, cultura celular ou um processo a jusante.
[0064] Em uma modalidade, a invenção é direcionada a métodos para produzir uma proteína anti-VEGF de uma amostra biológica usando cromatografia de afinidade. Em um aspecto particular, os métodos descritos aqui podem ser usados para separar, pelo menos em parte, a proteína anti-VEGF de uma ou mais proteínas de célula hospedeira e ácidos nucleicos (por exemplo, DNA) formados durante o processo de produção de cultura de uma proteína anti-VEGF.
[0065] Em um aspecto, o método pode compreender uma amostra biológica compreendendo uma proteína anti-VEGF juntamente com contaminantes acompanhantes para uma cromatografia de afinidade sob condições adequadas. Em um aspecto particular, a cromatografia de afinidade pode compreender material capaz de seletivamente ou especificamente ligar-se a uma proteína anti-VEGF ("captura"). Exemplos não limitantes de tal material cromatográfico incluem: proteína A, proteína G, material cromatográfico compreendendo, por exemplo, proteína capaz de ligar-se a uma proteína anti-VEGF, e material cromatográfico compreendendo uma proteína de ligação a Fc. Em um aspecto específico, a proteína capaz de ligar-se a ou interagir com a proteína anti-VEGF pode ser um anticorpo, proteína de fusão ou um fragmento dos mesmos. Exemplos não limitantes de tal material capaz de seletivamente ou especificamente ligar-se a uma proteína anti- VEGF são descritos no Exemplo 7.
[0066] Em um aspecto da presente modalidade, o método pode compreender uma amostra biológica compreendendo uma proteína anti-VEGF e uma ou mais proteínas de célula hospedeira/contaminantes para cromatografia de afinidade sob condições adequadas, em que a fase estacionária de cromatografia de afinidade compreende uma proteína capaz de seletivamente ou especificamente ligar-se a uma proteína anti-VEGF. Em um aspecto particular, a proteína pode ser um anticorpo, uma proteína de fusão, um scFv ou um fragmento de anticorpo. Em um aspecto específico, a proteína pode ser formas de VEGF165, VEGF121, ou formas VEGF de outras espécies, tal como, coelho. Por exemplo, como exemplificado nas Tabela 7-1 e Tabela 7-10, usando VEGF165, a proteína capaz de seletivamente ou especificamente ligar-se a ou interagir com a proteína anti-VEGF leva a uma produção bem-sucedida de MT5 (uma proteína anti-VEGF), aflibercepte e um fragmento anti-VEGF scFv. Em outro aspecto específico, a proteína pode ser uma ou mais das proteínas tendo uma sequência de aminoácido como mostrado em SEQ ID NO: 73-80, Tabela 7-1 também descreve produção bem-sucedida de MT5 usando as proteínas tendo sequências de aminoácido como mostrado em SEQ ID NO: 73-80 como a proteína capaz de seletivamente ou especificamente ligar-se a uma proteína anti-VEGF (MT5).
[0067] Em um aspecto da presente modalidade, o método pode compreender uma amostra biológica compreendendo a proteína anti- VEGF e uma ou mais proteínas de célula hospedeira/contaminantes para cromatografia de afinidade sob condições adequadas, em que a fase estacionária de cromatografia de afinidade compreende uma proteína capaz de seletivamente ou especificamente ligar-se a ou interagir com a proteína anti-VEGF, em que a proteína anti-VEGF pode ser selecionada de aflibercepte, MiniTrap de VEGF, ou um anticorpo anti-VEGF. Em um aspecto particular, a MiniTrap de VEGF pode ser obtida de componentes de receptor de VEGF; além disso, ela pode ser formada por expressão recombinante de MiniTrap de VEGF em uma célula hospedeira. Realização do método pode reduzir a quantidade de uma ou mais proteínas de célula hospedeira na amostra. Por exemplo, FIGURA 35A e FIGURA 35B mostram uma redução significante em proteínas de célula hospedeira total na amostra compreendendo MT5 (uma proteína anti-VEGF) usando cinco diferentes colunas de cromatografia de afinidade compreendendo (i) VEGFWÕ (SEQ ID NO: 72);(ii) mAb1 (um LgG1 humano de mAb anti-VEGFR1 de camundongo onde SEQ ID NO: 73 é uma cadeia pesada e SEQ ID NO: 74 é uma cadeia leve); (iii) mAb2 (um LgG1 humano de mAb anti-VEGFR1 de camundongo onde SEQ ID NO: 75 é uma cadeia pesada e SEQ ID NO: 76 é uma cadeia leve); (iv) mAb3 (um IgG1 de camundongo de mAb anti-VEGFR1 de camundongo onde SEQ ID NO: 77 é uma cadeia pesada e SEQ ID NO: 78 é uma cadeia leve) e (v) mAb4 (um IgG1 de camundongo de mAb anti-VEGFR1 de camundongo onde SEQ ID NO: 79 é uma cadeia pesada e SEQ ID NO: 80 é uma cadeia leve) como diferentes proteínas capazes de seletivamente ou especificamente ligar- se a MT5. Como visto nas FIGURA 35A e FIGURA 35B, os eluatos de cada dos processos de produção com base em afinidade reduziram as proteínas de célula hospedeira de acima de 7000 ppm a cerca de 25 ppm, e a cerca de 55 ppm, respectivamente.
[0068] As condições adequadas para empregar cromatografia de afinidade podem incluir, porém, não estão limitados a equilíbrio de uma coluna de cromatografia de afinidade usando um tampão de equilíbrio. Após equilíbrio usando, por exemplo, cloridrato de Tris a um pH de cerca de 8,3 a cerca de 8,6, a coluna de cromatografia de afinidade é carregada com uma amostra biológica. Após o carregamento de uma coluna, a coluna pode ser lavada uma ou múltiplas vezes usando, por exemplo, o tampão de equilíbrio, tal como, solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS). Outras lavagens incluindo lavagens utilizando diferentes tampões podem ser usadas antes de eluir uma coluna. A eluição da coluna pode ser efetuada pelo tipo de tampão e pH e condutividade. Outras condições de eluição bem conhecidas aos versados na técnica podem ser aplicadas. Após eluição utilizando um ou mais tipos de tampões de eluição, por exemplo, glicina a um pH de cerca de 2,0 a cerca de 3,0, as frações eluídas podem ser neutralizadas com a adição de um tampão neutralizante, por exemplo, Tris a 1 M a pH 7,5.
[0069] Em um aspecto da modalidade, o pH de tanto o tampão de equilíbrio quanto de lavagem pode ser de cerca de 7,0 a cerca de 8,6. Em um aspecto da modalidade, o tampão de lavagem pode ser DPBS. Em um aspecto, o tampão de eluição pode compreender tampão de glicina a 100 mM com pH de cerca de 2,5. Em outro aspecto, o tampão de eluição pode ser um tampão com um pH de cerca de 2,0 a cerca de 3.0. Em um aspecto, o tampão neutralizante pode compreender tris a 1 M com pH de cerca de 7,5.
[0070] Em um aspecto da presente modalidade, o método pode também compreender lavagem da coluna com um tampão de lavagem. Em um aspecto da presente modalidade, o método pode também compreender eluição da coluna com um tampão de eluição para obter frações de eluição. Em um aspecto particular, a quantidade de proteínas de célula hospedeira nas frações eluídas é significantemente reduzida quando comparada à quantidade de proteínas de célula hospedeira na amostra biológica, por exemplo, por cerca de 70%, cerca de 80%, 90%, cerca de 95%, cerca de 98%, ou cerca de 99%.
[0071] A presente modalidade pode incluir a adição de uma ou mais etapas, em nenhuma ordem particular, tais como, cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia com base em afinidade, cromatografia multimodal, inativação viral (por exemplo, usando pH baixo), filtração viral, e/ou ultra/diafiltração.
[0072] Em um aspecto, o perfil de glicosilação de uma composição de uma proteína anti-VEGF é como segue: cerca de 40% a cerca de 50% de glicanos fucosilados totais, cerca de 30% a cerca de 55% de glicanos sialilados totais, cerca de 6% a cerca de 15% de manose-5, e cerca de 60% a cerca de 79% de glicanos galactosilados.
[0073] Em um aspecto desta modalidade, a proteína anti-VEGF tem glicosilação de Man5 de cerca de 32,4% de 123 resíduos de asparagina e/ou cerca de 27,1% de 196 resíduos de asparagina. Em uma modalidade específica, a proteína anti-VEGF pode ser aflibercepte, anticorpo anti-VEGF ou MiniTrap de VEGF.
[0074] Em uma modalidade, o método pode também compreender formular uma substância de fármaco usando um excipiente farmaceuticamente aceitável. Em um aspecto, o excipiente farmaceuticamente aceitável pode ser selecionado dos seguintes: água, agentes de tamponamento, açúcar, sal, tensoativo, aminoácido, poliol, agente quelante, emulsificante e conservante. Outros excipientes bem conhecidos ao técnico versado estão dento do alcance desta modalidade.
[0075] Em um aspecto da modalidade, a formulação pode ser adequada para administração a um indivíduo humano. Em um aspecto da presente modalidade, administração pode ser efetuada por injeção intravítrea. Em um aspecto, a formulação pode ter cerca de 40 a cerca de 200 mg/mL da proteína de interesse. Em um aspecto particular, a proteína de interesse pode ser aflibercepte, anticorpo anti-VEGF ou MiniTrap de VEGF.
[0076] A formulação pode ser usada em um método de tratar ou prevenir distúrbios de olho angiogênico que podem incluir: degeneração macular relacionada à idade (por exemplo, seca ou úmida), edema macular, edema macular após oclusão de veia retiniana, oclusão de veia retiniana (RVO), oclusão de veia retiniana central (CRVO), oclusão de veia retiniana filial (BRVO), edema macular diabético (DME), neovascularização cloroidal (CNV), neovascularização de íris, glaucoma neovascular, fibrose pós cirúrgica em glaucoma, vitreoretinopatia proliferativa (PVR), neovascularização do disco óptico, neovascularização da córnea, neovascularização retiniana, neovascularização vítrea, pannus, pterígio, retinopatia vascular, retinopatia diabética em um indivíduo com edema macular diabético; ou retinopatias diabéticas (por exemplo, retinopatia diabética não proliferativa (por exemplo, caracterizado por um nível de Escala de Gravidade de Retinopatia Diabética (DRSS) de cerca de 47 ou 53) ou retinopatia diabética proliferativa; por exemplo, em um indivíduo que não sofre de DME).
Síntese de Espécies Oxo
[0077] Uma modalidade da presente invenção é direcionada a um ou mais métodos para sintetizar espécies de proteína oxidadas usando luz. Em um aspecto da presente modalidade, a proteína de interesse é uma proteína anti-VEGF. Em um aspecto particular, a proteína anti- VEGF é aflibercepte. Em outro aspecto, a proteína anti-VEGF é uma MiniTrap de VEGF incluindo MiniTrap de VEGF recombinante. Em ainda outro aspecto da presente modalidade, a proteína anti-VEGF é um fragmento variável de cadeia única (scFv).
[0078] Em um aspecto da presente modalidade, uma amostra compreende uma proteína de interesse, por exemplo, proteína de fusão de aflibercepte com mínimo ou nenhuma oxovariantes. A amostra é foto- estressada para sintetizar espécies oxidadas de aflibercepte. Em um aspecto particular, a amostra é foto-estressada usando luz branca fria. Em outro aspecto particular, a amostra é foto-estressada usando luz ultravioleta.
[0079] Em um aspecto específico da modalidade, uma amostra compreendendo aflibercepte ou outra proteína anti-VEGF é exposta à luz branca fria por cerca de 30 horas a cerca de 300 horas resultando em cerca de 1,5 a cerca de 50 vezes de aumento no oligopeptídeo modificado. Esses peptídeos são digeridos enzimaticamente e analisados compreendendo um ou mais do grupo consistindo em:
[0080] DKTH*TC*PPC*PAPELLG (SEQ ID NO: 17),EIGLLTC*EATVNGH*LYK (SEQ ID NO: 18),QTNTIIDVVLSPSH*GIELSVGEK (SEQ ID NO: 19),TELNVGIDFNWEYPSSKH*QHK (SEQ ID NO: 20), TNILTH*R (SEQ ID NO: 21), SDTGRPFVEMYSEIPEIIH*MTEGR (SEQ ID NO: 22),VH*EKDK (SEQ ID NO: 23), SDTGRPFVEM*YSEIPEIIHMTEGR (SEQ ID NO: 64), SDTGRPFVEMYSEIPEIIHM*TEGR (SEQ ID NO: 65), TQSGSEM*K (SEQ ID NO: 66), SDQGLYTC*AASSGLM*TK (SEQ ID NO: 67), IIW*DSR/(SEQ ID NO: 28), RIIW*DSR/ (SEQ ID NO: 115), IIW*DSRK (SEQ ID NO: 114), TELNVGIDFNW*EYPSSK (SEQ ID NO: 29), GFIISNATY*K (SEQ ID NO: 69), KF*PLDTLIPDGK (SEQ ID NO: 70) F*LSTLTIDGVTR (SEQ ID NO: 32), em que H * é uma histidina que é oxidada a 2-oxo-histidina, em que C * é uma cisteína que é carboximetilada, em que M * é uma metionina oxidada, em que W * é um triptofano oxidado, em que Y * é uma tirosina oxidada, e em que F * é uma fenilalanina oxidada. A digestão pode ser realizada por proteases aludidas antes, por exemplo, a tripsina. Os oligopeptídeos podem ser analisados usando espectrometria de massa.
[0081] Em um aspecto específico da modalidade, uma amostra compreendendo aflibercepte ou outra proteína anti-VEGF é exposta à luz ultravioleta por cerca de 4 horas a cerca de 40 horas resultando em cerca de 1,5 a cerca de 25 vezes de aumento em produtos de oligopeptídeo modificados (obtidos na realização de digestão) em que a amostra compreende um ou mais oligopeptídeos modificados selecionados do grupo consistindo em:DKTH*TC*PPC*PAPELLG (SEQ ID NO: 17), EIGLLTC*EATVNGH*LYK (SEQ ID NO: 18), QTNTIIDVVLSPSH*GIELSVGEK (SEQ ID NO: 19), TELNVGIDFNWEYPSSKH*QHK (SEQ ID NO: 20), TNILTH*R (SEQ ID NO: 21), SDTGRPFVEMYSEIPEIIH*MTEGR (SEQ ID NO: 22),VH*EKDK (SEQ ID NO: 23), SDTGRPFVEM*YSEIPEIIHMTEGR (SEQ ID NO: 64), SDTGRPFVEMYSEIPEIIHM*TEGR (SEQ ID NO: 65), TQSGSEM*K (SEQ ID NO: 66), SDQGLYTC*AASSGLM*TK (SEQ ID NO: 67), IIW*DSR/(SEQ ID NO: 28), RIIW*DSR/(SEQ ID NO: 115) IIW*DSRK (SEQ ID NO: 114), TELNVGIDFNW*EYPSSK (SEQ ID NO: 29), GFIISNATY*K (SEQ ID NO: 69), KF*PLDTLIPDGK (SEQ ID NO: 70) F*LSTLTIDGVTR (SEQ ID NO: 32),em que H * é uma histidina que é oxidada a 2-oxo-histidina, em que C * é uma cisteína que é carboximetilada, em que M * é uma metionina oxidada, em que W * é um triptofano oxidado, em que Y * é uma tirosina oxidada, e em que F * é uma fenilalanina oxidada. A digestão pode ser realizada por proteases aludidas antes, por exemplo, tripsina. Os oligopeptídeos podem ser analisados por espectrometria de massa.
Métodos para Minimizar Cor Amarelo-Marrom
[0082] A presente invenção fornece métodos para reduzir coloração de amarelo-marrom para a produção de aflibercepte, MiniTrap ou similares produzida em um MQD.
[0083] Em uma modalidade, o método compreende cultivo de uma célula hospedeira em um MQD sob condições adequadas, em que a célula hospedeira expressa uma proteína recombinante de interesse e em seguida, colhe uma preparação compreendendo a proteína recombinante de interesse. Em um aspecto, a proteína recombinante de interesse é uma proteína anti-VEGF. Em um aspecto particular, a proteína anti-VEGF é selecionada do grupo consistindo em aflibercepte, MiniTrap, MiniTrap recombinante (exemplos dos quais são descritos em Patente Norte Americana N°. 7.279.159, que é aqui incorporada por referência em sua totalidade), uma scFv e outras proteínas anti-VEGF. Em um aspecto, o método pode produzir uma preparação da proteína recombinante de interesse, em que a cor da preparação é caracterizada usando o método europeu BY ou o método CIELAB (b*). Adicionalmente, a presença de oxovariantes pode ser analisada usando, por exemplo, LC-MS.
[0084] Em um aspecto da presente modalidade, as condições de mitigação incluem aumento ou diminuição das concentrações cumulativas de um ou mais componentes de meio, por exemplo, aminoácidos, metais ou antioxidantes, incluindo, sais e precursores, correspondendo a uma redução nas variantes de cor e proteína de aflibercepte e MiniTrap de VEGF. Exemplos não limitantes de aminoácidos incluem alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutâmico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina. Em um aspecto particular, a redução da concentração de cisteína pode ser eficaz na redução da cor amarelo- marrom de uma preparação. A concentração de cisteína também pode afetar as oxovariantes.
[0085] Em uma modalidade, o método compreende cultivo de uma célula hospedeira em um MQD sob condições adequadas, em que a célula hospedeira expressa uma proteína recombinante de interesse, tal como, aflibercepte, e colheita de uma preparação da proteína de interesse produzida pela célula, em que as condições adequadas são obtidas, em parte, diminuindo a concentração cumulativa de cisteína no MQD para menos do que ou igual a cerca de 10 mM. Exemplos de meios adequados incluem, porém, não são limitados a MQD1B, Excell ou similares. Como usado aqui, o termo "quantidade cumulativa" refere-se à quantidade total de um componente específico adicionado a um biorreator ao longo da cultura celular para formar o MQD, incluindo quantidades adicionadas no início da cultura (MQD no dia 0) e posteriormente quantidades adicionadas do componente. As quantidades de um componente adicionado a uma cultura de sementeira ou inóculo antes da produção do biorreator (isto é, antes do MQD no dia 0) também são incluídas no cálculo da quantidade cumulativa do componente. Uma quantidade cumulativa é não efetuada pela perda de um componente ao longo do tempo durante o cultivo (por exemplo, por metabolismo ou degradação química). Assim, duas culturas com as mesmas quantidades cumulativas de um componente podem, no entanto, ter níveis absolutos diferentes, por exemplo, se o componente é adicionado às duas culturas em momentos diferentes (por exemplo, se em uma cultura todo o componente é adicionado no início, e em outra cultura o componente é adicionado ao longo do tempo). Uma quantidade cumulativa também é não efetuada por síntese in situ de um componente ao longo do tempo durante a cultura (por exemplo, via metabolismo ou conversão química). Assim, duas culturas com as mesmas quantidades cumulativas de um determinado componente podem, no entanto, ter níveis absolutos diferentes, por exemplo, se o componente for sintetizado in situ em uma das duas culturas por meio de um processo de bioconversão. Uma quantidade cumulativa pode ser expressa em unidades, tais como, por exemplo, gramas ou moles do componente.
[0086] Como usado aqui, o termo "concentração cumulativa" refere- se à quantidade cumulativa de um componente dividida pelo volume de líquido no biorreator no início da batelada de produção, incluindo a contribuição para o volume inicial de qualquer inóculo usado na cultura. Por exemplo, se um biorreator contém 2 litros de meio de cultura celular no início da batelada de produção, e um grama do componente X é adicionado nos dias 0, 1,2, e 3, então a concentração cumulativa após o dia 3 é de 2 g/L (isto é, 4 gramas dividido por 2 litros). Se, no dia 4, um litro adicional de líquido não contendo o componente X fosse adicionado ao biorreator, a concentração cumulativa permaneceria 2 g/L. Se, no dia 5, alguma quantidade de líquido fosse perdida do biorreator (por exemplo, por evaporação), a concentração acumulada permaneceria 2 g/L. Uma concentração cumulativa pode ser expressa em unidades, tais como, por exemplo, gramas por litro ou moles por litro.
[0087] Em um aspecto desta modalidade, o método compreende cultivo de uma célula hospedeira em um MQD sob condições adequadas, em que a célula hospedeira expressa uma proteína recombinante de interesse, colheita de uma preparação de a proteína produzida pela célula, em que as condições adequadas são obtidas diminuindo a relação de concentração de cisteína cumulativa de cerca de 1:10 a 1:29 para uma concentração de aminoácido total cumulativa de cerca de 1:50 a cerca de 1:30,
[0088] Em uma modalidade, o método compreende (i) cultivo de uma célula hospedeira em um MQD sob condições adequadas, em que a célula hospedeira expressa uma proteína recombinante de interesse, tal como, aflibercepte, e (ii) colheita de uma preparação da proteína recombinante de interesse produzida pela célula, em que as condições adequadas são obtidas diminuindo a concentração cumulativa de ferro no MQD para menos do que cerca de 55,0 μM. Em um aspecto desta modalidade, a preparação obtida por este método mostra menos cor amarelo-marrom do que a preparação obtida por um método em que a concentração cumulativa de ferro no MQD é maior do que cerca de 55,0 μM.
[0089] Em uma modalidade, o método compreende cultivo de uma célula hospedeira em um MQD sob condições adequadas, em que a célula hospedeira expressa uma proteína recombinante de interesse, tal como, aflibercepte. O método também compreende colheita de uma preparação da proteína recombinante de interesse produzida pela célula, em que as condições adequadas são obtidas diminuindo a concentração cumulativa de cobre no MQD para menos do que ou igual a cerca de 0,8 μM. Em um aspecto desta modalidade, a preparação obtida por este método mostra menos cor amarelo-marrom do que a preparação obtida por um método em que a concentração cumulativa de cobre no MQD é maior do que cerca de 0,8 μM.
[0090] Em uma modalidade, o método compreende cultivo de uma célula hospedeira em um MQD sob condições adequadas, em que a célula hospedeira expressa uma proteína recombinante de interesse, tal como, aflibercepte, e colheita de uma preparação de a proteína recombinante de interesse produzida pela célula, em que as condições adequadas são obtidas diminuindo a concentração cumulativa de níquel no MQD para menos do que ou igual a cerca de 0,40 μM. Em um aspecto desta modalidade, a preparação obtida por este método mostra menos cor amarelo-marrom do que a preparação obtida por um método em que a concentração cumulativa de níquel no MQD é maior do que cerca de 0,40 μM.
[0091] Em uma modalidade, o método compreende cultivo de uma célula hospedeira em um MQD sob condições adequadas, em que a célula hospedeira expressa uma proteína recombinante de interesse, tal como, aflibercepte. O método também compreende colheita de uma preparação da proteína recombinante de interesse produzida pela célula, em que as condições adequadas são obtidas diminuindo a concentração cumulativa de zinco no MQD para menos do que ou igual a cerca de 56 μM. Em um aspecto desta modalidade, a preparação obtida por este método mostra menos cor amarelo-marrom do que a preparação obtida por um método em que a concentração cumulativa de zinco no MQD é maior do que cerca de 56 μM.
[0092] Em uma modalidade, o método compreende cultivo de uma célula hospedeira em um MQD sob condições adequadas, em que a célula hospedeira expressa uma proteína recombinante de interesse, tal como, aflibercepte. O método também compreende colheita de uma preparação da proteína recombinante de interesse produzida pela célula, em que as condições adequadas são obtidas na presença de antioxidantes no MQD em uma concentração cumulativa de cerca de 0,001 mM a cerca de 10 mM para um único antioxidante e não mais do que cerca de concentração cumulativa a 30 mM se antioxidantes múltiplos forem adicionados ao referido MQD. Em um aspecto desta modalidade, a preparação obtida por este método mostra menos cor amarelo-marrom do que a preparação obtida por um método em que antioxidantes estão presentes no MQD em uma concentração cumulativa de menos que cerca de 0,01 mM ou acima de cerca de 100 mM. Exemplos não limitantes do antioxidante podem ser taurina, hipotaurina, glicina, ácido tioctico, glutationa, cloreto de colina, hidrocortisona, Vitamina C, Vitamina E, agente quelantes, catalase, S- carboximetil-L-cisteína e combinações dos mesmos. Exemplos não limitantes de agentes quelantes incluem ácido aurintricarboxílico (ATA), deferoxamina (DFO), EDTA e citrato.
[0093] Em uma modalidade, o método compreende o cultivo de uma célula hospedeira em um MQD sob condições adequadas, em que a célula hospedeira expressa uma proteína recombinante de interesse, tal como, aflibercepte. O método também compreende a preparação da proteína recombinante de interesse produzida pela célula, em que as condições adequadas incluem um MQD com: concentração cumulativa de ferro em referido MQD que é menor do que cerca de 55 μM, concentração cumulativa de cobre em referido MQD que é menor ou igual a cerca de 0,8 μM, concentração cumulativa de níquel em referido MQD que é menor ou igual a cerca de 0,40 μM, concentração cumulativa de zinco em referido MQD que é menor ou igual a cerca de 56 μM, concentração cumulativa de cisteína em referido MQD que é menor do que 10 mM; e/ou um antioxidante no referido MQD em uma concentração de cerca de 0,001 mM a cerca de 10 mM para um único antioxidante, e não mais do que cerca de concentração cumulativa a 30 mM se antioxidantes múltiplos forem adicionados ao referido MQD.
[0094] Em um aspecto da presente modalidade, a preparação obtida a partir da utilização de condições adequadas resulta na redução das variantes de proteína do aflibercepte e MiniTrap de VEGF para uma quantidade desejada de variantes de proteína do aflibercepte e MiniTrap de VEGF (referido como um "valor alvo" das variantes da proteína do aflibercepte e MiniTrap de VEGF). Em um outro aspecto desta modalidade, a preparação obtida a partir de condições adequadas resulta em uma redução na cor das preparações para um valor b* ou valor BY desejado (referido como um "valor b* alvo" "valor BY alvo" respectivamente) quando a preparação de proteína, incluindo variantes de aflibercepte e MiniTrap de VEGF é normalizada em uma concentração de 5 g/L ou 10 g/L. Em um outro aspecto da presente modalidade, o valor alvo b* (ou valor alvo BY) e/ou valor alvo das variantes podem ser obtidos em uma preparação onde a titulação aumenta ou não diminui significantemente.
[0095] Estes e outros aspectos da invenção serão melhor apreciados e compreendidos quando considerados em conjunto com a seguinte descrição e figuras anexas. A descrição a seguir, embora indique várias modalidades e vários detalhes específicos das mesmas, é dada a título de ilustração e não de limitação. Muitas substituições, modificações, adições ou disposições podem ser feitas no escopo da invenção.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0096] O arquivo de patente ou pedido contém pelo menos um desenho executado em cor. Cópias desta patente ou publicação de pedido de patente com desenho(s) colorido(s) serão fornecidas pelo Escritório mediante solicitação e pagamento da taxa necessária.
[0097] FIGURA 1 retrata uma MiniTrap de VEGF gerada usando uma modalidade exemplar, incluindo VEGFR1 (SEQ ID NO:34), VEGFR2 (SEQ ID NO: 36), fragmento de domínio de articulação (SEQ ID NO: 60)) e o fragmento de Fc clivado de aflibercepte (SEQ ID NO: 113).
[0098] FIGURA 2 retrata um mecanismo proposto para oxidação de histidina para 2-oxo-histidina (14 Da).
[0099] FIGURA 3 retrata um mecanismo proposto para oxidação de histidina para 2-oxo-histidina (16 Da).
[00100] FIGURA 4 retrata um mecanismo proposto para oxidação de triptofano para N-formilquinurenina e quinurenina.
[00101] FIGURA 5 retrata uma modalidade exemplar para produção de aflibercepte.
[00102] FIGURA 6 retrata uma modalidade exemplar para produção de MiniTrap de VEGF.
[00103] FIGURA 7 retrata uma modalidade exemplar para produção de aflibercepte.
[00104] FIGURA 8 retrata uma modalidade exemplar para produção de MiniTrap de VEGF.
[00105] FIGURA 9 retrata um gráfico de padrões BY calculados versus valor b* calculado de acordo com uma modalidade exemplar.
[00106] FIGURA 10 retrata resultados de um experimento realizado para avaliar a porcentagem de 2-oxo-histidinas e oxidação de triptofano (onde o sublinhado representa a oxidação do resíduo) em oligopeptídeos de carga de AEX digerida por protease e fluxo direto, incluindo fragmentos de aflibercepte reduzido e alquilado (SEQ ID NO: 55), incluindo SEQ ID NOs: 114-115, 21, 115, 28, 28, 20, 18, 17, 116-117, e 19, respectivamente, na ordem de aparecimento.
[00107] FIGURA 11 retrata a abundância relativa dos peptídeos identificados na análise de mapeamento de peptídeo realizada usando oligopeptídeos de carga de AEX digerida por protease e fluxo direto (onde o sublinhado representa a oxidação do resíduo na sequência do peptídeo), incluindo fragmentos de aflibercepte (SEQ ID NO: 55), incluindo SEQ ID NOs: 22, 18, 21, 19-20, 118-119, e 28-29, respectivamente, na ordem de aparecimento.
[00108] FIGURA 12A retrata uma visão completa do gráfico do cromatograma de absorbância versus tempo (minutos) para MT4 e MT1 a 350 nm.
[00109] FIGURA 12B retrata uma visão expandida do gráfico do cromatograma de absorbância versus tempo (16-30 minutos) para MT4 e MT1 a 350 nm, incluindo SEQ ID NOs: 21, 28 e 28, respectivamente, na ordem de aparecimento.
[00110] FIGURA 12C retrata uma visão expandida do gráfico do cromatograma de absorbância versus tempo (30-75 minutos) para MT4 e MT1 a 350 nm, incluindo SEQ ID NO: 17, 20, 18, e 19, respectivamente, na ordem de aparecimento.
[00111] FIGURA 13 retrata resultados de um experimento realizado para avaliar a porcentagem de 2-oxo-histidinas (e dioxidação de triptofano) em oligopeptídeos de MT1 digeridos por protease que foram processados por cromatografia de AEX e oligopeptídeos de MT1 digeridos por protease que foram retirados de cromatografia de AEX, incluindo SEQ ID NOs: 21, 28, 17, 20, e 18, 19, respectivamente, na ordem de aparecimento.
[00112] FIGURA 14 retrata resultados de um experimento realizado para comparar as espécies acídicas presentes em lotes de produção diferentes de MT1 e as frações de ácido acídico obtidas na realização de uma cromatografia de troca de cátion forte (CEX), incluindo SEQ ID NOs: 21, 28, 28, 17, 20, e 18, 19, respectivamente, na ordem de aparecimento.
[00113] FIGURA 15 retrata um método exemplar para o enriquecimento das espécies acídicas e outras variantes presentes em amostras de colheita de cultura celular usando cromatografia de troca de cátion forte.
[00114] FIGURA 16 retrata as frações de realização de cromatografia de troca de cátion forte de acordo com uma modalidade exemplar.
[00115] FIGURA 17 retrata cromatogramas de troca de cátion forte realizados de acordo com uma modalidade exemplar para a produção de MT1 (antes de qualquer procedimento de produção, <BY3) submetido a CEX e para variantes enriquecidas de MiniT rap dessialilado (dsMT1) usando um gradiente duplo de sal-pH.
[00116] FIGURA 18A retrata um cromatograma 3D para controle parental não fracionado realizado por cromatografia de troca de cátion forte de acordo com uma modalidade exemplar.
[00117] FIGURA 18B retrata um cromatograma 3D para MT1, fração 1 representando algumas das características de cauda para o experimento realizado por cromatografia de troca de cátion forte de acordo com uma modalidade exemplar.
[00118] FIGURA 18C retrata um cromatograma 3D para MT1, característica de fração 2 realizada por cromatografia de troca de cátion forte de acordo com uma modalidade exemplar.
[00119] FIGURA 18D retrata um cromatograma 3D para MT1, característica de fração 3 realizada por cromatografia de troca de cátion forte de acordo com uma modalidade exemplar.
[00120] FIGURA 18E retrata um cromatograma 3D para MT1, característica de fração 4 realizada por cromatografia de troca de cátion forte de acordo com uma modalidade exemplar.
[00121] FIGURA 18F retrata um cromatograma 3D para MT1, característica de fração 5 realizada por cromatografia de troca de cátion forte de acordo com uma modalidade exemplar.
[00122] FIGURA 18G retrata um cromatograma 3D para MT1, característica de fração 6 realizada por cromatografia de troca de cátion forte de acordo com uma modalidade exemplar.
[00123] FIGURA 18H retrata um cromatograma 3D para MT1, característica de fração 7 realizada por cromatografia de troca de cátion forte de acordo com uma modalidade exemplar.
[00124] FIGURA 19 retrata eletroferogramas de focalização isoelétrica capilar por imagem (icIEF) realizados de acordo com uma modalidade exemplar para a produção de MT1.
[00125] FIGURA 20 retrata resultados de um estudo correlacionando a exposição da luz branca fria de MT1 ou luz UVA com o aparecimento de resíduos de aminoácido oxidados, incluindo SEQ ID NOs: 114, 114115, 21, 115, 28, 28, 28, 17, 83, 20, 18, 29, 29, 19, e 22, respectivamente, na ordem de aparecimento.
[00126] FIGURA 21 retrata os cromatogramas 3D SEC-PDA (cromatografia de exclusão de tamanho acoplada à detecção de disposição de fotodiodo) em MT1 de estresse por CWL com absorbância a ~ 350 nm (veja, por exemplo, círculo em destaque ~ 350 nm) de acordo com uma modalidade exemplar onde A mostra o cromatograma a T = 0, B mostra o cromatograma a 0,5x ICH. C mostra o cromatograma a 2,0x ICH, e D mostra imagens de MT1 em frascos (normalizados para 80 mg/mL) estressados por CWL durante diferentes intervalos de tempo.
[00127] FIGURA 22 retrata os cromatogramas 3D SEC-PDA em MT1 de estresse por UVA com absorbância a ~ 350 nm (veja, por exemplo, círculo em destaque ~ 350 nm) de acordo com uma modalidade exemplar onde A mostra o cromatograma a T = 0, B mostra o cromatograma a 0,5x ICH. C mostra o cromatograma a 2,0x ICH, e D mostra imagens de MT1 em frascos (normalizados para 80 mg/mL) estressados por UVA durante diferentes intervalos de tempo.
[00128] FIGURA 23A retrata relações de absorbância de A320/280 quantificadas a partir de cromatogramas SEC-PDA para as amostras estressadas usando CWL (painel superior) e B retrata um gráfico de relações de absorbância de A320/280 para variantes de tamanho nas amostras estressadas usando CWL (painel inferior), em que as amostras são estressadas de acordo com uma modalidade exemplar.
[00129] FIGURA 24A retrata relações de absorbância de A320/280 quantificadas a partir de cromatogramas SEC-PDA para as amostras estressadas usando UVA (painel superior) e B um gráfico de relações de absorbância de A320/280 para variantes de tamanho nas amostras estressadas usando UVA (painel inferior), em que as amostras são estressadas de acordo com uma modalidade exemplar.
[00130] FIGURA 25 A retrata estimativa em escala do efeito que a incubação de vários componentes com aflibercepte tem sobre a geração de cor (valor de b previsto CIEL *, a*, b*); e B retrata gráfico do valor b real contra o valor b previsto.
[00131] FIGURA 26A retrata o efeito dos MQDs compreendendo baixo teor de cisteína e baixo teor de metais no título de aflibercepte, a FIGURA 26B retrata o efeito de MQDs compreendendo baixo teor de cisteína e baixo teor de metais sobre a concentração de células viáveis, a FIGURA 26C retrata o efeito de MQDs compreendendo baixo teor de cisteína e baixo teor de metais sobre a viabilidade, a FIGURA 26D retrata o efeito de MQDs compreendendo baixo teor de cisteína e baixo teor de metais sobre a amônia e a FIGURA 26E retrata o efeito de MQDs compreendendo baixo teor de cisteína e baixo teor de metais sobre aosmolalidade.
[00132] FIGURA 27 é um gráfico que mostra o perfil de previsão da cor da colheita (visto como valores b* do dia 13) sobre concentrações crescentes/decrescentes de metais e cisteína de acordo com uma modalidade exemplar.
[00133] FIGURA 28 (A-B) retrata o efeito de incubação de vários componentes com aflibercepte no MQD gasto na geração de cor (valor de b previsto CIE L *, a*, b*) (A); e por um gráfico de impactos previstos em escala sobre o valor de b (B).
[00134] FIGURA 28C retrata os efeitos estimados em escala da incubação de vários componentes com aflibercepte em MQD na geração de cor (valor de b previsto CIEL *, a*, b*) em uma cultura de frasco de agitação.
[00135] FIGURA 28D retrata o efeito de incubação de hipotaurina e sal de mesilato de deferoxamina (DFO) com aflibercepte no MQD gasto na geração de cor (valor previsto "b" CIEL *, a*, b*).
[00136] FIGURA 28E retrata o efeito de incubação de vários componentes individualmente com aflibercepte da cultura do frasco de agitação na geração da cor (valor "b" previsto CIEL *, a*, b*).
[00137] FIGURA 29 é um gráfico que mostra o efeito da adição de uridina, manganês, galactose e dexametasona em MQDs sobre o título do aflibercepte produzido.
[00138] FIGURA 30 é um gráfico que mostra o efeito da adição de uridina, manganês, galactose e dexametasona em MQDs sobre a viabilidade de células expressando aflibercepte, em que o aflibercepte é produzido.
[00139] FIGURA 31 é um gráfico que mostra o efeito da adição de uridina, manganês, galactose e dexametasona em MQDs sobre a contagem de célula viável de células expressando aflibercepte, em que o aflibercepte é produzido.
[00140] FIGURA 32 é um gráfico mostrando uma curva padrão de concentrações de absorbância versus proteína de célula hospedeira (ng/mL) preparada usando soluções de proteína de célula hospedeira padrão de Cygnus 3G (F550).
[00141] FIGURA 33 é uma imagem de análise de SDS-PAGE realizada usando tampão de amostra de SDS-PAGE não reduzida.
[00142] FIGURA 34 é uma imagem de análise de SDS-PAGE realizada usando redução de tampão de amostra de SDS-PAGE.
[00143] FIGURA 35A é um gráfico de proteína de célula hospedeira total detectada na solução de carregamento, frações eluídas de colunas de cromatografia de afinidade 1-3 compreendendo VEGF165, mAb1 e mAb2, respectivamente.
[00144] FIGURA 35B é um gráfico de proteínas de célula hospedeira totais detectadas na solução de carregamento, frações eluídas de colunas de cromatografia de afinidade 1, 2, 4 e 5 compreendendo VEGF165, mAb1, mAb3 e mAb4, respectivamente.
[00145] FIGURA 36A retrata os perfis de SEC de MiniTrap de VEGF antes e a FIGURA 36B retrata os perfis de SEC de MiniTrap de VEGF após realização de produção de cromatografia de afinidade.
[00146] FIGURA 37 retrata uma representação em esboço do estudo cinético de MiniTrap de VEGF para VEGF165, em que os construtos de MiniTrap de VEGF estudados foram de antes e após a realização de produção de cromatografia de afinidade de acordo com algumas modalidades exemplares.
[00147] FIGURA 38 retrata sensogramas de SPR do estudo cinético de MiniTrap de VEGF para VEGF165, em que os construtos de MiniTrap de VEGF estudados foram de antes e após a realização de produção de cromatografia de afinidade de acordo com algumas modalidades exemplares.
[00148] FIGURA 39 é um gráfico de proteína de célula hospedeira total detectada na solução de carregamento, frações eluídas de colunas de cromatografia de afinidade usadas repetidamente para colunas compreendendo VEGF165, mAb1 e mAb2.
[00149] FIGURA 40 retrata a estrutura de VEGF Mini Trap MT1 (SEQ ID NO: 46) de acordo com uma modalidade exemplar.
[00150] FIGURA 41 retrata a estrutura de VEGF Mini Trap MT6 (SEQ ID NO: 51) de acordo com uma modalidade exemplar.
[00151] FIGURA 42 retrata Cromatogramas de Íon Totais (TIC) de absorbância relativa versus tempo (minutos) para análise de SEC-MS nativo de MT1, MT5 e MT6 e uma visão ampliada de região de peso molecular baixo dos TICs.
[00152] FIGURA 43 retrata espectros de massa deconvoluídos do pico principal para MT1 e MT5 para confirmar a identidade de dímero de MiniTrap com elucidação para alguns PTMs, com aminoácidos N- terminais indicados (SEQ ID NO: 120).
[00153] FIGURA 44 retrata um espectro de massa deconvoluído do pico principal para MT6 para confirmar a identidade de MiniTrap de cadeia única com elucidação para alguns PTMs.
[00154] FIGURA 45A retrata o gráfico de absorbância relativa versus tempo (minutos) para impurezas de peso molecular baixo em MT1.
[00155] FIGURA 45B retrata espectros de massa para as impurezas de baixo peso molecular em MT1.
[00156] FIGURA 46 retrata absorbância relativa versus tempo (minutos) para MT1 que mostra ausência da enzima FabRICATOR que foi usada para clivar aflibercepte em MT1.
[00157] FIGURA 47 retrata absorbância relativa versus tempo (minutos) para impurezas de peso molecular baixo em MT5.
[00158] FIGURA 48 retrata absorbância relativa versus tempo (minutos) para impurezas de peso molecular baixo em MT6.
[00159] FIGURA 49A retrata um gráfico de absorbância versus tempo (minutos) obtido na realização de HILIC-UV/MS para MiniTrap de VEGF MT6, em que o gráfico mostra a eluição de pico principal em 21 minutos e O-glicanos em cerca de 21,5 minutos.
[00160] FIGURA 49B retrata um espectro de massa obtido na realização de HILIC-UV/MS para MiniTrap de VEGF MT6 mostrando o pico principal a 47985.8 Da.
[00161] FIGURA 49C retrata espectros de massa de O-glicanos de MiniTrap de VEGF MT6 obtidos na realização de HILIC-UV/MS.
[00162] FIGURA 50 é uma imagem de dímero de MiniTrap de VEGF em que a ponte de dissulfeto na região de articulação (SEQ ID NO: 83, 123, 83 e 123) da MiniTrap de VEGF pode ser paralela ou cruzada.
[00163] FIGURA 51 retrata abundância relativa de distribuição de glicanos observada em Asn36, entre MT1, MT5 e MT6. A FIGURA descreve SEQ ID NO: 121.
[00164] FIGURA 52 retrata abundância relativa de distribuição de glicanos observada em Asn68, entre MT1, MT5 e MT6. A FIGURA descreve SEQ ID NOs: 101 e 30, respectivamente, na ordem de aparecimento.
[00165] FIGURA 53 retrata abundância relativa de distribuição de glicanos observada em Asn123, entre MT1, MT5 e MT6. A FIGURA descreve SEQ ID NO: 82.
[00166] FIGURA 54 retrata abundância relativa de distribuição de glicanos observada em Asn196, entre MT1, MT5 e MT6. A FIGURA descreve SEQ ID NOs: 103 e 122, respectivamente, na ordem de aparecimento.
[00167] FIGURA 55 retrata a análise de glicano N-ligado liberado por cromatografia de interação hidrofílica (HILIC) acoplada à detecção de fluorescência e análise espectrometria de massa (escala completa e empilhada).
[00168] FIGURA 56 retrata cromatogramas de HILIC-FLR para MT1, MT5 e MT6.
[00169] FIGURA 57 retrata a análise de glicano N-ligado liberado por HILIC acoplado à detecção de fluorescência e análise espectrometria de massa (escala completa, empilhada e normalizada).
[00170] FIGURA 58A é uma tabela de identificação de glicano detalhada e quantificação de amostras de MiniTrap de VEGF MT1, MT5 e MT6.
[00171] FIGURA 58B é uma tabela de identificação de glicano detalhada e quantificação de amostras de MiniTrap de VEGF MT1, MT5 e MT6.
[00172] FIGURA 58C é uma tabela de identificação de glicano detalhada e quantificação de amostras de MiniTrap de VEGF MT1, MT5 e MT6.
[00173] FIGURA 59 retrata um procedimento de produção exemplar para fabricar MiniTrap de acordo com uma modalidade exemplar.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[00174] Angiogênese, o crescimento de novos vasos sanguíneos da vasculatura preexistente, é um processo altamente orquestrado que é crítico para o desenvolvimento vascular embrionário e pós-natal adequado. A angiogênese anormal ou patológica é uma marca registrada do câncer e de várias doenças retinais, onde a suprarregulação de fatores pró-angiogênicos, tal como, fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) leva a aumentos na proliferação endotelial, alterações na morfologia da vasculatura e aumento da permeabilidade vascular. Níveis elevados de VEGF foram encontrados no fluido vítreo e na vasculatura retiniana de pacientes com várias doenças oculares. O bloqueio da atividade do VEGF também se tornou a terapia de escolha para o tratamento de DME, AMD úmida, CNV, oclusão de veia retiniana e outras doenças oculares em que a angiogênese anormal é a etiologia subjacente.
[00175] Como usado aqui, aflibercepte é uma tal proteína anti-VEGF compreendendo uma sequência de aminoácido totalmente humana compreendendo o segundo domínio Ig do VEGFR1 humano e o terceiro domínio Ig do VEGFR2 humano expresso como uma fusão em linha com um (Fc) de IgG1 humano. O aflibercepte se liga a todas as formas de VEGF-A (VEGF), mas também se liga à PlGF e VEGF-B. Várias outras MiniTrap de VEGFs homodiméricas foram geradas como produtos clivados enzimaticamente de aflibercepte ou expressas de forma recombinante diretamente a partir de linhas de células hospedeiras. Um exemplo de um MiniTrap de VEGF é mostrado na FIGURA 1. Nesta figura, uma lisina terminal é representada (K), alguns processos de cultura removem esta lisina terminal, enquanto outros não. FIGURA 1 ilustra um processo através do qual a lisina terminal permanece. Em geral, o aflibercepte abrange tanto a presença quanto a ausência da lisina terminal.
[00176] Como demonstrado aqui, a presente invenção, em parte, descreve a produção de proteínas anti-VEGF (Exemplo 1) usando um MQD. A análise de soluções compreendendo aflibercepte produzido utilizando determinados MQDs demonstrou uma determinada propriedade de cor, tal como, uma cor amarelo-marrom intensa. A intensidade da cor da solução depende do MQD usado. Nem todos os MQDs examinados produziram uma amostra com uma cor amarelo- marrom distinta depois que as soluções foram normalizadas para uma concentração de 5 g/L.
[00177] Uma cor, tal como, amarelo-marrom, em uma solução de fármaco terapêutica injetável, pode ser uma característica indesejável. Pode ser um parâmetro utilizado importante para determinar se um produto farmacêutico satisfaz um nível predeterminado de pureza e qualidade para um determinado terapêutico. Uma cor, tal como, amarelo-marrom observada ao longo da rotina de fabricação de um biológico pode ser causada por modificações químicas desse biológico, produtos de degradação dos excipientes da formulação ou produtos de degradação formados pela reação dos excipientes biológicos e da formulação. No entanto, tais informações podem ser valiosas para a compreensão da causa da mudança de cor. Também pode ajudar no projeto de condições de armazenamento de curto prazo, bem como, de longo prazo para evitar modificações que facilitam essa mudança de cor.
[00178] Os inventores observaram que o uso de AEX durante a produção de uma solução de proteína anti-VEGF minimizou a coloração amarelo-marrom. Adicionalmente, os inventores descobriram que a coloração amarelo-marrom pode ser diminuída pela modificação da cultura célula usada para produzir uma proteína recombinante, tal como, aflibercepte ou um aflibercepte modificado como MiniTrap.
[00179] A presente invenção abrange proteínas anti-VEGF e sua produção usando MQD. Adicionalmente, a presente invenção é baseada na identificação e otimização de tecnologias de processo a jusante e a montante para a produção de proteína.
[00180] Como demonstrado aqui, alguns dos Exemplos estabelecidos abaixo descrevem uma produção de proteínas anti-VEGF (Exemplo 1), produção de espécies oxidadas de proteínas anti-VEGF (Exemplo 4), métodos para reduzir espécies oxidadas de proteínas anti- VEGF otimizando o meio de cultura (Exemplo 5) e otimizando métodos de produção (Exemplo 2).
[00181] Vários pedidos de patentes recentes e patentes concedidas pretendem descrever várias espécies de aflibercepte e métodos de produzi-los, mas nenhuma descreve ou sugere as composições anti- VEGF e métodos para produzir as mesmas descritos aqui. Veja, por exemplo, pedido Norte Americano N°. 16/566.847 de Coherus Biosciences Inc., Patente Norte Americana N°. 10.646.546 de Sam Chun Dang Pharm. Co., Ltd., Patente Norte Americana N° 10.576.128 de Formycon AG, Pedido Internacional N° PCT/US2020/015659 de Amgen Inc., e Patentes Norte Americanas N° 8.956.830; 9.217.168; 9.487.810; 9.663.810; 9.926.583; e 10.144.944 para Momenta Pharmaceuticals, Inc.
I. Explanação de Termos Selecionados
[00182] A menos que descrito de outro modo, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado que comumente entendido por alguém versado na técnica à qual esta invenção pertence. Métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos aqui conhecidos pelo técnico versado podem ser usados na prática de modalidades específicas descritas aqui. Todas as publicações mencionadas são aqui incorporadas por referência em sua totalidade.
[00183] O termo "um" deve ser entendido como significando "pelo menos um" e os termos "cerca de" e "aproximadamente" devem ser entendidos para permitir a variação padrão como seria entendido por aqueles versados na técnica e onde faixas são fornecidas, as finalidades são incluídas.
[00184] Como usado aqui, o termo "distúrbio angiogênico do olho" significa qualquer doença ocular causada ou associada ao crescimento ou proliferação de vasos sanguíneos ou ao vazamento dos vasos sanguíneos.
[00185] Como usado aqui, o termo "meio quimicamente definido" ou "meios quimicamente definidos" (ambos abreviados como "MQD") refere-se a um meio de crescimento sintético em que a identidade e concentração de todos os ingredientes são definidas. Meios quimicamente definidos não contêm extratos de bactérias, leveduras, animais ou vegetais, soro ou plasma animal, embora possam ser adicionados componentes individuais derivados de plantas ou animais (por exemplo, proteínas, polipeptídeos, etc.). Meios quimicamente definidos podem conter sais inorgânicos, tais como, fosfatos, sulfatos, e similares necessários para suportar o crescimento. A fonte de carbono é definida, e é geralmente um açúcar, tais como, glicose, lactose, galactose, e similares, ou outros compostos, tais como, glicerol, lactato, acetato e similares. Embora certos meios de cultura quimicamente definidos também usem sais de fosfato como tampão, outros tampões podem ser empregados, tais como, bicarbonato de sódio, HEPES, citrato, trietanolamina e similares. Exemplos de meios quimicamente definidos comercialmente disponíveis incluem, porém, não são limitados a meio de Eagle modificado por Dulbecco (DME) (Sigma-Aldrich Co; SAFC Biosciences, Inc.), mistura de nutriente de Ham (Sigma-Aldrich Co; SAFC Biosciences, Inc.), vários meios de EX-CELLs (Sigma-Aldrich Co; SAFC Biosciences, Inc.), vários meios de IS CHO-CDs (FUJIFILM Irvine Scientific), combinações dos mesmos e similares. Métodos de preparação de meios de cultura quimicamente definidos são conhecidos na técnica, por exemplo, na Patente Norte Americana Nos. 6.171.825 e 6.936.441, WO 2007/077217, e Publicação de Pedido de Patente Norte Americana Nos. 2008/0009040 e 2007/0212770, todos os ensinamentos dos quais são aqui incorporados por referência.
[00186] Como usado aqui, o termo "quantidade cumulativa" refere-se à quantidade total de um componente específico adicionado a um biorreator ao longo do curso de uma cultura de célula para formar o MQD, incluindo quantidades adicionadas no início da cultura (MQD no dia 0) e, quantidades subsequentemente adicionadas do componente. As quantidades de um componente adicionadas a uma cultura de sementeira ou inóculo antes da produção do biorreator (isto é, antes do MQD no dia 0) também são incluídas no cálculo da quantidade cumulativa do componente. Uma quantidade cumulativa é não efetuada pela perda de um componente ao longo do tempo durante a cultura (por exemplo, por metabolismo ou degradação química). Assim, duas culturas com as mesmas quantidades cumulativas de um componente podem, no entanto, ter níveis absolutos diferentes, por exemplo, se o componente for adicionado às duas culturas em momentos diferentes (por exemplo, se em uma cultura todo o componente for adicionado no início e em outra cultura o componente for adicionado ao longo do tempo). Uma quantidade cumulativa também é não efetuada por síntese in situ de um componente ao longo do tempo durante a cultura (por exemplo, via metabolismo ou conversão química). Assim, duas culturas com as mesmas quantidades cumulativas de um determinado componente podem, no entanto, ter níveis absolutos diferentes, por exemplo, se o componente for sintetizado in situ em uma das duas culturas por meio de um processo de bioconversão. Uma quantidade cumulativa pode ser expressa em unidades, tais como, por exemplo, gramas ou moles do componente.
[00187] Como usado aqui, o termo "concentração cumulativa" refere- se à quantidade cumulativa de um componente dividida pelo volume de líquido no biorreator no início da batelada de produção, incluindo a contribuição para o volume inicial de qualquer inóculo usado na cultura. Por exemplo, se um biorreator contém 2 litros de meio de cultura celular no início da batelada de produção, e um grama do componente X for adicionado nos dias 0, 1,2, e 3, então a concentração cumulativa após o dia 3 é de 2 g/L (isto é, 4 gramas dividido por 2 litros). Se, no dia 4, um litro adicional de líquido não contendo o componente X for adicionado ao biorreator, a concentração cumulativa permaneceria 2 g/L. Se, no dia 5, alguma quantidade de líquido for perdida do biorreator (por exemplo, por evaporação), a concentração cumulativa permaneceria 2 g/L. Uma concentração cumulativa pode ser expressa em unidades, tais como, por exemplo, gramas por litro ou moles por litro.
[00188] Como usado aqui, o termo "formulação" refere-se a uma proteína de interesse que é formulada juntamente com um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis. Em um aspecto, a proteína de interesse é aflibercepte e/ou MiniTrap. Em algumas modalidades exemplares, a quantidade de proteína de interesse na formulação pode variar de cerca de 0,01 mg/mL a cerca de 600 mg/mL. Em algumas modalidades específicas, a quantidade da proteína de interesse na formulação pode ser cerca de 0,01 mg/mL, cerca de 0,02 mg/mL, cerca de 0,03 mg/mL, cerca de 0,04 mg/mL, cerca de 0,05 mg/mL, cerca de 0,06 mg/mL, cerca de 0,07 mg/mL, cerca de 0,08 mg/mL, cerca de 0,09 mg/mL, cerca de 0,1 mg/mL, cerca de 0,2 mg/mL, cerca de 0,3 mg/mL, cerca de 0,4 mg/mL, cerca de 0,5 mg/mL, cerca de 0,6 mg/mL, cerca de 0,7 mg/mL, cerca de 0,8 mg/mL, cerca de 0,9 mg/mL, cerca de 1 mg/mL, cerca de 2 mg/mL, cerca de 3 mg/mL, cerca de 4 mg/mL, cerca de 5 mg/mL, cerca de 6 mg/mL, cerca de 7 mg/mL, cerca de 8 mg/mL, cerca de 9 mg/mL, cerca de 10 mg/mL, cerca de 15 mg/mL, cerca de 20 mg/mL, cerca de 25 mg/mL, cerca de 30 mg/mL, cerca de 35 mg/mL, cerca de 40 mg/mL, cerca de 45 mg/mL, cerca de 50 mg/mL, cerca de 55 mg/mL, cerca de 60 mg/mL, cerca de 65 mg/mL, cerca de 70 mg/mL, cerca de 75 mg/mL, cerca de 80 mg/mL, cerca de 85 mg/mL, cerca de 90 mg/mL, cerca de 100 mg/mL, cerca de 110 mg/mL, cerca de 120 mg/mL, cerca de 130 mg/mL, cerca de 140 mg/mL, cerca de 150 mg/mL, cerca de 160 mg/mL, cerca de 170 mg/mL, cerca de 180 mg/mL, cerca de 190 mg/mL, cerca de 200 mg/mL, cerca de 225 mg/mL, cerca de 250 mg/mL, cerca de 275 mg/mL, cerca de 300 mg/mL, cerca de 325 mg/mL, cerca de 350 mg/mL, cerca de 375 mg/mL, cerca de 400 mg/mL, cerca de 425 mg/mL, cerca de 450 mg/mL, cerca de 475 mg/mL, cerca de 500 mg/mL, cerca de 525 mg/mL, cerca de 550 mg/mL, cerca de 575 mg/mL, ou cerca de 600 mg/mL. Em algumas modalidades exemplares, pH da composição pode ser maior do que cerca de 5,0. Em uma modalidade exemplar, o pH pode ser maior do que cerca de 5,0, maior do que cerca de 5,5, maior do que cerca de 6,0 maior do que cerca de 6,5, maior do que cerca de 7,0, maior do que cerca de 7,5, maior do que cerca de 8,0, ou maior do que cerca de 8,5.
[00189] Como usado aqui, o termo "base de dados" refere-se a uma ferramenta de bioinformática, que fornece a possibilidade de pesquisar o espectro de MS-MS não interpretado contra todas as possíveis sequências nas bases de dados. Exemplos não limitantes de tais ferramentas são Mascot (www.matrixscience.com), Spectrum Mill (www.chem.agilent.com), PLGS (www.waters.com), PEAKS (www.bioinformaticssolutions.com), Proteinpilot(download.appliedbiosystems.com//proteinpilot), Phenyx(http://www.phenyx-ms.com), Sorcerer (www.sagenresearch.com), OMSSA (www.pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/omssa/), X!Tandem (www.thegpm. Org/TANDEM/), proteína Prospector (www.prospector.ucsf. Edu/prospector/mshome.htm), Byonic(www.proteinmetrics.com/products/byonic) ou Sequest (fields.scripps. Edu/sequest).
[00190] Como usado aqui, o termo "ultrafiltração" ou "UF" podem incluir um processo de filtração por membrana semelhante à osmose reversa, usando pressão hidrostática para forçar a água através de uma membrana semipermeável. A ultrafiltração é descrita em detalhes em: LEOS J. ZEMAN & ANDREW L. ZYDNEY, MICROFILTRATION AND ULTRAFILTRATION: PRINCIPLES AND APPLICATIONS (1996), todo o ensinamento do qual é aqui incorporado. Filtros com poros menores que 0,1 μm podem ser usados para ultrafiltração. Ao empregar filtros com esse tamanho de poro pequeno, o volume da amostra pode ser reduzido por meio da permeação do tampão da amostra através do filtro, enquanto as proteínas são retidas atrás do filtro.
[00191] Como usado aqui, "diafiltração" ou "DF" pode incluir um método de usar ultrafiltros para remover sais de troca, açúcares e solventes não aquosos, para separar espécies livres de ligadas, para remover material de baixo peso molecular, e/ou para causar a rápida mudança de ambientes de pH e/ou iônicos. Os microssolutos são removidos de forma mais eficiente pela adição de solvente a uma solução que está sendo ultrafiltrada a uma taxa aproximadamente igual à taxa de ultrafiltração. Isso lava as microespécies da solução em um volume constante. Em certas modalidades exemplares da presente invenção, uma etapa de diafiltração pode ser utilizada para trocar vários tampões usados na conexão com a presente invenção, por exemplo, antes da cromatografia ou outras etapas de produção, bem como, para remover impurezas de uma preparação de proteína. Como usado aqui, o termo "tecnologia de processo a jusante" refere-se a uma ou mais técnicas usadas após as tecnologias de processo a montante para produzir uma proteína. A tecnologia de processo a jusante inclui, por exemplo, a produção de um produto de proteína, usando, por exemplo, cromatografia de afinidade, incluindo cromatografia de afinidade de proteína A, bem como, cromatografia de afinidade que usa uma fase sólida tendo uma molécula bem definida como VEGF que pode interagir com seu cognato como um receptor de VEGF (VEGFR), cromatografia de troca de íon, tal como, cromatografia de troca de ânions ou cátions, cromatografia de interação hidrofóbica ou cromatografia de deslocamento.
[00192] A frase "célula hospedeira recombinante" (ou simplesmente "célula hospedeira") inclui uma célula na qual um vetor de expressão recombinante que codifica uma proteína de interesse foi introduzido. Deve ser entendido que tal termo se destina a referir-se não apenas a uma célula em particular, mas também a uma progênie de tal célula. Como certas modificações podem ocorrer em gerações sucessivas devido a mutações ou influências ambientais, tal progênie pode não ser, de fato, idêntica à célula origem, mas são ainda incluídas no escopo do termo "célula hospedeira" como usado aqui. Em uma modalidade, as células hospedeiras incluem células procarióticas e eucarióticas selecionadas de qualquer um dos reinos da vida. Em um aspecto, as células eucarióticas incluem células protistas, fúngicas, vegetais e animais. Em um outro aspecto, as células hospedeiras incluem células eucarióticas, tais como, células vegetais e/ou animais. A células podem ser células de mamíferos, células de peixes, células de insetos, células de anfíbios ou células de aves. Em um aspecto particular, a célula hospedeira é uma célula de mamífero. Uma grande variedade de linhagens celulares de mamíferos adequadas para crescimento em cultura estão disponíveis na American Type Culture Collection (Manassas, Va.) e outros depósitos, bem como, fornecedores comerciais. Células que podem ser usadas em processos da invenção incluem, porém, não limitadas a células MK2.7, células PER-C6, células de ovário de hamster chinês (CHO), tais como, CHO-K1 (ATCC CCL- 61), DG44 (Chasin et al., 1986, Som. Cell Molec. Genet., 12: 555-556; Kolkekar et al., 1997, Biochemistry, 36: 10901-10909; e WO 01/92337 A2), células CHO de di-hidrofolato redutase negativo (CHO/-DHFR, Urlaub e Chasin, 1980, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 77: 4216), e células dp12.CHO (Patente Norte Americana N°. 5.721.121); células de rim de macaco (CV1, ATCC CCL-70); células CV1 de rim de macaco transformadas por SV40 (células COS, COS-7, ATCC CRL-1651); Células HEK 293,e células Sp2/0, células de hibridoma 5L8, células Daudi, células EL4, células HeLa, células HL-60, células K562, células Jurkat, células THP-1, células Sp2/0, células epiteliais primárias (por exemplo, queratinócitos, células epiteliais cervicais, células epiteliais brônquicas, células epiteliais traqueais, células epiteliais renais e células epiteliais retinais) e linhagens celulares estabelecidas e suas cepas (por exemplo, células renais embrionárias humanas (por exemplo, células 293 ou células 293 subclonadas para crescimento em cultura em suspensão, Graham et al., 1977, J. Gen. Virol., 36:59); células de rim de hamster bebê (BHK, ATCC CCL-10); células de Sertoli de camundongo (TM4, Mather, 1980, Biol. Reprod., 23: 243-251); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL-2); células de rim canino (MDCK, ATCC CCL-34); células de pulmão humano (W138, ATCC CCL-75); células de hepatoma humano ( HEP-G2, HB 8065); células de tumor mamário de camundongo (MMT 060562, ATCC CCL- 51); células de fígado de rato búfalo (BRL 3A, ATCC CRL-1442); células TRI (Mather, 1982, Annals NY Acad. Sci., 383:44-68); células MCR 5; células FS4; células retinais PER-C6, células MDBK (NBL-1), células 911, células CRFK, células MDCK, células BeWo, células Chang, células Detroit 562, células HeLa 229, células HeLa S3, células Hep-2, células KB, células LS 180, células LS 174T, células NCI-H-548, células RPMI 2650, células SW-13, células T24, WI-28 VA13, células 2RA, células WISH, células BS-C-I, células LLC-MK2, células Clone M-3, células 1-10, células RAG, células TCMK-1, células Y-1, células LLC- PK1, células PK(15), células GH1, células GH3, células L2, células LLC- RC 256, células MH1C1, células XC, células MDOK, células VSW, e células TH-I, B1, ou derivados das mesmas), células de fibroblasto de qualquer tecido ou órgão (incluindo porém, não limitadas a, coração, fígado, rim, cólon, intestinos, esôfago, estômago, tecido neural (cérebro, medula espinhal), pulmão, tecido vascular (artéria, veia, capilar), tecido linfoide (glândula linfática, adenoide, amígdala, medula óssea e sangue), baço, e fibroblasto e linhagens celulares tipo fibroblasto (por exemplo, células TRG-2, células IMR-33, células Don, células GHK-21, células de citrulinemia, células Dempsey, células Detroit 551 células, Detroit 510, células Detroit 525, células Detroit 529, células Detroit 532, células Detroit 539, células Detroit 548, células Detroit 573, células HEL 299, células IMR-90, células MRC-5, células WI-38, células WI-26, células MÍCII, células CV-1, células COS-1, células COS-3, células COS-7, células renais de macaco verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587; VERO, ATCC CCL-81); células DBS-FrhL-2, células BALB/3T3, células F9, células SV-T2, células M-MSV-BALB/3T3, células K-BALB, células BLO-11, células NOR-10, células C3H/IOTI/2, células HSDM1C3, células KLN205, células McCoy, células L de camundongo, células de cepa 2071 (L de camundongo), células de cepa L-M (L de camundongo), células L-MTK (L de camundongo), células NCTC clones 2472 e 2555, SCC-PSA1, células Swiss/3T3, células muntac indiana, células SIRC, células CII, e células Jensen, ou derivados das mesmas) ou qualquer outro tipo celular conhecido por alguém versado na técnica.
[00193] Como usado aqui, o termo "proteínas de célula hospedeira" (HCP) inclui proteína derivada de uma célula hospedeira e pode ser não relacionada à proteína de interesse desejada. Proteínas de célula hospedeira podem ser uma impureza relacionada ao processo que pode ser derivado do processo de fabricação e pode incluir três categorias principais: derivada de substrato celular, derivada de cultura celular e derivada a jusante. As impurezas derivadas de substrato celular incluem, porém, não são limitadas a proteínas derivadas de um organismo hospedeiro e ácido nucleico (genômica da célula hospedeira, vetor ou DNA total). Impurezas derivadas da cultura celular incluem, porém, não são limitadas a indutores, antibióticos, soro e outros componentes de meio. As impurezas derivadas a jusante incluem, porém, não são limitadas a enzimas, reagentes de processamento químico e bioquímico (por exemplo, brometo de cianogênio, guanidina, agentes oxidantes e redutores), sais inorgânicos (por exemplo, metais pesados, arsênio, íon não metálico), solventes, veículos, ligantes (por exemplo, anticorpos monoclonais) e outros lixiviáveis.
[00194] Em algumas modalidades exemplares, a proteína de célula hospedeira pode ter um pl na faixa de cerca de 4,5 a cerca de 9,0. Em uma modalidade exemplar, o pl pode ser cerca de 4,5, cerca de 5,0, cerca de 5,5, cerca de 5,6, cerca de 5,7, cerca de 5,8, cerca de 5,9,cerca de 6,0, cerca de 6,1 cerca de 6,2, cerca de 6,3, cerca de 6,4, cerca de 6,5, cerca de 6,6, cerca de 6,7, cerca de 6,8, cerca de 6,9, cerca de 7,0, cerca de 7,1 cerca de 7,2, cerca de 7,3, cerca de 7,4, cerca de 7,5, cerca de 7,6, cerca de 7,7, cerca de 7,8, cerca de 7,9, cerca de 8,0, cerca de 8,1 cerca de 8,2, cerca de 8,3, cerca de 8,4, cerca de 8,5, cerca de 8,6, cerca de 8,7, cerca de 8,8, cerca de 8,9, ou cerca de 9,0.
[00195] Como usado aqui, o termo "agente hidrolisante" refere-se a qualquer um ou combinação de um grande número de diferentes agentes que podem realizar a digestão de uma proteína. Exemplos não limitantes de agentes hidrolisantes que podem realizar digestão enzimática incluem protease de Aspergillus saitoi, elastase, subtilisina, protease XIII, pepsina, tripsina, Tryp-N, quimiotripsina, aspergilopepsina I, LysN protease (Lys-N), LysC endoproteinase (LysC -C), Asp-N endoproteinase (Asp-N), Arg-C endoproteinase (Arg-C), Glu-C endoproteinase (Glu-C) ou proteína T da membrana externa (OmpT), enzima degradadora de imunoglobulina de Streptococcus pyogenes (IdeS), termolisina, papaína, pronase, V8 protease ou fragmentos biologicamente ativos ou homólogos dos mesmos ou combinações dos mesmos. Exemplos não limitantes de agentes hidrolisantes que podem realizar digestão não enzimática incluem o uso de alta temperatura, microondas, ultrassom, alta pressão, infravermelho, solventes (exemplos não limitantes são etanol e acetonitrila), digestão enzimática imobilizada (IMER), enzimas imobilizadas por partícula magnética, e enzimas imobilizadas on-chip. Para uma revisão recente que discute as técnicas disponíveis para a digestão de proteína, veja Switzar et al., " Protein Digestion: An Overview of the Available Techniques and Recent Developments" (Linda Switzar, Martin Giera e Wilfried MA Niessen, Protein Digestion: An Overview of the Available Techniques and Recent Developments, 12 JOURNAL OF PROTEOME RESEARCH 1067-1077 (2013), cujos ensinamentos inteiros são aqui incorporados). Um ou uma combinação de agentes hidrolisantes pode clivar ligações de peptídeo em uma proteína ou polipeptídeo, de maneira específica de sequência, gerando uma coleção previsível de peptídeos mais curtos. A relação de agente hidrolisante para proteína e o tempo necessário para a digestão podem ser apropriadamente selecionados para obter a digestão ideal da proteína. Quando a relação enzima para substrato for inadequadamente alta, a correspondentemente alta taxa de digestão não permitirá tempo suficiente para que os peptídeos sejam analisados por espectrômetro de massa, e a cobertura da sequência ficará comprometida. Por outro lado, uma relação E/S baixa necessitaria de uma digestão longa e, portanto, de um tempo de aquisição de dados longo. A relação enzima para substrato pode variar de cerca de 1: 0,5 a cerca de 1: 200. Como usado aqui, o termo "digestão" refere-se à hidrólise de uma ou mais ligações de peptídeo de uma proteína. Existem vários métodos para realizar a digestão de uma proteína em uma amostra biológica usando um agente hidrolisante apropriado, por exemplo, digestão enzimática ou digestão não enzimática. Um dos métodos amplamente aceitos para digestão de proteínas em uma amostra envolve o uso de proteases. Muitas proteases estão disponíveis e cada uma delas possui características próprias em termos de especificidade, eficiência e condições ideais de digestão. Proteases referem-se a endopeptidases e exopeptidases, como classificado com base na capacidade da protease para clivar em aminoácidos não terminais ou terminais dentro de um peptídeo. Alternativamente, as proteases também se referem a seis classes distintas - aspártica, glutâmica, e metaloproteases, cisteína, serina e treonina proteases, como classificado com base no mecanismo de catálise. Os termos "protease" e "peptidase" são usados indistintamente para se referir a enzimas, que hidrolisam ligações de peptídeos.
[00196] O termo "em associação com" indica que os componentes, uma composição anti-VEGF da presente invenção, juntamente com outro agente, tal como, anti-ANG2, podem ser formulados em uma única composição para liberação simultânea, ou formulados separadamente em duas ou mais composições (por exemplo, um kit incluindo cada componente). Componentes administrados em associação entre si podem ser administrados a um indivíduo em um momento diferente do que quando o outro componente é administrado; por exemplo, cada administração pode ser dada não simultaneamente (por exemplo, separadamente ou sequencialmente) em intervalos durante um determinado período de tempo. Os componentes separados administrados em associação uns com os outros também podem ser administrados essencialmente simultaneamente (por exemplo, precisamente ao mesmo tempo ou separados por um período de tempo não clinicamente significante) durante a mesma sessão de administração. Além disso, os componentes separados administrados em associação uns com os outros podem ser administrados a um indivíduo pela mesma ou por uma via diferente, por exemplo, uma composição de aflibercepte juntamente com outro agente, tal como, anti-ANG2, em que a composição de aflibercepte compreende cerca de 15% ou menos das suas variantes.
[00197] Como usado aqui, o termo "cromatografia líquida" refere-se a um processo em que uma mistura biológica/química transportada por um líquido pode ser separada em componentes como resultado da distribuição diferencial dos componentes conforme eles fluem diretamente (ou para dentro) de uma fase líquida ou sólida estacionária. Exemplos não limitantes de cromatografia líquida incluem cromatografia líquida de fase reversa, cromatografia de troca de íon, cromatografia de exclusão de tamanho, cromatografia de afinidade, cromatografia de modo misto ou cromatografia hidrofóbica.
[00198] Como usado aqui, "cromatografia de afinidade" pode incluir separações incluindo qualquer método pelo qual duas substâncias são separadas com base em sua afinidade a um material cromatográfico. Pode compreender submeter as substâncias a uma coluna compreendendo um meio cromatográficos de afinidade adequado. Exemplos não limitantes de tais meios cromatográficos incluem, porém, não são limitados a resina de proteína A, resina de proteína G, suporte de afinidade compreendendo um antígeno contra o qual uma molécula de ligação (por exemplo, anticorpo) foi produzida, proteína capaz de ligar-se a uma proteína de interesse e suporte de afinidade compreendendo uma proteína de ligação a Fc. Em um aspecto, uma coluna de afinidade pode ser equilibrada com um tampão adequado antes do carregamento da amostra. Um exemplo de um tampão adequado pode ser um tampão de Tris/NaCl, pH em torno de 7,0 a 8,0. Um técnico versado pode desenvolver um tampão adequado sem carga excessiva. Após esse equilíbrio, uma amostra pode ser carregada sobre a coluna. Após o carregamento da coluna, a coluna pode ser lavada uma ou múltiplas vezes usando, por exemplo, o tampão de equilíbrio. Outras lavagens incluindo lavagens utilizando diferentes tampões podem ser usadas antes de eluir a coluna. A coluna de afinidade pode então ser eluída usando um tampão de eluição apropriado. Um exemplo de um tampão de eluição adequado pode ser um tampão de ácido acético/NaCl, pH em torno de 2,0 a 3,5. Novamente, o técnico versado pode desenvolver um tampão de eluição apropriado sem carga excessiva. O eluato pode ser monitorado usando técnicas bem definidas por aqueles versados na técnica, incluindo UV, por exemplo, a absorbância a 280 nm pode ser utilizada especialmente se uma amostra de interesse compreende anéis aromáticos (por exemplo, proteínas tendo aminoácidos aromáticos como triptofano).
[00199] Como usado aqui, "cromatografia de troca de íon" pode referir-se a separações incluindo qualquer método pelo qual duas substâncias são separadas com base em diferenças em suas respectivas cargas iônicas, seja na molécula de interesse e/ou material cromatográfico como um todo ou localmente em regiões específicas da molécula de interesse e/ou material cromatográfico, podendo assim utilizar material de troca catiônica ou de troca aniônica. Cromatografia de troca de íon separa as moléculas com base nas diferenças entre as cargas locais das moléculas de interesse e as cargas locais do material cromatográfico. Uma coluna de cromatografia de troca de íon empacotada ou um dispositivo de membrana de troca de íon pode ser operado no modo de diluição de ligação, modo de fluxo direto ou modo híbrido. Após a lavagem de uma coluna ou do dispositivo de membrana com um tampão de equilíbrio ou outro tampão, a recuperação do produto pode ser alcançada pelo aumento da força iônica (isto é, condutividade) do tampão de eluição para competir com o soluto pelos sítios carregados da matriz de troca de íon. Mudar o pH e, assim, alterar a carga do soluto pode ser outra forma de conseguir a eluição do soluto. A mudança na condutividade ou no pH pode ser gradual (eluição de gradiente) ou etapa a etapa (eluição de etapa). Substituintes aniônicos ou catiônicos podem ser ligados a matrizes para formar suportes aniônicos ou catiônicos para cromatografia. Exemplos não limitantes de substituintes de troca aniônica incluem grupos dietilaminoetila (DEAE), aminoetila quaternária (QAE) e amina quaternária (Q). Substituintes catiônicos incluem carboximetila (CM), sulfoetila (SE), sulfopropila (SP), fosfato (P) e sulfonato (S). Os meios ou suportes de troca de íon de celulose podem incluir DE23™, DE32™, DE52™, CM-23™, CM-32™ e CM-52™ que estão disponíveis na Whatman Ltd. Maidstone, Kent, Reino Unido. Trocadores de íon ligados a lacrosse e baseados em SEPHADEX® também são conhecidos. Por exemplo, DEAE-, QAE-, CM, e SP-SEPHADEX® e DEAE-, Q-, CM- e S-SEPHAROSE® e SEPHAROSE® Fast Flow, e Capto™ S estão todos disponíveis na GE Healthcare. Além disso, ambos os copolímeros de etileno glicol- metacrilato derivados de DEAE e CM, tais como, TOYOPEARL™ DEAE-650S ou M e TOYOPEARL™ CM-650S ou M são disponíveis na Toso Haas Co., Filadélfia, Pa., ou Nuvia S e UNOSphere™ S de BioRad, Hercules, Calif., Eshmuno® S de EMD Millipore, MA.
[00200] Como usado aqui, o termo "resina de cromatografia de interação hidrofóbica" pode incluir uma fase sólida, que pode ser covalentemente modificada com fenila, octila, butila ou similares. Ela pode usar as propriedades de hidrofobicidade para separar as moléculas umas das outras. Neste tipo de cromatografia, grupos hidrofóbicos, tais como, fenila, octila, hexila ou butila podem formar a fase estacionária da coluna. Moléculas como, proteínas, peptídeos e similares passam por uma coluna de HIC (cromatografia hidrofóbica interativa) que possui uma ou mais regiões hidrofóbicas em sua superfície ou possui bolsas hidrofóbicas e são capazes de interagir com grupos hidrofóbicos compreendendo uma fase estacionária de HIC. Exemplos de resinas de HIC ou suporte incluem fenil sefarose FF, Capto fenila (GE Healthcare, Uppsala, Suécia), fenila 650-M (Tosoh Bioscience, Tóquio, Japão) e Sartobind fenila (corporação Sartorius, Nova York, EUA).
[00201] Como usado aqui, o termo "Cromatografia de modo misto" ou "cromatografia multimodal" (ambas "MMC") inclui um método cromatográfico em que os solutos interagem com uma fase estacionária por meio de mais de um modo ou mecanismo de interação. A MMC pode ser usada como uma ferramenta alternativa ou complementar à tradicional cromatografia de fase reversa (RP), troca de íon (IEX) e fase normal (NP). Ao contrário da cromatografia de RP, NP e IEX, em que interação hidrofóbica, interação hidrofílica e interação iônica, respectivamente são os modos de interação dominantes, a cromatografia de modo misto pode empregar uma combinação de dois ou mais desses modos de interação. Os meios de cromatografia de modo misto podem fornecer seletividade única que não pode ser reproduzida por cromatografia de modo único. A cromatografia de modo misto também pode fornecer economia potencial de custos, vida útil de coluna mais longa e flexibilidade de operação em comparação com métodos baseados em afinidade. Em algumas modalidades exemplares, a cromatografia de modo misto pode ser composta por ligantes de modo misto acoplados a um suporte orgânico ou inorgânico, algumas vezes denotada como matriz base, diretamente ou por meio de um espaçador. O suporte pode ser na forma de partículas, tais como, partículas essencialmente esféricas, um monólito, filtro, membrana, superfície, capilares, etc. Em algumas modalidades exemplares, o suporte pode ser preparado a partir de um polímero nativo, tal como, material de carboidrato reticulado ligado, tais como, agarose, agPV, celulose, dextrano, quitosana, konjac, carragenina, gelano, alginato, etc. Para obter altas capacidades de adsorção, o suporte pode ser poroso e ligantes são então acoplados às superfícies externas, bem como, às superfícies dos poros. Esses suportes de polímero nativo podem ser preparados de acordo com métodos padrão, tal como, gelificação em suspensão inversa (S Hjerten: Biochim Biophys Acta 79 (2), 393-398 (1964), cujos ensinamentos são aqui incorporados). Alternativamente, o suporte pode ser preparado a partir de um polímero sintético, tais como, polímeros sintéticos reticulados, por exemplo, estireno ou derivados de estireno, divinilbenzeno, acrilamidas, ésteres de acrilato, ésteres de metacrilato, ésteres de vinila, vinil amidas e similares. Esses polímeros sintéticos podem ser produzidos de acordo com métodos padrão, por exemplo, "Styrene based polymer supports developed by suspension polymerization" (R Arshady: Chimica e Llndustria 70 (9), 70-75 (1988), todos os ensinamentos dos quais são aqui incorporados). Suportes de polímero sintético ou nativo poroso também estão disponíveis em fontes comerciais, tal como, GE Healthcare, Uppsala, Suécia.
[00202] Como usado aqui, o termo "espectrômetro de massa" inclui um dispositivo capaz de identificar espécies moleculares específicas e medir suas massas precisas. O termo destina-se a incluir qualquer detector molecular no qual um polipeptídeo ou peptídeo pode ser caracterizado. Um espectrômetro de massa pode incluir três partes principais: a fonte de íon, o analisador de massa, e o detector. O papel da fonte de íon é criar íons de fase gasosa. Átomos de analito, moléculas, ou agrupamentos podem ser transferidos para fase gasosa e ionizado concomitantemente (como na ionização por eletropulverização) ou por meio de processos separados. A escolha de fonte de íon depende da aplicação. Em algumas modalidades exemplares, o espectrômetro de massa pode ser um espectrômetro de massa em tandem. Como usado aqui, o termo "espectrometria de massa em tandem" inclui uma técnica onde a informação estrutural nas moléculas de amostra é obtida usando múltiplos estágios de seleção de massa e separação de massa. Um pré-requisito é que as moléculas de amostra sejam transformadas em uma fase gasosa e ionizadas de modo que os fragmentos sejam formados de forma previsível e controlável após a primeira etapa de seleção de massa. MS/MS, ou MSNmultiestágio, pode ser realizada primeiro selecionando e isolando um íon precursor (MS2), fragmentando-o, isolando um íon de fragmento primário (MS3), fragmentando-o, isolando um fragmento secundário (MS4), e assim por diante, contanto que se possa obter informações significativas, ou o sinal de íon de fragmento seja detectável. MS em tandem foi realizada com sucesso com uma ampla variedade de combinações de analisador. Cujos analisadores para combinar para uma determinada aplicação pode ser determinado por muitos fatores diferentes, tais como sensibilidade, seletividade e velocidade, mas também tamanho, custo e disponibilidade. As duas categorias principais de métodos de MS em tandem são tandem em espaço e tandem em tempo, mas também existem híbridos onde analisadores em tandem em tempo são acoplados no espaço ou com analisadores em tandem em espaço. Um espectrômetro de massa em tandem em espaço compreende uma fonte de íon, um dispositivo de ativação de íon precursor, e pelo menos dois analisadores de massa sem armadilha. Funções de separação m/z específica podem ser projetadas de modo que em uma seção dos íons de instrumento são selecionadas, dissociadas em uma região intermediária, e os íons de produto são então transmitidos para o outro analisador para separação de m/z e aquisição de dados. Íons de espectrômetro de massa em tandem em tempo produzidos em uma fonte de íon podem ser aprisionados, isolados, fragmentados, e separados por m/z no mesmo dispositivo físico. Os peptídeos identificados pelos espectrômetros de massa podem ser usados como substitutos representativos da proteína intacta e suas modificações pós translacionais. Eles podem ser usados para caracterização de proteína correlacionando dados de MS/MS experimentais e teóricos, o último dos peptídeos possíveis gerados em uma base de dados de sequência de proteína. A caracterização inclui, mas não é limitada a sequenciar aminoácidos dos fragmentos de proteína, determinar sequenciamento de proteína, determinar sequenciamento de proteína de novo, localizar modificações pós- translacionais, ou identificar modificações pós translacionais, ou análise de compatibilidade, ou combinações dos mesmos.
[00203] Como usado aqui, "Mini-Trap" ou "MiniTrap" ou "molécula de ligação MiniTrap" é capaz de se ligar a uma molécula de VEGF. Tais MiniTraps podem incluir (i) polipeptídeos quiméricos bem como (ii) moléculas multiméricas (por exemplo, diméricas) compreendendo dois ou mais polipeptídeos que são ligados não covalentemente, por exemplo, por um ou mais pontes de dissulfeto. MiniTraps podem ser produzidas por meio de modificação química, atividade enzimática, ou fabricadas de forma recombinante.
[00204] Como usado aqui, "MiniTrap de VEGF" ou "molécula de ligação MiniTrap de VEGF" pode ser uma molécula ou complexo de moléculas que se liga à VEGF e tem um ou mais conjuntos de domínios tipo Ig de receptor de VEGF (ou variantes dos mesmos) (por exemplo, domínio 2 de Ig de VEGFR e/ou domínio 3 e/ou 4 de Ig de VEGFR2) e um componente de multimerização ausente ou modificado (MC), por exemplo, em que o MC é uma imunoglobulina Fc modificada. A modificação pode ser o resultado de digestão proteolítica de uma armadilha de VEGF (por exemplo, aflibercepte ou conbercept) ou expressão direta das cadeias de polipeptídeo resultantes com a sequência de MC encurtada. (Ver a estrutura molecular representada em FIGURA B1.) FIGURA 1 é uma representação de uma molécula deMiniTrap de VEGF, que é o produto de proteólise de aflibercepte com IdeS de Streptococcus pyogenes. A molécula homodimérica é representada tendo um fragmento de domínio de articulação de Ig conectado por duas ligações de dissulfeto paralelas. O domínio de VEGFR1, o domínio de VEGFR2 e o fragmento de domínio de articulação (MC) são indicados. O ponto em aflibercepte onde clivagem de IdeS ocorre é indicado com um "//". O fragmento de Fc clivado de aflibercepte é também indicado. Um único polipeptídeo quimérico, que não é dimerizado, pode também ser um MiniTrap de VEGF se ele tiver atividade de ligação a VEGF. O termo "MiniTrap de VEGF" inclui um único polipeptídeo compreendendo um primeiro conjunto de um ou mais domínios de Ig de receptor de VEGF (ou variantes dos mesmos), sem um MC, mas fundidos com um ligante (por exemplo, um ligante de peptídeo) a um ou mais conjuntos adicionais de um ou mais domínios de Ig de receptor de VEGF (ou variantes dos mesmos). Os domínios de ligação a VEGF em uma MiniTrap de VEGF da presente invenção podem ser idênticos ou diferentes de outros (ver WO2005/00895, todos os ensinamentos dos quais são aqui incorporados).
[00205] Por exemplo, em uma modalidade da invenção, o domínio de Fc de imunoglobulina não modificado compreende uma sequência de aminoácido ou aminoácidos 1-226 da mesma:DKTHTCPX1CPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQD WLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELT KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKX2TPPVLDSDGSFF LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 33; em que X1é L ou P e X2 é A ou T)
[00206] Inibição de VEGF inclui, por exemplo, antagonismo de ligação de VEGF ao receptor de VEGF, por exemplo, por competição com receptor de VEGF para ligação de VEGF (por exemplo, VEGF110, VEGF121 e/ou VEGF165). Tal inibição pode resultar em inibição de ativação mediada por VEGF de VEGFR, por exemplo, inibição de expressão de luciferase em uma linhagem celular (por exemplo, HEK293) expressando receptor de VEGF quimérico (por exemplo, um homodímero dos mesmos) tendo domínios extracelulares de VEGFR fundidos a domínios intracelulares IL18Rα e/ou IL18Rβ na superfície da célula e tendo também um gene repórter NFkB-luciferase-IRES-eGFP, por exemplo, a linhagem celular HEK293/D9/Flt-IL18Rα/Flt-IL18Rβ como descrito aqui.
[00207] Os componentes de domínio de Ig de receptor de VEGF de MiniTraps de VEGF da presente invenção podem incluir: (i) um ou mais do domínio 2 (Ig) tipo imunoglobulina de VEGFR1 (Flt1) (R1D2), (ii) um ou mais do domínio 3 de Ig de VEGFR2 (Flk1 ou KDR) (Flk1D3) (R2D3), (iii) um ou mais do domínio 4 de Ig de VEGFR2 (Flk1 ou KDR) (Flk1D4) (R2D4) e/ou (iv) um ou mais do domínio 3 de Ig de VEGFR3 (Flt4) (Flt1D3 ou R3D3).
[00208] Domínios tipo imunoglobulina de receptores de VEGF podem ser referidos aqui como domínios de "Ig" de VEGFR. Domínios de Ig de VEGFR que são referidos aqui, por exemplo, R1D2 (que podem ser referidos aqui como VEGFR1(d2)), R2D3 (que podem ser referidos aqui como VEGFR2(d3)), R2D4 (que podem ser referidos aqui como VEGFR2(d4)) e R3D3 (que podem ser referidos aqui como VEGFR3(d3)) destinam-se a englobar não apenas o domínio de Ig tipo selvagem completo, mas também variantes dos mesmos que substancialmente retém as características funcionais do domínio tipo selvagem, por exemplo, retém a capacidade de formar um domínio de ligação de VEGF funcionando quando incorporados em uma MiniTrap de VEGF. Será facilmente evidente para alguém versado na técnica que numerosas variantes dos domínios de Ig acima, que irão reter substancialmente as mesmas características funcionais como o domínio tipo selvagem, podem ser obtidas.
[00209] A presente invenção fornece um polipeptídeo MiniTrap de VEGF compreendendo a seguinte estrutura de domínio: - ((R1D2)-(R2D3))a-ligante-((R1D2)-(R2D3))b; - ((R1D2)-(R2D3)-(R2D4))c-ligante-((R1D2)-(R2D3)-(R2D4))d; - ((R1D2)-(R2D3))e-(MC)g; - ((R1D2)-(R2D3)-(R2D4))f-(MC)g; em que, - R1D2 é o domínio 2 de Ig de receptor 1 de VEGF (VEGFR1) (D2); - R2D3 é o domínio 3 de Ig de VEGFR2; - R2D4 é o domínio 4 de Ig de VEGFR2; - MC é um componente de multimerização (por exemplo, um domínio de articulação de IgG ou fragmento do mesmo, por exemplo, de IgG1); - ligante é um peptídeo compreendendo cerca de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 aminoácidos, por exemplo, (GGGS)g;(SEQ ID NO: 104) e, Independentemente, a= 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15; b= 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15; c= 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15; d= 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15; e= 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15; f= 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15; e g= 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15.
[00210] Em uma modalidade da invenção, R1D2 compreende uma sequência de aminoácido: SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLI PDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTN TIID (SEQ ID NO: 34). Em um aspecto, o R1D2 não tem o SDT N- terminal.
[00211] Em uma modalidade da invenção, R1D2 compreende uma sequência de aminoácido: PFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRI IWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQT (SEQ ID NO: 35).
[00212] Em uma modalidade da invenção, R2D3 compreende uma sequência de aminoácido: VVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKL VNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNS TFVRVHEK (SEQ ID NO: 36).
[00213] Em uma modalidade da invenção, R2D4 compreende uma sequência de aminoácido: PFVAFGSGMESLVEATVGERVRIPAKYLGYPPPEIKWYKNGIPLESN HTIKAGHVLTIMEVSERDTGNYTVILTNPISKEKQSHVVSLVVYVPPGP G (SEQ ID NO: 37).
[00214] Em uma modalidade da invenção, R2D4 compreende uma sequência de aminoácido: FVAFGSGMESLVEATVGERVRIPAKYLGYPPPEIKWYKNGIPLESNHT IKAGHVLTIMEVSERDTGNYTVILTNPIKSEKQSHVVSLVVYVP (SEQ ID NO: 38).
[00215] Em uma modalidade da invenção, um componente de multimerização (MC) para uso em uma MiniTrap de VEGF é um peptídeo, por exemplo, uma imunoglobulina Fc modificada (por exemplo, de um IgG1) que é capaz de se ligar a outro componente de multimerização. Em um aspecto, um MC é uma imunoglobulina Fc modificada que inclui a região de articulação de imunoglobulina. Por exemplo, em uma modalidade da invenção, um MC é um peptídeo compreendendo uma ou mais (por exemplo, 1,2, 3, 4, 5 ou 6) cisteínas que são capazes de formar um ou mais pontes de cisteína com cisteínas em outro MC, por exemplo, DKTHTCPPC (SEQ ID NO: 39), DKTHTCPPCPPC (SEQ ID NO: 40), DKTHTCPPCPPCPPC (SEQ ID NO: 41), DKTHTC(PPC)h, em que h é 1,2, 3, 4, ou 5, (SEQ ID NO. 105), DKTHTCPPCPAPELLG (SEQ ID NO: 60), DKTHTCPLCPAPELLG (SEQ ID NO: 43), DKTHTC (SEQ ID NO: 44) ou DKTHTCPLCPAP (SEQ ID NO: 45).
[00216] A presente invenção também fornece um polipeptídeo MiniTrap de VEGF compreendendo a seguinte estrutura de domínio: (i) (R1D2)a-(R2D3)b-(MC)c; ou (ii) (R1D2)a-(R2D3)b-(R2D4)c-(MC)d; que pode ser homodimerizada com um segundo dos referidos polipeptídeos, por exemplo, por ligação entre os MCs de cada polipeptídeo, em que (i) referida coordenada de domínios de R1D2; (ii) referida coordenada de domínios de R2D3; e/ou (iii) referida coordenada de domínios de R2D4, formam um domínio de ligação de VEGF dimérico.
[00217] Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo MiniTrap de VEGF compreende a sequência de aminoácido: SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPN36ITVTLKKFPLDTL IPDGKRIIWDSRKGFIISN68ATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQ TNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLN123CTARTELNVGIDFNWEYPSSK HQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGL MTKKNi96STFVRVHEKDKTHTCPPCPAPELLG(SEQ ID NO: 46; MC sublinhado);GRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKF PLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLT HRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPS SKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLST1LTIDGVTRSDQGLYTCAAS SGLMTKKNSTFVRVHENLSVAFGSGMESLVEATVGERVRIPAKYLGY PPPEIKWYKNGIPLESNHTIKAGHVLTIMEVSERDTGNYTVILTNPISK EKQSHVVSLVVYVPPGPGDKTHTCPLCPAPELLG (SEQ ID NO: 47; MC sublinhado); SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPN36ITVTLKKFPLDTL IPDGKRIIWDSRKGFIISN68ATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQ TNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLN123CTARTELNVGIDFNWEYPSSK HQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGL MTKKN196STFVRVHEKDKTHTCPPC (SEQ ID NO: 48; MC sublinhado); SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPN36ITVTLKKFPLDTL IPDGKRIIWDSRKGFIISN68ATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQ TNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLN123CTARTELNVGIDFNWEYPSSK HQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGL MTKKN196STFVRVHEKDKTHTCPPCPPC (SEQ ID NO: 49; MC sublinhado); SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPN36ITVTLKKFPLDTL IPDGKRIIWDSRKGFIISN68ATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQ TNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLN123CTARTELNVGIDFNWEYPSSK HQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGL MTKKN196STFVRVHEKDKTHTCPPCPPCPPC (SEQ ID NO: 50; MC sublinhado); ouSDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDT LIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQT NTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQ HKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMT KKNSTFVRVHEKDKTHTC-(PPC)X (MC sublinhado; em que x é 1, 2, 3, 4 ou 5.) (SEQ ID NO. 106). Como descrito, tais polipeptídeos podem ser multimerizados (por exemplo, dimerizados (por exemplo, homodimerizados)) em que ligação entre os polipeptídeos é mediada por meio dos componentes de multimerização. Em uma modalidade da invenção, o domínio 2 tipo Ig de VEGFR1 das MiniTraps de VEGF monomérico da presente invenção, têm glicosilação ligada à N em N36 e/ou N68; e/ou uma ponte de dissulfeto de intercadeia entre C30 e C79; e/ou, o domínio 3 tipo Ig de VEGFR2 das MiniTraps de VEGF monomérico da presente invenção, têm glicosilação ligada à N em N123 e/ou N196; e/ou uma ponte de dissulfeto de intercadeia entre C124 e C185. Em uma modalidade da invenção, a MiniTrap de VEGF compreende a estrutura: • (R1D2)I-(R2D3)I-(G4S)3-(R1D2)I-(R2D3)I; ("(G4S)3 descrito como SEQ ID NO: 107); • (R1D2)1-(R2D3)1-(G4S)6-(R1D2)1-(R2D3)1; ("(G4S)6 descrito como SEQ ID NO: 108); • (R1D2)1-(R2D3)1-(G4S)9-(R1D2)1-(R2D3)1; ("(G4S)9 descrito como SEQ ID NO: 109); • (R1D2)1-(R2D3)1-(G4S)12-(R1D2)1-(R2D3)1. ("(G4S)12 descrito como SEQ ID NO: 110), G4S é -Gly-Gly-Gly-Gly-Ser- (SEQ ID NO:111) Em uma modalidade da invenção, a MiniTrap de VEGF compreende uma sequência de aminoácido: (i) SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLI PDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTN TIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQH KKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTK KNSTFVRVHE KGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSSD TGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPD GKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTII DVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKK LVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKN STFVRVHEK (SEQ ID NO: 51; ligante sublinhado); (iii) SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLI PDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTN TIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQH KKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTK KNSTFVRVHEKGGGGSGGGGSGGGGSSDTGRPFVEMYSEIPEIIHM TEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATY KEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKL VLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKF LSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEK (SEQ ID NO: 52; ligante sublinhado); (iv) SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLI PDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTN TIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQH KKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTK KNSTFVRVHEKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSG GGGSGGGGSGGGGSSDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVT SPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVN GHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVG IDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQ GLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEK (SEQ ID NO: 53; ligante sublinhado) (v) SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLI PDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTN TIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQH KKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTK KNSTFVRVHEKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSG GGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSSDTGRPFVEMYSEI PEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFI ISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELS VGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGS EMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEK (SEQ ID NO: 54; ligante sublinhado); ou (vi) SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLI PDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTN TIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQH KKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTK KNSTFVRVHEK-(GGGGS)x - SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLI PDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTN TIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQH KKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTK KNSTFVRVHEK (SEQ ID NO: 112) (em que x é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15). Como descrito aqui, estes polipeptídeos podem compreender uma estrutura secundária em que domínios tipo Ig de VEGFR se associam para formar um domínio de ligação de VEGF intercadeia (por exemplo, FIGURA 2). Em uma modalidade da invenção, dois ou mais de tais polipeptídeos multimerizam (por exemplo, dimerizam (por exemplo, homodimerizam)) em que os domínios de Ig de VEGFR de cada cadeia se associam com domínios tipo Ig de outra cadeia para formar um domínio de ligação de VEGF intercadeia.
[00218] Em uma certa modalidade da invenção, uma MiniTrap de VEGF da presente invenção não tem qualquer modificação significante dos resíduos de aminoácido de um polipeptídeo MiniTrap de VEGF (por exemplo, modificação química modificada tal como PEGuilação ou iodoacetamidação, por exemplo, nas terminações N e/ou C).
[00219] Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo compreende uma estrutura secundária em que domínios tipo Ig de VEGFR em um único polipeptídeo quimérico (por exemplo, (R1D2)a- (R2D3)b-ligante-(R1 D2)c-(R2D3)d; ou (R1 D2)a-(R2D3)b-(R2D4)c-ligante- (R1D2)d-(R2D3)e-(R2D4)f) ou em polipeptídeos quiméricos separados (por exemplo, homodímeros) coordenados para formar um domínio de ligação de VEGF. Por exemplo, em que (i) referida coordenada de domínios de R1D2; (ii) referida coordenada de domínios de R2D3; e/ou (iii) referida coordenada de domínios de R2D4, formam um domínio de ligação de VEGF. FIGURA 2 é uma descrição de uma MiniTrap de VEGF de cadeia única representando tal coordenação de domínio. O VEGFR1, VEGFR2 e domínios de ligantes são indicados. O ligante mostrado é (G4S)6 (SEQ ID NO: 108). A presente invenção inclui MiniTraps de VEGF de cadeia única com um ligante (G4S)3 (SEQ ID NO: 107).; (G4S)9 (SEQ ID NO: 109) ou (G4S)12(SEQ ID NO: 110).
[00220] Além disso, a presente invenção também fornece um complexo compreendendo uma MiniTrap de VEGF como descrito aqui complexada com um polipeptídeo de VEGF ou um fragmento do mesmo ou fusões do mesmo. Em uma modalidade da invenção, o VEGF (por exemplo, VEGF165) é homodimerizado e/ou a MiniTrap de VEGF é homodimerizada em um complexo de 2:2 (2 VEGFs:2 MiniTraps) e/ou MiniTrap de VEGF é homodimerizada em um complexo de 1:1. Complexos podem incluir moléculas de VEGF homodimerizadas ligadas a polipeptídeos MiniTrap de VEGF homodimerizada. Em uma modalidade da invenção, o complexo está in vitro (por exemplo, imobilizado em um substrato sólido) ou está no corpo de um indivíduo. A presente invenção também inclui uma composição de complexos de um dímero de VEGF (por exemplo, VEGF165) complexado com uma MiniTrap de VEGF.
[00221] Como usado aqui, o termo "proteína" ou "proteína de interesse" pode incluir qualquer polímero de aminoácido tendo ligações de amida covalentemente ligadas. Exemplos de proteínas de interesse incluem, mas não são limitados a aflibercepte e MiniTrap. Proteínas compreendem um ou mais polímero de cadeias de aminoácido, geralmente conhecidas na técnica como "polipeptídeos". "Polipeptídeo" se refere a um polímero composto de resíduos de aminoácido, variantes estruturais de ocorrência natural relacionadas, e análogos de ocorrência não natural sintéticos dos mesmos ligados por meio de ligações de peptídeo. "Peptídeo ou polipeptídeo sintético" se refere a um peptídeo ou polipeptídeo de ocorrência não natural. Peptídeos ou polipeptídeos sintéticos podem ser sintetizados, por exemplo, usando um sintetizador de polipeptídeo automatizado. Vários métodos de síntese de peptídeo de fase sólida são conhecidos por aqueles versados na técnica. Uma proteína pode compreender um ou múltiplos polipeptídeos para formar uma única biomolécula funcionando. Em outro aspecto exemplar, uma proteína pode incluir fragmentos de anticorpo, nanocorpos, quimeras de anticorpo recombinante, citocinas, quimiocinas, hormônios de peptídeo, e similares. Proteínas de interesse pode incluir quaisquer proteínas bioterapêuticas, proteínas recombinantes usadas em pesquisa ou terapia, proteínas armadilhas e outras proteínas de fusão Fc de receptor quimérico, proteínas quiméricas, anticorpos, anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos humanos, e anticorpos biespecíficos. Em um indivíduo em particular, a proteína de interesse é uma proteína de fusão anti-VEGF (por exemplo, aflibercepte ou MiniTrap). Proteínas podem ser produzidas usando sistemas de produção com base em célula recombinante, tal como o sistema de baculovírus de inseto, sistemas de levedura (por exemplo, Pichia sp.), e sistemas mamíferos (por exemplo, células CHO e derivados de CHO como células CHO-K1). Para uma revisão recente discutindo proteínas bioterapêuticas e sua produção, ver Ghaderi et al., "Production platforms for biotherapeutic glycoproteins. Occurrence, impact, and challenges of non-human sialylation," (Darius Ghaderi et al., Production platforms for biotherapeutic glycoproteins. Occurrence, impact, and challenges of non-human sialylation, 28 BIOTECHNOLOGY AND GENETIC ENGINEERING REVIEWS 147-176 (2012), todos os ensinamentos dos quais são aqui incorporados). Em algumas modalidades exemplares, proteínas compreendem modificações, adutos, e outras porções covalentemente ligadas. Estas modificações, adutos e porções incluem, por exemplo, avidina, estreptavidina, biotina, glicanos (por exemplo, N- acetilgalactosamina, galactose, ácido neuramínico, N-acetilglucosamina, fucose, manose, e outros monossacarídeos), PEG, poli-histidina, FLAGtag, proteína de ligação à maltose (MBP), proteína de ligação à quitina (CBP), myc-epítopo de glutationa-S-transferase (GST), marcações fluorescentes e outros corantes, e similares. Proteínas podem ser classificadas com base nas composições e solubilidade e pode, assim, incluir proteínas simples, tais como, proteínas globulares e proteínas fibrosas; proteínas conjugadas, tais como, nucleoproteínas, glicoproteínas, mucoproteínas, cromoproteínas, fosfoproteínas, metaloproteínas e lipoproteínas; e proteínas derivadas, tais como, proteínas primárias derivadas e proteínas secundárias derivadas.
[00222] Em algumas modalidades exemplares, a proteína de interesse pode ser uma proteína recombinante, um anticorpo, um anticorpo biespecífico, um anticorpo multiespecífico, fragmento de anticorpo, anticorpo monoclonal, proteína de fusão, scFv e combinações dos mesmos.
[00223] Como usado aqui, o termo "proteína de recombinante" se refere a uma proteína produzida como o resultado da transcrição e tradução de um gene carregado em um vetor de expressão recombinante que foi introduzido em uma célula hospedeira adequada. Em certas modalidades exemplares, a proteína recombinante pode ser uma proteína de fusão. Em um indivíduo em particular, a proteína recombinante é uma proteína de fusão anti-VEGF (por exemplo, aflibercepte ou MiniTrap). Em certas modalidades exemplares, a proteína recombinante pode ser um anticorpo, por exemplo, um anticorpo quimérico, humanizado, ou completamente humano. Em certas modalidades exemplares, a proteína recombinante pode ser um anticorpo de um isotipo selecionado do grupo consistindo em: IgG, IgM, IgA1, IgA2, IgD ou IgE. Em certas modalidades exemplares a molécula de anticorpo é um anticorpo de tamanho natural (por exemplo, um IgG1) ou alternativamente o anticorpo pode ser um fragmento (por exemplo,um fragmento de Fc ou um fragmento de Fab).
[00224] O termo "anticorpo," como usado aqui inclui moléculas de imunoglobulina compreendendo quatro cadeias de polipeptídeo, duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interconectadas por ligações de dissulfeto, bem como multímeros dos mesmos (por exemplo, IgM). Cada cadeia pesada compreende uma região variável de cadeia pesada (abreviada aqui como HCVR ou VH) e uma região constante de cadeia pesada. A região constante de cadeia pesada compreende três domínios, CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve compreende uma região variável de cadeia leve (abreviada aqui como LCVR ou VL) e uma região constante de cadeia leve. A região constante de cadeia leve compreende um domínio (CL1). As regiões VH e VL podem também ser subdivididas em regiões de hipervariabilidade, chamadas regiões de determinação de complementaridade (CDRs), intercaladas com regiões que são mais conservadas, chamadas regiões de estrutura (FR). Cada VH e VL é composta por três CDRs e quatro FRs, arranjadas do terminal amino ao terminal carbóxi na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4. Em diferentes modalidades da invenção, as FRs do anticorpo anti-big-ET-1 (ou porção de ligação ao antígeno dos mesmos) podem ser idênticas às sequências de linha germinativa humana ou podem ser naturalmente ou artificialmente modificadas. Uma sequência de consenso de aminoácido pode ser definida com base em uma análise lado a lado de duas ou mais CDRs. O termo "anticorpo," como usado aqui, também inclui fragmentos de ligação ao antígeno de moléculas de anticorpo completas. Os termos "porção de ligação ao antígeno" de um anticorpo, "fragmento de ligação ao antígeno" de um anticorpo, e similares, como usado aqui, incluem qualquer polipeptídeo ou glicoproteína de ocorrência natural, obtido enzimaticamente, sintético ou geneticamente modificado que se especificamente se liga a um antígeno para formar um complexo.Fragmentos de ligação ao antígeno de um anticorpo podem ser derivados, por exemplo, de moléculas de anticorpo completas usando quaisquer técnicas padrão adequadas tais como digestão proteolítica ou técnicas de modificação genética recombinante envolvendo a manipulação e expressão de DNA codificando anticorpo variável e domínios opcionalmente constantes. Tal DNA é conhecido e/ou está prontamente disponível de, por exemplo, fontes comerciais, bibliotecas de DNA (incluindo, por exemplo, bibliotecas de fago-anticorpo), ou pode ser sintetizado. O DNA pode ser sequenciado e quimicamente manipulado ou usando técnicas de biologia molecular, por exemplo, para arranjar um ou mais domínios variáveis e/ou constantes em uma configuração adequada, ou para introduzir códons, criar resíduos de cisteínas, modificar, adicionar ou deletar aminoácidos, etc.
[00225] Como usado aqui, um "fragmento de anticorpo" inclui uma porção de um anticorpo intacto, tal como, por exemplo, a região de ligação ao antígeno ou variável de um anticorpo. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem, mas não são limitados a um fragmento de Fab, um fragmento de Fab’, um fragmento de F(ab’)2, um fragmento de scFv, um fragmento de Fv, um diacorpo de dsFv, um fragmento de dAb, um fragmento de Fd’, um fragmento de Fd, e uma região de determinação de complementaridade isolada (CDR), bem como triacorpos, tetracorpos, anticorpos lineares, moléculas de anticorpo de cadeia única, e anticorpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticorpo. Fragmentos de Fv são a combinação das regiões variáveis das cadeias de imunoglobulina pesada e leve, e proteínas de ScFv são moléculas de polipeptídeo de cadeia única recombinante em que regiões variáveis de cadeia leve e pesada de imunoglobulina são conectadas por um ligante de peptídeo. Em algumas modalidades exemplares, um fragmento de anticorpo compreende uma sequência de aminoácido suficiente do anticorpo principal do qual é um fragmento que se liga ao mesmo antígeno que o anticorpo principal; em algumas modalidades exemplares, um fragmento se liga ao antígeno com uma afinidade comparável àquela do anticorpo principal e/ou compete com o anticorpo principal pela ligação antígeno. Um fragmento de anticorpo pode ser produzido por quaisquer meios. Por exemplo, um fragmento de anticorpo pode produzido enzimaticamente ou quimicamente por fragmentação de um anticorpo intacto e/ou ele pode ser produzido recombinantemente de um gene codificando a sequência de anticorpo parcial. Alternativamente, ou adicionalmente, um fragmento de anticorpo pode ser totalmente ou parcialmente sinteticamente produzido. Um fragmento de anticorpo pode compreender opcionalmente um fragmento de anticorpo de cadeia única. Alternativamente, ou adicionalmente, um fragmento de anticorpo pode compreender cadeias múltiplas que são ligadas juntas, por exemplo, por ligações de dissulfeto. Um fragmento de anticorpo pode compreender opcionalmente um complexo multimolecular. Um fragmento de anticorpo funcional tipicamente compreende pelo menos cerca de 50 aminoácidos e mais tipicamente compreende pelo menos cerca de 200 aminoácidos.
[00226] O termo "anticorpo biespecífico" inclui um anticorpo capaz de ligar seletivamente duas ou mais epítopos. Anticorpos biespecíficos geralmente compreendem duas cadeias pesadas diferentes com cada cadeia pesada se ligando especificamente a um epítopo diferente — ou em duas moléculas diferentes (por exemplo, antígenos) ou na mesma molécula (por exemplo, no mesmo antígeno). Se um anticorpo biespecífico é capaz de ligar seletivamente dois epítopos diferentes (um primeiro epítopo e um segundo epítopo), a afinidade da primeira cadeia pesada para o primeiro epítopo será geralmente pelo menos uma a duas ou três ordens de magnitude inferior à afinidade da primeira cadeia pesada para o segundo epítopo, e vice-versa. Os epítopos reconhecidos pelo anticorpo biespecífico pode estar no mesmo ou em diferentes alvos (por exemplo, na mesma proteína ou em uma proteína diferente). Anticorpos biespecíficos podem ser feitos, por exemplo, combinando cadeias pesadas que reconhecem diferentes epítopos do mesmo antígeno. Por exemplo, sequências de ácido nucleico codificando sequências variáveis de cadeia pesada que reconhecem diferentes epítopos do mesmo antígeno podem ser fundidas a sequências de ácido nucleico codificando diferentes regiões constantes de cadeia pesada e tais sequências podem ser expressas em uma célula que expressa uma cadeia leve de imunoglobulina.
[00227] Um anticorpo biespecífico típico tem duas cadeias pesadas cada uma tendo três CDRs de cadeia pesada, seguidas por um domínio de CH1, uma articulação, um domínio de CH2, e um domínio CH3, e uma cadeia leve de imunoglobulina que não confere especificidade de ligação ao antígeno, mas que pode se associar com cada cadeia pesada, ou que pode se associar com cada cadeia pesada que pode ligar um ou mais dos epítopos ligados pelas regiões de ligação ao antígeno de cadeia pesada, ou que podem se associar com cada cadeia pesada e possibilizar a ligação de uma ou ambas das cadeias pesadas a um ou ambos os epítopos. BsAbs podem ser divididos em duas classes principais, aqueles que carregam uma região de Fc (tipo IgG) e aqueles que não têm uma região de Fc, os últimos normalmente sendo menores do que as moléculas biespecíficas de IgG e tipo IgG compreendendo um Fc. Os bsAbs tipo IgG podem ter formatos diferentes tais como, mas não limitados a, triomabe, saliências em orifícios IgG (kih IgG), crossMab, orth-Fab IgG, domínios de Igde dupla variável (DVD-Ig), Fab dois em um ou de dupla ação (DAF), Fv de cadeia única de IgG(IgG-scFv), ouKÀ-corpos. Os formatos diferentes tipo não IgG incluem scFvs em tandem, formato de diacorpo, anticorpo de cadeia única, diacorpos em tandem (TandAbs), molécula de redirecionamento de dupla afinidade (DART), DART-Fc, nanocorpos, ou anticorpos produzidos pelo método dock-and-lock (DNL) (Gaowei Fan, Zujian Wang &MingjuHao, anticorpos biespecíficos e as suas aplicações, 8 JOURNAL OF HEMATOLOGY & ONCOLOGY 130; Dafne Müller & Roland E. Kontermann, anticorpos biespecíficos, HANDBOOK OF THERAPEUTIC ANTIBODIES265-310 (2014),todos os ensinamentos dos quais são aqui incorporados). Os métodos de produção de bsAbs não estão limitados à tecnologia de quadroma com base na fusão somática de duas linhagens celulares de hibridoma diferentes, conjugação química, que envolve reticuladores químicos, e abordagens genéticas que utilizam tecnologia de DNA recombinante. Exemplos de bsAbs incluem aqueles divulgados nos seguintes pedidos de patente, que são aqui incorporados por referência: U.S. Ser. N°. 12/823838, arquivado em 25 de junho de 2010; U.S. Ser. N°. 13/ 488628, arquivado em 5 de junho de 2012; U.S. Ser. N° 14/031075, arquivado em 19 de setembro de 2013; U.S. Ser. N°. 14/808171, arquivado em 24 de julho de 2015; U.S. Ser. N°. 15/713574, arquivado em 22 de setembro de 2017; U.S. Ser. N°. 15/713569, arquivado em 22 de setembro de 2017; U.S. Ser. N°. 15/386453, arquivado em 21 de dezembro de 2016; U.S. Ser. N°. 15/386443, arquivado em 21 dedezembro de 2016; U.S. Ser. N°. 15/22343 arquivado em 29 de julho de 2016; e U.S. Ser. N°. 15814095, arquivado em 15 de novembro 2017. Baixos níveis de impurezas de homodímero podem estar presentes em várias etapas durante a produção de anticorpos biespecíficos. A detecção de tais impurezas de homodímero pode ser desafiadora quando realizada usando análise de massa intacta devido à baixa abundância das impurezas de homodímero e a co-eluição dessas impurezas com as espécies principais quando realizada usando um método cromatográfico líquido regular.
[00228] Como usado aqui "anticorpo multiespecífico" se refere a um anticorpo com especificidades de ligação para pelo menos dois antígenos diferentes. Embora tais moléculas normalmente se liguem apenas a dois antígenos (isto é, anticorpos biespecíficos, bsAbs), anticorpos com especificidades adicionais, tais como anticorpo triespecífico e KIH triespecífico, também podem ser endereçados pelo sistema e método aqui divulgado.
[00229] O termo "anticorpo monoclonal" como usado aqui não se limita a anticorpos produzidos através da tecnologia de hibridoma. Um anticorpo monoclonal pode ser derivado de um único clone, incluindo qualquer clone eucariótico, procariótico ou fágico, por qualquer meio disponível ou conhecido na técnica. Anticorpos monoclonais úteis com a presente divulgação podem ser preparados usando uma ampla variedade de técnicas conhecidas na técnica, incluindo o uso de tecnologias de hibridoma, recombinante e de exibição de fago, ou uma combinação das mesmas.
[00230] Em algumas modalidades exemplares, a proteína de interesse pode ter uma pl na faixa de cerca de 4,5 a cerca de 9,0. Em uma modalidade específica exemplar, a pI pode ser cerca de 4,5, cerca de 5,0, cerca de 5,5, cerca de 5,6, cerca de 5,7, cerca de 5,8, cerca de 5,9, cerca de 6,0, cerca de 6,1 cerca de 6,2, cerca de 6,3, cerca de 6,4, cerca de 6,5, cerca de 6,6, cerca de 6,7, cerca de 6,8, cerca de 6,9, cerca de 7,0, cerca de 7,1 cerca de 7,2, cerca de 7,3, cerca de 7,4, cerca de 7,5, cerca de 7,6, cerca de 7,7, cerca de 7,8, cerca de 7,9, cerca de 8,0, cerca de 8,1 cerca de 8,2, cerca de 8,3, cerca de 8,4, cerca de 8,5, cerca de 8,6, cerca de 8,7, cerca de 8,8, cerca de 8,9, ou cerca de 9,0. Em algumas modalidades exemplares, os tipos de proteína de interesse nas composições podem ser mais do que um.
[00231] Em algumas modalidades exemplares, a proteína de interesse pode ser produzida de células de mamíferos. As células de mamíferos podem ser de origem humana ou de origem não humana e podem incluir células epiteliais primárias (por exemplo, queratinócitos, células epiteliais cervicais, células epiteliais brônquicas, células epiteliais traqueais, células epiteliais renais e células epiteliais retinais),linhagens celulares estabelecidas e suas cepas (por exemplo, 293 células renais embrionárias, células BHK, células epiteliais cervicais HeLa e células retinais PER-C6, células MDBK (NBL-1), células 911, células CRFK, células MDCK, células CHO, células BeWo, células Chang, células Detroit 562, células HeLa 229, células HeLa S3, células Hep-2, células KB, células LSI80, células LS174T, células NCI-H-548, células RPMI2650, células SW-13, células T24, WI-28 VA13, células 2RA, células WISH, células BS-CI, células LLC-MK2, células clone M3, células 1-10, Células RAG, células TCMK-1, células Yl, células LLC- PKi, Células PK (15), células GHi, células GH3, células L2, células LLC- RC 256, células MHiCi, células XC, células MDOK, células VSW e TH- I, células B1, células BSC-1, células RAf, células RK, células PK-15 ou derivados das mesmas), células fibroblastos de qualquer tecido ou órgão (incluindo, mas não se limitando a coração, fígado, rim, cólon, intestinos, esôfago, estômago, tecido neural (cérebro, medula espinhal), pulmão, tecido vascular (artéria, veia, capilar), tecido linfoide (glândula linfática, adenoide, amígdala, medula óssea e sangue), baço e fibroblasto e linhagens celulares tipo fibroblastos (por exemplo, células CHO, células TRG-2, células IMR-33, células Don, células GHK-21, células de citrulinemia, células Dempsey, células Detroit 551, células Detroit 510, células Detroit 525, células Detroit 529, células Detroit 532, células Detroit 539, células Detroit 548, células Detroit 573, células HEL 299, células IMR-90, células MRC-5, células WI-38, células WI-26, células Midi, células CHO, células CV-1, células COS-1, células COS- 3, células COS-7, células Vero, células DBS-FrhL-2, células BALB/3T3, células F9, células SV-T2, células M-MSV-BALB/3T3, células K-BALB, Células BLO-11, células NOR-10, células C3H/IOTI/2, células HSDMÍC3, células KLN205, células McCoy, células L de camundongo, células da cepa 2071 (camundongo L), células da cepa L-M (camundongo L), células L-MTK' (camundongo L),clones NCTC 2472 e 2555, células SCC-PSA1, células Swiss/3T3, células muntjac indianas, células SIRC, células Cn e células Jensen, Sp2/0, NS0, células NS1 ou derivados das mesmas).
[00232] Como usado aqui, o termo "agente de alquilação de proteína" se refere a um agente usado para alquilar certos resíduos de aminoácido livres em uma proteína. Exemplos não limitantes de agentes de alquilação de proteínas são iodoacetamida (IOA), cloroacetamida (CAA), acrilamida (AA), N-etilmaleimida (NEM), metanotiossulfonato de metila (MMTS), e 4-vinilpiridina ou combinações dos mesmos.
[00233] Como usado aqui, "desnaturação de proteína" pode se referir a um processo em que a forma tridimensional de uma molécula é alterada de seu estado nativo. A desnaturação da proteína pode ser realizada usando um agente de desnaturação de proteína. Exemplos não limitantes de um agente de desnaturação de proteína incluem calor, pH alto ou baixo, agentes redutores como DTT (ver abaixo) ou exposição a agentes caotrópicos. Vários agentes caotrópicos podem ser usados como agentes de desnaturação de proteína. Os solutos caotrópicos aumentam a entropia do sistema interferindo nas interações intramoleculares mediadas por forças não covalentes, tais como ligações de hidrogênio, forças de van der Waals e efeitos hidrofóbicos. Exemplos não limitantes para agentes caotrópicos incluem butanol, etanol, cloreto de guanidínio, perclorato de lítio, acetato de lítio, cloreto de magnésio, fenol, propanol, dodecil sulfato de sódio, tioureia, N- lauroilsarcosina, ureia e sais dos mesmos.
[00234] Como usado aqui, o termo "agente de redução de proteína" se refere ao agente usado para redução de pontes de dissulfeto em uma proteína. Exemplos não limitantes do agente de redução de proteínasusado para reduzir a proteína são ditiotreitol (DTT), β- mercaptoetanol, reagente de Ellman, cloridrato de hidroxilamina, cianoborohidreto de sódio, cloridrato de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP- HCl), ou combinações dos mesmos.
[00235] Como usado aqui, o termo "variante" de um polipeptídeo (por exemplo, de um domínio de Ig de VEGFR) se refere a um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos cerca de 70 a 99,9% (por exemplo, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81,82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,5, 99,9%) idêntica ou similar à sequência de aminoácido referida ou nativa de uma proteína de interesse. Uma comparação de sequência pode ser realizada por, por exemplo, um algoritmo BLAST em que os parâmetros do algoritmo são selecionados para dar a maior correspondência entre as respectivas sequências ao longo de todo o comprimento das respectivas sequências de referência (por exemplo, limite esperado: 10; tamanho da palavra: 3; correspondências máximas em um intervalo de consulta: 0; matriz BLOSUM 62;custos de lacuna: existência 11, extensão 1; ajuste de matriz de pontuação de composição condicional). Variantes de um polipeptídeo (por exemplo, de um domínio de Ig de VEGFR) podem também se referir a um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos referenciada, exceto por uma ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10) mutações tais como, por exemplo, mutações de sentido errado (por exemplo, substituições conservativas), mutações sem sentido, deleções ou inserções. As seguintes referências se referem a algoritmos BLAST frequentemente usados para análise de sequência: BLAST ALGORITHMS: Altschul et al. (2005) FEBS J. 272(20): 5101-5109; Altschul, S. F., et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410; Gish, W., et al., (1993) NatureGenet. 3:266-272; Madden, T. L., et al., (1996) Meth. Enzymol. 266:131-141; Altschul, S. F., et al., (1997) NucleicAcids Res.25:3389-3402; Zhang, J., et al., (1997) Genome Res. 7:649-656;Wootton, J. C., et al., (1993) Comput. Chem. 17:149-163; Hancock, J. M. et al., (1994) Comput. Appl. Biosci. 10:67-70; ALIGNMENTSCORING SYSTEMS: Dayhoff, M. O., et al., "A model of evolutionary change in proteins." in Atlas of Protein Sequence and Structure, (1978) vol. 5, suppl. 3. M. O. Dayhoff (ed.), pp. 345-352, Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.; Schwartz, R. M., et al., "Matrices for detecting distant relationships." in Atlas of Protein Sequence and Structure, (1978) vol. 5, suppl. 3.'' M. O. Dayhoff (ed.), pp. 353-358, Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.; Altschul, S. F., (1991) J. Mol. Biol. 219:555-565; States, D. J., et al., (1991) Methods 3:66-70; Henikoff, S., et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919; Altschul, S. F., et al., (1993) J. Mol. Evol. 36:290-300; ALIGNMENT STATISTICS: Karlin, S., et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268; Karlin, S., et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877; Dembo, A., et al., (1994) Ann. Prob. 22:2022-2039; e Altschul, S. F. "Evaluating the statistical significance of multiple distinct local alignments." in Theoretical and Computational Methods in Genome Research (S. Suhai, ed.), (1997) pp. 1-14, Plenum, N.Y.; todos os ensinamentos dos quais são aqui incorporados.
[00236] Algumas variantes podem ser modificações covalentes que os polipeptídeos sofrem, durante (modificação co-tradução) ou após (modificação pós-tradução "PTM") sua síntese ribossômica. PTMs são geralmente introduzidas por enzimas específicas ou vias enzimáticas. Muitas ocorrem no local de uma sequência de proteína característica específica (por exemplo, sequência de assinatura) dentro da cadeia principal da proteína. Várias centenas de PTMs foram gravadas e estas modificações invariavelmente influenciam algum aspecto da estrutura ou função de uma proteína (Walsh, G. "Proteins" (2014) segunda edição, publicado por Wileyand Sons, Ltd., ISBN: 9780470669853, todos os ensinamentos dos quais são aqui incorporados). Em certas modalidades exemplares, uma composição de proteína pode compreender mais do que um tipo de variante de proteína de uma proteína de interesse.
[00237] Variantes de proteína no caso de aflibercepte (e proteínas compartilhando características estruturais de aflibercepte, por exemplo, uma ou mais regiões de cadeia pesada ou leve de aflibercepte) podem compreender, mas não são limitadas a, variantes de oxidação que podem resultar de oxidação de um ou mais resíduos de aminoácido ocorrendo em, por exemplo, resíduos de histidina, cisteína, metionina, triptofano, fenilalanina e/ou tirosina; variantes de desamidação que podem resultar da desamidação em resíduos de asparagina e/ou desoxiglucosonação em resíduos de arginina.
[00238] Com respeito a aflibercepte (e proteínas compartilhando características estruturais de aflibercepte por exemplo, uma ou mais regiões de cadeia pesada ou leve de aflibercepte) as variantes de oxidação podem compreender a oxidação do resíduo de histidina em His86, His110, His145, His209, His95, His19 e/ou His203 (ou posições de resíduos equivalentes em proteínas que compartilham certas características estruturais de aflibercepte); oxidação de resíduos de triptofano em Trp58 e/ou Trp138 (ou posições de resíduos equivalentes em proteínas que compartilham certas características estruturais de aflibercepte); oxidação de resíduos de tirosina em Tyr64 (ou posições equivalentes em proteínas que compartilham certas características estruturais de aflibercepte); oxidação de resíduos de fenilalanina em Phe44 e/ou Phe166 (ou posições de resíduos equivalentes em proteínas que compartilham certas características estruturais de aflibercepte); e/ou oxidação de resíduos de metionina em Met10, Met20, Met163 e/ou Met192 (ou posições de resíduos equivalentes em proteínas que compartilham certas características estruturais de aflibercepte).
[00239] Com respeito a aflibercepte (e proteínas compartilhando características estruturais de aflibercepte, por exemplo, uma ou mais regiões de cadeia pesada ou leve de aflibercepte) variantes de desamidação podem compreender desamidação de resíduo de asparagina em Asn84 e/ou Asn99 (ou posições de resíduos equivalentes em proteínas que compartilham certas características estruturais de aflibercepte).
[00240] Com respeito a aflibercepte (e proteínas compartilhando características estruturais de aflibercepte, por exemplo, uma ou mais regiões de cadeia pesada ou leve de aflibercepte) variante de desoxiglucosonação pode compreender 3-desoxiglucosonação de resíduo de arginina em Arg5 (ou posição de resíduo equivalente em proteínas que compartilham certas características estruturais de aflibercepte).
[00241] Variantes de proteína podem incluir ambas as espécies ácidas e espécies básicas. As espécies ácidas são tipicamente as variantes que eluem antes do pico principal de CEX ou depois do pico principal de AEX, enquanto as espécies básicas são as variantes que eluem depois do pico principal de CEX ou antes do pico principal de AEX.
[00242] Como usado aqui, os termos "espécies ácidas," "AS," "região ácida," e "AR," referem-se às variantes de uma proteína que são caracterizadas por uma carga ácida total. Por exemplo, em preparações de proteína recombinante tais espécies ácidas podem ser detectadas por vários métodos, tal como um trocador de íon, por exemplo, WCX-10 HPLC (uma cromatografia de troca catiônica fraca), ou IEF (focagem isoelétrica). Espécies ácidas de um anticorpo podem incluir variantes, variantes de estrutura, e/ou variantes de fragmentação. Variantes exemplares podem incluir, mas não são limitadas a variantes de desamidação, variantes de afucosilação, variantes de oxidação, variantes de metilglioxal (MGO), variantes de glicação e variantes de ácido cítrico. Variantes de estrutura exemplares incluem, mas não são limitadas a variantes de glicosilação e variantes de acetonação. Variantes de fragmentação exemplares incluem qualquer espécie de proteína modificada da molécula alvo devido à dissociação da cadeia de peptídeo, e/ou modificação químicas e/ou enzimática, incluindo, mas não se limitando a, fragmentos Fc e Fab, fragmentos sem um Fab, fragmentos sem um domínio variável de cadeia pesada, variantes de truncamento C-terminal, variantes com excisão de Asp N-terminal na cadeia leve e variantes com truncamento N-terminal da cadeia leve. Outras variantes de espécies ácidas incluem variantes compreendendo dissulfetos desemparelhados, proteínas de células hospedeiras e ácidos nucleicos hospedeiros, materiais cromatográficos e componentes de meio. Comumente, espécies ácidas eluem antes do pico principal durante CEX ou depois do pico principal durante a análise de AEX (Ver FIGURAS 16 e 17).
[00243] Em certas modalidades, uma composição de proteína pode compreender mais do que um tipo de variante de espécies ácida. Por exemplo, mas não como limitação, as espécies ácidas totais podem ser categorizadas com base no tempo de retenção cromatográfica dos picos que aparecem. Outro exemplo em que as espécies ácidas totais podem ser categorizadas pode ser baseado no tipo de variante - variantes, variantes de estrutura ou variante de fragmentação.
[00244] O termo "espécies ácidas" ou "AS" não se referem a impurezas relacionadas ao processo. O termo "impureza relacionada ao processo," como usado aqui, refere-se a impurezas que estão presentes em uma composição que compreende uma proteína, mas não são derivadas da própria proteína. Impurezas relacionadas ao processo incluem, mas não são limitadas a proteínas da célula hospedeira (HCPs), ácidos nucleicos da célula hospedeira, materiais cromatográficos e componentes de meio.
[00245] Em uma modalidade exemplar, a quantidade de espécies ácidas na composição anti-VEGF em comparação com a proteína de interesse podem ser no máximo cerca de 20%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4,5%, 4%, 3,5%, 3%, 2,5%, 2%, 1,9%, 1,8%, 1,7%, 1,6%, 1,5%, 1,4%, 1,3%, 1,2%, 1,1%, 1%, 0,9%, 0,8%, 0,7%, 0,6%, 0,5%, 0,4%, 0,3%, 0,2%, 0,1%, ou 0,0% e intervalos dentro de um ou mais dos anteriores. Exemplos de composições anti-VEGF são discutidas na Seção III abaixo. Em um aspecto, a composição anti- VEGF pode compreender uma proteína anti-VEGF selecionada a partir do grupo que consiste em aflibercepte, MiniTrap recombinante (exemplos dos quais são divulgados em Patente Norte Americana N°. 7,279,159), um scFv e outras proteínas anti-VEGF. Em um aspecto preferido, a proteína recombinante de interesse é aflibercepte.
[00246] Entre as vias de degradação química responsáveis por espécies ácidas ou básicas, as duas modificações covalentes mais comumente observadas que ocorrem em proteínas e peptídeos são a desaminação e a oxidação. Metionina, cisteína, histidina, triptofano e tirosina são alguns dos aminoácidos mais suscetíveis à oxidação: Met e Cys por causa de seus átomos de enxofre e His, Trp e Tyr por causa de seus anéis aromáticos.
[00247] Como usado aqui, os termos "espécies oxidativas", "OS" ou "variante de oxidação" referem-se às variantes de uma proteína formada por oxidação. Tais espécies oxidativas também podem ser detectadas por vários métodos, tais como troca iônica, por exemplo, WCX-10 HPLC (uma cromatografia de troca catiônica fraca) ou IEF (focagem isoelétrica). As variantes de oxidação podem resultar da oxidação que ocorre em resíduos de histidina, cisteína, metionina, triptofano, fenilalanina e/ou tirosina. Com respeito, em particular, a aflibercepte (e proteínas compartilhando características estruturais de aflibercepte, por exemplo, uma ou mais regiões de cadeia pesada ou leve de aflibercepte), as variantes de oxidação podem compreender a oxidação do resíduo de histidina em His86, His110, His145, His209, His95, His19 e/ou His203 (ou posições de resíduos equivalentes em proteínas que compartilham certas características estruturais de aflibercepte); oxidação de resíduos de triptofano em Trp58 e/ou Trp138 (ou posições de resíduos equivalentes em proteínas que compartilham certas características estruturais de aflibercepte); oxidação de resíduos de tirosina em Tyr64 (ou posições equivalentes em proteínas que compartilham certas características estruturais de aflibercepte); oxidação de resíduos de fenilalanina em Phe44 e/ou Phe166 (ou posições de resíduos equivalentes em proteínas que compartilham certas características estruturais de aflibercepte); e/ou oxidação de resíduos de metionina em Met10, Met 20, Met163 e/ou Met192 (ou posições de resíduos equivalentes em proteínas que compartilham certas características estruturais de aflibercepte).
[00248] Em uma modalidade exemplar, a quantidade das espécies oxidativas em uma composição anti-VEGF em comparação com uma proteína de interesse podem ser no máximo cerca de 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4,5%, 4%, 3,5%, 3%, 2,5%, 2%, 1,9%, 1,8%, 1,7%, 1,6%, 1,5%, 1,4%, 1,3%, 1,2%, 1,1%, 1%, 0,9%, 0,8%, 0,7%, 0,6%, 0,5%, 0,4%, 0,3%, 0,2%, 0,1%, ou 0,0% e intervalos dentro de um ou mais dos anteriores. Exemplos de composições anti- VEGF são descritos na Seção III abaixo. Em um aspecto, a composição anti-VEGF pode compreender uma proteína anti-VEGF selecionada do grupo que consiste em aflibercepte, MiniTrap recombinante (exemplos dos quais são divulgados em Patente Norte Americana N°. 7,279,159), um scFv e outras proteínas anti-VEGF. Em um aspecto preferido, a proteína recombinante de interesse é aflibercepte ou MiniTrap.
[00249] Os resíduos de cisteína podem sofrer oxidação espontânea para formar ligações dissulfeto intra ou intermoleculares ou subprodutos monomoleculares, tal como ácido sulfênico.
[00250] Os resíduos de histidina também são altamente sensíveis à oxidação por meio da reação com seus anéis de imidazol, que podem subsequentemente gerar espécies de hidroxila adicionais (Li, S, C Schoneich, e RT. Borchardt. 1995. Chemical Instability of Protein Pharmaceuticals: Mechanisms of Oxidation and Strategies for Stabilization. Biotechnol. Bioeng. 48:490-500, todos os ensinamentos dos quais são aqui incorporados). Os mecanismos propostos para a oxidação da histidina são destacados na FIGURA 2 e FIGURA 3. Estudos mecanísticos detalhados estão disponíveis em Anal. Chem. 2014, 86, 4940-4948 e J. Pharm. Biomed. Anal. 21 (2000) 1093-1097, todos os ensinamentos dos quais são aqui incorporados.
[00251] A oxidação da metionina pode levar à formação de sulfóxido de metionina (Li, S, C Schoneich, e RT. Borchardt. 1995. Chemical Instability of Protein Pharmaceuticals: Mechanisms of Oxidation and Strategies for Stabilization. Biotechnol. Bioeng. 48:490-500). Os vários mecanismos de oxidação possíveis dos resíduos de metionina foram descritos na literatura. (Brot, N., Weissbach, H. 1982. Biochemistry of methionine sulfoxide residues in proteins. Trends Biochem. Sci. 7: 137139, todos os ensinamentos dos quais são aqui incorporados).
[00252] A oxidação do triptofano pode gerar uma mistura complexa de produtos. Os produtos primários podem ser N-formilquinurenina e quinurenina junto com produtos de mono-oxidação, di-oxidação e/ou tri- oxidação (FIGURA 4). Os peptídeos com modificações de Trp oxidadas geralmente exibem aumentos de massa de 4, 16, 32 e 48 Da,correspondendo à formação de quinurenina (KYN), hidroxitriptofano (WOXI) e N-formilquinurenina/di-hidroxitriptofano (NFK/Wox2, referido também como "Trp duplamente oxidado"), tri-hidroxitriptofano (Wox3,também referido como "Trp triplamente oxidado") e suas combinações, tais como hidroxiquinurenina (KYNOXI, +20 Da). Oxidação em hidroxitriptofano (WOXI) foi descrita na literatura (Mass spectrometric identification of oxidative modification soft tryptophan residues in proteins: chemical artifactor post-translational modification? J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2010 Jul; 21(7): 1114-1117, todos os ensinamentos dos quais são aqui incorporados). A oxidação do triptofano, mas não a oxidação da metionina e da histidina, foi descoberto produzir uma mudança de cor em produtos proteicos (Characterization of the Degradation Products of a Color-Changed anticorpo monoclonal: Tryptophan-Derived Chromophores. dx.doi. Org/10.1021/ac404218t | Anal. Chem. 2014, 86, 6850-6857). Semelhante ao triptofano, a oxidação da tirosina produz principalmente 3,4-di-hidroxifenilalanina (DOPA) e ditrosina (Li, S, C Schoneich, e RT. Borchardt. 1995. Chemical Instability of Protein Pharmaceuticals: Mechanisms of Oxidation and Strategies for Stabilization. Biotechnol. Bioeng. 48: 490-500).
[00253] Como usado aqui, os termos "espécies básicas", "região básica" e "BR" referem-se às variantes de uma proteína, por exemplo, um anticorpo ou porção de ligação ao antígeno dos mesmos, que são caracterizados por uma carga básica geral, em relação às espécies variantes de carga primária presentes na proteína. Por exemplo, nas preparações de proteína recombinante, tais espécies básicas podem ser detectadas por vários métodos, tais como troca de íon, por exemplo, WCX-10 HPLC (uma cromatografia de troca catiônica fraca), ou IEF (focagem isoelétrica). Variantes exemplares podem incluir, mas não são limitadas a variantes de lisina, isomerização de ácido aspártico, formação de sucinimida na asparagina, oxidação de metionina, amidação, formação de ligação dissulfeto incompleta, mutação de serina para arginina, aglicosilação, fragmentação e agregação. Comumente, espécies básicas eluem depois do pico principal durante CEX ou antes do pico principal durante a análise AEX. (Chromatographic analysis of the acidic and basic species of recombinant monoclonal antibodies. MAbs. 1 de setembro de 2012; 4(5): 578-585. doi: 10.4161/mabs.21328, todos os ensinamentos dos quais são aqui incorporados.)
[00254] Em certas modalidades, uma composição de proteína pode compreender mais de um tipo de variante de espécie básica. Por exemplo, mas não como forma de limitação, as espécies básicas totais podem ser divididas com base no tempo de retenção cromatográfica dos picos que aparecem. Outro exemplo em que as espécies básicas totais podem ser divididas pode ser com base no tipo de variante - variantes, variantes de estrutura ou variante de fragmentação.
[00255] Como descrito para espécies ácidas, o termo "espécie básica" não inclui impurezas relacionadas ao processo e as espécies básicas podem ser o resultado de preparação do produto (referido aqui como "espécies básicas derivadas da preparação"), ou o resultado do armazenamento (referido aqui como "espécies básicas derivadas do armazenamento").
[00256] Em uma modalidade exemplar, a quantidade de espécies básicas em uma composição anti-VEGF em comparação com uma proteína de interesse podem ser no máximo cerca de 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4,5%, 4%, 3,5%, 3%, 2,5%, 2%, 1,9%, 1,8%, 1,7%, 1,6%, 1,5%, 1,4%, 1,3%, 1,2%, 1,1%, 1%, 0,9%, 0,8%, 0,7%, 0,6%, 0,5%, 0,4%, 0,3%, 0,2%, 0,1%, ou 0,0% e intervalos dentro de um ou mais dos anteriores. Exemplos de composições anti- VEGF são descritos na Seção III abaixo. Em um aspecto, a composição anti-VEGF pode compreender uma proteína anti-VEGF selecionada do grupo consistindo em aflibercepte, MiniTrap recombinante (exemplos dos quais são divulgados em Patente Norte Americana N°. 7,279,159), um scFv e outras proteínas anti-VEGF. Em um aspecto preferido, a proteína recombinante de interesse é aflibercepte.
[00257] Como usado aqui, "Amostra de matriz" ou "amostra biológica" podem ser obtidas de qualquer etapa do bioprocesso, tal como fluido de cultura de células (CCF), fluido de cultura de células colhidas (HCCF), qualquer etapa do processamento a jusante, substância de fármaco (DS), ou um fármaco (DP) compreendendo o produto formulado final. Em algumas outras modalidades exemplares específicas, a amostra biológica pode ser selecionada de qualquer etapa do processo a jusante de clarificação, produção cromatográfica, inativação viral ou filtração. Em algumas modalidades exemplares específicas, o fármaco pode ser selecionado do medicamento produzido na clínica, transporte, armazenamento ou manuseio.
[00258] Como usado aqui, o termo "indivíduo" se refere a um mamífero (por exemplo, rato, camundongo, gato, cachorro, vaca, ovelha, cavalo, cabra, coelho), de preferência um humano em necessidade de prevenção e/ou tratamento de um câncer ou um distúrbio ocular angiogênico. O indivíduo pode ter câncer ou distúrbio ocular angiogênico ou estar predisposto a desenvolver câncer ou distúrbio angiogênico ocular.
[00259] Em termos de formulação de proteína, o termo "estável," como usado aqui refere-se à proteína de interesse dentro da formulação sendo capaz de reter um grau aceitável de estrutura química ou função biológica após armazenamento sob condições exemplares aqui definidas. Uma formulação pode ser estável mesmo que a proteína de interesse nela contida não mantenha 100% da sua estrutura química ou função biológica após armazenamento por um período de tempo definido. Sob certas circunstâncias, a manutenção de cerca de 90%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98% ou cerca de 99%da estrutura ou função de uma proteína após o armazenamento por um determinado período de tempo pode ser considerado "estável".
[00260] O termo "tratar" ou "tratamento" refere-se a uma medida terapêutica que reverte, estabiliza ou elimina uma doença ou desordem indesejada (por exemplo, uma doença ocular angiogênica ou câncer), por exemplo, causando a regressão, estabilização ou eliminação de um ou mais sintomas ou indícios de tal doença ou distúrbio em qualquer grau clinicamente mensurável, por exemplo, no que diz respeito a um distúrbio ocular angiogênico, causando uma redução ou manutenção do escore de gravidade da retinopatia diabética (DRSS), melhorando ou mantendo a visão (por exemplo, na melhor acuidade visual corrigida, por exemplo, como medida por um aumento nas letras ETDRS), aumentar ou manter o campo visual e/ou reduzir ou manter a espessura retiniana central e, em relação ao câncer, interromper ou reverter o crescimento, sobrevivência e/ou metástase de células de câncer no indivíduo. Tipicamente, a medida terapêutica é a administração de uma ou mais doses de uma quantidade terapeuticamente eficaz de MiniTrap de VEGF ao indivíduo com a doença ou distúrbio.
[00261] Como usado aqui, o termo "tecnologia de processo a montante", no contexto da preparação de proteínas, refere-se a atividades que envolvem a produção e coleta de proteínas de células durante ou após a cultura de células de uma proteína de interesse. Como usado aqui, o termo "cultura de células" refere-se a métodos para gerar e manter uma população de células hospedeiras capazes de produzir proteína recombinante de interesse, bem como aos métodos e técnicas para otimizar a produção e coleta da proteína de interesse. Por exemplo, uma vez que um vetor de expressão foi incorporado em uma célula hospedeira apropriada, uma célula hospedeira pode ser mantida em condições adequadas para a expressão das sequências de codificação de nucleotídeos relevantes, e a coleta e produção da proteína recombinante desejada.
[00262] Ao usar as técnicas de cultura de células da presente invenção, uma proteína de interesse pode ser produzida intracelularmente, no espaço periplasmático, ou diretamente secretada no meio. Em modalidades onde uma proteína de interesse é produzida intracelularmente, resíduos particulados - células hospedeiras ou células lisadas (por exemplo, resultantes da homogeneização) podem ser removidos por uma variedade de meios, incluindo, mas não se limitando a, centrifugação ou ultrafiltração. Onde uma proteína de interesse é secretada no meio, os sobrenadantes de tais sistemas de expressão podem ser primeiro concentrados usando um filtro de concentração de proteína disponível comercialmente, por exemplo, usando uma unidade de ultrafiltração Amicon™ ou Millipore Pellicon™. Em um aspecto, a proteína de interesse pode ser colhida por centrifugação seguida por filtração profunda e, em seguida, cromatografia de captura de afinidade.
[00263] Como usado aqui, um "antagonista de VEGF" é qualquer proteína ou peptídeo que se liga a ou interage com VEGF. Tipicamente, esta ligação ou interação com inibe a ligação de VEGF a seus receptores (VEGFR1 e VEGFR2), e/ou inibe a sinalização biológica e a atividade de VEGF. Os antagonistas de VEGF incluem moléculas que interferem com a interação entre VEGF e um receptor de VEGF natural, por exemplo, moléculas que se ligam a VEGF ou um receptor de VEGF e previnem ou impedem a interação entre VEGF e um receptor de VEGF. Antagonistas de VEGF exemplares específicos incluem anticorpos anti-VEGF (por exemplo, ranibizumabe [LUCENTIS®]), anticorpos de receptor anti-VEGF (por exemplo, anticorpos anti- VEGFR1, anticorpos anti-VEGFR2 e similares) e moléculas quiméricas com base no receptor de VEGF ou proteínas de fusão inibidora de VEGF (também referidos aqui como "VEGF-Traps" ou "MiniTraps de VEGF"), tais como aflibercepte, ziv-aflibercepte e uma proteína tendo um aminoácido tendo SEQ ID NO: 60. Outros exemplos de VEGF-Traps são ALT-L9, M710, FYB203 e CHS-2020. Exemplos adicionais de VEGF-Traps podem ser encontrados em Patente Norte Americanas Nos. 7.070.959; 7.306.799; 7.374.757; 7.374.758; 7.531.173; 7.608.261; 5.952.199; 6.100.071; 6.383.486; 6.897.294; 7.771.721, que são especificamente incorporados aqui por referência em sua íntegra.
[00264] As moléculas quiméricas com base no receptor de VEGF incluem polipeptídeos quiméricos que compreendem dois ou mais domínios tipo (Ig) imunoglobulina de um receptor de VEGF tal como VEGFR1 (também referido como Flt1) e/ou VEGFR2 (também referido como Flk1 ou KDR), e também pode compreender um domínio de multimerização (por exemplo, um domínio de Fc que facilita a multimerização [por exemplo, dimerização] de duas ou mais polipeptídeo quiméricos). Uma molécula quimérica com base no receptor de VEGF exemplar é uma molécula referida como VEGFR1R2- FcΔC1(a) (também conhecida como aflibercepte; comercializada sob o nome do produto EYLEA®). Em certas modalidades exemplares, aflibercepte compreende uma sequência de aminoácido descrita como SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLI PDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTN TIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQH KKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTK KNSTFVRVHEKDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVY TLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS LSPGK. (SEQIDNO.:55)
[00265] Como usado aqui, "filtração viral" pode incluir filtração usando filtros adequados, incluindo, mas não se limitando a, Planova 20N™, 50 N ou BioEx de AsahiKasei Pharma, filtros Viresolve™ de EMD Millipore, ViroSart CPV de Sartorius, ou filtro Ultipor DV20 ou DV50™ de Pall Corporation. Será aparente para aquele versado na técnica selecionar um filtro adequado para obter o desempenho de filtração desejado.
II. Determinação de Cor
[00266] Como usado aqui, a cor observada durante a produção de proteína recombinante, especificamente, uma proteína anti-VEGF, pode ser medida por vários métodos. Exemplos não limitantes incluem o uso do número da cor iodine, número da cor de hazen, número da cor do gardner, número da cor lovibond, número da cor de Saybolt, número da cor mineral oil, número da cor da farmacopeia europeia, número da cor da farmacopeia dos EUA, CIE L*, a*, b* (ou CIELAB), número da cor Klett, número da cor de Hess-Ives, índice de amarelecimento, número da cor ADMI e ASBC e número da cor da cervejaria EBC. Detalhes sobre tais escalas podem ser encontrados no Relatório de Aplicação N°. 3.9 e por Lange, todos os ensinamentos dos quais são aqui incorporados.
[00267] Correspondência visual de cores com base na Farmacopeia Europeia (PhEur) (Padrões de cores europeus, ver Farmacopeia Europeia. Chapter 2.2.2. Degree of coloration of liquids. 8a ed. EP, todos os ensinamentos dos quais são aqui incorporados) pode incluir preparar uma solução de referência de cor como descrito em Ph. Eur. (EP 2.2.2. DegreeofColorationofLiquids2)- três soluções originais para vermelho (cloreto cobaltoso (II)), amarelo (cloreto ferroso (III)) e cores azuis (sulfato cuproso (II)) e ácido clorídrico a 1%, cinco soluções de referência de cores para amarelo (Y), amarelo esverdeado (GY), tons de amarelo acastanhado (BY), marrom (B) e vermelho (R) são preparadas. Com essas cinco soluções de referência, por sua vez, um total de trinta e sete soluções de referência de cores são preparadas (Y1-Y7, GY1-GY7, BY1-BY7, B1-B9 e R1-R7). Cada solução de referência é claramente definida no espaço de cores CIE-Lab, por exemplo, por luminosidade, matiz e croma. Dos sete padrões amarelo- marrom (padrões BY), BY1 é o padrão mais escuro e BY7 é o menos escuro. A correspondência de uma determinada amostra com a de um padrão de cor BY geralmente é feita sob luz diurna difusa. As composições dos padrões europeus de cor amarelo-marrom são descritas na Tabela 1, abaixo.Tabela 1. Composição dos Padrões Europeus de Marrom-AmareloSolução Padrão Amarelo Acastanhado (BY): 10,8g/L FeCl3.6H2O, 6,0g/L CoCl2.6H2O e 2,5g/L CuSO4.5H2O
[00268] O teste de cor de líquidos é realizado comparando uma solução de teste com uma solução de cor padrão. A composição da solução de cor padrão é selecionada dependendo do matiz e da intensidade da cor da solução de teste. Normalmente, a comparação é realizada em tubos de fundo plano de vidro incolor, transparente e neutro que são correspondidos o mais próximo possível no diâmetro interno e em todos os outros aspectos (por exemplo, tubos de cerca de 12, 15, 16 ou 25 mm de diâmetro). Por exemplo, uma comparação pode ser entre 2 ou 10 mL da solução de teste e solução de cor padrão. A profundidade dos líquidos, por exemplo, pode ser cerca de 15, 25, 40 ou 50 mm. A cor atribuída à solução de teste não deve ser mais intensa do que a cor padrão. As comparações de cores são normalmente realizadas em luz difusa (por exemplo, luz do dia) contra um fundo branco. As cores podem ser comparadas no eixo vertical ou no eixo horizontal dos tubos.
[00269] Em contraste com a medição de cor EP, a USP Monograph 1061 Color - Instrumental Measurement faz referência ao uso de medição de cor CIEL*, a*, b* (ou CIELAB) para quantificar cores de forma precisa e objetiva. Um total de vinte soluções de referência de cores (identificadas sequencialmente pelas letras A a T) são definidas na Farmacopeia Norte-americano. A cor da amostra medida é automaticamente correlacionada com as soluções de referência de cor. Isso significa que a solução de referência de cor que está mais próxima da amostra (ou seja, a solução de referência com a menor diferença de cor E* para a cor da amostra) é exibida. Os valores ΔL*, Δa* e Δb* fornecem as diferenças quantitativas entre os valores L*, a* e b* da amostra e aqueles das soluções USP exibidas. No sistema de coordenadas CIE L* a* b*, L* representa o grau de claridade de uma cor em uma escala de 0 a 100, com 0 sendo o mais escuro e 100 o mais claro, a* representa o vermelho ou verde de uma cor (os valores positivos de a* representam o vermelho, enquanto os valores negativos de a* representam o verde) e b* representa o amarelo ou azul de uma amostra, com os valores positivos de b* representando o amarelo e os valores negativos de b* representando o azul. A diferença de cor de um padrão ou de uma amostra inicial em uma avaliação pode ser representada por uma mudança nos componentes de cor individuais ΔL*, Δa* e Δb*. A mudança composta, ou diferença na cor, pode ser calculada como uma distância euclidiana simples no espaço usando a fórmula: Coordenadas de cores CIEL*, a*, b* podem ser geradas, por exemplo, usando o Hunter LabsUltrascanPro (Hunter Associates Laboratory, Reston, Virginia) ou no BYK Gardner LCS IV (BYK-Gardner, Columbia, Maryland). Para o Hunter LabsUltraScan Pro, o teste de filtro de didímio pode ser executado para calibração de comprimento de onda. O instrumento pode ser padronizado em TTRAN com a inserção de porta de 0,780 polegadas e DIW antes do uso; assim, estabelecendo o topo (L = 100) e o fundo (L = 0) da escala fotométrica usando uma armadilha de luz e cartão preto. Ver Pack et al., Modernization of Physical Appearance and Solution Color Tests Using Quantitative Tristimulus Colorimetry: Advantages, Harmonization, and Validation Strategies, J. Pharmaceutical Sci. 104: 3299-3313 (2015), todos os ensinamentos dos quais são aqui incorporados. A cor dos padrões BY também pode ser expressa no espaço de cores CIEL*, a*, b* (espaço de cores "CIELAB" ou "CIELab"). Ver Tabela 2.Tabela 2. Caracterização dos padrões europeus de cor marrom- amarelo no espaço de cores CIEL*, a*, b* A Reportac o por Pac k et al. ~Medido experimentalmente aqui - os valores L* e b*, para cada padrão de cor BY
[00270] Para permitir uma triagem de alto rendimento para o ensaio de cores, o método de ensaio espectrofotométrico (CIELAB) é uma medida mais adequada e quantitativa do que os padrões de cores BY. O ensaio substituto foi ainda otimizado como descrito na seção de exemplo.
[00271] Para qualquer uma das amostras avaliadas quanto à cor, a concentração de proteína nas amostras de teste deve ser padronizada para a concentração de proteína nas amostras, por exemplo, 5 g/L, 10 g/L e similares para comparação.
III. Composições anti-VEGF
[00272] Existem pelo menos cinco membros da família VEGF de proteínas que regulam a via de sinalização do VEGF: VEGF-A, VEGF- B, VEGF-C, VEGF-D e fator de crescimento da placenta (PlGF). Composições anti-VEGF podem compreender um antagonista de VEGF, que interage especificamente com um ou mais membros da família de proteínas VEGF e inibe um ou mais de suas atividades biológicas, por exemplo, sua atividade mitogênica, angiogênica e/ou de permeabilidade vascular.
[00273] Em uma modalidade, um método de produção de uma proteína anti-VEGF compreende: (a) fornecer uma célula hospedeira geneticamente modificada para expressar a proteína anti-VEGF; (b) cultivar uma célula hospedeira em um MQD sob condições adequadas nas quais a célula expressa a proteína anti- VEGF; e (c) colher uma preparação da proteína anti-VEGF produzida pela célula. Em um aspecto, a proteína anti-VEGF é selecionada a partir do grupo que consiste em aflibercepte, MiniTrap recombinante (exemplos dos quais são divulgados em Patente Norte Americana N°. 7.279.159), um scFv e outras proteínas anti-VEGF. Em um aspecto preferido, a proteína recombinante de interesse é aflibercepte.
[00274] Os inventores descobriram que a produção de proteínas anti- VEGF (por exemplo, aflibercepte) em certos MQDs produziu uma amostra biológica exibindo uma cor distinta. As propriedades de cor distintas foram observadas em diferentes etapas de produção e até mesmo na formulação final compreendendo a proteína anti-VEGF. Como observado no Exemplo 9, para a produção de MiniTrap de VEGF, células de cultura em MQD produziu proteínas anti-VEGF (por exemplo, aflibercepte) com uma intensa cor marrom-amarela. A etapa de captura de afinidade após a colheita também produziu um eluato exibindo uma certa cor - uma cor amarelo-marrom. Outras etapas de produção usando AEX também exibiram uma cor amarelo-marrom, porém com intensidade reduzida.
[00275] Como descrito em mais detalhes abaixo, a cor pode ser avaliada usando (i) o Padrão Europeu de Cor BY no qual uma inspeção visual qualitativa é feita ou (ii) um ensaio colorimétrico, CIELAB, que é mais quantitativo do que o sistema BY. No entanto, em ambos os casos, a avaliação da cor entre várias amostras foi normalizada em relação à concentração de proteína para garantir uma avaliação/comparação significativa. Por exemplo, referindo-se ao Exemplo 9, em particular Tabela 9-2, o eluato de Proteína A tem um valor de b* de cerca de 2,52 que corresponde a aproximadamente um valor BY de BY5 (quando medido a uma concentração de 5g/L de proteína no eluato de Proteína A). Se a cor do eluato da Proteína A for comparada com a de outra amostra, a comparação deve ser feita usando a mesma concentração de proteína. Assim, comparando o eluato de proteína A com o agrupamento AEX que tem um valor de b* de cerca de 0,74 (quando medido a uma concentração de 5g/L de proteína no eluato de proteína A), o método de produção mostra uma redução substancial na cor amarelo-marrom da amostra do eluato de Proteína A para o agrupamento AEX após cromatografia de AEX.
[00276] As composições da presente invenção podem ser caracterizadas por uma cor amarelo-marrom como descrito aqui, por exemplo, não mais escura/mais intensa do que o padrão europeu de cor marrom-amarelo BY2-BY3, BY3-BY4, BY4-BY5 ou BY5-BY6 e/ou tendo um valor de b* 17-23, 10-17, 5-10, 3-5, ou 1-3, em que a composição compreende cerca de 5 g/L da proteína anti-VEGF ou cerca de 10 g/L da proteína anti-VEGF e em que a composição é obtida como uma amostra de uma colheita clarificada ou uma eluato de proteína A da colheita clarificada.
[00277] Em uma modalidade, as composições da invenção produzidas usando o MQD produzem uma amostra biológica com uma cor marrom-amarela distinta, em que a amostra pode ser caracterizada por uma caracterização de cor padrão reconhecida: mais amarelo-marrom do que o mais amarelo-marrom do que o mais amarelo-marrom do que o mais amarelo-marrom do que o europeu BY5; (v) entre o padrão de cor europeu BY2 e BY3; (vi) entre o padrão de cor europeu BY3 e BY4; (vii) entre o padrão de cor europeu BY4 e BY5, em que a composição compreende cerca de 5 g/L ou cerca de 10 g/L da proteína anti-VEGF e em que a composição é obtida como uma amostra de um eluato de proteína A de uma colheita clarificada. Em outra modalidade, as composições da invenção produzidas usando um MQD produz uma amostra biológica com uma cor marrom-amarela distinta, em que a composição é caracterizada por uma caracterização de cor padrão reconhecida na escala CIELAB: (i) não mais amarelo-marrom do que um valor de b* de cerca de 22-23; (ii) não mais amarelo-marrom do que um valor de b* de cerca de 16-17; (iii) não mais amarelo-marrom do que um valor de b* de 910; (iv) não mais amarelo-marrom do que um valor de b* de 45; (v) não mais amarelo-marrom do que um valor de b* de 23; (vi) entre o valor de b* de 17-23; (vii) entre o valor de b* de 10-17; (viii) entre o valor de b* de 5-10; (ix) entre o valor de b* de 3-5; ou (x) entre o valor de b* de 1-3, em que a composição compreende cerca de 5 g/L ou cerca de 10 g/L da proteína anti-VEGF e em que a composição é obtida como uma amostra de um eluato de proteína A de uma colheita clarificada.
[00278] Em uma modalidade, as composições da invenção produzidas usando MQD podem compreender outras espécies ou variantes da proteína anti-VEGF. Essas variantes incluem isoformas de proteína anti-VEGF que compreendem um ou mais resíduos de aminoácido oxidados, denominados coletivamente como oxovariantes. A digestão enzimática de tais composições compreendendo a proteína anti-VEGF e suas oxovariantes pode compreender um ou mais de: EIGLLTC*EATVNGH*LYK (SEQ ID NO: 18) que compreende cerca de 0,004 a 0,013% de 2-oxo-histidinas, QTNTIIDVVLSPSH*GIELSVGEK (SEQ ID NO: 19) que compreende cerca de 0,006 a 0,028% de 2-oxo-histidinas, TELNVGIDFNWEYPSSKH*QHK (SEQ ID NO: 20) que compreende cerca de 0,049 a 0,085% de 2-oxo-histidinas, DKTH*TC*PPC*PAPELLG (SEQ ID NO: 17) que compreende cerca de 0,057 a 0,092% de 2-oxo-histidinas, TNYLTH*R (SEQ ID NO: 21) que compreende cerca de 0,008 a 0,022% de 2-oxo-histidinas, e/ou IIWDSR (SEQ ID NO: 56) que compreende cerca de 0,185 a 0,298% de triptofano antioxidado; ou EIGLLTC*EATVNGH*LYK (SEQ ID NO: 18) que compreende cerca de 0,008% de 2-oxo-histidinas, QTNTIIDVVLSPSH*GIELSVGEK (SEQ ID NO: 19) que compreende cerca de 0,02% de 2-oxo-histidinas, TELNVGIDFNWEYPSSKH*QHK (SEQ ID NO: 20) que compreende cerca de 0,06% de 2-oxo-histidinas, DKTH*TC*PPC*PAPELLG (SEQ ID NO: 17) que compreende cerca de 0,07% de 2-oxo-histidinas, TNYLTH*R (SEQ ID NO: 21) que compreende cerca de 0,01% de 2- oxo-histidinas, e/ou IIWDSR (SEQ ID NO: 56) que compreende cerca de 0,23% de di- oxotriptofanos, em que H*é uma histidina que pode ser oxidada a 2-oxo- histidina e em que C * é uma cisteína que pode ser carboximetilada. Em uma modalidade particular, a proteína anti-VEGF é aflibercepte. Em outra modalidade, a proteína anti-VEGF é uma MiniTrap de VEGF.
[00279] Em uma modalidade exemplar da invenção, as composições da invenção podem compreender uma proteína anti-VEGF, em que não mais do que cerca de 1%, não mais do que cerca de 0,1% ou cerca de 0,1 a 1%, 0,2 a 1%, 0,3 a 1%, 0,4 a 1%, 0,5 a 1%, 0,6 a 1%, 0,7 a 1%, 0,8 a 1% ou 0,9 a 1%de resíduos de histidina da proteína anti-VEGF são 2-oxo-histidina. Em tais composições, pode haver uma população heterogênea das variantes da proteína anti-VEGF, cada uma tendo uma quantidade variável de resíduos de 2-oxo-histidina e resíduos de histidina não oxidados. Assim, a porcentagem de proteína anti-VEGF de 2-oxo-histidina em uma composição refere-se às 2-oxo-histidinas específicas do sítio entre as moléculas anti-VEGF divididas pelo total de histidinas específicas do sítio nas moléculas da proteína anti-VEGF (oxidado mais não oxidado) vezes 100. Um método para quantificar o nível de 2-oxo-histidinas em uma composição é digerir o polipeptídeo com uma protease (por exemplo, Lys-C e/ou tripsina) e analisar a quantidade de 2-oxo-histidinas nos peptídeos resultantes por, por exemplo, espectrometria de massa (MS).
[00280] Antes da digestão da proteína anti-VEGF, grupos sulfidrila de cisteína são bloqueados pela reação com iodoacetamida (IAM), resultando em um resíduo representado pela seguinte estrutura química: Tal modificação protege os tióis livres da formação de pontes de dissulfeto e previne a mistura da ligação de dissulfeto. A presente invenção inclui composições (por exemplo, composições aquosas) compreendendo a proteína anti-VEGF e suas variantes que, quando modificadas com IAM e digeridas com protease (por exemplo, Lys-C e tripsina) e analisadas por espectrometria de massa, compreendem os seguintes peptídeos: EIGLLTC*EATVNGH*LYK (SEQ ID NO: 18) que compreende cerca de 0,004 a 0,013% de 2-oxo-histidinas, QTNTIIDVVLSPSH*GIELSVGEK (SEQ ID NO: 19) que compreende cerca de 0,006 a 0,028% de 2-oxo-histidinas, TELNVGIDFNWEYPSSKH*QHK (SEQ ID NO: 20) que compreende cerca de 0,049 a 0,085% de 2-oxo-histidinas, DKTH*TC*PPC*PAPELLG (SEQ ID NO: 17) que compreende cerca de 0,057 a 0,092% de 2-oxo-histidines, TNYLTH*R (SEQ ID NO: 21) que compreende cerca de 0,008 a 0,022% de 2-oxo-histidinas, e/ou IIWDSR (SEQ ID NO: 56) que compreende cerca de 0,185 a 0,298% de triptofano antioxidado; ou EIGLLTC*EATVNGH*LYK (SEQ ID NO: 18) que compreende cerca de 0,008% de 2-oxo-histidinas, QTNTIIDVVLSPSH*GIELSVGEK (SEQ ID NO: 19) que compreende cerca de 0,02% de 2-oxo-histidinas, TELNVGIDFNWEYPSSKH*QHK (SEQ ID NO: 20) que compreende cerca de 0,06% de 2-oxo-histidinas, DKTH*TC*PPC*PAPELLG (SEQ ID NO: 17) que compreende cerca de 0,07% de 2-oxo-histidinas, TNYLTH*R (SEQ ID NO: 21) que compreende cerca de 0,01% de 2- oxo-histidinas, e/ou IIWDSR (SEQ ID NO: 56) que compreende cerca de 0,23% de di- oxotriptofanos, em que H* é 2-oxo-histidina e em que C* é cisteína carboximetilada. Em uma modalidade da invenção, os peptídeos são desglicosilados com PNGase F.
[00281] A presente invenção inclui composições que compreendem a proteína anti-VEGF, em que cerca de 0,1% a 10% de todas as histidinas da proteína anti-VEGF são modificadas para 2-oxo-histidina. Além disso, a cor da composição não é mais escura/mais intensa do que, por exemplo, o padrão europeu de cor marrom-amarelo BY2-BY3, BY3-BY4, BY4-BY5 ou BY5-BY6, ou alternativamente, tendo um valor de b*, como caracterizado usando CIE L*, a*, b** de cerca de 17-23, 1017, 5-10, 3-5, ou 1-3, em que a composição compreende cerca de 5 g/L ou cerca de 10 g/L da proteína anti-VEGF. A composição é obtida ou como uma amostra de uma colheita clarificada ou um eluato de proteína A da colheita clarificada. Tais composições podem ser obtidas da colheita clarificada quando o material da colheita é submetido a um procedimento de cromatografia de captura. Em um aspecto, a etapa de captura é um procedimento de cromatografia de afinidade usando, por exemplo, uma coluna de afinidade de Proteína A. Quando uma amostra de afinidade é analisada usando cromatografia líquida - espectrometria de massa (LC-MS), uma ou mais variantes podem ser detectadas.
[00282] A presente invenção inclui composições que compreendem a proteína anti-VEGF, em que cerca de 0,1% a 10% de todos os triptofanos da proteína anti-VEGF são modificados para quinurenina. Além disso, a cor da composição não é mais escura/mais intensa do que o padrão europeu de cor marrom-amarelo BY2-BY3, BY3-BY4, BY4-BY5 ou BY5-BY6 e/ou tendo um valor de b*, como caracterizado por CIE L*, a*, b** de cerca de 17-23, 10-17, 5-10, 3-5 ou 1-3, em que a composição compreende cerca de 5 g/L da proteína anti-VEGF ou cerca de 10 g/L da proteína anti-VEGF. A composição é obtida como uma amostra de uma colheita clarificada ou um eluato de proteína Ada colheita clarificada. Tais composições podem ser obtidas da colheita clarificada quando submetida a um procedimento de cromatografia de captura. A etapa de captura é um procedimento de cromatografia de afinidade usando, por exemplo, uma coluna de afinidade de proteína A. Quando uma amostra de afinidade é analisada por cromatografia líquida - espectrometria de massa (LC-MS), uma ou mais dessas variantes podem ser detectadas.
[00283] A presente invenção inclui composições que compreendem a proteína anti-VEGF, em que cerca de 0,1% a 10% de todos os triptofanos da proteína anti-VEGF são modificados para mono-hidroxil triptofano. Além disso, a cor da composição não é mais escura/mais intensa do que o padrão europeu de cor marrom-amarelo BY2-BY3, BY3- BY4, BY4-BY5 ou BY5-BY6 e/ou tendo um valor de b* caracterizada por CIE L*, a*, b** de cerca de 17-23, 10-17, 5-10, 3-5 ou 1-3, em que a composição compreende cerca de 5 g/L da proteína anti-VEGF ou cerca de 10 g/L da proteína anti-VEGF. A composição é obtida como uma amostra de uma colheita clarificada ou um eluato de proteína Ada colheita clarificada. Tais composições podem ser obtidas da colheita clarificada quando submetida a um procedimento de cromatografia de captura. A etapa de captura é um procedimento de cromatografia de afinidade usando, por exemplo, uma coluna de afinidade de proteína A. Quando uma amostra extraída da etapa de afinidade é analisada por meio de cromatografia líquida - espectrometria de massa (LC-MS), uma ou mais essas variantes podem ser detectadas.
[00284] A presente invenção inclui composições que compreendem a proteína anti-VEGF, em que cerca de 0,1% a 10% de todos os triptofanos da proteína anti-VEGF são modificados para di-hidroxil triptofano. Além disso, a cor não é mais escura/intensa do que o padrão europeu de cor marrom-amarelo BY2-BY3, BY3-BY4, BY4-BY5 ou BY5- BY6 e/ou tendo um valor de b* caracterizado usando CIE L*, a*, b* de cerca de 17-23, 10-17, 5-10, 3-5, ou 1-3, em que a composição compreende cerca de 5 g/L da proteína anti-VEGF ou cerca de 10 g/L da proteína anti-VEGF. A composição é obtida como uma amostra de uma colheita clarificada ou um eluato de proteína Ada colheita clarificada. Tais composições podem ser obtidas da colheita clarificada feita usando MQD compreendendo a proteína anti-VEGF, bem como suas oxovariantes submetidas a um procedimento de cromatografia de captura. A etapa de captura é um procedimento de cromatografia de afinidade usando, por exemplo, uma coluna de afinidade de proteína A. Quando uma amostra extraída da etapa de afinidade é analisada por meio de cromatografia líquida - espectrometria de massa (LC-MS), uma ou mais essas variantes podem ser detectadas.
[00285] A presente invenção inclui composições que compreendem a proteína anti-VEGF, em que cerca de 0,1% a 10% de todos os triptofanos da proteína anti-VEGF são modificados para tri-hidroxil triptofano. Além disso, a cor da composição não é mais escura/mais intensa do que o padrão europeu de cor marrom-amarelo BY2-BY3, BY3-BY4, BY4-BY5 ou BY5-BY6 e/ou tendo um valor de b* caracterizado por CIE L*, a*, b* de cerca de 17-23, 10-17, 5-10, 3-5, ou 1-3, em que a composição compreende cerca de 5 g/L da proteína anti- VEGF ou cerca de 10 g/L da proteína anti-VEGF. A composição é obtida como uma amostra de uma colheita clarificada ou um eluato de proteína A da colheita clarificada. Tais composições podem ser obtidas usando cromatografia de captura. A etapa de captura é um procedimento de cromatografia de afinidade usando, por exemplo, uma coluna de afinidade de proteína A. Quando uma amostra extraída da afinidade é analisada por cromatografia líquida - espectrometria de massa (LC-MS), uma ou mais dessas variantes podem ser detectadas.
[00286] Em uma modalidade, as composições da invenção podem compreender uma proteína anti-VEGF, em que a proteína anti-VEGF pode compreender modificações de um ou mais resíduos como se segue: uma ou mais asparaginas são desamidadas; um ou mais ácidos aspárticos são convertidos em iso-aspartato e/ou Asparagina; um ou mais metioninas são oxidadas; um ou mais triptofanos são convertidos em N-formilquinurenina; um ou mais triptofanos são mono-hidroxil triptofano; um ou mais triptofanos são di-hidroxil triptofano; um ou mais triptofanos são tri-hidroxil triptofano; uma ou mais argininas são convertidos em Arg 3-desoxiglucosona; a glicina C-terminal não está presente; e/ou existem um ou mais glicosítios não glicosilados.
[00287] Tais composições podem ser obtidas de uma colheita clarificada feita usando MQD compreendendo proteína anti-VEGF bem como suas variantes sujeitas a, por exemplo, um procedimento de cromatografia de captura. A etapa de captura é um procedimento de cromatografia de afinidade usando, por exemplo, uma coluna de proteína A. Quando uma amostra extraída da etapa de afinidade é analisada utilizando, por exemplo, cromatografia líquida - espectrometria de massa (LC-MS), uma ou mais dessas variantes podem ser detectadas.
[00288] Em uma modalidade exemplar, as composições da invenção pode compreender uma proteína anti-VEGF compartilhando características estruturais de aflibercepte que podem ser oxidadas em uma ou mais das seguintes: His86, His110, His145, His209, His95, His19 e/ou His203 (ou posições de resíduos equivalentes em proteínas que compartilham certas características estruturais de aflibercepte); Trp58 e/ou Trp138 (ou posições de resíduos equivalentes em proteínas que compartilham certas características estruturais de aflibercepte); Tyr64 (ou posições equivalentes em proteínas que compartilham certas características estruturais de aflibercepte); Phe44 e/ou Phe166 (ou posições de resíduos equivalentes em proteínas que compartilham certas características estruturais de aflibercepte); e/ou Met10, Met 20, Met163 e/ou Met192 (ou posições de resíduos equivalentes em proteínas que compartilham certas características estruturais de aflibercepte. Tais composições podem ser obtidas de uma colheita clarificada feita usando MQD compreendendo aflibercepte, bem como suas oxovariantes submetidas a um procedimento de cromatografia de captura. A etapa de captura pode ser um procedimento de cromatografia de afinidade usando, por exemplo, uma coluna de proteína A. Quando uma amostra extraída da etapa de afinidade é analisada utilizando, por exemplo, cromatografia líquida - espectrometria de massa (LC-MS), uma ou mais dessas variantes podem ser detectadas.
[00289] Em uma modalidade, as composições da invenção podem compreender uma MiniTrap de VEGF tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 46, que pode ser oxidada em His86, His110, His145, His209, His95, His19 e/ou His203; Trp58 e/ou Trp138; Tyr64; Phe44 e/ou Phe166; e/ou Met10, Met 20, Met163 e/ou Met192. Tais composições podem ser obtidas da colheita clarificada feita usando MQD que compreende o MiniTrap de VEGF bem como suas oxovariantes submetidas a um procedimento de cromatografia de captura. A etapa de captura é um procedimento de cromatografia de afinidade usando, por exemplo, uma coluna de proteína A - quando analisada usando cromatografia líquida - espectrometria de massa (LCMS), uma ou mais dessas variantes podem ser detectadas.
[00290] Em algumas modalidades exemplares, composições da presente invenção pode compreender uma proteína anti-VEGF e suas variantes (incluindo oxovariantes), em que a quantidade das variantes de proteínas na composição pode ser no máximo cerca de 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4,5%, 4%, 3,5%, 3%, 2,5%, 2%, 1,9%, 1,8%, 1,7%, 1,6%, 1,5%, 1,4%, 1,3%, 1,2%, 1,1%, 1%, 0,9%, 0,8%, 0,7%, 0,6%, 0,5%, 0,4%, 0,3%, 0,2%, 0,1%, ou 0,0% e intervalos dentro de um ou mais dos anteriores. Tais composições podem ser obtidas da colheita clarificada feita usando MQD compreendendo proteína anti-VEGF bem como suas variantes submetidas a um procedimento de cromatografia de captura. A etapa de captura é um procedimento de cromatografia de afinidade utilizando, por exemplo, uma coluna de proteína A - quando analisada usando cromatografia líquida - espectrometria de massa (LC-MS), uma ou mais dessas variantes podem ser detectadas. Em um aspecto, a cor de tal composição não é mais escuro/intenso que, por exemplo, o padrão europeu de cor marrom-amarelo BY2-BY3, BY3-BY4, BY4-BY5 ou BY5-BY6 e/ou tendo um valor de b* caracterizada por CIE L*, a*, b* de cerca de 17-23, 10-17, 5-10, 3-5, ou 1-3, em que a composição compreende cerca de 5 g/L ou cerca de 10 g/L da proteína anti-VEGF.
[00291] Em outras modalidades exemplar, composições da presente invenção pode compreender uma proteína anti-VEGF e suas variantes, em que a quantidade das variantes de proteínas na composição pode ser cerca de 0% a cerca de 20%, por exemplo, cerca de 0% a cerca de 20%, cerca de 0,05% a cerca de 20%, cerca de 0,1% a cerca de 20%, cerca de 0,2% a cerca de 20%, cerca de 0,3% a cerca de 20%, cerca de 0,4% a cerca de 20%, cerca de 0,5% a cerca de 20%, cerca de 0,6% a cerca de 20%, cerca de 0,7% a cerca de 20%, cerca de 0,8% a cerca de 20%, cerca de 0,9% a cerca de 20%, cerca de 1% a cerca de 20%, cerca de 1,5% a cerca de 20%, cerca de 2% a cerca de 20%, cerca de 3% a cerca de 20%, cerca de 4% a cerca de 20%, cerca de 5% a cerca de 20%, cerca de 6% a cerca de 20%, cerca de 7% a cerca de 20%, cerca de 8% a cerca de 20%, cerca de 9% a cerca de 20%, cerca de 10% a cerca de 20%, cerca de 0% a cerca de 10%, cerca de 0,05% a cerca de 10%, cerca de 0,1% a cerca de 10%, cerca de 0,2% a cerca de 10%, cerca de 0,3% a cerca de 10%, cerca de 0,4% a cerca de 10%, cerca de 0,5% a cerca de 10%, cerca de 0,6% a cerca de 10%, cerca de 0,7% a cerca de 10%, cerca de 0,8% a cerca de 10%, cerca de 0,9% a cerca de 10%, cerca de 1% a cerca de 10%, cerca de 1,5% a cerca de 10%, cerca de 2% a cerca de 10%, cerca de 3% a cerca de 10%, cerca de 4% a cerca de 10%, cerca de 5% a cerca de 10%, cerca de 6% a cerca de 10%, cerca de 7% a cerca de 10%, cerca de 8% a cerca de 10%, cerca de 9% a cerca de 10%, cerca de 0% a cerca de 7,5%, cerca de 0,05% a cerca de 7,5%, cerca de 0,1% a cerca de 7,5%, cerca de 0,2% a cerca de 7,5%, cerca de 0,3% a cerca de 7,5%, cerca de 0,4% a cerca de 7,5%, cerca de 0,5% a cerca de 7,5%, cerca de 0,6% a cerca de 7,5%, cerca de 0,7% a cerca de 7,5%, cerca de 0,8% a cerca de 7,5%, cerca de 0,9% a cerca de 7,5%, cerca de 1% a cerca de 7,5%, cerca de 1,5% a cerca de 7,5%, cerca de 2% a cerca de 7,5%, cerca de 3% a cerca de 7,5%, cerca de 4% a cerca de 7,5%, cerca de 5% a cerca de 7,5%, cerca de 6% a cerca de 7,5%, cerca de 7% a cerca de 7,5%, cerca de 0% a cerca de 5%, cerca de 0,05% a cerca de 5%, cerca de 0,1% a cerca de 5%, cerca de 0,2% a cerca de 5%, cerca de 0,3% a cerca de 5%, cerca de 0,4% a cerca de 5%, cerca de 0,5% a cerca de 5%, cerca de 0,6% a cerca de 5%, cerca de 0,7% a cerca de 5%, cerca de 0,8% a cerca de 5%, cerca de 0,9% a cerca de 5%, cerca de 1% a cerca de 5%, cerca de 1,5% a cerca de 5%, cerca de 2% a cerca de 5%, cerca de 3% a cerca de 5%, cerca de 4% a cerca de 5%e intervalos dentro de um ou mais dos anteriores. Tais composições podem ser obtidas realizando cromatografia de captura em uma amostra de colheita. A etapa de captura é um procedimento de cromatografia de afinidade usando, por exemplo, uma coluna de proteína de A. Quando uma amostra é analisada por cromatografia líquida - espectrometria de massa (LC-MS), uma ou mais dessas variantes podem ser detectadas. Em um aspecto, a cor de tal composição não é mais escuro/intenso que, por exemplo, o padrão europeu de cor marrom-amarelo BY2-BY3, BY3- BY4, BY4-BY5 ou BY5-BY6 e/ou tendo um valor de b* caracterizada por CIE L*, a*, b* de cerca de 17-23, 10-17, 5-10, 3-5, ou 1-3, em que a composição compreende cerca de 5 g/L ou cerca de 10 g/L da proteína anti-VEGF.
[00292] Em uma modalidade, composições da presente invenção pode compreender uma proteína anti-VEGF incluindo suas espécies ácidas, em que a quantidade das espécies ácidas na composição pode ser cerca de 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4,5%, 4%, 3,5%, 3%, 2,5%, 2%, 1,9%, 1,8%, 1,7%, 1,6%, 1,5%, 1,4%, 1,3%, 1,2%, 1,1%, 1%, 0,9%, 0,8%, 0,7%, 0,6%, 0,5%, 0,4%, 0,3%, 0,2%, 0,1%, ou 0,0% e intervalos dentro de um ou mais dos anteriores. Como descrito supra, tais espécies ácidas podem ser detectadas por vários métodos tais como troca de íon, por exemplo, WCX (WCX-10 HPLC, uma cromatografia de troca catiônica fraca), ou IEF (focagem isoelétrica). Comumente, espécies ácidas eluem antes do pico principal durante CEX ou depois do pico principal durante a análise de AEX (ver FIGURA 16 e FIGURA 17). As composições que compreendem espécies ácidas podem ser relacionadas de material biológico, tal como colheita ou material produzido por afinidade usando cromatografia de troca iônica.
[00293] Em um aspecto, a cor de tal composição não é mais escura/mais intensa que, por exemplo, o padrão europeu de cor marrom-amarelo BY2-BY3, BY3-BY4, BY4-BY5 ou BY5-BY6 e/ou tendo um valor de b* caracterizada por CIE L*, a*, b* de cerca de 17-23, 1017, 5-10, 3-5, ou 1-3, em que a composição compreende cerca de 5 g/L ou cerca de 10 g/L. Como um exemplo, referindo-se à FIGURA 16 e FIGURA 17, as frações F1 e F2 representam frações ácidas que compreendem a maioria das espécies ácidas. Picos 1 e 2 de MT1 na FIGURA 17 compreendem as espécies ácidas e as frações F1 e F2 compreendem a maioria das frações ácidas. As frações que compreendem tais espécies ácidas (F1 e F2) também mostraram uma cor amarelo-marrom em comparação com outras frações (FIGURA 18B e FIGURA 18C).
[00294] Em outra modalidade, composições da presente invenção compreendem uma proteína anti-VEGF incluindo suas espécies ácidas, em que a quantidade de espécies ácidas na composição pode ser cerca de 0% a cerca de 20%, por exemplo, cerca de 0% a cerca de 20%, cerca de 0,05% a cerca de 20%, cerca de 0,1% a cerca de 20%, cerca de 0,2% a cerca de 20%, cerca de 0,3% a cerca de 20%, cerca de 0,4% a cerca de 20%, cerca de 0,5% a cerca de 20%, cerca de 0,6% a cerca de 20%, cerca de 0,7% a cerca de 20%, cerca de 0,8% a cerca de 20%, cerca de 0,9% a cerca de 20%, cerca de 1% a cerca de 20%, cerca de 1,5% a cerca de 20%, cerca de 2% a cerca de 20%, cerca de 3% a cerca de 20%, cerca de 4% a cerca de 20%, cerca de 5% a cerca de 20%, cerca de 6% a cerca de 20%, cerca de 7% a cerca de 20%, cerca de 8% a cerca de 20%, cerca de 9% a cerca de 20%, cerca de 10% a cerca de 20%, cerca de 0% a cerca de 10% , cerca de 0,05% a cerca de 10%, cerca de 0,1% a cerca de 10%, cerca de 0,2% a cerca de 10%, cerca de 0,3% a cerca de 10%, cerca de 0,4% a cerca de 10%, cerca de 0,5% a cerca de 10%, cerca de 0,6% a cerca de 10%, cerca de 0,7% a cerca de 10%, cerca de 0,8% a cerca de 10%, cerca de 0,9% a cerca de 10%, cerca de 1% a cerca de 10%, cerca de 1,5% a cerca de 10%, cerca de 2% a cerca de 10%, cerca de 3% a cerca de 10%, cerca de 4% a cerca de 10%, cerca de 5% a cerca de 10%, cerca de 6% a cerca de 10%, cerca de 7% a cerca de 10%, cerca de 8% a cerca de 10%, cerca de 9% a cerca de 10%, cerca de 0% a cerca de 7,5% , cerca de 0,05% a cerca de 7,5%, cerca de 0,1% a cerca de 7,5%, cerca de 0,2% a cerca de 7,5%, cerca de 0,3% a cerca de 7,5%, cerca de 0,4% a cerca de 7,5%, cerca de 0,5% a cerca de 7,5%, cerca de 0,6% a cerca de 7,5%, cerca de 0,7% a cerca de 7,5%, cerca de 0,8% a cerca de 7,5%, cerca de 0,9% a cerca de 7,5%, cerca de 1% a cerca de 7,5%, cerca de 1,5% a cerca de 7,5%, cerca de 2% a cerca de 7,5%, cerca de 3% a cerca de 7,5%, cerca de 4% a cerca de 7,5%, cerca de 5% a cerca de 7,5%, cerca de 6% a cerca de 7,5%, cerca de 7% a cerca de 7,5%, cerca de 0% a cerca de 5% , cerca de 0,05% a cerca de 5%, cerca de 0,1% a cerca de 5%, cerca de 0,2% a cerca de 5%, cerca de 0,3% a cerca de 5%, cerca de 0,4% a cerca de 5%, cerca de 0,5% a cerca de 5%, cerca de 0,6% a cerca de 5%, cerca de 0,7% a cerca de 5%, cerca de 0,8% a cerca de 5%, cerca de 0,9% a cerca de 5%, cerca de 1% a cerca de 5%, cerca de 1,5% a cerca de 5%, cerca de 2% a cerca de 5%, cerca de 3% a cerca de 5%, cerca de 4% a cerca de 5% e intervalos dentro de um ou mais dos anteriores. Como descrito acima, tais espécies ácidas podem ser detectadas por vários métodos, tais como troca de íon, por exemplo, WCX (WCX-10 HPLC, uma cromatografia de troca catiônica fraca), ou IEF (focagem isoelétrica). Tipicamente, as espécies ácidas eluem antes do pico principal durante CEX ou depois do pico principal durante a análise de AEX (Ver FIGURA 16 e FIGURA 17).
[00295] Usando uma coluna de troca catiônica, todos os picos que eluem antes do pico principal de interesse foram somados como a região ácida, e todos os picos que eluíram após uma proteína de interesse foram somados como a região básica. Em modalidades exemplares, as espécies ácidas podem ser eluídas como duas ou mais regiões ácidas e podem ser numeradas AR1, AR2, AR3 e assim por diante com base em um determinado tempo de retenção dos picos e na coluna de troca iônica usada.
[00296] Em uma modalidade, composições podem compreender uma proteína anti-VEGF incluindo espécies ácidas, em que AR1 é 20%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4,5%, 4%, 3,5%, 3%, 2,5%, 2%, 1,9%, 1,8%, 1,7%, 1,6%, 1,5%, 1,4%, 1,3%, 1,2%, 1,1%, 1%, 0,9%, 0,8%, 0,7%, 0,6%, 0,5%, 0,4%, 0,3%, 0,2%, 0,1%, ou 0,0%, e intervalos dentro de um ou mais dos anteriores. Em um aspecto, composições pode compreender uma proteína anti-VEGF incluindo suas espécies ácidas, em que AR1 é cerca de 0,0% a cerca de 10%, cerca de 0,0% a cerca de 5%, cerca de 0,0% a cerca de 4%, cerca de 0,0% a cerca de 3%, cerca de 0,0% a cerca de 2%, cerca de 3% a cerca de 5%, cerca de 5% a cerca de 8%, ou cerca de 8% a cerca de 10%, ou cerca de 10% a cerca de 15%, e intervalos dentro de um ou mais dos anteriores. Como descrito acima, tais regiões ácidas podem ser detectadas por vários métodos, tais como troca de íon, por exemplo, WCX (WCX-10 HPLC, uma cromatografia de troca catiônica fraca), ou IEF (focagem isoelétrica). Comumente, espécies ácidas eluem antes do pico principal durante CEX ou depois do pico principal durante a análise de AEX (Ver FIGURA 16 e FIGURA 17).
[00297] Em outra modalidade, composições podem compreender uma proteína anti-VEGF incluindo espécies ácidas, em que AR2 é 20%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4,5%, 4%, 3,5%, 3%, 2,5%, 2%, 1,9%, 1,8%, 1,7%, 1,6%, 1,5%, 1,4%, 1,3%, 1,2%, 1,1%, 1%, 0,9%, 0,8%, 0,7%, 0,6%, 0,5%, 0,4%, 0,3%, 0,2%, 0,1% ou 0,0%, e intervalos dentro de um ou mais dos anteriores. Em um aspecto, composições podem compreender uma proteína anti-VEGF incluindo espécies ácidas, em que AR2 é cerca de 0,0% a cerca de 10%, cerca de 0,0% a cerca de 5%, cerca de 0,0% a cerca de 4%, cerca de 0,0% a cerca de 3%, cerca de 0,0% a cerca de 2%, cerca de 3% a cerca de 5%, cerca de 5% a cerca de 8%, ou cerca de 8% a cerca de 10% ou cerca de 10% a cerca de 15%, e intervalos dentro de um ou mais dos anteriores.
[00298] Em uma modalidade, composições podem compreender uma proteína anti-VEGF incluindo espécies básicas, em que a quantidade das espécies básicas na composição pode ser no máximo cerca de 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4,5%, 4%, 3,5%, 3%, 2,5%, 2%, 1,9%, 1,8%, 1,7%, 1,6%, 1,5%, 1,4%, 1,3%, 1,2%, 1,1%, 1%, 0,9%, 0,8%, 0,7%, 0,6%, 0,5%, 0,4%, 0,3%, 0,2%, 0,1% ou 0,0% e intervalos dentro de um ou mais dos anteriores. Em um aspecto, composições podem compreender uma proteína anti-VEGF e suas espécies básicas, em que a quantidade das espécies básicas na composição em comparação com uma proteína anti-VEGF pode ser de 0% a cerca de 20%, por exemplo, cerca de 0% a cerca de 20%, cerca de 0,05% a cerca de 20%, cerca de 0,1% a cerca de 20%, cerca de 0,2% a cerca de 20%, cerca de 0,3% a cerca de 20%, cerca de 0,4% a cerca de 20%, cerca de 0,5% a cerca de 20%, cerca de 0,6% a cerca de 20%, cerca de 0,7% a cerca de 20%, cerca de 0,8% a cerca de 20%, cerca de 0,9% a cerca de 20%, cerca de 1% a cerca de 20%, cerca de 1,5% a cerca de 20%, cerca de 2% a cerca de 20%, cerca de 3% a cerca de 20%, cerca de 4% a cerca de 20%, cerca de 5% a cerca de 20%, cerca de 6% a cerca de 20%, cerca de 7% a cerca de 20%, cerca de 8% a cerca de 20%, cerca de 9% a cerca de 20%, cerca de 10% a cerca de 20%, cerca de 0% a cerca de 10% , cerca de 0,05% a cerca de 10%, cerca de 0,1% a cerca de 10%, cerca de 0,2% a cerca de 10%, cerca de 0,3% a cerca de 10%, cerca de 0,4% a cerca de 10%, cerca de 0,5% a cerca de 10%, cerca de 0,6% a cerca de 10%, cerca de 0,7% a cerca de 10%, cerca de 0,8% a cerca de 10%, cerca de 0,9% a cerca de 10%, cerca de 1% a cerca de 10%, cerca de 1,5% a cerca de 10%, cerca de 2% a cerca de 10%, cerca de 3% a cerca de 10%, cerca de 4% a cerca de 10%, cerca de 5% a cerca de 10%, cerca de 6% a cerca de 10%, cerca de 7% a cerca de 10%, cerca de 8% a cerca de 10%, cerca de 9% a cerca de 10%, cerca de 0% a cerca de 7,5%, cerca de 0,05% a cerca de 7,5%, cerca de 0,1% a cerca de 7,5%, cerca de 0,2% a cerca de 7,5%, cerca de 0,3% a cerca de 7,5%, cerca de 0,4% a cerca de 7,5%, cerca de 0,5% a cerca de 7,5%, cerca de 0,6% a cerca de 7,5%, cerca de 0,7% a cerca de 7,5%, cerca de 0,8% a cerca de 7,5%, cerca de 0,9% a cerca de 7,5%, cerca de 1% a cerca de 7,5%, cerca de 1,5% a cerca de 7,5%, cerca de 2% a cerca de 7,5%, cerca de 3% a cerca de 7,5%, cerca de 4% a cerca de 7,5%, cerca de 5% a cerca de 7,5%, cerca de 6% a cerca de 7,5%, cerca de 7% a cerca de 7,5%, cerca de 0% a cerca de 5%, cerca de 0,05% a cerca de 5%, cerca de 0,1% a cerca de 5%, cerca de 0,2% a cerca de 5%, cerca de 0,3% a cerca de 5%, cerca de 0,4% a cerca de 5%, cerca de 0,5% a cerca de 5%, cerca de 0,6% a cerca de 5%, cerca de 0,7% a cerca de 5%, cerca de 0,8% a cerca de 5%, cerca de 0,9% a cerca de 5%, cerca de 1% a cerca de 5%, cerca de 1,5% a cerca de 5%, cerca de 2% a cerca de 5%, cerca de 3% a cerca de 5%, cerca de 4% a cerca de 5% e intervalos dentro de um ou mais dos anteriores.
[00299] As espécies básicas podem ser eluídas como duas ou mais regiões básicas e podem ser numeradas BR1, BR2, BR3 e assim por diante com base em um certo tempo de retenção dos picos e troca de íon usados.
[00300] Em uma modalidade, composições podem compreender uma proteína anti-VEGF incluindo suas espécies básicas, em que BR1 é 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4,5%, 4%, 3,5%, 3%, 2,5%, 2%, 1,9%, 1,8%, 1,7%, 1,6%, 1,5%, 1,4%, 1,3%, 1,2%, 1,1%, 1%, 0,9%, 0,8%, 0,7%, 0,6%, 0,5%, 0,4%, 0,3%, 0,2%, 0,1% ou 0,0%, e intervalos dentro de um ou mais dos anteriores. Em um aspecto, composições podem compreender uma proteína anti-VEGF e suas espécies básicas, em que BR1 é cerca de 0,0% a cerca de 10%, cerca de 0,0% a cerca de 5%, cerca de 0,0% a cerca de 4%, cerca de 0,0% a cerca de 3%, cerca de 0,0% a cerca de 2%, cerca de 3% a cerca de 5%, cerca de 5% a cerca de 8%, ou cerca de 8% a cerca de 10% ou cerca de 10% a cerca de 15%, e intervalos dentro de um ou mais dos anteriores.
[00301] Em outra modalidade, a composição pode compreender uma proteína anti-VEGF e suas espécies básicas, em que BR2 é 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4,5%, 4%, 3,5%, 3%, 2,5%, 2%, 1,9%, 1,8%, 1,7%, 1,6%, 1,5%, 1,4%, 1,3%, 1,2%, 1,1%, 1%, 0,9%, 0,8%, 0,7%, 0,6%, 0,5%, 0,4%, 0,3%, 0,2%, 0,1% ou 0,0%, e intervalos dentro de um ou mais dos anteriores. Em um aspecto, composições podem compreender uma proteína anti-VEGF e suas espécies básicas da proteína anti-VEGF, em que BR2 é cerca de 0,0% a cerca de 10%, cerca de 0,0% a cerca de 5%, cerca de 0,0% a cerca de 4%, cerca de 0,0% a cerca de 3%, cerca de 0,0% a cerca de 2%, cerca de 3% a cerca de 5%, cerca de 5% a cerca de 8%, ou cerca de 8% a cerca de 10%, ou cerca de 10% a cerca de 15%, e intervalos dentro de um ou mais dos anteriores.
[00302] Em outra modalidade, a composição pode compreender uma proteína anti-VEGF e suas espécies básicas, em que BR3 é 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4,5%, 4%, 3,5%, 3%, 2,5%, 2%, 1,9%, 1,8%, 1,7%, 1,6%, 1,5%, 1,4%, 1,3%, 1,2%, 1,1%, 1%, 0,9%, 0,8%, 0,7%, 0,6%, 0,5%, 0,4%, 0,3%, 0,2%, 01% ou 0,0%, e intervalos dentro de um ou mais dos anteriores. Em um aspecto, composições podem compreender uma proteína anti-VEGF e suas espécies básicas da proteína anti-VEGF, em que BR3 é cerca de 0,0% a cerca de 10%, cerca de 0,0% a cerca de 5%, cerca de 0,0% a cerca de 4%, cerca de 0,0% a cerca de 3%, cerca de 0,0% a cerca de 2%, cerca de 3% a cerca de 5%, cerca de 5% a cerca de 8%, ou cerca de 8% a cerca de 10%, ou cerca de 10% a cerca de 15%, e intervalos dentro de um ou mais dos anteriores.
Oxidação induzida por foto de aflibercepte
[00303] Além de descobrir as diferentes características das cores ou variantes das composições de proteínas anti-VEGF produzidas usando MQD, os inventores também descobriram que tais composições podem ser produzidas artificialmente em laboratório pela exposição à luz.
[00304] Variantes modificadas, incluindo oxidadas, de uma composição anti-VEGF podem ser produzidas pela exposição de proteína anti-VEGF à luz branca fria ou ultravioleta. Em um aspecto, a composição anti-VEGF pode compreender cerca de 1,5 a cerca de 50 vezes de aumento em um ou mais oligopeptídeos modificados, em comparação com a amostra, em que os oligopeptídeos são selecionados do grupo consistindo em:
[00305] DKTH*TC*PPC*PAPELLG (SEQ ID NO: 17), EIGLLTC*EATVNGH*LYK (SEQ ID NO: 18), QTNTIIDVVLSPSH*GIELSVGEK (SEQ ID NO: 19), TELNVGIDFNWEYPSSKH*QHK (SEQ ID NO: 20), TNYLTH*R (SEQ ID NO: 21), SDTGRPFVEMYSEIPEIIH*MTEGR (SEQ ID NO: 22), VH*EKDK (SEQ ID NO: 23), SDTGRPFVEM*YSEIPEIIHMTEGR (SEQ ID NO: 64), SDTGRPFVEMYSEIPEIIHM*TEGR (SEQ ID NO: 65), TQSGSEM*K (SEQ ID NO: 66), SDQGLYTC*AASSGLM*TK (SEQ ID NO: 67), IIW*DSR/(SEQ ID NO: 28) RIIW*DSR/ (SEQ ID NO: 115); IIW*DSRK (SEQ ID NO: 114), TELNVGIDFNW*EYPSSK (SEQ ID NO: 29), GFIISNATY*K (SEQ ID NO: 69), KF*PLDTLIPDGK (SEQ ID NO: 70) F*LSTLTIDGVTR (SEQ ID NO: 32), em que H*é uma histidina é oxidada para 2-oxo-histidina, em que C*é uma cisteína é carboximetilada, em que M* é uma metionina oxidada, em que W*é um triptofano oxidado, em que Y* é uma tirosina oxidada, e em que F*é uma fenilalanina oxidada. Em um outro aspecto, a composição anti-VEGF pode compreender cerca de 1,5 a cerca de 10 vezes de aumento em um ou mais oligopeptídeos modificados pela exposição de uma composição anti-VEGF à luz branca fria por um período de tempo, por exemplo, cerca de 30 horas. Em outro aspecto, a composição anti- VEGF pode compreender cerca de 1,5 a cerca de 10 vezes de aumento em um ou mais oligopeptídeos modificados expondo uma amostra à luz branca fria por cerca de 75 horas. Em ainda outro aspecto, a composição anti-VEGF pode compreender cerca de 1,5 a cerca de 20 vezes de aumento em um ou mais oligopeptídeos, expondo a amostra à luz branca fria por cerca de 100 horas. Em ainda outro aspecto, a composição anti-VEGF pode compreender cerca de 1,5 a cerca de 20 vezes de aumento em um ou mais oligopeptídeos expondo a amostra à luz branca fria por cerca de 150 horas. Em ainda outro aspecto, a composição anti-VEGF pode compreender cerca de 1,5 a cerca de 50 vezes de aumento em um ou mais oligopeptídeos expondo a amostra à luz branca fria por cerca de 300 horas - ver Exemplo 4 abaixo.
[00306] A composição anti-VEGF pode compreender cerca de 1,5 a cerca de 3 vezes de aumento em um ou mais oligopeptídeos, como descrito acima, expondo uma amostra de uma composição anti-VEGF à luz ultravioleta por cerca de 4 horas. Em outro aspecto, a composição anti-VEGF pode compreender cerca de 1,5 a cerca de 10 vezes de aumento em um ou mais oligopeptídeos expondo a amostra à luz ultravioleta por cerca de 10 horas. Em ainda outro aspecto, a composição anti-VEGF pode compreender cerca de 1,5 a cerca de 10 vezes de aumento em um ou mais oligopeptídeos expondo a amostra à luz ultravioleta por cerca de 16 horas. Em ainda outro aspecto, a composição anti-VEGF pode compreender cerca de 1,5 a cerca de 25 vezes de aumento em um ou mais oligopeptídeos, expondo a amostra à luz ultravioleta por cerca de 20 horas. Em ainda outro aspecto, a composição anti-VEGF pode compreender cerca de 1,5 a cerca de 25 vezes de aumento em um ou mais oligopeptídeos, expondo a matriz da amostra à luz ultravioleta por cerca de 40 horas. Ver o Exemplo 4.
Glicodiversidade - proteína anti-VEGF produzida usando MQD
[00307] As composições desta invenção compreendem uma proteína anti-VEGF, em que a proteína anti-VEGF produzida em MQD tem uma variedade de glicodiversidade. Os diferentes perfis de glicosilação da proteína anti-VEGF estão dentro do escopo desta invenção.
[00308] Em algumas modalidades exemplares da invenção, a composição pode compreender uma proteína anti-VEGF glicosilada em uma ou mais asparaginas como se segue: glicosilação de G0-GlcNAc; glicosilação de G1-GlcNAc; glicosilação de G1S-GlcNAc; glicosilação de G0; glicosilação de G1; glicosilação de G1S; glicosilação de G2; glicosilação de G2S; glicosilação de G2S2; glicosilação de G0F; glicosilação de G2F2S; glicosilação de G2F2S2; glicosilação de G1F; glicosilação de G1FS; glicosilação de G2F; glicosilação de G2FS; glicosilação de G2FS2; glicosilação de G3FS; glicosilação de G3FS3; glicosilação de G0-2GlcNAc; glicosilação de Man4; glicosilação de Man4_A1G1; glicosilação de Man4_A1G1S1; glicosilação de Man5; glicosilação de Man5_A1G1; glicosilação de Man5_A1G1S1; glicosilação de Man6;glicosilação de Man6_G0+Fosfato; glicosilação de Man6+Fosfato; e/ou glicosilação de Man7. Em um aspecto, a proteína de interesse pode ser aflibercepte, anticorpo anti-VEGF ou MiniTrap de VEGF.
[00309] Em uma modalidade, a composição pode ter um perfil de glicosilação como se segue: cerca de 40% a cerca de 50% de glicanos fucosilados totais, cerca de 30% a cerca de 50% de glicanos sialilados totais, cerca de 6% a cerca de 15% de manose-5, e cerca de 60% a cerca de 79% de glicanos galactosilados. (Exemplo 6).
[00310] Em uma modalidade, a composição pode compreender uma proteína anti-VEGF, em que a proteína de interesse tem glicosilação Man5 em cerca de 32,4% de resíduos de asparagina 123 e/ou cerca de 27,1%de resíduos de asparagina 196. Em um aspecto, a proteína de interesse pode ser aflibercepte, anticorpo anti-VEGF ou MiniTrap de VEGF.
[00311] Em outra modalidade, a composição pode ter cerca de 40%, cerca de 41%, cerca de 42%, cerca de 43%, cerca de 44%, cerca de 45%, cerca de 46%, cerca de 47%, cerca de 48%, cerca de 49% ou cerca de 50% de glicanos fucosilados totais.
[00312] Em ainda outra modalidade, a composição pode ter cerca de 30%, cerca de 31%, cerca de 32%, cerca de 33%, cerca de 34%, cerca de 35%, cerca de 36%, cerca de 37%, cerca de 38%, cerca de 39%, cerca de 40%, cerca de 41%, cerca de 42%, cerca de 43%, cerca de 44%, cerca de 45%, cerca de 46%, cerca de 47%, cerca de 48%, cerca de 49% ou cerca de 50% de glicanos sialilados totais.
[00313] Em uma modalidade, a composição pode ter cerca de 6%, cerca de 7%, cerca de 8%, cerca de 9%, cerca de 10%, cerca de 11%, cerca de 12%, cerca de 13%, cerca de 14%, ou cerca de 15% manose- 5.
[00314] Em outra modalidade, a composição pode ter cerca de 60%, cerca de 61%, cerca de 62%, cerca de 63%, cerca de 64%, cerca de 65%, cerca de 66%, cerca de 67%, cerca de 68%, cerca de 69%, cerca de 70%, cerca de 71%, cerca de 72%, cerca de 73%, cerca de 74%, cerca de 75%, cerca de 76%, cerca de 77%, cerca de 78%, ou cerca de 79% de glicanos galactosilados totais.
[00315] Em uma modalidade, a proteína anti-VEGF pode ter um nível reduzido de glicanos fucosilados por cerca de 1%, 1,2%, 1,5%, 2%, 2,2%, 2,5%, 3%, 3,2%, 3,5%, 4%, 4,2%, 4,5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99%. A proteína anti-VEGF pode ter um nível diminuído de glicanos fucosilados por intervalos dentro de um ou mais dos valores anteriores, por exemplo, 1 a 10%, 1 a 15%, 1 a 20%, 1 a 25%, 1 a 30%, 1 a 35%, 1 a 40%, 1 a 41%, 1 a 42%, 1 a 43%, 1 a 44%, 1 a 45%, 1 a 46%, 1 a 47%, 1 a 48%, 1 a 49%, 1 a 50%, 2 a 10%, 2 a 15%, 2 a 20%, 2 a 25%, 2 a 30%, 2 a 35%, 2 a 40%, 2 a 41%, 2 a 42%, 2 a 43%, 2 a 44%, 2 a 45%, 2 a 46%, 2 a 47%, 2 a 48%, 2 a 49%, 2 a 50%, 3 a 10%, 3 a 15%, 3 a 20%, 3 a 25%, 3 a 30%, 3 a 35%, 3 a 40%, 3 a 41%, 3 a 42%, 3 a 43%, 3 a 44%, 3 a 45%, 3 a 46%, 3 a 47%, 3 a 48%, 3 a 49%, 3 a 50%, 4 a 10%, 4 a 15%, 4 a 20%, 4 a 25%, 4 a 30%, 4 a 35%, 4 a 40%, 4 a 41%, 4 a 42%, 4 a 43%, 4 a 44%, 4 a 45%, 4 a 46%, 4 a 47%, 4 a 48%, 4 a 49%, 4 a 50% ou 1 a 99% em comparação com o nível de glicanos fucosilados em uma proteína anti-VEGF produzida usando um hidrolisado de soja.
[00316] Em uma modalidade, a proteína anti-VEGF pode ter um nível reduzido de glicanos sialilados por cerca de 1%, 1,2%, 1,5%, 2%, 2,2%, 2,5%, 3%, 3,2%, 3,5%, 4%, 4,2%, 4,5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99%. A proteína anti-VEGF pode ter um nível diminuído de glicanos sialilados em Intervalos dentro de um ou mais dos valores anteriores, por exemplo, 1 a 10%, 1 a 15%, 1 a 20%, 1 a 25%, 1 a 30%, 1 a 35%, 1 a 40%, 1 a 41%, 1 a 42%, 1 a 43%, 1 a 44%, 1 a 45%, 1 a 46%, 1 a 47%, 1 a 48%, 1 a 49%, 1 a 50%, 2 a 10%, 2 a 15%, 2 a 20%, 2 a 25%, 2 a 30%, 2 a 35%, 2 a 40%, 2 a 41%, 2 a 42%, 2 a 43%, 2 a 44%, 2 a 45%, 2 a 46%, 2 a 47%, 2 a 48%, 2 a 49%, 2 a 50%, 3 a 10%, 3 a 15%, 3 a 20%, 3 a 25%, 3 a 30%, 3 a 35%, 3 a 40%, 3 a 41%, 3 a 42%, 3 a 43%, 3 a 44%, 3 a 45%, 3 a 46%, 3 a 47%, 3 a 48%, 3 a 49%, 3 a 50%, 4 a 10%, 4 a 15%, 4 a 20%, 4 a 25%, 4 a 30%, 4 a 35%, 4 a 40%, 4 a 41%, 4 a 42%, 4 a 43%, 4 a 44%, 4 a 45%, 4 a 46%, 4 a 47%, 4 a 48%, 4 a 49%, 4 a 50% ou 1 a 99% em comparação com o nível de glicanos sialilados em uma proteína anti-VEGF produzida usando um hidrolisado de soja.
[00317] Em outra modalidade, a proteína anti-VEGF pode ter um nível reduzido de glicanos galactosilados por cerca de 1%, 1,2%, 1,5%, 2%, 2,2%, 2,5%, 3%, 3,2%, 3,5%, 4%, 4,2%, 4,5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99%. A proteína anti-VEGF pode ter um nível diminuído de glicanos sialilados em Intervalos dentro de um ou mais dos valores anteriores, por exemplo, 1 a 10%, 1 a 15%, 1 a 20%, 1 a 25%, 1 a 30%, 1 a 35%, 1 a 40%, 1 a 41%, 1 a 42%, 1 a 43%, 1 a 44%, 1 a 45%, 1 a 46%, 1 a 47%, 1 a 48%, 1 a 49%, 1 a 50%, 2 a 10%, 2 a 15%, 2 a 20%, 2 a 25%, 2 a 30%, 2 a 35%, 2 a 40%, 2 a 41%, 2 a 42%, 2 a 43%, 2 a 44%, 2 a 45%, 2 a 46%, 2 a 47%, 2 a 48%, 2 a 49%, 2 a 50%, 3 a 10%, 3 a 15%, 3 a 20%, 3 a 25%, 3 a 30%, 3 a 35%, 3 a 40%, 3 a 41%, 3 a 42%, 3 a 43%, 3 a 44%, 3 a 45%, 3 a 46%, 3 a 47%, 3 a 48%, 3 a 49%, 3 a 50%, 4 a 10%, 4 a 15%, 4 a 20%, 4 a 25%, 4 a 30%, 4 a 35%, 4 a 40%, 4 a 41%, 4 a 42%, 4 a 43%, 4 a 44%, 4 a 45%, 4 a 46%, 4 a 47%, 4 a 48%, 4 a 49%, 4 a 50% ou 1 a 99%em comparação com o nível de glicanos galactosilados em uma proteína anti-VEGF produzida usando um hidrolisado de soja.
[00318] Em uma modalidade, a proteína anti-VEGF pode ter um nível aumentado de glicanos manosilados em cerca de 1 %, 1,2%, 1,5%, 2%, 2,2%, 2,5%, 3%, 3,2%, 3,5%, 4%, 4,2%, 4,5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99%. A proteína anti-VEGF pode ter um nível aumentado de glicanos manosilados por intervalos dentro de um ou mais dos valores anteriores, por exemplo, 1 a 10%, 1 a 15%, 1 a 20%, 1 a 25%, 1 a 30%, 1 a 35%, 1 a 40%, 1 a 41%, 1 a 42%, 1 a 43%, 1 a 44%, 1 a 45%, 1 a 46%, 1 a 47%, 1 a 48%, 1 a 49%, 1 a 50%, 2 a 10%, 2 a 15%, 2 a 20%, 2 a 25%, 2 a 30%, 2 a 35%, 2 a 40%, 2 a 41%, 2 a 42%, 2 a 43%, 2 a 44%, 2 a 45%, 2 a 46%, 2 a 47%, 2 a 48%, 2 a 49%, 2 a 50%, 3 a 10%, 3 a 15%, 3 a 20%, 3 a 25%, 3 a 30%, 3 a 35%, 3 a 40%, 3 a 41%, 3 a 42%, 3 a 43%, 3 a 44%, 3 a 45%, 3 a 46%, 3 a 47%, 3 a 48%, 3 a 49%, 3 a 50%, 4 a 10%, 4 a 15%, 4 a 20%, 4 a 25%, 4 a 30%, 4 a 35%, 4 a 40%, 4 a 41 %, 4 a 42%, 4 a 43%, 4 a 44%, 4 a 45%, 4 a 46%, 4 a 47%, 4 a 48%, 4 a 49%, 4 a 50% ou 1 a 99% em comparação com o nível de glicanos manosilados em uma proteína anti- VEGF produzida usando um hidrolisado de soja.
[00319] As composições descritas nesta seção podem ser produzidas por vários parâmetros a jusante e a montante como descrito abaixo nas seções IV e V, respectivamente.
IV. Preparação de composições usando tecnologias de processo a montante
[00320] Para produtos biológicos, a implementação de um processo a montante robusto e flexível é desejável. Um processo eficiente de a montante pode levar à produção desejável e aumento de escala de uma proteína de interesse. Os inventores descobriram que as composições da invenção compreendendo uma proteína anti-VEGF podem ser produzidas modulando as condições durante a produção de proteína a montante, tal como mudanças nos componentes do meio de um MQD. Cada etapa de um processo a montante pode afetar a qualidade, pureza e quantidade da proteína produzida.
[00321] A presente divulgação fornece evidências da existência de certas variantes de aflibercepte e/ou MiniTrap produzidas usando MQD. Essas variantes incluem isoformas que compreendem um ou mais resíduos de aminoácido oxidados. Exemplos de resíduos oxidados incluem, mas não são limitados a um ou mais resíduos de histidina, triptofano, metionina, fenilalanina ou tirosina. As composições produzidas usando o MQD modificado pode produzir uma preparação de proteína anti-VEGF com um valor alvo desejado de variantes de proteína de aflibercepte e/ou MiniTrap. Como mencionado acima, também pode haver uma cor amarelo-acastanhada associada às frações produzidas usando um MDL. (Como mencionado acima, nem todos os MQDs testados pelos inventores manifestaram uma descoloração distinta.)
[00322] Esta invenção inclui a cultura de uma célula hospedeira em um MQD modificado sob condições combinadas em que a célula expressa uma proteína de interesse recombinante seguida pela colheita de uma preparação de proteína recombinante de interesse produzida pela célula. Tal MQD modificado pode ser usado para produzir as composições como descrito acima em Seção III.
[00323] Em uma modalidade, o método compreende a cultura de uma célula hospedeira em um MQD sob condições adequadas, em que a célula hospedeira expresses a proteína recombinante de interesse, tal como aflibercepte. O método também compreende a colheita de uma preparação da proteína recombinante de interesse produzida pela célula, em que as condições adequadas incluem um MQD com: concentração cumulativa de ferro no referido MQD que é inferior a cerca de 55 μM, concentração cumulativa de cobre no referido MQD que é inferior ou igual a cerca de 0,8 μM, concentração cumulativa de níquel no referido MQD que é menor ou igual a cerca de 0,40 μM, concentração cumulativa de zinco no referido MQD que é menor ou igual a cerca de 56 μM, concentração cumulativa de cisteína no referido MQD que é inferior a cerca de 10 mM; e/ou um antioxidante no referido MQD em uma concentração de cerca de 0,001 mM a cerca de 10 mM para um único antioxidante e não mais do que cerca de 30 mM de concentração cumulativa se vários antioxidantes forem adicionados no referido MQD.
[00324] Em um aspecto da presente modalidade, a preparação obtida a partir do uso de condições adequadas resulta em uma redução nas variantes de proteína de aflibercepte e MiniTrap de VEGF uma quantidade desejada de variantes de proteínas de aflibercepte e MiniTrap de VEGF (referido como um "valor alvo" de variantes de proteínas de aflibercepte e MiniTrap de VEGF). Em um outro aspecto desta modalidade, a preparação obtida usando condições adequadas resulta em uma redução na cor das preparações para um valor BY desejado (referido como um "valor BY alvo") quando a preparação da proteína, incluindo variantes de aflibercepte e MiniTrap de VEGF são normalizadas para uma concentração de 5 g/L, 10 g/L ou ainda mais.
[00325] Em um aspecto adicional da presente modalidade, o valor alvo BY e/ou valor alvo de variantes pode ser obtido em uma preparação onde o título aumenta ou não diminui significativamente (ver Exemplo 5).
[00326] Em algumas modalidades, as composições produzidas usando o MQD modificado podem produzir uma preparação de proteína anti-VEGF com um valor alvo BY desejado, em que a cor da preparação é caracterizada como segue: (i) não mais amarelo-marrom do que o padrão de cor europeu BY2; (ii) não mais amarelo-marrom do que o padrão de cor europeu BY3; (iii) não mais amarelo-marrom do que o padrão de cor europeu BY4; (iv) não mais amarelo-marrom do que o padrão de cor europeu BY5; (v) entre o padrão europeu de cores BY2 e BY3; (vi) entre o padrão europeu de cores BY3 e BY4; (vii) entre o padrão europeu de cores BY4 e BY5, em que a composição compreende cerca de 5 g/L ou cerca de 10 g/L da proteína anti-VEGF e em que uma amostra da composição pode ser obtida como uma amostra de um eluato de Proteína A de uma colheita clarificada. Como visto no Exemplo 9, Tabela 9-3 abaixo, o eluato de Proteína A compreendendo 5 g/L de aflibercepte exibiu uma cor amarelo-marrom medida como tendo um valor de b* de 1,77. Tal amostra, quando produzida a jusante seguindo AEX teve um valor de b* de 0,50 demonstrando a utilidade da AEX para reduzir a coloração amarelo- marrom de uma amostra (Tabela 9-3). As composições produzidas usando o MQD modificado podem produzir uma preparação de proteína anti-VEGF, em que a cor da preparação é caracterizada por uma caracterização de cor padrão reconhecida na escala CIELAB: (i) não mais amarelo-marrom do que um valor de b* de cerca de 22 a 23; (ii) não mais amarelo-marrom do que um valor de b* de cerca de 16 a 17; (iii) não mais amarelo-marrom do que um valor de b* de 9 a 10; (iv) não mais amarelo-marrom do que um valor de b* de 4 a 5; (v) não mais amarelo-marrom do que um valor de b* de 2 a 3; (vi) entre valor de b* de 17 a 23; (vii) entre valor de b* de 10 a 17; (viii) entre valor de b* de 5 a 10; (ix) entre valor de b* de 3 a 5; ou (x) entre valor de b* de 1 a 3, em que a composição compreende cerca de 5 g/L ou cerca de 10 g/L da proteína anti-VEGF e em que a composição é obtida como uma amostra de um eluato de Proteína A de uma colheita clarificada. Ver Exemplo 9, Tabela 9-3.
[00327] Para componentes adicionados à cultura de células para formar o MQD modificado, o termo "quantidade cumulativa" se refere à quantidade total de um componente específico adicionado a um biorreator ao longo do curso da cultura de células para formar o MQD, incluindo as quantidades adicionadas no início da cultura (MQD no dia 0) e, subsequentemente, as quantidades adicionadas do componente. As quantidades de um componente adicionado a uma cultura de sementeira ou inóculo antes da produção do biorreator (isto é, antes do MQD no dia 0) também estão incluídas no cálculo da quantidade cumulativa do componente. Uma quantidade cumulativa não é afetada pela perda de um componente ao longo do tempo durante a cultura (por exemplo, através do metabolismo ou degradação química). Assim, duas culturas com as mesmas quantidades cumulativas de um componente podem, no entanto, ter níveis absolutos diferentes, por exemplo, se o componente for adicionado às duas culturas em momentos diferentes (por exemplo, se em uma cultura todo o componente é adicionado no início, e em outra cultura o componente é adicionado ao longo do tempo). Uma quantidade cumulativa também não é afetada pela síntese in situ de um componente ao longo do tempo durante a cultura (por exemplo, por meio de metabolismo ou conversão química). Assim, duas culturas com as mesmas quantidades cumulativas de um determinado componente podem, no entanto, ter níveis absolutos diferentes, por exemplo, se o componente for sintetizado in situ em uma das duas culturas por meio de um processo de bioconversão. Uma quantidade cumulativa pode ser expressa em unidades tais como, por exemplo, gramas ou moles do componente. O termo "concentração cumulativa" refere-se à quantidade cumulativa de um componente dividido pelo volume de líquido no biorreator no início do lote de produção, incluindo a contribuição para o volume inicial de qualquer inóculo usado na cultura. Por exemplo, se um biorreator contém 2 litros de meio de cultura de células no início do lote de produção e um grama do componente X é adicionado nos dias 0, 1,2 e 3, então a concentração cumulativa após o dia 3 é de 2 g/L (isto é, 4 gramas divididos por 2 litros). Se, no dia 4, um litro adicional de líquido não contendo o componente X fosse adicionado ao biorreator, a concentração cumulativa permaneceria 2 g/L. Se, no dia 5, alguma quantidade de líquido for perdida do biorreator (por exemplo, por meio da evaporação), a concentração cumulativa permaneceria 2 g/L. Uma concentração cumulativa pode ser expressa em unidades como, por exemplo, gramas por litro ou moles por litro.
Aminoácidos:
[00328] Em algumas modalidades, um MQD modificado pode ser obtido diminuindo ou aumentando as concentrações cumulativas de aminoácidos em um MQD. Exemplos não limitativos de tais aminoácidos incluem alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutâmico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina (sais dos mesmos). O aumento ou diminuição na quantidade cumulativa desses aminoácidos no MQD modificado pode ser de cerca de 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% em comparação com o MQD de partida, e varia dentro de um ou mais dos anteriores. Alternativamente, o aumento ou redução na quantidade cumulativa de um ou mais aminoácidos no MQD modificado pode ser de cerca de 5 a cerca de 20%, cerca de 10 a cerca de 30%, cerca de 30% a cerca de 40%, cerca de 30% a cerca de 50%, cerca de 40% a cerca de 60%, cerca de 60% a cerca de 70%, cerca de 70% a cerca de 80%, cerca de 80% a cerca de 90% ou cerca de 90% a cerca de 100% em comparação com o MQD não modificado, e varia dentro de um ou mais dos anteriores (ver FIGURAS 25 a 27 e Exemplo 5).
[00329] Em algumas modalidades, o MQD modificado pode ser obtido diminuindo a concentração cumulativa de cisteína em um MQD.A diminuição na quantidade de cisteína no MQD para formar o MQD modificado pode ser de cerca de 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% em comparação com o MQD não modificado, e varia dentro de um ou mais dos anteriores. Alternativamente, a diminuição na quantidade cumulativa da cisteína no MQD modificado pode ser de cerca de 5 a cerca de 20%, cerca de 10 a cerca de 30%, cerca de 30% a cerca de 40%, cerca de 30% a cerca de 50%, cerca de 40% a cerca de 60%, cerca de 60% a cerca de 70%, cerca de 70% a cerca de 80%, cerca de 80% a cerca de 90%, ou cerca de 90% a cerca de 100% em comparação com o MQD, e varia dentro de um ou mais dos anteriores. Em um aspecto, a quantidade de cisteína cumulativa em MQD modificado é inferior a cerca de 1 mM, cerca de 2 mM, cerca de 3 mM, cerca de 4 mM, cerca de 5 mM, cerca de 6 mM, cerca de 7 mM, cerca de 8 mM, cerca de 9 mM ou cerca de 10 mM (ver FIGURAS 25 a 27 e Exemplo 5).
[00330] Em algumas modalidades, o MQD modificado pode ser obtido substituindo pelo menos uma certa porcentagem de cisteína cumulativa em um MQD com cistina. A substituição pode ser de cerca de 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% em comparação com o MQD não modificado, e varia dentro de um ou mais dos anteriores. Alternativamente, a substituição pode ser de cerca de 5% a cerca de 20%, cerca de 10% a cerca de 30%, cerca de 30% a cerca de 40%, cerca de 30% a cerca de 50%, cerca de 40% a cerca de 60%, cerca de 60% a cerca de 70%, cerca de 70% a cerca de 80%, cerca de 80% a cerca de 90%, ou cerca de 90% a cerca de 100% em comparação com o MQD não modificado, e varia dentro de um ou mais dos anteriores (ver FIGURAS 25 a 27 e Exemplo 5).
[00331] Em algumas modalidades, o MQD modificado pode ser obtido substituindo pelo menos uma certa porcentagem de cisteína cumulativa em um MQD com sulfato de cisteína. A substituição pode ser de cerca de 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% em comparação com o MQD não modificado, e varia dentro de um ou mais dos anteriores. Alternativamente, a substituição pode ser de cerca de 5% a cerca de 20%, cerca de 10% a cerca de 30%, cerca de 30% a cerca de 40%, cerca de 30% a cerca de 50%, cerca de 40% a cerca de 60%, cerca de 60% a cerca de 70%, cerca de 70% a cerca de 80%, cerca de 80% a cerca de 90%, ou cerca de 90% a cerca de 100% em comparação com o MQD não modificado, e varia dentro de um ou mais dos anteriores.
Metais:
[00332] Em algumas modalidades, o MQD modificado pode ser obtido reduzindo ou aumentando a concentração cumulativa de metais em um MQD. Exemplos não limitativos de metais incluem ferro, cobre, manganês, molibdênio, zinco, níquel, cálcio, potássio e sódio. O aumento ou diminuição na quantidade de um ou mais metais no MQD modificado pode ser de cerca de 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% em comparação com o MQD não modificado, e varia dentro de um ou mais dos anteriores. Alternativamente, o aumento ou diminuição na quantidade cumulativa de um ou mais metais no MQD modificado pode ser de cerca de 5% a cerca de 20%, cerca de 10% a cerca de 30%, cerca de 30% a cerca de 40%, cerca de 30% a cerca de 50%, cerca de 40% a cerca de 60%, cerca de 60% a cerca de 70%, cerca de 70% a cerca de 80%, cerca de 80% a cerca de 90%, ou cerca de 90% a cerca de 100% em comparação com o MQD não modificado, e varia dentro de um ou mais dos anteriores (ver FIGURAS 25 a 27 e Exemplo 5).
Antioxidantes:
[00333] Em algumas modalidades, o MQD modificado compreende um ou mais antioxidantes. Exemplos não limitantes de antioxidantes podem incluir taurina, hipotaurina, glicina, ácido tióctico, glutationa, cloreto de colina, hidrocortisona, vitamina C, vitamina E e combinações dos mesmos (ver FIGURA 28A a E e Exemplo 5).
[00334] Em algumas modalidades, o MQD modificado compreende cerca de 0,01 mM a cerca de 20 mM de taurina, isto é, cerca de 0,01 mM a cerca de 1 mM, cerca de 0,01 mM a cerca de 5 mM, cerca de 0,01 mM a cerca de 10 mM, 0,1 mM a cerca de 1 mM, cerca de 0,1 mM a cerca de 5 mM, cerca de 0,1 mM a cerca de 10 mM, cerca de 1 mM a cerca de 5 mM, cerca de 1 mM a cerca de 10 mM, e faixas dentro de uma ou mais das anteriores.
[00335] Em algumas modalidades, o MQD modificado compreende cerca de 0,01 mM a cerca de 20 mM de hipotaurina, isto é, cerca de 0,01 mM a cerca de 1 mM, cerca de 0,01 mM a cerca de 5 mM, cerca de 0,01 mM a cerca de 10 mM, cerca de 0,1 mM a cerca de 1 mM, cerca de 0,1 mM a cerca de 5 mM, cerca de 0,1 mM a cerca de 10 mM, cerca de 1 mM a cerca de 5 mM, cerca de 1 mM a cerca de 10 mM, e faixas dentro de uma ou mais das anteriores.
[00336] Em algumas modalidades, o MQD modificado compreende cerca de 0,01 mM a cerca de 20 mM de glicina, isto é, cerca de 0,01 mM a cerca de 1 mM, cerca de 0,01 mM a cerca de 5 mM, cerca de 0,01 mM a cerca de 10 mM, 0,1 mM a cerca de 1 mM, cerca de 0,1 mM a cerca de 5 mM, cerca de 0,1 mM a cerca de 10 mM, cerca de 1 mM a cerca de 5 mM, cerca de 1 mM a cerca de 10 mM, e faixas dentro de uma ou mais das anteriores.
[00337] Em algumas modalidades, o MQD modificado compreende cerca de 0,01 μM a cerca de 5 μM de ácido tióctico, isto é, cerca de 0,01 μM a cerca de 0,1 μM, cerca de 0,1 μM a cerca de 1 μM, cerca de 1 μM a cerca de 2,5 μM, cerca de 1 μM a cerca de 3 μM, cerca de 1 μM a cerca de 5 μM, e faixas dentro de uma ou mais das anteriores.
[00338] Em algumas modalidades, o MQD modificado compreende cerca de 0,01 M a cerca de 5 mM de glutationa, isto é, cerca de 0,01 mM a cerca de 1 mM, cerca de 0,1 mM a cerca de 1 mM, cerca de 0,1 mM a cerca de 5 mM, cerca de 1 mM a cerca de 5 mM, e intervalos dentro de uma ou mais das anteriores.
[00339] Em algumas modalidades, o MQD modificado compreende cerca de 0,01 μM a cerca de 5 μM de hidrocortisona, isto é, cerca de 0,01 μM a cerca de 0,1 μM, cerca de 0,1 μM a cerca de 1 μM, cerca de 1 μM a cerca de 2,5 μM, cerca de 1 μM a cerca de 3 μM, cerca de 1 μM a cerca de 5 μM, e faixas dentro de uma ou mais das anteriores.Em algumas modalidades, o MQD modificado compreende cerca de 1 μM a cerca de 50 μM de vitamina C, isto é, cerca de 1 μM a cerca de 5 μM, cerca de 5 μM a cerca de 20 μM, cerca de 10 μM a cerca de 30 μM, cerca de 5 μM a cerca de 30 μM, cerca de 20 μM a cerca de 50 μM, cerca de 25 μM a cerca de 50 μM, e faixas dentro de uma ou mais das anteriores.
Mudanças no Meio para Modular a Glicosilação:
[00340] Esta invenção também inclui métodos de modulação da glicosilação de uma proteína anti-VEGF por meio da variação das concentrações cumulativas de certos componentes em um MQD. Com base nas quantidades cumulativas de componentes adicionados ao MQD, a % total de fucosilação, % total de galactosilação, % total de sialilação e manose-5 podem ser variadas.
[00341] Em modalidades exemplares, o método de modulação da glicosilação de uma proteína anti-VEGF pode compreender suplementar o MQD com uridina. A proteína anti-VEGF pode ter cerca de 40% a cerca de 50% de glicanos fucosilados totais, cerca de 30% a cerca de 55% de glicanos sialilados totais, cerca de 2% a cerca de 15% de manose-5, e cerca de 60% a cerca de 79% de glicanos galactosilados. (Veja Exemplo 6 abaixo).
[00342] Em algumas modalidades, o método de modulação da glicosilação de uma proteína anti-VEGF pode compreender a suplementação de um MQD com manganês. Em um aspecto, o MQD é desprovido de manganês antes da suplementação. A proteína anti- VEGF pode ter cerca de 40% a cerca de 50% de glicanos fucosilados totais, cerca de 30% a cerca de 55% de glicanos sialilados totais, cerca de 2% a cerca de 15% de manose-5, e cerca de 60% a cerca de 79% de glicanos galactosilados. (Veja Exemplo 6 abaixo).
[00343] Em algumas modalidades, o método de modulação da glicosilação de uma proteína anti-VEGF pode compreender a suplementação de um MQD com galactose. Em um aspecto, o MQD é desprovido de galactose antes da suplementação. A proteína anti-VEGF pode ter cerca de 40% a cerca de 50% de glicanos fucosilados totais, cerca de 30% a cerca de 55% de glicanos sialilados totais, cerca de 2% a cerca de 15% de manose-5, e cerca de 60% a cerca de 79% de glicanos galactosilados. (Veja o Exemplo 6 abaixo).
[00344] Em algumas modalidades, o método de modulação da glicosilação de uma proteína anti-VEGF pode compreender a suplementação de um MQD com dexametasona. Em um aspecto, o MQD é desprovido de dexametasona antes da suplementação. A proteína anti-VEGF pode ter cerca de 40% a cerca de 50% de glicanos fucosilados totais, cerca de 30% a cerca de 55% de glicanos sialilados totais, cerca de 2% a cerca de 15% de manose-5, e cerca de 60% a cerca de 79% de glicanos galactosilados (Veja o Exemplo 6 abaixo).
[00345] Em algumas modalidades, o método de modulação da glicosilação de uma proteína anti-VEGF pode compreender a suplementação de um MQD com um ou mais dentre uridina, manganês, galactose e dexametasona. Em um aspecto, o MQD é desprovido de um ou mais dentre uridina, manganês, galactose e dexametasona antes da suplementação. A proteína anti-VEGF pode ter cerca de 40% a cerca de 50% de glicanos fucosilados totais, cerca de 30% a cerca de 55% de glicanos sialilados totais, cerca de 2% a cerca de 15% de manose-5, e cerca de 60% a cerca de 79% de glicanos galactosilados. (veja o Exemplo 6 abaixo).
V. Preparação de Composições Usando Tecnologias de Processo a jusante
[00346] As composições que compreendem uma proteína anti-VEGF da invenção podem ser produzidas por condições de modulação durante a produção de proteína a jusante. Os inventores descobriram que otimizar os procedimentos a jusante pode levar à minimização de certas variantes da proteína anti-VEGF, bem como à descoloração. A otimização do processo a jusante pode produzir uma composição com oxovariantes reduzidas, bem como características de cor otimizadas.
[00347] As tecnologias de processo a jusante podem ser usadas sozinhas ou em combinação com as tecnologias de processo a jusante descritas na Seção IV, supra.
Cromatografia de Troca Aniônica:
[00348] Em algumas modalidades, uma composição da invenção pode envolver um processo que compreende: expressar uma proteína anti-VEGF em uma célula hospedeira em um MQD, em que a proteína anti-VEGF é segregada da célula hospedeira para o meio e uma colheita clarificada é obtida. A colheita é submetida às seguintes etapas: (a) carregamento de uma amostra biológica obtida da colheita em uma coluna de cromatografia de troca aniônica (AEX); (b) lavar a coluna AEX com um tampão de lavagem adequado; (c) coletar a(s) fração(ões) de fluxo direto, opcionalmente; (d) lavar a coluna com um tampão de tira adequado; e (e) coletar frações descartadas.
[00349] O fluxo através das frações pode compreender oxovariantes da proteína anti-VEGF que são de cerca de 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% da amostra de proteína anti-VEGF quando comparada com as oxovariantes na fração despojada da coluna de cromatografia de troca aniônica. Por exemplo, referindo-se a Tabela 95 e Tabela 9-6, as frações de fluxo direto compreendem variantes oxidadas da proteína anti-VEGF onde vários resíduos de histidina e triptofano são de cerca de 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% (e faixas dentro de uma ou mais das anteriores) oxidadas quando comparadas com as variantes oxidadas nas frações descartadas.
[00350] O pH de ambos os tampões de equilíbrio e lavagem para a coluna AEX pode ser de cerca de 8,20 a cerca de 8,60. Em outro aspecto, a condutividade de ambos os tampões de equilíbrio e lavagem para a coluna AEX pode ser de cerca de 1,50 a cerca de 3,0 mS/cm. Em um aspecto, o equilíbrio e os tampões de lavagem podem ser cerca de 50 mM de cloridrato de Tris. Em um aspecto, o tampão de tira compreende cloreto de sódio a 2 M ou hidróxido de sódio a 1 N ou ambos (ver Tabela 2-2). O Exemplo 2 ilustra ainda a otimização da concentração e condutividade dos tampões de equilíbrio e lavagem.
[00351] Variantes da proteína podem incluir modificações de um ou mais resíduos como segue: uma ou mais asparaginas são desamidadas; um ou mais ácidos aspárticos são convertidos em iso- aspartato e/ou Asn; uma ou mais metioninas são oxidadas; um ou mais triptofanos são convertidos em N-formilquinurenina; um ou mais triptofanos são mono-hidroxil triptofano; um ou mais triptofanos são di- hidroxil triptofano; um ou mais triptofanos são tri-hidroxil triptofano; uma ou mais argininas são convertidas em Arg 3-desoxiglucosona; a glicina C-terminal não está presente; e/ou há uma ou mais glicosítios não glicosilados.
[00352] A proteína de interesse pode ser aflibercepte, anticorpo anti-VEGF ou um MiniTrap de VEGF. As variantes proteicas podem ser formadas por um ou mais de (i) oxidação de histidinas a partir dos resíduos de histidina selecionados de His86, His110, His145, His209, His95, His19 e/ou His203 (ou posições de resíduos equivalentes em proteínas que compartilham certas características estruturais de aflibercepte); (ii) oxidação de resíduos de triptofano selecionados a partir de resíduos de triptofano em Trp58 e/ou Trp138 (ou posições de resíduos equivalentes em proteínas que compartilham certas características estruturais de aflibercepte); (iii) resíduo de tirosina de oxidação em Tyr64 (ou posições equivalentes em proteínas que compartilham certas características estruturais do aflibercepte); (iv) oxidação de resíduos de fenilalanina selecionados de Phe44 e/ou Phe166 (ou posições de resíduos equivalentes em proteínas que compartilham certas características estruturais de aflibercepte); e/ou (v) oxidação de resíduos de metionina selecionados de Met10, Met20, Met163 e/ou Met192 (ou posições de resíduos equivalentes em proteínas que compartilham certas características estruturais de aflibercepte).
[00353] As frações de fluxo direto podem compreender um ou mais dos seguintes: (a) uma porcentagem de resíduos de histidina que foram oxidados para 2-oxo-histidina em que sua caracterização de cor é a seguinte: (i) não mais amarelo-marrom do que o padrão de cor europeu BY2; (ii) não mais amarelo-marrom do que o padrão de cor europeu BY3; (iii) não mais amarelo-marrom do que o padrão de cor europeu BY4; (iv) não mais amarelo-marrom do que o padrão de cor europeu BY5; (v) entre o padrão europeu de cores BY2 e BY3; (vi) entre o padrão europeu de cores BY3 e BY4; (vii) entre o padrão europeu de cores BY4 e BY5, em que a composição compreende cerca de 5 g/L ou cerca de 10 g/L da proteína anti-VEGF, e em que a composição é obtida como uma amostra das frações de fluxo direto. uma porcentagem de resíduos de histidina que foram oxidados para 2-oxo-histidina. Além disso, sua cor é caracterizada por ter uma cor marrom-amarelada que se aproxima daquela de BY2, BY3, BY4, BY5, BY6, BY7; ou não é mais escuro/mais intenso que BY2, não mais escuro que BY3, não mais escuro que BY4, não mais escuro que BY5, não mais escuro que BY6, não mais escuro que BY7; ou está entre o de BY2 e BY3, entre o de BY2 e BY4, entre o de BY3 e BY4 ou entre o de BY3 e BY5. uma porcentagem de resíduos de histidina que foram oxidados para 2-oxo-histidina em que sua cor é caracterizada por uma cor no espaço de cor CIE L*, a*, b* como segue: (i) não mais amarelo-marrom do que um valor de b* de cerca de 22 a 23; (ii) não mais amarelo-marrom do que um valor de b* de cerca de 16 a 17; (iii) não mais amarelo-marrom do que um valor de b* de 9 a 10; (iv) não mais amarelo-marrom do que um valor de b* de 4 a 5; (v) não mais amarelo-marrom do que um valor de b* de 2 a 3; (vi) entre valor de b* de 17 a 23; (vii) entre valor de b* de 10 a 17; (viii) entre valor de b* de 5 a 10; (ix) entre valor de b* de 3 a 5; ou (x) entre valor de b* de 1 a 3, em que a composição compreende cerca de 5 g/L ou cerca de 10 g/L da proteína anti-VEGF e em que a composição é obtida como uma amostra das frações de fluxo direto. não mais do que cerca de 1%, não mais do que cerca de 0,1% ou cerca de 0,1 a 1%, 0,2 a 1%, 0,3 a 1%, 0,4 a 1%, 0,5 a 1%, 0,6 a 1%, 0,7 a 1%, 0,8 a 1% ou 0,9 a 1% dos resíduos de histidina na composição são oxidados a 2-oxo-histidina. O cálculo da porcentagem é descrito na Seção II.
Cromatografia de Afinidade:
[00354] Em algumas modalidades, as composições da invenção podem ser produzidas usando um processo que compreende: expressar uma proteína anti-VEGF em uma célula hospedeira em que a proteína anti-VEGF é segregada da célula hospedeira para o meio e uma colheita clarificada é obtida. A colheita é submetida às seguintes etapas, compreendendo (a) carregar uma amostra biológica obtida da colheita clarificada em uma coluna de cromatografia de afinidade, em que a cromatografia de afinidade compreende uma proteína capaz de se ligar seletivamente ou especificamente à proteína anti-VEGF; (b) lavar a coluna de cromatografia de afinidade com um tampão de eluição adequado, e (c) coletar a(s) fração(ões) eluída(s). Por exemplo, conforme exemplificado na Tabela 7-1 e Tabela 7-7 a 7-10, usando VEGF165 como a proteína capaz de se ligar seletivamente ou especificamente à proteína anti-VEGF e coletar as frações eluídas de acordo com o método acima, levou a uma produção bem-sucedida de MT5 (uma proteína anti-VEGF), aflibercepte e um fragmento anti-VEGF scFv. Tabela 7-1 também descreve a produção bem-sucedida de MT5 usando (i) mAb1 (um IgG1 humano de mAb anti-VEGFR1 de camundongo em que SEQ ID NO: 73 é uma cadeia pesada e a SEQ ID NO: 74 é uma cadeia leve); (ii) mAb2 (um IgG1 humano de mAb anti- VEGFR1 de camundongo em que a SEQ ID NO: 75 é uma cadeia pesada e a SEQ ID NO: 76 é uma cadeia leve); (iii) mAb3 (um IgG1 de camundongo de mAb anti-VEGF-R1 de camundongo em que a SEQ ID NO: 77 é uma cadeia pesada e a SEQ ID NO: 78 é uma cadeia leve) e (iv) mAb4 (um IgG1 de camundongo de mAb anti-VEGFR1 de camundongo em que a SEQ ID NO: 79 é uma cadeia pesada e a SEQ ID NO: 80 é uma cadeia leve) como proteínas diferentes capazes de se ligar seletivamente ou especificamente a MT5.
[00355] Com relação à etapa (a) acima, a amostra biológica a ser carregada na coluna de afinidade pode vir de uma amostra na qual a colheita clarificada pode ser submetida à cromatografia antes da afinidade, incluindo, mas não limitado a cromatografia de troca iônica (ânion ou cátion). Outros procedimentos cromatográficos bem conhecidos pelos versados na técnica também podem ser empregados antes do uso da etapa de afinidade. O ponto importante é que uma amostra biológica compreendendo uma proteína anti-VEGF pode ser submetida a cromatografia de afinidade.
[00356] Em algumas modalidades, as composições da invenção podem ser produzidas usando um processo que compreende: expressar uma proteína MiniTrap de VEGF em uma célula hospedeira em que a MiniTrap de VEGF é segregada da célula hospedeira para o meio e em que o meio pode ser posteriormente processado formando uma colheita clarificada. Esta colheita pode ser posteriormente processada por procedimentos cromatográficos conhecidos, produzindo uma amostra biológica que compreende um MiniTrap de VEGF. Esta amostra biológica pode ser posteriormente processada utilizando as seguintes etapas, compreendendo (a) carregar a amostra biológica em uma coluna de cromatografia de afinidade, em que a cromatografia de afinidade compreende uma proteína capaz de se ligar seletivamente ou especificamente a ou interagir com a proteína MiniTrap de VEGF; (b) lavar a coluna de cromatografia de afinidade com um tampão de eluição adequado e (c) coletar a(s) fração(ões) eluída(s). Referindo-se novamente à Tabela 7-1, descrita nesta Tabela está uma produção bem-sucedida de MT5 (MiniTrap de VEGF) usando (i) VEGFI65;(ÍÍ) mAb1 (um IgG1 humano de mAb anti-VEGFR1 de camundongo em que a SEQ ID NO: 73 é uma cadeia pesada e a SEQ ID NO: 74 é uma cadeia leve); (iii) mAb2 (um IgG1 humano de mAb anti-VEGFR1 de camundongo em que a SEQ ID NO: 75 é uma cadeia pesada e a SEQ ID NO: 76 é uma cadeia leve); (iv) mAb3 (um IgG1 de camundongo de mAb anti-VEGF-R1 de camundongo em que a SEQ ID NO: 77 é uma cadeia pesada e a SEQ ID NO: 78 é uma cadeia leve) e (v) mAb4 (um IgG1 de camundongo de mAb anti-VEGFR1 de camundongo em que a SEQ ID NO: 79 é uma cadeia pesada e a SEQ ID NO: 80 é uma cadeia leve) como proteínas diferentes capazes de se ligar seletivamente ou especificamente a de interagir com MT5.
[00357] Em uma modalidade, a cromatografia de afinidade também pode ser usada para isolar outras proteínas MiniTrap. Após a clivagem de um aflibercepte, uma amostra compreendendo o aflibercepte clivado pode ser submetida a cromatografia de afinidade usando um ligante específico para o aflibercepte clivado. Em um aspecto, o ligante pode ser um anticorpo ou porção do mesmo.
[00358] A clivagem do aflibercepte pode ser facilitada usando digestão proteolítica de aflibercepte com, por exemplo, protease IdeS (FabRICATOR) ou uma variante desta para gerar o MiniTrap de VEGF. A clivagem do aflibercepte com a protease IdeS ou uma variante da mesma pode produzir uma mistura de produtos incluindo um fragmento Fc e o MiniTrap de VEGF. A MiniTrap de VEGF pode ser posteriormente processado usando uma ou mais das estratégias de produção aqui descritas.
[00359] Em algumas modalidades exemplares, uma proteína capaz de se ligar seletivamente ou especificamente ("ligante") a ou interagir com uma proteína anti-VEGF, tal como aflibercepte ou MiniTrap, pode ser originada de um humano ou de um camundongo.
[00360] O processo de produção de afinidade pode ainda compreender equilibrar uma coluna de afinidade usando um tampão de equilíbrio antes de carregar a amostra biológica. Tampões de equilíbrio exemplares podem ser fosfato de sódio 20 mM, pH 6 A 8 (esp. 7,2), fosfato de sódio a 10 mM, NaCl a 500 mM, pH 6 a 8 (esp. 7,2), Tris a 50 mM pH 7 a 8, DPBS pH 7,4.
[00361] A amostra biológica pode ser carregada usando um tampão adequado, como DPBS.
[00362] Este processo de produção de afinidade pode compreender ainda a lavagem de uma coluna de afinidade com um ou mais tampões de lavagem. A coluna pode ser lavada uma ou várias vezes. Além disso, as lavagens também podem ser coletadas como frações de lavagem. O pH do tampão de lavagem pode ser de cerca de 7,0 a cerca de 8,60. Em um aspecto, o tampão de lavagem pode ser DPBS. Em outro aspecto, o tampão de lavagem pode ser fosfato de sódio a 20 mM, pH 6 a 8 (esp. 7,2), fosfato de sódio a 10 mM, NaCl a 500 mM, pH 6 a 8 (esp. 7,2), Tris a 50 mM pH 7 a 8, ou DPBS pH 7,4.
[00363] Este processo de afinidade pode compreender ainda a lavagem de uma coluna de afinidade com um ou mais tampões de eluição adequados e a coleta das frações eluídas. A coluna pode ser lavada uma ou várias vezes. Exemplos não limitativos de tal tampão de eluição adequado incluem: acetato de amônio (pH de cerca de 2,0 a cerca de 3,0), ácido acético (pH de cerca de 2,0 a cerca de 3,2), glicina- HCl (pH de cerca de 2,0 a cerca de 3,0), citrato de sódio (pH de cerca de 2,0 a cerca de 3,0), ácido cítrico (pH de cerca de 2,0 a cerca de 3,0), isotiocianato de potássio (pH de cerca de 2,0 a cerca de 3,0), ou combinações dos mesmos.
[00364] Em alguns aspectos, as frações eluídas podem ser neutralizadas usando um tampão de neutralização. Um exemplo de tal tampão de neutralização é Tris para Tris-HCl (pH de cerca de 7,0 a cerca de 9,0).
Mutantes IdeS:
[00365] A protease IdeS usada para a clivagem de uma proteína de fusão Fc, tal como o aflibercepte, perderá rapidamente a atividade enzimática sob condições básicas de pH, o que pode limitar seu uso durante a fabricação de MiniTrap de VEGF. Assim, as variantes foram desenvolvidas para serem mais estáveis em pH básico, por exemplo, na presença de uma base forte tal como NaOH. Tais condições básicas podem ser NaOH a 0,05 N durante 1 hora ou NaOH a 0,1 N durante 0,5 horas.
[00366] Em algumas modalidades, um mutante IdeS pode ter uma sequência de aminoácidos compreendendo pelo menos cerca de 70% de identidade de sequência ao longo de seu tamanho natural com as sequências de aminoácidos estabelecidas no grupo que consiste de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 16. Em alguns aspectos, a sequência de aminoácidos tem cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou cerca de 100% de identidade de sequência em todo o seu comprimento com as sequências de aminoácidos mencionadas diretamente acima.
[00367] Em algumas modalidades, um mutante de IdeS pode ter uma molécula de ácido nucleico isolada que codifica um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos compreendendo pelo menos 70% de identidade de sequência em todo o seu comprimento com as sequências de aminoácidos conforme estabelecido no grupo que consiste de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 16. Em alguns aspectos, a sequência de aminoácidos tem cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou cerca de 100% de identidade de sequência em todo o seu comprimento com as sequências de aminoácidos mencionadas diretamente acima.
[00368] Em algumas modalidades, o polipeptídeo pode ter uma sequência de aminoácidos compreendendo pelo menos 70% de identidade de sequência em todo o seu comprimento com as sequências de aminoácidos conforme estabelecido no grupo que consiste de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 16 e pode ser expresso por uma célula hospedeira com um vetor adequado compreendendo ácido nucleico que codifica para os peptídeos identificados. Em um aspecto, a molécula de ácido nucleico está operacionalmente ligada a uma sequência de controle de expressão capaz de direcionar sua expressão em uma célula hospedeira. Em um aspecto, o vetor pode ser um plasmídeo. Em alguns aspectos, a sequência de aminoácidos tem cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou cerca de 100% de identidade de sequência em todo o seu comprimento com as sequências de aminoácidos mencionadas diretamente acima. Em alguns aspectos, uma molécula de ácido nucleico isolada pode ser usada para codificar o polipeptídeo.
[00369] Em algumas modalidades, mutantes de IdeS podem ter uma sequência de aminoácidos compreendendo uma sequência de aminoácidos parental definida pela SEQ ID NO: 1 (IdeS) com um resíduo de asparagina na posição 87, 130, 182 e/ou 274 mutado para um aminoácido diferente de asparagina. Em um aspecto, a mutação pode conferir uma estabilidade química aumentada em valores de pH alcalinos em comparação com a sequência de aminoácidos parental. Em outro aspecto, a mutação pode conferir um aumento na estabilidade química em 50% em valores de pH alcalinos em comparação com a sequência de aminoácidos parental. Em um aspecto, o aminoácido pode ser selecionado a partir de ácido aspártico, leucina e arginina. Em um aspecto particular, os resíduos de asparagina na posição 87 é mutado para um resíduo de ácido aspártico. Em outro aspecto particular, os resíduos de asparagina na posição 130 é mutado para um resíduo de arginina. Em ainda outro aspecto particular, os resíduos de asparagina na posição 182 é mutado para um resíduo de leucina. Em ainda outro aspecto particular, os resíduos de asparagina na posição 274 é mutado para um resíduo de ácido aspártico. Em ainda outro aspecto particular, os resíduos de asparagina nas posições 87 e 130 está mutado. Em ainda um outro aspecto particular, os resíduos de asparagina nas posições 87 e 182 são mutados. Em ainda outro aspecto particular, os resíduos de asparagina na posição 87 e 274 são mutados. Em ainda outro aspecto particular, os resíduos de asparagina na posição 130 e 182 são mutados. Em ainda outro aspecto particular, os resíduos de asparagina na posição 130 e 274 são mutados. Em ainda outro aspecto particular, os resíduos de asparagina na posição 182 e 274 são mutados. Em ainda outro aspecto particular, os resíduos de asparagina na posição 87, 130 e 182 são mutados. Em ainda outro aspecto particular, os resíduos de asparagina na posição 87, 182 e 274 são mutados. Em ainda outro aspecto particular, os resíduos de asparagina na posição 130, 182 e 274 são mutados. Em ainda outro aspecto particular, os resíduos de asparagina na posição 87, 130, 182 e 274 são mutados. Em alguns aspectos, a sequência de aminoácidos tem cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou cerca de 100% de identidade de sequência em todo o seu comprimento com as sequências de aminoácidos descritas acima. Em alguns aspectos, uma molécula de ácido nucleico isolada pode ser usada para codificar o polipeptídeo.
[00370] Aqueles ordinariamente versados na técnica, familiarizados com técnicas de biologia molecular padrão, podem, sem carga indevida, preparar e usar mutantes IdeS da presente invenção. Técnicas padrão podem ser usadas para DNA recombinante, síntese de oligonucleotídeos, cultura de tecidos, transformação e (por exemplo, eletroporação, lipofecção). Ver, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual, supra, que é incorporado aqui por referência para qualquer propósito. As reações enzimáticas e as técnicas de produção podem ser realizadas de acordo com as especificações do fabricante ou conforme descrito neste documento.
VI. Produção de Proteínas em Geral
[00371] Uma variedade de diferentes técnicas de produção, incluindo, mas não se limitando a, afinidade, troca iônica, modo misto, exclusão de tamanho, e cromatografia de interação hidrofóbica, individualmente ou em combinação, são considerados como estando no escopo da presente invenção. Estas etapas cromatográficas separam misturas de proteínas de uma amostra biológica com base em sua carga, grau de hidrofobicidade ou tamanho, ou uma combinação dos mesmos, dependendo da forma particular de separação. Várias resinas de cromatografia diferentes estão disponíveis para cada uma das técnicas aludidas supra, permitindo a adaptação precisa do esquema de produção para uma proteína particular envolvida. Cada método de separação resulta na proteína atravessando em taxas diferentes através de uma coluna para alcançar uma separação física que aumenta conforme eles passam pela coluna ou aderem seletivamente a um meio de separação. As proteínas são então (i) eluídas diferencialmente usando um tampão de eluição apropriado e/ou (ii) coletadas a partir de frações de fluxo obtidas a partir da coluna usada, opcionalmente, a partir da lavagem da coluna com um tampão de equilíbrio apropriado. Em alguns casos, a proteína de interesse é separada das impurezas (HCPs, variantes de proteínas, etc.) quando as impurezas aderem preferencialmente à coluna e a proteína de interesse nem tanto, isto é, a proteína de interesse não adsorve à fase sólida de uma determinada coluna e, portanto, flui através da coluna. Em alguns casos, as impurezas são separadas da proteína de interesse quando não conseguem adsorver à coluna e, assim, fluem através da coluna.
[00372] O processo de produção pode começar na etapa de separação após a proteína recombinante ter sido produzida usando métodos de produção a montante descritos acima e/ou por métodos de produção alternativos convencionais na técnica. Uma vez que uma solução clarificada ou mistura compreendendo a proteína de interesse, por exemplo, uma proteína de fusão, foi obtida, a separação da proteína de interesse de impurezas relacionadas ao processo (tal como as outras proteínas produzidas pela célula (como HCPs), bem como substâncias relacionadas com o produto, tais como variantes ácidas ou básicas) é realizada. Uma combinação de uma ou mais técnicas de produção diferentes, incluindo afinidade, troca iônica (por exemplo, CEX, AEX), modo misto (MM) e/ou cromatografia de interação hidrofóbica pode ser utilizada. Essas etapas de produção separam misturas de componentes dentro de uma amostra biológica com base em sua, por exemplo, carga, grau de hidrofobicidade e/ou tamanho aparente. Numerosas resinas de cromatografia estão comercialmente disponíveis para cada uma das técnicas de cromatografia aqui mencionadas, permitindo a adaptação precisa do esquema de produção para uma proteína particular envolvida. Cada um dos métodos de separação permite que as proteínas atravessem em diferentes taxas através de uma coluna, alcançando uma separação física que aumenta à medida que passam pela coluna ou adsorvem seletivamente a uma resina de separação (ou meio). As proteínas podem então ser coletadas diferencialmente. Em alguns casos, a proteína de interesse é separada dos componentes de uma amostra biológica quando outros componentes são adsorvidos especificamente à resina de uma coluna enquanto a proteína de interesse não.
Recuperação Primária e Inativação de Vírus
[00373] Em certas modalidades, as etapas iniciais dos métodos de produção aqui descritos envolvem clarificação e recuperação primária de uma proteína de interesse a partir de uma amostra biológica. A recuperação primária incluirá uma ou mais etapas de centrifugação para separar a proteína de interesse de uma célula hospedeira e detritos celulares assistentes. A centrifugação da amostra pode ser realizada a, por exemplo, mas não como limitação, 7.000 x g a aproximadamente 12.750 x g. No contexto da produção em grande escala, essa centrifugação pode ocorrer on-line com uma taxa de fluxo definida para atingir, por exemplo, um nível de turbidez de 150 NTU no sobrenadante resultante. Esse sobrenadante pode então ser coletado para processamento posterior ou filtrado in-line através de um ou mais filtros de profundidade para maior clarificação da amostra.
[00374] Em certas modalidades, a recuperação primária pode incluir o uso de uma ou mais etapas de filtração de profundidade para clarificar a amostra e, assim, auxiliar no processamento da proteína de interesse. Em outras modalidades, a recuperação primária pode incluir o uso de uma ou mais etapas de filtração de profundidade pós-centrifugação. Exemplos não limitativos de filtros de profundidade que podem ser usados no contexto da presente invenção incluem os filtros de profundidade Millistak+ X0HC, F0HC, D0HC, A1HC, B1HC (EMD Millipore), 3M™ modelo 30/60ZA, 60/90 ZA, VR05, VR07, filtros de profundidade delipid (3M Corp.). Um filtro de 0,2 μm tal como o Sartorius de 0,45/0,2 μm Sartopore™ bicamada ou o Express SHR da Millipore ou cartuchos de filtro SHC normalmente seguem os filtros de profundidade. Outros filtros bem conhecidos por alguém versado na técnica também podem ser usados.
[00375] Em certas modalidades, o processo de recuperação primário também pode ser um ponto para reduzir ou inativar os vírus que podem estar presentes em uma amostra biológica. Qualquer um ou mais de uma variedade de métodos de redução/inativação viral podem ser usados durante a fase de recuperação primária da produção, incluindo inativação por calor (pasteurização), inativação de pH, tratamento com tampão/detergente, Irradiação de raios UV e Y e a adição de certos agentes de inativação química, como β-propiolactona ou, por exemplo, cobre fenantrolina, conforme descrito na Patente Norte Americana N°. 4.534.972, todo o ensinamento da qual é aqui incorporado por referência. Em certas modalidades exemplares da presente invenção, a amostra é exposta à inativação viral do detergente durante a fase de recuperação primária. Em outras modalidades, a amostra pode ser exposta a inativação de baixo pH durante a fase de recuperação primária.
[00376] Nas modalidades em que a redução/inativação viral é utilizada, uma amostra biológica pode ser ajustada, conforme necessário, para outras etapas de produção. Por exemplo, após a inativação viral de baixo pH, o pH da amostra é tipicamente ajustado para um valor de pH mais neutro, por exemplo, de cerca de 4,5 a cerca de 8,5, antes de continuar o processo de produção. Além disso, a mistura pode ser diluída com água para injeção (WFI) para obter uma condutividade desejada.
Cromatografia de Afinidade
[00377] Em certas modalidades exemplares, pode ser vantajoso submeter uma amostra biológica à cromatografia de afinidade para a produção de uma proteína de interesse. O material cromatográfico é capaz de se ligar seletivamente ou especificamente a ou interagir com a proteína de interesse. Exemplos não limitativos de tal material cromatográfico incluem: Proteína A e Proteína G. Além disso, material cromatográfico compreendendo, por exemplo, uma proteína ou porção da mesma capaz de ligação ou interação com a proteína de interesse. Em um aspecto, a proteína de interesse é uma proteína anti-VEGF, tal como aflibercepte, MiniTrap ou uma proteína relacionada a mesma.
[00378] A cromatografia de afinidade pode envolver a submissão de uma amostra biológica a uma coluna que compreende uma resina de proteína A adequada. Quando usado neste documento, o termo "Proteína A" abrange a Proteína A recuperada de uma fonte nativa da mesma, a Proteína A produzida sinteticamente (por exemplo, por síntese de peptídeo ou por técnicas recombinantes), e suas variantes que retêm a capacidade de se ligar a proteínas que têm uma região CH2/CH3. Em certos aspectos, a resina de Proteína A é útil para a produção com base em afinidade e isolamento de uma variedade de isotipos de anticorpos, interagindo especificamente com a porção Fc de uma molécula caso ela possua essa região.
[00379] Existem várias fontes comerciais de resina de proteína A. Uma resina adequada é MabSelect™ da GE Healthcare. As resinas adequadas incluem, mas não se limitam a MabSelect SuRe™, MabSelect SuRe LX, MabSelect, MabSelect SuRe pcc, MabSelect Xtra, rProtein A Sepharose da GE Healthcare, ProSep HC, ProSep Ultra, e ProSep Ultra Plus da EMD Millipore, MapCapture da Life Technologies. Um exemplo não limitativo de uma coluna adequada empacotada com MabSelect™ é uma coluna de cerca de 1,0 cm de diâmetro x cerca de 21,6 cm de comprimento (volume de leito de 17 mL). Uma coluna adequada pode compreender uma resina como MabSelect™ SuRe ou uma resina análoga. A proteína A também pode ser adquirida comercialmente na Repligen, Pharmacia e Fermatech.
[00380] Uma coluna de afinidade pode ser equilibrada com um tampão adequado antes do carregamento da amostra. Após o carregamento da coluna, a coluna pode ser lavada uma ou várias vezes usando um tampão de lavagem adequado. A coluna pode então ser eluída usando um tampão de eluição apropriado, por exemplo, glicina- HCl, ácido acético ou ácido cítrico. O eluato pode ser monitorado usando técnicas bem conhecidas daqueles versados na técnica, tal como um detector de UV. As frações de interesse eluídas podem ser coletadas e, em seguida, preparadas para processamento posterior.
[00381] Em um aspecto, o eluato pode ser submetido a inativação viral, por exemplo, por detergente ou baixo pH. Uma concentração adequada de detergente ou pH (e tempo) pode ser selecionada para obter um resultado de inativação viral desejado. Após a inativação viral, o eluato é geralmente pH e/ou condutividade ajustada para as etapas de produção subsequentes.
[00382] O eluato pode ser submetido à filtração através de um filtro de profundidade para remover a turbidez e/ou várias impurezas da proteína de interesse antes das etapas adicionais de polimento cromatográfico. Exemplos de filtros de profundidade adequados incluem, mas não estão limitados a filtros Millistak+ XOHC, FOHC, DOHC, AIHC, X0SP, e BIHC Pod (EMD Millipore) ou Zeta Plus 30ZA/60ZA, 60ZA/90ZA, delipid, VR07 e VR05 (3M). O filtro multi- mecanismo Emphaze AEX Hybrid Purifier também pode ser usado para clarificar o eluato. O pool de eluato pode precisar ser ajustado a um determinado pH e condutividade, a fim de obter a remoção de impurezas desejadas e recuperação de produto da etapa de filtração em profundidade.
Cromatografia de Troca Aniônica
[00383] Em certas modalidades, uma proteína de interesse é produzida submetendo uma amostra biológica a pelo menos uma etapa de separação por troca aniônica. Em um cenário, a etapa de troca aniônica pode ocorrer seguindo um procedimento de cromatografia de afinidade (por exemplo, afinidade de Proteína A). Em outros cenários, a etapa de troca aniônica pode ocorrer antes da etapa de cromatografia de afinidade. Em ainda outros protocolos, a troca aniônica pode ocorrer antes e depois de uma etapa de cromatografia de afinidade. Em um aspecto, a proteína de interesse é aflibercepte ou MiniTrap.
[00384] O uso de um material de troca aniônica versus um material de troca catiônica é baseado, em parte, nas cargas locais da proteína de interesse. A cromatografia de troca aniônica pode ser usada em combinação com outros procedimentos cromatográficos, tais como cromatografia de afinidade, cromatografia de exclusão de tamanho, cromatografia de interação hidrofóbica, bem como outros modos de cromatografia conhecidos por alguém versado na técnica.
[00385] Ao realizar uma separação, a composição de proteína inicial (amostra biológica) pode ser colocada em contato com um material de troca aniônica usando qualquer uma de uma variedade de técnicas, por exemplo, usando uma técnica de produção em lote ou uma técnica cromatográfica.
[00386] No contexto da produção em lote, o material de troca aniônica é preparado ou equilibrado em um tampão de partida desejado. Após a preparação, uma pasta do material de troca aniônica é obtida. A amostra biológica é colocada em contato com a pasta para permitir a adsorção da proteína ao material de troca aniônica. Uma solução compreendendo espécies ácidas que não se ligam ao material AEX é separada da pasta, permitindo que a pasta se assente e removendo o sobrenadante. A pasta pode ser submetida a uma ou mais etapas de lavagem e/ou etapas de eluição.
[00387] No contexto da separação cromatográfica, uma coluna cromatográfica é usada para abrigar o material de suporte cromatográfico (resina ou fase sólida). Uma amostra contendo uma proteína de interesse é carregada em uma coluna cromatográfica particular. A coluna pode então ser submetida a uma ou mais etapas de lavagem usando um tampão de lavagem adequado. Os componentes de uma amostra que não foram adsorvidos na resina provavelmente fluirão diretamente pela coluna. Os componentes que foram adsorvidos à resina podem ser eluídos diferencialmente usando um tampão de eluição apropriado.
[00388] Uma etapa de lavagem é tipicamente realizada em cromatografia AEX usando condições semelhantes às condições de carga ou, alternativamente, reduzindo o pH e/ou aumentando a força iônica/condutividade da lavagem em uma etapa ou forma gradiente linear. Em um aspecto, a solução salina aquosa usada tanto no tampão de carregamento quanto no de lavagem tem um pH que está no, ou próximo ao ponto isoelétrico (pI) da proteína de interesse. Normalmente, o pH é cerca de 0 a 2 unidades maior ou menor do que o pI da proteína de interesse, no entanto, pode estar na faixa de 0 a 0,5 unidades maior ou menor. Também pode estar no pI da proteína de interesse.
[00389] O agente aniônico pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em acetato, cloreto, formato e combinações dos mesmos. O agente catiônico pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em Tris, arginina, sódio e combinações dos mesmos. Em um exemplo particular, a solução tampão é um tampão Tris/formato. O tampão pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em piridina, piperazina, L-histidina, Bis-Tris, Bis-Tris propano, imidazol, N-etilmorfolina, TEA (trietanolamina), Tris, morfolina, N-metildietanolamina, AMPD (2-amino- 2-metil-1,3-propanodiol), dietanolamina, etanolamina, AMP (2-amino-2- metil-l-propaol), piperazina, 1,3-diaminopropano e piperidina.
[00390] Uma coluna de cromatografia de troca aniônica empacotada, dispositivo de membrana de troca aniônica, dispositivo monolítico de troca aniônica ou meio de filtro de profundidade pode ser operado tanto no modo de eluição de ligação, modo de fluxo direto ou modo híbrido em que as proteínas exibem ligação ao material cromatográfico e ainda pode ser lavado de tal material usando um tampão que é o mesmo ou substancialmente semelhante ao tampão de carga.
[00391] No modo de eluição de ligação, uma coluna ou dispositivo de membrana é primeiro condicionado com um tampão com força iônica e pH apropriados sob condições em que certas proteínas irão adsorver à matriz à base de resina. Por exemplo, durante a carga de alimentação, uma proteína de interesse pode ser adsorvida à resina devido à atração eletrostática. Depois de lavar a coluna ou o dispositivo de membrana com o tampão de equilíbrio ou outro tampão com um pH e/ou condutividade diferente, a recuperação do produto é obtida aumentando a força iônica (isto é, condutividade) do tampão de eluição para competir com o soluto pelos sítios carregados da matriz de troca aniônica. Mudar o pH e, assim, alterar a carga do soluto é outra maneira de conseguir a eluição do soluto. A mudança na condutividade ou pH pode ser gradual (gradiente de eluição) ou passo a passo (etapa de eluição).
[00392] No modo de fluxo direto, uma coluna ou dispositivo de membrana é operado em um pH e condutividade selecionados de modo que a proteína de interesse não se ligue à resina ou à membrana, enquanto as espécies ácidas serão retidas na coluna ou terão um perfil de eluição distinto em comparação com a proteína de interesse. No contexto desta estratégia, as espécies ácidas irão interagir ou se ligar ao material cromatográfico sob condições adequadas, enquanto a proteína de interesse e certos agregados e/ou fragmentos da proteína de interesse irão fluir através da coluna.
[00393] Exemplos não limitativos de resinas de troca aniônica incluem grupos dietilaminoetila (DEAE), aminoetila quaternária (QAE) e amina quaternária (Q). Outros exemplos não limitativos incluem: Poros 50PI e Poros 50HQ, que são contas poliméricas rígidas com uma estrutura que consiste em poli[estireno-divinilbenzeno] reticulado; Capto Q Impres e Capto DEAE, que são contas de agarose de alto fluxo; Toyopearl QAE-550, Toyopearl DEAE-650, e Toyopearl GigaCap Q- 650, que são contas de base polimérica; Fractogel® EMD TMAE Hicap, que é uma resina polimérica sintética com um trocador de íons tentáculo; Sartobind STIC® PA nano, que é uma membrana cromatográfica tolerante a sal com um ligante de amina primária; Sartobind Q nano; que é uma membrana cromatográfica de troca aniônica forte; CUNO BioCap; que é um meio de filtro de profundidade zeta-plus construído a partir de auxiliares de filtro inorgânicos, celulose refinada e uma resina de troca iônica; e XOHC, que é um meio de filtro de profundidade construído a partir de auxiliar de filtro inorgânico, celulose e ésteres de celulose mistos.
[00394] Em certas modalidades, a carga de proteína de uma amostra pode ser ajustada a uma carga de proteína total para a coluna entre cerca de 50 g/L e cerca de 500 g/L, ou entre cerca de 75 g/L e cerca de 350 g/L, ou entre cerca de 200 g/L e cerca de 300 g/L. Em outras modalidades, a concentração de proteína da mistura de proteína de carga é ajustada a uma concentração de proteína do material carregado na coluna de cerca de 0,5 g/L e cerca de 50 g/L, entre cerca de 1g/L e cerca de 20 g/L, ou entre cerca de 3g/L e cerca de 10 g/L. Em ainda outras modalidades, a concentração de proteína da mistura de proteína de carga é ajustada para uma concentração de proteína do material para a coluna de cerca de 37 g/L.
[00395] Aditivos tais como polietilenoglicol (PEG), detergentes, aminoácidos, açúcares, agentes caotrópicos podem ser adicionados para melhorar o desempenho da separação para obter melhor separação, recuperação e/ou qualidade do produto.
[00396] Em certas modalidades, incluindo aquelas relacionadas ao aflibercepte e/ou MiniTrap de VEGF, os métodos da presente invenção podem ser usados para remover seletivamente, reduzir significativamente, ou remover essencialmente pelo menos 10% de variantes de proteínas, produzindo assim composições de proteínas que têm variantes de proteína reduzidas.
[00397] As variantes proteicas podem incluir modificações de um ou mais resíduos como segue: uma ou mais asparaginas são desamidadas; um ou mais ácidos aspárticos são convertidos em aspartato-glicina e/ou Asn-Gly; uma ou mais metioninas são oxidadas; um ou mais triptofanos são convertidos em N-formilquinurenina; um ou mais triptofanos são mono-hidroxil triptofano; um ou mais triptofanos são di-hidroxil triptofano; um ou mais triptofanos são tri-hidroxil triptofano; uma ou mais argininas são convertidas em Arg 3-desoxiglucosona; a glicina C-terminal não está presente; e/ou há uma ou mais glicosítios não glicosilados. O uso de AEX também foi observado para reduzir espécies oxidadas e ácidas de variantes anti-VEGF no referido eluato de afinidade. Em comparação com o eluato de afinidade, após o uso de AEX, a fração de fluxo direto pode mostrar uma redução de pelo menos cerca de 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, ou 5% em espécies oxidadas e/ou ácidas de variantes anti-VEGF.
[00398] Variantes de proteínas de aflibercepte e/ou MiniTrap de VEGF podem incluir uma ou mais de (i) histidinas oxidadas dos resíduos de histidina selecionados de His86, His110, His145, His209, His95, His19 e/ou His203 (ii) resíduos de triptofano oxidados selecionados de resíduos de triptofano em Trp58 e/ou Trp138; (iii) resíduo de tirosina oxidada em Tyr64; (iv) resíduos de fenilalanina oxidada selecionados de Phe44 e/ou Phe166; e/ou (v) resíduos de metionina oxidada selecionados de Met10, Met 20, Met163 e/ou Met192.
Cromatografia de Troca Catiônica
[00399] As composições da presente invenção podem ser produzidas submetendo uma amostra biológica compreendendo uma proteína de interesse a pelo menos uma etapa de troca catiônica (CEX). Em certas modalidades exemplares, a etapa CEX será além de uma etapa AEX e ocorrerá antes ou depois da etapa AEX. Em um aspecto, a proteína de interesse é aflibercepte, MiniTrap ou uma molécula relacionada a mesma.
[00400] O uso de um material de troca catiônica versus um material de troca aniônica, tal como aqueles materiais de troca aniônica descritos supra, é baseado, em parte, nas cargas locais da proteína de interesse em uma determinada solução e nas condições de separação desejadas. Está no escopo desta invenção empregar uma etapa de troca catiônica antes da utilização de uma etapa de troca aniônica, ou uma etapa de troca aniônica antes da utilização de uma etapa de troca catiônica. Além disso, está no escopo desta invenção empregar apenas uma etapa de troca catiônica em combinação com outros procedimentos de cromatografia.
[00401] Ao realizar a troca catiônica, uma amostra compreendendo uma proteína de interesse pode ser contatada com um material de troca catiônica usando qualquer uma de uma variedade de técnicas, por exemplo, usando uma técnica de produção em lote ou uma técnica cromatográfica, conforme descrito acima para AEX.
[00402] Uma solução aquosa de sal pode ser usada como tampão de carregamento e de lavagem com um pH inferior ao ponto isoelétrico (pI) da proteína de interesse. Em um aspecto, o pH é cerca de 0 a 5 unidades mais baixo do que o pI da proteína. Em outro aspecto, está na faixa de 1 a 2 unidades menor do que o pI da proteína. Em ainda outro aspecto, está na faixa de 1 a 1,5 unidades menor do que o pI da proteína.
[00403] Em certas modalidades, a concentração do agente aniônico em solução aquosa de sal é aumentada ou diminuída para atingir um pH entre cerca de 3,5 e cerca de 10,5, ou entre cerca de 4 e cerca de 10, ou entre cerca de 4,5 e cerca de 9,5, ou entre cerca de 5 e cerca de 9, ou entre cerca de 5,5 e cerca de 8,5, ou entre cerca de 6 e cerca de 8, ou entre cerca de 6,5 e cerca de 7,5. Em um aspecto, a concentração do agente aniônico é aumentada ou diminuída na solução aquosa de sal a fim de atingir um pH de 5, ou 5,5, ou 6, ou 6,5, ou 6,8, ou 7,5. Os sistemas tampão adequados para uso nos métodos CEX incluem, mas não estão limitados a Tris formato, Tris acetato, sulfato de amônio, cloreto de sódio, e sulfato de sódio.
[00404] Em certas modalidades, a condutividade e o pH da solução aquosa de sal é ajustada aumentando ou diminuindo a concentração de um agente catiônico. Em um aspecto, o agente catiônico é mantido em uma concentração que varia de cerca de 20 mM a cerca de 500 mM, cerca de 50 mM a cerca de 350 mM, cerca de 100 mM a cerca de 300 mM, ou cerca de 100 mM a cerca de 200 mM. Exemplos não limitativos do agente catiônico podem ser selecionados do grupo que consiste em sódio, Tris, trietilamina, amônio, arginina e combinações dos mesmos.
[00405] Uma coluna de cromatografia de troca catiônica empacotada ou um dispositivo de membrana de troca catiônica pode ser operado no modo de eluição de ligação, modo de fluxo direto ou modo híbrido em que o produto exibe ligação ou interação com um material cromatográfico, mas pode ser lavado de tal material usando um tampão que é o mesmo ou substancialmente similar ao tampão de carregamento (os detalhes desses modos estão descritos acima).
[00406] Substituintes catiônicos incluem carboximetila (CM), sulfoetila (SE), sulfopropila (SP), fosfato (P) e sulfonato (S). Materiais catiônicos adicionais incluem, mas não estão limitados a: Capto SP ImpRes, que é uma conta de agarose de alto fluxo; CM Hyper D grau F; que é uma conta de cerâmica revestida e permeada com um hidrogel funcionalizado, 250 a 400 grupos iônicos μeq/mL; Eshmuno S, que é uma matriz de base de polivinil éter hidrofílico com capacidade iônica de 50 a 100 μeq/mL; Nuvia C Prime, que é um meio de troca catiônica hidrofóbico composto por uma matriz polimérica hidrofílica macroporosa altamente reticulada 55 a 75 με/mL; Nuvia S, que tem uma matriz base UNOsphere com grupos iônicos de90a 150 με/mL; Poros HS; que é uma conta polimérica rígida com uma estrutura que consiste em poli[estireno- divinilbenzeno] reticulado; Poros XS; que é uma conta polimética rígida com uma estrutura que consiste em poli[estirenodivinil-benzeno] reticulado; Toyo Pearl Giga Cap CM 650M, que é uma contade base polimérica com capacidade iônica de 0,225 meq/mL; Toyo Pearl Giga Cap S 650M que é uma conta de base polimérica; e Toyo Pearl MX TRP, que é uma conta de base polimérica. É de notar que a cromatografia CEX pode ser usada com resinas MM, aqui descritas.
[00407] A carga de proteína de uma amostra compreendendo uma proteína de interesse é ajustada a uma carga de proteína total para a coluna entre cerca de 5 g/L e cerca de 150 g/L, ou entre cerca de 10 g/L e cerca de 100 g/L, entre cerca de 20 g/L e cerca de 80 g/L, entre cerca de 30 g/L e cerca de 50 g/L, ou entre cerca de 40 g/L e cerca de 50 g/L. Em certas modalidades, a concentração de proteína da mistura de proteína de carga é ajustada para uma concentração de proteína do material a ser carregado na coluna de cerca de 0,5 g/L e cerca de 50 g/L, ou entre cerca de 1 g/L e cerca de 20 g/L.
[00408] Aditivos como polietilenoglicol, detergentes, aminoácidos, açúcares, agentes caotrópicos podem ser adicionados para melhorar o desempenho da separação, de modo a alcançar uma melhor separação, recuperação e/ou qualidade do produto.
[00409] Em certas modalidades, incluindo aquelas relacionadas ao aflibercepte ou anticorpo anti-VEGF ou MiniTrap de VEGF, os métodos da presente invenção podem ser usados para remover seletivamente, reduzir significativamente, ou remover essencialmente todas as oxovariantes em uma amostra onde a proteína de interesse estará essencialmente no fluxo direto de um procedimento CEX, enquanto as oxovariantes serão substancialmente capturadas pelo meio da coluna. Cromatografia de Modo Misto
[00410] A cromatografia de modo misto ("MM") também pode ser usada para preparar as composições da invenção. A cromatografia MM, também aqui referida como "cromatografia multimodal", é uma estratégia cromatográfica que utiliza um suporte compreendendo um ligante que é capaz de fornecer pelo menos duas interações diferentes com um analito ou proteína de interesse de uma amostra. Um desses sítios fornece um tipo atraente de interação carga-carga entre o ligante e a proteína de interesse e o outro sítio fornece interação aceitador- doador de elétrons e/ou interações hidrofóbicas e/ou hidrofílicas. As interações doador-aceitador de elétrons incluem interações como ligação de hidrogênio, π-π, ration-π, transferência de carga, dipolo- dipolo, dipolo induzido, etc.
[00411] A resina de coluna utilizada para uma separação de modo misto pode ser Capto Adhere. Capto Adhere é um forte trocador de ânions com funcionalidade multimodal. Sua matriz base é uma agarose altamente reticulada com um ligante (N-benzil-N-metil etanol amina) que apresenta diferentes funcionalidades de interação, tal como interação iônica, ligação de hidrogênio e interação hidrofóbica. Em certos aspectos, a resina utilizada para uma separação de modo misto é selecionada a partir de PPA-HyperCel e HEA-HyperCel. As matrizes base de PPA-HyperCel e HEA-HyperCel são celulose reticulada de alta porosidade. Seus ligantes são fenilpropilamina e hexilamina, respectivamente. Fenilpropilamina e hexilamina oferecem diferentes opções de seletividade e hidrofobicidade para separações de proteínas. Suportes cromatográficos de modo misto adicionais incluem, mas não estão limitados a Nuvia C Prime, Toyo Pearl MX Trp 650M, e Eshmuno® HCX. Em certos aspectos, a resina de cromatografia de modo misto é composta de ligantes acoplados a um suporte orgânico ou inorgânico, algumas vezes denotado por uma matriz de base, diretamente ou por meio de um espaçador. Suporte pode estar na forma de partículas, tais como partículas essencialmente esféricas, um monólito, filtro, membrana, superfície, capilares e similares. Em certos aspectos, o suporte é preparado a partir de um polímero nativo, tal como material de carboidrato reticulado, tal como agarose, ágar, celulose, dextrano, quitosano, konjac, carragenina, gelano, alginato e similares. Para obter altas capacidades de adsorção, o suporte pode ser poroso, e ligantes são então acoplados às superfícies externas, bem como às superfícies dos poros. Esses suportes de polímero nativo podem ser preparados de acordo com métodos padrão, tais como gelificação em suspensão inversa (S Hjerten: Biochim Biophys Acta 79 (2), 393 a 398 (1964), todo o ensino do qual é incorporado aqui por referência). Alternativamente, o suporte pode ser preparado a partir de um polímero sintético, tal como polímeros sintéticos reticulados, por exemplo, estireno ou derivados de estireno, divinilbenzeno, acrilamidas, ésteres de acrilato, ésteres de metacrilato, ésteres de vinila, vinilamidas e similares. Esses polímeros sintéticos podem ser produzidos de acordo com métodos padrão, veja "Styrene based polymer supports developed by suspension polymerization" (R Arshady: Chimica e L'Industria 70(9), 70 a 75 (1988), todo o ensino do qual é incorporado aqui por referência). Suportes de polímero nativo ou sintético poroso também estão disponíveis a partir de fontes comerciais, tais como GE Healthcare, Uppsala, Sweden.
[00412] A carga de proteína de uma mistura de amostra biológica compreendendo uma proteína de interesse pode ser ajustada a uma carga de proteína total para a coluna entre cerca de 25 g/L e cerca de 750 g/L, ou entre cerca de 75 g/L e cerca de 500 g/L, ou entre cerca de 100 g/L e cerca de 300 g/L. Em certas modalidades exemplares, a concentração de proteína da mistura de proteína de carga é ajustada para uma concentração de proteína do material carregado na coluna de cerca de 1 g/L e cerca de 50 g/L, ou entre cerca de 9g /L e cerca de 25 g/L.
[00413] Aditivos como polietilenoglicol, detergentes, aminoácidos, açúcares, agentes caotrópicos podem ser adicionados para melhorar o desempenho da separação, de modo a alcançar uma melhor separação, recuperação e/ou qualidade do produto.
[00414] Em certas modalidades, incluindo aquelas relacionadas ao aflibercepte e/ou MiniTrap, os métodos da presente invenção podem ser usados para remover seletivamente, reduzir significativamente ou remover essencialmente todos os PTMs, incluindo oxovariantes.
[00415] Os métodos para a produção da composição da invenção também podem ser implementados em um modo de cromatografia contínua. Neste modo, pelo menos duas colunas são utilizadas (referidas como uma "primeira" coluna e uma "segunda" coluna). Em certas modalidades, este modo de cromatografia contínua pode ser realizado de modo que as frações eluídas e/ou frações descartadas compreendendo PTMs, por exemplo, oxovariantes, podem então ser carregadas subsequentemente ou simultaneamente na segunda coluna (com ou sem diluição).
[00416] Em uma modalidade, a escolha de meio para o modo contínuo pode ser uma de muitas resinas cromatográficas com grupos funcionais hidrofóbicos e de troca aniônica pendentes, meio monolítico, meio de membrana adsorvente ou meio de filtração de profundidade. Cromatografia de Interação Hidrofóbica
[00417] As composições da invenção também podem ser preparadas usando Cromatografia de Interação Hidrofóbica (HIC).
[00418] Ao realizar a separação, uma amostra biológica é contatada com um material HIC, por exemplo, usando uma técnica de produção em lote ou usando uma coluna ou cromatografia de membrana. Antes do processamento de HIC, pode ser desejável ajustar a concentração do tampão de sal para atingir a ligação/interação da proteína desejada com a resina ou a membrana.
[00419] Enquanto a cromatografia de troca iônica depende da carga local da proteína de interesse para a separação seletiva, a cromatografia de interação hidrofóbica explora as propriedades hidrofóbicas das proteínas para conseguir a separação seletiva. Grupos hidrofóbicos em ou dentro de uma proteína interagem com grupos hidrofóbicos de resina de cromatografia ou uma membrana. Normalmente, em condições adequadas, quanto mais hidrofóbica é uma proteína (ou porções de uma proteína), mais forte ela irá interagir com a coluna ou a membrana. Assim, sob condições adequadas, o HIC pode ser usado para facilitar a separação de impurezas relacionadas ao processo (por exemplo, HCPs), bem como substâncias relacionadas ao produto (por exemplo, agregados e fragmentos) de uma proteína de interesse em uma amostra.
[00420] Como a cromatografia de troca iônica, uma coluna HIC ou um dispositivo de membrana HIC também pode ser operado em um modo de eluição, um fluxo direto ou um modo híbrido em que o produto exibe ligação ou interação com um material cromatográfico mas pode ser lavado de tal material usando um tampão que é o mesmo ou substancialmente similar ao tampão de carregamento. (Os detalhes desses modos são descritos acima em conexão com o processamento AEX.) Como as interações hidrofóbicas são mais fortes em alta força iônica, esta forma de separação é convenientemente realizada após uma etapa de eluição de sal, tal como aquelas normalmente usadas em conexão com cromatografia de troca iônica. Alternativamente, os sais podem ser adicionados a uma amostra antes de empregar uma etapa de HIC. A adsorção de uma proteína em uma coluna de HIC é favorecida por altas concentrações de sal, mas as concentrações reais podem variar em uma ampla faixa, dependendo da natureza da proteína de interesse, tipo de sal e ligante de HIC particular escolhido. Vários íons podem ser dispostos em uma chamada série solufóbica dependendo se eles promovem interações hidrofóbicas (efeitos de precipitação por saturação) ou perturbam a estrutura da água (efeito caotrópico) e levam ao enfraquecimento da interação hidrofóbica. Os cátions são classificados em termos de aumento do efeito de precipitação por saturação como Ba2+; Ca2+; Mg2+; Li+; Cs+; Na+; K+; Rb+; NH4+, enquanto os ânions podem ser classificados em termos de efeito caotrópico ~mo 3-, mo y-, oi I oo - . oi-. m~-. MO - . oio - . I-, πr'M- crescente como PO43, SO42, CH3CO3 , CI, Br-; NO3 , ClO4 , I, SCN .
[00421] Em geral, sulfatos de Na+, K+ ou NH4+ promovem efetivamente a interação ligante-proteína usando HIC. Os sais podem ser formulados para influenciar a força da interação, conforme dado pela seguinte relação: (NH4)2SO4> Na2SO4> NaCl > NH4C1 > NaBr > NaSCN. Em geral, as concentrações de sal entre cerca de 0,75 M e cerca de 2 M de sulfato de amônio ou entre cerca de 1 M e cerca de 4 M de NaCl são úteis.
[00422] O meio HIC normalmente compreende uma matriz de base (por exemplo, agarose reticulada ou material de copolímero sintético) à qual ligantes hidrofóbicos (por exemplo, grupos alquila ou arila) são acoplados. Um meio HIC adequado compreende uma resina de agarose ou uma membrana funcionalizada com grupos fenila (por exemplo, uma Phenyl Sepharose™ da GE Healthcare ou uma Phenyl Membrane da Sartorius). Muitas resinas HIC estão disponíveis comercialmente. Os exemplos incluem, mas não estão limitados a, Capto Phenyl, Phenyl Sepharose™ 6 Fast Flow com substituição baixa ou alta, Phenyl Sepharose™ High Performance, Octyl Sepharose™ High Performance (GE Healthcare); Fractogel™ EMD Propyl ou Fractogel™ EMD Phenyl (E. Merck, Germany); colunas Macro-Prep™ Methyl ou Macro-Prep™ t- Butyl (Bio-Rad, California); WP HI- Propyl (C3)™ (J. T. Baker, New Jersey); e Toyopearl™ éter, fenila ou butila (TosoHaas, PA); ToyoScreen PPG; ToyoScreen Phenyl; ToyoScreen Butyl; ToyoScreen Hexyl; GE HiScreen e Butyl FF HiScreen Octyl FF.
[00423] A carga de proteína de uma amostra compreendendo uma proteína de interesse é ajustada a uma carga de proteína total para a coluna entre cerca de 50 g/L a cerca de 1000 g/L; cerca de 5 g/L e cerca de 150 g/L, entre cerca de 10 g/L e cerca de 100 g/L, entre cerca de 20 g/L e cerca de 80 g/L, entre cerca de 30 g/L e cerca de 50 g/L, ou entre cerca de 40 g/L e cerca de 50 g/L. Em certas modalidades, a concentração de proteína da mistura de proteína de carga é ajustada para uma concentração de proteína do material a ser carregado na coluna de cerca de 0,5 g/L e cerca de 50 g/L, ou entre cerca de 1g/L e cerca de 20 g/L.
[00424] Como o pH selecionado para qualquer processo de produção particular deve ser compatível com a estabilidade e atividade da proteína, condições particulares de pH podem ser específicas para cada aplicação. No entanto, como em pH 5,0 a 8,5, determinados valores de pH têm muito pouca significância na seletividade e resolução final de uma separação HIC, tais condições podem ser favorecidas. Um aumento no pH enfraquece as interações hidrofóbicas e a retenção de proteínas muda mais drasticamente em valores de pH acima de 8,5 ou abaixo de 5,0. Além disso, mudanças na força iônica, presença de solventes orgânicos, temperatura e pH (principalmente no ponto isoelétrico, pI, quando não há carga superficial líquida) podem impactar na estrutura e solubilidade da proteína e, consequentemente, na interação com outras superfícies hidrofóbicas, tal como aqueles em meio HIC e, portanto, em certas modalidades, a presente invenção incorpora estratégias de produção em que um ou mais dos anteriores são ajustados para atingir a redução desejada em impurezas relacionadas ao processo e/ou substâncias relacionadas ao produto.
[00425] Em certas modalidades, métodos de espectroscopia, tal como UV, NIR, FTIR, Fluorescência, e Raman podem ser usados para monitorar a proteína de interesse e impurezas em um modo on-line, at- line ou in-line, que pode então ser usado para controlar o nível de agregados no material agrupado coletado do efluente adsorvente HIC.Em certas modalidades, métodos de monitoramento on-line, at-line ou in-line podem ser usados na linha de efluente da etapa de cromatografia ou no recipiente de coleta, para permitir a obtenção da qualidade/recuperação de produto desejada. Em certas modalidades, o sinal de UV pode ser usado como substituto para alcançar uma qualidade/recuperação de produto apropriada, em que o sinal de UV pode ser processado de forma adequada, incluindo, mas não se limitando a, técnicas de processamento como integração, diferenciação, média móvel, de modo que a variabilidade normal do processo possa ser abordada e a qualidade do produto alvo possa ser alcançada. Em certas modalidades, tais medições podem ser combinadas com métodos de diluição in-line, de modo que a concentração de íons/condutividade da carga/lavagem possa ser controlada por feedback e, portanto, facilite o controle de qualidade do produto.
Cromatografia de Exclusão de Tamanho
[00426] Cromatografia de exclusão de tamanho ou filtração em gel depende da separação de componentes em função de seu tamanho molecular. A separação depende da quantidade de tempo que as substâncias passam na fase estacionária porosa em comparação ao tempo no fluido. A probabilidade de uma molécula residir em um poro depende do tamanho da molécula e do poro. Além disso, a capacidade de uma substância de permear nos poros é determinada pela mobilidade de difusão das macromoléculas, que é maior para macromoléculas pequenas. Macromoléculas muito grandes podem não penetrar nos poros da fase estacionária; e, para macromoléculas muito pequenas, a probabilidade de penetração é próxima da unidade. Enquanto os componentes de maior tamanho molecular se movem mais rapidamente após a fase estacionária, os componentes de pequeno tamanho molecular têm um caminho de comprimento mais longo através dos poros da fase estacionária e são, portanto, retidos por mais tempo na fase estacionária.
[00427] O material cromatográfico pode compreender um material de exclusão de tamanho, em que o material de exclusão de tamanho é uma resina ou membrana. A matriz usada para exclusão de tamanho é de preferência um meio de gel inerte que pode ser um composto de polissacarídeos reticulados, por exemplo, agarose reticulada e/ou dextrano na forma de contas esféricas. O grau de reticulação determina o tamanho dos poros que estão presentes nas contas de gel inchadas. Moléculas maiores que um certo tamanho não entram nas contas de gel e, portanto, movem-se através do leito cromatográfico o mais rápido. Moléculas menores, tal como detergente, proteína, DNA e similares, que entram nas contas de gel em extensões variadas dependendo de seu tamanho e formato, são retardadas em sua passagem pelo leito. As moléculas são, portanto, geralmente eluídas em ordem decrescente de tamanho molecular.
[00428] As resinas cromatográficas porosas apropriadas para cromatografia de exclusão por tamanho de vírus podem ser feitas de dextrose, agarose, poliacrilamida ou sílica, que têm características físicas diferentes. Combinações de polímero também podem ser usadas. Mais comumente usados são aqueles com o nome comercial, "SEPHADEX", disponível na Amersham Biosciences. Outros suportes de exclusão de tamanho de diferentes materiais de construção também são apropriados, por exemplo, Toyopearl 55F (polimetacrilato, de Tosoh Bioscience, Montgomery Pa.) e Bio-Gel P-30 Fine (BioRad Laboratories, Hercules, CA).
[00429] A carga de proteína de uma amostra compreendendo uma proteína de interesse pode ser ajustada a uma carga de proteína total para a coluna entre cerca de 50 g/L e cerca de 1000 g/L; cerca de 5 g/L e cerca de 150 g/L, entre cerca de 10 g/L e cerca de 100 g/L, entre cerca de 20 g/L e cerca de 80 g/L, entre cerca de 30 g/L e cerca de 50 g/L, ou entre cerca de 40 g/L e cerca de 50 g/L. Em certas modalidades, a concentração de proteína da mistura de proteína de carga é ajustada para uma concentração de proteína do material a ser carregado na coluna de entre cerca de 0,5 g/L e cerca de 50 g/L, ou entre cerca de 1 g/L e cerca de 20 g/L.
Filtração Viral
[00430] Filtração Viral é uma etapa de redução viral dedicada em um processo de produção. Esta etapa geralmente é realizada após o polimento cromatográfico. A redução viral pode ser alcançada por meio do uso de filtros adequados, incluindo, mas não se limitando a, Planova 20N™, 50 N ou BioEx da Asahi Kasei Pharma, filtros Viresolve™ da EMD Millipore, ViroSart CPV da Sartorius, ou filtro Ultipor DV20 ou DV50™ da Pall Corporation. Será evidente para alguém versado na técnica selecionar um filtro adequado para obter o desempenho de filtração desejado.
I. Ultrafiltração/Diafiltração
[00431] Certas modalidades da presente invenção empregam ultrafiltração e diafiltração para concentrar e formular uma proteína de interesse. A ultrafiltração é descrita em detalhes em: Microfiltration e Ultrafiltration: Principles e Applications, L. Zeman e A. Zydney (Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1996); e em: Ultrafiltration Handbook, Munir Cheryan (Technomic Publishing, 1986; ISBN N°. 87762- 456-9); todos os ensinamentos dos quais são incorporados neste documento por referência. Um processo de filtração é Filtração de Fluxo T angencial, conforme descrito no catálogo Millipore intitulado "Pharmaceutical Process Filtration Catalogue" pp. 177 a 202 (Bedford, Mass., 1995/96), todo o ensino do qual é incorporado aqui por referência. Ultrafiltração é geralmente considerada como filtração usando filtros com um tamanho de poro menor que 0,1 μm. Ao empregar filtros com um tamanho de poro tão pequeno, o volume da amostra pode ser reduzido através da permeação do tampão de amostra através dos poros da membrana do filtro, enquanto as proteínas são retidas acima da superfície da membrana.
[00432] Alguém versado na técnica pode selecionar um dispositivo de filtro de membrana apropriado para a operação UF/DF. Os exemplos de cassetes de membrana adequados para a presente invenção incluem, mas não se limitam a Cassetes Pellicon 2 ou Pellicon 3 com membranas de 10 kD, 30 kD ou 50 kD da EMD Millipore, cassetes de membrana Kvick 10 kD, 30 kD ou 50 kD da GE Healthcare, e Centramate ou Centrasette 10 kD, 30 kD ou 50 kD cassetes da Pall Corporation.
J. Estratégias de Produção Exemplares
[00433] A recuperação primária pode prosseguir utilizando sequencialmente redução de pH, centrifugação e filtração para remover células e detritos celulares (incluindo HCPs) de uma colheita de biorreator de produção. A presente invenção é direcionada a submeter uma amostra biológica compreendendo uma proteína de interesse da recuperação primária a uma ou mais etapas de produção, incluindo (em nenhuma ordem particular) AEX, CEX, SEC, HIC e/ou MM. Certos aspectos da presente invenção incluem outras etapas de processamento. Exemplos de procedimentos de processamento adicionais incluem precipitação com etanol, focagem isoelétrica, HPLC de fase reversa, cromatografia em sílica, cromatografia em heparina Sepharose™, posteriormente cromatografia de troca aniônica e/ou posterior cromatografia de troca catiônica, cromatofocagem, SDS- PAGE, precipitação de sulfato de amônio, cromatografia em hidroxiapatita, eletroforese em gel, diálise, e cromatografia de afinidade (por exemplo, usando Proteína A ou G, um anticorpo, um substrato específico, ligante ou antígeno como o reagente de captura). Em certos aspectos, a temperatura da coluna (bem como outros parâmetros) pode ser variada de forma independente para melhorar a eficiência de separação e/ou rendimento de qualquer etapa de produção particular.
[00434] Em certas modalidades, as frações de fluxo direto e de lavagem não ligadas podem ser ainda mais fracionadas e uma combinação de frações fornecendo uma pureza de produto alvo pode ser agrupada.
[00435] As etapas de carregamento e lavagem da coluna podem ser controladas por medição in-line, at-line ou off-line dos níveis de impurezas/substâncias relacionadas ao produto, tanto no efluente da coluna, quanto no pool coletado ou em ambos, de modo a atingir um determinado alvo de qualidade e/ou rendimento do produto. Em certas modalidades, a concentração de carga pode ser controlada dinamicamente por diluições in-line ou em lote ou contínuas com tampões ou outras soluções para conseguir o particionamento necessário para melhorar a eficiência de separação e/ou rendimento.
[00436] Exemplos de tais procedimentos de produção são descritos em FIGURAS 5-8.
[00437] FIGURA 5 representa uma modalidade exemplar usada para a produção de aflibercepte. Referindo-se a FIGURA 5, o método compreende: (a) expressar aflibercepte em uma célula hospedeira cultivada em um MQD; (b) captura de aflibercepte usando um primeiro suporte de cromatografia, que pode incluir resina de captura de afinidade; e (c) contatar pelo menos uma porção de aflibercepte com um segundo suporte de cromatografia, que pode incluir cromatografia de troca aniônica. A etapa (c) pode compreender ainda a lavagem de uma coluna AEX e coleta de fluxo através da(s) fração(ões) de uma amostra compreendendo aflibercepte. Opcionalmente, a etapa (c) pode compreender a remoção do segundo suporte cromatográfico e a coleta das frações descartadas. As etapas podem ser realizadas pela metodologia de rotina em conjunto com a metodologia mencionada supra. Deve ser entendido que alguém versado na técnica pode optar por empregar CEX em vez de ou em adição a AEX. Em nenhuma ordem particular, etapas cromatográficas adicionais também podem ser utilizadas, incluindo, mas não se limitando a, HIC e SEC.
[00438] Além da modalidade exemplar na FIGURA 5, outras modalidades exemplares adicionais podem incluir (d) contatar pelo menos uma porção do referido aflibercepte da etapa (c) com um terceiro suporte de cromatografia. Em um aspecto, o protocolo pode incluir (e) contatar pelo menos uma porção aflibercepte da etapa (d) com um quarto suporte de cromatografia. Em um aspecto desta modalidade, o protocolo pode opcionalmente compreender submeter a amostra compreendendo aflibercepte da etapa (c) a um pH inferior a 5,5. Em um aspecto, o presente método compreende uma etapa de clarificação antes de uma etapa (a).
[00439] A FIGURA 6 representa uma modalidade exemplar usada para a produção de MiniTrap de VEGF. Este método compreende: (a) expressar aflibercepte em uma célula hospedeira cultivada em um MQD; (b) captura de aflibercepte usando um primeiro suporte de cromatografia que pode incluir resina de cromatografia de afinidade; (c) clivar o aflibercepte removendo assim o domínio Fc e formando uma amostra compreendendo MiniTrap de VEGF; (d) contatar a amostra da etapa (c) com um segundo suporte cromatográfico que pode ser cromatografia de afinidade e (e) contatar o fluxo da etapa (d) para um terceiro suporte de cromatografia que pode incluir uma cromatografia de troca aniônica. A etapa (d) compreende a coleta de fração(ões) de fluxo direto onde, devido à ausência de um domínio Fc, a MiniTrap deve residir enquanto o aflibercepte ou qualquer outra proteína com um domínio Fc deve essencialmente interagir com a coluna de afinidade da etapa (d). Opcionalmente, a etapa (d) pode compreender a remoção do terceiro suporte cromatográfico e a coleta das frações descartadas. As etapas podem ser realizadas por metodologia de rotina em conjunto com a metodologia descrita acima. Em nenhuma ordem particular, etapas cromatográficas adicionais podem ser utilizadas incluindo, mas não limitadas a HIC e SEC.
[00440] A FIGURA 7 representa uma modalidade exemplar para a produção de aflibercepte. Este método compreende: (a) expressar aflibercepte em uma célula hospedeira cultivada em um MQD; (b) capturar aflibercepte usando um primeiro suporte de cromatografia, que pode incluir cromatografia de troca catiônica; e (c) contatar um fluxo direto da etapa (b) para um segundo suporte de cromatografia que pode incluir uma cromatografia de troca aniônica. Opcionalmente, a etapa (c) pode compreender a remoção do segundo suporte cromatográfico e a coleta das frações descartadas. As etapas podem ser realizadas por metodologia de rotina em conjunto com os protocolos mencionados acima. Em nenhuma ordem particular, outros procedimentos cromatográficos podem ser empregados incluindo, mas não se limitando a, HIC e SEC.
[00441] A FIGURA 8 representa uma modalidade exemplar para a produção de MiniTrap de VEGF. Este método compreende: (a) expressar aflibercepte em uma célula hospedeira cultivada em um MQD; (b) captura de aflibercepte usando um primeiro suporte de cromatografia que pode incluir uma cromatografia de troca iônica; (c) submeter uma fração de fluxo direto de (b) compreendendo aflibercepte a cromatografia de afinidade; eluição, em que a eluição compreende aflibercepte; (d) submeter o aflibercepte de (c) a uma atividade de clivagem, em que o domínio Fc é clivado, formando assim MiniTrap de VEGF. Em um aspecto, a troca iônica da etapa (b) compreende AEX. Alternativamente, a etapa (b) pode compreender CEX. Em nenhuma ordem particular, etapas cromatográficas adicionais podem ser incluídas, tais como etapas adicionais de cromatografia de troca iônica após a etapa (d), a adição de HIC e/ou SEC.
VII. Formulações Farmacêuticas que Compreendem as Composições
[00442] A invenção também descreve formulações compreendendo composições anti-VEGF (conforme descrito acima). As formulações adequadas para proteínas anti-VEGF incluem, mas não estão limitadas a formulações descritas em Patente Norte Americana N°. 7.608.261, Patente Norte Americana N°. 7.807.164, Patente Norte Americana N°. 8.092.803, Patente Norte Americana N°. 8.481.046, Patente Norte Americana N°. 8.802.107, Patente Norte Americana N°. 9.340.594, Patente Norte Americana N°. 9.914.763, Patente Norte Americana N°. 9.580.489, Patente Norte Americana N°. 10.400.025, Patente Norte Americana N°. 8.110.546, Patente Norte Americana N°. 8.404.638, Patente Norte Americana N°. 8.710.004, Patente Norte Americana N°. 8.921.316, Patente Norte Americana N°. 9.416.167, Patente Norte Americana N°. 9.511.140, Patente Norte Americana N°. 9.636.400, e Patente Norte Americana N°. 10.406.226, que são todos incorporados neste documento por referência em sua totalidade.
[00443] As tecnologias de processo a montante (descritas na Seção IV, supra,) e tecnologias de processo a jusante (descritas na Seção V, supra) podem ser usadas sozinhas ou em combinação umas com as outras para efetuar a produção da formulação.
[00444] A presente invenção descreve formulações compreendendo composições anti-VEGF em associação com um ou mais ingredientes/excipientes, bem como métodos de uso dos mesmos e métodos de preparação de tais composições. Em uma modalidade da invenção, uma formulação farmacêutica da presente invenção tem um pH de aproximadamente 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1 ou 6,2.
[00445] Para preparar formulações farmacêuticas para composições anti-VEGF, uma composição anti-VEGF é misturada com um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Veja, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences e U.S. Pharmacopeia: National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1984); Hardman, et al. (2001) Goodman e Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, N.Y.; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, e Wilkins, New York, N.Y.; Avis, et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, N.Y.; Weiner e Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y.; todos os ensinamentos dos quais são incorporados neste documento por referência. Em uma modalidade da invenção, a formulação farmacêutica é estéril.
[00446] As formulações farmacêuticas da presente invenção incluem uma composição anti-VEGF e um carreador farmaceuticamente aceitável incluindo, por exemplo, água, agentes tamponantes, conservantes e/ou detergentes.
[00447] A presente invenção fornece uma formulação farmacêutica compreendendo qualquer uma das composições anti-VEGF aqui estabelecidas e um carreador farmaceuticamente aceitável, por exemplo, em que a concentração do polipeptídeo é de cerca de 40 mg/mL, cerca de 60 mg/mL, cerca de 80 mg/mL, cerca de 90 mg/mL, cerca de 100 mg/mL, cerca de 110 mg/mL, cerca de 120 mg/mL, cerca de 130 mg/mL, cerca de 140 mg/mL, cerca de 150 mg/mL, cerca de 200 mg/mL ou cerca de 250 mg/mL.
[00448] O escopo da presente invenção inclui composições dessecadas, por exemplo, secas por congelamento, compreendendo uma proteína anti-VEGF e um carreador farmaceuticamente aceitável substancialmente (cerca de 85% a cerca de 99% ou mais) sem água.
[00449] Em uma modalidade, um outro agente terapêutico que é administrado a um indivíduo em associação com uma composição anti- VEGF descrita neste documento é administrada ao indivíduo de acordo com o Physicians' Desk Reference 2003 (Thomson Healthcare; 57a edição (1 de novembro de 2002), cujo ensino é aqui incorporado por referência).
[00450] A presente invenção fornece um recipiente (por exemplo, um frasco de plástico ou vidro com uma tampa ou uma coluna de cromatografia, agulha de orifício oco ou um cilindro de seringa) compreendendo qualquer uma das composições anti-VEGF ou uma formulação farmacêutica compreendendo um carreador farmaceuticamente aceitável descrito aqui. A presente invenção também fornece um dispositivo de injeção que compreende a composição ou formulação anti-VEGF aqui apresentada, por exemplo, uma seringa, uma seringa pré-cheia ou um autoinjetor. Em um aspecto, o vaso é tingido (por exemplo, marrom) para bloquear a luz, natural ou de outra forma.
[00451] A presente invenção inclui combinações incluindo composições anti-VEGF em associação com um ou mais outros agentes terapêuticos. A composição anti-VEGF e o agente terapêutico adicional podem estar em uma única composição ou em composições separadas. Por exemplo, o agente terapêutico é um inibidor de Ang-2 (por exemplo, nesvacumabe), um ativador do receptor Tie-2, um anticorpo anti-PDGF ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, um receptor anti-PDGF ou anticorpo beta do receptor PDGF ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo e/ou um antagonista VEGF adicional, tal como aflibercepte, conbercepte, bevacizumabe, ranibizumabe, um aptâmero anti-VEGF, tal como pegaptanibe (por exemplo, pegaptanibe de sódio), um anticorpo anti-VEGF de cadeia única (por exemplo, VL-VH), tal como brolucizumabe, um anti-VEGF DARPin, tal como o Abicipar Pegol DARPin, um anticorpo biespecífico anti-VEGF, por exemplo, que também se liga a ANG2, tal como RG7716, ou uma forma solúvel de receptor-3 do fator de crescimento endotelial vascular humano (VEGFR- 3) compreendendo os domínios extracelulares 1-3, expressos como uma proteína de fusão Fc.
VIII. Métodos de Tratamento
[00452] A presente invenção fornece métodos para tratar ou prevenir um câncer (por exemplo, cujo crescimento e/ou metástase é mediado, pelo menos em parte, por VEGF, por exemplo, Angiogênese mediada por VEGF) ou um distúrbio ocular angiogênico, em um indivíduo, compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de composições conforme descrito neste documento (Seção III supra).
[00453] As tecnologias de processo a montante (Seção IV supra), as tecnologias de processo a jusante (Seções V e VI supra) podem ser usadas sozinhas ou em combinação umas com as outras para produzir as composições conforme descrito na Seção III e/ou as formulações conforme descrito na Seção VII, que podem ser usadas para tratar ou prevenir uma variedade de distúrbios, incluindo doenças oftalmológicas e oncológicas.
[00454] A presente invenção também fornece um método para administrar as composições aqui estabelecidas (Seção III e Seção VII) a um indivíduo (por exemplo, um humano) compreendendo a introdução das composições com cerca de 0,5 mg, 2 mg, 4 mg, 6 mg, 8 mg, 10 mg, 12 mg, 14 mg, 16 mg, 18 mg ou 20 mg da proteína de interesse (por exemplo, aflibercepte ou MiniTrap) em não mais do que cerca de 100 μL, por exemplo, cerca de 50μL, cerca de 70 μL ou cerca de 100 μL, e opcionalmente um outro agente terapêutico, no corpo do indivíduo por, por exemplo, injeção intraocular, tal como por injeção intravítrea.
[00455] A presente invenção fornece um método para o tratamento de câncer cujo crescimento e/ou metástase é mediado, pelo menos em parte, por VEGF, por exemplo, angiogênese mediada por VEGF ou um distúrbio ocular angiogênico em um indivíduo em necessidade, o método compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz das composições aqui estabelecidas (Seção III e Seção VII acima), por exemplo, 2 mg, 4 mg, 6 mg, 8 mg ou 10 mg da proteína de interesse, em não mais do que cerca de 100 μl, e opcionalmente um outro agente terapêutico, para um indivíduo. Em uma modalidade da invenção, a administração é feita por injeção intravítrea. Exemplos não limitativos de distúrbios oculares angiogênicos que são tratáveis ou evitáveis usando os métodos aqui descritos incluem: • degeneração macular relacionada à idade (por exemplo, úmida ou seca), • edema macular, • edema macular após oclusão da veia da retina, • oclusão da veia da retina (RVO), • oclusão da veia central da retina (CRVO), • oclusão da veia da retina do ramo (BRVO), • edema macular diabético (DME), • neovascularização coroidal (CNV), • neovascularização da íris, • glaucoma neovascular, • fibrose pós-cirúrgica no glaucoma, • vitreorretinopatia proliferativa (PVR), • neovascularização do disco ótico, • neovascularização da córnea, • neovascularização retiniana, • neovascularização vítrea, • pannus, • pterígio, • retinopatia vascular, • retinopatia diabética em um indivíduo com edema macular diabético; e • retinopatias diabéticas (por exemplo, retinopatia diabética não proliferativa (por exemplo, caracterizada por um nível de Escala de Gravidade de Retinopatia Diabética (DRSS) de cerca de 47 ou 53) ou retinopatia diabética proliferativa; por exemplo, em um indivíduo que não sofre de DME).
[00456] O modo de administração de tais composições ou formulações (Seção III e Seção VII) pode variar e pode ser determinado por um profissional habilitado. As vias de administração incluem parenteral, não parenteral, oral, retal, transmucosa, intestinal, parenteral; intramuscular, subcutâneo, intradérmica, intramedular, intratecal, intraventricular direta, intravenosa, intraperitoneal, intranasal, intraocular, inalação, insuflação, tópica, cutânea, intraocular, intravítrea, transdérmica ou intra-arterial.
[00457] Em uma modalidade da invenção, a injeção intravítrea de uma formulação farmacêutica da presente invenção (que inclui uma composição ou formulações da presente invenção) inclui a etapa de perfurar o olho com uma seringa e agulha (por exemplo, agulha de injeção calibre 30) compreendendo a formulação e injetando a formulação (por exemplo, menor que ou igual a cerca de 100 microlitros; cerca de 40, 50, 55, 56, 57, 57,1, 58, 60 ou 70 microlitros) no vítreo do olho com um volume suficiente para entregar uma quantidade terapeuticamente eficaz, conforme estabelecido neste documento, por exemplo, de cerca de 2, 4, 6, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 10 ou 20 mg da proteína de interesse. Opcionalmente, o método inclui as etapas de administração de um anestésico local (por exemplo, proparacaína, lidocaína ou tetracaína), um antibiótico (por exemplo, uma fluoroquinolona), anti-séptico (por exemplo, iodopovidona) e/ou um agente dilatador da pupila para o olho sendo injetado. Em um aspecto, um campo estéril ao redor do olho a ser injetado é estabelecido antes da injeção. Após a injeção intravítrea, o indivíduo é monitorado quanto a elevações na pressão intraocular, inflamação e/ou pressão arterial.
[00458] Uma quantidade eficaz ou terapeuticamente eficaz de proteína de interesse para um distúrbio ocular angiogênico refere-se à quantidade da proteína de interesse suficiente para causar a regressão, estabilização ou eliminação do câncer ou distúrbio ocular angiogênico, por exemplo, por regressão, estabilização ou eliminação de um ou mais sintomas ou indícios de câncer ou distúrbio ocular angiogênico em qualquer grau clinicamente mensurável, por exemplo, no que diz respeito a um distúrbio ocular angiogênico, causando uma redução na ou manutenção da classificação de gravidade da retinopatia diabética (DRSS), por melhorar ou manter a visão (por exemplo, na melhor acuidade visual corrigida, medida por um aumento nas letras ETDRS), aumentar ou manter o campo visual e/ou reduzir ou manter a espessura da retina central e, em relação ao câncer, parar ou reverter o crescimento, sobrevivência e/ou metástases de células cancerosas no indivíduo.
[00459] Em uma modalidade da invenção, uma quantidade eficaz ou terapeuticamente eficaz de uma proteína de interesse, tal como aflibercepte para o tratamento ou prevenção de um distúrbio ocular angiogênico é de cerca de 0,5 mg, 2 mg, 3 mg, 4 mg, 5 mg, 6 mg, 7 mg, 7,25 mg, 7,7 mg, 7,9 mg, 8,0 mg, 8,1 mg, 8,2 mg, 8,3 mg, 8,4 mg, 8,5 mg, 8,6 mg , 8,7 mg, 8,8 mg, 8,9 mg, 9 mg, 10 mg, 11 mg, 12 mg, 13 mg, 14 mg, 15 mg, 16 mg, 17 mg, 18 mg, 19 mg ou 20 mg, por exemplo, em não mais do que cerca de 100 μL. A quantidade pode variar dependendo da idade e do tamanho de um indivíduo a ser administrado, doença alvo, condições, via de administração e similares. Em certas modalidades exemplares, a dose inicial pode ser seguida pela administração de uma segunda ou uma pluralidade de doses subsequentes da proteína de interesse em uma quantidade que pode ser aproximadamente a mesma ou menor ou mais do que a dose inicial, em que as doses subsequentes são separadas por pelo menos 1 dia a 3 dias; pelo menos uma semana, pelo menos duas semanas; pelo menos 3 semanas; pelo menos 4 semanas; pelo menos 5 semanas; pelo menos 6 semanas; pelo menos 7 semanas; pelo menos 8 semanas; pelo menos 9 semanas; pelo menos 10 semanas; pelo menos 12 semanas; ou pelo menos 14 semanas.
[00460] Deve-se observar que os valores da dosagem podem variar com o tipo e gravidade da condição a ser aliviada. Deve ser ainda compreendido que para qualquer indivíduo em particular, os regimes de dosagem específicos devem ser ajustados ao longo do tempo de acordo com a necessidade individual e o julgamento profissional da pessoa que administra ou supervisiona a administração das composições, e que as faixas de dosagem aqui estabelecidas são exemplares apenas e não se destinam a limitar o escopo ou prática da composição reivindicada.
IX. Método de Ensaio de Variantes de Proteína
[00461] Os níveis de variantes de proteína em uma amostra cromatográfica produzida usando as técnicas aqui descritas podem ser analisados conforme descrito nos Exemplos abaixo. Em certas modalidades, um método cIEF é utilizado usando um analisador iCE3 (ProteinSimple) com um cartucho capilar revestido de fluorocarbono (100 μπi x 5 cm). A solução anfólita consiste em uma mistura de 0,35% de metilcelulose (MC), 4% de anfólitos carreadores Pharmalyte 3-10, 4% de anfólitos carreadores Pharmalyte 5-8, 10 mM de L-Arginina HCl, 24% de formamida, e marcadores pl 5,12 e 9,77 em água purificada. O anólito foi ácido fosfórico a 80 mM, e o católito foi hidróxido de sódio a 100 mM, ambos em metilcelulose a 0,10%. As amostras foram diluídas em água purificada a 10 mg/mL. As amostras foram misturadas com a solução anfólita e então focadas pela introdução de um potencial de 1500 V por um minuto, seguido de um potencial de 3000 V por 7 minutos. Uma imagem das variantes focadas foi obtida passando luz ultravioleta de 280 nm através do capilar e para a lente de uma câmera digital de dispositivo de carga acoplada. Esta imagem foi então analisada para determinar a distribuição das várias variantes de carga. Pessoas versadas na técnica podem variar os parâmetros precisos enquanto ainda alcançam o resultado desejado.
[00462] Várias publicações, incluindo patentes, pedidos de patentes, pedidos de patentes publicados, números de acesso, artigos técnicos e artigos acadêmicos são citados ao longo do relatório descritivo. Cada uma dessas referências citadas é incorporada por referência, em sua totalidade.
[00463] A presente invenção será mais completamente entendida por referência aos seguintes Exemplos. Eles não devem, no entanto, ser interpretados como limitando o escopo da invenção.
EXEMPLOS
[00464] As MiniTraps (MT) 1 a 6 discutidas nos Exemplos são as seguintes:
[00465] MT1: MiniTrap de VEGF obtida por clivagem de aflibercepte produzido usando MQD1.
[00466] MT2: MiniTrap de VEGF obtida por clivagem de aflibercepte produzido usando MQD2.
[00467] MT3: MiniTrap de VEGF obtida por clivagem de aflibercepte produzido usando MQD3.
[00468] MT4: MiniTrap de VEGF obtida por clivagem de aflibercepte produzido usando hidrolisado de soja. MT5: MiniTrap de VEGF recombinante (dímero).
[00469] MT6: MiniTrap de VEGF recombinante (scFv).
[00470] A caracterização de MT1, MT5 e MT6 são descritas abaixo no Exemplo 8.
Avaliação da Cor das Amostras
[00471] O método de ensaio espectrofotométrico para medir o valor de b* (CIELAB) foi considerado adequado para realizar a avaliação da cor.
[00472] A absorbância de uma amostra de proteína de 1 mL foi quantificada sobre o espectro de luz visível (380 a 780 nm) e a curva de absorbância foi transformada no espaço de cores CIELAB usando um conjunto de operações de matriz. O instrumento pode processar aproximadamente 6 amostras por hora. O formato de alto rendimento do ensaio usou um leitor de placas CLARIOstar (BMG Labtech). Até 96 amostras podem ser analisadas usando uma placa de 96 orifícios que requerem 0,3 mL de amostra.
[00473] Para converter os padrões BY em valores b*, os padrões de referência BY (BY1 a BY7) foram quantificados usando o formato de ensaio de alto rendimento.
[00474] As soluções foram preparadas de acordo com os padrões BY descritos acima. O valor de b* para cada um dos padrões é mostrado em FIGURA 9. Este método forneceu um ensaio mais rápido com um menor requisito de amostra e tempos de execução mais curtos, conforme mostrado na Tabela 3 abaixo. Para todas as amostras avaliadas usando este método, a concentração de proteína das amostras de teste foi padronizada para 5 g/L ou 10 g/L.Tabela 3.
Exemplo 1:Produção de uma proteína usando um meio quimicamente definido 1.1 Fonte e colheita da célula
[00475] Uma linhagem celular produtora de aflibercepte foi utilizada no presente estudo. Linhagens celulares produtoras de aflibercepte foram cultivadas e colhidas usando meio quimicamente definido (MQD).
1.2 Clivagem Proteolítica de Aflibercepte
[00476] Uma coluna com uma enzima IdeS imobilizada (FabRICATOR® obtida da Genovis (Cambridge, MA)) foi usada para gerar MT1. Aflibercepte obtido a partir de uma colheita de cultura de células (20 mg em 1,0 mL de tampão de clivagem) foi adicionado à coluna e incubado por 30 min a 18°C. Após 30 min, a coluna foi lavada com o tampão de clivagem (1,0 mL). A mistura de digestão e as soluções de lavagem foram combinadas. A mistura foi carregada em e eluída de uma coluna analítica de afinidade de Proteína A (Applied Biosystems™, POROS™ 20μM Protein A Cartridge 2,1 x 30 mm, 0,1 mL (Cat# 2-1001-00)). O processamento foi realizado de acordo com o protocolo Applied Biosystems™ para POROS ™ 20 μM Protein A Cartridge 2.1x30mm, 0,1mL (Cat # 2-1001-00). A altura da coluna foi de 20 ± 1,0 cm, o tempo de residência foi de 15 minutos e o equilíbrio/lavagem foi realizado usando Tris a 40 mM, acetato a 54 mM pH 7,0 ± 0,1.
Exemplo 2. Cromatografia de Troca Aniônica (AEX) para Minimização de Cores (A) AEX foi utilizado para reduzir a formação de cor
[00477] A cromatografia AEX foi realizada para remover a coloração obtida durante a produção de aflibercepte expresso usando MQD1.
2.1 Projeto
[00478] Cinco separações de AEX foram realizadas para este estudo, conforme detalhado na Tabela 2-1 com o protocolo de AEX conforme descrito na Tabela 2-2. Uma coluna Q Sepharose Fast Flow de 15,7 mL (19,5 cm de altura do leito, 1,0 cm I.D.) e uma coluna POROS 50 HQ de 14,1 mL (18,0 cm de altura do leito, 1,0 cm I.D.) foram integrados em um controlador de cromatografia líquida de bancada AKTA Avant.
[00479] O pH da carga de AEX foi ajustado para atingir ± 0,05unidades de pH usando Tris base a 2M ou ácido acético a 2M. A condutividade da carga de AEX foi ajustada para a meta de ± 0,1 mS/cm usando cloreto de sódio a 5 M ou água deionizada. Todas as amostras de pool foram analisadas para alto peso molecular (HMW), cor e rendimento.Tabela 2-1. Sumário do Projeto de Estudo para Redução de Cor de AEXTabela 2-2. Protocolo AEX para redução de cor
2.2 Resultados
[00480] Utilizando Separação AEXs para produção exibiu uma redução significativa na cor. (Tabela 2-3). Por exemplo, como visto na Tabela 2-3, a cor observada no fluxo direto (FT) e lavagem na Separação AEX 1 (pH 8,30 a 8,50, 1,90 a 2,10 mS/cm) teve um valor de b* de 1,05, em comparação com a cor da Carga para AEX ("Carga de AEX ") com um valor de b* de 3,06. O aumento no valor de b* reflete a intensidade da coloração amarelo-marrom de uma amostra.
[00481] Cinco separações AEXs foram realizadas para avaliar o impacto da resina (Q Sepharose FF ou POROS 50 HQ) e ponto de definição de pH e condutividade (pH 8,40 e 2,00 mS/cm, pH 8,00 e 2,50 mS/cm, ou pH 7,80 e 4,00 mS/cm) na redução de cor. Para POROS 50 HQ, os rendimentos (64,4, 81,9, e 91,4%) e os níveis de HMW do pool (1,02, 1,29, e 1,83%) aumentaram conforme o ponto de definição foi alterado para um pH inferior e maior condutividade. A cor (valores de b*) também aumentou (1,05, 1,33, e 1,55) conforme o ponto de definição foi alterado para um pH mais baixo e maior condutividade. Os níveis de pH mais elevados e as condutividades mais baixas proporcionaram a maior redução na cor em relação à separação de AEX para POROS 50 HQ.
[00482] Para Q Sepharose Fast Flow, os rendimentos (49,5 e 77,7%) e os níveis de HMW de pool (0,59 e 1,25%) também aumentaram conforme o ponto de definição foi alterado para um pH inferior e condutividade superior. A cor (valores de b*) também aumentou (0,96 e 1,35) conforme o ponto de ajuste foi alterado para um pH mais baixo e maior condutividade.
[00483] O uso de AEX reduz a coloração amarelo-marrom - ver Tabela 2-3. Além disso, foi determinado que Q Sepharose Fast Flow reduziu a cor mais do que POROS 50 HQ para os dois pontos de fixação avaliados em ambas as resinas. A pH 8,00 e 2,50 mS/cm de ponto de definição, o pool POROS 50 HQ teve um valor de b* de 1,33, enquanto o pool Q Sepharose Fast Flow teve um valor de b* de 0,96. Da mesma forma, em pH 7,80 e 4,00 mS/cm de ponto de ajuste, o pool POROS 50 HQ teve um valor de b* de 1,55, enquanto o pool Q Sepharose Fast Flow teve um valor de b* de 1,35 (Tabela 2-3).Tabela 2-3. Sumário de Resultados Experimentais do Estudo de Redução de Cor de AEXAEX, Cromatografia de Troca Aniônica; HMW, espécies de alto peso molecular; N/A, não aplicável As frações foram ajustadas a uma concentração de proteína de 10 g/L para medições de cor.
2.3 Conclusão
[00484] O uso de AEX foi encontrado para reduzir a coloração amarelo-marrom, ver Tabela 2-3. Referindo-se à Tabela 2-3, a Carga de AEX tem um valor de b* de 3,06, mas quando submetido à cromatografia AEX (Separação AEX 1-5), o valor de b* diminui indicando uma diminuição na coloração amarelo-marrom. Novamente, conforme o valor de b* diminui, a coloração também diminui; conforme o valor de b* aumenta, ele é reflexo do aumento de cor amarelo-marrom em uma determinada amostra.
[00485] A redução da cor foi avaliada utilizando-se duas resinas AEX (Fluxo rápido de Sefarose Q e POROS 50 HQ) e três pontos de ajuste (pH 8,40 e 2,00 mS/cm, pH 8,00 e 2,50 mS/cm, e pH 7,80 e 4,00 mS/cm). Para ambas as resinas, a redução da cor foi maior para o pH maior e pontos de ajuste de menor condutividade. Além disso, o fluxo rápido de Sefarose Q forneceu mais redução de cor do que POROS 50 HQ nos dois pontos de ajuste avaliados em ambas as resinas (pH 8,00 e 2,50 mS/cm e pH 7,80 e 4,00 mS/cm). Entretanto, todos os cinco métodos de separação de AEX induziram a uma significante redução de cor quando comparado com a solução de carga para AEX ("Carga de AEX"), demonstrando a importância da produção de AEX no processo de produção de aflibercepte expresso utilizando-se um MQD. O valor inicial de b*da Carga de AEX (em uma concentração de 10 g/L) pode variar de cerca de 0,5 a cerca de 30, mais particularmente de cerca de 1,0 a cerca de 25,0, e ainda mais particularmente de cerca de 2,0 a cerca de 20,0. Após o uso de AEX, o valor de b* para o fluxo direto (em uma concentração de 10 g/L) pode variar de 0,5 a cerca de 10,0, mais particularmente de cerca de 0,5 a cerca de 7,0, e ainda mais particularmente de cerca de 0,5 a cerca de 5,0.
2.4 Mapeamento de Peptídeo
[00486] Preparação de Amostra. O mapeamento trípitico das amostras aflibercepte alquiladas e reduzidas obtidas da Carga de AEX e o fluxo direto do experimento acima (Tabelas 2-3) foram realizados para identificar e quantificar a modificação pós-translacional (PTM). Uma alíquota de cada amostra (Carga e fluxo direto) foi desnaturada utilizando-se 8,0 M de Ureia, 0,1 M de Tris-HCl, pH 7,5, reduzida com DTT e, em seguida, alquilada com iodoacetamida. A amostra desnaturada, reduzida e alquilada foi primeiro digerida com Lys-C recombinante (rLys-C) em uma enzima para relação de substrato de 1:100 (peso/peso) a 37°C durante 30 minutos, diluída com 0,1 M de Tris- HCl, pH 7,5 tal que uma concentração de ureia final foi de 1,8 M, subsequentemente digerida com tripsina em uma enzima para relação de substância de 1:20 (peso/peso) a 37°C durante horas e em seguida desglicosilada com PNGase F em uma relação de enzima substrato de 1:5 (peso/peso) 37°C durante uma hora. A digestão foi interrompida levando-se o pH abaixo de 2,0 utilizando-se ácido fórmico (FA).
[00487] Análise de LC-MS. Uma alíquota de 20 μg de peptídeos rLys-C/trípticos resultantes de cada amostra foi separada e analisada por cromatografia líquida de ultra performance de fase reversa (UPLC) utilizando-se coluna Waters ACQUITY UPLC CSH C18 (130 Â, 1,7 μm, 2,1x150 mm) seguido por detecção PDA on - line (em comprimentos de ondas de 280 nm, 320 nm e 350 nm) e análise de espectrometria de massa. A Fase Móvel A foi 0,1% de FA em água, e a Fase Móvel B foi 0,1% de FA em acetonitrila. Após a injeção de amostra, um gradiente foi iniciado com 5 minutos de manutenção a 0,1% de B seguido por um aumento linear a 35% de B durante 75 minutos para ótima separação de peptídeo. Os experimentos MS e MS/MS foram conduzidos utilizando-se um espectrômetro de massa Thermo Scientific Q Exactive Hybrid Quadrupole-Orbitrap com dissociação colisional de alta energia (HCD) utilizado para fragmentação de peptídeo para os experimentos MS/MS. As designações de identidade de peptídeo foram baseadas na massa precisa experimentalmente determinada de um peptídeo fornecido no espectro MS total bem como os íons de fragmento b e y no correspondente espectro HCD MS/MS. Os cromatogramas de íon extraídos dos peptídeos da Carga e fluxo direto foram gerados (ver FIGURA 10). Como visto no cromatograma de íon extraído na FIGURA 10, os fragmentos de peptídeo identificados em "Carga AEX" e "AEX FT/lavagem" a partir das Separações AEX de 1 a 5 (como identificado nas Tabelas 2-3) são mostrados. A abundância relativa de alguns destes peptídeos identificados na FIGURA 10 da análise de mapeamento de peptídeo é mostrada na FIGURA 11.
[00488] Referente a FIGURA 11, esta FIGURA identifica vários fragmentos de peptídeo analisados e seus níveis relativos de oxidação. Em particular, a terceira coluna identifica os resíduos de aminoácido ("Sequência de Peptídeo") de fragmentos de peptídeo que foram isolados e analisados. Cada sequência de peptídeo tem um resíduo de aminoácido que é sublinhado. O resíduo de aminoácido sublinhado identifica o aminoácido na Sequência de Peptídeo que é oxidado. Os aminoácidos oxidados correspondem à oxidação de histidina (H) ou oxidação de triptofano (W). É também descrito nesta figura, linhas à direita de cada Sequência de Peptídeo mostrando a abundância da espécie oxidada. Este sombreamento nas linhas indica as diferenças na quantidade relativa de resíduos oxidados em uma amostra particular utilizando-se diferentes Separações de AEX identificadas nos respectivos títulos das colunas. Por exemplo, referente ao segundo peptídeo, EIGLLTCEATVNGHLYK (SEQ ID NO: 18) na FIGURA 11, quando ler ao longo de uma maneira horizontal, a população total relativa deste peptídeo em uma amostra particular ("Carga AEX aflibercepte") que está oxidada é de aproximadamente 0,013% oxidada. Quando a progressão é feita através da mesma linha, existe uma mudança no sombreamento, indicando uma alteração na abundância relativa das espécies oxidadas. Por exemplo, utilizando-se esta mesma Sequência de Peptídeo, a abundância relativa das espécies oxidadas para Separação AEX é de 0,006% a 0,010% quando seguindo diferentes protocolos de separação de AEX. Desse modo, pode ser apreciado que a cromatografia AEX diminui a abundância das espécies oxidadas.
(B) AEX foi utilizado para reduzir a formação da cor na produção de MiniTrap
[00489] A cromatografia AEX foi realizada para remover a coloração obtida durante a produção de MT1, o qual foi obtida na realização da clivagem de aflibercepte de tamanho natural expresso utilizando-se MQD1.
2.5Projeto
[00490] Quatro separações de AEX foram realizadas durante este estudo como descrito nas Tabelas 2-4. A carga AEX foi obtida de uma amostra de filtração de MT1 ("piscina de filtração de MT1"). Uma coluna Capto Q de 15,7 mL (20,0 cm de altura de leito, 1,0 cm de I.D.), uma coluna POROS 50 HQ de 14,1 mL (18,0 cm de altura de leito,1,0 cm de I.D.), e uma coluna Q Sefarose FF de 16,5 mL (21,0 cm de altura de leito,1,0 cm de I.D.) foram integradas em um controlador de cromatografia líquida de bancada AKTA Avant para este experimento. O pH da carga AEX foi ajustado para marcar± 0,05 unidades de pH utilizando-se 2 M tris base ou 2 M de ácido acético. A condutividade da carga AEX foi ajustada para marcar ± 0,1 mS/cm utilizando-se 5 M cloreto de sódio ou água deionizada. Todas as amostras de piscina foram analisadas para HMW, cor e rendimento. Tabela 2-4. Sumário do projeto de estudo para o estudo de redução da cor de AEXTabela 2-5. Protocolo AEX de fluxo direto utilizado para o estudo de redução de corAEX, cromatografia de troca de ânion; CV, volume de coluna Tabela 2-6. Protocolo AEX de ligação e eluição utilizado para o estudo de redução de corAEX, cromatografia de troca de ânion; CV, volume de coluna
2.6Resultados
[00491] Todas as quatro separações AEX induzem a redução na cor como visto para coloração do fluxo direto e lavagem para as separações AEX de 1 a 4 (Tabelas de 2 a 7). Ao mesmo tempo que as primeiras três separações AEX foram avaliadas em um método de ligação e eluição (Tabelas de 2 a 6), foi observado que a maioria do produto estava presente nos blocos de carga e lavagem (62% a 94%).
[00492] As primeiras três separações avaliaram o pH8,4e2,0 mS/cm ponto de ajuste para Capto Q, POROS 50 HQ, e resinas Q Sefarose FF. Todas as três separações tiveram um bom rendimento (> 80%). A piscina POROS 50 HQ AEX mostrou a menor cor amarela na piscina AEX (valor b* de 2,09) seguido pela piscina AEX Q Sefarose FF (valor b* de 2,22) e a piscina AEX Capto Q (valor b* de 2,55).Tabela 2-7. Sumário dos resultados experimentais do estudo de redução de cor AEXAEX, cromatografia de troca de ânion; HMW, espécie de peso molecular elevado.
[00493] As frações foram ajustadas a uma concentração de proteína de 5 g/L para medições de cor.
2.7 Conclusão
[00494] Como visto para aflibercepte (ver Seção 2,3 acima), o uso de AEX foi descoberto reduzir a coloração amarelo-amarronzada (Tabelas de 2 a 7) para a produção de MiniTrap. Referente às Tabelas de 2 a 7, a Carga AEX tem um valor b* de 4,17, porém quando submetida à cromatografia AEX (Separação AEX 1-4), o valor de b* diminui indicando uma diminuição na coloração amarelo-amarronzada. Novamente, como o valor de b* diminui assim também a coloração. O valor inicial de b* da Carga de AEX (em uma concentração de 5 g/L) pode variar de cerca de 0,5 a cerca de 25, mais particularmente de cerca de 1,0 a cerca de 20,0, e ainda mais particularmente de cerca de 1,5 a cerca de 15,0. Após o uso de AEX, o valor de b* do fluxo direto (em uma concentração de 5 g/L) pode variar de 0,5 a cerca de 10,0, mais particularmente de cerca de 0,5 a cerca de 7,0, e ainda mais particularmente de cerca de 0,5 a cerca de 5,0.
Exemplo 3. Estudo de Peptídeo Oxidado 3.1 Mapeamentos de Peptídeo
[00495] Preparação de Amostra. O mapeamento tríptico de amostras reduzidas e alquiladas MiniTrap (MT1) e MT4 (MiniTrap similar a MT1 utilizando-se um aflibercepte de tamanho natural diferente, um produzido utilizando-se cultura celular de hidrolisado de soja) foi realizado para identificar e quantificar a modificação pós-translacional. Uma alíquota da amostra foi desnaturada utilizando-se 8,0 M de Ureia em 0,1 M de Tris-HCl, pH 7,5, reduzida com DTT e, em seguida, alquilada com iodoacetamida. A substância de fármaco desnaturada, reduzida e alquilada foi primeiro digerida com Lys-C recombinante (rLys- C) em uma enzima para relação de substrato de 1:100 (peso/peso) a 37°C durante 30 minutos, diluída com 0,1 M de Tris-HCl, pH 7,5 tal que a concentração final de ureia foi de 1,8 M, subsequentemente digerida com tripsina em uma enzima para relação de substância de 1:20 (peso/peso) a 37°C durante duas horas e em seguida desglicosilada com PNGase F em uma relação de enzima substrato de 1:5 (peso/peso) a 37oC durante uma hora. A digestão foi interrompida levando-se o pH abaixo de 2,0 utilizando-se ácido fórmico (FA).
[00496] Análise LC-MS. Uma alíquota de 20 μg de peptídeos rLys- C/trípticos resultantes de cada amostra foi separada e analisada por cromatografia líquida de ultra performance de fase reversa (UPLC) utilizando-se coluna Waters ACQUITY UPLC CSH C18 (130 Â, 1,7 μm, 2,1x150 mm) seguido por detecção PDA on-line (em comprimentos de ondas de 280 nm, 320 nm e 350 nm) e análise de espectrometria de massa. A Fase Móvel A era 0,1% de FA em água e a Fase Móvel B era de 0,1% de FA em acetonitrila. Após a injeção de amostra, um gradiente iniciou com uma espera de 5 minutos a 0,1% B seguido por um aumento linear a 35% B durante 75 minutos para ótima separação de peptídeo. Os experimentos MS e MS/MS foram conduzidos em um espectrômetro de massa Thermo Scientific Q Exactive Hybrid Quadrupole-Orbitrap com dissociação colisional de alta energia (HCD) utilizado para fragmentação de peptídeo para os experimentos MS/MS. As designações de identidade de peptídeo foram baseadas na massa precisa experimentalmente determinada de um peptídeo fornecido no espectro MS total bem como os íons de fragmento b e Y no correspondente espectro HCD MS/MS. Os cromatogramas de íon extraídos de peptídeos oxidados e o correspondente peptídeo nativo foram gerados com as áreas de pico integradas para calcular a porcentagem específica de sítio de resíduo(s) de aminoácido oxidado dentro da amostra MT1.
Fragmentos de Peptídeo ligados à absorbância aumentada a 350 nm
[00497] Os PTMs em MT1 foram observados em comparação aos mapas de peptídeo trípticos para MT1 eMT4 (A FIGURA 12A mostra a absorbância de peptídeos eluídos de 20,0 a 75 minutos). Os peptídeos com picos UV variantes são destacados. A vista expandida do cromatograma é mostrada na FIGURA 12B que exibe a absorbância dos peptídeos eluídos de 16 a 30 minutos. Os peptídeos com contraste nítido em absorbância UV entre MT1 eMT4 foram TNYLTH*R (SEQ ID NO: 21), IIW(+4)DSR (SEQ ID NO: 28) e IIIW(+132)DSR (SEQ ID NO: 124) (* ou sublinhado representa a oxidação do resíduo). Além disso, a vista expandida do cromatograma é mostrada na FIGURA 12C, que exibe a absorbância dos peptídeos eluídos de 30 a 75 minutos. Os peptídeos com contraste nítido em absorbância UV entre MT1 e MT4 foram DKTH*TC*PPC*PAPELLG (SEQ ID NO:17), TELNVGIDFNWEYPSSKH*QHK (SEQ ID NO: 20), EIGLLTCEATVNGH*LYK (SEQ ID NO: 18) e QTNTIIDVVLSPSH*GIELSVGEK (SEQ ID NO: 19) (* representa a oxidação do resíduo). O mapeamento de peptídeo revelou a identidade dos peptídeos que são significantemente diferentes em abundância entre os MiniTrap de VEGFs. A abundância relativa dos peptídeos identificados da análise de mapeamento de peptídeo é mostrada na Tabela 3-1. A quantidade de 2-oxo-histidinas em MT 1 (produzido em um MQD) foi maior do que MT4 (produzido em hidrolisado de soja), sugerindo que os meios empregados para expressar aflibercepte podem ter um significante efeito na abundância relativa dos peptídeos com histidinas oxidadas ou triptofanos oxidados. Por exemplo, para o peptídeo QTNTIIDVVLSPSH*GIELSVGEK (SEQ ID NO: 19), a porcentagem de abundância relativa do peptídeo em MT1 (MQD produzido) era de 0,015% comparada com a porcentagem de abundância relativa do peptídeo em MT4 (hidrolisado de soja produzido; o qual é cerca de 15 vezes menos quando comparado a MT1).Tabela 3-1.
[00498] Quantil Ficação de 2-oxo-Histidina e cor. A porcentagem de 2-oxo-histidinas nos oligopeptídeos que foram gerados por digestão de protease, como medido por espectrometria de massa, é também mostrada (Tabela 3-2). (Os valores foram normalizados contra os peptídeos não modificados.) A Tabela 3-2(I) mostra a porcentagem de histidinas/triptofanos oxidados observada por fluxo direto de AEX: MT1 lote 1, fluxo direto de AEX para MT1 lote 2, e fluxo direto de AEX para MT1 lote 3. A Tabela 3-2(II) mostra a porcentagem de histidinas/triptofanos oxidados observada por fração acídica 1, fração acídica 2, e fração principal obtida realizando-se a separação de CEX por MT1 lote 3. Desta tabela, é claro que as variantes acídicas são compreendidas de espécies oxidadas. Da Tabela 3-2(I), é claro que a% de dioxidação de 2-oxo-histidinas e triptofano compreendendo peptídeos/proteína é reduzida no fluxo direto de AEX comparada à faixa AEX. É evidente que decapar a coluna AEX enriquece para a porcentagem de tais peptídeos modificados. Por exemplo, a% do peptídeo modificado "EIGLLTC[+57]EATVNGH[+14]LYK (SEQ ID NO: 18)" no fluxo direto de AEX(MT1 lote 1) era de0,013% e na "Faixa AEX" era de 0,080%. Isto também corrobora que a coluna AEX captura os peptídeos modificados, desse modo reduzindo a porcentagem de peptídeos modificados no fluxo direto de AEX.Tabela 3-2 (I). Porcentagem de 2-oxo-Histidinas/TriptofanosTabela 3-2 (II). Porcentagem de 2-oxo-Histidinas/Triptofanos
[00499] Na Tabela 3-2(II), [+57] representa a alquilação de cisteína por iodoacetamida que adiciona uma porção de carboximetil amina na cisteína, que é uma massa líquida aumentada de cerca de +57 sobre a cisteína não modificada:
[00500] Na Tabela 3-2(II), [+14] representa a conversão de His a 2- oxo-His. Um átomo de oxigênio é adicionado no carbono 2, porém dois átomos de hidrogênio são perdidos (um de Carbono 2, o outro de nitrogênio 3), que é uma massa líquida aumentada de cerca de +14 sobre a histidina não modificada.
[00501] Na Tabela 3-2(II), [+32] representa a dioxidação de triptofano resultando na formação de N-formilcinurenina, que é uma massa líquida aumentada de cerca de +32 sobre o triptofano não modificado (FIGURA 4).
[00502] Um segundo grupo de experimentos foram realizados para avaliar a porcentagem de 2-oxo-histidinas (e dioxidação de triptofano) em oligopeptídeos de aflibercepte clivado por FabRICATOR digerido por protease (MT4) que foi processado por cromatografia AEX (FIGURA 13e Tabela 3-3 abaixo). A porcentagem de 2-oxo-histidinas e dioxidação de triptofano em faixa de AEX para oligopeptídeos de aflibercepte clivada por FABRICATOR digerido por protease (MT4) foi significantemente maior do que a porcentagem de 2-oxo-histidinas e dioxidação de triptofano no fluxo direto de AEX (referente a "MT1" na Tabela 3-3 abaixo).Tabela 3-3. Porcentagem de 2-oxo-Histidinasavalor calculado utilizando-se um peptídeo diferente para o aflibercepte de tamanho natural, como o peptídeo de terminal C é diferente de MiniTrap.
[00503] A porcentagem de 2-oxo-histidinas e dioxidação de triptofanona faixa AEX foi significantemente maior do que a porcentagem de 2-oxo-histidinas e dioxidação de triptofano nos fluxos diretos de AEX durante as produções de MT1(referente a "MT1" na Tabela 3-3 acima). Comparado à Tabela 3-2, a Tabela 3-3 mostra resultados similares que decapando a coluna AEX produziu uma amostra com uma porcentagem significantemente maior de 2-oxo- histidinase dioxidação de triptofano comparado à porcentagem de 2- oxo-histidinas e dioxidação de triptofanono fluxo direto de AEX sugerindo que as espécies de 2-oxo-histidinase dioxidação de triptofano são ligadas à coluna AEX durante a separação e são removidas decapando-se a coluna AEX. Isto é também evidente no cromatograma de íon extraído como visto na FIGURA 14.
Cromatograma de Troca de Cátion Forte (CEX)
[00504] Uma série de experimentos foram conduzidos a fim de identificar espécies acídicas e outras variantes presentes nas amostras compreendendo proteínas anti-VEGF.
[00505] A cromatografia de troca de cátion forte foi realizada utilizando-se uma coluna MonoS (10/100) GL(GE Life Sciences, Marlborough, MA). Para as separações de amostra, as Fases Móveis utilizadas foram 20 mM de ácido 2-(N-morfolino)etanossulfônico (MES), pH 5,7 (Fase Móvel A) e 40 mM de fosfato de sódio, 100 mM de Cloreto de sódio pH 9,0 (Fase Móvel B). Um gradiente de pH não linear foi utilizado para eluir as variantes de carga de MT1 com detecção em 280 nm. Os picos que eluiram em um tempo de residência relativo anterior ao pico principal são designados aqui como espécies acídicas.
[00506] Uma amostra do MT1 lote 2 (< BY3), antes de qualquer enriquecimento, foi submetida a CEX utilizando-se o método como descrito na FIGURA 15. A desialilação foi aplicada à amostra a fim de reduzir a complexidade das variantes de MT1. Isto foi seguido pelo processamento de SEC preparativo (Superdex 200 prep grade XK26/100) utilizando-se 1X DPBS, pH 7,2 ± 0,2, como a Fase Móvel. As frações obtidas da coluna SEC preparativa compreendendo MiniTrap desialilada (dsMT1) foram combinadas e também submetidas à cromatografia de troca de cátion forte (SCX) para enriquecer variantes de carga de MT1 utilizando-se um gradiente de sal-pH dual. O procedimento resultou em um total de 7 frações (F1-F7; MC representa o controle de método, FIGURA 16 e FIGURA 17).
[00507] No desempenho CEX, as espécies acídicas eluíram mais cedo do que os picos principais e as espécies básicas eluíram após os picos principais. Como observado na FIGURA 17, os picos 3-5 são os picos principais. Os picos 1 e 2 são eluídos antes da eluição das espécies principais de MT1 (picos 3-5), e desse modo, compreendem as espécies acídicas. O pico 6 é eluído após a eluição das espécies principais de MT1 (picos 3-5), e desse modo, compreende as espécies básicas. As Tabela 3-4 exibem a abundância relativa dos picos em MC (como identificado na FIGURA 16). Por exemplo, a fileira dois das Tabelas 3-4 (rotulada MC) exibe que a quantidade total relativa das espécies acídicas em MC é de cerca de 19,8% (isto é, pico 1 + pico 2). As Tabelas 3-4 também exibem a abundância relativa dos picos para cada fração individual. Ao mesmo tempo que existem espécies sobrepostas nas diferentes frações (como refletido nas FIGURA 16 e FIGURA 17), a maioria das frações F1 e F2 são espécies acídicas (isto é, pico 1 e pico 2). Por exemplo, a fração F1 é compreendida de 63,7% do pico 1e 19,2% do pico 2 (para um total de 82,9% de espécies acídicas). A Fração F2 é compreendida de 9,6% do pico 1 e 75,9% do pico 2 (para um total de 85,5%de espécies acídicas). A maioria das frações F3-F5 são as espécies principais de MT1 (picos 3-5). Por último, a maioria das frações F6-F7 são as espécies básicas (pico 6), porém induzem algumas porções das espécies principais (por exemplo, picos 4 e 5).
[00508] Foi também observado que as frações F1 e F2 (as quais compreendem as espécies acídicas) tinham uma coloração amarela- marrom intense comprador com as frações F3-F5 (as quais compreendem as espécies principais ou "MT1"). Todas as frações foram inspecionadas quanto à cor em concentrações > 13 mg/mL. Como evidente para este Exemplo, a presença das espécies acídicas na amostra monitoradas com a aparência de coloração amarela-marrom, a remoção (ou minimização) das quais pode ser realizada removendo-se (ou minimizando) as espécies acídicas de MT1.Tabela 3-4. Abundância relativa de picos com base em CEX analítico
[00509] Os cromatogramas 3D para MT1 lote 2 e as frações F1 - F7 são mostrados nas FIGURAS 18A-H. MT1 lote 2 não exibiu quaisquer características espectrais significantes (FIGURA 18A). As Frações 1 e 2 (compreendendo as espécies acídicas) exibiram uma assinatura espectral entre 320-360 nm (ver o círculo na FIGURA 18B). Esta característica era mais proeminente na fração 1 comparado com a fração 2 (FIGURAS 18B e 18C) e estava ausente na fração 3 e frações 4 a 7 (espécies principais, MT1) (FIGURAS 18D e 18H), as quais não exibiram a coloração amarela-marrom.
[00510] Desse modo, como observado acima, CEX induziu a identificação de espécies acídicas/frações acídicas (frações 1 e 2) as quais exibiram uma coloração intensa amarela-marrom quando comparado às principais espécies/frações (frações 3 a 6). Este resultado também foi observado na forma de uma assinatura espectral distinta presente nos cromatogramas 3D das frações F1-F2 e ausente nas frações F3-F7.
Eletroferogramas de Focagem Isoelétrica Capilar com imagem (icIEF)
[00511] A distribuição de variantes em frações F1-F7 e MC (de MT1 - lote 2 após CEX) foi também avaliada por icIEF (FIGURA 19).
[00512] A distribuição de variantes em frações F1-F7 e MC (de MT1 - lote 2 após CEX) foi também avaliada por icIEF utilizando-se um analisador iCE3 (Proteína Simples) com um cartucho capilar revestido por fluorocarbono (100 μm x 5 cm). A solução anfólita consistiu de uma mistura de 0,35% de metil celulose (MC), 0,75% de Pharmalyte 3 a 10 anfólitos de veículo, 4,2% de Pharmalyte 8-10,5 anfólitos de veículo e 0,2% de pI marcador 7,40 e 0,15% de pI marcador 9,77 em água purificada. O anólito era 80 mM de ácido fosfórico, e o católito era 100 mM de hidróxido de sódio, ambos em0,10% de metilcelulose. As amostras foram diluídas em água purificada e sialidase A foi adicionada a cada amostra diluída em uma enzima para relação de substrato de 1:200 (unidades de sialidase A por miligrama de MT1) seguido por incubação a temperatura ambiente por aproximadamente 16 horas. As amostras tratadas com sialidase A foram misturadas com a solução anfólita e em seguida focadas introduzindo-se um potencial de 1500 V durante um minuto seguido por um potencial de 3000 V durante 7 minutos. Uma imagem das variantes MT1 focadas foi obtida passando- se 280 nm de luz ultravioleta através do capilar e nas lentes de uma câmera digital de dispositivo acoplado à carga. Esta imagem foi em seguida analisada para determinar a distribuição das diversas variantes de carga (FIGURA 19). Referente a FIGURA 19, as frações F1 e F2 (ou as frações acídicas) exibiram uma ausência do pico para MT1, o qual é claramente observado por MC e as frações F3-F7 (espécies principais, MT1). Desse modo, os eletroferogramas icIEF foram considerados capazes de detectar e determinar a distribuição das diferentes variantes de carga da proteína sob consideração, MT1 neste caso. Desse modo, foi evidente que as frações acídicas realizando análise CEX exibiram (a) abundância relativa aumentada da porcentagem de 2-oxo-histidina ou dioxotriptofano (Tabela 3-2 (II)); (b) coloração amarela-marrom aumentada (nenhum dado mostrado); e (c) presença de uma assinatura espectral como visto nos cromatogramas 3D para as frações 1 e 2 (FIGURA 18B e FIGURA 18C).
Exemplo 4. Estudo de FotoIndução
[00513] Neste Exemplo, a fotoindução de MiniTrap de VEGF (MT), por exemplo, MT1, foi realizada pela exposição de uma amostra de proteína a quantidades variadas de luz fluorescente branca fria (CW) ou luz ultravioleta (UVA). O conteúdo do aminoácido oxidado e colorido das amostras expostas à luz foi determinado. A análise de LCMS foi realizada após a exposição, como explicado acima. A exposição de MT à luz branca fria ou luz UVA produziu um aumento nos resíduos de aminoácido oxidado, por exemplo, histidina (Tabela 4-1, Tabela 4-2 e Tabela 4-3).Tabela 4-1. Projeto de Estudo de FotoIndução
[00514] ICH refere-se à Diretriz Tripartida Harmonizada ICH: Teste de Estabilidade: Teste de Fotoestabilidade de Novas Substâncias de Fármaco e Produtos Q1B os quais especificam estudos de fotoestabilidade para serem conduzidos com não menos do que 1,2 milhão lux*horas de luz fluorescente branca fria e energia perto da ultravioleta de não menos do que 200 W*hr/m2.
[00515] A Tabela 4-2 descreve o aumento na coloração da amostra de MT exposta à luz branca fria e luz ultravioleta. Por exemplo, o valor b para amostra (t=0) foi de 9,58. Expondo esta amostra à luz branca fria a 2,4 milhão de lux*hr, o valor b aumenta a 22,14. Este aumento no valor b indica que a exposição de MT à luz branca fria a 2,4 milhão lux*hr aumenta coloração amarela-marrom da amostra quando comparado à amostra (t=0). Similarmente, expondo a amostra de MT (t=0) à luz ultravioleta a400 W*h/m2, o valor b aumenta a 10,72 de 9,58. Este aumento no valor b indica que a exposição de amostra de MT à luz ultravioleta a 400 W*h/m2 produz uma coloração amarela-marrom aumentada da amostra quanto comparado à amostra (t=0).Tabela 4-2. Cor das Amostras expostas à Luz Branca Fria e Luz Ultravioleta
[00516] As cores da amostra são indicadas utilizando-se o espaço de cor CIELAB (variáveis L*, a*e b*) e relativas ao padrão de cor EP BY; L* = branco a preto (L*é leveza); a* = magenta a aqua; b* = amarelo a azul, o maior valor b o mais amarelo.Tabela 4-3 (I). Níveis de 2-oxo-His em Peptídeos de MiniTrap estressado por Luz UltravioletaTabela 4-3 (II). Níveis de 2-oxo-His em Peptídeos de MiniTrap estressados por Luz Branca Fria
[00517] Exposição de aflibercepte MT à luz branca fria ou luz UVA monitorada com a aparência de histidinas oxidadas (2-oxo-his) (Tabela 4-3). Referente à Tabela 4-3, o peptídeo "SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGR (SEQ ID NO: 22)" com oxo-histidina foi de 0,007% na amostra MT (t=0), enquanto que sua abundância aumentou a 0,324% em exposição à luz ultravioleta durante 40 horas (Tabela 4-3(I)) e a 1,309% em exposição à luz branca fria durante 300 horas (Tabela 4-3(II)).
[00518] Duas espécies de 2-oxo-histidina foram observadas, uma espécie 13,98 Da (como mostrado na FIGURA 2) e uma espécie 15,99 Da (como mostrado na FIGURA 3), com a espécie 13,98 Da sendo predominante nas amostras MiniTrap estressadas por luz. As espécies 15,99 Da é conhecida ser um produto de um processo catalisado por metal de cobre (Schoneich, J. Pharm. Biomed Anal., 21:1093-1097 (2000)). Além disso, a espécie 13,98 Da é um produto de um processo induzido por luz (Liu e outro(s), Anal. Chem., 86, 10, 4940-4948 (2014)).
[00519] Similar à abundância aumentada de histidinas oxidadas nas amostras expostas à luz branca fria e luz UVA, a exposição de MT à luz branca fria ou luz UVA também induziu a formação de outros PTMs (Tabela 4-4 e Tabela 4-5).Tabela 4-4 (I). Outros PTMs nos Peptídeos de MiniTrap estressado por Luz UltravioletaTabela 4-4 (II). Outros PTMs em Peptídeos de MiniTrap estressado por Luz Branca FriaTabela 4-5 (I). Níveis de oxidação de Triptofano/Tirosina/Fenilalanina em Peptídeos de MiniTrap estressados por Luz UltravioletaTabela 4-5 (II). Níveis de oxidação de Triptofano/Tirosina/Fenilalanina em Peptídeos de MiniTrap estressados por Luz Branca Fria
[00520] Desse modo, a exposição de MT à luz branca fria ou uz UVA monitorada com a aparência de resíduos oxidados (tais como histidinas/triptofanos (oxo-Trp)). Quatro espécies de oxo-trp foram observadas: +4 Da, +16 Da, +32 Da e +48 Da. A espécie +4 Da é explicada pela formação de cinurenina (FIGURA 4), enquanto 16 Da, +32 Da e +48 Da são mono-oxidação, dioxidação e trioxidação de resíduos triptofano. O mapeamento de peptídeo da digestão tríptica de amostras MT monitoradas a 320 nm é mostrado na FIGURA 20. A presença relativa de resíduos oxidados compreendendo os peptídeos pode ser comparada na FIGURA 20. Por exemplo, para o peptídeo, IIW(+4)DSRK, (SEQ ID NO: 114), uma diferença significante em sua presença pode ser vista para a amostra MT a t=0, e amostra MT1 exposta a UVA durante 40 horas e amostra MT exposta a CWL durante 300 horasA exposição de MT à luz branca fria ou luz UVA foi também avaliada para a presença de espécies HMW/peso molecular baixo (LMW) (Tabela 4-6).Tabela 4-6. Espécies HMW/LMW foram geradas após o Estresse de CWL e UVA estendido
[00521] Para monitorar a coloração com relação às espécies HMW/LMW para cada amostra, cromatografia de exclusão de tamanho analítico com detecção de PDA de espectro completo (SEC-PDA) foi realizada como mostrado acima em todas as amostras estressadas (CWL e UVA). A análise de SEC-PDA de MT estressado por CWL revela significante aumento na absorbância a ~350 nm para todas as variantes de tamanho exceto a espécie LMW (FIGURA 21), enquanto o MT estressado por SEC-PDA em UVA não revela aumento na absorbância a ~350 nm (FIGURA 22). Diferente das amostras estressadas tratadas com CWL não produzem qualquer cor amarela-marrom significantemente quantificável.
[00522] Um resultado similar foi obtido após estudar as relações de absorbância a 320 nm e 280 nm para as amostras estressadas por UVA e CWL. As relações A320/A280, analisadas pela intensidade bruta ou área de pico total, monitoradas com intensidade aumentada da cor amarela em amostras estressadas por CWL (FIGURA 23), enquanto as relações A320/A280 não monitorou com intensidade aumentada da cor amarela em amostras estressadas por UVA (FIGURA 24). Isto corrobora com a observação prévia que as amostras de MT1 submetidas ao estresse UVA não resultam na mesma cor amarela- marrom observada após o estresse CWL.
Exemplo 5. Métodos a montante para reduzir a coloração 5.1 Estudo de Incubação de Meio quimicamente definido
[00523] O efeito de vários constituintes cravados nos meios frescos quimicamente definidos (MQD) compreendendo aflibercepte com respeito à coloração que foi examinado.
[00524] Um ou mais tubos de 50mL agitadores de ventilação tampada com 10 mL de volume de trabalho (MQD1 fresco) foram incubados durante 7 dias, tirando as amostras no dia 0 e dia 7. As amostras aflibercepte (proteína recombinante aflibercepte em uma solução tamponada aquosa, pH 6,2, compreendendo 5 mM de fosfato de sódio, 5 mM de citrato de sódio e 100 mM de Cloreto de sódio) foram cravados nos tubos agitadores em uma concentração de 6 g/L.
[00525] Componentes adicionados para alcançar uma concentração cumulativa: • Cisteína: 16,6 mM • Ferro: 0,23 mM • Cobre: 0,0071 mM • Zinco: 0,54 mM
[00526] O efeito em escala de cada constituinte adicionado no valor de b*(espaço de cor CIE L*, a*, b*) é apresentado na FIGURA 25Ae lote de valor real b* contra valor b* previsto é apresentado na FIGURA 25B. A adição de cisteína resultou no maior aumento de cor amarelo- amarronzada. Ferro e zinco também geraram cor. O grupo de vitamina B e ácido fólico (incluindo tiamina, niacinamida, ácido D-pantotênico, D- biotina e piridoxina) aumentou a cor amarela-marrom. Riboflavina e Vitamina B12, estatisticamente, não impactam a cor.
5.2 Efeito da diminuição de cisteína e metais no valor b*
[00527] Os biorreatores (por exemplo, 2L) foram inoculados de uma cultura de sementes de uma linhagem celular produzindo aflibercepte. As culturas inoculares foram desenvolvidas em uma temperatura de 35,5°C, pH de 7,1 ± 0,25, e ponto de ajuste de jato de ar de 22 ccm. Glicose, antiespuma, e alimentações basais foram suplementados aos biorreatores, quando necessário. O efeito de diminuir a concentração de cisteína e de metais na cor, quando aflibercepte é expresso, foi calculado em MQD1. Meio no dia 0= MQD1, incluindo 1,48 mM de cisteína • Alimentações Nutritivas: o Dia 2 = alimentação quimicamente definida (CDF) + 1,3-2,1 mM de cisteína o Dia 4 = CDF + 1,6 a 1,7 mM de cisteína o Dia 6 = CDF + 1,6 a 1,7 mM de cisteína o Dia 8 = CDF + 1,6 a 1,7 mM de cisteína As condições do biorreator foram conforme a seguir: • A Cisteína foi adicionada em uma concentração cumulativa de cerca de6-7milimoles por L de cultura, 8-9milimoles por L de cultura ou 10-11 milimoles per L de cultura. • Metais em MQD1 (níveis 0,5x, 1x, ou 1,5x MQD1) em níveis de 1x são listados abaixo (onde as concentrações são antes da adição de inóculo): o Fe = 68 a 83 micromoles por litro de cultura o Zn = 6 a 7 micromoles por litro de cultura o Cu = 0,1 a 0,2 micromoles por litro de cultura o Ni = 0,5 a 1 micromoles por litro de cultura
[00528] Diminuir níveis de cisteína cumulativa a 6 a 7 milimoles/L de cor amarela-marrom reduzida sem nenhum impacto significante no título. Diminuir as concentrações de metal a 0,5x no meio de cor reduzida com aumento significante no título. Houve um impacto mínimo no título, VCC (concentração celular viável), viabilidade, amônia ou osmolalidade (Ver FIGURA 26A-E). O efeito em escala previsto de conteúdo de metal e cisteína no valor b* e o título é apresentado na FIGURA 27.
5.3 Avaliação do Efeito de Antioxidantes no valor de b*
[00529] O efeito dos antioxidantes, taurina, hipotaurina, ácido tiótico, glutationa, glicina e vitamina C, na cor, fortificado no MQD gasto compreendendo aflibercepte, foi avaliado. Um ou mais tubos agitadores de 50 mL de ventilação tampados com 10 mL de volume de trabalho (MQD1) foram incubados durante 7 dias, tirando as amostras no dia 0 e dia 7.As condições para as adições componentes ao MQD1 gasto foram conforme a seguir:
[00530] A amostra aflibercepte (proteína recombinante aflibercepte em uma solução tamponada aquosa, pH 6,2, compreendendo 5 mM de fosfato de sódio, 5 mM de citrato de sódio e 100 mM de Cloreto de sódio) cravada em tubos agitadores a 6 g/L de concentração
[00531] Antioxidantes adicionados ao MQD1 gasto nas seguintes concentrações: o Taurina = cultura a 10 mM o Hipotaurina = cultura a 10 mM o Glicina = cultura a 10 mM o Ácido Tiótico = 0,0024 mM de cultura o Glutationa reduzida = 2 mM de cultura o Hidrocortisona = 0,0014 mM de cultura o Vitamina C (ácido ascórbico) = 0,028 mM de cultura
[00532] Os antioxidantes múltiplos diminuíram a formação da cor no meio gasto: uma combinação de hipotaurina, taurina e glicina; ácido tiótico; e vitamina C. Glutationa aumentou o valor de b*. Tabela 5-1. Sumário de Efeito Antioxidante sobre a Formação da cor de MiniTrap*Antioxidantes que significantemente diminuíram o valor b*: Hipotaurina/Taurina/Glicina, ácido tiótico, Vitamina C.
[00533] Um sumário do efeito previsto de vários antioxidantes sobre o valor b* (espaço de cor CIE L*, a*, b*) é apresentado na FIGURA 28 (A-C).
[00534] O efeito da outra adição aos antioxidantes sobre a cor, quando fortificado no MQD gasto compreendendo aflibercepte, foi avaliado. Um ou mais tubos agitadores de 50 mL de ventilação tampada com 10 mL de volume de trabalho (MQD1) foram incubados durante 7 dias, tirando as amostras no dia 0 e dia 7.As condições para as adições componentes ao MQD1 gasto foram conforme a seguir:
[00535] A amostra aflibercepte (proteína recombinante aflibercepte em uma solução tamponada aquosa, pH 6,2, compreendendo 5 mM de fosfato de sódio, 5 mM de citrato de sódio e 100 mM de Cloreto de sódio) cravada em tubos agitadores a 6 g/L de concentração
[00536] Dois experimentos DOE foram executados: (i) Antioxidantes adicionados ao MQD1 gasto nas seguintes concentrações: o Taurina = cultura a 10 mM o Hipotaurina = cultura a 10 mM o Glicina = cultura a 10 mM o Ácido Tiótico = 0,0024 mM de cultura o Vitamina C (ácido ascórbico) = 0,028 mM de cultura (ii) Antioxidantes adicionados para alcançar as seguintes concentrações cumulativas: o ATA = 2,5 μM a 5 μM o Mesilato de deferoxamina (DFO) = 5 μM a 10 μM o Catalase = 101,5 mg/L o S-carboximetil-L-Cisteína = 10 mM
[00537] A Hipotaurina foi descoberta diminuir a formação de cor no meio gasto (FIGURA 28D). DFO também significantemente diminuiu a formação de cor no meio gasto (FIGURA 28D). Os outros antioxidantes não tiveram impacto estatístico na formação de cor.Tabela 5-2. Sumário do Efeito Antioxidante sobre a Formação de Cor de MiniTrap
Estudo Antioxidante de Frasco agitado:
[00538] Taurina, Hipotaurina, glicina, ácido tiótico e vitamina C foram avaliados individualmente e em combinação com sua capacidade de diminuir a formação de cor na cultura celular (Tabela 5-3).
[00539] Os frascos agitados de 250 mL foram inoculados de uma cultura de semente de uma linhagem celular produzindo aflibercepte. As células inoculadas foram desenvolvidas a 35,5°C em incubadoras com 5% de controle de CO2. Glicose e alimentações basais foram suplementadas aos frascos agitados, quando necessário. O processo acima descrito foi utilizado, em que metais estavam presentes a 0,5x de concentração em MQD1 e cisteína foi adicionada em uma concentração cumulativa de 6 a 7 mM.Tabela 5-3.
[00540] A FIGURA 28E mostra o efeito previsto dos antioxidantes na Tabela 5-3 sobre o valor b* (espaço de cor CIE L*, a*, b*) e título final. Taurina, hipotaurina, e glicina significantemente reduziram o valor b* sem negativamente impactar o título.
Exemplo 6. Glicosilação e Estudos de viabilidade para a produção de aflibercepte utilizando-se MQD
[00541] Os biorreatores (por exemplo, 2L) foram inoculados de uma cultura de semente de uma linhagem celular produzindo aflibercepte. As culturas inoculares foram desenvolvidas em uma temperatura de 35,5°C, pH de 7,1 ± 0,25, e ponto de ajuste de jato de ar de 22 ccm. Glicose, antiespuma, e alimentações basais foram suplementados aos biorreatores, quando necessário. A produção de proteína aflibercepte foi realizada utilizando-se MQD1 (proprietário). A produção de uma linhagem de célula hospedeira expressando proteína de fusão de aflibercepte foi realizada utilizando-se MQD 1 (proprietário), MQD2 (comercialmente obtido), e MQD3 (comercialmente obtido). Uma série de experimentos foi realizada utilizando-se MQD 1,2, e 3 sem nenhum componente de meios adicionais. Outra série de experimentos foi realizada utilizando-se MQDs 1-3 aos quais manganês (tetraidrato de cloreto de manganês, Sigma, 3,2 mg/L), galactose (Sigma, 8 g/L), e uridina (Sigma, 6 g/L) foram adicionados às alimentações para modificar o perfil de galactosilação. Por último, uma série de experimentos foi realizada utilizando-se MQDs 1-3 aos quais manganês (tetraidrato de cloreto de manganês, Sigma, 3.2 mg/L), galactose (Sigma, 8 g/L), e uridina (Sigma, 6 g/L) foram adicionados às alimentações para modificar o perfil de galactosilação e dexametasona (Sigma, 12 mg/L) foi adicionado às alimentações para modificar o perfil de sialiação da composição. A colheita clarificada utilizando-se cada MQD foi preparada por centrifugação seguida por 0,45 μm de filtração.
[00542] As amostras foram processadas pela Proteína A antes da análise de N-glicano.
Medições do Título
[00543] Por todos estes exemplos, a não ser que de outra forma estabelecido, os títulos aflibercepte foram medidos diariamente utilizando-se Agilent (Santa Clara, CA) 1200 Series HPLC, ou equivalente, operando com um pH baixo, e gradiente de eluição por etapas com detecção em 280 nm. As concentrações foram determinadas com relação a uma curva de calibração padrão.
Densidade celular viável (VCD) e Valores de viabilidade celular
[00544] Por todos estes exemplos, a não ser que de outra forma estabelecido, densidade celular viável (VCD) e valores de viabilidade celular foram medidos através da exclusão de tripano azul por meio de contadoras celulares automatizadas Nova BioProfile Flex (Nova Biomedical, Waltham, MA). Glicose, lactato, pH fora de linha, oxigênio dissolvido (DO), medições de pCO2, e osmolalidade foram medidos com Nova BioProfile Flex (Nova Biomedical, Waltham, MA).
Perfilagem de Oligossacarídeo N-Glicano
[00545] Aproximadamente 15 μg de amostras processadas de Proteína A de colheitas de MQD 1-3 foram preparadas para análise de N-glicano de acordo com o protocolo Waters GlycoWorks utilizando-se a Desglicosilação Rápida GlycoWorks e kits de Rótulo GlycoWorks RapiFluor-MS (números de parte Waters 186008939 e 186008091, respectivamente). N-glicanos foram removidos da proteína aflibercepte tratando-se as amostras com PNGase-F a 50,5°C durante 5 minutos, seguido por um resfriamento a 25°C durante 5 minutos. Os glicanos liberados foram marcados com corante fluorescente RapiFluor-MS através de reação a temperatura ambiente durante 5 minutos. A proteína foi precipitada adicionando-se acetonitrila à mistura reacional e peletizada à base da cavidade através de centrifugação a 2,204 x g durante 10 minutos. O sobrenadante compreendendo os glicanos marcados foi coletado e analisado em um UPLC utilizando-se cromatografia líquida de interação hidrofílica (coluna Amida Waters BEH) com detecção de fluorescência de pós-coluna. Após ligarem-se à coluna, os glicanos marcados foram separados e eluídos utilizando-se um gradiente de fase móvel binária compreendido de acetonitrila e formiato de amônio a 50 mM aquoso (pH 4,4). Os glicanos marcados foram detectados utilizando-se um detector de fluorescência com um comprimento de onda de excitação de 265 nm e um comprimento de emissão de 425 nm. Utilizando-se as porcentagens de área relativa dos picos de N-glicano nos cromatogramas resultantes, a distribuição de N- glicano é reportada como a porcentagem total de N-glicanos (1) contendo um resíduo de fucose de núcleo (Fucosilação total, Tabela 61), (2) contendo pelo menos um resíduo de ácido siálico (Sialilação total, Tabela 6-2), (3) identificado com Manose-5 (Manose-5, Tabela 6-3), (4) contendo pelo menos um resíduo de galactose (Galactosilação total, Tabela 6-4), e (5) de identidade conhecida (Picos identificados totais,Tabela 6-5).
Resultados
[00546] A conta de célula viável (VCC), viabilidade, e os resultados de título de colheita são mostrados em FIGURAS 29-31 para MQDs 13 com e sem os componentes adicionais.
[00547] Entre as nove culturas, a cultura de MQD1 compreendendo uridina, manganês e galactose mostrou o mais alto título em 12 dias (5,5 g/L). MQD1 sem os componentes adicionais também mostrou um elevado título em 12 dias (cerca de 4,25 g/L) comparado com as outras sete culturas (FIGURA 29).
[00548] Os resultados de viabilidade celular foram similares entre as várias condições até dia de processo 6. Após o dia de processo 7, as culturas MQD2 e MQD3 com ou sem os componentes de meios adicionais mostraram mais do que cerca de 90% de viabilidade (FIGURA 30).
[00549] A cultura de MQD1 com uridina, manganês e galactose mostrou o mais alto VCC por volta do dia 6 (FIGURA 31).
[00550] A influência de culturas e suplementos teve um significante impacto na distribuição de N-glicano total (Tabelas 6-1 a 6-5). Os níveis de glicano foram comparados utilizando-se aflibercepte processado por Proteína A (duas amostras foram avaliadas) feito utilizando-se hidrolisado de soja. Os picos identificados totais são listados na Tabela 6-5.Tabela 6-1. Fucosilação total (%)U é uridina, M é manganês, G é galactose, Dex é dexametasona Tabela 6-2. Sialilação total (%) U é uridina, M é manganês, G é galactose, Dex é dexametasona Tabela 6-3. Mannose-5 (%) U é uridina, M é manganês, G é galactose, Dex é dexametasona Tabela 6-4. Galactosilação total (%) U é uridina, M é manganês, G é galactose, Dex é dexametasona Tabela 6-5. Picos identificados totais(%) U é uridina, M é manganês, G é galactose, Dex é dexametasona
[00551] A Fucosilação total, Sialilação total, Galactosilação total e manose-5 observados no dia 12 das culturas dos vários MQDs era de 42,61% a 46,26%, 30,84% a 39,14%, 59,02 a 66% e 8,86% a 13,38%, respectivamente. Estes valores para glicosilação diferem dos valores de glicosilação obtidos utilizando-se hidrolisado de soja.
[00552] Por último, as medições de cor foram realizadas para as colheitas clarificadas obtidas das células expressando aflibercepte MQD1, MQD2, e MQD3 suplementados com uridina, manganês e galactose. Os parâmetros de operação para as etapas do estudo de biorreator serão conhecidos por alguém de experiência versado na técnica.
Exemplo 7. Produção de afinidade de Proteínas anti-VEGF 7.1Expressão de MiniTrap de VEGF
[00553] As regiões de codificação de MiniTrap de VEGF recombinante (por exemplo, MT5, SEQ ID NO: 46) foram ligadas de forma operacional a uma sequência sinal, clonada em um vetor de expressão de mamífero e transfectada nas células de ovário de Hamster Chinês; as piscinas estavelmente transfectadas foram isoladas após a seleção com 400 μg/mL de higromicina durante 12 dias. As piscinas celulares de CHO estável, desenvolvidas em meio livre de proteína quimicamente definido, foram utilizadas para produzir proteínas para teste. Os polipeptídeos recombinantes foram secretados das células no meio de crescimento. Sequências de domínios constituintes do MiniTrap de VEGF • Flt1 humano (acesso # NP_001153392,1) • Flk1 humano (acesso # NP_002244,1) • Fc humano (IGHG1, acesso # P01857-1)
[00554] A MiniTrap de VEGF recombinante (MT5) foi obtida deste processo e foi também processada.
7.2Preparação de Colunas de Cromatografia de Afinidade
[00555] Cinco proteínas distintas capazes de ligarem-se a MiniTrap de VEGF (MT5) foram avaliadas. As proteínas utilizadas incluem VEGF165 (SEQ ID NO: 72), mAbl (lgG1 humano mAb anti-VEGFR1 de camundongo onde SEQ ID NO: 73 é uma cadeia pesada e SEQ ID NO: 74 é uma cadeia leve); mAb2 (um lgG1 humano mAb anti-VEGFR1 de camundongo onde SEQ ID NO: 75 é uma cadeia pesada e SEQ ID NO: 76 é uma cadeia leve); mAb3 (um lgG1 de camundongo mAb anti- VEGFR1 de camundongo onde SEQ ID NO: 77 é uma cadeia pesada e SEQ ID NO: 78 é uma cadeia leve) e mAb4 (um lgG1 de camundongo mAb anti-VEGFR1 de camundongo onde SEQ ID NO: 79 é uma cadeia pesada e SEQ ID NO: 80 é uma cadeia leve).
[00556] A coluna foi ativada lavando-se as colunas com 6 Volumes de Coluna (CV) de 1 mM de ácido hidroclórico gelado em uma taxa de fluxo não excedendo 1 mL/min. Dez mg de cada uma das proteínas foram carregados nas três colunas de afinidade HP ativadas por HiTrap NHS (1 mL, GE Healthcare, Cat # 17-0716-01) e as colunas foram fechadas para permitir o acoplamento ocorrer durante 30 minutos a temperatura ambiente. As colunas foram lavadas com 18 Volumes de Coluna de 0,5 M de acetato de sódio, NaCl a 0,5 M, pH 4,0 e os sítios abertos foram bloqueados com 18 Volumes de Coluna de Tris a 0,5 M- HCl, NaCl a 0,5 M, pH 8,3 (a lavagem foi realizada na seguinte ordem: 6 Volumes de Coluna de Tris a 0,5 M-HCl, NaCl a 0,5 M, pH 8,3; 6 Volumes de Coluna de acetato de sódio a 0,5 M (acetato de sódio: JT Baker, Cat# 3470-01), NaCl a 0,5 M, pH 4,0; 6 Volumes de Coluna de Tris a 0,5 M, pH 8,3; incubar a coluna durante 30 minutos a temperatura ambiente; 6 Volumes de Coluna de tampão de acetato de sódio a 0,5 M, NaCl a 0,5 M, pH 4,0; 6 Volumes de Coluna de Tris a 0,5 M - HCl, NaCl a 0,5 M, pH 8,3 e 6 Volumes de Coluna de tampão de acetato de sódio a 0,5 M, NaCl a 0,5 M, pH 4,0). As colunas foram armazenadas em DPBS, pH 7,5. As cinco colunas avaliadas são designadas como coluna 1 (compreendendo VEGFWÕ), coluna 2 (compreendendo mAb1), coluna 3 (compreendendo mAb2), coluna 4 (compreendendo mAb3) e coluna 5 (compreendendo mAb4).
7.3Produção de MiniTrap utilizando-se Cromatografia de Afinidade
[00557] Preparação da Amostra. Dois diferentes processos de produção para o MiniTrap foram realizados. Em um caso, o material compreendendo uma amostra de MiniTrap foi produzido utilizando-se cada uma das colunas de afinidade onde o material parental (MiniTrap) foi diluído em tampão 1X DPBS a 20 mg/mL e foi aplicado à coluna e incluído em RT durante 30 minutos. Utilizando-se a coluna de afinidade, o MiniTrap foi isolado de ~7000 ppm de HCP.
[00558] Alternativamente, o sobrenadante de cultura colhido foi utilizado, o qual compreendeu 0,4 mg/mL de proteína no sobrenadante e carregado nas diferentes colunas de afinidade (1-5) separadamente. Nenhuma outra diluição foi realizada. As colunas de afinidade foram em seguida lavadas com 9 CV de tampão 1x DPBS seguido pela eluição das proteínas com o tampão de eluição IgG, pH 2,8 (Thermo, Cat # 21009).
[00559] O material MiniTrap obtido como descrito acima foi em seguida filtrado através de um filtro 0,45 μm ou centrifugado antes de carregar nas colunas preparadas como descrito na Seção7.2 acima. Vinte e cinco mL de solução de carga compreendendo aproximadamente 0,4 mg/mL de proteína foi carregado em cada uma das colunas e incubado durante 20 minutos. Cada coluna foi lavada com 9 CV de DPBS (Invitrogen, Cat# 14190-144) antes da eluição para Equilíbrio. A quantidade de MT5 nas frações de lavagem é mostrada na Tabela 7-1. As lavagens foram seguidas por eluição utilizando-se 6 CV de pH 2,8 (Tampão de Eluição Comercial, (Thermo, Cat#21009)) e 100 mM de tampão de glicina pH 2,5 e as frações foram rapidamente neutralizadas com a adição de 1 M de Tris, pH 7,5 (Invitrogen, Cat# 15567-027). A quantidade de MiniTrap nas frações eluídas é também mostrada na Tabela 7-1.
[00560] O MiniTrap (MT5) foi produzido com sucesso a partir de todas as cinco colunas de afinidade. O rendimento da coluna com VEGFi65foi maior do que comparado com as colunas mAbl e mAb2. As mAb3 e mAb4 compreendendo mAb anti-VEGFR1 humanizado também mostrou sucesso na produção de MT5 com rendimento similar a mAb1 e mAb2. Na Tabela 7-1, o rendimento esperado foi calculado com base em 100% de eficiência de conjugação e 1:1 relação molar de proteína capturada por afinidade a MT5.Tabela 7-1.
7.4 Estudo de Estabilidade de coluna
[00561] Ciclos múltiplos foram realizados utilizando-se colunas 1 e 2 após o método descrito na Seção 7.3 (Tabela 7-2 para a coluna 1 e Tabela 7-3 para a coluna 2).Tabela 7-2Tabela 7-3
[00562] As colunas foram armazenadas a 4°C durante cerca de 5 semanas. Uma quantidade similar de MT5 foi eluído de cada produção demonstrando boa estabilidade de coluna.
7.5 Estudo de Estabilidade da MiniTrap de VEGF produzido
[00563] A Análise de SDS-PAGE das frações eluídas das três colunas (coluna 1, coluna 2 e coluna 3) foi realizada. As amostras foram preparadas no tampão de amostra SDS-PAGE de redução e não redução e realizadas em 4 a 12% de gradiente NuPage bis-Tris gel utilizando-se 1X MES (Cat. N°. NP0322, Invitrogen, Carlsbad, CA).
[00564] As cavidades foram carregadas com (1) peso molecular padrão, (2) solução de carga, (3) lavagem de coluna da coluna 1, (4) fração eluída da coluna2, (5) fração eluída da coluna1, (6) fração eluída da coluna3, (7) MT5 armazenado a pH 2,8 durante 1 min, (8) MT5 armazenado a pH 2,8 durante 30 min, e (9) peso molecular padrão (FIGURA 33 e FIGURA 34). A análise demonstrou que as frações obtidas das frações eluídas de todas as três colunas de afinidade (colunas 1 a 3) exibiu perfis de tamanhos similares e o uso das colunas de afinidade não desestabiliza o MiniTrap.
7.6 Cálculo do Nível de Proteína de Célula Hospedeira
[00565] Uma curva padrão de concentração de proteínas de célula hospedeira foi obtida utilizando-se o Kit CHO HCP ELISA, 3G (F550) (Cygus Technologies) (FIGURA 32 e Tabela 7-4). A quantidade de HCPs nas soluções de carga e as frações eluídas foram calculadas utilizando-se a curva padrão como descrito na FIGURA 32 e a fórmula da curva listada na Tabela 7-4.Tabela 7-4.
[00566] Os HCPs totais foram caculados utilizando-se a curva padrão e o gráfico com a quantidade total de proteínas de célula hospedeira é mostrado na FIGURA 35A. FIGURA 35B também exibe a quantidade total de proteínas de célula hospedeira na carga comparado com as lavagens e as frações eluídas das colunas 1,2, 4 e 5. Os Ciclos múltiplos foram realizados utilizando-se as colunas e o (#) na FIGURA 35B representa o ciclo do qual a fração foi avaliada.O uso da captura de afinidade utilizando-se proteínas capazes de ligarem-se a MiniTrap mostrou uma redução eficiente de HCPs de cerca de 7000 ppm a cerca de 25-50 ppm. Como observado pelo rendimento, a coluna com VEGFwõmiostrou maior pureza de MiniTrap dos HCPs do que mostrado pelas colunas mAb1 e mAb2.
7.7 Perfis SEC de MiniTrap de VEGF antes e após a Produção de afinidade
[00567] Os perfis SEC das frações eluídas das três colunas (colunas 1 a 3) foram comparados ao perfil SEC de MiniTrap na solução de carga. Como visto nas FIGURA 36 e Tabela 7-5, os perfis SEC do MT5 antes ou após a produção de afinidade eram altamente similares.Tabela 7-5.
7.8Cinética de MiniTrap de VEGF Pré e Pós a Ligação das Amostras de coluna a mAb1, mAb2 e VEGF165
[00568] Os Estudos cinéticos foram realizados utilizando-se um instrumento Biacore T200.
[00569] As Constantes de dissociação de equilíbrio (valores KD) para ligação de VEGF165 a MiniTrap nos eluídos das colunas 1 e 2 e a solução de carga foram determinadas utilizando-se um biossensor de ressonância de plasmônio de superfície em tempo real utilizando-se um instrumento Biacore T200. Todos os estudos de ligação foram realizadas em 10 mM de HEPES, 150 mM de NaCl, 3 mM de EDTA, e 0,05% de v/v Tensoativo Tween-20, pH 7,4 (HBS-ET) tampão de execução a 25°C. A superfície do sensor Biacore foi primeiro derivitizada por acoplamento de amina com mAb1 para capturar MT5. Uma representação do desenho do estudo de ligação é mostrada na FIGURA 37.
[00570] Brevemente, os eluatos das colunas e solução de carga foram diluídos em um tampão HBS-EP (Biacore) e injetados através das matrizes de proteína imobilizada em um nível de captura de ~70 RUs. O VEGF165 foi em seguida injetado em uma taxa de fluxo de 50 μL/minuto. A concentração equivalente de analito foi simultaneamente injetada sobre uma superfície de referência não tratada para servir como sensorgramas em branco para subtração de base do índice de refração de massa. A superfície do chip do sensor foi regenerada entre os ciclos com duas injeções em 5minutos de 10 mM de Glicina, a 25 μL/minuto. Os sensorgramas de ligação experimental resultante foram em seguida avaliados utilizando-se o software de avaliação BIA 4.0.1 para determinar os parâmetros de taxa cinética. Os grupos de dados para cada amostra foram ajustados ao modelo 1:1 Langmuir. Para estes estudos, os dados de ligação e dissociação foram analisados sob o protocolo de Análise de Ajuste Global ao mesmo tempo selecionar localmente o ajuste para capacidade de ligação de analito máxima (RU) ou atributo Rmax. Neste caso, o software calculou uma constante de dissociação única (kd), constante de associação (ka), e constante de afinidade (Kd). A constante de dissociação de equilíbrio é KD=kd/ka. A taxa de ativação cinética, taxa de desconto cinética e as afinidades totais foram determinadas utilizando-se diferentes VEGFWÕ concentrações na faixa de 0,03-2 nM (Tabela 7-6). As meias vidas dissociativas (t%) foram calculadas das constantes de taxa cinética como: ti/2= ln(2)/60*Kd. Os parâmetros cinéticos de ligação para MT5 a VEGF165 obtidos antes e após a produção de cromatografia de afinidade a 25°C são mostrados na Tabela 7-6.
[00571] A afinidade (KD), taxa de ativação (ka, M-1s-1) e taxa de desconto (kd) para MT5 produzidas por cromatografia de afinidade comparado com a solução de carga para avaliar o(s) efeito(s) da etapa de cromatografia de afinidade não mostrou mudança nos cinéticos de MT5 das diferentes amostras. Os sensorgramas SPR das construções MiniTrap de VEGF são mostrados na FIGURA 38.Tabela 7-6.
7.9 Ciclos de produção múltipla
[00572] A produção cromatográfica de colheita como obtido pela etapa7.1 foi realizada utilizando-se a coluna 1 (hVEGFwõ) e a coluna 2 (mAb1) como mostrado na 7.3. As colunas foram utilizadas para os ciclos cromatográficos múltiplos. Os rendimentos nas colunas não variam significantemente devido aos ciclos adicionais, sugerindo que as colunas retinham capacidade de ligação (Tabela 7-7).Tabela 7-7.
[00573] Os cálculos HCP na solução de cargas, frações de lavagem e frações de eluatos para as colunas 1 e 2 foram obtidos utilizando-se no método descrito em 7.4 (FIGURA 39). Os HCPs totais calculados mostraram que o uso repetido das colunas não reduziu a capacidade das colunas ligarem-se a MiniTrap.
7.10Otimizando as Colunas Cromatográficas de Afinidade
[00574] A produção cromatográfica do material colhido como obtido na Seção 7.1 foi realizada utilizando-se coluna 1 (VEGFWÕ) e coluna 2 (mAb1). Para os estudos de otimização, 14 mg ou 45 mg ao invés de 10 mg do VEGF165 ou o mAb anti-VEGFR1 foram carregados em duas colunas de afinidade HP ativadas por HiTrap NHS (1 mL, GE Healthcare) e as colunas foram fechadas para permitir o acoplamento ocorrer durante 30 minutos a temperatura ambiente. A produção e preparação da coluna da colheita incluindo o MiniTrap foram realizadas como descrito em7.2 e7.3 acima. A quantidade de MT5 na lavagem e frações eluídas é mostrada na Tabela 7-8. A comparação da coluna de afinidade com 14 mg ou 45 mg (VEGFWÕ ou anti-VEGFR1 mAb (mAb1)) de quantidade de conjugação ao invés de 10 mg mostra um rendimento aumentado de MiniTrap de ambas as colunas. Desse modo, o rendimento de coluna, utilizando-se o método delineado, pode ser melhorado otimizando-se a proteína para relação de coluna ou aumentando-se a eficiência de conjugação mudando-se o pH, tempo de incubação, temperatura de incubação, etc.Tabela 7-8.
7.11Uso de CEX com a Cromatografia de Afinidade
[00575] Uma amostra de cultura celular da expressão de MT5 foi produzida utilizando-se coluna 1 como descrito na Seção 7.3 acima. O eluído obtido foi submetido à coluna de cromatografia de troca de cátion (CEX) (HiTrap Capto S, 1 mL). As condições de operação da coluna são mostradas nas Tabelas 7 a 9.Tabela 7-9.
[00576] O HCP total na amostra de cultura celular original/partida, o eluído da coluna 1 de cromatografia de afinidade e eluído CEX foi de cerca de 230.000 ng/mL, cerca de 9.000 ng/mL e cerca de 850 ng/mL, respectivamente. As quantidades de HCP foram quantificadas determinadas utilizando-se o Kit Cygnus CHO HCP ELISA, 3G, como acima mencionado.
7.12 Uso de Cromatografia de Afinidade para Produzir outras Proteínas Anti-VEGF
[00577] A Coluna 1 foi avaliada para estudar sua capacidade de produzir outras proteínas anti-VEGF. Aflibercepte e um fragmento scFv com potencial de ligação a VEGF foram usados para este estudo. Os processos de produção foram realizados como descrito na Seção 7.3. A Tabela 7-10 demonstra que a coluna foi bem-sucedida em ligação e eluição de outras proteínas anti-VEGF.Tabela 7-10.
Exemplo 8. Caracterização Com Base em Espectrometria de Massa de Construções MiniTrap de VEGF
[00578] Materiais. MiniTrap (MT1) de VEGF foi produzido de aflibercepte como descrito no Exemplo 1. MiniTrap5 de VEGF (MT5) foi produzido como descrito no Exemplo 7. MiniTrap5 de VEGF (MT6) foi produzido pelo seguinte método: as regiões de codificação de MiniTrap5 de VEGF (MT5) recombinante foram ligadas de forma operacional a uma sequência sinal e clonadas em um vetor de expressão mamífero, transfectadas em células de ovário de hamster Chinês (CHO-K1) e pools estavelmente transfectados foram isolados após seleção com 400 μg/mL de higromicina durante 12 dias. Os pools de células CHO estáveis, desenvolvidos em MQD foram usados para produzir proteínas para análise.
8.1 Desglicosilação de Glicoproteínas.
[00579] Amostras de colheitas clarificadas de MT1, MT5 e MT6 foram diluídas ou reconstituídas para uma concentração de 0,52 mg/mL em uma solução de 28,8 μL de 1% (p/v) de tensoativo RG (RapiGest SF, Waters, Milford, MA) e HEPES a 50 mM (pH 7,9). Estas soluções foram aquecidas para aproximadamente 95°C durante 2 minutos, deixadas resfriar para 50°C, e misturadas com 1,2 μL de solução de PNGase (GlycoWorks Rapid PNGase F, Waters, Milford, MA). Desglicosilação foi concluída incubando as amostras a 50°C durante 5 minutos.
8.2 Análise de HILIC-Fluorescência-ESI-MS (MS/MS).
[00580] MT1 foi analisada por meio de separação HILIC combinada com fluorescência e detecção espectrométrica de massa. MT5 e MT6 foram analisadas usando apenas HILIC. Cromatografia foi realizada usando uma Waters 2D Acquity UPLC equipado com detectores de disposição de fotodiodo e fluorescência (FLR) e interface com um espectrômetro de massa Waters Synapt G2-S (condições MS). Um modo de separação de cromatografia de interação hidrofílica (HILIC) foi usado com uma coluna Waters UPLC Glycan BEH Amida, 150 x 2,1 mm, 1,7 μm. A temperatura da coluna foi definida para 60°C e a temperatura do autoamostrador foi definida para 5°C. O volume de injeção foi de 50 μL. A faixa de varredura da matriz de fotodiodo foi de 190 a 700 nm. A FLR foi definida para excitação de 265 nm, emissão 425 nm para glicanas marcadas por RapiFluor e excitação 274 nm, e emissão 303 nm para tirosina presente nos glicopeptídeos. A taxa de fluxo inicial foi de 0,4 mL/min com a fase móvel A compreendendo de formiato de amônio a 100 mM (pH 4,4) e fase móvel B sendo acetonitrila.
8.3 Condições de MS
[00581] Experimentos de cromatografia líquida/espectrometria de massa (LC/MS) foram conduzidos usando um espectrômetro de massa Waters Synapt G2-S. A faixa de varredura foi a relação de massa para carga de 100-2400 para análises de modo de íon positivo e negativo. O tempo de varredura foi de 1s, e glu-fibrinopeptídeo B foi constantemente infundido (2 μL/min) como um calibrante ("massa de bloqueio"). A voltagem capilar foi definida para 2,5 kV, com uma temperatura de fonte de 120°C e temperatura de dessolvação de 500°C. O fluxo de gás nebulizador de nitrogênio foi definido para 700 l/h.
8.4 SEC-MS Nativo
[00582] Sistema de classe ACQUITY UPLC I (Waters, Milford, MA) foi acoplado a Espectrômetro de massa Orbitrap quadrupolo híbrido Q Exactive HF (Thermo Scientific, Bremen, Alemanha) para todas as análises SEC-MS online. Coluna ACQUITY UPLC Protein BEH SEC (200Â, 1,7 μm, 4,6 x 300 mm) foi definida a 30°C e usada para separação de proteína. A fase móvel foi de acetato de amônio a 100 mM em pH 6,8. Cada separação foi de 30 minutos com uma taxa de fluxo de 0,3 mL/min, e a quantidade de injeção foi definida para 40 μg. Os seguintes parâmetros MS foram usados para aquisição dos dados de SEC-nano-ESI-MS on-line. Cada aquisição foi de 25 minutos começando imediatamente após a injeção da amostra. As amostras desglicosiladas foram ionizadas em modo positivo com voltagem de spray de 3 kV, temperatura capilar de 200°C, e nível RF de 70 S-lens. CID em-fonte foi definida a 75 eV. Varreduras de MS Completas foram adquiridas a 15 K de força de resolução com faixa de massa entre m/z 2000-8000. Um tempo de injeção máximo de 100 ms, valor alvo de controle de ganho automático de 3e6, e 10 microvarreduras foram usadas para varreduras MS completas.
8.5 Mapeamento de Peptídeo
[00583] Preparação de amostra para Mapeamento de Peptídeo. Redução foi obtida pela adição de 500 mmol/L de ditiotreitol (DTT) a uma concentração final de 5 mmol/L seguida pela incubação a 4°C durante 60 minutos. Alquilação foi realizada adicionando 500 mmol/L de iodoacetamida (IAM) a uma concentração final de 10 mmol/L e incubando a 4°C durante 60 minutos no escuro. O tampão de desnaturação foi trocado por tampão de digestão (1 mol/L ureia em 0,1 mol/L de Tris, pH 7,8) usando colunas de dessalinação de exclusão de tamanho Zeba™ Spin 7 K MWCO (P/N 89882) (Thermo Scientific, Waltham, MA) de acordo com as instruções do fabricante. Tripsina suína recombinante (adquirida da Sigma, Cat # 03708985001) foi adicionada em uma relação de massa de 1:18 (enzima:amostra) (com base na concentração de proteína MiniTrap de VEGF como medido por espectrometria UV-Vis após troca de tampão), a concentração de proteínas MiniTrap de VEGF foi ajustada para 0,5 μg/μL e a digestão deixada prosseguir durante uma incubação de 4 horas a temperatura ambiente. Quando a digestão foi concluída, 0,1% de ácido fórmico em água grau LC-MS foi adicionado em uma relação de 1:1 de volume. As digestões foram armazenadas a -80°C até análise.
[00584] Análise LC-MS/MS de digestões trípticas. Um ou mais 2,5 μg (10 μL) de digestões de peptídeo foram carregados por meio de autoamostrador sobre uma coluna C18 fechada em um forno de coluna com termostato ajustado para 40 °C. As amostras foram mantidas a 7°C enquanto enfileiradas para injeção. O método cromatográfico foi iniciado com 98% de fase móvel A (0,1% de fração de volume de ácido fórmico em água) e 2% de fase móvel B (0,1% de fração de volume de ácido fórmico em acetonitrila) com a taxa de fluxo definida em uma constante de 0,200 mL/min. Após uma lavagem de 10 min, os peptídeos foram eluídos em um gradiente de 110 min em que o conteúdo da fase móvel B aumentou a uma taxa de 0,39% por minuto para atingir uma composição final compreendendo 45% de fase móvel B. Antes da injeção da amostra seguinte, a coluna foi lavada durante 15 minutos com 97% de fase móvel B, em seguida equilibrada a 98% de fase móvel A durante 25 minutos. O eluato foi desviado para resíduos durante os primeiros 1,5 minutos e os 5 minutos finais da execução. Peptídeos eluídos da coluna de cromatografia foram analisados por absorção de UV a 214 nm seguida por espectrometria de massa na LTQ Orbitap Elite ou Discovery XL. Dados de Mapeamento de Peptídeo Replicado foram coletados para as amostras PS 8670 e RM 8671 para incluir três análises MS (MS/MS) e uma análise apenas MS cada. As análises MS/MS foram realizadas para identificação de peptídeo em modo dependente dos dados em que um ciclo de experimentos consistiu em uma varredura MS completa de 300 m/z a 2000 m/z seguida por cinco eventos MS/MS sequenciais realizados no primeiro ao quinto íons mais intensos detectados em uma contagem limítrofe mínima de 500 na varredura de MS iniciando nesse ciclo. O alvo de AGC de espectrometria de massa sequencial (MSn) foi definido a 1E4 com microvarreduras = 3. A armadilha de íon foi usada em modo centroide em taxa de varredura normal para analisar fragmentos MS/MS. Varreduras MS completas foram coletadas em modo de perfil usando o analisador FTMS de alta resolução (R = 30,000) com um alvo AGC de varredura completa de 1E6 e microvarreduras = 1. Íons foram selecionados para MS/MS usando uma amplitude de isolamento de 2 Da, em seguida fragmentados por dissociação induzida por colisão (CID) com gás hélio usando uma energia CID normalizada de 35, uma ativação Q de 0,25 e um tempo de ativação de 10 msec. Um estado de carga padrão foi definido a z = 2. Massas dependentes dos dados foram colocados na lista de exclusão durante 45s se o íon precursor desencadeou um evento duas vezes dentro de 30s; a amplitude de massa de exclusão foi definida a ±1 Da. Rejeição de estado de carga foi possibilitada para estados de carga não atribuídos. Uma lista de massa de rejeição incluiu contaminantes comuns a 122,08 m/z, 185,94 m/z, 355,00 m/z, 371,00 m/z, 391,00 m/z, 413,30 m/z, 803,10 m/z, 1222,10 m/z, 1322,10 m/z, 1422,10 m/z, 1522,10 m/z, 1622,10 m/z, 1722,10 m/z, 1822.10 m/z, e 1922,10 m/z. Análises apenas MS foram realizados para a geração do mapa de peptídeo não reduzido de TIC e mapas reduzidos.
8.6 Resultados
[00585] Estruturas de construções MiniTrap de VEGF. Estrutura de MiniTraps de VEGF MT1, MT5 e MT6 são representadas nas FIGURA 40, FIGURA 41, FIGURA 43 e FIGURA 44.
[00586] Análise de massa inicial usando SEC-MS confirmou as identidades de todas as três moléculas em nível de proteína intacto após desglicosilação (FIGURA 42). A Cromatografia de Íon Total (TIC) da análise de SEC-MS Nativa demonstra a detecção de uma molécula MiniTrap de VEGF intactas em torno de 12 a 13 minutos. A expansão da região de baixo peso molecular (LMW) da TIC mostrou a presença de impurezas de LMW em todas as três amostras de proteína.
[00587] Os espectros de massa desconvoluídos para as MiniTraps de VEGF também confirmaram sua identidade e forneceram dados para elucidação das maiores PTMs presentes nas amostras compreendendo MT1 e MT5 (FIGURA 43), que são dímeros e MT6 (FIGURA 44) que é uma proteína de cadeia única.
[00588] Análise de amostra de MT1. As espécies de LMW identificadas da TIC da análise de SEC-MS das amostras compreendendo MT1 foram extraídas para examinar três distintas impurezas LMW - LMW1, LMW2 e LMW3 (FIGURA 45A e FIGURA 45B). Espécies LMW1 compreenderam uma espécie truncada de aflibercepte. Espécies LMW2 compreenderam a impureza Fc presente na amostra da clivagem de aflibercepte que foi realizada para produzir MiniTrap. Espécies LMW3 compreendiam um monômero possivelmente clivado da molécula MT1 (dímero).
[00589] Amostra MT1 não mostrou a presença de enzima FABRICATOR, que foi usada para clivar aflibercepte para formar uma proteína MiniTrap. A enzima, se presente, é detectada em torno de 11,5 e 12,5 minutos. Nenhum tal pico foi detectado durante a análise SECMS da amostra MT1 (FIGURA 46).
[00590] Análise de amostra MT5. As espécies de LMW identificadas da TIC da análise de SEC-MS das amostras compreendendo MT5 foram extraídas para examinar a presença de duas impurezas LMW distintas - LMW1 e LMW2 (FIGURA 47).
[00591] Análise de amostra MT6. As espécies de LMW identificadas da TIC da análise de SEC-MS das amostras compreendendo MT1 foram extraídas para examinar a presença de três impurezas LMW distintas - LMW1, LMW2 e LMW3 (FIGURA 48). Espécies LMW2 compreendiam um fragmento da MT6 em que a clivagem produziu o fragmento de MiniTrap de VEGF com o ligante G4S (SEQ ID NO: 111. Espécies LMW5 compreendiam um fragmento da MT6 em que a clivagem ocorreu imediatamente antes ou após o ligante G4S (SEQ ID NO: 111).
[00592] Os glicanos na amostra MT6 foram identificados por sua massa e ordem de eluição no método de cromatografia HILIC usando o valor da unidade de glicose iniciado por Waters e the National Institute for Bioprocessing Research e Training (Dublin, Ireland) (FIGURA 49A e FIGURA 49B).
[00593] Quantificação de Tiol Livre. Resíduos de Cisteína das construções MiniTrap de VEGF podem estar envolvidos na formação de ligações de dissulfeto intra- e intermolecular ou eles podem existir como tióis livres. A presença de ligações de sulfeto em peptídeos e proteínas foi mostrada impor rigidez conformacional sobre uma proteína. Tióis podem ser detectados por uma variedade de reagentes e técnicas de separação. A análise das três construções MiniTrap de VEGF quanto a um nível muito baixo de tióis livres é mostrada na Tabela 8-1.Tabela 8-1.
[00594] Quantificação de Trissulfeto. Similar a tióis livres em resíduos Cys das construções MiniTrap de VEGF, ligações de trissulfeto podem influenciar a estrutura da proteína. A análise das três construções MiniTrap de VEGF sob condições com nível muito baixo de tióis livres é mostrada na Tabela 8-2. Tabela 8-2.
[00595] Dissulfeto intracadeia na região de articulação. Ligações de dissulfeto mal pareadas na região de articulação podem ter implicações sobre a estrutura, função e estabilidade das construções MiniTrap de VEGF. A análise das três construções MiniTrap de VEGF quanto a uma muito baixa ou nenhuma ligação de dissulfeto intracadeia na região de articulação das construções MiniTrap de VEGF [THTC*PPC*PAPELLG, C* mostra onde a ligação de sulfeto intracadeia pode ser formada] (SEQ ID NO: 83) é mostrada na Tabela 8-3.Tabela 8-3.
[00596] Quantificação de isômero de ligação de dissulfeto cruzada e paralela. Para MT1 e MT5, que são dímeros conectados por ligações de dissulfeto paralelas nas regiões de articulação, existe uma possibilidade de isômeros em que as ligações de dissulfeto na região de articulação podem ser cruzadas (FIGURA 50).
[00597] A quantificação de tipos de ligação de dissulfeto, paralela versus cruzada, mostrou que a proteína recombinantemente expressa de MT5 teve um nível ligeiramente maior de ponte de dissulfeto cruzada na região de dobradiça Fc em comparação com a MT1 - que é uma molécula digerida FabRICATOR (Tabela 8-4).Tabela 8-4.Tabela 8-5.
[00598] Avaliação de PTMs em todas as três construções MiniTrap de VEGF mostrou níveis comparáveis de PTMs (Tabela 8-5). A desamidação observada a Asn84 para formar sucinimida foi na faixa de cerca de 3,1 a 3,2% e para formar ácido aspártico/ácido isoaspártico foi de 18,9 a 21,9%. Oxidação de diversos resíduos de metionina (por exemplo, Met10, Met 20m Met163 e Met192) foi observada na faixa de cerca de 0,7 a 6,8% para todas as três construções MiniTrap de VEGF. MT6, que, ao contrário de MT1 e MT5, compreende um ligante, mostrou oxidação adicional de resíduos de metionina no ligante (por exemplo, Met245 e Met255). Cerca de 0,1% e 2,0% da glicina C-terminal (Gly211) em MT1 e MT5 mostrou uma perda de glicina. Isto não foi observado para MT6, que não possui uma glicina C-terminal.
[00599] Modificações do produto final de glicação avançada relacionada com a glicação de arginina e lisina. Glicação das construções MiniTrap de VEGF pode alterar sua estrutura e função, levando à atividade anti-VEGF prejudicada.Tabela 8-6.
[00600] Avaliação de modificações em todas as três construções MiniTrap de VEGF mostrou níveis comparáveis (Tabela 8-6).
[00601] Sítios modificados. Os sítios modificados nas construções MiniTrap de VEGF, como elucidado pela análise de massa intacta de acordo com a Seção 8.4, foram confirmados e quantificados usando Mapeamento de Peptídeo reduzido como ilustrado na Seção 8.5 (Tabela 8-7). O sítio T90N91 para sequência de peptídeo TNYLTHR (SEQ ID NO: 21), o ** representa que a asparagina foi convertida em ácido aspártico após truncação, enquanto para o sítio N99T100 a sequência de peptídeo QTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEK (SEQ ID NO: 19), o * representa um nível elevado de clivagem não específica por tripsina. Estes dois sítios de truncação foram verificados formar impurezas de espécie LMW durante avaliação de MT1 e MT5. A truncação em M245Y246 foi verificada apenas em MT6 que teve o único ligante e foi responsável pela impureza de espécie LMW2 durante a preparação de MT6.Tabela 8-7.
[00602] Quantificação de ocupação de glicosítios. N-glicosilação é um PTM comum. Caracterização da N-glicosilação específica do sítio incluindo macro heterogeneidade (ocupação do sítio de glicosilação) e micro heterogeneidade (estrutura de glicano sítio específica) de N- glicano é importante para o entendimento de biossíntese e função de glicoproteína. A extensão de glicosilação pode mudar dependendo de como a proteína é expressa. Os níveis de glicosilação em N36 foram similares para todas as três MiniTraps de VEGF (Tabela 8-8 e FIGURA 51). Similarmente, os níveis de glicosilação em N68 foram também similares para todas as três MiniTraps de VEGF (Tabela 8-8 e FIGURA 52). Os níveis de glicosilação em N123 foram também similares para todas as três MiniTraps de VEGF (Tabela 8-8 e FIGURA 53), mas manose-5 foi verificada ser elevada na preparação MT1. Para as construções MiniTrap de VEGF, glicosilação em Asn196 foi inferior para MT5 e MT6, em comparação com MT1 (Tabela 8-8 e FIGURA 54). Adicionalmente, a manose-5 foi também elevada para a preparação MT1 do que as preparações MT5 e MT6.Tabela 8-8.
[00603] Análise de N-glicanos. A glicosilação em N36 é mostrada na Tabela 8-9. G2F, G2FS, G2FS2 foram os maiores N-glicanos encontrados em todas as três MiniTraps de VEGF. Para glicosilação em N68 mostrada na Tabela 8-10, G2F e G2FS foram os maiores N- glicanos encontrados em todas as três MiniTraps de VEGF. Para glicosilação em N123 que é mostrada na Tabela 8-11, G2F e G2S foram os maiores N-glicanos encontrados em todas as três MiniTraps de VEGF e Mannose-5 foi detectada em altos níveis em MT1 em comparação com MT5 e MT6. Para glicosilação em N196 mostrada na Tabela 8-12, G2, G2S, G2S2 foram os maiores N-glicanos encontrados em todas as três MiniTraps de VEGF e Mannose-5 foi detectada em altos níveis em MT1 em comparação com MT5 e MT6.Tabela 8-9. Tabela 8-10. Tabela 8-11. Tabela 8-12.
[00604] O-Glicanos no ligante para MT6. O ligante GS para MT6 foi avaliado para estudar O-Glicanos em MT6. O-xilosilação foi encontrada sobre resíduos de serina localizados sobre o ligante GS de MT6 (GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSSDTGRPFVEMYS EIPEIIHMTEGR, resíduos de serina sublinhados foram glicosilados) (SEQ ID NO: 98). A composição de O-Glicanos é mostrada na Tabela 8-13.Tabela 8-13.
[00605] Análise de HILIC-FLR-MS. Análise de HILIC-FLR-MS foi realizada para todas as proteínas MiniTrap VEGF como descrito na Seção 8.2.
[00606] A análise mostrou que os Glicanos N-ligados para MT5 e MT6 foram similares mas foram diferentes daqueles obtidos para MT1 (FIGURA 55 mostra cromatogramas em escala real e empilhados, FIGURA 56 mostra cromatogramas em escala real e sobrepostos e FIGURA 57 mostra os cromatogramas em escala real, empilhados e normalizados).
[00607] Finalmente, o percentual de glicosilação, e identificação e quantificação de glicano detalhada para todas as três proteínas MiniTrap de VEGF é listado na Tabela 8-14 e FIGURA 58A-C, respectivamente. Como observado em toda a análise de glicano, o perfil de glicosilação e níveis de manose para MT5 e MT6 são similares, mas diferentes de MT1.Tabela 8-14.
Exemplo 9. Quantificação de Produção e Cor Usando Meio a Montange e Otimização de Processo de Alimentação (A)MQD Não otimizada (Biorreator de Controle)
[00608] A fabricação de MiniTrap descrita no Exemplo 5 foi utilizada.
[00609] Os parâmetros de operação para as etapas de estudo são como conhecido por alguém versado na técnica.
[00610] Média no dia 0= MQD1 e incluíram os seguintes nutrientes, antioxidantes e metais: • Cisteína foi adicionada em uma concentração cumulativa de 8 a 9 mM [221] Metais em Meio de Partida são listados abaixo em 1x a concentração (onde as concentrações são anteriores à adição de inóculo): o Fe = 68-83 micromoles por litro de cultura o Zn = 6-7 micromoles por litro de cultura o Cu = 0,1 a 0,2 micromol por litro de cultura o Ni = 0,5 a 1 micromol por litro de cultura
[00611] Na colheita de MT1, o procedimento de produção como mostrado na FIGURA 59 foi seguido. Os parâmetros de operação para a cromatografia são conhecidos por alguém versado na técnica. Os parâmetros de operação para a captura de afinidade (etapa 3 de FIGURA 59), fluxo direto de afinidade (etapa 5 de FIGURA 59), AEX (etapa 8 de FIGURA 59), e HIC (etapa 9 de FIGURA 59) são descritos na Tabela 9-1. A clivagem proteolítica de aflibercepte seguindo a etapa de captura de afinidade e filtração foi realizada usando o procedimento como descrito no Exemplo 1.2.Tabela 9-1.
[00612] A Tabela 9-2 mostra a quantificação de cor dos pools obtidos realizando várias etapas cromatográficas. A quantificação de cor foi realizada usando amostras do pool tendo uma concentração de proteína de 5 g/L.
[00613] O pool de Captura de Afinidade refere-se ao eluato coletado na realização da etapa de Captura de Afinidade (etapa 3 de FIGURA 59). Pool Enzimático refere-se ao fluxo direto coletado na realização da etapa de clivagem enzimática (etapa 4 de FIGURA 59). Pool de fluxo direto de afinidade refere-se ao fluxo direto coletado na realização da etapa de fluxo direto de afinidade (etapa 5 de FIGURA 59) e eluato de fluxo direto de afinidade refere-se ao eluato coletado na realização da etapa de fluxo direto de afinidade (etapa 5 de FIGURA 59). Pool AEX e Tira AEX refere-se ao fluxo direto e frações descartadas obtidas na realização da etapa de cromatografia de troca de ânion (etapa 8 de FIGURA 59). Pool HIC refere-se ao fluxo direto coletado na realização da etapa de cromatografia de interação hidrofóbica (etapa 9 de FIGURA 59).
[00614] Cada etapa, como observado na Tabela 9-2, mostra uma redução em coloração (como observado a partir da redução em valores b* dos pools). Por exemplo, na realização de cromatografia de fluxo direto de afinidade, a fração de fluxo direto tem um valor de b* de 2,16 (reduzido de um valor b* de 2,52 para o fluxo direto coletado da etapa de captura de afinidade). O fluxo direto e lavagem seguindo a separação AEX também reduziu a coloração, como observado pela redução no valor b* de 2,16 a 0,74. Como esperado, o descarte da coluna AEX levou a uma amostra com uma cor amarelo-marrom que foi significantemente mais intensa do que a coloração do fluxo direto e lavagem seguindo a separação AEX como observado a partir dos valores b* (8,10 versus 0,74). Por último, uma etapa HIC produziu uma outra redução em cor (o valor b* pode ser normalizado para 5 g/L de concentração de proteína do valor b* obtido para o pool HIC a 28,5 g/L de concentração de proteína).Tabela 9-2. Quantificação de Cor de Amostras em Várias Etapas de Produção(B)MQD otimizado (Pouca Cisteína, Poucos Metais e Biorreator de Antioxidantes Aumentados)
[00615] O efeito de redução da concentração de cisteína, redução da concentração de metais, e aumento de antioxidantes na coloração foi avaliado usando os seguintes protocolos: Média no dia 0 = MQD1 o Cisteína foi adicionada em uma concentração cumulativa de 5 a 6mM
[00616] Antioxidantes foram adicionados a MQD1 para alcançar as seguintes concentrações cumulativas (onde as concentrações são anteriores à adição do inóculo): o Taurina = cultura a 10 mM o Glicina = cultura a 10 mM o Ácido ascórbico = cultura a 0,0024 mM o Vitamina C (ácido ascórbico) = cultura a 0,028 mM
[00617] Metais em Meio de Partida são listados abaixo para o Nível 1x. o Fe = 68 a 83 micromoles por litro de cultura o Zn = 6 a 7 micromoles por litro de cultura o Cu = 0,1 a 0,2 micromol por litro de cultura o Ni = 0,5 a 1 micromol por litro de cultura. o A redução de todos os metais incluídos usando 0,25x as concentrações mencionadas acima para o meio.
[00618] Na colheita da amostra de MT1, o procedimento de produção como mostrado na FIGURA 59 foi seguido. Os parâmetros de operação para a cromatografia são conhecidos por alguém versado na técnica. Os parâmetros de operação para a captura de afinidade, fluxo direto de afinidade, e HIC são descritos na Tabela 9-1. A clivagem proteolítica de aflibercepte seguindo a etapa de captura de afinidade e filtração foi realizada usando o procedimento como descrito no Exemplo 1.2.
[00619] A Tabela 9-3 mostra a quantificação de cores dos Pools obtidos na realização das várias etapas cromatográficas. A quantificação da cor foi realizada usando amostras do Pool com uma concentração de proteína de 5 g/L. As etapas, conforme visto na Tabela 9-3, proporcionaram uma produção semelhante à observada para as etapas na Tabela 9-2.Tabela 9-3. Quantificação de cores de amostras em várias etapas de produção de MiniTrap
[00620] Comparando a Tabela 9-2 e a Tabela 9-3, é evidente que a "Condição do Biorreator com Baixo Teor de Cisteína, Baixo Teor de Metais e Antioxidantes Aumentados" tinha cor inferior no Pool de captura de afinidade (valor de b* de 1,77) em comparação com "Condição do Biorreator de Controle" (valor de b* 2,52).
[00621] Uma amostra de MT com uma concentração de 160 g/L, onde a MT é formada usando as etapas listadas na Tabela 9-2 e Tabela 9-3, está prevista ter um valor de ab* de 13,45 para a "Condição do Biorreator com Baixo Teor de Cisteína, Baixo Teor de Metais e Antioxidantes Aumentados "e valor de ab* de 17,45 para a "Condição do Biorreator de Controle". Uma redução de 23% na cor é alcançada por meio da otimização dos meios a montante e feeds. Da mesma forma, uma amostra de MT com uma concentração de 110 g/L, onde a MT é formada usando as etapas listadas na Tabela 9-2 e Tabela 9-3, é prevista ter um valor de ab* de 9,25 para a "Condição do Biorreator com Baixo Teor de Cisteína, Baixo Teor de Metais e Antioxidantes Aumentados" e valor de ab* de 17,45 para a "Condição do Biorreator de Controle" e valor de ab* de 12 para a "Condição do Biorreator de Controle ".
[00622] Para entender como cada operação da unidade de produção contribui para a redução da cor, o valor de b* para cada intermediário do processo de produção como uma porcentagem da cor do pool de captura de afinidade foi calculado (Tabela 9-4).Tabela 9-4.
[00623] A operação da unidade AEX fornece a maior redução de cor (alteração de 1,08 a 1,42 em b*), enquanto a operação da unidade HIC fornece alguma redução de cor adicional (alteração de 0,08 a 0,19 em b*). As operações unitárias avaliadas removem em geral 76,3% - 78,2% da cor presente no pool de captura de afinidade.
[00624] A cor de vários intermediários do processo de produção para "Condição do biorreator de controle" e "Condição do Biorreator com Baixo Teor de Cisteína, Baixo Teor de Metais e Antioxidantes Aumentados" também foram estudados para a porcentagem de 2-oxo- histidinas e porcentagem de oxotriptofanos no oligopeptídeos que foram gerados por digestão com protease, conforme medido por espectrometria de massa como mostrado na Tabela 9-5 e Tabela 9-6, respectivamente. O mapeamento de peptídeos foi realizado conforme descrito no Exemplo 3.
[00625] Com referência à Tabela 9-5, ao comparar os níveis de oxidação de histidina nos pools em diferentes etapas de produção, é evidente que a abundância relativa da porcentagem de níveis de oxidação de histidina para MT formado reduz no pool à medida que o processo de produção avança. Por exemplo, para H209 na "Condição do biorreator de controle", o nível de oxidação de histidina percentual foi de 0,062 para o pool de clivagem enzimática e isso foi reduzido para 0,029 para o fluxo direto de AEX e ainda reduzido para 0,020 para o pool de HIC. Da mesma forma, para H209 na "Condição do Biorreator com Baixo Teor de Cisteína, Baixo Teor de Metais e Antioxidantes Aumentados", o nível de oxidação de histidina percentual foi de 0,039 para o pool de clivagem enzimática e foi reduzido para 0,023 para o fluxo direto de AEX e posteriormente reduzido para 0,016 para o pool de HIC. Assim, a estratégia de produção levou a uma redução na porcentagem dos níveis de oxidação da histidina na MT. À medida que a coloração foi reduzida, a presença de alguns dos resíduos oxidados na amostra também diminuiu. Semelhante à oxidação da histidina, os níveis de oxidação do triptofano também foram rastreados para os pools em diferentes etapas de produção para a "Condição do biorreator de controle" e "Condição do Biorreator com Baixo Teor de Cisteína, Baixo Teor de Metais e Antioxidantes Aumentados" (Tabela 9-6).Tabela 9-5 Tabela 9-6.

Claims (36)

1. Método para produzir aflibercepte obtido de uma célula hospedeira cultivada em um meio quimicamente definido (MQD), caracterizado pelo fato de que compreende: (a) cultivar a referida célula hospedeira no referido MQD sob condições adequadas sendo que a referida célula hospedeira expressa o referido aflibercepte, sendo que a concentração cumulativa de cobre no referido MQD é menor ou igual a 0,8 μM e a concentração cumulativa de níquel no referido MQD é menor ou igual a 0,4 μM e um ou mais dos seguintes: i) a concentração cumulativa de ferro no referido MQD é menor ou igual a 55,0 μM; ii) a concentração cumulativa de zinco no referido MQD é menor ou igual a 56,0 μM; iii) a concentração cumulativa de cisteína no referido MQD é menor ou igual a 10,0 mM; e iv) o referido MQD inclui antioxidantes sendo que a concentração cumulativa de um antioxidante é de 0,001 mM a 10,0 mM para qualquer antioxidante único; e (b) colher aflibercepte produzido pela referida célula hospedeira.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida colheita tem uma cor não mais amarelo- marrom do que o padrão de cor europeu BY2, sendo que a concentração de aflibercepte é de 5,0 g/L.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido antioxidante é taurina, hipotaurina, glicina, ácido tióctico, glutationa, colina, hidrocortisona, vitamina C, vitamina E ou combinações dos mesmos.
4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o cultivo da referida célula hospedeira no referido MQD aumenta o título do referido aflibercepte colhido em comparação com um MQD, em que a concentração cumulativa de cobre no referido MQD é superior a 0,8 μM.
5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o título de aflibercepte, a concentração de células viáveis, a viabilidade, a amônia ou osmolalidade estão inalterados.
6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida célula hospedeira é selecionada do grupo que consiste em CHO, NS0, Sp2/0, célula renal embrionária e BHK.
7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida colheita compreende uma ou mais variantes de aflibercepte, em que as referidas variantes têm pelo menos um resíduo de aminoácido oxidado.
8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o referido resíduo de aminoácido oxidado é selecionado do grupo que consiste em metionina, triptofano, histidina, fenilalanina, tirosina e uma combinação dos mesmos.
9. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a referida variante de aflibercepte consiste em um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71 e combinações das mesmas.
10. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a colheita tem uma cor que é: a) não mais amarelo-marrom do que o padrão de cor europeu BY2; b) não mais amarelo-marrom do que o padrão de cor europeu BY3; c) não mais amarelo-marrom do que o padrão de cor europeu BY4; d) não mais amarelo-marrom do que o padrão de cor europeu BY5; e) entre o padrão europeu de cores BY2 e BY3; ou f) entre o padrão europeu de cores BY2 e BY4, e em que a concentração de aflibercepte na colheita é de 5,0 g/L.
11. Método para produzir aflibercepte colhido de uma célula hospedeira cultivada em um meio quimicamente definido (MQD), caracterizado pelo fato de que compreende: (a) fornecer uma célula hospedeira geneticamente modificada para expressar aflibercepte; (b) cultivar a referida célula hospedeira no referido MQD sob condições adequadas nas quais a referida célula hospedeira expressa o referido aflibercepte, em que a concentração cumulativa de cisteína no referido MQD é menor ou igual a 10,0 mM e a concentração cumulativa de níquel no referido MQD é menor ou igual a 0,4 μM e um ou mais dos seguintes: i. a concentração cumulativa de ferro no referido MQD é menor ou igual a 55,0 μM; ii. a concentração cumulativa de cobre no referido MQD é menor ou igual a 0,8 μM; iii. a concentração cumulativa de zinco no referido MQD é menor ou igual a 56,0 μM; e iv. o referido MQD inclui antioxidantes em que a concentração cumulativa de um antioxidante é de 0,001 mM a 10,0 mM para qualquer antioxidante único; e (c) colher aflibercepte produzido pela referida célula hospedeira.
12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a referida colheita tem uma cor não mais amarelo- marrom do que o padrão europeu de cores BY2, em que a concentração de aflibercepte é de 5,0 g/L
13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o referido antioxidante é taurina, hipotaurina, glicina, ácido tióctico, glutationa, colina, hidrocortisona, vitamina C, vitamina E ou combinações dos mesmos.
14. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a referida concentração cumulativa de um antioxidante no referido MQD é de 0,001 mM a 10,0 mM para qualquer antioxidante único e a concentração cumulativa de todos os antioxidantes é de 30,0 mM ou menor que 30,0 mM.
15. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o título de aflibercepte, a concentração de células viáveis, a viabilidade, a amônia ou osmolalidade estão inalterados.
16. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a referida célula hospedeira é selecionada do grupo que consiste em CHO, NS0, Sp2/0, célula renal embrionária e BHK.
17. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a referida colheita compreende uma ou mais variantes de aflibercepte, em que as referidas variantes têm pelo menos um resíduo de aminoácido oxidado.
18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o referido resíduo de aminoácido oxidado é selecionado do grupo que consiste em metionina, triptofano, histidina, fenilalanina, tirosina e uma combinação dos mesmos.
19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o referido resíduo de aminoácido oxidado é histidina.
20. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o referido resíduo de aminoácido oxidado é triptofano.
21. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a referida variante de aflibercepte consiste em um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71 e combinações das mesmas.
22. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o referido antioxidante é taurina, hipotaurina, glicina, ácido tióctico, glutationa, colina, hidrocortisona, vitamina C, vitamina E ou combinações dos mesmos.
23. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a colheita tem uma cor que é: a. não mais amarelo-marrom do que o padrão de cor europeu BY2; b. não mais amarelo-marrom do que o padrão de cor europeu BY3; c. não mais amarelo-marrom do que o padrão de cor europeu BY4; d. não mais amarelo-marrom do que o padrão de cor europeu BY5; e. entre o padrão europeu de cores BY2 e BY3; ou f. entre o padrão europeu de cores BY2 e BY4, e em que a concentração de aflibercepte na colheita é de 5,0 g/L.
24. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que a cor da colheita é caracterizada no espaço de cor CIE L*, a*, b*, onde L* é de 70 a 99, a* é 0 e b* é 20 ou menor que 20 quando a concentração de aflibercepte é de 5,0 g/L.
25. Método para produzir aflibercepte colhido de uma célula hospedeira cultivada em um meio quimicamente definido (MQD), caracterizado pelo fato de que compreende: a. ) fornecer uma célula hospedeira geneticamente modificada para expressar aflibercepte; b. ) cultivar a referida célula hospedeira no referido MQD sob condições adequadas nas quais a referida célula hospedeira expressa o referido aflibercepte, sendo que a concentração cumulativa de níquel no referido MQD é menor ou igual a 0,4 μM, e um ou mais dos seguintes: i. a concentração cumulativa de ferro no referido MQD é menor ou igual a 55,0 μM; ii. a concentração cumulativa de cobre no referido MQD é menor ou igual a 0,8 μM; iii. a concentração cumulativa de zinco no referido MQD é menor ou igual a 56,0 μM; e iv. o referido MQD inclui antioxidantes sendo que a concentração cumulativa de um antioxidante é de 0,001 mM a 10,0 mM para qualquer antioxidante único; e c. ) colher aflibercepte produzido pela referida célula hospedeira, em que a cor da referida colheita é: d. não mais amarelo-marrom do que o padrão de cor europeu BY2; e. não mais amarelo-marrom do que o padrão de cor europeu BY3; f. não mais amarelo-marrom do que o padrão de cor europeu BY4; g. não mais amarelo-marrom do que o padrão de cor europeu BY5; h. entre o padrão europeu de cores BY2 e BY3; ou i. entre o padrão europeu de cores BY2 e BY4, e em que a concentração de aflibercepte na colheita é de 5,0 g/L.
26. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a referida colheita tem uma cor não mais amarelo- marrom do que o padrão de cor europeu BY2, em que a concentração de aflibercepte é de 5,0 g/L.
27. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o referido antioxidante é taurina, hipotaurina, glicina, ácido tióctico, glutationa, colina, hidrocortisona, vitamina C, vitamina E ou combinações dos mesmos.
28. Método, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a referida concentração cumulativa de um antioxidante no referido MQD é de 0,001 mM a 10,0 mM para qualquer antioxidante único e a concentração cumulativa de todos os antioxidantes é de 30,0 mM ou menor que 30,0 mM.
29. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a referida célula hospedeira é selecionada do grupo que consiste em CHO, NS0, Sp2/0, célula renal embrionária e BHK.
30. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a referida colheita compreende uma ou mais variantes de aflibercepte, em que as referidas variantes têm pelo menos um resíduo de aminoácido oxidado.
31. Método, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que o referido resíduo de aminoácido oxidado é selecionado do grupo que consiste em metionina, triptofano, histidina, fenilalanina, tirosina e uma combinação dos mesmos.
32. Método, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que o referido resíduo de aminoácido oxidado é histidina.
33. Método, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que o referido resíduo de aminoácido oxidado é triptofano.
34. Método, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que a referida variante de aflibercepte consiste em um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71 e combinações das mesmas.
35. Método para produzir aflibercepte colhido de uma célula hospedeira cultivada em meio quimicamente definido (MQD), caracterizado pelo fato de que compreende: (a) cultivar a referida célula hospedeira no referido MQD sob condições adequadas nas quais a referida célula hospedeira expressa o referido aflibercepte em que a concentração cumulativa de cisteína no referido MQD é menor ou igual a 10,0 mM e a concentração cumulativa de níquel no referido MQD é menor ou igual a 0,4 μM e um ou mais dos seguintes: i. a concentração cumulativa de ferro no referido MQD é menor ou igual a 55,0 μM; ii. a concentração cumulativa de cobre no referido MQD é menor ou igual a 0,8 μM; iii. a concentração cumulativa de zinco no referido MQD é menor ou igual a 56,0 μM; e iv. o referido MQD inclui antioxidantes em que a concentração cumulativa de um antioxidante é de 0,001 mM a 10,0 mM para qualquer antioxidante único; e (b) colheita de aflibercepte produzido pela referida célula hospedeira.
36. Método para produzir aflibercepte colhido de uma célula hospedeira cultivada em meio quimicamente definido (MQD), caracterizado pelo fato de que compreende: (a) cultivar a referida célula hospedeira no referido MQD sob condições adequadas nas quais a referida célula hospedeira expressa o referido aflibercepte em que a concentração cumulativa de cisteína no referido MQD é menor ou igual a 10,0 mM e a concentração cumulativa de níquel no referido MQD é menor ou igual a 0,4 μM; e (b) colheita de aflibercept produzido pela referida célula hospedeira.
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