JP7846628B2 - バーコード化可能な交換可能ペプチド－ｍｈｃ多量体ライブラリー - Google Patents

バーコード化可能な交換可能ペプチド－ｍｈｃ多量体ライブラリー

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Description

関連出願
本出願は、２０２０年３月３１日に出願された米国仮出願第６３／００３，１７７号に対する優先権を主張し、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
背景
個々のＴ細胞によって認識されるペプチドの識別は、免疫関連疾患の理解および処置、ならびに疾患の予防のためのワクチン開発のために重要である。抗原応答性Ｔ細胞の検出のための技法は、所与のＴＣＲとそのペプチド－ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）認識モチーフとの間の相互作用を活用する。可溶性ＭＨＣ分子を調製する能力は、可溶性ペプチド－ＭＨＣ複合体の調製を可能にし、これは、次いで多量体複合体にすることができる。多量体化ｐＭＨＣ分子を使用するＴ細胞検出は、多種多様な研究および臨床状況において抗原特異的Ｔ細胞を検出するための好ましい方法になっている。
Altman et al. (Science 274:94-96, 1996)が、ペプチドロードＭＨＣクラスＩ（ｐＭＨＣＩ）分子の四量体化がＴ細胞受容体（ＴＣＲ）－ｐＭＨＣ相互作用に対する十分な安定性を提供し、フローサイトメトリーを使用して蛍光標識化ＭＨＣ多量体－結合Ｔ細胞の検出を可能にしたことを示して以来、ＭＨＣ多量体は、抗原応答性Ｔ細胞の検出のために使用されている。しかしながら、ＭＨＣクラスＩ分子は、それらがペプチドとの複合体の一部ではない場合に非常に不安定であるので、ｐＭＨＣＩに基づく技術は、最初、各ペプチドが個々のフォールディングおよび精製手順を必要とする分子の面倒な産生によって制限されていた（Bakker et al., Curr. Opin. Immunol. 17:428-433, 2005）。
より最近になって、共有結合的に連結されたペプチドを有する各種のＭＨＣＩ分子が報告された（例えば、Goldberg et al., J. Cell. Mol. Med. 15:1822-1832, 2011によって概説）。いくつかの種類のｐＭＨＣＩマイクロアレイシステムも開発されているが、ほとんどの研究は、支持する表面を最適化すること、ならびに結合および／または洗浄の間に適用される条件を改変する事に集中していた。これらのシステムの使用はまた、不十分な検出限界、および既存のサイトメトリーに基づく分析と比較した低い再現性に起因して限定的である。例えば、そのようなアレイに基づく戦略に対する一般的な限定は、所与のアレイにおいて提示されるすべての可能性のあるｐＭＨＣ相互作用を追跡するための所与のＴ細胞の傾向である。結果として、細胞調製物中の抗原応答性Ｔ細胞の頻度は、典型的には、頑強な読み取りを可能にするために、＞０．１％である必要がある。
ＭＨＣＩ多量体およびそのライブラリーは、ビオチン化ペプチド－ＭＨＣＩ単量体を使用して調製され、これは次いで、ストレプトアビジン上のビオチン結合部位と会合して、四量体を形成する（例えば、Leisner et al., PLoS One 3(2):e1678, 2008を参照されたい）。ＭＨＣクラスＩライブラリーの作出のために、オリゴヌクレオチドバーコード標識がストレプトアビジンにコンジュゲートされた手法が記載されている。しかしながら、既存の戦略は、大きなライブラリーの容易な産生を限定する複雑なおよび／または費用のかかる手法を含む。例えば、一手法では、個々のストレプトアビジン前駆体が、ビオチン化ペプチド－ＨＬＡ単量体の四量体化の前に、オーバーラップ伸長ＰＣＲによって個々にバーコード化されなければならない（Zhang et al., Nature Biotech. 2018; doi:10.1038.nbt.4282）。別の手法では、高価な試薬であるストレプトアビジン－コンジュゲート化デキストランが、デキストラマーを作出するために使用され、これが、デキストラン骨格にコンジュゲートされたストレプトアビジンを介して、ビオチン化ペプチド－ＨＬＡ単量体およびビオチン化バーコードオリゴヌクレオチドの両方と複合体化される（Bentzen et al., Nature Biotech. 34:10: 1037-1045, 2016）。
ｐＭＨＣＩ四量体を用いる手法と類似して、可溶性ＭＨＣクラスＩＩ分子も、ｐＭＨＣＩＩ四量体を調製するために使用されており、これは、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の抗原特異性の研究において使用されている（例えば、Nepom et al. (2002) Arthrit. Rheumat. 46:5-12；Vollers and Stern (2008) Immunol. 123:305-313；Cecconi et al. (2008) Cytometry 73A:1010-1018において概説される通り）。典型的には、ｐＭＨＣＩＩ多量体を調製するために、可溶性ビオチン化ＭＨＣＩＩ α／β二量体は、組換え的に発現され、次いで、それらのビオチン結合部位を通したストレプトアビジンまたはアビジンへの結合によって四量体化される。次いで、ストレプトアビジンまたはアビジンの蛍光標識化は、フローサイトメトリーによるｐＭＨＣＩＩ多量体と結合するＴ細胞の単離を可能にする。ＭＨＣＩＩ分子の抗原性ペプチドローディングに関して、一手法では、ペプチドは、ＭＨＣＩＩ α／β二量体に共有結合的に付着される。いくつかのグループが、酸性条件下で目的のペプチドと交換され得る共有結合的であるが切断可能な「スタッファー」ペプチドロードｐＭＨＣＩＩを生成している（Day et al., J Clin Invest. 2003;112(6):831-842）。
代替手法では、「空」ＭＨＣＩＩ α／β二量体が、調製され、次いで可溶性ＭＨＣＩＩ結合性ペプチドがロードされる（例えば、Novak et al. (1999) J. Clin. Invest. 104:63-67；Nepom et al. (2002) Arthrit. Rheumat. 46:5-12；Macaubus et al. (2006) J. Immunol. 176:5069-5077を参照されたい）。この手法は、ＭＨＣＩＩ α／β二量体上でのペプチドローディングのより高い多様性を可能にするが、安定な「空」ＭＨＣＩＩ α／β二量体を組換え的に発現する能力は限定的であり、そのため再び、大スケールのｐＭＨＣＩＩ多量体ライブラリーの調製は阻まれる。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ封入体からの再フォールディングによるか、または昆虫細胞もしくは哺乳動物細胞発現による「空」ＭＨＣＩＩ α／β二量体の産生が報告されているが、収率は、ハイスループット法を支持するには低すぎる（Vollers and Stern (2008) Immunology 123: 305-313において概説）。
Altman et al. Science 274:94-96, 1996
したがって、モデル抗原の選択に制限される分析よりもむしろゲノム規模での各種の方法、例えば、Ｔ細胞認識の分析のためのＴ細胞特異性のスクリーニングにおいて利用され得る、バーコード化ライブラリーを含むペプチド－ＭＨＣライブラリーを生成する効率的で費用効率がよい方法に対する必要性が残されている。
概要
本開示は、そのライブラリーを含む、バーコード化ペプチドロードＭＨＣ（ｐＭＨＣ）多量体（例えば、四量体）を産生するための方法を提供する。この方法は、容易なペプチド交換および多量体のバーコード標識化を可能にして、それによって大きなｐＭＨＣ多量体ライブラリーの効率的な調製を可能にする効率的な反応条件を使用して、短い期間内でのｐＭＨＣ多量体の高いタンパク質収率を提供する。したがって、本明細書に記載される組成物および方法は、ｐＭＨＣ多量体が有用であるすべての場合に、日常的な実験室での研究、ならびに大スケールでの工業的および臨床的適用のために好適である。一実施形態では、ｐＭＨＣ多量体は、ｐＭＨＣクラスＩ（ｐＭＨＣＩ）多量体であり、これは、ＣＤ８＋Ｔ細胞抗原認識の分析のために有用である。別の実施形態では、ｐＭＨＣ多量体は、ｐＭＨＣクラスＩＩ（ｐＭＨＣＩＩ）多量体であり、これは、ＣＤ４＋Ｔ細胞抗原認識の分析のために有用である。本発明のＭＨＣ多量体は、ＭＨＣ単量体と多量体化ドメインとの間の共有結合的連結を含み、それによって多量体化ドメイン上の非共有結合部位をバーコード標識化のために容易に使用することを可能にする。
一態様では、本開示は、２つまたはそれよりも多くのペプチドロードＭＨＣ（ｐＭＨＣ）単量体を含むペプチドロードＭＨＣ（ｐＭＨＣ）多量体を産生する方法であって、ｐＭＨＣ単量体のそれぞれが、多量体化ドメインに共有結合的に連結されている、方法を提供する。特に、ｐＭＨＣ単量体は、ビオチン／ストレプトアビジンまたはビオチン／アビジン相互作用ではない化学的連結を通して多量体化ドメインに連結され、この連結は、効率的なバルク化学反応において達成される。この化学的連結は、ｐＭＨＣ単量体上のコンジュゲーション部分および多量体化ドメインの使用により達成され、次いでこれらの部分が反応して、化学的連結を形成する。次いで、ペプチド交換およびオリゴヌクレオチドバーコード標識化は、ｐＭＨＣ多量体上で容易に行うことができ、効率的な大スケールのｐＭＨＣライブラリー産生を可能にする。
したがって、一態様では、本開示は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）多量体を産生する方法であって、
（ａ）２つまたはそれよりも多くのＭＨＣ単量体を提供するステップであって、各単量体が、コンジュゲーション部分を含む、ステップ；
（ｂ）多量体化ドメインを提供するステップであって、多量体化ドメインの各サブユニットが、コンジュゲーション部分を含む、ステップ；
（ｃ）ＭＨＣ単量体と多量体化ドメインとの間の共有結合的コンジュゲーションのために十分な条件下でＭＨＣ単量体および多量体化ドメインを組み合わせて、ＭＨＣ多量体を産生するステップ
を含む、方法を提供する。
一実施形態では、ＭＨＣ単量体は、ＭＨＣクラスＩ単量体である。別の実施形態では、ＭＨＣ単量体は、ＭＨＣクラスＩＩ単量体である。ある特定の実施形態では、ＭＨＣ単量体は、多量体化ドメインと組み合わせる前に、プレースホルダペプチドがロードされている。
一実施形態では、多量体化ドメインは、非共有結合部位を含み、方法は、ＭＨＣ多量体が、多量体化ドメインの非共有結合部位と結合するオリゴヌクレオチドバーコードで標識されていることをさらに含む。
一実施形態では、多量体は、四量体である。一実施形態では、多量体化ドメインは、ストレプトアビジンである。一実施形態では、多量体化ドメインは、ストレプトアビジンであり、オリゴヌクレオチドバーコードは、ストレプトアビジンのビオチン結合部位と結合する。
ＭＨＣ単量体と多量体化ドメインとの間の共有結合的連結に関して、一実施形態では、各ＭＨＣ単量体のコンジュゲーション部分は、Ｘを含み、多量体化ドメインの各サブユニットのコンジュゲーション部分は、Ｙを含み、
（ｉ）Ｘは、末端アルキンであり、Ｙは、アジドである；
（ｉｉ）Ｘは、アジドであり、Ｙは、末端アルキンである；
（ｉｉｉ）Ｘは、歪んだアルキンであり、Ｙは、アジドである；
（ｉｖ）Ｘは、アジドであり、Ｙは、歪んだアルキンである；
（ｖ）Ｘは、ジエンであり、Ｙは、ジエノフィルである；
（ｖｉ）Ｘは、ジエノフィルであり、Ｙは、ジエンである；
（ｖｉｉ）Ｘは、チオールであり、Ｙは、アルケンである；または
（ｖｉｉｉ）Ｘは、アルケンであり、Ｙは、チオールである。
一実施形態では、アジドは、銅キレート化アジドである。一実施形態では、銅キレート化アジドは、ピコリルアジドである。
一実施形態では、各ＭＨＣ単量体のコンジュゲーション部分および多量体化ドメインの各サブユニットのコンジュゲーション部分は、ｓｏｒｔａｇモチーフを含む。
一実施形態では、各ＭＨＣ単量体のコンジュゲーション部分および多量体化ドメインの各サブユニットのコンジュゲーション部分は、インテイン配列を含む。
一実施形態では、方法は、プレースホルダペプチドを、ＭＨＣ単量体と結合するレスキューペプチドエピトープと交換するステップをさらに含む。
別の態様では、本開示は、
（ａ）２つまたはそれよりも多くのＭＨＣ単量体；
（ｂ）２つまたはそれよりも多くのサブユニットを含み、少なくとも１つの非共有結合部位を有する多量体化ドメイン；および
（ｃ）オリゴヌクレオチドバーコード
を含むバーコード標識化ＭＨＣ多量体であって、
各ＭＨＣ単量体が、共有結合的連結を通して多量体化ドメインのサブユニットに結合されており、
オリゴヌクレオチドバーコードが、多量体化ドメイン上の非共有結合部位への非共有結合によって多量体化ドメインに結合されている、
ＭＨＣ多量体に関連する。
一実施形態では、ＭＨＣ多量体は、多量体の各ＭＨＣ単量体上にロードされたＭＨＣ結合性ペプチドをさらに含む。一実施形態では、ＭＨＣ単量体は、ＭＨＣクラスＩ単量体である。一実施形態では、ＭＨＣ単量体は、ＭＨＣクラスＩＩ単量体である。
一実施形態では、ＭＨＣ多量体は、四量体である。一実施形態では、多量体化ドメインは、ストレプトアビジンである。一実施形態では、オリゴヌクレオチドバーコードは、ストレプトアビジン上のビオチン結合部位に非共有結合されている。
ＭＨＣ多量体の一実施形態では、各ＭＨＣ単量体は、コンジュゲーション部分Ｘを含み、多量体化ドメインの各サブユニットは、コンジュゲーション部分Ｙを含み、
（ｉ）Ｘは、末端アルキンであり、Ｙは、アジドである；
（ｉｉ）Ｘは、アジドであり、Ｙは、末端アルキンである；
（ｉｉｉ）Ｘは、歪んだアルキンであり、Ｙは、アジドである；
（ｉｖ）Ｘは、アジドであり、Ｙは、歪んだアルキンである；
（ｖ）Ｘは、ジエンであり、Ｙは、ジエノフィルである；
（ｖｉ）Ｘは、ジエノフィルであり、Ｙは、ジエンである；
（ｖｉｉ）Ｘは、チオールであり、Ｙは、アルケンである；または
（ｖｉｉｉ）Ｘは、アルケンであり、Ｙは、チオールである。
一実施形態では、アジドは、銅キレート化アジドである。一実施形態では、銅キレート化アジドは、ピコリルアジドである。
ＭＨＣ多量体の一実施形態では、各ＭＨＣ単量体および多量体化ドメインの各サブユニットは、コンジュゲーション部分を含み、各コンジュゲーション部分は、ｓｏｒｔａｇモチーフを含む。
ＭＨＣ多量体の一実施形態では、各ＭＨＣ単量体および多量体化ドメインの各サブユニットは、コンジュゲーション部分を含み、各コンジュゲーション部分は、インテイン配列を含む。
さらに別の態様では、本開示は、ＭＨＣクラスＩ多量体を調製する方法に関連する。一実施形態では、ｐＭＨＣＩ多量体を産生する方法であって、（ａ）（ｉ）ＭＨＣＩ重鎖ポリペプチドまたはその機能的断片、（ｉｉ）β２－ミクログロブリンポリペプチドまたはその機能的断片、（ｉｉｉ）コンジュゲーション部分、および（ｉｖ）各ＭＨＣＩ単量体のペプチド結合溝中で結合したプレースホルダペプチドをそれぞれ含む、２つまたはそれよりも多くのプレースホルダペプチドロードＭＨＣＩ（ｐ＊ＭＨＣＩ）単量体を提供するステップ；（ｂ）多量体化ドメインを提供するステップであって、多量体化ドメインの各サブユニットが、コンジュゲーション部分を含む、ステップ；（ｃ）２つまたはそれよりも多くのｐ＊ＭＨＣＩ単量体と多量体化ドメインとの間の共有結合的コンジュゲーションのために十分な条件下でｐ＊ＭＨＣＩ単量体および多量体化ドメインを組み合わせて、ｐ＊ＭＨＣＩ多量体を産生するステップ；ならびに（ｄ）ｐ＊ＭＨＣＩ多量体中のｐ＊ＭＨＣＩ単量体のそれぞれのペプチド結合溝中で結合したプレースホルダペプチドをレスキューペプチドエピトープで置き換えて、ｐＭＨＣＩ多量体を産生するステップを含む、方法が提供される。方法は、多量体を、ｐＭＨＣＩ多量体に、例えばｐＭＨＣＩ多量体の多量体化ドメインに結合する結合性部分を含むバーコード化オリゴヌクレオチドと反応させることによって、ｐＭＨＣＩ多量体をオリゴヌクレオチドバーコードで標識するステップをさらに含むことができる。
別の態様では、バーコード化ペプチドｐＭＨＣＩ多量体を産生する方法であって、
（ａ）（ｉ）ＭＨＣＩ重鎖ポリペプチドまたはその機能的断片、（ｉｉ）β２－ミクログロブリンポリペプチドまたはその機能的断片、（ｉｉｉ）コンジュゲーション部分、および（ｉｖ）各ＭＨＣＩ単量体のペプチド結合溝中で結合したプレースホルダペプチドをそれぞれ含む、２つまたはそれよりも多くのプレースホルダペプチドロードＭＨＣＩ（ｐ＊ＭＨＣＩ）単量体を提供するステップ；
（ｂ）多量体化ドメインを提供するステップであって、多量体化ドメインの各サブユニットが、コンジュゲーション部分を含み、多量体化ドメインが、少なくとも１つの非共有結合部位を含む、ステップ；
（ｃ）２つまたはそれよりも多くのｐ＊ＭＨＣＩ単量体と多量体化ドメインとの間の共有結合的コンジュゲーションのために十分な条件下でｐ＊ＭＨＣＩ単量体および多量体化ドメインを組み合わせて、ｐ＊ＭＨＣＩ多量体を産生するステップ；
（ｄ）ｐ＊ＭＨＣＩ多量体中のｐ＊ＭＨＣＩ単量体のそれぞれのペプチド結合溝中で結合したプレースホルダペプチドをレスキューペプチドエピトープで置き換えて、ｐＭＨＣＩ多量体を産生するステップ；ならびに
（ｅ）オリゴヌクレオチドバーコードを多量体化ドメイン上の前記非共有結合部位に結合させるステップ
を含む、方法が提供される。
さらなる態様では、ｐＭＨＣＩ多量体を産生する方法であって、
（ａ）（ｉ）ＭＨＣＩ重鎖ポリペプチドまたはその機能的断片、（ｉｉ）β２－ミクログロブリンポリペプチドまたはその機能的断片、（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）のＣ末端にコンジュゲーション部分を含むペプチドリンカー、および（ｉｖ）各ＭＨＣＩ単量体のペプチド結合溝中で結合したプレースホルダペプチドをそれぞれ含む、２つまたはそれよりも多くのプレースホルダペプチドロードＭＨＣＩ（ｐ＊ＭＨＣＩ）単量体を提供するステップ；
（ｂ）多量体化ドメインの各サブユニットのＣ末端にコンジュゲーション部分を含むペプチドリンカーを含む多量体化ドメインを提供するステップ；
（ｃ）多量体化ドメインへの２つまたはそれよりも多くのｐ＊ＭＨＣＩ単量体間の共有結合的コンジュゲーションのために十分な条件下でｐ＊ＭＨＣＩ単量体および多量体化ドメインを組み合わせて、ｐ＊ＭＨＣＩ多量体を産生するステップ；ならびに
（ｄ）ｐ＊ＭＨＣＩ多量体中のｐ＊ＭＨＣＩ単量体のそれぞれのペプチド結合溝中で結合したプレースホルダペプチドをレスキューペプチドエピトープで置き換えて、ｐＭＨＣＩ多量体を産生するステップ
を含む、方法が提供される。
任意の好適なｐ＊ＭＨＣ単量体は、本明細書に記載される方法において使用することができる。一実施形態では、ｐ＊ＭＨＣ単量体は、脊椎動物起源のものである。別の実施形態では、ｐ＊ＭＨＣＩ単量体は、ヒトＭＨＣＩ重鎖ポリペプチドまたはその機能的断片、およびヒトβ２－ミクログロブリンポリペプチドまたはその機能的断片を含む。別の実施形態では、その各ｐ＊ＭＨＣＩ単量体は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－ＢまたはＨＬＡ－Ｃである。別の実施形態では、各ｐ＊ＭＨＣＩ単量体は、ＨＬＡ－Ａである。別の実施形態では、各ｐ＊ＭＨＣＩ単量体は、可溶性である。
別の実施形態では、各ｐ＊ＭＨＣＩ単量体のＭＨＣＩ重鎖ポリペプチドまたはその機能的断片は、ＭＨＣＩ α１ドメインを含む。別の実施形態では、各ｐ＊ＭＨＣＩ単量体のＭＨＣＩ重鎖ポリペプチドまたはその機能的断片が、ＭＨＣＩ α１／α２ヘテロ二量体を含む。別の実施形態では、各ｐ＊ＭＨＣＩ単量体のＭＨＣＩ重鎖ポリペプチドまたはその機能的断片は、ＭＨＣＩ α１、α２およびα３ドメインを含む。別の実施形態では、各ｐ＊ＭＨＣＩ単量体のＭＨＣＩ重鎖ポリペプチドまたはその機能的断片は、配列番号２８～１５９に示されるアミノ酸配列のいずれかと少なくとも８０、８５、９０、９５、または９９％同一であるαドメインを含む。
別の実施形態では、各ｐ＊ＭＨＣＩ単量体は、β２－ミクログロブリンドメインを含む。一実施形態では、各ｐ＊ＭＨＣＩ単量体のβ２－ミクログロブリンポリペプチドは、野生型ヒトβ２－ミクログロブリンである。別の実施形態では、β２－ミクログロブリンポリペプチドは、ヒトβ２－ミクログロブリンのアミノ酸配列（配列番号２または１６０に示されるアミノ酸配列など）と少なくとも８０、８５、９０、９５、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
別の実施形態では、各ｐ＊ＭＨＣ単量体は、融合タンパク質である。例えば、一実施形態では、各ｐ＊ＭＨＣ単量体は、ＭＨＣＩ重鎖またはその機能的断片、およびβ２－ミクログロブリンまたはその機能的断片を含む融合タンパク質である。別の実施形態では、ｐ＊ＭＨＣ融合タンパク質は、ＭＨＣＩ重鎖またはその機能的断片とβ２－ミクログロブリンポリペプチドまたはその機能的断片との間にペプチドリンカーを含む。
任意の好適なプレースホルダペプチドは、本明細書に記載される方法において使用することができる。一実施形態では、プレースホルダペプチドは、ＭＨＣＩポリペプチドのフォールディングを促進するペプチドまたはペプチド様化合物である。一実施形態では、プレースホルダペプチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または３５個のアミノ酸である。別の実施形態では、プレースホルダペプチドは、２～２５個のアミノ酸である。別の実施形態では、プレースホルダペプチドは、８～１１個のアミノ酸である。別の実施形態では、プレースホルダペプチドは、９個のアミノ酸である。別の実施形態では、プレースホルダペプチドは、１０個のアミノ酸である。別の実施形態では、プレースホルダペプチドは、ＧＩＬＧＦＶＦＪＬ（配列番号７）を含む。別の実施形態では、プレースホルダペプチドは、ＧＩＬＧＦＶＦＪＬ（配列番号７）からなる。他の実施形態では、プレースホルダペプチドは、配列番号８～２７または２７１～２７９のいずれか１つに示される配列を有する。
別の実施形態では、プレースホルダペプチドは、交換されたペプチドエピトープよりもＭＨＣＩペプチド結合溝に対して低い親和性を有し、ステップ（ｄ）は、競合アッセイにおいて、ｐ＊ＭＨＣＩ単量体を過剰のペプチドエピトープと接触させることを含む。別の実施形態では、プレースホルダペプチドは、交換されたペプチドエピトープよりも約４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、または１５倍低いＫＤを有する。別の実施形態では、プレースホルダペプチドは、交換されたペプチドエピトープよりも約１０倍低いＫＤを有する。別の実施形態では、プレースホルダペプチドは、交換されたペプチドエピトープよりもＭＨＣＩ結合溝に対してより高い親和性を有する。
別の実施形態では、プレースホルダペプチドは、約３０～３７℃の間の温度で不安定であり、ステップ（ｄ）は、ペプチドエピトープの存在下、約３０～３７℃の間の温度（例えば、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、または３７℃）にｐ＊ＭＨＣＩ単量体を曝露することを含む。別の実施形態では、プレースホルダペプチドは、約ｐＨ２．０～５．５の間の酸性ｐＨ（例えば、ｐＨ２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、または５．５）で不安定である。別の実施形態では、ｐ＊ＭＨＣＩ単量体は、ペプチドエピトープの存在下、約ｐＨ２．０～５．５の間のｐＨ（例えば、ｐＨ２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、または５．５）に曝露される。別の実施形態では、プレースホルダペプチドは、約ｐＨ２．０～５．５の間の酸性ｐＨ（例えば、ｐＨ２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、または５．５）で不安定であり、ステップ（ｄ）は、ペプチドエピトープの存在下、約ｐＨ２．０～５．５の間のｐＨ（例えば、ｐＨ２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、または５．５）にｐ＊ＭＨＣＩ単量体を曝露することを含む。
別の実施形態では、プレースホルダペプチドは、約ｐＨ９～１１の間の塩基性ｐＨ（例えば、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、１０、１０．１、１０．２、１０．３、１０．４、１０．５、１０．６、１０．７、１０．８、１０．９、または１１）で不安定である。別の実施形態では、プレースホルダペプチドは、約ｐＨ９～１１の間の塩基性ｐＨ（例えば、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、１０、１０．１、１０．２、１０．３、１０．４、１０．５、１０．６、１０．７、１０．８、１０．９、または１１）で不安定であり、ｐ＊ＭＨＣＩ単量体は、ペプチドエピトープの存在下、約ｐＨ９～１１の間のｐＨ（例えば、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、１０、１０．１、１０．２、１０．３、１０．４、１０．５、１０．６、１０．７、１０．８、１０．９、または１１）に曝露される。別の実施形態では、プレースホルダペプチドは、約ｐＨ９～１１の間の塩基性ｐＨ（例えば、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、１０、１０．１、１０．２、１０．３、１０．４、１０．５、１０．６、１０．７、１０．８、１０．９、または１１）で不安定であり、ステップ（ｄ）は、ペプチドエピトープの存在下、約ｐＨ９～１１の間のｐＨ（例えば、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、１０、１０．１、１０．２、１０．３、１０．４、１０．５、１０．６、１０．７、１０．８、１０．９、または１１）にｐ＊ＭＨＣＩ単量体を曝露することを含む。
一部の実施形態では、プレースホルダペプチドは、ＧＩＬＧＦＶＦＪＬ（配列番号７）を含む。一部の実施形態では、プレースホルダペプチドは、ＧＩＬＧＦＶＦＪＬ（配列番号７）からなる。他の実施形態では、プレースホルダペプチドは、配列番号８～２７または２７１～２７９のいずれか１つに示される配列を有する。
一実施形態では、プレースホルダペプチドは、切断可能部分を含む。一実施形態では、方法は、プレースホルダペプチドを切断するために十分な条件下でｐ＊ＭＨＣＩ単量体をペプチドエピトープと接触させるステップを含む。任意の好適な切断可能部分を使用することができる。一実施形態では、切断可能部分は、光切断可能アミノ酸であり、方法（例えば、ステップ（ｄ））は、プレースホルダペプチド中の光切断可能部分の切断およびＭＨＣＩ単量体へのペプチドエピトープの結合を誘導するために十分な条件下でＵＶ光にｐ＊ＭＨＣＩ単量体を曝露することを含む。一実施形態では、光切断可能アミノ酸は、（２－ニトロ）フェニル側鎖を含む。別の実施形態では、光切断可能アミノ酸は、３－アミノ－３－（２－ニトロフェニル）プロピオン酸を含む。別の実施形態では、光切断可能アミノ酸は、（２－ニトロ）フェニルグリシンである。
他の実施形態では、光切断可能プレースホルダペプチド、およびそれが結合する対応するＭＨＣ分子は、Ａ＊０２：０１、ＫＩＬＧＦＶＦＪＶ（配列番号１５）またはＧＩＬＧＦＶＦＪＬ（配列番号７）、Ａ＊０１：０１、ＳＴＡＰＧＪＬＥＹ（配列番号１６）；Ａ＊０２：０３、ＳＶＲＤＪＬＡＲＬ（配列番号２７１）；Ａ＊０２：０６、ＬＴＡＪＦＬＩＦＬ（配列番号２７２）；Ａ＊０２：０７、ＬＬＤＳＤＪＥＲＬ（配列番号２７３）；Ａ＊０２：１１、ＫＭＤＩＪＶＰＬＬ（配列番号２７４）；Ａ＊０３：０１、ＲＩＹＲＪＧＡＴＲ（配列番号１７）；Ａ＊１１：０１、ＲＶＦＡＪＳＦＩＫ（配列番号１８）；Ａ＊２４：０２、ＶＹＧＪＶＲＡＣＬ（配列番号１１）；Ａ＊３３：０３、ＦＹＶＪＧＡＡＮＲ（配列番号２７５）；Ｂ＊０７：０２、ＡＡＲＧＪＴＬＡＭ（配列番号１４）；Ｂ＊１５：０２、ＩＬＧＰＰＧＪＶＹ（配列番号２７６）；Ｂ＊３５：０１、ＫＰＩＶＶＬＪＧＹ（配列番号１９）；Ｂ＊４４：０５、ＥＥＦＧＡＡＪＳＦ（配列番号２７７）；Ｂ＊４６：０１、ＫＭＫＥＩＡＪＡＹ（配列番号２７８）；Ｂ＊５５：０２、ＫＰＷＤＪＩＰＭＶ（配列番号２７９）；Ｃ＊０３：０４、ＦＶＹＧＪＳＫＴＳＬ（配列番号２０）、Ｂ＊０８：０１、ＦＬＲＧＲＡＪＧＬ（配列番号２１）；Ｃ＊０７：０２、ＶＲＩＪＨＬＹＩＬ（配列番号２２）；Ｃ＊０４：０１、ＱＹＤＪＡＶＹＫＬ（配列番号２３）；Ｂ＊１５：０１、ＩＬＧＰＪＧＳＶＹ（配列番号２４）；Ｂ＊４０：０１、ＴＥＡＤＶＱＪＷＬ（配列番号２５）；Ｂ＊５８：０１、ＩＳＡＲＧＱＪＬＦ（配列番号２６）；およびＣ＊０８：０１、ＫＡＡＪＤＬＳＨＦＬ（配列番号２７）（ここで、Ｊは、３－アミノ－３－（２－ニトロフェニル）プロピオン酸である）から選択される。
別の実施形態では、切断可能部分は、化学選択的部分を含むアミノ酸である。別の実施形態では、方法（例えば、ステップ（ｄ））は、化学選択的部分を切断するために十分な条件下でｐ＊ＭＨＣＩ単量体をペプチドエピトープと接触させることを含む。別の実施形態では、化学選択的部分は、亜ジチオン酸ナトリウム感受性アゾベンゼンリンカーである。別の実施形態では、方法（例えば、ステップ（ｄ））は、亜ジチオン酸ナトリウム（sodium diothionite）の存在下でｐ＊ＭＨＣＩ単量体をペプチドエピトープと接触させることを含む。
別の実施形態では、切断可能部分は、過ヨウ素酸塩感受性アミノ酸である。別の実施形態では、方法（例えば、ステップ（ｄ））は、プレースホルダペプチドを切断するために十分な条件下、過ヨウ素酸塩の存在下でｐ＊ＭＨＣＩ単量体をペプチドエピトープと接触させることを含む。別の実施形態では、過ヨウ素酸塩感受性アミノ酸は、ビシナルジオール部分を含む。別の実施形態では、過ヨウ素酸塩感受性アミノ酸は、ビシナルアミノアルコールを含む。別の実施形態では、過ヨウ素酸塩感受性アミノ酸は、α、γ－ジアミノ－β－ヒドロキシブタン酸（ＤＡＨＢ）である。
別の実施形態では、切断可能部分は、プロテアーゼ認識部分である。一実施形態では、プロテアーゼは、アミノペプチダーゼである。一実施形態では、プロテアーゼは、メチオニンアミノペプチダーゼである。さらに他の実施形態では、プロテアーゼは、ＦＸａ、トロンビン、ＴＥＶ、ＨＲＶ３Ｃ、およびフューリンから選択される。
一実施形態では、プレースホルダペプチドは、ジペプチドである。別の実施形態では、ジペプチドは、ＭＨＣＩ結合溝のＦポケットに結合する。別の実施形態では、ジペプチドの第２のアミノ酸は、疎水性である。別の実施形態では、ジペプチドは、グリシル－ロイシン（ＧＬ）、グリシル－バリン（ＧＶ）、グリシル－メチオニン（methione）（ＧＭ）、グリシル－シクロヘキシルアラニン（ＧＣｈａ）、グリシル－ホモロイシン（ＧＨｌｅ）、およびグリシル－フェニルアラニン（ＧＦ）からなる群から選択される。
任意の好適な多量体化ドメインを使用することができる。一実施形態では、多量体化ドメインの各サブユニットは、コンジュゲーション部分を含む。別の実施形態では、多量体化ドメインは、多量体化ドメインの各サブユニットのＮ末端にコンジュゲーション部分を含むペプチドリンカーを含む。別の実施形態では、多量体化ドメインは、多量体化ドメインの各サブユニットのＣ末端にコンジュゲーション部分を含むペプチドリンカーを含む。一実施形態では、多量体化ドメインは、二量体、四量体、六量体、八量体、十量体、または十二量体である。別の実施形態では、多量体化ドメインは、ホモ多量体である。別の実施形態では、多量体化ドメインは、ヘテロ多量体である。別の実施形態では、多量体化ドメインは、ストレプトアビジンまたはその誘導体を含む。別の実施形態では、多量体化ドメインは、ストレプトアビジンまたはその誘導体の四量体である。別の実施形態では、多量体化ドメインは、Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇ（登録商標）またはＳｔｒｅｐ－ｔａｃｔｉｎ（登録商標）を含む。
一実施形態では、コンジュゲーション部分は、各ｐ＊ＭＨＣＩ単量体のＭＨＣＩ重鎖α１ドメインのＣ末端に付着されている。別の実施形態では、多量体化ドメインは、ＭＨＣＩ α１ドメインのＣ末端に共有結合的にコンジュゲートされている。別の実施形態では、コンジュゲーション部分は、各ｐ＊ＭＨＣＩのＭＨＣＩ重鎖α２ドメインのＣ末端に付着されている。別の実施形態では、多量体化ドメインは、ＭＨＣＩ α２ドメインのＣ末端に共有結合的にコンジュゲートされている。別の実施形態では、コンジュゲーション部分は、各ｐ＊ＭＨＣＩのＭＨＣＩ重鎖α３ドメインのＣ末端に付着されている。別の実施形態では、多量体化ドメインは、ＭＨＣＩ α３ドメインのＣ末端に共有結合的にコンジュゲートされている。別の実施形態では、コンジュゲーション部分は、各ｐ＊ＭＨＣＩ単量体の各ｐ＊ＭＨＣ単量体のβ２－ミクログロブリンのＣ末端に付着されている。別の実施形態では、多量体化ドメインは、各ｐ＊ＭＨＣ単量体のβ２－ミクログロブリンのＣ末端に共有結合的にコンジュゲートされている。別の実施形態では、多量体化ドメインへの各ｐ＊ＭＨＣＩ単量体の共有結合的コンジュゲーションは、システイントランスペプチダーゼ（例えば、ソルターゼまたはその酵素的に活性な断片）によって媒介される。
別の実施形態では、２つまたはそれよりも多くのｐ＊ＭＨＣ単量体は、多量体化ドメインに化学的にコンジュゲートされている。別の実施形態では、化学的コンジュゲーションは、システインバイオコンジュゲーションによって媒介される。別の実施形態では、化学的コンジュゲーションは、天然の化学的コンジュゲーションによって媒介される。別の実施形態では、化学的コンジュゲーションは、クリックケミストリーによって媒介される。
別の実施形態では、各ｐ＊ＭＨＣＩ単量体のコンジュゲーション部分は、Ｘを含み、多量体化ドメインの各サブユニットのコンジュゲーション部分は、Ｙを含む。例えば、一実施形態では、Ｘは、末端アルキンであり、Ｙは、アジドである。別の実施形態では、Ｘは、アジドであり、Ｙは、末端アルキンである。別の実施形態では、Ｘは、歪んだアルキンであり、Ｙは、アジドである。別の実施形態では、Ｘは、アジドであり、Ｙは、歪んだアルキンである。ある特定の実施形態では、アジドは、銅キレート化アジドである。一実施形態では、銅キレート化アジドは、ピコリルアジドである。別の実施形態では、Ｘは、ジエンであり、Ｙは、ジエノフィルである。別の実施形態では、Ｘは、ジエノフィルであり、Ｙは、ジエンである。別の実施形態では、Ｘは、チオールであり、Ｙは、アルケンである。別の実施形態では、Ｘは、アルケンであり、Ｙは、チオールである。
別の実施形態では、各ｐ＊ＭＨＣドメインのコンジュゲーション部分は、Ｃ末端に付着したペプチドリンカーを含み、多量体化ドメインの各サブユニットのコンジュゲーション部分は、多量体化ドメインの各サブユニットのＣ末端に付着したペプチドリンカーを含む。別の実施形態では、各ｐ＊ＭＨＣ単量体のＣ末端のペプチドリンカーは、（Ｇ）ｎ－Ｘ（ここで、ｎは、少なくとも２であり、Ｘは、化学的コンジュゲーションのために好適な部分である）を含み、多量体化ドメインの各サブユニットのＣ末端のペプチドリンカーは、（Ｇ）ｎ－Ｙ（ここで、ｎは、少なくとも２であり、Ｙは、各ｐ＊ＭＨＣ単量体のＸ部分への化学的コンジュゲーションのために好適な部分である）を含む。
別の実施形態では、各ｐ＊ＭＨＣＩ単量体のコンジュゲーション部分は、Ｃ末端ｓｏｒｔａｇを含み、多量体化ドメインの各サブユニットのコンジュゲーション部分は、Ｎ末端ｓｏｒｔａｇを含む。別の実施形態では、各ｐ＊ＭＨＣＩ単量体のコンジュゲーション部分は、Ｎ末端ｓｏｒｔａｇを含み、多量体化ドメインの各サブユニットのコンジュゲーション部分は、Ｃ末端ｓｏｒｔａｇを含む。別の実施形態では、方法（例えば、上記に記載されるＭＨＣ多量体を調製する方法のステップ（ｃ））は、ｐ＊ＭＨＣＩ単量体および多量体化ドメインの混合物へのソルターゼの添加を含み、各ｐ＊ＭＨＣ単量体と多量体化ドメインとの間のペプチド結合の形成を触媒して、ｐ＊ＭＨＣ多量体を産生する。
別の実施形態では、２つまたはそれよりも多くのｐ＊ＭＨＣＩ単量体（例えば、上記に記載されるＭＨＣ多量体を調製する方法のステップ（ａ）における）は、化学的コンジュゲーションのために好適な部分を含むペプチドリンカーの存在下でＣ末端ｓｏｒｔａｇを含むｐ＊ＭＨＣＩ単量体をソルターゼまたはその酵素的に活性な断片と接触させることによって産生され、ソルターゼまたはその酵素的に活性な断片は、ｐ＊ＭＨＣ単量体へのペプチドリンカーのコンジュゲーションを媒介し、多量体化ドメイン（例えば、上記に記載される方法におけるステップ（ｂ）において）は、化学的コンジュゲーションのために好適な部分を含むペプチドリンカーの存在下でＮ末端ｓｏｒｔａｇを含む多量体化ドメインをソルターゼと接触させることによって産生され、ソルターゼまたはその酵素的に活性な断片は、多量体化ドメインの各サブユニットのＮ末端へのペプチドリンカーのコンジュゲーションを媒介し、ステップ（ｃ）は、ｐ＊ＭＨＣ多量体を産生するための、２つまたはそれよりも多くのｐ＊ＭＨＣ単量体のＣ末端のペプチドリンカーと多量体化ドメインの各サブユニットのＮ末端のペプチドリンカーとの間の化学的コンジュゲーションを含む。
一実施形態では、各ｐ＊ＭＨＣ単量体のＣ末端のペプチドリンカーは、（Ｇ）ｎ－Ｘ（ここで、ｎは、少なくとも２であり、Ｘは、クリックケミストリーコンジュゲーションのために好適な部分である）を含み、多量体化ドメインの各サブユニットのＮ末端のペプチドリンカーは、Ｙ－（Ｇ）ｎ（ここで、ｎは、少なくとも２であり、Ｙは、各ｐ＊ＭＨＣ単量体のＸ部分とのクリックケミストリーコンジュゲーションのために好適な部分である）を含む。別の実施形態では、Ｘは、末端アルキンであり、Ｙは、アジドである。別の実施形態では、Ｘは、アジドであり、Ｙは、末端アルキンである。別の実施形態では、Ｘは、歪んだアルキンであり、Ｙは、アジドである。別の実施形態では、Ｘは、アジドであり、Ｙは、歪んだアルキンである。ある特定の実施形態では、アジドは、銅キレート化アジドである。一実施形態では、銅キレート化アジドは、ピコリルアジドである。別の実施形態では、Ｘは、ジエンであり、Ｙは、ジエノフィルである。別の実施形態では、Ｘは、ジエノフィルであり、Ｙは、ジエンである。別の実施形態では、Ｘは、チオールであり、Ｙは、アルケンである。別の実施形態では、Ｘは、アルケンであり、Ｙは、チオールである。
一実施形態では、ソルターゼまたはその酵素的に活性な断片は、Ｃａ２＋依存性である。別の実施形態では、ソルターゼまたはその酵素的に活性な断片は、Ｃａ２＋非依存性である。別の実施形態では、ソルターゼまたはその酵素的に活性な断片は、野生型ソルターゼの可溶性断片である。別の実施形態では、ソルターゼまたはその酵素的に活性な断片は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓソルターゼＡのバリアントまたはホモログである。別の実施形態では、ソルターゼまたはその酵素的に活性な断片は、改変ソルターゼＡである。別の実施形態では、ソルターゼまたはその酵素的に活性な断片は、ＳｒｔＡｓｔａｐｈ突然変異体である。別の実施形態では、ＳｒｔＡｓｔａｐｈ突然変異体は、Ｆ４０、ＳｒｔＡｓｔａｐｈ五重突然変異体、２Ａ－９、および４Ｓ－９からなる群から選択される。
一実施形態では、多量体化ドメインへの各ｐ＊ＭＨＣＩ単量体の共有結合的コンジュゲーションは、インテインによって媒介される。一実施形態では、インテインは、ＭｘｅＧｙｒＡ、ＳｓｐＤｎａＥ、ＮｐｕＤｎａＥ、ＡｖａＤｎａＥ、Ｃｆａ（コンセンサスＤｎａＥスプリットインテイン）、ｇｐ４１－１、ｇｐ４１－８、およびＮｒｄＪ－１からなる群から選択される。別の実施形態では、インテインは、スプリットインテイン対である。別の実施形態では、各ｐ＊ＭＨＣＩ単量体は、インテインペプチドタグによって多量体化ドメインにコンジュゲートされている。別の実施形態では、各ｐ＊ＭＨＣＩ単量体は、Ｃ末端にＮ－インテイン断片を含み、多量体化ドメインの各サブユニットは、Ｎ末端にＮｐｕ－Ｃ－インテイン断片を含む。
一実施形態では、レスキューペプチドエピトープは、識別子を含む。一実施形態では、識別子は、核酸識別子である。一実施形態では、識別子は、核酸識別子である。別の実施形態では、核酸識別子は、ペプチドをコードする。別の実施形態では、核酸識別子は、２５ヌクレオチド長～５００ヌクレオチド長である。別の実施形態では、核酸識別子は、８０ヌクレオチド長～１２０ヌクレオチド長である。
一態様では、本開示は、多様なｐＭＨＣＩ多量体のライブラリーを産生する方法、およびハイスループット法を含むそれらの産生のための方法を提供する。一部の実施形態では、ｐＭＨＣ多量体は、核酸識別子をさらに含み、便宜上、本明細書の他の場所で記載されるように、結合の検出および定量化を可能にする。
一実施形態では、多様なペプチドエピトープロードＭＨＣＩ（ｐＭＨＣＩ）多量体を含むライブラリーを産生する方法であって、
（ａ）（ｉ）ＭＨＣＩ重鎖ポリペプチドまたはその機能的断片、（ｉｉ）β２－ミクログロブリンポリペプチドまたはその機能的断片、（ｉｉｉ）コンジュゲーション部分、および（ｉｖ）各ＭＨＣＩ単量体のペプチド結合溝中で結合したプレースホルダペプチドをそれぞれ含む、複数のプレースホルダペプチドロードＭＨＣＩ（ｐ＊ＭＨＣＩ）単量体を提供するステップ；
（ｂ）複数の多量体化ドメインを提供するステップであって、多量体化ドメインの各サブユニットが、コンジュゲーション部分を含む、ステップ；
（ｃ）２つまたはそれよりも多くのｐ＊ＭＨＣＩ単量体と多量体化ドメインとの間の共有結合的コンジュゲーションのために十分な条件下でｐ＊ＭＨＣＩ単量体および多量体化ドメインを組み合わせて、ｐ＊ＭＨＣＩ多量体を産生するステップ；ならびに
（ｄ）複数のｐ＊ＭＨＣＩ多量体中のプレースホルダペプチドを複数の固有のＭＨＣＩペプチドエピトープを含むペプチドライブラリーで置き換えて、複数のペプチドロードＭＨＣＩ（ｐＭＨＣＩ）多量体を産生するステップ
を含む、方法が提供される。
別の態様では、多様なバーコード化ペプチドロード主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ（ｐＭＨＣＩ）多量体を含むライブラリーを産生する方法であって、
（ａ）（ｉ）ＭＨＣＩ重鎖ポリペプチドまたはその機能的断片、（ｉｉ）β２－ミクログロブリンポリペプチドまたはその機能的断片、（ｉｉｉ）コンジュゲーション部分、および（ｉｖ）各ＭＨＣＩ単量体のペプチド結合溝中で結合したプレースホルダペプチドをそれぞれ含む、複数のプレースホルダペプチドロードＭＨＣＩ（ｐ＊ＭＨＣＩ）単量体を提供するステップ；
（ｂ）複数の多量体化ドメインを提供するステップであって、多量体化ドメインの各サブユニットが、コンジュゲーション部分を含み、多量体化ドメインが、少なくとも１つの非共有結合部位を含む、ステップ；
（ｃ）２つまたはそれよりも多くのｐ＊ＭＨＣＩ単量体と多量体化ドメインとの間の共有結合的コンジュゲーションのために十分な条件下で複数のｐ＊ＭＨＣＩ単量体および複数の多量体化ドメインを組み合わせて、複数のｐ＊ＭＨＣＩ多量体を産生するステップ；
（ｄ）ｐ＊ＭＨＣＩ多量体のペプチド結合溝中で結合したプレースホルダペプチドを複数の固有のレスキューペプチドエピトープで置き換えて、複数のｐＭＨＣＩ多量体を産生するステップ；ならびに
（ｅ）オリゴヌクレオチドバーコードを多量体化ドメイン上の非共有結合部位に結合させるステップ
を含む、方法が提供される。
別の態様では、多様なバーコード化ペプチドロード主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ（ｐＭＨＣＩ）多量体を含むライブラリーを産生する方法であって、
（ａ）（ｉ）ＭＨＣＩ重鎖ポリペプチドまたはその機能的断片、（ｉｉ）β２－ミクログロブリンポリペプチドまたはその機能的断片、（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）のＣ末端にコンジュゲーション部分を含むペプチドリンカー、および（ｉｖ）各ＭＨＣＩ単量体のペプチド結合溝中で結合したプレースホルダペプチドをそれぞれ含む、複数のプレースホルダペプチドロードＭＨＣＩ（ｐ＊ＭＨＣＩ）単量体を提供するステップ；
（ｂ）多量体化ドメインの各サブユニットのＣ末端にコンジュゲーション部分を含むペプチドリンカーを含む複数の多量体化ドメインを提供するステップ；
（ｃ）多量体化ドメインへの２つまたはそれよりも多くのｐ＊ＭＨＣＩ単量体間の共有結合的コンジュゲーションのために十分な条件下で複数のｐ＊ＭＨＣＩ単量体および複数の多量体化ドメインを組み合わせて、複数のｐ＊ＭＨＣＩ多量体を産生するステップ；
（ｄ）ｐ＊ＭＨＣＩ多量体のペプチド結合溝中で結合したプレースホルダペプチドを複数の固有のレスキューペプチドエピトープで置き換えて、複数のｐＭＨＣＩ多量体を産生するステップ；ならびに
（ｅ）オリゴヌクレオチドバーコードを多量体化ドメイン上の非共有結合部位に結合させるステップ
を含む、方法が提供される。
別の態様では、本開示は、ペプチドロードＭＨＣクラスＩ（ｐＭＨＣ）多量体のライブラリーであって、ライブラリー中の各ｐＭＨＣ多量体が、固有のペプチドエピトープがロードされた２つまたはそれよりも多くのｐＭＨＣ単量体を含み、各ｐＭＨＣ単量体が、多量体化ドメインのサブユニットに共有結合的に連結されている、ライブラリーを提供する。
一実施形態では、ＭＨＣＩペプチドエピトープのライブラリーは、高多様性ペプチドライブラリーである。別の実施形態では、ペプチドライブラリーは、約１０３～１０２０の異なるＭＨＣＩペプチドエピトープを含む。別の実施形態では、ペプチドライブラリーは、約１０３、約１０４、約１０５、約１０６、約１０７、約１０８、約１０９、約１０１０、約１０１１、約１０１２、約１０１３、約１０１４、約１０１５、約１０１６、約１０１７、約１０１８、約１０１９、約１０２０、またはそれよりも多くの異なるＭＨＣＩペプチドエピトープを含む。
一実施形態では、ＭＨＣＩペプチドエピトープは、単一の抗原性タンパク質に由来する。別の実施形態では、ＭＨＣＩペプチドエピトープは、抗原性タンパク質の重複する断片を含む。別の実施形態では、複数の固有のペプチドエピトープは、生物体のゲノム、生物体のトランスクリプトーム、生物体のプロテオーム、または生物体のペプチドもしくはタンパク質から生成される。別の実施形態では、複数の固有のペプチドエピトープは、２つのゲノム間の差分配列から生成される。別の実施形態では、ＭＨＣペプチドエピトープは、目的の特定のペプチドエピトープの変更ペプチドリガンド（ＡＰＬ）であり得る。
別の実施形態では、ｐＭＨＣ多量体のそれぞれは、固有の識別子部分を含む。一実施形態では、固有の識別子部分は、核酸である。
別の態様では、複数のペプチドロードＭＨＣＩ（ｐＭＨＣＩ）多量体を含むポリペプチドライブラリーであって、ペプチドロードｐＭＨＣＩ多量体のそれぞれが、多量体化ドメインにコンジュゲートされた２つまたはそれよりも多くのｐＭＨＣＩ単量体を含む、ポリペプチドライブラリーが提供される。
別の態様では、ＭＨＣ多量体が結合したリンパ球を単離する方法であって、
（ａ）複数のリンパ球をｐＭＨＣＩ多量体のライブラリーと接触させるステップ；ならびに
（ｂ）複数のコンパートメントを生成するステップであって、各コンパートメントが、ライブラリーのｐＭＨＣＩ多量体に結合したリンパ球、および捕捉支持体を含む、ステップ
を含む、方法が提供される。一実施形態では、リンパ球は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、またはＮＫ細胞である。
別の実施形態では、ｐＭＨＣ多量体に結合したリンパ球を識別する方法であって、
（ａ）複数のリンパ球をｐＭＨＣＩ多量体のライブラリーと接触させるステップ；
（ｂ）単一のコンパートメント中にライブラリーのｐＭＨＣＩ多量体に結合した複数のリンパ球のうちの１つのリンパ球をコンパートメント化するステップであって、ｐＭＨＣＩ多量体が、固有の識別子を含む、ステップ；および
（ｃ）コンパートメント化されたリンパ球に結合したｐＭＨＣＩについての固有の識別子を決定するステップ
を含む、方法が提供される。
本開示の性質および利点のより完全な理解のために、添付の図面と併せて考慮される次の詳細な説明を参照すべきである。本開示は、本開示から逸脱することなく、さまざまな点で改変が可能である。したがって、これらの実施形態の図面および説明は制限的なものではない。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）多量体を産生する方法であって、
（ａ）２つまたはそれよりも多くのＭＨＣ単量体を提供するステップであって、各単量体が、コンジュゲーション部分を含む、ステップ；
（ｂ）多量体化ドメインを提供するステップであって、前記多量体化ドメインの各サブユニットが、コンジュゲーション部分を含む、ステップ；
（ｃ）前記ＭＨＣ単量体と前記多量体化ドメインとの間の共有結合的コンジュゲーションのために十分な条件下で前記ＭＨＣ単量体および前記多量体化ドメインを組み合わせて、ＭＨＣ多量体を産生するステップ
を含む、方法。
（項目２）
前記ＭＨＣ単量体が、ＭＨＣクラスＩ単量体である、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記ＭＨＣ単量体が、ＭＨＣクラスＩＩ単量体である、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記ＭＨＣ単量体は、前記多量体化ドメインと組み合わせる前に、プレースホルダペプチドがロードされている、項目１～３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５）
前記多量体化ドメインが、非共有結合部位を含み、さらに、前記ＭＨＣ多量体が、前記多量体化ドメインの前記非共有結合部位と結合するオリゴヌクレオチドバーコードで標識されている、項目１～４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
前記多量体化ドメインが、ストレプトアビジンである、項目１～５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
前記多量体化ドメインが、ストレプトアビジンであり、前記オリゴヌクレオチドバーコードが、ストレプトアビジンのビオチン結合部位と結合する、項目５に記載の方法。
（項目８）
各ＭＨＣ単量体の前記コンジュゲーション部分が、Ｘを含み、前記多量体化ドメインの各サブユニットの前記コンジュゲーション部分が、Ｙを含み、
（ｉ）Ｘが、末端アルキンであり、Ｙが、アジドである；
（ｉｉ）Ｘが、アジドであり、Ｙが、末端アルキンである；
（ｉｉｉ）Ｘが、歪んだアルキンであり、Ｙが、アジドである；
（ｉｖ）Ｘが、アジドであり、Ｙが、歪んだアルキンである；
（ｖ）Ｘが、ジエンであり、Ｙが、ジエノフィルである；
（ｖｉ）Ｘが、ジエノフィルであり、Ｙが、ジエンである；
（ｖｉｉ）Ｘが、チオールであり、Ｙが、アルケンである；または
（ｖｉｉｉ）Ｘが、アルケンであり、Ｙが、チオールである、
項目１～７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
前記アジドが、銅キレート化アジドである、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記銅キレート化アジドが、ピコリルアジドである、項目９に記載の方法。
（項目１１）
各ＭＨＣ単量体の前記コンジュゲーション部分および前記多量体化ドメインの各サブユニットの前記コンジュゲーション部分が、ｓｏｒｔａｇモチーフを含む、項目１～１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
各ＭＨＣ単量体の前記コンジュゲーション部分および前記多量体化ドメインの各サブユ
ニットの前記コンジュゲーション部分が、インテイン配列を含む、項目１～１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
前記多量体が、四量体である、項目１～１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
前記プレースホルダペプチドを、前記ＭＨＣ単量体と結合するレスキューペプチドエピトープと交換するステップをさらに含む、項目４に記載の方法。
（項目１５）
（ａ）２つまたはそれよりも多くのＭＨＣ単量体；
（ｂ）２つまたはそれよりも多くのサブユニットを含み、少なくとも１つの非共有結合部位を有する多量体化ドメイン；および
（ｃ）オリゴヌクレオチドバーコード
を含むバーコード標識化ＭＨＣ多量体であって、
各ＭＨＣ単量体が、共有結合的連結を通して前記多量体化ドメインのサブユニットに結合されており、
前記オリゴヌクレオチドバーコードが、前記多量体化ドメイン上の前記非共有結合部位への非共有結合によって前記多量体化ドメインに結合されている、
ＭＨＣ多量体。
（項目１６）
前記多量体の各ＭＨＣ単量体上にロードされたＭＨＣ結合性ペプチドをさらに含む、項目１５に記載のＭＨＣ多量体。
（項目１７）
前記ＭＨＣ単量体が、ＭＨＣクラスＩ単量体である、項目１５または１６に記載のＭＨＣ多量体。
（項目１８）
前記ＭＨＣ単量体が、ＭＨＣクラスＩＩ単量体である、項目１５または１６に記載のＭＨＣ多量体。
（項目１９）
四量体である、項目１５～１８のいずれか一項に記載のＭＨＣ多量体。
（項目２０）
前記多量体化ドメインが、ストレプトアビジンである、項目１９に記載のＭＨＣ多量体。
（項目２１）
前記オリゴヌクレオチドバーコードが、ストレプトアビジン上のビオチン結合部位に非共有結合されている、項目２０に記載のＭＨＣ多量体。
（項目２２）
各ＭＨＣ単量体が、コンジュゲーション部分Ｘを含み、前記多量体化ドメインの各サブユニットが、コンジュゲーション部分Ｙを含み、
（ｉ）Ｘが、末端アルキンであり、Ｙが、アジドである；
（ｉｉ）Ｘが、アジドであり、Ｙが、末端アルキンである；
（ｉｉｉ）Ｘが、歪んだアルキンであり、Ｙが、アジドである；
（ｉｖ）Ｘが、アジドであり、Ｙが、歪んだアルキンである；
（ｖ）Ｘが、ジエンであり、Ｙが、ジエノフィルである；
（ｖｉ）Ｘが、ジエノフィルであり、Ｙが、ジエンである；
（ｖｉｉ）Ｘが、チオールであり、Ｙが、アルケンである；または
（ｖｉｉｉ）Ｘが、アルケンであり、Ｙが、チオールである、
項目１５～２１のいずれか一項に記載のＭＨＣ多量体。
（項目２３）
前記アジドが、銅キレート化アジドである、項目２２に記載のＭＨＣ多量体。
（項目２４）
前記銅キレート化アジドが、ピコリルアジドである、項目２３に記載のＭＨＣ多量体。
（項目２５）
各ＭＨＣ単量体および前記多量体化ドメインの各サブユニットが、コンジュゲーション部分を含み、各コンジュゲーション部分が、ｓｏｒｔａｇモチーフを含む、項目１５～２４のいずれか一項に記載のＭＨＣ多量体。
（項目２６）
各ＭＨＣ単量体および前記多量体化ドメインの各サブユニットが、コンジュゲーション部分を含み、各コンジュゲーション部分が、インテイン配列を含む、項目１５～２４のいずれか一項に記載のＭＨＣ多量体。
（項目２７）
ペプチドロード主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ（ｐＭＨＣＩ）多量体を産生する方法であって、
（ａ）（ｉ）ＭＨＣＩ重鎖ポリペプチドまたはその機能的断片、（ｉｉ）β２－ミクログロブリンポリペプチドまたはその機能的断片、（ｉｉｉ）コンジュゲーション部分、および（ｉｖ）各ＭＨＣＩ単量体のペプチド結合溝中で結合したプレースホルダペプチドをそれぞれ含む、２つまたはそれよりも多くのプレースホルダペプチドロードＭＨＣＩ（ｐ ＊ ＭＨＣＩ）単量体を提供するステップ；
（ｂ）多量体化ドメインを提供するステップであって、前記多量体化ドメインの各サブユニットが、コンジュゲーション部分を含む、ステップ；
（ｃ）前記２つまたはそれよりも多くのｐ ＊ ＭＨＣＩ単量体と前記多量体化ドメインとの間の共有結合的コンジュゲーションのために十分な条件下で前記ｐ ＊ ＭＨＣＩ単量体および前記多量体化ドメインを組み合わせて、ｐ ＊ ＭＨＣＩ多量体を産生するステップ；ならびに
（ｄ）前記ｐ ＊ ＭＨＣＩ多量体中の前記ｐ ＊ ＭＨＣＩ単量体のそれぞれの前記ペプチド結合溝中で結合した前記プレースホルダペプチドをレスキューペプチドエピトープで置き換えて、ｐＭＨＣＩ多量体を産生するステップ
を含む、方法。
（項目２８）
バーコードペプチドロード主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ（ｐＭＨＣＩ）多量体を産生する方法であって、
（ａ）（ｉ）ＭＨＣＩ重鎖ポリペプチドまたはその機能的断片、（ｉｉ）β２－ミクログロブリンポリペプチドまたはその機能的断片、（ｉｉｉ）コンジュゲーション部分、および（ｉｖ）各ＭＨＣＩ単量体のペプチド結合溝中で結合したプレースホルダペプチドをそれぞれ含む、２つまたはそれよりも多くのプレースホルダペプチドロードＭＨＣＩ（ｐ ＊ ＭＨＣＩ）単量体を提供するステップ；
（ｂ）多量体化ドメインを提供するステップであって、前記多量体化ドメインの各サブユニットが、コンジュゲーション部分を含み、前記多量体化ドメインが、少なくとも１つの非共有結合部位を含む、ステップ；
（ｃ）前記２つまたはそれよりも多くのｐ ＊ ＭＨＣＩ単量体と前記多量体化ドメインとの間の共有結合的コンジュゲーションのために十分な条件下で前記ｐ ＊ ＭＨＣＩ単量体および前記多量体化ドメインを組み合わせて、ｐ ＊ ＭＨＣＩ多量体を産生するステップ；
（ｄ）前記ｐ ＊ ＭＨＣＩ多量体中の前記ｐ ＊ ＭＨＣＩ単量体のそれぞれの前記ペプチド結合溝中で結合した前記プレースホルダペプチドをレスキューペプチドエピトープで置き換えて、ｐＭＨＣＩ多量体を産生するステップ；ならびに
（ｅ）オリゴヌクレオチドバーコードを前記多量体化ドメイン上の前記非共有結合部位に結合させるステップ
を含む、方法。
（項目２９）
ペプチドロード主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ（ｐＭＨＣＩ）多量体を産生する方
法であって、
（ａ）（ｉ）ＭＨＣＩ重鎖ポリペプチドまたはその機能的断片、（ｉｉ）β２－ミクログロブリンポリペプチドまたはその機能的断片、（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）のＣ末端にコンジュゲーション部分を含むペプチドリンカー、および（ｉｖ）各ＭＨＣＩ単量体のペプチド結合溝中で結合したプレースホルダペプチドをそれぞれ含む、２つまたはそれよりも多くのプレースホルダペプチドロードＭＨＣＩ（ｐ ＊ ＭＨＣＩ）単量体を提供するステップ；
（ｂ）多量体化ドメインの各サブユニットのＣ末端にコンジュゲーション部分を含むペプチドリンカーを含む前記多量体化ドメインを提供するステップ；
（ｃ）前記多量体化ドメインへの２つまたはそれよりも多くのｐ ＊ ＭＨＣＩ単量体間の共有結合的コンジュゲーションのために十分な条件下で前記ｐ ＊ ＭＨＣＩ単量体および前記多量体化ドメインを組み合わせて、ｐ ＊ ＭＨＣＩ多量体を産生するステップ；ならびに
（ｄ）前記ｐ ＊ ＭＨＣＩ多量体中の前記ｐ ＊ ＭＨＣＩ単量体のそれぞれの前記ペプチド結合溝中で結合した前記プレースホルダペプチドをレスキューペプチドエピトープで置き換えて、ｐＭＨＣＩ多量体を産生するステップ
を含む、方法。
（項目３０）
各ｐ ＊ ＭＨＣ単量体が、脊椎動物起源のものである、項目２７～２９のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１）
各ｐ ＊ ＭＨＣＩ単量体が、ヒトＭＨＣＩ重鎖ポリペプチドまたはその機能的断片、およびヒトβ２－ミクログロブリンポリペプチドまたはその機能的断片を含む、項目２７～３０のいずれか一項に記載の方法。
（項目３２）
その各ｐ ＊ ＭＨＣＩ単量体が、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－ＢまたはＨＬＡ－Ｃである、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
各ｐ ＊ ＭＨＣＩ単量体が、ＨＬＡ－Ａである、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
各ｐ ＊ ＭＨＣＩ単量体の前記ＭＨＣＩ重鎖ポリペプチドまたはその機能的断片が、ＭＨＣＩ α１ドメインを含む、項目２７～３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５）
各ｐ ＊ ＭＨＣＩ単量体の前記ＭＨＣＩ重鎖ポリペプチドまたはその機能的断片が、ＭＨＣＩ α１／α２ヘテロ二量体を含む、項目２７～３４のいずれか一項に記載の方法。
（項目３６）
各ｐ ＊ ＭＨＣＩ単量体の前記ＭＨＣＩ重鎖ポリペプチドまたはその機能的断片が、ＭＨＣＩ α１、α２およびα３ドメインを含む、項目２７～３５のいずれか一項に記載の方法。
（項目３７）
各ｐ ＊ ＭＨＣＩ単量体の前記ＭＨＣＩ重鎖ポリペプチドまたはその機能的断片が、配列番号２８～１５９に示されるアミノ酸配列のいずれかと少なくとも８０、８５、９０、９５、または９９％同一であるαドメインを含む、項目２７～３６のいずれか一項に記載の方法。
（項目３８）
各ｐ ＊ ＭＨＣＩ単量体が、可溶性である、項目２７～３７のいずれか一項に記載の方法。
（項目３９）
各ｐ ＊ ＭＨＣＩ単量体の前記β２－ミクログロブリンポリペプチドが、野生型ヒトβ２－ミクログロブリンである、項目２７～３８のいずれか一項に記載の方法。
（項目４０）
前記β２－ミクログロブリンポリペプチドが、ヒトβ２－ミクログロブリンのアミノ酸配列（配列番号２または１６０）と少なくとも８０、８５、９０、９５、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、項目２７～３９のいずれか一項に記載の方法。
（項目４１）
各ｐ ＊ ＭＨＣ単量体が、ＭＨＣＩ重鎖またはその機能的断片、およびβ２－ミクログロブリンまたはその機能的断片を含む融合タンパク質である、項目２７～４０のいずれか一項に記載の方法。
（項目４２）
前記ｐ ＊ ＭＨＣ融合タンパク質が、前記ＭＨＣＩ重鎖またはその機能的断片と前記β２－ミクログロブリンポリペプチドまたはその機能的断片との間にペプチドリンカーを含む、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記プレースホルダペプチドが、前記ＭＨＣＩポリペプチドのフォールディングを促進するペプチドまたはペプチド様化合物である、項目２７～４２のいずれか一項に記載の方法。
（項目４４）
前記プレースホルダペプチドが、２～２５個のアミノ酸である、項目２７～４３のいずれか一項に記載の方法。
（項目４５）
前記プレースホルダペプチドが、８～１１個のアミノ酸である、項目２７～４４のいずれか一項に記載の方法。
（項目４６）
前記プレースホルダペプチドが、９～１０個のアミノ酸である、項目２７～４５のいずれか一項に記載の方法。
（項目４７）
前記プレースホルダペプチドが、交換されたペプチドエピトープよりも前記ＭＨＣＩペプチド結合溝に対して低い親和性を有し、ステップ（ｄ）が、競合アッセイにおいて、前記ｐ ＊ ＭＨＣＩ単量体を過剰のペプチドエピトープと接触させることを含む、項目２７～４６のいずれか一項に記載の方法。
（項目４８）
前記プレースホルダペプチドが、前記交換されたペプチドエピトープよりも約１０倍低いＫＤを有する、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
前記プレースホルダペプチドが、約３０～３７℃の間の温度で不安定であり、ステップ（ｄ）が、ペプチドエピトープの存在下、約３０～３７℃の間の温度に前記ｐ ＊ ＭＨＣＩ単量体を曝露することを含む、項目２７～４６のいずれかに記載の方法。
（項目５０）
前記プレースホルダペプチドが、約ｐＨ２．５～５．５の間の酸性ｐＨで不安定であり、ステップ（ｄ）が、ペプチドエピトープの存在下、約ｐＨ２．５～５．５の間のｐＨに前記ｐ ＊ ＭＨＣＩ単量体を曝露することを含む、項目２７～４６のいずれかに記載の方法。
（項目５１）
前記プレースホルダペプチドが、約ｐＨ９～１１の間の塩基性ｐＨで不安定であり、ステップ（ｄ）が、ペプチドエピトープの存在下、約ｐＨ９～１１の間のｐＨに前記ｐ ＊ ＭＨＣＩ単量体を曝露することを含む、項目２７～４６のいずれかに記載の方法。
（項目５２）
前記プレースホルダペプチドが、ＧＩＬＧＦＶＦＪＬ（配列番号７）を含む、項目２７～５１のいずれかに記載の方法。
（項目５３）
前記プレースホルダペプチドが、ＧＩＬＧＦＶＦＪＬ（配列番号７）からなる、項目
２７～５１のいずれかに記載の方法。
（項目５４）
前記プレースホルダペプチドが、切断可能部分を含み、ステップ（ｄ）が、前記プレースホルダペプチドを切断するために十分な条件下で前記ｐ ＊ ＭＨＣＩ単量体をペプチドエピトープと接触させることを含む、項目２７～４６のいずれかに記載の方法。
（項目５５）
前記切断可能部分が、光切断可能アミノ酸であり、ステップ（ｄ）が、前記プレースホルダペプチド中の前記光切断可能部分の切断および前記ＭＨＣＩ単量体への前記ペプチドエピトープの結合を誘導するために十分な条件下でＵＶ光に前記ｐ ＊ ＭＨＣＩ単量体を曝露することを含む、項目５４に記載の方法。
（項目５６）
前記光切断可能アミノ酸が、２－ニトロフェニル側鎖を含む、項目５５に記載の方法。
（項目５７）
前記光切断可能アミノ酸が、３－アミノ－３－（２－ニトロフェニル）プロピオン酸を含む、項目５５に記載の方法。
（項目５８）
前記光切断可能アミノ酸が、（２－ニトロ）フェニルグリシンである、項目５５に記載の方法。
（項目５９）
前記光切断可能プレースホルダペプチドが、Ａ ＊ ０２：０１、ＫＩＬＧＦＶＦＪＶ（配列番号１５）またはＧＩＬＧＦＶＦＪＬ（配列番号７）、Ａ ＊ ０１：０１、ＳＴＡＰＧＪＬＥＹ（配列番号１６）；Ａ＊０２：０３、ＳＶＲＤＪＬＡＲＬ（配列番号２７１）；Ａ＊０２：０６、ＬＴＡＪＦＬＩＦＬ（配列番号２７２）；Ａ＊０２：０７、ＬＬＤＳＤＪＥＲＬ（配列番号２７３）；Ａ＊０２：１１、ＫＭＤＩＪＶＰＬＬ（配列番号２７４）；Ａ＊３：０１、ＲＩＹＲＪＧＡＴＲ（配列番号１７）；Ａ＊１１：０１、ＲＶＦＡＪＳＦＩＫ（配列番号１８）；Ａ＊２４：０２、ＶＹＧＪＶＲＡＣＬ（配列番号１１）；Ａ＊３３：０３、ＦＹＶＪＧＡＡＮＲ（配列番号２７５）；Ｂ＊０７：０２、ＡＡＲＧＪＴＬＡＭ（配列番号１４）；Ｂ＊１５：０２、ＩＬＧＰＰＧＪＶＹ（配列番号２７６）；Ｂ＊３５：０１、ＫＰＩＶＶＬＪＧＹ（配列番号１９）；Ｂ＊４４：０５、ＥＥＦＧＡＡＪＳＦ（配列番号２７７）；Ｂ＊４６：０１、ＫＭＫＥＩＡＪＡＹ（配列番号２７８）；Ｂ＊５５：０２、ＫＰＷＤＪＩＰＭＶ（配列番号２７９）；Ｃ＊３：０４、ＦＶＹＧＪＳＫＴＳＬ（配列番号２０）、Ｂ＊０８：０１、ＦＬＲＧＲＡＪＧＬ（配列番号２１）；Ｃ＊０７：０２、ＶＲＩＪＨＬＹＩＬ（配列番号２２）；Ｃ＊０４：０１、ＱＹＤＪＡＶＹＫＬ（配列番号２３）；Ｂ＊１５：０１、ＩＬＧＰＪＧＳＶＹ（配列番号２４）；Ｂ＊４０：０１、ＴＥＡＤＶＱＪＷＬ（配列番号２５）；Ｂ＊５８：０１、ＩＳＡＲＧＱＪＬＦ（配列番号２６）；およびＣ ＊ ０８：０１、ＫＡＡＪＤＬＳＨＦＬ（配列番号２７）（ここで、Ｊは、３－アミノ－３－（２－ニトロフェニル）プロピオン酸である）からなる群から選択される、項目５５に記載の方法。
（項目６０）
前記切断可能部分が、化学選択的部分を含むアミノ酸であり、ステップ（ｄ）が、化学選択的部分を切断するために十分な条件下で前記ｐ ＊ ＭＨＣＩ単量体をペプチドエピトープと接触させることを含む、項目５４に記載の方法。
（項目６１）
前記化学選択的部分が、亜ジチオン酸ナトリウム感受性アゾベンゼンリンカーであり、ステップ（ｄ）が、亜ジチオン酸ナトリウムの存在下で前記ｐ ＊ ＭＨＣＩ単量体をペプチドエピトープと接触させることを含む、項目６０に記載の方法。
（項目６２）
前記切断可能部分が、過ヨウ素酸塩感受性アミノ酸であり、ステップ（ｄ）が、前記プレースホルダペプチドを切断するために十分な条件下、過ヨウ素酸塩の存在下で前記ｐ ＊
ＭＨＣＩ単量体をペプチドエピトープと接触させることを含む、項目５４に記載の方法。
（項目６３）
前記過ヨウ素酸塩感受性アミノ酸が、ビシナルジオール部分またはビシナルアミノアルコールを含む、項目６２に記載の方法。
（項目６４）
前記過ヨウ素酸塩感受性アミノ酸が、α、γ－ジアミノ－β－ヒドロキシブタン酸（ＤＡＨＢ）である、項目６３に記載の方法。
（項目６５）
前記切断可能部分が、プロテアーゼ認識部分である、項目５４に記載の方法。
（項目６６）
前記プロテアーゼが、アミノペプチダーゼである、項目６５に記載の方法。
（項目６７）
前記プロテアーゼが、メチオニンアミノペプチダーゼである、項目６６に記載の方法。
（項目６８）
前記プレースホルダペプチドが、ジペプチドである、項目２７～４６のいずれか一項に記載の方法。
（項目６９）
前記ジペプチドが、前記ＭＨＣＩ結合溝のＦポケットに結合する、項目６８に記載の方法。
（項目７０）
前記ジペプチドの第２のアミノ酸が、疎水性である、項目６８または６９に記載の方法。
（項目７１）
前記ジペプチドが、グリシル－ロイシン（ＧＬ）、グリシル－バリン（ＧＶ）、グリシル－メチオニン（ＧＭ）、グリシル－シクロヘキシルアラニン（ＧＣｈａ）、グリシル－ホモロイシン（ＧＨｌｅ）、およびグリシル－フェニルアラニン（ＧＦ）からなる群から選択される、項目６８～７０のいずれか一項に記載の方法。
（項目７２）
前記多量体化ドメインが、二量体、四量体、六量体、八量体、十量体、または十二量体である、項目２７～７１のいずれか一項に記載の方法。
（項目７３）
前記多量体化ドメインが、四量体である、項目２７～７２のいずれか一項に記載の方法。
（項目７４）
前記多量体化ドメインが、ホモ多量体である、項目２７～７３のいずれか一項に記載の方法。
（項目７５）
前記多量体化ドメインが、ヘテロ多量体である、項目２７～７３のいずれか一項に記載の方法。
（項目７６）
前記多量体化ドメインが、ストレプトアビジンまたはその誘導体を含む、項目２７～７５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７７）
前記多量体化ドメインが、ストレプトアビジンまたはその誘導体の四量体である、項目７６に記載の方法。
（項目７８）
前記多量体化ドメインが、Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇ（登録商標）またはＳｔｒｅｐ－ｔａｃｔｉｎ（登録商標）を含む、項目７６に記載の方法。
（項目７９）
前記コンジュゲーション部分が、各ｐ ＊ ＭＨＣＩ単量体の前記ＭＨＣＩ重鎖α１ドメインのＣ末端に付着されており、ステップ（ｃ）が、前記ＭＨＣＩ α１ドメインのＣ末端への前記多量体化ドメインの共有結合的コンジュゲーションを含む、項目２７～７８のいずれか一項に記載の方法。
（項目８０）
前記コンジュゲーション部分が、各ｐ ＊ ＭＨＣＩの前記ＭＨＣＩ重鎖α２ドメインのＣ末端に付着されており、ステップ（ｃ）が、前記ＭＨＣＩ α２ドメインのＣ末端への前記多量体化ドメインの共有結合的コンジュゲーションを含む、項目２７～７８のいずれか一項に記載の方法。
（項目８１）
前記コンジュゲーション部分が、各ｐ ＊ ＭＨＣＩの前記ＭＨＣＩ重鎖α３ドメインのＣ末端に付着されており、ステップ（ｃ）が、前記ＭＨＣＩ α３ドメインのＣ末端への前記多量体化ドメインの共有結合的コンジュゲーションを含む、項目２７～７８のいずれか一項に記載の方法。
（項目８２）
前記コンジュゲーション部分が、各ｐ ＊ ＭＨＣＩ単量体の各ｐ ＊ ＭＨＣ単量体のβ２－ミクログロブリンのＣ末端に付着されており、ステップ（ｃ）が、各ｐ ＊ ＭＨＣ単量体の前記β２－ミクログロブリンのＣ末端への前記多量体化ドメインの共有結合的コンジュゲーションを含む、項目２７～７８のいずれか一項に記載の方法。
（項目８３）
ステップ（ｃ）が、前記多量体化ドメインへの前記２つまたはそれよりも多くのｐ ＊ ＭＨＣ単量体の化学的コンジュゲーションを含む、項目２７～８２のいずれか一項に記載の方法。
（項目８４）
前記化学的コンジュゲーションが、システインバイオコンジュゲーションによって媒介される、項目８３に記載の方法。
（項目８５）
前記化学的コンジュゲーションが、天然の化学的コンジュゲーションによって媒介される、項目８３に記載の方法。
（項目８６）
前記化学的コンジュゲーションが、クリックケミストリーによって媒介される、項目８３に記載の方法。
（項目８７）
各ｐ ＊ ＭＨＣＩ単量体の前記コンジュゲーション部分が、Ｘを含み、前記多量体化ドメインの各サブユニットの前記コンジュゲーション部分が、Ｙを含み、
（ｉ）Ｘが、末端アルキンであり、Ｙが、アジドである；
（ｉｉ）Ｘが、アジドであり、Ｙが、末端アルキンである；
（ｉｉｉ）Ｘが、歪んだアルキンであり、Ｙが、アジドである；
（ｉｖ）Ｘが、アジドであり、Ｙが、歪んだアルキンである；
（ｖ）Ｘが、ジエンであり、Ｙが、ジエノフィルである；
（ｖｉ）Ｘが、ジエノフィルであり、Ｙが、ジエンである；
（ｖｉｉ）Ｘが、チオールであり、Ｙが、アルケンである；または
（ｖｉｉｉ）Ｘが、アルケンであり、Ｙが、チオールである、
項目８６に記載の方法。
（項目８８）
前記アジドが、銅キレート化アジドである、項目８７に記載の方法。
（項目８９）
前記銅キレート化アジドが、ピコリルアジドである、項目８８に記載の方法。
（項目９０）
各ｐ ＊ ＭＨＣドメインの前記コンジュゲーション部分が、Ｎ末端に付着したペプチドリンカーを含み、前記多量体化ドメインの各サブユニットの前記コンジュゲーション部分が、前記多量体化ドメインの各サブユニットのＣ末端に付着したペプチドリンカーを含む、項目２７～８９のいずれか一項に記載の方法。
（項目９１）
各ｐ ＊ ＭＨＣ単量体のＣ末端の前記ペプチドリンカーが、（Ｇ） ｎ －Ｘ（ここで、ｎは、少なくとも２であり、Ｘは、化学的コンジュゲーションのために好適な部分である）を含み、前記多量体化ドメインの各サブユニットのＣ末端の前記ペプチドリンカーが、（Ｇ） ｎ －Ｙ（ここで、ｎは、少なくとも２であり、Ｙは、各ｐ ＊ ＭＨＣ単量体の前記Ｘ部分への化学的コンジュゲーションのために好適な部分である）を含む、項目９０に記載の方法。
（項目９２）
前記多量体化ドメインへの各ｐ ＊ ＭＨＣＩ単量体の共有結合的コンジュゲーションが、システイントランスペプチダーゼによって媒介される、項目２７～７８のいずれか一項に記載の方法。
（項目９３）
前記システイントランスペプチダーゼが、ソルターゼまたはその酵素的に活性な断片である、項目９２に記載の方法。
（項目９４）
各ｐ ＊ ＭＨＣＩ単量体の前記コンジュゲーション部分が、Ｃ末端ｓｏｒｔａｇを含み、前記多量体化ドメインの各サブユニットの前記コンジュゲーション部分が、Ｎ末端ｓｏｒｔａｇを含み、ステップ（ｃ）が、ｐ ＊ ＭＨＣＩ単量体および多量体化ドメインの混合物への前記ソルターゼの添加を含み、各ｐ ＊ ＭＨＣ単量体と前記多量体化ドメインとの間のペプチド結合の形成を触媒して、ｐ ＊ ＭＨＣ多量体を産生する、項目９３に記載の方法。
（項目９５）
ステップ（ａ）における前記２つまたはそれよりも多くのｐ ＊ ＭＨＣＩ単量体が、化学的コンジュゲーションのために好適な部分を含むペプチドリンカーの存在下でＣ末端ｓｏｒｔａｇを含むｐ ＊ ＭＨＣＩ単量体を前記ソルターゼまたはその酵素的に活性な断片と接触させることによって産生され、前記ソルターゼまたはその酵素的に活性な断片が、前記ｐ ＊ ＭＨＣ単量体への前記ペプチドリンカーの前記コンジュゲーションを媒介し、
ステップ（ｂ）における前記多量体化ドメインが、化学的コンジュゲーションのために好適な部分を含むペプチドリンカーの存在下でＣ末端ｓｏｒｔａｇを含む多量体化ドメインを前記ソルターゼと接触させることによって産生され、前記ソルターゼまたはその酵素的に活性な断片が、前記多量体化ドメインの各サブユニットのＮ末端の前記ペプチドリンカーの前記コンジュゲーションを媒介し、
ステップ（ｃ）が、前記ｐ ＊ ＭＨＣ多量体を産生するための、前記２つまたはそれよりも多くのｐ ＊ ＭＨＣ単量体のＣ末端の前記ペプチドリンカーと前記多量体化ドメインの各サブユニットのＣ末端の前記ペプチドリンカーとの間の化学的コンジュゲーションを含む、項目９２に記載の方法。
（項目９６）
各ｐ ＊ ＭＨＣ単量体のＣ末端の前記ペプチドリンカーが、（Ｇ） ｎ －Ｘ（ここで、ｎは、少なくとも２であり、Ｘは、クリックケミストリーコンジュゲーションのために好適な部分である）を含み、前記多量体化ドメインの各サブユニットのＮ末端の前記ペプチドリンカーが、（Ｇ） ｎ －Ｙ（ここで、ｎは、少なくとも２であり、Ｙは、各ｐ ＊ ＭＨＣ単量体の前記Ｘ部分とのクリックケミストリーコンジュゲーションのために好適な部分である）を含む、項目９５に記載の方法。
（項目９７）
（ｉ）Ｘが、末端アルキンであり、Ｙが、アジドである；
（ｉｉ）Ｘが、アジドであり、Ｙが、末端アルキンである；
（ｉｉｉ）Ｘが、歪んだアルキンであり、Ｙが、アジドである；
（ｉｖ）Ｘが、アジドであり、Ｙが、歪んだアルキンである；
（ｖ）Ｘが、ジエンであり、Ｙが、ジエノフィルである；
（ｖｉ）Ｘが、ジエノフィルであり、Ｙが、ジエンである；
（ｖｉｉ）Ｘが、チオールであり、Ｙが、アルケンである；または
（ｖｉｉｉ）Ｘが、アルケンであり、Ｙが、チオールである、
項目９６に記載の方法。
（項目９８）
前記アジドが、銅キレート化アジドである、項目９７に記載の方法。
（項目９９）
前記銅キレート化アジドが、ピコリルアジドである、項目９８に記載の方法。
（項目１００）
前記ソルターゼまたはその酵素的に活性な断片が、Ｃａ２＋依存性である、項目９３～９９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０１）
前記ソルターゼまたはその酵素的に活性な断片が、Ｃａ２＋非依存性である、項目９３～９９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０２）
前記ソルターゼが、野生型ソルターゼの可溶性断片である、項目９３～９９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０３）
前記ソルターゼが、Ｓ．ａｕｒｅｕｓソルターゼＡのバリアントまたはホモログである、項目９３～９９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０４）
前記ソルターゼが、改変ソルターゼＡの可溶性断片である、項目９３～９９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０５）
前記ソルターゼが、ＳｒｔＡｓｔａｐｈ突然変異体である、項目９３～９９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０６）
前記ＳｒｔＡｓｔａｐｈ突然変異体が、Ｆ４０、ＳｒｔＡｓｔａｐｈ五重突然変異体、２Ａ－９、および４Ｓ－９からなる群から選択される、項目１０５に記載の方法。
（項目１０７）
前記多量体化ドメインへの各ｐ ＊ ＭＨＣＩ単量体の前記共有結合的コンジュゲーションが、インテインによって媒介される、項目２７～７８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０８）
前記インテインが、ＭｘｅＧｙｒＡ、ＳｓｐＤｎａＥ、ＮｐｕＤｎａＥ、ＡｖａＤｎａＥ、Ｃｆａ（コンセンサスＤｎａＥスプリットインテイン）、ｇｐ４１－１、ｇｐ４１－８、およびＮｒｄＪ－１からなる群から選択される、項目１０７に記載の方法。
（項目１０９）
前記インテインが、スプリットインテイン対である、項目１０７に記載の方法。
（項目１１０）
各ｐ ＊ ＭＨＣＩ単量体が、インテインペプチドタグによって前記多量体化ドメインにコンジュゲートされている、項目２７～７８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１１）
各ｐ ＊ ＭＨＣＩ単量体が、Ｃ末端にＮ－インテイン断片を含み、前記多量体化ドメインの各サブユニットが、Ｎ末端にＮｐｕ－Ｃ－インテイン断片を含む、項目２７～７８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１２）
前記多量体化ドメインが、識別子を含む、項目２７～１１１のいずれか一項に記載の
方法。
（項目１１３）
前記識別子が、核酸識別子である、項目１１２に記載の方法。
（項目１１４）
前記核酸識別子が、前記ペプチドをコードする、項目１１３に記載の方法。
（項目１１５）
前記核酸識別子が、２５ヌクレオチド長～５００ヌクレオチド長である、項目１１３または１１４に記載の方法。
（項目１１６）
前記核酸識別子が、４０ヌクレオチド長～１２０ヌクレオチド長である、項目１１３または１１４に記載の方法。
（項目１１７）
多様なペプチドエピトープロードＭＨＣＩ（ｐＭＨＣＩ）多量体を含むライブラリーを産生する方法であって、
（ａ）（ｉ）ＭＨＣＩ重鎖ポリペプチドまたはその機能的断片、（ｉｉ）β２－ミクログロブリンポリペプチドまたはその機能的断片、（ｉｉｉ）コンジュゲーション部分、および（ｉｖ）各ＭＨＣＩ単量体のペプチド結合溝中で結合したプレースホルダペプチドをそれぞれ含む、複数のプレースホルダペプチドロードＭＨＣＩ（ｐ ＊ ＭＨＣＩ）単量体を提供するステップ；
（ｂ）複数の多量体化ドメインを提供するステップであって、前記多量体化ドメインの各サブユニットが、コンジュゲーション部分を含む、ステップ；
（ｃ）前記２つまたはそれよりも多くのｐ ＊ ＭＨＣＩ単量体と多量体化ドメインとの間の共有結合的コンジュゲーションのために十分な条件下で前記ｐ ＊ ＭＨＣＩ単量体および前記多量体化ドメインを接触させて、ｐ ＊ ＭＨＣＩ多量体を産生するステップ；ならびに
（ｄ）前記複数のｐ ＊ ＭＨＣＩ多量体中の前記プレースホルダペプチドを複数の固有のＭＨＣＩペプチドエピトープを含むペプチドライブラリーで置き換えて、複数のペプチドロードＭＨＣＩ（ｐＭＨＣＩ）多量体を産生するステップ
を含む、方法。
（項目１１８）
多様なバーコード化ペプチドロード主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ（ｐＭＨＣＩ）多量体を含むライブラリーを産生する方法であって、
（ａ）（ｉ）ＭＨＣＩ重鎖ポリペプチドまたはその機能的断片、（ｉｉ）β２－ミクログロブリンポリペプチドまたはその機能的断片、（ｉｉｉ）コンジュゲーション部分、および（ｉｖ）各ＭＨＣＩ単量体のペプチド結合溝中で結合したプレースホルダペプチドをそれぞれ含む、複数のプレースホルダペプチドロードＭＨＣＩ（ｐ ＊ ＭＨＣＩ）単量体を提供するステップ；
（ｂ）複数の多量体化ドメインを提供するステップであって、前記多量体化ドメインの各サブユニットが、コンジュゲーション部分を含み、前記多量体化ドメインが、少なくとも１つの非共有結合部位を含む、ステップ；
（ｃ）前記２つまたはそれよりも多くのｐ ＊ ＭＨＣＩ単量体と多量体化ドメインとの間の共有結合的コンジュゲーションのために十分な条件下で前記複数のｐ ＊ ＭＨＣＩ単量体および前記複数の多量体化ドメインを接触させて、複数のｐ ＊ ＭＨＣＩ多量体を産生するステップ；
（ｄ）前記ｐ ＊ ＭＨＣＩ多量体の前記ペプチド結合溝中で結合した前記プレースホルダペプチドを複数の固有のレスキューペプチドエピトープで置き換えて、複数のｐＭＨＣＩ多量体を産生するステップ；ならびに
（ｅ）オリゴヌクレオチドバーコードを前記多量体化ドメインの前記非共有結合部位に結合させるステップ
を含む、方法。
（項目１１９）
多様なバーコード化ペプチドロード主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ（ｐＭＨＣＩ）多量体を含むライブラリーを産生する方法であって、
（ａ）（ｉ）ＭＨＣＩ重鎖ポリペプチドまたはその機能的断片、（ｉｉ）β２－ミクログロブリンポリペプチドまたはその機能的断片、（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）のＣ末端にコンジュゲーション部分を含むペプチドリンカー、および（ｉｖ）各ＭＨＣＩ単量体のペプチド結合溝中で結合したプレースホルダペプチドをそれぞれ含む、複数のプレースホルダペプチドロードＭＨＣＩ（ｐ ＊ ＭＨＣＩ）単量体を提供するステップ；
（ｂ）多量体化ドメインの各サブユニットのＣ末端にコンジュゲーション部分を含むペプチドリンカーを含む複数の前記多量体化ドメインを提供するステップ；
（ｃ）多量体化ドメインへの２つまたはそれよりも多くのｐ ＊ ＭＨＣＩ単量体間の共有結合的コンジュゲーションのために十分な条件下で前記複数のｐ ＊ ＭＨＣＩ単量体および前記複数の多量体化ドメインを接触させて、複数のｐ ＊ ＭＨＣＩ多量体を産生するステップ；ならびに
（ｄ）前記ｐ ＊ ＭＨＣＩ多量体の前記ペプチド結合溝中で結合した前記プレースホルダペプチドを複数の固有のレスキューペプチドエピトープで置き換えて、複数のｐＭＨＣＩ多量体を産生するステップ
を含む、方法。
（項目１２０）
ＭＨＣＩペプチドエピトープの前記ライブラリーが、高多様性ペプチドライブラリーである、項目１１７～１１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２１）
前記ペプチドライブラリーが、約１０ ３ 、約１０ ４ 、約１０ ５ 、約１０ ６ 、約１０ ７ 、約１０ ８ 、約１０ ９ 、約１０ １０ 、約１０ １１ 、約１０ １２ 、約１０ １３ 、約１０ １４ 、約１０ １５ 、約１０ １６ 、約１０ １７ 、約１０ １８ 、約１０ １９ 、約１０ ２０ 、またはそれよりも多くの異なるＭＨＣＩペプチドエピトープを含む、項目１２０に記載の方法。
（項目１２２）
前記ＭＨＣＩペプチドエピトープが、単一の抗原性タンパク質に由来する、項目１１７～１２０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２３）
前記ＭＨＣＩペプチドエピトープが、抗原性タンパク質の重複する断片を含む、項目１２２に記載の方法。
（項目１２４）
前記複数の固有のペプチドエピトープが、生物体のゲノム、生物体のトランスクリプトーム、生物体のプロテオーム、生物体のペプチドまたはタンパク質から生成される、項目１１７～１２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２５）
前記複数の固有のペプチドエピトープが、２つのゲノム間の異なる配列から生成される、項目１１７～１２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２６）
前記ｐＭＨＣ多量体のそれぞれが、固有の識別子部分を含む、項目１１７～１２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２７）
前記固有の識別子部分が、核酸である、項目１２６に記載の方法。
（項目１２８）
複数のペプチドロードＭＨＣＩ（ｐＭＨＣＩ）多量体を含むポリペプチドライブラリーであって、前記ペプチドロードｐＭＨＣＩ多量体のそれぞれが、多量体化ドメインにコンジュゲートされた２つまたはそれよりも多くのｐＭＨＣＩ単量体を含む、ポリペプチドライブラリー。
（項目１２９）
ＭＨＣ多量体が結合したリンパ球を単離する方法であって、
（ａ）複数のリンパ球をｐＭＨＣＩ多量体のライブラリーと接触させるステップ；ならびに
（ｂ）複数のコンパートメントを生成するステップであって、各コンパートメントが、前記ライブラリーのｐＭＨＣＩ多量体に結合したリンパ球、および捕捉支持体を含む、ステップ
を含む、方法。
（項目１３０）
前記リンパ球が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、またはＮＫ細胞である、項目１２９に記載の方法。
（項目１３１）
ｐＭＨＣ多量体に結合したリンパ球を識別する方法であって、
（ａ）複数のリンパ球をｐＭＨＣＩ多量体のライブラリーと接触させるステップ；
（ｂ）単一のコンパートメント中に前記ライブラリーのｐＭＨＣＩ多量体に結合した前記複数のリンパ球のうちの１つのリンパ球をコンパートメント化するステップであって、前記ｐＭＨＣＩ多量体が、固有の識別子を含む、ステップ；および
（ｃ）前記コンパートメント化されたリンパ球に結合した前記ｐＭＨＣＩについての固有の識別子を決定するステップ
を含む、方法。
本発明の新規な特徴は、添付の特許請求の範囲に詳細に記載される。本発明の特徴および利点のより良い理解は、本発明の原理が利用される例示的な実施形態を記載する以下の詳細な説明、および添付の図面を参照することによって得られるであろう。
図１は、さまざまなクリックケミストリーハンドルおよび反応を例示する。 図２は、さまざまなペプチド交換方法を例示する。 図３Ａ～３Ｅは、コンジュゲーション反応のＳＤＳ－ＰＡＧＥまたはウエスタンブロット解析を示す。模式図の画像は、１つ、２つ、３つまたは４つのＨＬＡ分子に連結されたＳＡｖ四量体を表す。矢印は、所望されない副産物を示す。図３Ａ：ＳＡｖコンジュゲーション反応の抗Ｈｉｓウエスタンブロット解析。それぞれのレーンの説明を表中に示す。反応の程度は、参照ＳＡタンパク質との比較に基づいて、およそ９４～９７％である。図３Ｂ：ＨＬＡ－Ａ２－ＤＢＣＯ－ＳＡｖ－ＡｚのＳＤＳ－ＰＡＧＥ画像。レーン１：ＳｅｅＢｌｕｅとタンパク質標準、レーン２：ＳＡ－Ａｚ（ボイルなし）、レーン３：ＳＡ－Ａｚ（ボイル）、レーン４：ＨＬＡ－Ａ２－ＤＢＣＯ－ＳＡｖ－Ａｚ（ボイルなし、還元なし）、レーン５：ＨＬＡ－Ａ２－ＤＢＣＯ－ＳＡｖ－Ａｚ（ボイル、還元）。図３Ｃ：ＨＬＡ－Ａ２－Ａｚ－ＳＡｖ－ＤＢＣＯのＳＤＳ－ＰＡＧＥ画像。レーン１：ＳｅｅＢｌｕｅとタンパク質標準、レーン２：ＨＬＡ－Ａ２－Ａｚ（ボイルなし）、レーン３：ＨＬＡ－Ａ２－Ａｚ－ＳＡｖ－ＤＢＣＯ（ボイルなし）、レーン４～７：ＨＬＡ－Ａ２－Ａｚ－ＳＡｖ－ＤＢＣＯ反応（ボイルなし）。図３Ｄ：ＨＬＡ－Ａ２－Ａｌｋ－ＳＡｖ－ＡｚのＳＤＳ－ＰＡＧＥ画像。レーン１：ＳｅｅＢｌｕｅとタンパク質標準、レーン３：ＨＬＡ－Ａ２－Ａｌｋ－ＳＡｖ－Ａｚ（ボイルなし、還元なし）、レーン５：ＨＬＡ－Ａ２－アルキン－ＳＡｖ－Ａｚ（ボイル、還元）。図３Ｅ：コンジュゲートされた四量体フォーマット中のＨＬＡ－Ａ＊０１：０１、ＨＬＡ－Ａ＊０３：０１、およびＨＬＡ－Ａ＊２４：０２のＳＤＳ－ＰＡＧＥ画像。試料は、ボイルなし／還元なし（ＮＢ／ＮＲ）またはボイル／還元（ボイル／Ｒ）のいずれかであった。 同上。 同上。 ＨＬＡ－Ａ２－Ｎ－インテイン／β２ｍ／ペプチド複合体とＳＡｖ－Ｃ－インテインとの間のインテインスプライシング反応のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。 図５Ａおよび５Ｂは、示差走査蛍光定量法によってモニターされたＵＶ交換を示す。図５Ａは、プレースホルダＧＩＬＧＦＶＦＪＬペプチド（配列番号７）を含有する実施例１と同様に産生されたか、または過剰のＮＬＶＰＭＶＡＴＶペプチド（配列番号８）の存在下でのＵＶ交換後のＨＬＡ－Ａ＊０２：０１－Ａｌｋ－ＳＡｖ－Ａｚコンジュゲート化四量体の示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）を示し、より高い親和性のペプチドへの交換を示す安定性の２０℃の増加を示す。図５Ｂは、単量体におけるＵＶ交換とそれに続く四量体化によって、または四量体それ自体におけるＵＶ交換によって産生されたＨＬＡ－Ａ＊０２ビオチン媒介四量体のＤＳＦであり、多量体状態がＵＶ交換の効率に影響を及ぼさないこと、および本発明の多量体が業界標準のｐＭＨＣと同じ安定性を有することを確認する。 図６Ａ～６Ｆは、ビオチン化ＨＬＡ－Ａ＊０２単量体および四量体におけるペプチド交換後のフローサイトメトリーを表す。ＮＬＶＰＭＶＧＴＶペプチド（配列番号９）とともに拡大されたドナーＰＢＭＣを以下で染色した：抗ＣＤ８－ＢＶ７８５および抗Ｆｌａｇ－ＡＰＣ二次のみ（図６Ａ）、プレースホルダペプチドＧＩＬＧＦＶＦＪＬ（配列番号７）がロードされた５０ｎＭのＨＬＡ－Ａ＊０２ビオチン媒介四量体（図６Ｂ）、ＮＬＶＰＭＶＡＴＶペプチド（配列番号８）で再フォールドされた５０ｎＭのＨＬＡ－Ａ＊０２ビオチン媒介四量体（図６Ｃ）、単量体形態におけるＵＶ交換とそれに続くストレプトアビジンによる四量体化を介したＮＬＶＰＭＶＡＴＶペプチド（配列番号８）がロードされた５０ｎＭのＨＬＡ－Ａ＊０２ビオチン媒介四量体（図６Ｄ）、四量体形態それ自体におけるＵＶ交換を介してＮＬＶＰＭＶＡＴＶペプチド（配列番号８）がロードされた５０ｎＭのＨＬＡ－Ａ＊０２ビオチン媒介四量体（図６Ｅ）、ならびに四量体形態それ自体におけるジペプチド交換を介してＮＬＶＰＭＶＡＴＶペプチド（配列番号８）がロードされた５０ｎＭのＨＬＡ－Ａ＊０２ビオチン媒介四量体（図６Ｆ）。 図７Ａ～７Ｂは、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１－Ａｌｋ－ＳＡｖ－Ａｚコンジュゲート化四量体におけるＵＶ交換後のフローサイトメトリーを表す。ＮＬＶＰＭＶＡＴＶペプチド（配列番号８）とともに拡大されたドナーＰＢＭＣを以下で染色した：抗ストレプトアビジンＰＥおよび抗Ｆｌａｇ－ＡＰＣ二次のみ（図７Ａ）、または四量体形態における直接ＵＶ交換を介してＮＬＶＰＭＶＡＴＶペプチド（配列番号８）がロードされた１ｎＭのＨＬＡ－Ａ＊０２：０１－Ａｌｋ－ＳＡｖ－Ａｚコンジュゲート化四量体（図７Ｂ）。 図８Ａ～８Ｃは、ＵＶ交換されたＨＬＡ－Ａ＊０２四量体の安定性試験としてのＥＬＩＳＡおよびＤＳＦの比較を表す。具体的には、図８Ａは、ＮＬＶＰＭＶＡＴＶペプチド（配列番号８）の変更ペプチドリガンド（ＡＰＬ）を表す１９２メンバーのペプチドパネルにＵＶ交換されたＨＬＡ－Ａ＊０２：０１－Ａｌｋ－ＳＡｖ－Ａｚコンジュゲート化四量体のＥＬＩＳＡ分析を表す。ＥＬＩＳＡ ＯＤを、各ペプチドについての正味ＭＨＣ予測ＩＣ５０に対してプロットする。異なるペプチドは、ＥＬＩＳＡシグナルの範囲に及ぶ。図８Ｂは、ビオチン媒介四量体にＵＶ交換されたＮＬＶＰＭＶＡＴＶ（配列番号８）ＡＰＬペプチドのサブセットについてのＤＳＦ曲線を示し、安定性の範囲を実証する。図８Ｃは、ビオチン媒介四量体にＵＶ交換されたＮＬＶＰＭＶＡＴＶ（配列番号８）ＡＰＬペプチドのサブセットについてのＤＳＦ／ＥＬＩＳＡ相関を示す。 図９Ａ～９Ｄは、ＨＬＡ－Ａ＊０１：０１－Ａｌｋ－ＳＡｖ－Ａｚコンジュゲート化四量体の品質管理分析を表す。具体的には、図９Ａは、低凝集性のＨＬＡ－Ａ＊０１：０１四量体の分析的ＳＥＣクロマトグラムを表す。図９Ｂは、ＨＬＡ－Ａ＊０１：０１－Ａｌｋ－ＳＡｖ－Ａｚコンジュゲート化四量体のボイルなし／還元なし（ＮＢ／ＮＲ）またはボイル／還元（ボイル／Ｒ）のＳＤＳ－ＰＡＧＥを表す。図９Ｃは、プレースホルダペプチドＳＴＡＰＧＪＬＥＹ（配列番号１６）がロードされた（ＵＶなし）、またはレスキューペプチドの非存在（ＵＶペプチドなし）もしくは存在（ＵＶ＋ＶＴＥＨＤＴＬＬＹ（配列番号１０））下でのＵＶ交換後のＨＬＡ－Ａ＊０１：０１－Ａｌｋ－ＳＡｖ－Ａｚコンジュゲート化四量体のＤＳＦを表す。図９Ｄは、ＶＴＥＨＤＴＬＬＹペプチド（配列番号１０）とともに拡大され、再フォールディングによってＶＴＥＨＤＴＬＬＹペプチド（配列番号１０）がロードされた２０ｎＭのＨＬＡ－Ａ＊０１：０１ビオチン媒介四量体（再フォールドＶＴＥ）、ＳＴＡＰＧＪＬＥＹ（配列番号１６）がロードされたＨＬＡ－Ａ＊０１：０１－Ａｌｋ－ＳＡｖ－Ａｚコンジュゲート化四量体（ＵＶなし）、またはレスキューペプチドＶＴＥＨＤＴＬＬＹ（配列番号１０）の存在下でのＵＶ交換後のＨＬＡ－Ａ＊０１：０１－Ａｌｋ－ＳＡｖ－Ａｚコンジュゲート化四量体（ＵＶ＋ＶＴＥ）で染色されたＰＢＭＣについてのフローサイトメトリーデータを表す。四量体陽性細胞の割合（四量体＋％）および平均蛍光強度（ＭＦＩ）の両方を表す。 図１０Ａ～１０Ｄは、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２－Ａｌｋ－ＳＡｖ－Ａｚコンジュゲート化四量体の品質管理分析を表す。具体的には、図１０Ａは、低凝集性のＨＬＡ－Ａ＊２４：０２四量体の分析的ＳＥＣクロマトグラムを表す。図１０Ｂは、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２－Ａｌｋ－ＳＡｖ－Ａｚコンジュゲート化四量体のボイルなし／還元なし（ＮＢ／ＮＲ）またはボイル／還元（ボイル／Ｒ）のＳＤＳ－ＰＡＧＥを表す。図１０Ｃは、プレースホルダペプチドＶＹＧＪＶＲＡＣＬ（配列番号１１）がロードされた（ＵＶなし）、またはレスキューペプチドの非存在（ＵＶペプチドなし）もしくは存在（ＵＶ＋ＱＹＤＰＶＡＡＬＦ（配列番号１２））下でのＵＶ交換後のＨＬＡ－Ａ＊２４：０２－Ａｌｋ－ＳＡｖ－Ａｚコンジュゲート化四量体のＤＳＦを表す。図１０Ｄは、ＱＹＤＰＶＡＡＬＦペプチド（配列番号１２）とともに拡大され、二次のみ、再フォールディングによってＱＹＤＰＶＡＡＬＦペプチド（配列番号１２）がロードされた２０ｎＭのＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ビオチン媒介四量体（再フォールドＱＹＤ）、ＶＹＧＪＶＲＡＣＬ（配列番号１１）がロードされた２０ｎＭのＨＬＡ－Ａ＊２４：０２－Ａｌｋ－ＳＡｖ－Ａｚコンジュゲート化四量体（ＵＶなし）、またはレスキューペプチドＱＹＤＰＶＡＡＬＦ（配列番号１２）の存在下でのＵＶ交換後の２０ｎＭのＨＬＡ－Ａ＊２４：０２－Ａｌｋ－ＳＡｖ－Ａｚコンジュゲート化四量体（ＵＶ＋ＱＹＤ）で染色されたＰＢＭＣについてのフローサイトメトリーデータを表す。四量体陽性細胞の割合（四量体＋％）および平均蛍光強度（ＭＦＩ）の両方を表す。 図１１Ａ～１１Ｃは、ＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２－Ａｌｋ－ＳＡｖ－Ａｚコンジュゲート化四量体の品質管理分析を表す。具体的には、図１１Ａは、凝集なしのＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２四量体の分析的ＳＥＣクロマトグラムを表す。図１１Ｂは、ＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２－Ａｌｋ－ＳＡｖ－Ａｚコンジュゲート化四量体のボイルなし／還元なし（ＮＢ／ＮＲ）のＳＤＳ－ＰＡＧＥを表す。図１１Ｃは、ＲＰＨＥＲＮＧＦＴＶＬペプチド（配列番号１３）とともに拡大され、二次のみ、再フォールディングによってＲＰＨＥＲＮＧＦＴＶＬペプチド（配列番号１３）がロードされた２０ｎＭのＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２ビオチン媒介四量体（再フォールドＲＰＨ）、ＡＡＲＧＪＴＬＡＭ（配列番号１４）がロードされた２０ｎＭのＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２－Ａｌｋ－ＳＡｖ－Ａｚコンジュゲート化四量体（ＵＶなし）、またはレスキューペプチドＲＰＨＥＲＮＧＦＴＶＬ（配列番号１３）の存在下でのＵＶ交換後の２０ｎＭのＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２－Ａｌｋ－ＳＡｖ－Ａｚコンジュゲート化四量体（ＵＶ＋ＲＰＨ）で染色されたＰＢＭＣについてのフローサイトメトリーデータを表す。四量体陽性細胞の割合（四量体＋％）および平均蛍光強度（ＭＦＩ）の両方を表す。 図１２は、識別性オリゴヌクレオチドタグによるＨＬＡ－Ａ＊０２：０１－Ａｌｋ－ＳＡｖ－Ａｚコンジュゲート化四量体の標識化を表す。実施例１に記載されるように産生されたＨＬＡ－Ａ＊０２：０１－Ａｌｋ－ＳＡｖ－Ａｚコンジュゲート化四量体を、５’ビオチン化オリゴヌクレオチドとともにインキュベートし、抗Ｆｌａｇ抗体でプロービングしたウエスタンによって分離した。オリゴ添加の際にシフトしたバンドは四量体の標識化を示した。 図１３は、バーコード化ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１－Ａｌｋ－ＳＡｖ－Ａｚ ＡＰＬライブラリーの単一細胞配列決定を示す。単一細胞配列決定によって識別される個々のＴ細胞へのｐＭＨＣ結合のヒートマップ。２００８の個々の細胞を表すカラムを、ＴＣＲクローン型によってクラスター化し、列は、ＮＬＶＰＭＡＴＶ（配列番号８）の１９２個のＡＰＬバリアントのそれぞれを表す。暖色は、オリゴヌクレオチドタグを識別することによる強いｐＭＨＣ－ＴＣＲ相互作用の読み取りを示す。 図１４は、単一鋳型条件下でのヒドロゲル上のペプチドコード鋳型のＰＣＲ増幅を表す。ＰＣＲを、単一鋳型条件下のバルク中または液滴のカプセル化後のいずれかのヒドロゲルビーズにおいて実施した。ＰＣＲ後の液滴の破壊の際に放出される上清は、ＸｂａＩまたはモック消化によってビーズから放出された産物の隣で泳動した。 図１５は、液滴中での単一鋳型増幅の検証を示す。単一鋳型条件下でのバルクまたは液滴中での鋳型のＰＣＲ増幅後のヒドロゲルを、ストレプトアビジン－ＰＥで染色した。蛍光ヒドロゲルを、全ヒドロゲルに対して定量化して、単一鋳型条件を確認した。 図１６Ａ～１６Ｂは、ＰＣＲ増幅されたヒドロゲル上のＨＬＡ－Ａ＊０２：０１－Ａｌｋ－ＳＡｖ－Ａｚコンジュゲート化四量体のローディングを表す。コンジュゲート化四量体によるローディングまたはその後のベンゾナーゼもしくはＳｍａＩによる放出後の抗Ｆｌａｇ－ＡＰＣまたは抗β２Ｍ－Ａｌｅｘａ４８８で染色されたヒドロゲルについてのシグナルとノイズの比（図１６Ａ）。ヒドロゲルローディングステップ後の上清中に残った、またはベンゾナーゼもしくはＳｍａＩによるロードされたヒドロゲルから放出された、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１－Ａｌｋ－ＳＡｖ－Ａｚコンジュゲート化四量体のＥＬＩＳＡで決定された濃度（図１６Ｂ）。 図１７Ａ～１７Ｂは、機能的ＵＶ交換四量体を生成するためのＩＶＴＴペプチド産生を表す。抗ＳＵＭＯドメイン抗体によって探索されるウエスタン：ＳＵＭＯ－ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ（配列番号８）ペプチド融合物をコードするＰＣＲアンプリコン鋳型によって駆動されるＩＶＴＴ反応（＋／－ Ｕｌｐ１プロテアーゼ）の産物をレーン１０～１１において泳動した（図１７Ａ）。レーン２～９は、ＳＵＭＯドメイン含有標準の希釈系列を含有し、これは、約１ｕＭまでＳＵＭＯドメインの収率を定量化するために使用した（図１７Ａ）。ＩＶＴＴ産生したペプチドからＵＶ交換によって産生した四量体のフロー分析（図１７Ｂ）。四量体を、等モルの合成ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ（配列番号８）ペプチド（ＵＶ ｅｘ １：１ ＮＬＶ－合成）またはＳＵＭＯ－ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ（配列番号８）ペプチド鋳型によって駆動されたＩＶＴＴ反応（＋Ｕｌｐ１）（ＵＶ ｅｘ ＮＬＶ－ＩＶＴＴ）の存在下でＵＶ交換し、ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ（配列番号８）－拡大ＰＢＭＣにおいて１ｎＭで染色した（図１７Ｂ）。ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ（配列番号８）またはＧＩＬＧＦＶＦＪＬ（配列番号７）ペプチドで再フォールドされた陽性および陰性対照四量体も、示されるように、１ｎＭで染色した（図１７Ｂ）。 図１８は、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞において染色された、液滴法において利用されるヒドロゲルから産生および放出されたｐＭＨＣ四量体についてのフローサイトメトリーの結果を示す。 図１９は、交換可能なバーコード化可能四量体を使用するハイスループットバーコード化抗原ライブラリー産生を示す概略図である。 図２０は、ＳＡｖへのｐ＊ＭＨＣＩＩのコンジュゲーションのためのｓｏｒｔａｇおよびクリックケミストリーの使用、プレースホルダペプチド内のペプチドリンカーの切断、レスキューペプチドによるプレースホルダペプチドの交換、ならびにＴＣＲへの結合を示す概略図である。 図２１Ａ～２１Ｅは、ｐ＊ＭＨＣＩＩ多量体の生成を表す。図２１Ａ：単量体ｐ＊ＭＨＣＩＩのα鎖へのＧＧＧ－アルキンコンジュゲーションの抗Ｍｙｃウエスタンブロット解析。図２１Ｂ：ｐ＊ＭＨＣＩＩ－ＡｌｋおよびＳＡｖ－Ａｚのクリック反応後のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。図２１Ｃ：クリック反応試料のＨｉＬｏａｄ ２６／６００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ＳＥＣ溶出クロマトグラム。図２１Ｄ：ＳＥＣから得られたメインピークの抗ＦＬＡＧウエスタンブロット解析。レーン１：カメレオンＤｕｏ Ｐｒｅ－染色タンパク質ラダー（Ｌｉｃｏｒ）、レーン２：ＳＥＣカラムへの試料のローディング前のクリック反応、レーン３および４：ピークＩからのＳＥＣ試料、レーン５および６：ピークＩＩからのＳＥＣ試料、レーン７：無ＳＡｖ。レーン番号は、ボイルなし試料に対応するが、アスタリスクでラベルされているレーン番号はボイル試料に対応する。図２１Ｅ：ＳＥＣ後に得られたメインピークの抗Ｈｉｓウエスタンブロット解析。レーン番号は、図２１Ｄに記載されるものと同じである。 図２２Ａ～２２Ｃは、ｐＭＨＣＩＩの消化、交換およびＴＣＲ結合を示す。図２２Ａ：第Ｘａ因子切断前および後のボイル試料およびボイルなし試料のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。図２２Ｂ：ｐ↓ＭＨＣＩＩ多量体に結合するビオチン化された交換されたペプチドの能力を検出するＥＬＩＳＡアッセイ。図２２Ｃ：ＨＡ特異的ＴＣＲと、コグネイトＨＡペプチドを提示するように交換されたｐ↓ＭＨＣＩＩ多量体との間の相互作用を測定するＢＬＩアッセイ。黒色、薄灰色および暗灰色の曲線は、それぞれ、交換ｐ↓ＭＨＣＩＩ、交換なしｐ＊ＭＨＣＩＩおよびＢＬＩ緩衝液のいずれかを含有するウェルにＴＣＲロードバイオセンサーを移動させることから得られたシグナルに対応する。破線は、分析物を欠くウェルへのバイオセンサーの移動を定義する（解離）。 図２３Ａ～Ｂは、抗原特異的Ｔ細胞におけるｐＭＨＣＩＩ四量体ライブラリーの染色を示す。図２３Ａ：ＤＲＢ１＊０１：０１対立遺伝子を発現し、インフルエンザ血球凝集素エピトープＰＫＹＶＫＱＮＴＬＫＬＡＴ（配列番号２８１）とともに拡大されたドナーＣＤ４＋ＰＢＭＣを、抗ストレプトアビジン－ＰＥおよび抗ＣＤ４－ＢＶ５１０二次により１０メンバーのＤＲＢ１＊０１：０１ライブラリーで染色した。四量体陽性ゲート中の細胞を、選別し、Ａ＊０２：０１四量体にロードされたＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号２８２）バリアントの６メンバーのライブラリーで染色されたＭＡＲＴ１抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞と混合し、得られたプールを、単一細胞配列決定に付し、得られたヒートマップを図２３Ｂに示す。ｙ軸に分布したほとんどの優位なＴＣＲクローン型は、ＨＡペプチドロードＤＲＢ１＊０１：０１四量体に特異的に結合する。
詳細な説明
定義
本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、下記で他に定義されない限り、当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有することが意図される。本明細書で用いられる技法の言及は、当業者に認識されるであろうその技法に対する変形形態または等価な技法の置換を含んで、当技術分野において通常理解される技法を指すことが意図される。以下の用語は、当業者によって十分に理解されると考えられるが、以下の定義は、ここに開示される主題の説明を容易にするために記載する。
本明細書で使用される場合、「約」は、当業者によって理解され、それが使用される文脈に応じていくらかの程度まで変わる。用語が使用される文脈を考慮して当業者に明確ではないこの用語の使用が存在する場合、「約」は、特定の値のプラスまたはマイナス１０％までを意味する。
本明細書で使用される場合、「変更ペプチドリガンド」または「ＡＰＬ」は、ＭＨＣ結合性ペプチドなどのペプチドリガンドの変更バージョンまたは突然変異バージョンを指す。ペプチドリガンドの変更バージョンまたは突然変異バージョンは、それが由来するペプチドリガンドと比較して、少なくとも１つの構造的改変（例えば、アミノ酸置換）を含有する。例えば、ＡＰＬのパネルは、公知のＭＨＣ結合性ペプチドの体系的またはランダム突然変異によって調製されて、それによって、本明細書に記載されるＭＨＣコンジュゲート化多量体上へのローディングのためのＭＨＣ結合性ペプチドのライブラリーとして使用することができるＡＰＬのプールを作出することができる。
本明細書で使用される場合、「および／または」という用語は、実体のリストの文脈で使用される場合、単独で、または任意の可能な組合せもしくは下位組合せに存在している実体を指す。
「抗原決定基」または「エピトープ」という用語は、Ｔ細胞受容体、ＭＨＣ分子または抗体の可変ドメインが特異的に結合する抗原上の部位を指す。エピトープは、連続アミノ酸、またはタンパク質の三次フォールディングによって並置される不連続アミノ酸の両方から形成され得る。連続アミノ酸から形成されるエピトープは、典型的には、変性溶媒への曝露において保持されるが、三次フォールディングによって形成されるエピトープは、典型的には、変性溶媒による処理において失われる。エピトープは、典型的には、固有の空間コンフォメーションにおいて、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個のアミノ酸を含む。どのエピトープが所与のＴＣＲまたは抗体によって結合されるかを決定するための方法（すなわち、エピトープマッピング）は、当技術分野において周知であり、例えば、免疫ブロットおよび免疫沈降アッセイが挙げられ、ここで、抗原由来の重複または連続ペプチドが、所与のＴＣＲまたは免疫グロブリンとの反応性について試験される。エピトープの空間コンフォメーションを決定する方法は、当技術分野における技法および本明細書に記載される技法、例えば、ｘ線結晶学的核磁気共鳴、極低温電子顕微鏡法（ｃｒｙｏ－ＥＭ）、水素重水素交換質量分析（ＨＤＸ－ＭＳ）、および部位特異的突然変異誘発が挙げられる（例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)を参照されたい）。
「アビディティー」という用語は、本明細書で使用される場合、多価分子（例えば、可溶性多量体ｐＭＨＣ－免疫グロブリンタンパク質）の標的分子との多数の結合部位の協同的相互作用性の機能としての結合強度を指す。ｓｗｉｔｃｈＳＥＮＳＥおよび表面プラズモン共鳴を含む、分子相互作用のアビディティーを特徴付けるためにいくつかの技術が存在する（Gjelstrup et al., J. Immunol. 188:1292-1306, 2012)；Vorup-Jensen, Adv. Drug. Deliv. Rev. 64:1759-1781, 2012）。
本明細書で使用される場合、「バーコード」は、オリゴヌクレオチドバーコードとも称され、それがコンジュゲートされる分子を識別する短いヌクレオチド配列（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２ヌクレオチドの長さ）である。バーコードは、例えば、反応混合物中の分子を識別するために使用することができる。バーコードは、例えば「固有分子識別子」バーコードをそれぞれ含有するプライマーを使用して逆転写を行うことによって、それがコンジュゲートされる分子を固有に識別する。他の実施形態では、それぞれの分子に固有の「分子バーコード」を含有するプライマーを利用することができる。分子をバーコードで標識するプロセスは、本明細書では、「バーコード化」と称する。「ＤＮＡバーコード」は、ＤＮＡ配列決定の間に標的分子を識別するために使用されるＤＮＡ配列である。一部の実施形態では、ＤＮＡバーコードのライブラリーは、例えばプール中のオリゴをアセンブルすることによって、ランダムに生成される。他の実施形態では、ＤＮＡバーコードのライブラリーは、インシリコで合理的に設計され、次いで製造される。
「結合親和性」は、一般に、分子（例えば、ＴＣＲ、ｐＭＨＣ）の単一の結合部位とその結合パートナーとの間の非共有結合的相互作用の総計の強度を指す。他に示されない限り、本明細書で使用される場合、「結合親和性」は、結合対（例えば、ＴＣＲおよび抗原）のメンバー間の１：１の相互作用を反映する内因的な結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、一般に、解離定数（ｋｄ）によって表すことができる。例えば、ｋｄは、約２００ｎＭ、１５０ｎＭ、１００ｎＭ、６０ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、８ｎＭ、６ｎＭ、４ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、またはそれよりも強くあり得、最大で１μＭを含む。親和性は、本明細書に記載される方法を含む、当技術分野において公知の一般的な方法によって測定することができる。低親和性ＴＣＲは、一般に、抗原にゆっくりと結合し、直ちに解離する傾向があるが、高親和性ＴＣＲは、一般に、抗原により速く結合し、より長く結合したままである傾向がある。結合親和性を測定する各種の方法は、当技術分野において公知であり、そのいずれかを本開示の目的のために使用することができる。
「生体直交型ケミストリー」という用語は、天然の生化学的プロセスを妨げることなく、生体系の内部で起こり得る任意の化学反応を指す。この用語は、生理学的ｐＨでｉｎ ｖｉｔｒｏで、または水の存在下で起こる化学反応である化学反応を含む。生体直交型を考慮すると、反応は、選択的であり、出発化合物中に見出される他の官能基との副反応は回避される。加えて、反応パートナー間で生じる共有結合は、強く、かつ生体反応に化学的に不活性でなければならず、所望の分子の生物活性に影響を及ぼしてはならない。
本明細書で使用される場合、「担体」および「薬学的に許容される担体」という用語は、生理学的に適合性である、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。
「キレーターリガンド」という用語は、本明細書で使用される場合、放射性標識された補欠分子族を生物学的に活性な標的分子（例えば、ペプチドまたはタンパク質）に共有結合的に連結する二官能性コンジュゲート性部分を指す。二官能性コンジュゲート性部分は、官能基、例えば、アミドカップリングのためにカルボン酸または活性化エステル、チオウレアカップリングのためにイソチオシアネート、およびチオールカップリングのためにマレイミドを利用する。
本明細書で使用される場合、「切断可能部分」という用語は、切断可能であるモチーフまたは配列を指す。一部の実施形態では、切断部分は、タンパク質、例えば、酵素的切断部位を含む。一部の実施形態では、切断部分は、例えば酸化／還元条件への曝露、光／超音波、温度、ｐＨ、圧力などによる、化学的切断部位を含む。
「クリックケミストリー」という用語は、新たな化合物およびコンビナトリアルライブラリーの迅速な合成のための信頼できる選択的な生体直交型反応のセットを指す。クリック反応の特性としては、生理学的条件下で安定な化合物を産生するための、モジュール性、範囲の広さ、高収率、立体選択性、およびシンプルな産物単離（非クロマトグラフ法による不活性副産物からの分離）が挙げられる。放射化学およびラジオファーマシーでは、クリックケミストリーは、選択的なモジュール性のビルディングブロックを使用し、触媒の非存在下で生物学的に関連する化合物を放射性標識するための化学選択的ライゲーションを可能にする、一連の標識化反応に対する一般的な用語である。「クリック反応」は、銅を用いて行うことができ、またはこれは、無銅クリック反応であり得る。クリックケミストリーハンドルおよび反応の非限定的な例を図１に示す。
本明細書で使用される場合、「共有結合的コンジュゲーションのために十分な条件」という用語は、限定されるものではないが、所望の共有結合的コンジュゲーション化学反応が起こるような好適な温度、ｐＨおよび反応構成要素の濃度を含む反応条件を指す。
本明細書で使用される場合、「コンジュゲート化多量体」という用語は、ｐＭＨＣコンジュゲート化多量体とも称され、コンジュゲーション部分を含むｐＭＨＣ単量体とコンジュゲーション部分を含む多量体化ドメインとの反応から生じる反応産物を指し、ここで、２つのコンジュゲーション部分は互いと反応して、ｐＭＨＣ単量体と多量体化ドメインとの間で共有結合的連結を形成し、それによってコンジュゲート化多量体を形成する。一実施形態では、コンジュゲート化多量体は、コンジュゲート化四量体であり、ここで、４つのｐＭＨＣ単量体は、それらのコンジュゲーション部分を通して多量体化ドメインと反応して、それによって四量体を形成する。一実施形態では、コンジュゲート化多量体は、ｐＭＨＣＩコンジュゲート化多量体（例えば、四量体）であり、ここで、ｐＭＨＣクラスＩ単量体が多量体化される。一実施形態では、コンジュゲート化多量体は、ｐＭＨＣＩＩコンジュゲート化多量体（例えば、四量体）であり、ここで、ｐＭＨＣクラスＩＩ単量体が多量体化される。
本明細書で使用される場合、「架橋ユニット」という用語は、別の（同じまたは異なる）分子に連結される分子を指し得る。一部の実施形態では、架橋ユニットは、単量体である。一部の実施形態では、架橋は、化学結合である。一部の実施形態では、架橋は、共有結合である。一部の実施形態では、架橋は、イオン結合である。一部の実施形態では、架橋は、連結される分子の少なくとも１つの物理的特性、例えばポリマーの物理的特性を変更する。
本明細書で使用される場合、「エンドプロテアーゼ」という用語は、非末端アミノ酸のペプチド結合を切断するプロテアーゼを指す。
本明細書で使用される場合、「エピトープ」（「ペプチドエピトープ」におけるような）という用語は、免疫受容体に結合する（それと相互作用する、またはそれによって認識される）抗原（例えば、抗原性タンパク質）の一部を指す。そのため、Ｔ細胞受容体は、ペプチドエピトープと複合体化された（それがロードされた）ＭＨＣ分子を認識し、それに結合する。
「交換可能ｐＭＨＣポリペプチド」、「交換可能ｐＭＨＣ多量体」および「プレースホルダペプチドロードＭＨＣポリペプチド」という用語は、本明細書で互換的に使用され、ＭＨＣポリペプチドの結合溝中にプレースホルダペプチドを含むＭＨＣ単量体またはＭＨＣ多量体を指し、「ｐ＊ＭＨＣ」単量体または多量体とも称される。「交換可能」は、プレースホルダペプチドの抗原ペプチドとの交換を可能にするｐ＊ＭＨＣ単量体またはｐ＊ＭＨＣ多量体の特性を指す。一実施形態では、交換可能ｐＭＨＣまたはｐ＊ＭＨＣポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩ分子の結合溝中にＭＨＣクラスＩ結合性ペプチドを有するＭＨＣクラスＩ分子を含む。別の実施形態では、交換可能ｐＭＨＣまたはｐ＊ＭＨＣポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩ分子の結合溝中にＭＨＣクラスＩＩ結合性ペプチドを有するＭＨＣクラスＩＩ分子を含む。
本明細書で互換的に使用される「融合タンパク質」または「融合ポリペプチド」は、２つのポリペプチドが単一のタンパク質分子に連結または融合することによって調製される組換えタンパク質を指す。
本明細書でＭＨＣ単量体に適用される「単離された」という用語は、ＭＨＣ糖タンパク質を指し、これは、その天然の状態以外であり、例えば、正常にＭＨＣを発現する細胞の細胞膜と会合しない。この用語は、全長サブユニット鎖、およびＭＨＣ単量体の機能的断片を包含する。機能的断片は、抗原結合部位および適切なＴ細胞受容体による認識のために必要な配列を含むものである。これは、典型的には、全長鎖の配列の少なくとも約６０～８０％、典型的には９０～９５％を含む。「単離された」ＭＨＣサブユニット構成要素は、適切な細胞起源から組換え的に産生または可溶化され得る。一実施形態では、「単離された」ＭＨＣ単量体は、ＭＨＣクラスＩ単量体、例えばβ２－ミクログロブリンと会合されるＭＨＣクラスＩ重鎖（α鎖）の可溶性形態である。別の実施形態では、「単離された」ＭＨＣ単量体は、ＭＨＣクラスＩＩ単量体、例えばＭＨＣクラスＩＩα／β鎖の可溶性形態である。
本明細書で使用される場合、「識別子」という用語は、識別子に対応する同一性などの情報を提供するデータの読み取り可能な表現を指す。
本明細書で使用される場合、「連結された」、「コンジュゲートされた」、「融合された」または「融合」という用語は、組換えまたは化学手段を含むどんな手段によっても、２つより多くのエレメントまたは構成要素またはドメインを一緒に接合することに言及する場合、互換的に使用される。
「主要組織適合遺伝子複合体」または「ＭＨＣ」という用語は、それぞれ、断片化タンパク質のペプチドを循環する細胞傷害性およびヘルパーＴリンパ球に提示することによって免疫応答を調節するＭＨＣ古典的クラスＩおよびクラスＩＩ分子として公知の多様な細胞膜結合糖タンパク質をコードする遺伝子の群を含有するゲノム遺伝子座を指す。ヒトでは、この遺伝子の群は、「ヒト白血球抗原」または「ＨＬＡ」系とも呼ばれる。ヒトＭＨＣクラスＩ遺伝子は、例えば、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬ－ＢおよびＨＬＡ－Ｃ分子をコードする。ＨＬＡ－Ａは、ヒトＭＨＣクラスＩ細胞表面受容体の３つの主要な種類のうちの１つである。他は、ＨＬＡ－ＢおよびＨＬＡ－Ｃである。ＨＬＡ－Ａタンパク質は、ヘテロ二量体であり、重α鎖およびより小さいβ鎖で構成される。α鎖は、バリアントＨＬＡ－Ａ遺伝子によってコードされ、β鎖は、インバリアントβ２ミクログロブリン（β２ｍ）ポリペプチドである。β２ミクログロブリンポリペプチドは、ヒト遺伝子の別々の領域によってコードされる。ＨＬＡ－Ａ＊０２（Ａ＊０２）は、ＨＬＡ－Ａ血清型群内のヒト白血球抗原血清型である。血清型は、ＨＬＡ－Ａ α鎖のα２ドメインの抗体認識によって決定される。Ａ＊０２について、α鎖はＨＬＡ－Ａ＊０２遺伝子によってコードされ、β鎖はＢ２Ｍ遺伝子座によってコードされる。ヒトＭＨＣクラスＩＩ遺伝子は、例えば、ＨＬＡ－ＤＰＡ１、ＨＬＡ－ＤＰＢ１、ＨＬＡ－ＤＱＡ１、ＨＬＡ－ＤＱＢ１、ＨＬＡ－ＤＲＡ、およびＨＬＡ－ＤＲＢ１をコードする。ヒト主要組織適合遺伝子複合体の完全なヌクレオチド配列および遺伝子地図は公開されている（例えば、The MHC sequencing consortium, Nature 401:921-923, 1999）。
本明細書で使用される場合、「ＭＨＣ分子」および「ＭＨＣタンパク質」という用語は、本明細書で、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩ遺伝子によってコードされる多様な糖タンパク質を指すために使用され、これは、ペプチドエピトープのＴ細胞への提示に関与する。「ＭＨＣクラスＩ」または「ＭＨＣ Ｉ」という用語は、３つのドメイン（α１、α２およびα３）で構成されるα鎖、および第２のインバリアントβ２－ミクロブロブリンを含むタンパク質分子を指すために互換的に使用される。α３ドメインは、膜貫通性であり、ＭＨＣクラスＩ分子を細胞膜にアンカリングする。抗原由来ペプチドエピトープは、α１／α２ヘテロ二量体の中央領域において、ペプチド結合溝中に位置する。ＨＬＡ－ＡなどのＭＨＣクラスＩ分子は、短ポリペプチドを免疫系に提示するプロセスの部分である。これらのポリペプチドは、典型的には、９～１１アミノ酸長であり、細胞によって発現されるタンパク質が起源である。ＭＨＣクラスＩ分子は、抗原をＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞に提示する。「ＭＨＣクラスＩＩ」または「ＭＨＣ ＩＩ」という用語は、２つのドメイン（α１およびα２）を有するα鎖および２つのドメイン（β１およびβ２）を有するβ鎖を含有するタンパク質分子を指すために互換的に使用される。ペプチド結合溝は、α１／β１ヘテロ二量体によって形成される。ＭＨＣクラスＩＩ分子は、抗原を特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞を提示する。ＡＰＣに内因的に送達される抗原は、ＭＨＣクラスＩとの会合のために主にプロセシングされる。ＡＰＣに外因的に送達される抗原は、ＭＨＣクラスＩＩとの会合のために主にプロセシングされる。
本明細書で使用される場合、ＭＨＣタンパク質（ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩタンパク質）はＭＨＣバリアントも含み、これは、アミノ酸の置換、欠失または挿入を含有し、ＭＨＣペプチドエピトープ（ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩペプチドエピトープ）に依然として結合する。この用語は、これらのタンパク質すべての断片、例えば、ペプチド結合を保持する細胞外ドメインも含む。
「ＭＨＣタンパク質」という用語は、脊椎動物の非ヒト種のＭＨＣタンパク質も含む。脊椎動物の非ヒト種のＭＨＣタンパク質は、脊椎動物のこれらの種の疾患の実験および治癒において、例えば獣医学において、およびヒト疾患が動物モデルにおいて調べられる動物試験、例えばヒト疾患の多発性硬化症の動物モデルであるマウス（ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）におけるＥＡＥ（実験的自己免疫性脳脊髄炎）において、役割を果たす。脊椎動物の非ヒト種は、例えば、より具体的には、マウス（ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、ラット（ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）、ウシ（ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ）、ウマ（ｅｑｕｕｓ ｅｑｕｕｓ）、およびミドリザル（ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）である。マウスのＭＨＣタンパク質は、例えば、Ｈ－２タンパク質と称され、ここで、ＭＨＣクラスＩタンパク質は、遺伝子座Ｈ２Ｋ、Ｈ２ＬおよびＨ２Ｄによってコードされ、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質は、遺伝子座Ｈ２Ｉによってコードされる。
「ペプチドフリーＭＨＣポリペプチド」または「ペプチドフリーＭＨＣ多量体」は、本明細書で使用される場合、ＭＨＣポリペプチドの結合溝中にペプチドを含有しないＭＨＣ単量体またはＭＨＣ多量体を指す。ペプチドフリーＭＨＣ単量体および多量体は、「空」とも称される。一実施形態では、ペプチドフリーＭＨＣポリペプチドまたは多量体は、ＭＨＣクラスＩポリペプチドまたは多量体である。別の実施形態では、ペプチドフリーＭＨＣポリペプチドまたは多量体は、ＭＨＣクラスＩＩポリペプチドまたは多量体である。
本明細書で使用される場合、「多量体」という用語は、複数のユニットを指す。一部の実施形態では、多量体は、１つまたは複数の異なるユニットを含む。一部の実施形態では、多量体中のユニットは同じである。一部の実施形態では、多量体中のユニットは異なる。一部の実施形態では、多量体は、同じおよび異なるユニットの混合物を含む。
「ペプチドエピトープ」、「ＭＨＣペプチドエピトープ」、「ＭＨＣペプチド抗原」および「ＭＨＣリガンド」という用語は、本明細書で互換的に使用され、ＭＨＣ分子のペプチド結合溝中で結合することができるＭＨＣリガンドを指す。ペプチドエピトープは、典型的には、ＭＨＣ分子によって提示され得る。ペプチドエピトープは、典型的には、ペプチド結合を介して連結されている８～２５個のアミノ酸を有する。ペプチドは、改変、例えば、限定されるものではないが、アミノ酸残基の側鎖、標識またはタグの存在、合成アミノ酸の存在、アミノ酸の機能的等価体などを含有することができる。典型的な改変としては、細胞機構、例えば、グリカンの付加およびリン酸化によって産生するものが挙げられる。しかしながら、他の種類の改変も本開示の範囲内である。
本明細書で使用される場合、「ペプチド交換」という用語は、プレースホルダペプチドが除去され、「レスキューペプチド（または「レスキューペプチドエピトープ」）または「競合ペプチド」（または「競合ペプチドエピトープ」）とも本明細書で称される「交換されるペプチド」（または「交換ペプチドエピトープ」）によって置き換えられる競合アッセイを指す。典型的には、ペプチド交換は、プレースホルダペプチドがペプチドの切断によって放出される条件下、またはレスキューペプチドがＭＨＣ単量体もしくは多量体の結合性ポケットへの結合について競合するのを可能にする好適な条件下で起こる。例えば、ペプチド交換は、ＵＶ誘導交換、ジペプチド誘導交換、温度誘導交換、または当技術分野において公知および本明細書に開示される他の交換方法によって達成することができる。ペプチド交換の例示的な方法は、図２に示される。
本明細書で使用される場合、「ペプチドライブラリー」という用語は、複数のペプチドを指す。一部の実施形態では、ライブラリーは、固有の配列を有する１つまたは複数のペプチドを含む。一部の実施形態では、ライブラリー中の各ペプチドは、異なる配列を有する。一部の実施形態では、ライブラリーは、同じおよび異なる配列を有するペプチドの混合物を含む。
本明細書で使用される場合、「高多様性ペプチドライブラリー」という用語は、高度のペプチドの多様さを有するペプチドライブラリーを指す。例えば、高多様性ペプチドライブラリーは、約１０３、約１０４、約１０５、約１０６、約１０７、約１０８、約１０９、約１０１０、約１０１１、約１０１２、約１０１３、約１０１４、約１０１５、約１０１６、約１０１７、約１０１８、約１０１９、約１０２０、またはそれよりも多くの異なるペプチドを含む。
本明細書で使用される場合、「ライブラリーペプチド」という用語は、ライブラリー中の単一のペプチドを指す。
本明細書で使用される場合、「プレースホルダペプチド」または「交換可能ペプチド」という用語は、ＭＨＣタンパク質（例えば、ＭＨＣＩまたはＭＨＣＩＩタンパク質）に十分な親和性で結合し、アンフォールド状態からのＭＨＣタンパク質の適当なフォールディングもしくはフォールドされたＭＨＣタンパク質の安定化を引き起こすか、または促進する、ペプチドまたはペプチド様化合物を指すために互換的に使用される。プレースホルダペプチドは、その後、異なる目的のペプチド（交換ペプチドまたはレスキューペプチドと称される）と交換され得る。この交換は、ＵＶ誘導交換、ジペプチド誘導交換、温度誘導交換、または当技術分野において公知の他の交換方法によって達成することができる。
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために本明細書で互換的に使用される。この用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工的な化学的ミメティック、ならびに天然に存在するアミノ酸のポリマー、および天然に存在しないアミノ酸のポリマーである、アミノ酸のポリマーに適用される。「単離されたタンパク質」および「単離されたポリペプチド」という用語は、他の構成要素（例えば、タンパク質、細胞材料）および／または化学物質から分離または精製されているタンパク質（例えば、可溶性の多量体タンパク質）を指すために互換的に使用される。典型的には、ポリペプチドは、試料中の総タンパク質の少なくとも６０（例えば、少なくとも６５、７０、７５、８０、８５、９０、９２、９５、９７、または９９）重量％を構成する場合、精製されている。
本明細書で使用される場合、「タンパク質フォールディング」という用語は、ペプチドの空間的組織化を指す。一部の実施形態では、アミノ酸配列は、ペプチドの空間的組織化またはフォールディングに影響を及ぼす。一部の実施形態では、ペプチドは、機能的コンフォメーションにフォールドされ得る。一部の実施形態では、フォールドされたペプチドは、１つまたは複数の生物学的機能を有する。一部の実施形態では、フォールドされたペプチドは、三次元構造を獲得する。
本明細書で使用される場合、「Ｎ末端アミノ酸残基」という用語は、ポリペプチドのＮ末端の１つまたは複数のアミノ酸を指す。
本明細書で使用される場合、「小ユビキチン様修飾因子部分」または「ＳＵＭＯドメイン」または「ＳＵＭＯ部分」という用語は、互換的に使用され、特定のプロテアーゼ認識部分を指す。
本明細書で使用される場合、「タグ」という用語は、オリゴヌクレオチド構成要素、一般にＤＮＡを指し、これは、それが接合される標的分子（例えば、コンジュゲート化多量体）を対処する手段を提供する。例えば、一部の実施形態では、タグは、（例えば、固有の配列および／またはオリゴヌクレオチド、例えばＤＮＡポリメラーゼによる伸長のためのプライマー、または捕捉のためもしくはライゲーション反応のためのオリゴヌクレオチドのアニーリングのための部位を提供することによって）タグが付着している分子の識別、認識および／または分子もしくは生化学的操作を可能にするヌクレオチド配列を含む。タグを標的分子に接合するプロセスは、本明細書で「タグ化」と称される場合があり、タグ化を受けるか、またはタグを含有する標的分子は、「タグ化された」と称される（例えば、「タグ化されたコンジュゲート化多量体」）。タグは、バーコード、アダプター配列、プライマーのハイブリダイゼーション部位、またはそれらの組合せであり得る。
「Ｔ細胞」という用語は、細胞表面上のＴ細胞受容体の存在によって他の白血球から区別され得る白血球の種類を指す。いくつかのＴ細胞のサブセットが存在し、限定されるものではないが、ヘルパーＴ細胞（別名ＴＨ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞）およびサブタイプ、例えば、ＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ３、ＴＨ１７、ＴＨ９、およびＴＦＨ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞（別名ＴＣ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球、Ｔ－キラー細胞、キラーＴ細胞）、メモリーＴ細胞およびサブタイプ、例えば、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ細胞）、エフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭおよびＴＥＭＲＡ細胞）、およびレジデントメモリーＴ細胞（ＴＲＭ細胞）、調節性Ｔ細胞（別名Ｔｒｅｇ細胞またはサプレッサーＴ細胞）およびサブタイプ、例えば、ＣＤ４＋ＦＯＸＰ３＋Ｔｒｅｇ細胞、ＣＤ４＋ＦＯＸＰ３－Ｔｒｅｇ細胞、Ｔｒ１細胞、Ｔｈ３細胞、およびＴｒｅｇ１７細胞、ナチュラルキラーＴ細胞（別名ＮＫＴ細胞）、粘膜関連インバリアントＴ細胞（ＭＡＩＴ）、ならびにガンマデルタＴ細胞（γδＴ細胞）、例えば、Ｖγ９／Ｖδ２Ｔ細胞が挙げられる。「Ｔ細胞傷害性」という用語は、ＣＤ８＋Ｔ細胞活性化によって媒介される任意の免疫応答を含む。
本明細書で使用される場合、「Ｔ細胞受容体」という語句および「ＴＣＲ」という用語は、Ｔ細胞が抗原および／またはそのエピトープを認識するのを可能にする、典型的には、１つまたは複数の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子に結合する、Ｔ細胞の表面タンパク質を指す。ＴＣＲは、抗原決定基を認識し、免疫応答を開始するように機能する。典型的には、ＴＣＲは、２つの異なるタンパク質鎖を含むヘテロ二量体である。大部分のＴ細胞では、ＴＣＲは、アルファ（α）鎖およびベータ（β）鎖を含む。各鎖は、２つの細胞外ドメイン：可変（Ｖ）領域および定常（Ｃ）領域を含み、その後者は、膜に近接している。α鎖およびβ鎖の可変ドメインは、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも称される３つの超可変領域から構成される。ＣＤＲ、特にＣＤＲ３は、抗原に接触する主な原因となり、したがってＴＣＲの特異性を定義するが、α鎖のＣＤＲ１は、抗原のＮ末端部分と相互作用することができ、β鎖のＣＤＲ１は、抗原のＣ末端部分と相互作用する。Ｔ細胞のおよそ５％が、ガンマおよびデルタ（γ／δ）鎖で作り上げられたＴＣＲを有する。ＴＣＲのタンパク質ループおよびシートのアミノ酸配列のすべての番号付けおよび命名は、ＩＭＧＴ番号付けスキーム（ＩＭＧＴ、ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ＠ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ；http://imgt.cines.fr；Lefranc et al., (2003) Dev Comp Immunol 27:55 77.；Lefranc et al. (2005) Dev Comp Immunol 29:185-203）に従う。
本明細書で使用される場合、「可溶性Ｔ細胞受容体」および「ｓＴＣＲ」という用語は、ＴＣＲのヘテロ二量体性の短縮されたバリアントを指し、これは、ＴＣＲのα鎖およびβ鎖の細胞外部分（例えば、ジスルフィド結合によって連結される）を含むが、全長タンパク質の膜貫通およびサイトゾルドメインを欠く。可溶性ＴＣＲα鎖およびβ鎖の配列（アミノ酸または核酸）は、天然のＴＣＲ中の対応する配列と同一であってもよく、または、対応する天然のＴＣＲ配列と比較して、バリアント可溶性ＴＣＲα鎖およびβ鎖配列を含んでいてもよい。「可溶性Ｔ細胞受容体」という用語は、本明細書で使用される場合、バリアントまたは非バリアント可溶性ＴＣＲα鎖およびβ鎖配列を有する可溶性ＴＣＲを包含する。変形形態は、可溶性ＴＣＲα鎖およびβ鎖配列の可変または定常領域であってもよく、限定されるものではないが、アミノ酸の欠失、挿入、置換突然変異、およびアミノ酸配列を変更しない核酸配列に対する変更が挙げられ得る。バリアントは、それらの親分子の結合機能性を保持する。
本明細書で使用される場合、「ＴＣＲ／ｐＭＨＣ複合体」は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはその可溶性部分とペプチドロードＭＨＣ分子との間の結合によって形成されるタンパク質複合体を指す。したがって、「ＴＣＲ／ｐＭＨＣ複合体の構成要素」は、ＴＣＲの１つまたは複数のサブユニット（例えば、Ｖα、Ｖβ、Ｃα、Ｃβ）、あるいはＭＨＣまたはｐＭＨＣクラスＩもしくはＩＩ分子の１つまたは複数のサブユニットを指す。
本明細書で使用される場合、「偏りのない」という用語は、１つまたは複数の選択基準を欠くことを指す。
概要
本開示は、ＭＨＣ結合溝中の複数の固有のペプチドを含有し、ライブラリーメンバーの識別を容易にするためのオリゴヌクレオチドバーコード標識化を有するペプチドロードＭＨＣ（ｐＭＨＣ）多量体を含有するライブラリーのハイスループット生成のための方法を提供する。本明細書に提供される方法では、ｐＭＨＣ多量体の生成のための挑戦的で可能性がある非効率的な化学ステップのすべてを、クロマトグラフ浄化および精製を含む単一のバルク反応において行い、それに続いて非常に効率的なペプチド交換およびオリゴヌクレオチドバーコード化を行う。特に、ｐＭＨＣ単量体は、単量体と多量体化ドメインとの間の安定な化学的連結（すなわち、共有結合）を形成するために反応する単量体および多量体化ドメイン上のコンジュゲーション部分の使用により多量体化ドメインに連結され、それによってｐＭＨＣコンジュゲート化多量体、例えばｐＭＨＣコンジュゲート化四量体が形成される。さまざまなコンジュゲーション部分および反応が、本明細書に記載されるコンジュゲート化多量体の形成における使用のために好適であり、生体直交型ケミストリー、例えば、クリックケミストリーの使用を含み、これは、容易で効率的な反応を可能にする。また、多量体化ドメインがストレプトアビジンである場合、ビオチン結合部位は、ｐＭＨＣ単量体に付着するために使用されないので、このビオチン結合部位は、したがって、ビオチン化オリゴヌクレオチドバーコードの好都合な付着のために利用可能であり、それによって多量体を容易におよび効率的に標識する。
本明細書に提供されるｐＭＨＣ多量体のライブラリーは、ある範囲の治療、診断および研究適用において、特にｐＭＨＣ多量体が有用である任意の状況において有用である。例えば、本明細書に記載されるｐＭＨＣ多量体は、各種の方法、例えば、幅広い適用において特異的Ｔ細胞を識別および単離する方法において使用することができる。一実施形態では、ｐＭＨＣ多量体は、ｐＭＨＣクラスＩ多量体であり、これは、ＣＤ８＋Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）の抗原特異性を決定するために有用である。別の実施形態では、ｐＭＨＣ多量体は、ｐＭＨＣクラスＩＩ多量体であり、これは、ＣＤ４＋Ｔ細胞（例えば、ヘルパーＴ細胞）の抗原特異性を決定するために有用である。
Ｉ．ＭＨＣポリペプチド
Ａ．ＭＨＣクラスＩポリペプチド
クラスＩ組織適合性三重複合体は、非共有結合によって会合される３つの部分から構成される。ＭＨＣＩ重鎖は、３つの細胞外ドメインから構成される約４５ｋＤａの多様な膜貫通糖タンパク質であり、約９０アミノ酸（Ｎ末端のα１、α２およびα３）、約４０アミノ酸の膜貫通ドメインおよび約３０アミノ酸の細胞質尾部をそれぞれ含有する。ＭＨＣＩ重鎖のα１およびα２ドメインは、ペプチド結合溝または間隙を形成するアルファヘリックスの２つのセグメントを含有する。約８～１０アミノ酸の短いペプチドは、２つのアルファヘリックス間のこの溝に非共有結合的に結合する（「フィットする」）。ＭＨＣＩ重鎖のα３ドメインは、細胞膜に近接している。ＭＨＣＩ重鎖は、β２ミクログロブリン（β２ｍ）ポリペプチドに非共有結合して、三重複合体を形成する。ＭＨＣＩでは、結合溝は、保存されたチロシン残基によって両方の末端で閉じられ、ＦポケットへのそのＣ末端ドッキングによる通常８～１０残基への結合したペプチドのサイズ制限をもたらす。
本開示は、２つまたはそれよりも多くのＭＨＣＩまたはＭＨＣＩ様ポリペプチドを含む多量体タンパク質を提供する。ＭＨＣＩ分子は、好適には、ヒト、マウス、ラット、ブタ、ウシ、または鳥類のＭＨＣ分子などの脊椎動物のＭＨＣ分子であり得る。
本明細書に記載される多量体性ＭＨＣＩ多量体の一部の実施形態では、ＭＨＣ分子は、ヒトＭＨＣクラスＩタンパク質：ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－ＢまたはＨＬＡ－Ｃである。一部の実施形態では、多量体は、ＭＨＣＩクラスＩ様分子（非古典的ＭＨＣクラスＩ分子を含む）を含み、限定されるものではないが、ＣＤ１ｄ、ＨＬＡ Ｅ、ＨＬＡ Ｇ、ＨＬＡ Ｆ、ＨＬＡ Ｈ、ＭＩＣ Ａ、ＭＩＣ Ｂ、ＵＬＢＰ－１、ＵＬＢＰ－２、およびＵＬＢＰ－３が挙げられる。各種の脊椎動物種由来のＭＨＣＩ重鎖、β２ｍポリペプチドおよびＭＨＣクラスＩ様分子のアミノ酸配列は、当技術分野において公知であり、公開されている。
一部の実施形態では、ＭＨＣＩ重鎖アルファドメインは、ヒトであり、例えば、ＨＬＡ－Ａ＊０１：０１、ＨＬＡ－Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ－Ａ＊１１：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊０８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５７：０３、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｃ＊１６：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０８：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０２、ＨＬＡ－Ａ＊２９：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０４、ＨＬＡ－Ｂ＊４０：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０３、ＨＬＡ－Ａ＊３０：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１３：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊１２：０３、ＨＬＡ－Ａ＊２６：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊３８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１４：０２、ＨＬＡ－Ａ＊３３：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２３：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊３７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５１：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊１４：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊１５：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０２：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊２７：０５、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３０：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊４２：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊１７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊３９：０６、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊５８：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３３：０３、ＨＬＡ－Ａ＊６８：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０１：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０４、ＨＬＡ－Ａ＊６８：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３２：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４９：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５３：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５０：０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０５、ＨＬＡ－Ｂ＊５５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５２：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊１２：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊４０：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０３、および／またはＨＬＡ－Ａ＊７４：０１からなる群から選択されるヒトＭＨＣクラスＩ分子由来のＭＨＣＩ重鎖アルファドメインを含む。これらのＭＨＣＩ分子の全長アミノ酸配列（シグナル配列および膜貫通ドメインを含む）は、それぞれ、配列番号２８～９３に示される。これらのＭＨＣＩ分子の可溶型のアミノ酸配列（シグナル配列および膜貫通ドメインを欠く）は、それぞれ、配列番号９４～１５９に示される。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるｐＭＨＣＩ多量体は、ＭＨＣＩ重鎖のα１およびα２ドメインを含む。一部の実施形態では、本明細書に記載される化合物は、ＭＨＣＩ重鎖のα１、α２、およびα３ドメインを含む。
一部の実施形態では、多量体中の２つまたはそれよりも多くのｐＭＨＣＩまたはｐＭＨＣＩ様ポリペプチドは、β２－ミクログロブリンポリペプチド、例えば、ヒトβ２－ミクログロブリンを含む。一部の実施形態では、β２－ミクログロブリンは、野生型ヒトβ２－ミクログロブリンである。一部の実施形態では、β２－ミクログロブリンは、ヒトβ２－ミクログロブリンのアミノ酸配列と少なくとも８０、８５、９０、９５、または９９％同一であるアミノ酸配列を含み、その全長配列は、配列番号１６０に示される（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｉｄ．番号Ｐ６１７６９）。あるいは、ｐＭＨＣＩ多量体中で使用されるヒトβ２－ミクログロブリンポリペプチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含み得るか、またはそれからなり得る。
一部の実施形態では、多量体タンパク質は、可溶性ＭＨＣＩポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ＭＨＣ多量体タンパク質は、可溶性ＭＨＣＩ αドメインおよびβ２－ミクログロブリンポリペプチドを含む。一部の実施形態では、可溶性ＭＨＣＩタンパク質は、ＭＨＣＩ重鎖α１ドメインおよびＭＨＣＩ重鎖α２ドメインを含む。
あるいは、一部の実施形態では、ＭＨＣＩ単量体は、ＭＨＣＩ重鎖またはその機能的断片に共有結合的に連結されたβ２ｍポリペプチドまたはその機能的断片を含む融合タンパク質である。一部の実施形態では、β２ｍのカルボキシ（－ＣＯＯＨ）末端は、ＭＨＣＩ重鎖のアミノ（－ＮＨ２）末端に共有結合的に連結されている。
一部の実施形態では、ＭＨＣ単量体は、ＭＨＣＩ単量体の個々の構成要素間に１つまたは複数のリンカーを含む。一部の実施形態では、ＭＨＣＩ単量体は、リンカーを通してβ２ｍと融合された重鎖を含む。一部の実施形態では、重鎖とβ２ｍとの間のリンカーは、例えばグリシンおよびセリンで作られている可撓性リンカーである。一部の実施形態では、重鎖とβ２ｍとの間の可撓性リンカーは、５～２０残基の間の長さである。他の実施形態では、重鎖とβ２ｍとの間のリンカーは、定義された構造を伴う剛性であり、例えば、グルタミン酸、アラニン、リシン、およびロイシンのようなアミノ酸で作られている。一実施形態では、リンカーは、（Ｇ４Ｓ）４リンカー（配列番号１８１、ここで、ｎ＝４である）である。
多くのＭＨＣクラスＩタンパク質のアミノ酸配列が公知であり、その遺伝子がクローニングされており、したがって、重鎖単量体は、組換え法を使用して発現させることができる。ＭＨＣＩ分子の発現および精製のための方法は、広く記載されている（例えば、Altman et al., Curr. Protoc. Enz. 17.3.1-17.2-44, 2016）。例えば、ＭＨＣＩ重鎖およびβ２－ミクログロブリンは、別々の細胞において発現され、精製によって単離され、次いで、ｉｎ ｖｉｔｒｏで再フォールドすることができる。例えば、ＭＨＣポリペプチド鎖は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させることができ、ここで、ＭＨＣポリペプチド鎖は、細菌細胞中の不溶性封入体として蓄積する。ｉｎ ｖｉｔｒｏ再フォールディングは、例えば透析または希釈によって、ポリペプチドが添加される再フォールディング緩衝液中で起こる。再フォールディング緩衝液は、ＭＨＣポリペプチド鎖およびペプチドが天然の三量体フォールドを再構成することを可能にする任意の緩衝液であり得る。緩衝液は、酸化剤および／または還元剤を含有していてもよく、それによってＭＨＣタンパク質が正しいフォールドを確立するのを助けるレドックス緩衝液系を作出する。好適な再フォールディング緩衝液の例としては、限定されるものではないが、トリス緩衝液、ＣＡＰＳ緩衝液、ＴＡＰｓ緩衝液、ＰＢＳ緩衝液、他のリン酸緩衝液、炭酸緩衝液、およびＣｈｅｓ緩衝液が挙げられる。シャペロン分子または正しいタンパク質フォールディングを改善する他の分子も添加されてもよく、同様に、溶解性を増加させる薬剤および凝集体形成を防止する薬剤が緩衝液に添加されてもよい。そのような分子の例としては、限定されるものではないが、アルギニン、ＧｒｏＥ、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０、小有機化合物、ＤｎａＫ、ＣＩｐＢ、プロリン、グリシンベタイン、グリセロール、ｔｗｅｅｎ、塩、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）が挙げられる。
発現されたら、ＭＨＣＩ複合体は、ＭＨＣＩ発現細胞から全ＭＨＣＩまたはＭＨＣＩペプチド単量体として直接精製することができる。ＭＨＣＩ単量体は、細胞の表面上で発現され得、次いで、例えば界面活性剤を使用して、細胞膜の破壊によって単離され、ＭＨＣＩの精製に続く。一部の実施形態では、ＭＨＣ単量体は、ペリプラズムに発現され、発現細胞は、溶解され、精製されるＭＨＣＩ単量体が放出される。あるいは、ＭＨＣ単量体は、発現されたタンパク質を培養上清に分泌する細胞の上清から精製され得る。ＭＨＣＩ単量体を精製するための方法は、当技術分野において周知であり、例えば、アフィニティークロマトグラフィーと一緒にアフィニティータグ、ａｎｔタグでコーティングされたビーズ、および／またはＭＨＣＩタンパク質のアフィニティーマトリックスへの固定化を含む他の技法の使用、例えばゲル濾過を使用するサイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換、または細胞および／もしくは細胞溶解物からＭＨＣ分子を分離することができる他の方法による。
一部の実施形態では、ＭＨＣＩポリペプチドの組換え発現は、多くのＭＨＣ単量体の改変を可能にする。例えば、組換え技法は、疎水性膜貫通ドメインを欠失させるカルボキシ末端短縮のための方法を提供する。カルボキシ末端は、例えばシステインおよび／またはリシン残基を分子に導入することによって、リガンドまたは標識のコンジュゲーションを容易にするために任意に選択することもできる。合成遺伝子は、典型的には、発現ベクターへの挿入および遺伝子配列の操作を支援する制限部位を含む。適切な単量体をコードする遺伝子は、次いで、発現ベクターに挿入され、適切な宿主、例えばＥ．ｃｏｌｉ、酵母、昆虫または他の好適な細胞において発現され、組換えタンパク質が得られる。例えば、ＭＨＣクラスＩポリペプチドの産生は、細菌発現、およびＭＨＣクラスＩ軽鎖、β２－ミクログロブリン（β２ｍ）のフォールディング、ならびにＭＨＣクラスＩ重鎖、β２ｍ、およびプレースホルダペプチドから構成される複合体の形成を含む。
一部の実施形態では、ＭＨＣＩ単量体は、それらの重鎖またはβ２ｍのいずれかにおいてビオチン化される。一部の実施形態では、ＭＨＣＩ単量体は、再フォールディングまたはペプチド交換のいずれかによるペプチドのローディングの前にビオチン化される。ＭＨＣ単量体のビオチン化は、当技術分野において公知の通り、例えばビオチン化酵素の認識部位である特異的付着部位にビオチンを付着させることによって、達成することができる。一部の実施形態では、ビオチン化酵素は、ＢｉｒＡである。一部の実施形態では、ビオチン化は、タンパク質発現の間の翻訳後修飾として、ｉｎ ｖｉｖｏで所望のタンパク質鎖に対して行われる。
Ｂ．ＭＨＣクラスＩＩポリペプチド
ＭＨＣクラスＩＩ分子は、α鎖およびβ鎖で構成されるヘテロ二量体であり、その両方ともＭＨＣによってコードされる。アルファ鎖は、α１およびα２ドメインで構成される。ベータ鎖は、β１およびβ２ドメインで構成される。鎖のα１およびβ１ドメインは、非共有結合的に相互作用して、膜の遠位でペプチド結合性ドメインを形成する一方、α２およびβ２ドメインは、膜の近位で免疫グロブリン様ドメインを形成する。ペプチドエピトープが結合する抗原結合溝は、２つのα－ヘリックスおよびβ－シートで作り上げられる。ＭＨＣクラスＩＩ分子の抗原結合溝は、両方の末端で開放されているので、溝は、ＭＨＣクラスＩ分子よりも長いペプチドエピトープに適合し得る。ＭＨＣクラスＩＩ分子によって提示されるペプチドエピトープは、典型的には、約１５～２４アミノ酸残基長である。
本開示は、２つまたはそれよりも多くのＭＨＣＩＩまたはＭＨＣＩＩ様ポリペプチドを含む多量体タンパク質を提供する。ＭＨＣＩＩ分子は、好適には、ヒト、マウス、ラット、ブタ、ウシ、または鳥類のＭＨＣＩＩ分子などの脊椎動物のＭＨＣＩＩ分子であり得る。
本明細書に記載される多量体性ＭＨＣＩＩ多量体の一部の実施形態では、ＭＨＣ分子は、ヒトＭＨＣクラスＩＩタンパク質：ＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＸ、ＨＬＡ－ＤＯ、ＨＬＡ－ＤＺ、およびＨＬＡ－ＤＰである。ヒトを含む各種の脊椎動物種由来のＭＨＣＩＩ αおよびβ鎖のアミノ酸配列は、当技術分野において公知であり、公開されている。
一部の実施形態では、ヒトＭＨＣＩＩ分子は、ＤＲＢ１＊０１０１（例えば、Cameron et al. (2002) J. Immunol. Methods, 268:51-69；Cunliffe et al. (2002) Eur. J. Immunol., 32:3366-3375；Danke et al. (2003) J. Immunol., 171:3163-3169を参照されたい）、ＤＲＢ１＊１５０１（例えば、Day et al. (2003) J. Clin. Invest, 112:831-842を参照されたい）、ＤＲＢ５＊０１０１（例えば、Day et al.、同書を参照されたい）、ＤＲＢ１＊０３０１（例えば、Bronke et al. (2005) Hum. Immunol., 66:950-961を参照されたい）、ＤＲＢ１＊０４０１（例えば、Meyer et al. (2000) PNAS, 97:11433-11438；Novak et al. (1999) J. Clin. Invest, 104:R63-R67；Kotzin et al. (2000) PNAS, 97:291-296を参照されたい）、ＤＲＢ１＊０４０２（例えば、Veldman et al. (2007) Clin. Immunol., 122:330-337を参照されたい）、ＤＲＢ１＊０４０４（例えば、Gebe et al. (2001) J. Immunol. 167:3250-3256を参照されたい）、ＤＲＢ１＊１１０１（例えば、Cunliffe、同書；Moro et al.(2005) BMC Immunol., 6:24を参照されたい）、ＤＲＢ１＊１３０２（例えば、Laughlin et al.(2007) Infect. Immunol. 75:1852-1860を参照されたい）、ＤＲＢ１＊０７０１（例えば、Danke、同書を参照されたい）、ＤＱＡ１＊０１０２（例えば、Kwok et al.(2000) J. Immunol., 164:4244-4249を参照されたい）、ＤＱＢ１＊０６０２（例えば、Kwok、同書を参照されたい）、ＤＱＡ１＊０５０１（例えば、Quarsten et al.(2001) J. Immunol., 167:4861-4868を参照されたい）、ＤＱＢ１＊０２０１（例えば、Quarsten、同書を参照されたい）、ＤＰＡ１＊０１０３（例えば、Zhang et al.(2005) Eur. J. Immunol, 35:1066-1075；Yang et al.(2005) J. Clin. Immunol., 25:428-436を参照されたい）、およびＤＰＢ１＊０４０１（例えば、Zhang、同書；Yang、同書を参照されたい）からなる群から選択されるアロタイプのものである。
一部の実施形態では、ＭＨＣＩＩ分子は、ヒトであり、例えば、ＨＬＡ－ＤＲＡ＊０１：０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０１：０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０１：０２、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０３：０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４：０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４：０４、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０７：０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０８：０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１０：０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１１：０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１１：０４、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１３：０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１３：０２、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１４：０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０３、ＨＬＡ－ＤＱＡ１＊０１：０１、ＨＬＡ－ＤＱＢ１＊０５：０１、ＨＬＡ－ＤＱＡ１＊０１：０２、ＨＬＡ－ＤＱＢ１＊０６：０２、ＨＬＡ－ＤＱＡ１＊０３：０１、ＨＬＡ－ＤＱＢ１＊０３：０２、ＨＬＡ－ＤＱＡ１＊０５：０１、ＨＬＡ－ＤＱＢ１＊０２：０１、ＨＬＡ－ＤＱＢ１＊０３：０１、ＨＬＡ－ＤＱＢ１＊０３：０３、ＨＬＡ－ＤＱＢ１＊０４：０２、ＨＬＡ－ＤＱＢ１＊０５：０３、ＨＬＡ－ＤＱＢ１＊０６：０３、およびＨＬＡ－ＤＱＢ１＊０６：０４からなる群から選択されるＭＨＣＩＩアルファ鎖およびベータ鎖を含む。これらのＭＨＣＩＩ鎖の全長アミノ酸配列（シグナル配列および膜貫通ドメインを含む）は、それぞれ、配列番号１９４～２２３に示される。これらのＭＨＣＩＩ鎖の可溶型のアミノ酸配列（シグナル配列および膜貫通ドメインを欠く）は、それぞれ、配列番号２２４～２５３に示される。
ある特定の実施形態では、追加のアミノ酸配列を、例えば多量体化ドメインへの付着（例えば、コンジュゲーション）を媒介する部分を標識するおよび／または付着させる目的のために、ＭＨＣＩＩ分子のアルファまたはベータ鎖のＣ末端配列に付け加えることができる。例えば、ａｖｉｔａｇ（Ｓａｖのビオチン結合部位を通して結合を媒介する）、例えば、ＭｙｃタグおよびＨｉｓタグを有するａｖｉｔａｇｅ（配列番号２５４）またはＭｙｃタグを有するａｖｉｔａｇ（配列番号２５５）を付け加えることができる。別の実施形態では、ｓｏｒｔａｇ（本明細書に記載されるように、ソルターゼを通してクリックケミストリー部分のコンジュゲーションを媒介することができる）、例えば、配列番号２５７に示されるｓｏｒｔａｇまたは配列番号２５６に示されるＨｉｓタグを有するｓｏｒｔａｇを付け加えることができる。別の実施形態では、Ｖ５タグ（配列番号２５８）が、Ｃ末端に付け加えられる。
ある特定の実施形態では、ヘテロ二量体化対を、ＭＨＣＩＩ分子のアルファ鎖および／またはベータ鎖のＣ末端配列に付け加えることができる。そのようなヘテロ二量体化対配列の非限定的な例としては、ＦｏｓおよびＪｕｎ（例えば、それぞれ、配列番号２５９および２６０に示されるアミノ酸配列を有する）、酸性および塩基性ロイシンジッパー（例えば、それぞれ、配列番号２６１および２６２に示されるアミノ酸配列を有する）、ノブ－イントゥ－ホール技術のためのノブおよびホール配列（例えば、それぞれ、配列番号２６３および２６４に示されるアミノ酸配列を有する）、またはｓｐｙｔａｂおよびｓｐｙｃａｔｃｈｅｒ配列（例えば、それぞれ、配列番号２６５および２６６に示されるアミノ酸配列を有する）が挙げられる。
ある特定の実施形態では、ＭＨＣＩＩ結合性プレースホルダペプチドは、ＭＨＣＩＩ鎖の１つ、好ましくはベータ鎖のための発現構築物中に含まれ、その結果、プレースホルダペプチドおよび消化可能リンカーは、（Ｎ－末端）の上流の、かつＭＨＣＩＩ鎖についてのコード配列との作動可能な連結の構築物においてコードされる。例えば、発現構築物は、以下をコードすることができる（Ｎ末端からＣ末端に）：プレースホルダペプチド、消化可能リンカー、ＭＨＣＩＩ鎖（例えば、ベータ鎖）およびＣ末端タグ（例えば、配列番号１９２に示されるアミノ酸配列をコードする）。ある特定の実施形態では、Ｎ末端タグはまた、プレースホルダペプチドの上流に付け加えられ、これは、ペプチド交換後に非交換ペプチド種の除去を可能にする。そのようなＮ末端タグの非限定的な例としては、ＦＬＡＧタグ（例えば、配列番号２６７に示されるアミノ酸配列を有する）、Ｓｔｒｅｐタグ（例えば、配列番号２６８に示されるアミノ酸配列を有する）、およびプロテインＣタグ（例えば、配列番号２６９に示されるアミノ酸配列を有する）が挙げられる。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるｐＭＨＣＩＩ多量体は、ＭＨＣＩＩアルファ鎖のα１およびα２ドメイン、ならびにＭＨＣＩＩベータ鎖のβ１およびβ２ドメインを含む。一部の実施形態では、本明細書に記載される多量体は、ＭＨＣＩＩ重鎖のα１およびβ１ドメインのみを含む。他の実施形態では、ｐＭＨＣＩＩ多量体は、ペプチドと組み合わされたアルファ鎖およびベータ鎖を含む。他の実施形態としては、アルファ鎖およびベータ鎖のみで構成されるＭＨＣＩＩ分子（いわゆるペプチドがロードされていない「空」ＭＨＣ ＩＩ）、空またはペプチドがロードされた全長ベータ鎖と組み合わされた短縮されたアルファ鎖（例えば、α１ドメイン）、空もしくはペプチドがロードされた全長アルファ鎖と組み合わされた短縮されたベータ鎖（例えば、β１ドメイン）、または空もしくはペプチドがロードされた短縮されたベータ鎖と組み合わされた短縮されたアルファ鎖（例えば、α１およびβ１ドメイン）が挙げられる。
一部の実施形態では、多量体タンパク質は、可溶性ＭＨＣＩＩポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ＭＨＣ多量体タンパク質は、膜貫通および細胞内ドメインを欠く可溶性ＭＨＣＩＩを含む。
ヒトＭＨＣＩＩを含む多数のＭＨＣクラスＩＩタンパク質のアミノ酸配列は、当技術分野において公知であり、その遺伝子がクローニングされている。したがって、アルファおよびベータ鎖単量体は、組換え法を使用して発現させることができる。ＭＨＣＩＩ分子の発現および精製のための方法は、広く記載されている（例えば、Crawford et al. (1998) Immunity, 8:675-682；Novak et al. (1999) J. Clin. Invest., 104:R63-R67；Nepom et al. (2002) Arthrit. Rheum., 46:5-12；Day et al. (2003) J. Clin. Invest., 112:831-842；Vollers and Stern (2008) Immunol., 123:305-313；Cecconi et al. (2008) Cytometry, 73A:1010-1018、これらのそれぞれの全内容は、参照により本明細書に組み込まれる）。
ＭＨＣ ＩＩ分子について、アルファ鎖およびベータ鎖は、個々のポリペプチドとして別々の細胞において、または融合タンパク質として同じ細胞において発現されてもよい。ＭＨＣ ＩＩ－ペプチド複合体のペプチドは、別々に産生され、全ＭＨＣ複合体の精製後に添加されてもよく、またはｉｎ ｖｉｔｒｏ再フォールディングの間に添加されてもよく、またはリンカーを通していずれかの鎖に接続されたアルファ鎖および／もしくはベータ鎖と一緒に発現されてもよい。遺伝子材料は、ＭＨＣクラスＩＩアルファおよびベータ鎖のすべてまたは断片のみをコードすることができる。遺伝子材料は、発現されたポリペプチド鎖の精製に有用なタンパク質（例えば、精製タグ）、ポリペプチドの溶解性の増加／減少に有用なタンパク質、ポリペプチドの検出に有用なタンパク質、ＭＨＣ複合体の多量体化ドメインへのカップリングならびに／または標識のＭＨＣ複合体および／もしくはＭＨＣ多量体へのカップリングに関与するタンパク質を含む他のタンパク質をコードする遺伝子と融合されていてもよい。
ＭＨＣ Ｉ複合体とは対照的に、ＭＨＣ ＩＩ複合体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの変性後に容易に再フォールドされない。一部のＭＨＣ ＩＩ対立遺伝子のみが、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現され、ｉｎ ｖｉｔｒｏで再フォールドされ得る。したがって、ＭＨＣ ＩＩ分子の産生のために好ましい発現系は、タンパク質の発現後の再フォールディングが必要ではない真核細胞系である。好ましい発現系としては、哺乳動物発現系、例えば、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ細胞、またはヒトタンパク質の発現に好適な他の哺乳動物細胞系が挙げられる。他の発現系としては、可溶性Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞トランスフェクタント、バキュロウイルス感染昆虫細胞、またはタンパク質の発現に好適な他の哺乳動物細胞系が挙げられる。
可溶性ＭＨＣ ＩＩ複合体の安定化は、アルファ鎖およびベータ鎖の両方がペプチド結合溝の形成に関係し、細胞膜の埋め込まれなかった場合に解離する傾向があるので、ＭＨＣ Ｉ分子についてよりもさらにより重要である。したがって、一実施形態では、ＭＨＣＩＩ単量体は、ペプチドがＭＨＣＩＩ分子に共有結合的に連結されて調製される。例えば、ある手法は、ベータ鎖相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に近接するペプチド特異的ｃＤＮＡ配列を操作することによって方向付けられる、一本鎖ＭＨＣクラスＩＩ鎖－ペプチド複合体の共有結合的合成である（Crawford et al. (1999) Immunity, 8:675-682に記載される通り）。この戦略では、得られるポリペプチドは、クラスＩＩ分子のアミノ末端から伸張したペプチド配列により再フォールドする。ペプチド中のリンカー配列の繋留は、成熟クラスＩＩ分子中のペプチド結合溝を占有するペプチドに対する十分な可撓性を可能にする。切断可能リンカーは、ペプチドとＭＨＣＩＩ分子との間の共有結合的連結の切断を可能にするために使用することができ（例えば、Day et al. (2003) J. Clin. Invest., 112:831-842に記載される通り）、それによって他のペプチド（例えば、異なるペプチドのライブラリー）とのペプチド交換およびＭＨＣＩＩ分子のローディングを可能にする。
発現されたら、ＭＨＣＩＩ複合体は、ＭＨＣＩＩ発現細胞から全ＭＨＣＩＩまたはＭＨＣＩＩペプチド単量体として直接精製することができる。ＭＨＣＩＩ単量体は、細胞の表面上で発現され得、次いで、例えば界面活性剤を使用して、細胞膜の破壊によって単離され、ＭＨＣＩＩの精製に続く。一部の実施形態では、ＭＨＣ単量体は、ペリプラズムに発現され、発現細胞は、溶解され、精製されるＭＨＣＩＩ単量体が放出される。あるいは、ＭＨＣ単量体は、発現されたタンパク質を培養上清に分泌する細胞の上清から精製され得る。ＭＨＣＩＩ単量体を精製するための方法は、当技術分野において周知であり、例えば、アフィニティークロマトグラフィーと一緒にアフィニティータグ、ａｎｔタグでコーティングされたビーズ、および／またはＭＨＣＩＩタンパク質のアフィニティーマトリックスへの固定化を含む他の技法の使用、例えばゲル濾過を使用するサイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換、または細胞および／もしくは細胞溶解物からＭＨＣ分子を分離することができる他の方法による。
一部の実施形態では、ＭＨＣＩＩポリペプチドの組換え発現は、多くのＭＨＣ単量体の改変を可能にする。例えば、組換え技法は、疎水性膜貫通ドメインを欠失させるカルボキシ末端短縮のための方法を提供する。カルボキシ末端は、例えばシステインおよび／またはリシン残基を分子に導入することによって、リガンドまたは標識のコンジュゲーションを容易にするために任意に選択することもできる。合成遺伝子は、典型的には、発現ベクターへの挿入および遺伝子配列の操作を支援する制限部位を含む。適切な単量体をコードする遺伝子は、次いで、発現ベクターに挿入され、適切な宿主、例えばＥ．ｃｏｌｉ、酵母、昆虫または他の好適な細胞において発現され、組換えタンパク質が得られる。
一部の実施形態では、ＭＨＣＩＩ単量体は、それらのアルファまたはベータ鎖のいずれかにおいてビオチン化される。一部の実施形態では、ＭＨＣＩＩ単量体は、再フォールディングまたはペプチド交換のいずれかによるペプチドのローディングの前にビオチン化される。ＭＨＣ単量体のビオチン化は、当技術分野において公知の通り、例えばビオチン化酵素の認識部位である特異的付着部位にビオチンを付着させることによって、達成することができる。一部の実施形態では、ビオチン化酵素は、ＢｉｒＡである。一部の実施形態では、ビオチン化は、タンパク質発現の間の翻訳後修飾として、ｉｎ ｖｉｖｏで所望のタンパク質鎖に対して行われる。
ＩＩ．プレースホルダペプチド
Ａ．ＭＨＣクラスＩプレースホルダペプチド
本明細書に提供される方法では、ＭＨＣＩ単量体は、ＭＨＣＩ単量体の適当なフォールディングを容易にするようにプレースホルダペプチドがロードされて、多量体化前にプレースホルダペプチドロードＭＨＣＩ（ｐ＊ＭＨＣＩ）が産生する。プレースホルダペプチド、ならびにプレースホルダペプチドの存在下でｉｎ ｖｉｔｒｏでＭＨＣＩ重鎖およびβ２－ミクログロブリンのフォールディングを誘導する方法の例は、当技術分野において記載されている（例えば、Bakker et al., PNAS 105:3825-3830, 2008；Rodenko et al., Nat. Prot. 1: 1120-1132, 2006）。
一部の実施形態では、プレースホルダペプチドは、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－ＢまたはＨＬＡ－Ｃペプチドである。一部の実施形態では、プレースホルダペプチドは、ＨＬＡ－Ａ１ペプチド（例えば、Ａ＊１：０１結合性ペプチド）である。一部の実施形態では、プレースホルダペプチドは、ＨＬＡ－Ａ２ペプチド（例えば、Ａ＊０２：０１結合性ペプチド、Ａ＊０２：０２結合性ペプチド、Ａ＊０２：０６結合性ペプチド）である。他の実施形態では、プレースホルダペプチドは、ＨＬＡ－Ａ３ペプチド（例えば、Ａ＊３：０１結合性ペプチド）、ＨＬＡ－Ａ１１ペプチド（例えば、Ａ＊１１：０１結合性ペプチド）、ＨＬＡ－Ａ２３ペプチド（例えば、Ａ＊２３：０１結合性ペプチド）、ＨＬＡ－Ａ２４ペプチド（例えば、Ａ＊２４：０２結合性ペプチド）、ＨＬＡ－Ａ２６ペプチド（例えば、Ａ＊２６：０１結合性ペプチド）、ＨＬＡ－Ａ２９ペプチド（例えば、Ａ＊２９：０２結合性ペプチド）、ＨＬＡ－Ａ３０ペプチド（例えば、Ａ＊３０：０１結合性ペプチド；Ａ＊３０：０２結合性ペプチド）、ＨＬＡ－Ａ３１ペプチド（例えば、Ａ＊３１：０１結合性ペプチド）、ＨＬＡ－Ａ３２ペプチド（例えば、Ａ＊３２：０１結合性ペプチド）、ＨＬＡ－Ａ３３ペプチド（例えば、Ａ＊３３：０１結合性ペプチド；Ａ＊３３：０３結合性ペプチド）、ＨＬＡ－Ａ６８ペプチド（例えば、Ａ＊６８：０２結合性ペプチド）、ＨＬＡ－Ｂ７ペプチド（例えば、Ｂ＊０７：０２結合性ペプチド）、ＨＬＡ－Ｂ８ペプチド（例えば、Ｂ＊０８：０１結合性ペプチド）、ＨＬＡ－Ｂ１５ペプチド（例えば、Ｂ＊１５：０１結合性ペプチド；Ｂ＊１５：０３結合性ペプチド）、ＨＬＡ－Ｂ１８ペプチド（例えば、Ｂ＊１８：０１結合性ペプチド）、ＨＬＡ－Ｂ３５ペプチド（例えば、Ｂ＊３５：０１結合性ペプチド）、ＨＬＡ－Ｂ３８ペプチド（例えば、Ｂ＊３８：０１結合性ペプチド）、ＨＬＡ－Ｂ４０ペプチド（例えば、Ｂ＊４０：０１結合性ペプチド；Ｂ＊４０：０２結合性ペプチド）、ＨＬＡ－Ｂ４５ペプチド（例えば、Ｂ＊４５：０１結合性ペプチド）、ＨＬＡ－Ｂ５１ペプチド（例えば、Ｂ＊５１：０１結合性ペプチド）、ＨＬＡ－Ｂ５３ペプチド（例えば、Ｂ＊５３：０１結合性ペプチド）、ＨＬＡ－Ｂ５８ペプチド（例えば、Ｂ＊５８：０１結合性ペプチド）、ＨＬＡ－Ｃ３ペプチド（例えば、Ｃ＊０３：０３結合性ペプチド；Ｃ＊０３：０４結合性ペプチド）、ＨＬＡ－Ｃ４ペプチド（例えば、Ｃ＊０４：０１結合性ペプチド）、ＨＬＡ－Ｃ７ペプチド（例えば、Ｃ＊０７：０１結合性ペプチド；Ｃ＊０７：０２結合性ペプチド）、またはＨＬＡ－Ｃ８ペプチド（例えば、Ｃ＊０８：０１結合性ペプチド）である。一部の実施形態では、プレースホルダペプチドは、合成ペプチドである。
一部の実施形態では、プレースホルダペプチドのＭＨＣＩの結合溝に対する親和性は、レスキューペプチドよりも低い。一部の実施形態では、プレースホルダペプチドのＭＨＣＩ結合溝に対する親和性は、レスキューペプチドよりも約１０倍低い。一部の実施形態では、プレースホルダペプチドのＭＨＣＩの結合溝に対する親和性は、レスキューペプチドよりも高いが、しかしながら、プレースホルダペプチドは、依然として、過剰濃度のレスキューペプチドの使用によりレスキューペプチドによって置き換えることができる。
一部の実施形態では、プレースホルダペプチドは、熱不安定である。一部の実施形態では、プレースホルダペプチドは、約３０～３７℃の間の温度で熱不安定である。一部の実施形態では、プレースホルダペプチドは、３０℃もしくはそれを上回る、３２℃もしくはそれを上回る、３４℃もしくはそれを上回る、３５℃もしくはそれを上回る、３６℃もしくはそれを上回る、または約３７℃の温度で不安定である。熱不安定なプレースホルダペプチド、および熱不安定なプレースホルダペプチドを識別および産生する方法は、記載されている（例えば、ＷＯ９３／１０２２０号；ＷＯ２００５／０４７９０２号；ＵＳ２００８／０２０６７８９号；Luimstra et al., Curr. Protoc. Immunol. 126(1):e85, 2019；Luimstra et al., J. Exp. Med. 215(5):1493-1504, 2018）。
一部の実施形態では、プレースホルダペプチドは、酸性ｐＨで不安定である。一部の実施形態では、プレースホルダペプチドは、約ｐＨ２．５～６．５で不安定である。一部の実施形態では、プレースホルダペプチドは、約２．５～６．０、３．０～６．０、３．０～６．５、３．５～６．０、３．５～６．５、４．０～６．０、４．０～６．５、４．５～６．０、４．５～６．５、５．０～６．０、５．０～６．５、５．０、５．５、６．０、または６．５のｐＨで不安定である。一部の実施形態では、プレースホルダペプチドは、塩基性ｐＨで不安定である。一部の実施形態では、プレースホルダペプチドは、約ｐＨ９～１１の間で不安定である。一部の実施形態では、プレースホルダペプチドは、ｐＨ９もしくはそれを上回る、ｐＨ９．５もしくはそれを上回る、ｐＨ１０もしくは約ｐＨ１０、ｐＨ１０．５もしくは約ｐＨ１０．５、またはｐＨ１１もしくは約ｐＨ１１で不安定である。ｐＨ感受性のプレースホルダペプチドを生成および使用する方法は、公開されており、例えば、ＷＯ９３／１０２２０号；ＵＳ２００８／０２０６７８９号；およびCameron et al., J. Immunol. Meth. 268:51-59に記載される通りである。
一部の実施形態では、プレースホルダペプチドは、切断可能部分を含む。さまざまな種類の切断可能部分が、当技術分野において公知であり、例えば、光照射、酵素、求核剤または求電子剤、還元剤および酸化剤によって切断される部分が挙げられる（例えば、Leriche et al., Biorg. Med. Chem. 20(2):571-582, 2012において概説）。
一部の実施形態では、切断可能プレースホルダペプチドは、１つまたは複数の光切断可能な非天然β－アミノ酸を含む。一部の実施形態では、プレースホルダペプチドは、３－アミノ－３－（２－ニトロ－フェニル）－プロピオン酸を含む。一部の実施形態では、プレースホルダペプチドは、（２－ニトロ）フェニルグリシンを含む。一部の実施形態では、プレースホルダペプチドは、アゾベンゼン基を含む。一部の実施形態では、ＨＬＡ－Ａ２プレースホルダペプチドは、Ａ＊０２：０１、ＫＩＬＧＦＶＦＪＶ（配列番号１５）またはＧＩＬＧＦＶＦＪＬ（配列番号７）（ここで、Ｊは、３－アミノ－３－（２－ニトロ）フェニル－プロピオン酸である）である。一部の実施形態では、プレースホルダペプチドは、Ａ＊０１：０１、ＳＴＡＰＧＪＬＥＹ（配列番号１６）；Ａ＊０３：０１、ＲＩＹＲＪＧＡＴＲ（配列番号１７）；Ａ＊１１：０１、ＲＶＦＡＪＳＦＩＫ（配列番号１８）；Ａ＊２４：０２、ＶＹＧＪＶＲＡＣＬ（配列番号１１）；Ｂ＊０７：０２、ＡＡＲＧＪＴＬＡＭ（配列番号１４）；Ｂ＊３５：０１、ＫＰＩＶＶＬＪＧＹ（配列番号１９）；Ｃ＊０３：０４、ＦＶＹＧＪＳＫＴＳＬ（配列番号２０）、Ｂ＊０８：０１、ＦＬＲＧＲＡＪＧＬ（配列番号２１）；Ｃ＊０７：０２、ＶＲＩＪＨＬＹＩＬ（配列番号２２）；Ｃ＊０４：０１、ＱＹＤＪＡＶＹＫＬ（配列番号２３）；Ｂ＊１５：０１、ＩＬＧＰＪＧＳＶＹ（配列番号２４）；Ｂ＊４０：０１、ＴＥＡＤＶＱＪＷＬ（配列番号２５）；Ｂ＊５８：０１、ＩＳＡＲＧＱＪＬＦ（配列番号２６）；およびＣ＊０８：０１、ＫＡＡＪＤＬＳＨＦＬ（配列番号２７）（ここで、Ｊは、３－アミノ－３－（２－ニトロ）フェニル－プロピオン酸である）からなる群から選択される。別の実施形態では、プレースホルダペプチドは、配列番号７～２７または２７１～２７９のいずれか１つに示される配列を含む。別の実施形態では、プレースホルダペプチドは、配列番号７～２７または２７１～２７９のいずれか１つに示される配列からなる。
光切断可能アミノ酸を含有するプレースホルダペプチドを生成する方法は、当技術分野において公知であり、以前に記載されている（例えば、Toebes et al., Curr. Protoc. Immunol. 87:18.16.1-18.16.20, 2009；Bakker et al.、上記、Rodenko et al.上記）。さまざまな実施形態では、光切断可能プレースホルダペプチドは、以前に記載された方法（例えば、Toebes et al., Nat Med. 2006 Feb; 12(2):246-51；Bakker et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Mar 11; 105(10):3825-30；Rodenko et al., Nat Protoc. 2006; 1(3):1120-32；Frosig et al., Cytometry A. 2015 Oct; 87(10):967-75）を使用して、ＵＶ光への曝露の際に切断される。
一部の実施形態では、プレースホルダペプチドは、化学選択的部分を含む。一部の実施形態では、化学選択的部分は、亜ジチオン酸ナトリウム感受性アゾベンゼンリンカーを含み、ここで、アゾベンゼンは、電子供与基を含む少なくとも１つの芳香族基を含み、２個のアミノ酸残基間に位置する。アゾベンジンリンカーおよび化学選択的ペプチド交換のための方法は、当技術分野において公知であり、例えば米国特許第１０，４００，０２４号に記載されている。
一部の実施形態では、プレースホルダペプチドは、アミノペプチダーゼへの曝露の際に切断される切断可能部分を含む。一部の実施形態では、アミノ酸残基の切断は、メチオニンアミノペプチダーゼの使用を介して起こる。メチオニンアミノペプチダーゼは、２位のアミノ酸残基が、例えば、グリシン、アラニン、セリン、システイン、またはプロリンである場合に、ペプチドからメチオニンを切断することができる。一部の実施形態では、切断可能部分は、トロンビン切断ドメインを含む。
一部の実施形態では、プレースホルダペプチドは、化学的トリガーに対して感受性である切断可能部分を含む。一部の実施形態では、プレースホルダペプチドは、過ヨウ素酸塩感受性アミノ酸を含む。一部の実施形態では、過ヨウ素酸塩感受性アミノ酸は、ビシナルジオール部分を含む。一部の実施形態では、過ヨウ素酸塩感受性アミノ酸は、ビシナルアミノアルコールを含む。一部の実施形態では、過ヨウ素酸塩感受性アミノ酸は、１，２－アミノアルコール含有アミノ酸である。一部の実施形態では、過ヨウ素酸塩感受性アミノ酸は、α、γ－ジアミノ－β－ヒドロキシブタン酸（ＤＡＨＢ）である。過ヨウ素酸塩感受性アミノ酸を含有するペプチドを産生および使用するための方法は、公開されており、例えば、Rodenko et al. (J. Am. Chem. Soc. 131:12605-12313, 2009)およびAmore et al. (ChemBioChem 14:123-131, 2013)に記載されている。
一部の実施形態では、プレースホルダペプチドは、ジペプチドである。一部の実施形態では、ジペプチドは、ＭＨＣＩ結合溝のＦポケットに結合する。一部の実施形態では、ジペプチドの第２のアミノ酸は、疎水性である。一部の実施形態では、ジペプチドは、グリシル－ロイシン（ＧＬ）、グリシル－バリン（ＧＶ）、グリシル－メチオニン（ＧＭ）、グリシル－シクロヘキシルアラニン（ＧＣｈａ）、グリシル－ホモロイシン（ＧＨｌｅ）、およびグリシル－フェニルアラニン（ＧＦ）からなる群から選択される。プレースホルダペプチドとしてジペプチドを産生および使用するための方法は、公開されており、例えば、Saini et al. (PNAS 112:202-207, 2015)に記載されている。
一部の実施形態では、プレースホルダペプチドは、ＧＩＬＧＦＶＦＪＬ（配列番号７）を含む。一部の実施形態では、プレースホルダペプチドは、ＧＩＬＧＦＶＦＪＬ（配列番号７）からなる。他の実施形態では、プレースホルダペプチドは、配列番号８～２７または２７１～２７９のいずれか１つに示される配列を含む。他の実施形態では、プレースホルダペプチドは、配列番号８～２７または２７１～２７９のいずれか１つに示される配列からなる。
一部の実施形態では、プレースホルダペプチドは、蛍光標識をさらに含む。一部の実施形態では、蛍光標識は、プレースホルダペプチド中のシステイン残基に付着している。
一部の実施形態では、ｐ＊ＭＨＣＩ分子は、精製され、本明細書に記載されるペプチド交換条件への曝露の際に目的のペプチドエピトープと交換され得るストック分子の起源としての役割を果たすために保管される。
Ｂ．ＭＨＣクラスＩＩプレースホルダペプチド
本明細書に提供される方法では、ＭＨＣＩＩ単量体は、ＭＨＣＩＩ単量体の適当なフォールディングを容易にするようにプレースホルダペプチドがロードされて、多量体化前にプレースホルダペプチドロードＭＨＣＩＩ（ｐ＊ＭＨＣＩＩ）が産生する。さまざまな実施形態では、プレースホルダペプチドは、ＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＸ、ＨＬＡ－ＤＯ、ＨＬＡ－ＤＺ、またはＨＬＡ－ＤＰと結合するペプチドである。一部の実施形態では、プレースホルダペプチドは、合成ペプチドである。
一部の実施形態では、プレースホルダペプチドのＭＨＣＩＩの結合溝に対する親和性は、レスキューペプチドよりも低い。一部の実施形態では、プレースホルダペプチドのＭＨＣＩＩ結合溝に対する親和性は、レスキューペプチドよりも約１０倍低い。
一部の実施形態では、プレースホルダペプチドは、熱不安定である。一部の実施形態では、プレースホルダペプチドは、約３０～３７℃の間の温度で熱不安定である。一部の実施形態では、プレースホルダペプチドは、３０℃もしくはそれを上回る、３２℃もしくはそれを上回る、３４℃もしくはそれを上回る、３５℃もしくはそれを上回る、３６℃もしくはそれを上回る、または約３７℃の温度で不安定である。熱不安定なプレースホルダペプチド、および熱不安定なプレースホルダペプチドを識別および産生する方法は、記載されている（例えば、ＷＯ９３／１０２２０号；ＷＯ２００５／０４７９０２号；ＵＳ２００８／０２０６７８９号；Luimstra et al., Curr. Protoc. Immunol. 126(1):e85, 2019；Luimstra et al., J. Exp. Med. 215(5):1493-1504, 2018）。
一部の実施形態では、プレースホルダペプチドは、酸性ｐＨで不安定である。一部の実施形態では、プレースホルダペプチドは、約ｐＨ２．５～６．５で不安定である。一部の実施形態では、プレースホルダペプチドは、約２．５～６．０、３．０～６．０、３．０～６．５、３．５～６．０、３．５～６．５、４．０～６．０、４．０～６．５、４．５～６．０、４．５～６．５、５．０～６．０、５．０～６．５、５．０、５．５、６．０、または６．５のｐＨで不安定である。一部の実施形態では、プレースホルダペプチドは、塩基性ｐＨで不安定である。一部の実施形態では、プレースホルダペプチドは、約ｐＨ９～１１の間で不安定である。一部の実施形態では、プレースホルダペプチドは、ｐＨ９もしくはそれを上回る、ｐＨ９．５もしくはそれを上回る、ｐＨ１０もしくは約ｐＨ１０、ｐＨ１０．５もしくは約ｐＨ１０．５、またはｐＨ１１もしくは約ｐＨ１１で不安定である。ｐＨ感受性のプレースホルダペプチドを生成および使用する方法は、公開されており、例えば、ＷＯ９３／１０２２０号；ＵＳ２００８／０２０６７８９号；およびCameron et al., J. Immunol. Meth. 268:51-59に記載される通りである。
一部の実施形態では、プレースホルダペプチドは、切断可能部分を含む。さまざまな種類の切断可能部分が、当技術分野において公知であり、例えば、光照射、酵素、求核剤または求電子剤、還元剤および酸化剤によって切断される部分が挙げられる（例えば、Leriche et al., Biorg. Med. Chem. 20(2):571-582, 2012において概説）。
一実施形態では、プレースホルダペプチドは、分解タグに融合され、ペプチド交換は、レスキューペプチドの存在と一緒に対応するプロテアーゼ（分解タグを消化する）の存在下でのタンパク分解によって促進される。
一部の実施形態では、切断可能プレースホルダペプチドは、光切断可能ペプチドであり、例えば、ＵＶ光への曝露の際に切断される。例えば、プレースホルダペプチドは、１つまたは複数の光切断可能な非天然アミノ酸を含むことができる。例えばＵＶ感受性アミノ酸アナログの３－アミノ－３－（２－ニトロフェニル）－プロピオネートを組み込むＭＨＣＩＩ結合性光切断可能ペプチドが記載されている（例えば、Negroni and Stern (2018) PLos One, 13(7):e0199704を参照されたい）。
一実施形態では、ＭＨＣＩＩプレースホルダペプチドは、ＣＬＩＰペプチド、例えばアミノ酸配列ＫＰＶＳＫＭＲＭＡＴＰＬＬＭＱＡ（配列番号１８９）またはＡＴＰＬＬＭＱＡＬＰＭＧＡ（配列番号２８０）を有するものである。一実施形態では、ＣＬＩＰペプチドは切断可能である。一実施形態では、ＭＨＣＩＩ単量体は、例えば一本鎖ＭＨＣクラスＩＩ鎖－ペプチド複合体の合成によって共有結合的に付着され、ベータ鎖ｃＤＮＡの近位のペプチド特異的相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列を操作することによって方向付けられる、切断可能ＣＬＩＰペプチドを用いて合成される（例えば、Day et al. (2003) J. Clin. Invest., 112:831-842を参照されたい）。ＣＬＩＰペプチド（プレースホルダペプチドとして）とＭＨＣＩＩとの間の共有結合的連結の切断は、このようにして、他のＭＨＣＩＩ結合性ペプチドとのペプチド交換を可能にする。
ＭＨＣＩＩ分子およびその公知のＭＨＣＩＩ結合性ペプチドの適切な対形成に基づいて、プレースホルダペプチドとして使用することができる他のＭＨＣＩＩ結合性ペプチドは、当技術分野において記載されている。公知のＭＨＣＩＩ分子／ＭＨＣＩＩ結合性ペプチド対の非限定的な例としては、ＤＲＡ１＊０１０１／ＤＲＢ１＊０４０１および赤血球凝集素のＨＡ３０７～３１９の免疫優性ペプチド（Novak et al. (1999) J. Clin. Invest., 104:R63-R67を参照されたい）、ならびにＨＬＡ－ＤＲ＊１１０１およびアミノ酸配列ＱＩＹＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＬ（配列番号１９０）を有する破傷風トキソイド（ＴＴ）由来ｐ２ペプチド（ＴＴ８３０～８４４）（Cecconi et al. (2008) Cytometry, 73A:1010-1018を参照されたい）が挙げられる。
ＩＩＩ．ｐ＊ＭＨＣ多量体の産生
本明細書に提供されるｐＭＨＣ多量体の産生における使用のための多量体化ドメインは、２つまたはそれよりも多くのｐＭＨＣまたはｐ＊ＭＨＣ単量体の共有結合的コンジュゲートに好適であり、ｐＭＨＣポリペプチドの細胞への結合を妨げない、タンパク質、ポリペプチド、または他の多量体部分を含む。一部の実施形態では、多量体化ドメインは、タンパク質サブユニットを含む。一部の実施形態では、多量体化ドメインは、タンパク質サブユニットのホモ多量体である。一部の実施形態では、多量体化ドメインは、タンパク質サブユニットのヘテロ多量体である。一実施形態では、多量体は、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、八量体、十量体、または十二量体である。好ましい一実施形態では、ｐＭＨＣ多量体は、四量体である。
好適な結合性実体の例としては、ストレプトアビジン（ＳＡ）およびアビジンならびにそれらの誘導体、ビオチン、免疫グロブリン、抗体（モノクローナル、ポリクローナル、および組換え）、それらの抗体断片および誘導体、ＡＰ－１のロイシンジッパードメイン（ｊｕｎおよびｆｏｓ）、ヘキサ－ｈｉｓ（金属キレート部分）、ヘキサ－ｈａｔ ＧＳＴ（グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ）グルタチオン親和性、カルモジュリン結合性ペプチド（ＣＢＰ）、Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇ（登録商標）、セルロース結合性ドメイン、マルトース結合性タンパク質、Ｓ－ペプチドタグ、キチン結合性タグ、免疫反応性エピトープ、エピトープタグ、Ｅ２Ｔａｇ、ＨＡエピトープタグ、Ｍｙｃエピトープ、ＦＬＡＧエピトープ、ＡＵ１およびＡＵ５エピトープ、Ｇｌｕ－Ｇｌｕエピトープ、ＫＴ３エピトープ、ＩＲＳエピトープ、Ｂｔａｇエピトープ、プロテインキナーゼ－Ｃエピトープ、ＶＳＶエピトープ、炭水化物、脂質、およびタンパク質を含む多様な化合物への結合を媒介するレシチン、例えばＣｏｎ Ａ（Ｃａｎａｖａｌｉａｅｎｓｉ ｆｏｒｍｉｓ）またはＷＧＡ（小麦胚芽凝集素）、ならびにテトラネクチン、またはプロテインＡもしくはＧ（抗体親和性）、またはコイルドコイルポリペプチド、例えば、ロイシンジッパーである。そのような結合性実体の組合せも含まれる。
一部の実施形態では、多量体化ドメインは、ストレプトアビジン（ＳＡまたはＳＡｖ）またはその誘導体の四量体である。一部の実施形態では、多量体化ドメインは、四量体ストレプトアビジンである。一部の実施形態では、四量体は、Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇ（登録商標）またはＳｔｒｅｐ－ｔａｃｔｉｎ（登録商標）を含む。Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇ（登録商標）またはＳｔｒｅｐ－ｔａｃｔｉｎ（登録商標）は、それぞれ、米国特許第５，５０６，１２１号および米国特許第６，１０３，４９３号に記載されており、いくつかの供給源から市販されている。ＭＨＣ単量体をストレプトアビジンにＳＡｖのビオチン結合部位を介して非共有結合的に付着させるために、ａｖｉｔａｇ（例えば、配列番号１６１に示されるアミノ酸配列を有する、これは６×ＨｉｓタグおよびＦＬＡＧタグを含む）を、例えばＣ末端で、ＭＨＣ単量体に組み込むことができる（例えば、実施例３を参照されたい）。
本明細書に提供される方法では、ｐＭＨＣ多量体は、多量体化ドメインの各サブユニットのＮまたはＣ末端への各ｐ＊ＭＨＣ単量体の共有結合的コンジュゲーションによって産生され、本明細書でコンジュゲート化多量体と称される反応産物をもたらす。一実施形態では、コンジュゲート化多量体は、ｐＭＨＣクラスＩ（ｐＭＨＣＩ）コンジュゲート化多量体である。別の実施形態では、コンジュゲート化多量体は、ｐＭＨＣクラスＩＩ（ｐＭＨＣＩＩ）コンジュゲート化多量体である。
一部の実施形態では、ｐＭＨＣＩ多量体は、ＭＨＣＩ α１ドメインのＣ末端への多量体化ドメインの共有結合的コンジュゲーションによって産生される。一部の実施形態では、ｐＭＨＣＩ多量体は、ＭＨＣＩ α２ドメインのＣ末端への多量体化ドメインの共有結合的コンジュゲーションによって産生される。一部の実施形態では、ｐＭＨＣＩ多量体は、ＭＨＣＩ α３ドメインのＣ末端への多量体化ドメインの共有結合的コンジュゲーションによって産生される。一部の実施形態では、ｐＭＨＣＩ多量体は、各ｐ＊ＭＨＣ単量体のβ２－ミクログロブリンのＣ末端への多量体化ドメインの共有結合的コンジュゲーションによって産生される。
好ましい実施形態では、ｐＭＨＣＩＩ多量体は、ＭＨＣＩＩ α鎖への多量体化ドメインの共有結合的コンジュゲーションによって産生される。別の実施形態では、ｐＭＨＣＩＩ多量体は、ＭＨＣＩＩ β鎖への多量体化ドメインの共有結合的コンジュゲーションによって産生される。ある特定の実施形態では、ｐＭＨＣＩＩ多量体は、ＭＨＣＩＩ α１ドメインのＣ末端への多量体化ドメインの共有結合的コンジュゲーションによって産生される。ある特定の実施形態では、ｐＭＨＣＩＩ多量体は、ＭＨＣＩＩ α２ドメインのＣ末端への多量体化ドメインの共有結合的コンジュゲーションによって産生される。ある特定の実施形態では、ｐＭＨＣＩＩ多量体は、ＭＨＣＩＩ β１ドメインのＣ末端への多量体化ドメインの共有結合的コンジュゲーションによって産生される。ある特定の実施形態では、ｐＭＨＣＩＩ多量体は、ＭＨＣＩＩ β２ドメインのＣ末端への多量体化ドメインの共有結合的コンジュゲーションによって産生される。
各ＭＨＣ単量体と多量体化ドメインとの間で共有結合を形成するためのいくつかの好適な方法が本明細書に提供される。
Ａ．化学的バイオコンジュゲーション
一部の実施形態では、ｐ＊ＭＨＣ多量体は、化学的コンジュゲーションによって産生される。一部の実施形態では、化学的コンジュゲーションは、多量体化ドメインへのｐ＊ＭＨＣポリペプチドのシステインバイオコンジュゲーションによって媒介される。一部の実施形態では、システインバイオコンジュゲーションは、システインのアルキル化によって媒介される。一部の実施形態では、システインバイオコンジュゲーションは、システインの酸化によって媒介される。他の実施形態では、システインバイオコンジュゲーションは、脱硫反応によって媒介される。一部の実施形態では、システインバイオコンジュゲーションは、ヨードアセトアミドによって媒介される。一部の実施形態では、システインバイオコンジュゲーションは、マレイミドによって媒介される。本明細書に開示されるｐＭＨＣ多量体を産生するために使用され得る２つの部分のシステイン媒介連結を利用するための方法は記載されており、例えば、Chalker et al., Chem Asian J.4(5):630-40, 2009；Spicer et al., Nat Commun. 5:4740, 2015を参照されたい。
一部の実施形態では、ＭＨＣ多量体は、以前に記載されているように（Basle et al., M Chem Biol. 17(3):213-27, 2010；Hu et al., Chem Soc Rev. 45(6):1691-719, 2016；Lin et al., Science 355(6325):597-602, 2017）、限定されるものではないが、リシン、チロシン、アルギニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、セリン、トレオニン、メチオニン、ヒスチジン、およびトリプトファン側鎖、ならびにＮ末端アミンまたはＣ末端カルボキシルを含む、システイン以外のアミノ酸の化学的改変によって産生される。
Ｂ．天然の化学的ライゲーション
一部の実施形態では、ｐＭＨＣ多量体は、天然の化学的ライゲーション（ＮＣＬ）によって産生され、ここで、各ｐ＊ＭＨＣポリペプチドは、Ｃ末端チオエステルを含み、多量体化ドメインの各サブユニットは、Ｎ末端システイン残基またはその機能的等価体を含み、システイン側鎖とチオエステルとの間の反応は、不可逆的に天然のペプチド結合を形成し、このようにしてｐ＊ＭＨＣ単量体を多量体化ドメインにライゲーションする。ＮＣＬのための方法は記載されている（Hejjaoui et al., M Protein Sci. 24(7):1087-99. 2015) Mandal et al., Proc Natl Acad Sci USA 109(37):14779-84, 2012；Torbeev et al., Proc Natl Acad Sci USA 110(50):20051-6, 2013）。
一部の実施形態では、β－および／またはγ－チオアミノ酸がｐ＊ＭＨＣ単量体に組み込まれる。一部の実施形態では、β－および／またはγ－チオアミノ酸は、多量体化ドメインの各サブユニットのＮ末端位でシステイン様残基を置き換えて、例えば、トランス－チオエステル化のための反応性チオールを提供する。次いで、脱硫プロトコールは、所望の天然の側鎖を産生することができる。一部の実施形態では、ＮＣＬは、アラニン残基で行われる。他の実施形態では、ＮＣＬは、フェニルアラニン（Crich & Banerjee, 2007）、バリン（Chen et al. 2008；Haase et al. 2008）、ロイシン（Harpaz et al. 2010；Tan et al. 2010）、トレオニン（Chen et al. 2010b）、リシン（El Oualid et al. 2010；Kumar et al. 2009；Yang et al. 2009)、プロリン（Shang et al. 2011）、グルタミン（Siman et al. 2012）、アルギニン（Malins et al. 2013）、トリプトファン（Malins et al. 2014）、アスパラギン酸（Thompson et al. 2013）、グルタミン酸（Cergol et al. 2014）、およびアスパラギン（Sayers et al. 2015）で行われる。精製ステップを除去し、ライゲーションされた産物の収率を増加させるライゲーション／脱硫手法は記載されている（Moyal et al. 2013；Thompson et al. 2014）。
Ｃ．クリックケミストリー媒介生体直交型コンジュゲーション
一部の実施形態では、ｐ＊ＭＨＣ多量体は、各ｐ＊ＭＨＣ単量体のＣ末端のコンジュゲーション部分と多量体化ドメインの各サブユニットのＮ末端のコンジュゲーション部分との間の生体直交型コンジュゲーションによって産生される。一部の実施形態では、生体直交型コンジュゲーションは、「クリックケミストリー」（例えば、Kolb, Finn and Sharpless, Angewandte Chemie International Edition (2001) 40: 2004-2021を参照されたい）によって媒介される。クリックケミストリーのために好適なコンジュゲーション部分、反応条件および関連方法は、当技術分野において利用可能である（例えば、Kolb et al., Angewandte Chemie International Edition 40:2004-2021, 2001；Evans, Australian Journal of Chemistry 60: 384-395, 2007；Lahann, Click Chemistry for Biotechnology and Materials Science, John Wiley & Sons Ltd, ISBN 978-0-470-69970-6, 2009）。一部の実施形態では、クリックケミストリー部分は、末端アルキン、アジド、歪んだアルキン、ジエン、ジエノフィル、アルコキシアミン、カルボニル、ホスフィン、ヒドラジド、チオール、またはアルケン部分を含み得るか、またはそれらからなり得る。ある特定の実施形態では、アジドは、銅キレート化アジドである。一実施形態では、銅キレート化アジドは、ピコリルアジド、例えば、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－（ＰＥＧ）４－ピコリルアジドである。クリックケミストリー反応における使用のための試薬は、例えばＣｌｉｃｋ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｔｏｏｌｓ（Ｓｃｏｔｔｓｄａｌｅ、ＡＺ）またはＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）から、市販されている。
クリックケミストリーを介した多量体化ドメインのサブユニットへの各ｐ＊ＭＨＣ単量体のコンジュゲーションのために、タンパク質のクリックケミストリー部分は、例えば、各ｐ＊ＭＨＣ単量体のクリックケミストリー部分の１つの反応性基が多量体化ドメインのサブユニット上の第２のクリックケミストリー部分の反応性基と反応して、共有結合を形成するという点で、互いと反応性でなければならない。クリックケミストリーハンドルのそのような反応性対は、当業者に周知であり、限定されるものではないが、図１に示されるものが挙げられる。
一部の実施形態では、各ｐ＊ＭＨＣコンジュゲーション部分は、クリックケミストリー反応条件下で多量体化ドメインの各サブユニットのコンジュゲーション部分に共有結合的にコンジュゲーションすることができる。一部の実施形態では、各ｐ＊ＭＨＣ単量体のＣ末端の第１のクリックケミストリー部分、および多量体化ドメインの各サブユニットに第２のクリックケミストリー部分の反応をインストールするために、ソルターゼ媒介コンジュゲーションが使用される。本明細書に提供される方法では、第１のクリックケミストリー部分を含有する２つまたはそれよりも多くのｐ＊ＭＨＣ単量体は、クリックケミストリー条件下で多量体化ドメインの各サブユニットのＣ末端の第２のクリックケミストリー部分にコンジュゲートされる。ソルターゼを利用してクリックケミストリー部分を付着させる方法は、例えば、ＷＯ２０１３／００３５５号に記載されており、その全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。アルキン－アジドクリックケミストリーをソルターゼ媒介コンジュゲーションと組み合わせて使用して調製されるｐＭＨＣ多量体の非限定的な例示を、実施例１、５、６および７に詳細に記載する。
一部の実施形態では、各ｐ＊ＭＨＣ単量体のＣ末端の第１のクリックケミストリー部分、および多量体化ドメインの各サブユニットに第２のクリックケミストリー部分の反応をインストールするために、インテイン媒介コンジュゲーションが使用される。インテイン媒介コンジュゲート化を利用する方法を本明細書でさらに記載する。
一部の実施形態では、本明細書に提供される多量体化ドメインへのｐ＊ＭＨＣ単量体のクリックケミストリー媒介共有結合的コンジュゲーションの方法は、Ｃ末端チオエステルとβ－アミノチオールとの天然の化学的ライゲーションを含む（Xiao J, Tolbert TJ Org Lett. 2009 Sep 17; 11(18):4144-7）。
一部の実施形態では、ｐ＊ＭＨＣ多量体を産生するために使用されるクリックケミストリーは、１，３－双極性環化付加（例えば、銅（Ｉ）触媒の段階的バリアント、多くの場合単純に「クリック反応」と称される；例えば、Tornoe et al., Journal of Organic Chemistry (2002) 67: 3057-3064を参照されたい）を含む。銅およびルテニウムは、反応において一般に使用される触媒である。触媒としての銅の使用は、１，４－位置異性体の形成をもたらすが、ルテニウムは、１，５－位置異性体の形成をもたらす。
一部の実施形態では、ＭＨＣ単量体は、発現されたタンパク質ライゲーション（ＥＰＬ）によってアルキン化ペプチドにライゲーションされ、次いで銅（Ｉ）触媒末端アジド－アルキン環化付加（ＣｕＡＡＣ）によるアジド標識化多量体化ドメインにコンジュゲートされる。
一部の実施形態では、クリックケミストリーコンジュゲーションは、ディールス－アルダー反応などの環化付加反応を含む。一部の実施形態では、ＭＨＣＩおよび多量体化ドメインは、アジド－アルキン１，３－双極性環化付加（「クリックケミストリー」）によってコンジュゲートされる。一部の実施形態では、環化付加は、銅（Ｉ）触媒環化付加（ＣｕＡＡＣ）の存在によって促進される。
一部の実施形態では、クリックケミストリーコンジュゲーションは、エポキシドおよびアジリジンのような小さな歪んだ環への求核付加を含む。一部の実施形態では、環化付加は、例えばAgard NJ, Prescher JA, Bertozzi CR J Am Chem Soc. 2004 Nov 24; 126(46):15046-7に記載されるように、歪んだシクロオクチン系によって促進される。
一部の実施形態では、クリックケミストリーコンジュゲーションは、活性化されたカルボニル基への求核付加を含む。
一部の実施形態では、ｐＭＨＣ単量体および多量体化ドメインのコンジュゲーションは、生体直交反応によって起こる。一部の実施形態では、ＭＨＣおよび多量体化ドメインは、例えば、Blackman ML, Royzen M, Fox JM J Am Chem Soc. 2008 Oct 15; 130(41):13518-9；およびDevaraj NK, Weissleder R, Hilderbrand SA Bioconjug Chem. 2008 Dec; 19(12):2297-9に記載されるように、歪んだジエノフィルとテトラジンジエンとの間の逆電子要求ディールス－アルダー反応によってコンジュゲートされる。一部の実施形態では、ジエノフィルは、トランス－シクロオクテンである。一部の実施形態では、ジエノフィルは、ノルボルネンである。
Ｄ．ソルターゼ媒介コンジュゲーション
一部の実施形態では、ｐ＊ＭＨＣ単量体と多量体化ドメインとの間のコンジュゲーションは、システイントランスペプチダーゼによって媒介される。一部の実施形態では、システイントランスペプチダーゼは、ソルターゼまたはその酵素的に活性な断片である。各種のソルターゼ酵素が記載されており、市販されている（例えば、Antos et al., Curr. Opin. Struct. Biol. 38:111-118, 2016）。ソルターゼは、「ｓｏｒｔａｇ」と称されるアミノ酸モチーフを認識および切断して、２つのポリペプチド上のアシルドナーとアクセプター部位との間でペプチド結合を生じ、ＮまたはＣ末端ｓｏｒｔａｇを含有する異なるポリペプチドのライゲーションをもたらす。（アルキン－アジドクリックケミストリーと組み合わせて）ソルターゼ媒介コンジュゲーションを使用して調製されるｐＭＨＣ多量体の非限定的な例示を、実施例１、５、６および７に詳細に記載する。
したがって、一部の実施形態では、各ｐ＊ＭＨＣ単量体は、Ｃ末端ｓｏｒｔａｇを含み、多量体化ドメインの各サブユニットは、Ｎ末端ｓｏｒｔａｇを含む。他の実施形態では、各ｐ＊ＭＨＣ単量体は、Ｎ末端ｓｏｒｔａｇを含み、多量体化ドメインの各サブユニットは、Ｃ末端ｓｏｒｔａｇを含む。一部の実施形態では、ソルターゼは、ＭＨＣポリペプチドと多量体化ドメインのサブユニットのそれぞれとの間のペプチド結合の形成を触媒する。
一部の実施形態では、認識モチーフは、ｐＭＨＣ単量体のそれぞれのＣ末端に付加され、オリゴ－グリシンモチーフは、多量体化ドメインのサブユニットのそれぞれのＮ末端に付加される。ＭＨＣ単量体および多量体化ドメインの混合物へのソルターゼの添加の際に、ポリペプチドは、天然のペプチド結合を通して共有結合的に連結されて、ｐＭＨＣ多量体を産生する。
一部の実施形態では、ＭＨＣ単量体および／または多量体化ドメインは、ｓｏｒｔａｇとともにインフレームで発現される。一部の実施形態では、追加のタグとしては、例えば、６×－Ｈｉｓタグ（Sinisi et al. Bioconjug. Chem 23:1119-1126, 2012）、求核性蛍光色素（Nair et al. Immun. Inflamm. Dis. 1:3-13, 2013）、および／またはＦＬＡＧタグ（Greineder et al. Bioconjug. Chem. 29:56-66, 2018）が挙げられ得る。
一部の実施形態では、ｓｏｒｔａｇは、ＭＨＣ単量体と多量体化ドメインとの間の化学的コンジュゲーションに好適な改変アミノ酸を含有する。一部の実施形態では、ｓｏｒｔａｇは、本明細書に記載されるクリック－クリックケミストリーコンジュゲーションを方向付けることが可能なＣ末端アジドリシン残基を含有する。
一部の実施形態では、ＭＨＣポリペプチドおよび／または多量体化ドメインは、ポリペプチドとｓｏｒｔａｇとの間にリンカーを含む。一部の実施形態では、各ＭＨＣポリペプチドおよび多量体化ドメインの各サブユニットは、ｓｏｒｔａｇをリンカーとともに含む。好適なリンカーは、例えば、Greineder et al., Bioconjug. Chem. 29:56-66, 2018に記載されている。一部の実施形態では、リンカーは、半剛性リンカーである。一部の実施形態では、リンカーは、（ＳＳＳＳＧ）２ＳＡＡ（配列番号１８２）を含む。一部の実施形態では、リンカーは、（Ｇ）５（配列番号１８３）を含む。
一部の実施形態では、ｓｏｒｔａｇは、反応の進行および効率の測定を容易にするためにフルオロフォア改変リシン残基を含有する。
一部の実施形態では、ソルターゼは、Ｃａ２＋依存性である。一部の実施形態では、ソルターゼは、Ｃａ２＋非依存性である。
一部の実施形態では、ｓｏｒｔａｇ標識化ＭＨＣ分子は、例えば配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する、Ｃ末端ｓｏｒｔａｇおよび６×Ｈｉｓタグを有する可溶性ＨＬＡ－Ａ２（ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１）である。一部の実施形態では、ｓｏｒｔａｇ標識化多量体化ドメインは、例えば配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する、Ｃ末端ｓｏｒｔａｇおよび６×Ｈｉｓタグを有するストレプトアビジン分子である。一部の実施形態では、６×Ｈｉｓタグを有するｓｏｒｔａｇ標識は、配列番号１６２に示されるアミノ酸配列を有する。さまざまな他のｓｏｒｔａｇ配列が当技術分野において公知であり、本開示のコンジュゲート化多量体の調製における使用のために好適であり、その非限定的な例を下記にさらに記載する。
一部の実施形態では、ｓｏｒｔａｇは、アミノ酸配列ＬＰＸＴＧ（配列番号１６３）（ここで、Ｘは、任意のアミノ酸である）を含み、ソルターゼは、モチーフ内のトレオニンとグリシン骨格との間を切断する。
一部の実施形態では、ソルターゼは、ＩＰＫＴＧ（配列番号１６４）、ＭＰＸＴＧ（配列番号１６５）、ＬＡＥＴＧ（配列番号１６６）、ＬＰＸＡＧ（配列番号１６７）、ＬＰＥＳＧ（配列番号１６８）、ＬＰＥＬＧ（配列番号１６９）、またはＬＰＥＶＧ（配列番号１７０）から選択されるアミノ酸配列を含むｓｏｒｔａｇを認識する。
一部の実施形態では、ソルターゼは、ＳｒｔＡｓｔａｐｈ突然変異体である。一部の実施形態では、ＳｒｔＡｓｔａｐｈ突然変異体は、Ｆ４０であり、認識モチーフは、ＸＰＫＴＧ（配列番号１７１）である（Piotukh et al., J. Am. Chem. Soc. 2011 133:17536-17539）。一部の実施形態では、ＳｒｔＡｓｔａｐｈ突然変異体は、Ｆ４０であり、認識モチーフは、ＡＰＫＴＧ（配列番号１７２）、ＤＰＫＴＧ（配列番号１７３）、またはＳＰＫＴＧ（配列番号１７４）である。
一部の実施形態では、ＳｒｔＡｓｔａｐｈ突然変異体は、ＳｒｔＡｓｔａｐｈ五重突然変異体であり、認識モチーフは、ＬＰＸＴＧ（配列番号１６３）（ここで、Ｘは、任意のアミノ酸である）、ＬＰＥＸＧ（配列番号１７５）（ここで、Ｘは、任意のアミノ酸である）、またはＬＡＥＴＧ（配列番号１６６）である。一部の実施形態では、突然変異体は、ＳｒｔＡｓｔａｐｈ五重突然変異体であり、認識モチーフは、ＬＰＥＡＧ（配列番号１７６）、ＬＰＥＣＧ（配列番号１７７）、またはＬＰＥＳＧ（配列番号１６８）である。一部の実施形態では、ＳｒｔＡｓｔａｐｈ突然変異体は、２Ａ－９であり、認識モチーフは、ＬＡＥＴＧ（配列番号１６６）である。一部の実施形態では、ＳｒｔＡｓｔａｐｈ突然変異体は、４Ｓ－９であり、認識モチーフは、ＬＰＥＸＧ（配列番号１７８）（ここで、Ｘ＝Ａ、ＣまたはＳである）である。
一部の実施形態では、ソルターゼは、野生型ソルターゼの可溶性断片である。一部の実施形態では、ソルターゼは、改変ソルターゼＡの可溶性断片である（Mao H, Hart SA, Schink A, Pollok BA, J Am Chem Soc. 2004 Mar 10; 126(9):2670-1 A）。
一部の実施形態では、ソルターゼは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓソルターゼＡのバリアントまたはホモログである（Antos JM, Truttmann MC, Ploegh HL Curr Opin Struct Biol. 2016 Jun; 38:111-8；Dorr BM, Ham HO, An C, Chaikof EL, Liu DR Proc Natl Acad Sci U S A. 2014 Sep 16; 111(37):13343-8；Glasgow JE, Salit ML, Cochran JR J Am Chem Soc. 2016 Jun 22; 138(24):7496-9）。
タンパク質へのｓｏｒｔａｇのコンジュゲーションの方法も記載されている（Matsumoto T, Furuta K, Tanaka T, Kondo A ACS Synth Biol. 2016 Nov 18; 5(11):1284-1289；Williams FP, Milbradt AG, Embrey KJ, Bobby R PLoS One. 2016; 11(4):e0154607；およびWitte MD, Cragnolini JJ, Dougan SK, Yoder NC, Popp MW, Ploegh HL Proc Natl Acad Sci U S A. 2012 Jul 24; 109(30):11993-8；Mao H, Hart SA, Schink A, Pollok BA J Am Chem Soc. 2004 Mar 10; 126(9):2670-1；Guimaraes CP, Witte MD, Theile CS, Bozkurt G, Kundrat L, Blom AE, Ploegh HL Nat Protoc. 2013 Sep; 8(9):1787-99およびTheile CS, Witte MD, Blom AE, Kundrat L, Ploegh HL, Guimaraes CP Nat Protoc. 2013 Sep; 8(9):1800-7）。
一部の実施形態では、ソルターゼ反応によって生成されるアミノグリシンペプチド断片は、透析または遠心分離によって、例えば反応が進行している間に、除去される（Freiburger L, Sonntag M, Hennig J, Li J, Zou P, Sattler M J Biomol NMR. 2015 Sep; 63(1):1-8）。一部の実施形態では、アフィニティー固定化戦略またはフロー系プラットフォームが反応構成要素の選択的除去のために使用される（Policarpo RL, Kang H, Liao X, Rabideau AE, Simon MD, Pentelute BL Angew Chem Int Ed Engl. 2014 Aug 25; 53(35):9203-8）。
一部の実施形態では、反応の平衡は、ライゲーション産物または副産物の不活性化によって制御することができる。例えば、一部の実施形態では、反応は、Yamamura Y, Hirakawa H, Yamaguchi S, Nagamune T Chem Commun (Camb). 2011 Apr 28; 47(16):4742-4に記載されるように、ドナーおよびアクセプターへの付加されたＷＴＷＴＷ（配列番号１７９）モチーフのライゲーションによって制御される。他の実施形態では、副産物は、例えばLiu F, Luo EY, Flora DB, Mezo AR J Org Chem. 2014 Jan 17; 79(2):487-92；およびWilliamson DJ, Webb ME, Turnbull WB Nat Protoc. 2014 Feb; 9(2):253-62に記載されるように、アシルドナーのグリシンの化学的改変によって不活性化される。
Ｅ．インテイン媒介コンジュゲーション
インテインは、天然に存在する自己スプライシングタンパク質のサブドメインであり、これは、成熟宿主タンパク質を形成するために、一緒に２つの元の隣接するペプチド領域（「エクステイン」）を同時に接合しながら、より大きなタンパク質構造からそれら自体のタンパク質サブドメインを切除することができる。タンパク質改変およびライゲーションのインテインに基づく方法が開発されている。インテインは、前駆体タンパク質からインテイン配列を切り取り、隣接する配列（ＮまたはＣエクステイン）をペプチド結合で接合する、タンパク質スプライシング反応を触媒することができる内在性タンパク質配列である。インテイン媒介コンジュゲーションを使用して調製されるｐＭＨＣ多量体の非限定的な例示を、実施例２に詳細に記載する。
本明細書で使用される場合、「スプリットインテイン」という用語は、Ｎ末端およびＣ末端インテインセグメントが、スプライシングまたは切断反応に対して機能的であるインテインに非共有結合的に再会合または再構築できる別々の分子になるように、Ｎ末端インテインセグメントとＣ末端インテインセグメントとの間に存在する１つまたは複数のペプチド結合を破壊する任意のインテインを指す。任意の触媒的に活性なインテインまたはその断片を使用して、本明細書に開示されるシステムおよび方法における使用のためのスプリットインテインが誘導され得る。例えば、一態様では、スプリットインテインは、真核生物インテインから誘導され得る。別の態様では、スプリットインテインは、細菌インテインから誘導され得る。別の態様では、スプリットインテインは、古細菌インテインから誘導され得る。好ましくは、そのように誘導されたスプリットインテインは、スプライシング反応を触媒するために必須のアミノ酸配列のみを持つ。
本明細書で使用される場合、「Ｎ末端インテインセグメント」は、対応するＣ末端インテインセグメントと組み合わされた場合に、スプライシングおよび／または切断反応に対して機能的であるＮ末端アミノ酸配列を含む任意のインテイン配列を指す。したがって、Ｎ末端インテインセグメントは、スプライシングが起こる場合にスプライスされる配列も含む。Ｎ末端インテインセグメントは、天然に存在する（ネイティブ）インテイン配列のＮ末端部分の改変である配列を含むことができる。例えば、Ｎ末端インテインセグメントは、そのような追加のおよび／または突然変異した残基の包含がインテインをスプライシングまたは切断に対して非機能的にしない限り、追加のアミノ酸残基および／または突然変異した残基を含むことができる。好ましくは、追加のおよび／または突然変異した残基の包含は、インテインのスプライシング活性および／または制御性を改善または増強する。非インテイン残基を、アフィニティー精製される能力または共有結合的に固定化される能力などの追加の機能性を提供するために、インテインセグメントに遺伝子学的に融合することもできる。
本明細書で使用される場合、「Ｃ末端インテインセグメント」は、対応するＮ末端インテインセグメントと組み合わされた場合に、スプライシングまたは切断反応に対して機能的であるＣ末端アミノ酸配列を含む任意のインテイン配列を指す。一態様では、Ｃ末端インテインセグメントは、スプライシングが起こる場合にスプライスされる配列を含む。別の態様において、Ｃ末端インテインセグメントは、そのＣ末端に融合されたペプチド配列から切断される。Ｃ末端インテインセグメントは、天然に存在する（ネイティブ）インテイン配列のＣ末端部分の改変である配列を含むことができる。例えば、Ｃ末端インテインセグメントは、そのような追加のおよび／または突然変異した残基の包含がＣ末端インテインセグメントをスプライシングまたは切断に対して非機能的にしない限り、追加のアミノ酸残基および／または突然変異した残基を含むことができる。
発現されたタンパク質ライゲーション（ＥＰＬ）は、Ｃ末端チオエステルを有する組換えタンパク質とＮ末端システインを有する第２の薬剤との間の天然の化学的ライゲーションを指す。Ｃ末端チオエステルは、インテイン（介在するタンパク質）によって媒介されるタンパク質スプライシングとしても公知の自動プロセシングの使用により任意の組換えタンパク質（すなわち、標的リガンド）に容易に導入され得る。インテインは、隣接するエクステイン（外部タンパク質）断片間の天然のペプチド結合の形成をもたらすプロセスを利用して、より大きな前駆体ポリペプチド鎖からそれ自体を切り取ることができるタンパク質である。自動プロセシングタンパク質が標的リガンドの下流でクローニングされると、チオール（例えば、２－メルカプトエタンスルホン酸、ＭＥＳＮＡ）を使用して、自動プロセシングタンパク質の部位特異的切断を誘導し、反応性チオエステルの形成をもたらすことができる。次いで、チオエステルは、Ｎ末端システインを有する任意の薬剤と反応する。ＥＰＬは部位特異的な様式で作動し、反応は、両方の官能基が高濃度である場合に非常に効率的であることが公知である（Elias et al. Small 6:2460-2468において概説）。
したがって、一部の実施形態では、ＭＨＣ単量体は、発現されたタンパク質ライゲーション（ＥＰＬ）によってアルキン化ペプチドにライゲーションされ、次いで銅（Ｉ）触媒末端アジド－アルキン環化付加（ＣｕＡＡＣ）によってアジド標識化多量体化ドメインにコンジュゲートされる。
一部の実施形態では、ＭＨＣ単量体は、インテインペプチドタグによって多量体化ドメインにコンジュゲートされている。一部の実施形態では、ＭＨＣポリペプチドはＣ末端チオエステルを含み、多量体化ドメインは、トランス－エステル化を行う能力を欠く改変インテインに融合されたＮ－エクステインを含み、トランス－エステル化は、外因性チオールの添加によって起こる。
多くのインテインが現在記載されており、限定されるものではないが、ＭｘｅＧｙｒＡ（Frutos et al. (2010)；Southworth et al. (1999)）；ＳｓｐＤｎａＥ（Shah et al. (2012)；Wu et al. (1998)）；ＮｐｕＤｎａＥ（Shah et al. (2012)；Vila-Perello et al. (2013)）；ＡｖａＤｎａＥ（David et al. (2015)；Shah et al. (2012)）；Ｃｆａ（コンセンサスＤｎａＥスプリットインテイン）（Stevens et al. (2016)）；ｇｐ４１－１およびｇｐ４１－８（Carvajal-Vallejos et al. (2012)）；ＮｒｄＪ－１（Carvajal-Vallejos et al. (2012)）；ＩＭＰＤＨ－１（Carvajal-Vallejos et al）、およびＡｃｅＬ－ＴｅｒＬ（Thiel et al. (2014)）が挙げられる。これらのインテインの特性および使用を表１に要約する。
一部の実施形態では、インテインは、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｘｅｎｏｐｉ由来の１９８残基のジャイレースＡインテイン（Ｍｘｅ ＧｙｒＡ）である（Southworth MW, Amaya K, Evans TC, Xu MQ, Perler FB Biotechniques. 1999 Jul; 27(1):110-4, 116, 118-20）。一部の実施形態では、インテインは、シアノバクテリアＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．株ＰＣＣ６８０３（Ｓｓｐ）由来である。
一部の実施形態では、インテインは、スプリットインテイン対である。一部の実施形態では、スプリットインテイン対は、直交型スプリットインテイン対である（Carvajal-Vallejos P, Pallisse R, Mootz HD, Schmidt SR J Biol Chem. 2012 Aug 17; 287(34):28686-96；Shah NH, Vila-Perello M, Muir TW Angew Chem Int Ed Engl. 2011 Jul 11; 50(29):6511-5）。
一部の実施形態では、スプリットインテイン対は、６または１１残基程度の短さの人工スプリットインテイン対である（Appleby JH, Zhou K, Volkmann G, Liu XQ J Biol Chem. 2009 Mar 6; 284(10):6194-9；Ludwig C, Pfeiff M, Linne U, Mootz HD Angew Chem Int Ed Engl. 2006 Aug 4; 45(31):5218-21）。
一部の実施形態では、インテインは、ＤｎａＥインテインである。一部の実施形態では、ＤｎａＥインテインは、Ｎｏｓｔｏｃ ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ（Ｎｐｕ）由来である。一部の実施形態では、インテインは、ｇｐ４１－１インテインである。一部の実施形態では、インテインは、ｇｐ４１－８インテインである。一部の実施形態では、インテインは、ＩＭＰＤＨ－１インテインである。一部の実施形態では、インテインは、ＮｒｄＪインテインである。
一部の実施形態では、スプリットインテイン対は、ＡｃｅＬ－ＴｅｒＬである（Thiel IV, Volkmann G, Pietrokovski S, Mootz HD Angew Chem Int Ed Engl. 2014 Jan 27; 53(5):1306-10）。
一部の実施形態では、インテインは、コンセンサススプリットインテイン配列（Ｃｆａ）を含む（Stevens AJ, Brown ZZ, Shah NH, Sekar G, Cowburn D, Muir TW. Design of a split intein with exceptional protein splicing activity. Journal of the American Chemical Society. 2016;138(7):2162-2165）。
インテイン媒介コンジュゲーションのためのいくつかのプロトコールが利用可能であり、例示的な方法を本明細書の実施例２に提供する。タンパク質コンジュゲーションにおける使用のための好適なインテイン配列およびプロトコールは、当技術分野、例えば、Stevens, et al. J. Am. Chem. Soc., 138, 2162-2165, 2016；Shah et al. J. Am. Chem. Soc., 134, 11338-11341, 2012；およびVila-Perello et al., J. Am. Chem. Soc., 135, 286-292, 2013；Batjargal S, Walters CR, Petersson EJ J Am Chem Soc. 2015 Feb 11; 137(5):1734-7；およびGuan D, Ramirez M, Chen Z Biotechnol Bioeng. 2013 Sep; 110(9):2471-81において記載されており、これらのそれぞれの全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、インテイン標識化ＭＨＣ分子は、例えば配列番号４に示されるアミノ酸配列を有する、Ｎ－インテインタグを有する可溶性ＨＬＡ－Ａ２（ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１）である。一部の実施形態では、インテイン標識化多量体化ドメインは、例えば配列番号５に示されるアミノ酸配列を有する、Ｃ－インテインタグおよびＦＬＡＧタグを有するストレプトアビジン分子である。一部の実施形態では、ＦＬＡＧタグを含むＮ－インテインタグは、配列番号１８０に示されるアミノ酸配列を有する。さまざまな他のＮ－インテインおよびＣ－インテイン配列が当技術分野において公知であり、本開示のコンジュゲート化多量体の調製における使用のために好適であり、その非限定的な例は、上記に引用された参考文献に記載されている。
Ｆ．追加のバイオコンジュゲーション方法
一部の実施形態では、ＭＨＣおよび多量体化ドメインのコンジュゲーションは、酵素的に媒介される。一部の実施形態では、酵素は、ＣＸＰＸＲアミノ酸配列モチーフを認識し、システイン残基をホルミルグリシンに変換し、このようにしてアルデヒド官能基を導入するホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）（Wu P, Shui W, Carlson BL, Hu N, Rabuka D, Lee J, Bertozzi CR Proc Natl Acad Sci U S A. 2009 Mar 3; 106(9):3000-5）であり、これは、オキシム化およびヒドラジノ－ピクテ－スペングラー反応などの生体直交型変換に付される（Agarwal P, Kudirka R, Albers AE, Barfield RM, de Hart GW, Drake PM, Jones LC, Rabuka D Bioconjug Chem. 2013 Jun 19; 24(6):846-51；Dirksen A, Dawson PE Bioconjug Chem. 2008 Dec; 19(12):2543-8）。
部位特異的バイオコンジュゲーション戦略は、対象とするタンパク質改変に対して多くの可能性を提供する。さまざまな酵素に基づくコンジュゲーションプロトコールの中で、ホルミルグリシン生成酵素は、別個のコンセンサスモチーフ内のシステインまたはセリン残基から出発して、組換えタンパク質にアミノ酸Ｃα－ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）を翻訳後導入することを可能にする。アルデヒド保持ＦＧｌｙ残基は、すべての他の天然アミノ酸に対して直交型反応性を提示し、したがって、タンパク質スキャフォールドにおける部位特異的標識化反応のために使用することができる（Kruger et al., Biol Chem. 2019 Feb 25;400(3):289-297. doi: 10.1515/hsz-2018-0358において概説）。
ホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）は、ペンタペプチドコンセンサス配列ＣｘＰｘＲを認識し、これは、この配列中のシステインを異常なアルデヒド保持ホルミルグリシンに特異的に酸化する。ＦＧＥ認識配列またはアルデヒドタグを、原核生物または真核生物発現系のいずれかにおいて産生される異種組換えタンパク質に挿入することができる。ホルミルグリシンへのシステインの変換は、一過性にまたは安定な細胞系としてのいずれかで、ＦＧＥの共過剰発現によって達成され、生じるアルデヒドは、α－求核試薬と選択的に反応して、部位選択的に改変されたバイオコンジュゲートが生成され得る（Rabuka et al. Nat Protoc. 2012 May 10; 7(6): 1052-1067）。
一部の実施形態では、酵素は、１３残基標的配列内のリシン側鎖を改変して（Uttamapinant C, White KA, Baruah H, Thompson S, Fernandez-Suarez M, Puthenveetil S, Ting AY Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 Jun 15; 107(24):10914-9）、アジド、アリールアルデヒドおよびヒドラジン、ｐ－ヨードフェニル誘導体、ノルボルネン、ならびにトランス－シクロオクテンを含むバイオ直交基を導入する酵素である、リポ酸リガーゼである（Debelouchina et al. Q. Rev Biophys. 2017; 50 e7. doi:10.1017/S0033583517000021において概説）。
他の実施形態では、酵素は、ビオチンリガーゼ、ファルネシルトランスフェラーゼ、トランスグルタミナーゼ、またはＮ－ミリストイルトランスフェラーゼである（Rashidian M, Dozier JK, Distefano MD Bioconjug Chem. 2013 Aug 21; 24(8):1277-94において概説）。
Ｇ．ペプチドリンカー
他の実施形態では、ｐ＊ＭＨＣ多量体は、ペプチドリンカーを含む。「ペプチドリンカー」という用語は、天然および／または合成起源の直鎖状アミノ酸鎖を表す。リンカーは、ポリペプチドが正しくフォールドされ、かつ適当に提示されることを可能にすることによって、互いにコンジュゲートされたポリペプチドが、それらの生物活性を行うことができることを確実にする機能を有する。ペプチドリンカーは、反復アミノ酸配列または天然に存在するポリペプチドの配列を含有していてもよい。一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、２～５０個のアミノ酸の長さを有する。一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、３～３０個のアミノ酸、５～２５個のアミノ酸、５～２０個のアミノ酸、または１０～２０個のアミノ酸である。
一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、グリシン、グルタミン、および／またはセリン残基がリッチである。これらの残基は、例えば最大で５個のアミノ酸の小さな反復ユニットで配列する。この小さな反復ユニットは、１～５回反復され得る。多量体ユニットのアミノおよび／またはカルボキシ末端で、最大で６個の追加の任意の天然に存在するアミノ酸が付加されてもよい。他の合成ペプチドリンカーは、単一アミノ酸で構成され、これは、１０～２０回反復され、アミノおよび／またはカルボキシ末端に、最大で６個の追加の任意の天然に存在するアミノ酸を含み得る。すべてのペプチドリンカーは、核酸分子によってコードされ得、したがって、組換え的に発現され得る。リンカーはそれ自体がペプチドであるので、リンカーによって接続されるポリペプチドは、２個のアミノ酸間で形成されるペプチド結合を介してリンカーに接続される。
好適なペプチドリンカーは、当技術分野において周知であり、例えば、ＵＳ２０１０／０２１０５１１号、ＵＳ２０１０／０１７９０９４号、およびＵＳ２０１２／００９４９０９号に開示されており、これらは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。他のリンカーは、例えば、米国特許第５，５２５，４９１号；Alfthan et al., Protein Eng., 1995, 8:725-731；Shan et al., J. Immunol., 1999, 162:6589-6595；Newton et al., Biochemistry, 1996, 35:545-553；Megeed et al.; Biomacromolecules, 2006, 7:999-1004；およびPerisic et al., Structure, 1994, 12:1217-1226に提供されており、これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、ポリペプチドリンカーは、合成である。本明細書で使用される場合、ポリペプチドリンカーに関する「合成」という用語は、アミノ酸の線状配列が、実際は天然で連結されていない配列（天然に存在していてもよく、または存在していなくてもよい）に連結されたアミノ酸配列（天然に存在していてもよく、または存在していなくてもよい）を含むペプチド（またはポリペプチド）を含む。例えば、ポリペプチドリンカーは、天然に存在するポリペプチドの改変された形態であるか（例えば、付加、置換または欠失などの突然変異を含む）、または最初のアミノ酸配列（天然に存在していてもよく、または存在していなくてもよい）を含む、天然に存在しないポリペプチドを含んでいてもよい。ポリペプチドリンカーは、例えば、結合性部分（ＴＣＲまたはＭＨＣ）、多量体化ドメイン、および各多量体融合ポリペプチドのＩｇｇフレームワークが、機能的多量体タンパク質複合体の適当なフォールディングおよび形成を確実にするように並置されることを確実にするために用いられてもよい。好ましくは、ポリペプチドリンカーは、結合タンパク質の単量体サブユニットの中で、比較的非免疫原性であり、任意の非共有結合的会合を阻害しない。
一部の実施形態では、リンカーは、Ｇｌｙ－Ｓｅｒポリペプチドリンカー、すなわち、グリシンおよびセリン残基から構成されるペプチドである。１つの例示的なＧｌｙ－Ｓｅｒポリペプチドリンカーは、アミノ酸配列（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（ここで、ｎ＝１～６である）（配列番号１８１）を含む。ある特定の実施形態では、ｎ＝１である。ある特定の実施形態では、ｎ＝２である。ある特定の実施形態では、ｎ＝３である。ある特定の実施形態では、ｎ＝４である。ある特定の実施形態では、ｎ＝５である。ある特定の実施形態では、ｎ＝６である。別の例示的なＧｌｙ－Ｓｅｒポリペプチドリンカーは、アミノ酸配列Ｓｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（ここで、ｎ＝１～１０である）（配列番号１８４）を含む。ある特定の実施形態では、ｎ＝１である。ある特定の実施形態では、ｎ＝２である。ある特定の実施形態では、ｎ＝３、すなわち、Ｓｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３である。ある特定の実施形態では、ｎ＝４、すなわち、Ｓｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４である。ある特定の実施形態では、ｎ＝５である。ある特定の実施形態では、ｎ＝６である。ある特定の実施形態では、ｎ＝７である。ある特定の実施形態では、ｎ＝８である。ある特定の実施形態では、ｎ＝９である。ある特定の実施形態では、ｎ＝１０である。
他の例示的なリンカーとしては、ＧＳリンカー（すなわち、（ＧＳ）ｎ）、ＧＧＳＧリンカー（すなわち、（ＧＧＳＧ）ｎ）（配列番号１８５）、ＧＳＡＴリンカー（配列番号１８６）、ＳＥＧリンカー、およびＧＧＳリンカー（すなわち、（ＧＧＳＧＧＳ）ｎ）（配列番号１８７）（ここで、ｎは、正の整数（例えば、１、２、３、４、または５）である）が挙げられる。多量体融合タンパク質における使用のための他の好適なリンカーは、Ｌｉｎｋｅｒ Ｄａｔａｂａｓｅ（ibi.vu.nl/programs/linkerdbwww）などの公開されているデータベースを使用して見出すことができる。Ｌｉｎｋｅｒ Ｄａｔａｂａｓｅは、新規の多量体融合タンパク質において可能性があるリンカーとしての役割を果たす多機能酵素中のドメイン間リンカーのデータベースである（例えば、George et al., Protein Engineering 2002;15:871-9を参照されたい）。
ポリペプチドリンカーは、当技術分野において公知の技法を使用して、ポリペプチド配列に導入することができる。改変は、ＤＮＡ配列決定解析によって確認することができる。プラスミドＤＮＡを使用して、産生されるポリペプチドの安定な産生のために宿主細胞を形質転換することができる。
Ｈ．追加のペプチドリンカーおよびタグ
本明細書に提供される方法および組成物における使用のために好適な追加のタグとしては、アフィニティータグが挙げられ、限定されるものではないが、タンパク質の迅速で効率的な精製を可能にする、酵素、タンパク質ドメイン、または炭水化物、小生体分子、金属キレート、抗体などのようなある範囲の基質に高い特異性で結合する小ポリペプチドを含む。溶解性タグは、タンパク質の適当なフォールディングおよび溶解性を増強し、アフィニティータグとタンデムで頻繁に使用される。
限定されるものではないが、６×Ｈｉｓ、ＦＬＡＧ、Ｓｔｒｅｐ ＩＩおよびカルモジュリン結合性ペプチド（ＣＢＰ）タグを含む小サイズのタグは、ＭＨＣポリペプチドの構造、活性および特徴に対する効果を最小限にする利点を有する（Zhao et al. J. Anal. Chem. 2013 581093）。
一部の実施形態では、タグは、ＦＬＡＧタグである。ＦＬＡＧタグは、異なる認識および結合特徴を有するＭ１、Ｍ２、およびＭ５などのいくつかの特異的抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体に結合する親水性オクタペプチドエピトープタグである（Einhauer et al. J. Biochem. Biophys. 49:455-465, 2001: Hopp et al. Mol. Immunol. 33:601-608, 1996）。ＦＬＡＧ融合タンパク質は、カルシウム依存性（例えば、Ｍ２）またはカルシウム非依存性の様式で、モノクローナル抗体によって認識され得る。特に、融合タンパク質のＮ末端に付け加えられたタグは、Ｍ１モノクローナル抗体による免疫アフィニティー精製に必要であるが、Ｍ２は位置非感受性である。
ＩＶ．ＭＨＣペプチドエピトープ
Ａ．ペプチドエピトープ選択
Ｔ細胞エピトープであり得る新しいＭＨＣ結合性ペプチドを識別するためのさまざまなプロセスが開発されており、多くの実験方法は、固定数のアミノ酸によるタンパク質配列に沿って互いから相殺される一定の長さ（ｎ－ｍｅｒ）のアミノ酸配列を合成することによって、所与のタンパク質配列由来のペプチド断片の重複ライブラリーを構築することで開始する。次いで、各配列のＴ細胞を活性化するためのＭＨＣ結合の特性および可能性を、いくつかのアッセイにおいて評価することができる。
上記で概要を述べた方法および他の方法、例えば、コンフォメーションの結晶学的解析およびＭＨＣ結合溝中の荷電の分布で識別された既存のＭＨＣ結合性ペプチドは、最も一般的なＭＨＣ対立遺伝子に対して定義される結合性モチーフをもたらし、どんな種類の推定ＭＨＣ結合性ペプチドが所与の対立遺伝子のＭＨＣ分子に実際に十分に結合することができるかについての規則を設定する。これらのモチーフは、ＳＹＦＰＥＩＴＨＩアルゴリズム（Rammensee H.-G., et al. (1995), Immunogenetics 41:178-228）などのＭＨＣ分子へのペプチド結合を予測するための予測的コンピューターアルゴリズムに翻訳されている。
所望の抗原に対するタンパク質配列は、ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ（Rammensee et al. Immungenetics 50:213-219, 1999）、ならびにＩＥＤＢ（Peters et al. PLoS Biol. 3:e91, 2005）からの人工ニューラルネットワーク（ＡＮＮ）および安定化マトリックス法（ＳＭＭ）アルゴリズムを使用することによって、可能性のあるＨＬＡ特異的抗原について解析される。ペプチドは、ＳＹＦＰＥＩＴＨＹについて＞２１、ＡＮＮについて＜６０００、またはＳＭＭについて＜６００のいずれかの予測結合値に基づいて選択される。選択されたペプチドが合成される。
結合アッセイは、以前に記載されている蛍光偏光（ＦＰ）アッセイを使用して行うことができる（例えば、Buchi et al. Biochemistry 43:14852-14863, 2004；Sette et al., Mol. Immunol. 31:813-822.）。ペプチドの結合能力を決定するために、対照に対する阻害パーセンテージを、プレースホルダペプチドを用いるＦＰ競合アッセイにおいて決定することができる。
一部の実施形態では、ｐＭＨＣ多量体に結合したペプチドは、ペプチドの偏りのないライブラリー由来である。一部の実施形態では、ペプチドは、９－ｍｅｒである。一部の実施形態では、ｐＭＨＣＩ多量体に結合したペプチドは、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、またはロイシン（Ｌ）を含み得る２および９位に重要なアミノ酸を有するＨＬＡ－Ａ２結合性モチーフを含む９－ｍｅｒである。
一部の実施形態では、ライブラリーは、目的の任意のポリヌクレオチド配列の転写および翻訳、例えば、６つのリーディングフレームすべてにおいてゲノムまたはメタゲノムのフォワードおよびリバース鎖の両方の転写および翻訳産物のインシリコ産生によって産生されるすべてのｋ－ｍｅｒペプチドを含む。
一部の実施形態では、本開示のライブラリーは、目的のエクソームのインシリコ翻訳に由来し得るすべてのｋ－ｍｅｒペプチドを含む。
一部の実施形態では、本開示のライブラリーは、目的のトランスクリプトームのインシリコ翻訳に由来し得るすべてのｋ－ｍｅｒペプチドを含む。
一部の実施形態では、本開示のライブラリーは、目的のプロテオームに由来し得るすべてのｋ－ｍｅｒペプチドを含む。
一部の実施形態では、本開示のライブラリーは、目的のＯＲＦｅｏｍｅのインシリコ翻訳に由来し得るすべてのｋ－ｍｅｒペプチドを含む。
一部の実施形態では、アルゴリズムを使用して、ペプチドライブラリー中のペプチドを選択することができる。例えば、アルゴリズムを使用して、ＭＨＣ／ＨＬＡ結合性ポケット中でフォールドまたはドッキングする可能性が最も高いペプチドを予測することができ、ある特定の閾値を上回るペプチドを、ライブラリーへの包含のために選択することができる。
一部の実施形態では、本開示のライブラリーは、一群のゲノム、プロテオーム、トランスクリプトーム、ＯＲＦｅｏｍｅ、またはそれらの任意の組合せのインシリコ転写および翻訳または翻訳に由来し得るすべてのペプチドを含む。
一部の実施形態では、ペプチドは、一群の試料、例えば、患者集団からの臨床試料、または病原体ゲノムの群からのポリヌクレオチド配列のインシリコ転写および翻訳または翻訳に由来する。
一部の実施形態では、ペプチドは、異なるゲノム、プロテオーム、トランスクリプトーム、ＯＲＦｅｏｍｅ、またはそれらの任意の組合せに由来し、ここで、２つまたはそれよりも多くのゲノム、プロテオーム、トランスクリプトーム、ＯＲＦｅｏｍｅ、またはそれらの組合せは、差分配列である（例えば、それらの間で異なる）配列を識別するために比較される。一部の実施形態では、ペプチド配列は、目的の組織を比較することによって識別される。一部の実施形態では、ペプチド配列は、目的の細胞を比較することによって識別される。一部の実施形態では、ペプチド配列は、健康な細胞または組織に対して罹患した細胞または組織を比較することによって識別される。一部の実施形態では、罹患した細胞または組織は、がん細胞または組織である。一部の実施形態では、罹患した細胞は、自己免疫障害を有する個体に由来する。
一部の実施形態では、ペプチドは、ゲノム、プロテオーム、トランスクリプトーム、ＯＲＦｅｏｍｅ、またはそれらの任意の組合せの相同配列に由来し、ここで、２つまたはそれよりも多くのゲノム、プロテオーム、トランスクリプトーム、ＯＲＦｅｏｍｅ、またはそれらの組合せは、相同配列である配列を識別するために比較される。
一部の実施形態では、ペプチドは、目的の配列、例えば、抗原またはエピトープをコードするポリヌクレオチド配列中の単一のヌクレオチド突然変異から生成され得るすべての９－ｍｅｒペプチド中の突然変異に由来する。
一部の実施形態では、重複ペプチドライブラリーのペプチドは、鋳型配列（例えば、インシリコ翻訳されたゲノム）からの重複ペプチドを含み、ここで、設定された長さの重複ペプチドは、定義された数の残基によって相殺される。
一部の実施形態では、ペプチドの選択は、ある特定のＨＬＡ型に対する予測結合親和性に基づいてペプチドに優先順位をつけることを含む。
一部の実施形態では、本開示のライブラリーのためのペプチドの選択は、集団、例えばヒト集団における有病率に基づいてＨＬＡ型または対立遺伝子に優先順位をつける。
一部の実施形態では、ライブラリーは、目的の任意のポリヌクレオチド配列の転写および翻訳、例えば、６つのリーディングフレームすべてにおいてゲノムまたはメタゲノムのフォワードおよびリバース鎖の両方の転写および翻訳産物のインシリコ産生によって産生されるすべてのｋ－ｍｅｒペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のライブラリーは、哺乳動物ゲノム、例えば、マウスゲノム、ヒトゲノム、患者ゲノム、自己免疫患者ゲノム、またはがんゲノムのインシリコ転写および翻訳に由来し得るすべてのｋ－ｍｅｒペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のライブラリーは、微生物ゲノム、例えば、細菌ゲノム、ウイルスゲノム、原生動物ゲノム、原生生物ゲノム、酵母ゲノム、古細菌ゲノム、またはバクテリオファージゲノムのインシリコ転写および翻訳に由来し得るすべてのｋ－ｍｅｒペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のライブラリーは、病原体ゲノム、例えば、細菌性病原体ゲノム、ウイルス病原体ゲノム、真菌病原体ゲノム、日和見病原体ゲノム、条件付き病原体ゲノム、または真核性寄生生物ゲノムのインシリコ転写および翻訳に由来し得るすべてのｋ－ｍｅｒペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のライブラリーは、植物ゲノムまたは真菌ゲノムに由来し得る。一部の実施形態では、本開示のライブラリーは、ゲノムのインシリコ転写および翻訳に由来するｋ－ｍｅｒペプチドを含み、ここで、ゲノムは、インシリコ転写および翻訳の間に改変され、例えば、インシリコで突然変異されて、突然変異（例えば、置換、挿入、欠失）を含むｋ－ｍｅｒペプチドを産生する。
一部の実施形態では、本開示のライブラリーは、目的のエクソーム、例えば、哺乳動物エクソーム、ヒトエクソーム、マウスエクソーム、患者エクソーム、自己免疫患者エクソーム、がんエクソーム、ウイルスエクソーム、原生動物エクソーム、原生生物エクソーム、酵母エクソーム、病原体エクソーム、真核性寄生生物エクソーム、植物エクソーム、または真菌エクソームのインシリコ翻訳に由来し得るすべてのｋ－ｍｅｒペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のライブラリーは、エクソームのインシリコ翻訳に由来し得るｋ－ｍｅｒペプチドを含み、ここで、エクソームは、インシリコ翻訳の間に改変され、例えば、インシリコで突然変異されて、突然変異（例えば、置換、挿入、欠失）を含むｋ－ｍｅｒペプチドを産生する。
一部の実施形態では、本開示のライブラリーは、目的のトランスクリプトーム、例えば、哺乳動物トランスクリプトーム、ヒトトランスクリプトーム、マウストランスクリプトーム、患者トランスクリプトーム、自己免疫患者トランスクリプトーム、がんトランスクリプトーム、微生物トランスクリプトーム、細菌トランスクリプトーム、ウイルストランスクリプトーム、原生動物トランスクリプトーム、原生生物トランスクリプトーム、酵母トランスクリプトーム、古細菌トランスクリプトーム、バクテリオファージトランスクリプトーム、病原体トランスクリプトーム、真核性寄生生物トランスクリプトーム、植物トランスクリプトーム、真菌トランスクリプトーム、ＲＮＡ配列決定に由来するトランスクリプトーム、マイクロバイオームトランスクリプトーム、またはメタゲノムＲＮＡ配列決定に由来するトランスクリプトームのインシリコ翻訳に由来し得るすべてのｋ－ｍｅｒペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のライブラリーは、トランスクリプトームのインシリコ翻訳に由来するｋ－ｍｅｒペプチドを含み、ここで、トランスクリプトームは、インシリコ翻訳の間に改変され、例えば、インシリコで突然変異されて、突然変異（例えば、置換、挿入、欠失）を含むｋ－ｍｅｒペプチドを産生する。
一部の実施形態では、本開示のライブラリーは、目的のプロテオーム、例えば、哺乳動物プロテオーム、ヒトプロテオーム、マウスプロテオーム、患者プロテオーム、自己免疫患者プロテオーム、がんプロテオーム、微生物プロテオーム、細菌プロテオーム、ウイルスプロテオーム、原生動物プロテオーム、原生生物プロテオーム、酵母プロテオーム、古細菌プロテオーム、バクテリオファージプロテオーム、病原体プロテオーム、真核性寄生生物プロテオーム、植物プロテオーム、または真菌プロテオームに由来し得るすべてのｋ－ｍｅｒペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のライブラリーは、プロテオームに由来するｋ－ｍｅｒペプチドを含み、ここで、ｋ－ｍｅｒペプチドは、プロテオーム配列から改変されている、例えば、突然変異（例えば、置換、挿入、欠失）を含むｋ－ｍｅｒペプチドである。
一部の実施形態では、本開示のライブラリーは、目的のＯＲＦｅｏｍｅ、例えば、哺乳動物ＯＲＦｅｏｍｅ、ヒトＯＲＦｅｏｍｅ、マウスＯＲＦｅｏｍｅ、患者ＯＲＦｅｏｍｅ、自己免疫患者ＯＲＦｅｏｍｅ、がんＯＲＦｅｏｍｅ、微生物ＯＲＦｅｏｍｅ、細菌ＯＲＦｅｏｍｅ、ウイルスＯＲＦｅｏｍｅ、原生動物ＯＲＦｅｏｍｅ、原生生物ＯＲＦｅｏｍｅ、酵母ＯＲＦｅｏｍｅ、古細菌ＯＲＦｅｏｍｅ、バクテリオファージＯＲＦｅｏｍｅ、病原体ＯＲＦｅｏｍｅ、真核性寄生生物ＯＲＦｅｏｍｅ、植物ＯＲＦｅｏｍｅまたは真菌ＯＲＦｅｏｍｅ、次世代配列決定に由来するＯＲＦｅｏｍｅ、マイクロバイオームＯＲＦｅｏｍｅ、またはメタゲノム配列決定に由来するＯＲＦｅｏｍｅのインシリコ翻訳に由来し得るすべてのｋ－ｍｅｒペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のライブラリーは、ＯＲＦｅｏｍｅのインシリコ翻訳に由来するｋ－ｍｅｒペプチドを含み、ここで、ＯＲＦｅｏｍｅは、インシリコ翻訳の間に改変され、例えば、インシリコで突然変異されて、突然変異（例えば、置換、挿入、欠失）を含むｋ－ｍｅｒペプチドを産生する。
一部の実施形態では、本開示のライブラリーは、一群のゲノム、プロテオーム、トランスクリプトーム、ＯＲＦｅｏｍｅ、またはそれらの任意の組合せのインシリコ転写および翻訳または翻訳に由来し得るすべてのｋ－ｍｅｒペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のライブラリーは、一群の試料、例えば、患者集団からの臨床試料、または病原体ゲノムの群からのポリヌクレオチド配列のインシリコ転写および翻訳または翻訳に由来し得るすべてのｋ－ｍｅｒペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のライブラリーは、一群のウイルスゲノム、例えば、ヒトビロームのインシリコ転写および翻訳に由来し得るすべてのｋ－ｍｅｒペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のライブラリーは、一群のゲノム、プロテオーム、トランスクリプトーム、ＯＲＦｅｏｍｅ、またはそれらの任意の組合せのインシリコ転写および翻訳に由来し得るすべてのｋ－ｍｅｒペプチドを含み、ここで、起源配列は、インシリコ翻訳の間に改変され、例えば、インシリコで突然変異されて、突然変異（例えば、置換、挿入、欠失）を含むｋ－ｍｅｒペプチドを産生する。
一部の実施形態では、本開示のライブラリーは、異なるゲノム、プロテオーム、トランスクリプトーム、ＯＲＦｅｏｍｅ、またはそれらの任意の組合せに由来し得るすべてのｋ－ｍｅｒペプチドを含み、ここで、２つまたはそれよりも多くのゲノム、プロテオーム、トランスクリプトーム、ＯＲＦｅｏｍｅ、またはそれらの組合せは、差分配列である（例えば、それらの間で異なる）、例えば、ヌクレオチド配列、アミノ酸配列、ヌクレオチドの存在量、またはタンパク質の存在量において異なる配列を識別するために比較される。一部の実施形態では、ゲノム、プロテオーム、トランスクリプトーム、またはＯＲＦｅｏｍｅの差分配列は、目的の組織を比較することによって生成される。一部の実施形態では、ゲノム、プロテオーム、トランスクリプトーム、またはＯＲＦｅｏｍｅの差分配列は、目的の細胞（例えば、健康な細胞対がん細胞）由来の配列を比較することによって生成される。一部の実施形態では、ゲノム、プロテオーム、トランスクリプトーム、またはＯＲＦｅｏｍｅの差分配列は、目的の生物体の配列を比較することによって生成される。一部の実施形態では、ゲノム、プロテオーム、トランスクリプトーム、またはＯＲＦｅｏｍｅの差分配列は、目的の対象（例えば、罹患した対象対健康な対象）を比較することによって生成され得る。
一部の実施形態では、本開示のライブラリーは、ゲノム、プロテオーム、トランスクリプトーム、ＯＲＦｅｏｍｅ、またはそれらの任意の組合せの相同配列に由来し得るすべてのｋ－ｍｅｒペプチドを含み、ここで、２つまたはそれよりも多くのゲノム、プロテオーム、トランスクリプトーム、ＯＲＦｅｏｍｅ、またはそれらの組合せは、相同配列（例えば、ある程度の相同性を共有する）である配列、例えば、相同ヌクレオチド配列、相同アミノ酸配列、相同ヌクレオチドの存在量、または相同タンパク質の存在量を識別するために比較される。一部の実施形態では、ゲノム、プロテオーム、トランスクリプトーム、またはＯＲＦｅｏｍｅの相同配列は、目的の組織を比較することによって生成される。一部の実施形態では、ゲノム、プロテオーム、トランスクリプトーム、またはＯＲＦｅｏｍｅの相同配列は、目的の細胞（例えば、健康な細胞対自己免疫細胞に関与する細胞（例えば、自己免疫を誘発する細胞または自己免疫の間に標的となる細胞）由来の配列を比較することによって生成される。一部の実施形態では、ゲノム、プロテオーム、トランスクリプトーム、またはＯＲＦｅｏｍｅの相同配列は、目的の生物体の配列を比較することによって生成される。一部の実施形態では、ゲノム、プロテオーム、トランスクリプトーム、またはＯＲＦｅｏｍｅの相同配列は、目的の対象（例えば、罹患した対象対健康な対象）を比較することによって生成される。
一部の実施形態では、本開示のライブラリーは、目的のポリペプチド配列に由来し得るすべてのｋ－ｍｅｒペプチド、例えば、ウイルスタンパク質の完全なタンパク質配列を網羅するすべての可能な９－ｍｅｒペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のライブラリーは、目的のポリペプチド配列から生成され得るｋ－ｍｅｒペプチドを含み、ここで、目的のポリペプチド配列は、改変され、例えば、インシリコで突然変異されて、突然変異（例えば、置換、挿入、欠失）を含むｋ－ｍｅｒペプチドを産生する。
一部の実施形態では、本開示のライブラリーは、目的の配列中の突然変異に由来し得るすべてのｋ－ｍｅｒペプチド、例えば、抗原またはエピトープをコードするポリヌクレオチド配列中の単一のヌクレオチド突然変異から生成され得るすべての９－ｍｅｒペプチドを含む。例えば、本開示のライブラリーは、抗原またはエピトープをコードするポリヌクレオチド配列中の２、３、４、５、６、７、８、または９個のヌクレオチドの突然変異から生成され得るすべての９－ｍｅｒペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のライブラリーは、アラニン置換、例えば、本明細書に記載される配列のいずれかにおける任意の位置でのアラニン置換（例えば、タンパク質、一群のタンパク質、プロテオーム、インシリコ転写および翻訳されたゲノム）に由来し得るすべてのｋ－ｍｅｒペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のライブラリーは、位置走査ライブラリーを含み、ここで、選択されたアミノ酸残基は、他のすべての天然アミノ酸で順次置換される。一部の実施形態では、本開示のライブラリーは、コンビナトリアル位置走査ライブラリーを含み、ここで、選択されたアミノ酸残基は、一度に２つまたはそれよりも多くの位置で、他のすべての天然アミノ酸で順次置換される。一部の実施形態では、本開示のライブラリーは、鋳型配列（例えば、インシリコ翻訳されたゲノム）からの重複ペプチドを含む重複ペプチドライブラリーを含み、ここで、設定された長さの重複ペプチドは、定義された数の残基によって相殺される。一部の実施形態では、本開示のライブラリーは、Ｔ細胞の短縮されたペプチドライブラリーを含み、ここで、ライブラリーの各複製は、１つの末端に短縮を有するペプチド（例えば、名目上の１１－ｍｅｒのＣ末端短縮から誘導され得る８－ｍｅｒ、９－ｍｅｒ、１０－ｍｅｒ、および１１－ｍｅｒ）の等モル混合物を含む。一部の実施形態では、本開示のライブラリーは、カスタマイズされたペプチドのセットを含み、ここで、カスタマイズされたペプチドのセットは、リストに記載される。
一部の実施形態では、本開示のゲノム、エクソーム、トランスクリプトーム、プロテオーム、またはＯＲＦｅｏｍｅは、ウイルスのゲノム、エクソーム、トランスクリプトーム、プロテオーム、またはＯＲＦｅｏｍｅである。ウイルスの非限定的な例としては、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、アイチウイルス、オーストラリアコウモリリッサウイルス、ＢＫポリオーマウイルス、バナナウイルス、バーマフォレストウイルス、ブニヤムウェラウイルス、ラクロスブニヤウイルス、カンジキウサギブニヤウイルス、オナガザルヘルペスウイルス、チャンディプラウイルス、チクングニアウイルス、コサウイルスＡ、牛痘ウイルス、コクサッキーウイルス、クリミア－コンゴ出血熱ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、デングウイルス、ドーリウイルス、ジュグベウイルス、ドウベンハーゲウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、エボラウイルス、エコーウイルス、脳心筋炎ウイルス、エプスタイン－バーウイルス（ＥＢＶ）、ヨーロッパコウモリリッサウイルス、ＧＢウイルスＣ／Ｇ型肝炎ウイルス、ハンタンウイルス、ヘンドラウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、デルタ肝炎ウイルス、馬痘ウイルス、ヒトアデノウイルス、ヒトアストロウイルス、ヒトコロナウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、ヒト内在性レトロウイルス（ＨＥＲＶ）、ヒトエンテロウイルス、ヒトヘルペスウイルス（例えば、ＨＨＶ－１、ＨＨＶ－２、ＨＨＶ－６Ａ、ＨＨＶ－６Ｂ、ＨＨＶ－７、ＨＨＶ－８）、ヒト免疫不全ウイルス（例えば、ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２）、ヒトパピローマウイルス（例えば、ＨＰＶ－１、ＨＰＶ－２、ＨＰＶ－１６、ＨＰＶ－１８）、ヒトパラインフルエンザ、ヒトパルボウイルスＢ１９、ヒト呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）、ヒトライノウイルス、ヒトＳＡＲＳコロナウイルス、ヒトスプマレトロウイルス、ヒトＴリンパ球向性ウイルス（ＨＴＬＶ、例えば、ＨＴＬＶ－１、ＨＴＬＶ－２、ＨＴＬＶ－３）、ヒトトロウイルス、インフルエンザＡ型ウイルス、インフルエンザＢ型ウイルス、インフルエンザＣ型ウイルス、イスファハンウイルス、ＪＣポリオーマウイルス、日本脳炎ウイルス、フニンアレナウイルス、ＫＩポリオーマウイルス、クンジンウイルス、ラゴスコウモリウイルス、ビクトリア湖マールブルグウイルス、ランガットウイルス、ラッサウイルス、ローズデールウイルス、跳躍病ウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、マチュポウイルス、マヤロウイルス、ＭＥＲＳコロナウイルス、麻疹ウイルス、メンゴ脳心筋炎ウイルス、メルケル細胞ポリオーマウイルス、モコラウイルス、伝染性軟属腫ウイルス、サル痘ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、マリーバレー脳炎ウイルス、ニューヨークウイルス、ニパウイルス、ノロウイルス、ノーウォークウイルス、オニョンニョンウイルス、オーフウイルス、オロプーシェウイルス、ピチンデウイルス、ポリオウイルス、プンタトロフレボウイルス、プーマラウイルス、狂犬病ウイルス、リフトバレー熱ウイルス、ロサウイルスＡ、ロスリバーウイルス、ロタウイルス（例えば、ロタウイルスＡ、ロタウイルスＢ、ロタウイルスＣ、ロタウイルスＸ）、風疹ウイルス、サギヤマウイルス、サリウイルスＡ、シチリア型サシチョウバエ熱ウイルス、サッポロウイルス、セムリキ森林熱ウイルス、ソウルウイルス、サル泡沫状ウイルス、シミアンウイルス５、シンドビスウイルス、サウサンプトンウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、ダニ媒介ポワッサンウイルス、トルクテノウイルス、トスカーナウイルス、ウークニエミウイルス、ワクシニアウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、痘瘡ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、ＷＵポリオーマウイルス、西ナイルウイルス、ヤバサル腫瘍ウイルス、ヤバ様疾患ウイルス、黄熱病ウイルス、およびジカウイルスが挙げられる。
一部の実施形態では、本開示のゲノム、エクソーム、トランスクリプトーム、プロテオーム、またはＯＲＦｅｏｍｅは、がんのゲノム、エクソーム、トランスクリプトーム、プロテオーム、またはＯＲＦｅｏｍｅである。一部の実施形態では、本開示のライブラリーは、公知のがんネオエピトープを含む。一部の実施形態では、本開示のライブラリーは、公知のがん抗原タンパク質に由来し得るすべてのｋ－ｍｅｒペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のライブラリーは、上皮間葉移行に関与する遺伝子に由来し得るすべてのｋ－ｍｅｒペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のライブラリーは、がんに関係する遺伝子に由来し得るすべてのｋ－ｍｅｒペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のライブラリーは、突然変異性がんドライバー遺伝子に由来し得るすべてのｋ－ｍｅｒペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のライブラリーは、がん原遺伝子、がん遺伝子、または腫瘍抑制遺伝子に由来し得るすべてのｋ－ｍｅｒペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のライブラリーは、がん原遺伝子、がん遺伝子、または腫瘍抑制遺伝子に由来し得るすべてのｋ－ｍｅｒペプチドを含み、ここで、ｋ－ｍｅｒは、本明細書に記載される突然変異（例えば、アミノ酸置換、アラニン置換、位置走査、コンビナトリアル位置走査など）を含む。
がんの非限定的な例としては、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、副腎皮質癌、ＡＩＤＳ関連がん、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、肛門がん、虫垂がん、星状細胞腫、非定型奇形／ラブドイド腫瘍、基底細胞癌、胆管がん、膀胱がん、骨がん、脳腫瘍、乳がん、気管支腫瘍、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、原発不明の癌腫、心臓腫瘍、中枢神経系がん、子宮頸がん、胆管細胞癌、脊索腫、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄増殖性新生物、結腸直腸がん、頭蓋咽頭腫、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫、非浸潤性乳管癌、胚芽腫、子宮内膜がん、上皮がん、上衣腫、食道がん、感覚神経芽腫、ユーイング肉腫、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、眼がん、卵管がん、骨の線維性組織球腫、胆嚢がん、胃がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛性疾患、ヘアリー細胞白血病、頭頸部がん、肝細胞がん、組織球増殖症、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、眼球内黒色腫、膵島腫瘍、カポジ肉腫、腎臓（腎細胞）がん、ランゲルハンス細胞組織球増殖症、喉頭がん、白血病、口唇がんおよび口腔がん、肝臓がん、肺がん（非小細胞および小細胞）、リンパ腫、男性の乳がん、骨の悪性線維性組織球腫および骨肉腫、黒色腫、メルケル細胞癌、中皮腫、転移性がん、原発不明の転移性頸部扁平上皮がん、正中線癌、口腔がん、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄異形成性／骨髄増殖性新生物、鼻腔がん、上咽頭がん、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺がん、口腔がん、口唇がんおよび口腔がん、中咽頭がん、骨肉腫、卵巣がん、膵臓がん、膵神経内分泌腫瘍、乳頭腫、傍神経節腫、副鼻腔がん、副甲状腺がん、陰茎がん、咽頭がん、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、形質細胞新生物、胸膜肺芽腫、原発性中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫、原発性腹膜がん、前立腺がん、直腸がん、再発がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、肉腫、セザリー症候群、皮膚がん、小細胞肺がん、小腸がん、軟部肉腫、皮膚の扁平上皮癌、原発不明の頸部扁平上皮がん、胃がん、Ｔ細胞リンパ腫、精巣がん、喉がん、胸腺腫および胸腺癌、甲状腺がん、移行細胞がん、尿管および腎盂がん、尿道がん、子宮がん、子宮肉腫、膣がん、血管腫瘍、外陰がん、ならびにウィルムス腫瘍が挙げられる。
一部の実施形態では、本開示のゲノム、エクソーム、トランスクリプトーム、プロテオーム、またはＯＲＦｅｏｍｅは、炎症または自己免疫原性のゲノム、エクソーム、トランスクリプトーム、プロテオーム、またはＯＲＦｅｏｍｅである。一部の実施形態では、本開示のライブラリーは、公知の炎症または自己免疫原性のネオエピトープまたは自己エピトープを含む。一部の実施形態では、本開示のライブラリーは、公知の炎症または自己免疫原性の抗原タンパク質に由来し得るすべてのｋ－ｍｅｒペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のライブラリーは、炎症または自己免疫に関係する遺伝子に由来し得るすべてのｋ－ｍｅｒペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のライブラリーは、炎症または自己免疫に関連するドライバー遺伝子の突然変異に由来し得るすべてのｋ－ｍｅｒペプチドを含む。
炎症性疾患もしくは状態または自己免疫性疾患または状態の非限定的な例としては、急性散在性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）；急性壊死性出血性白質脳炎；アジソン病；アジュバント誘発関節炎；無ガンマグロブリン血症；円形脱毛症；アミロイド症；強直性脊椎炎；抗ＧＢＭ／抗ＴＢＭ腎炎；抗リン脂質症候群（ＡＰＳ）；自己免疫性血管性浮腫；自己免疫性再生不良性貧血；自己免疫性自律神経障害；自己免疫性胃萎縮症；自己免疫性溶血性貧血；自己免疫性肝炎；自己免疫性高脂血症；自己免疫性免疫不全；自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）；自己免疫性心筋炎；自己免疫性卵巣炎；自己免疫性膵炎；自己免疫性網膜症；自己免疫性血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）；自己免疫性甲状腺疾患；自己免疫性蕁麻疹；軸索型および神経型ニューロパチー；バロ病；ベーチェット病；水疱性類天疱瘡；心筋症；キャッスルマン病；セリアック病；シャーガス病；慢性炎症性脱髄性多発神経炎（ＣＩＤＰ）；慢性再発性多発性骨髄炎（Chronic recurrent multifocal ostomyelitis）（ＣＲＭＯ）；チャーグ－ストラウス症候群；瘢痕性類天疱瘡／良性粘膜類天疱瘡；クローン病；コーガン症候群；コラーゲン誘発関節炎；寒冷凝集素症；先天性心臓ブロック；コクサッキー心筋炎；ＣＲＥＳＴ病；本態性混合型クリオグロブリン血症；脱髄性ニューロパチー；疱疹状皮膚炎；皮膚筋炎；デビック病（視神経脊髄炎）；円板状ループス；ドレスラー症候群；子宮内膜症；好酸球性食道炎；好酸球性筋膜炎；結節性紅斑実験的アレルギー性脳脊髄炎；実験的自己免疫性脳脊髄炎；エヴァンス症候群；線維筋痛症；線維化性肺胞炎；巨細胞性動脈炎（側頭動脈炎）；巨細胞心筋炎；糸球体腎炎；グッドパスチャー症候群；多発血管炎性肉芽腫症（ＧＰＡ）（以前はウェゲナー肉芽腫症と呼ばれていた）；グレーブス病；ギラン－バレー症候群；橋本脳炎；橋本甲状腺炎；甲状腺炎；溶血性貧血；ヘノッホ－シェーンライン紫斑病；妊娠性疱疹；低ガンマグロブリン血症；特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）；ＩｇＡ腎症；ＩｇＧ４関連硬化性疾患；免疫調節性リポタンパク質；封入体筋炎；間質性膀胱炎；炎症性腸疾患；若年性関節炎；若年性少関節炎；若年性糖尿病（１型糖尿病）；若年性筋炎；川崎症候群；ランバート－イートン症候群；白血球破壊性血管炎；扁平苔癬；硬化性苔癬；木質性結膜炎；線状ＩｇＡ病（ＬＡＤ）；ループス（ＳＬＥ）；慢性ライム病；メニエール病；顕微鏡的多発血管炎；混合結合組織病（ＭＣＴＤ）；モーレン潰瘍；ムッハ－ハーベルマン病；多発性硬化症；重症筋無力症；筋炎；ナルコレプシー；視神経脊髄炎（デビック）；好中球減少症；非肥満糖尿病；眼部瘢痕性類天疱瘡；視神経炎；回帰性リウマチ；ＰＡＮＤＡＳ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓに関連する小児自己免疫性神経精神障害）；傍腫瘍性小脳変性症；発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）；パリーロンベルグ症候群；パーソネージ－ターナー症候群；毛様体扁平部炎（周辺部ぶどう膜炎）；天疱瘡；尋常性天疱瘡；末梢神経障害；静脈周囲性脳脊髄炎；悪性貧血；ＰＯＥＭＳ症候群；結節性多発動脈炎；Ｉ型、ＩＩ型、およびＩＩＩ型の多腺性自己免疫症候群；リウマチ性多発性筋痛；多発性筋炎；心筋梗塞後症候群；心膜切開後症候群；プロゲステロン皮膚炎；原発性胆汁性肝硬変；原発性硬化性胆管炎；乾癬；尋常性乾癬；乾癬性関節炎；特発性肺線維症；壊疽性膿皮症； 赤芽球癆；レイノー現象；反応性関節炎；反射性交感神経性ジストロフィー；ライター症候群；再発性多発性軟骨炎；下肢静止不能症候群；後腹膜線維症；リウマチ熱；関節リウマチ；サルコイドーシス；シュミット症候群；強膜炎；強皮症；硬化性胆管炎；硬化性唾液腺炎；シェーグレン症候群；精液精巣自己免疫；全身硬直症候群；亜急性細菌性心内膜炎（ＳＢＥ）；スザック症候群；交感性眼炎；全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）；全身性硬化症；高安動脈炎；側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎；血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）；トロサ－ハント症候群；横断性脊髄炎；１型糖尿病；潰瘍性大腸炎；未分化結合組織疾患（ＵＣＴＤ）；ぶどう膜炎；血管炎；小水疱水疱性皮膚病；白斑；ウェゲナー肉芽腫症（現在は多発血管炎性肉芽腫症（ＧＰＡ）と称される）が挙げられる。炎症性疾患もしくは状態または自己免疫性疾患または状態の非限定的な例としては、慢性感染症、潜伏感染症、遅発性感染症、持続性ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、マイコプラズマ感染症、または寄生生物感染症などの感染症が挙げられる。
記載されるように、例えば、米国仮出願第６２／７９１，６０１号は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
Ｂ．ペプチド産生
ｐＭＨＣ多量体における使用のために好適なペプチドは、当技術分野において公知の方法に従って生成されるか、または商業的供給業者によって、もしくは製造業者の使用説明書に従ってペプチド合成機を使用することによって合成的に産生される。例えば、一部の実施形態では、ｐＭＨＣ多量体における使用のために好適なペプチドは、インシリコ産生方法によって作製することができる。
他の実施形態では、ペプチドは、化学的方法、例えば、ティーバッグ合成、デジタルフォトリソグラフィー、ピン合成、およびＳＰＯＴ合成を介して合成することができる。例えば、ペプチドのアレイを、ＳＰＯＴ合成を介して作製することができ、ここで、アミノ酸鎖は、アミノ酸の付加および側鎖保護基の切断の反復サイクルによってセルロース膜上で構築される。
他の実施形態では、ペプチドは、例えば、発現構築物を細菌細胞、昆虫細胞または哺乳動物細胞に導入し、細胞抽出物から組換えタンパク質を精製する、組換えＤＮＡ技術を使用して発現させることができる。
一部の実施形態では、ペプチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写および翻訳によって合成することができ、ここで、合成は、例えば、核酸鋳型、関連するビルディングブロック（例えば、ＲＮＡ、アミノ酸）、酵素（例えば、ＲＮＡポリメラーゼ、リボソーム）、および条件を提供することによって、無細胞の状況で転写および翻訳の生物学的原理を利用する。
一部の実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写および翻訳は、無細胞タンパク質合成（ＣＦＰＳ）を含み得る。ＣＦＰＳによって高収率を得るには、細菌系の使用を必要とし、ここで、翻訳された配列の最初のアミノ酸は、Ｎ－ホルミルメチオニン（ｆＭｅｔ）である。この残基は、正に荷電したアミノ末端（ＮＨ３ ＋）の代わりに中性のホルミル基（ＨＣＯ）を含有することによって、メチオニンとは異なる。構築物を、酵素切断ドメインをコードする遺伝子、およびその全体が参照により本明細書に組み込まれる米国仮出願第６２／７９１，６０１号に記載されるライブラリーポリペプチドを含むように操作される。
少なくとも最初のメチオニンアミノ酸の除去は、ペプチドフォールディングおよびＭＨＣタンパク質上のローディングを成功させる。加えて、最初のメチオニンアミノ酸の除去は、より高いペプチドライブラリーの多様性の上限、例えば、２０ｘ（ここで、ｘは、ペプチドの長さである）を提供するが、この残基の包含は、ライブラリーの多様性を２０（ｘ－１）に制限する。
一部の実施形態では、ペプチドは、例えばＤＮＡ構築物のＲＮＡへの転写、次いでタンパク質へのＲＮＡの翻訳の両方を行うことができるｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳（ＩＶＴＴ）系を利用して合成される。例えば、本開示の方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳（ＩＶＴＴ）を行って、高多様性ペプチドライブラリーを産生し、タンパク質の正しいフォールディングを可能にするための方法を含む。ＩＶＴＴは、ＤＮＡまたはＲＮＡ鋳型から、直接、無細胞環境でのタンパク質産生を可能にし得る。
本明細書で使用されるＩＶＴＴ法は、例えば、ＰＣＲ産物、線状ＤＮＡプラスミド、環状ＤＮＡプラスミド、またはリボソーム結合部位（ＲＢＳ）配列を有するｍＲＮＡ鋳型を使用して行うことができる。適切な鋳型を単離した後、例えば、リボヌクレオチド三リン酸およびＲＮＡポリメラーゼを含む転写構成要素を、鋳型に添加することができる。転写が完了した後、例えば、ウサギ網状赤血球溶血液または小麦胚芽抽出物中に見出すことができる翻訳構成要素を添加することができる。一部の方法では、転写および翻訳を、単一ステップの間で行うことができ、ここで、例えばウサギ網状赤血球溶血液または小麦胚芽抽出物中に見出される精製された翻訳構成要素は、転写構成要素を核酸鋳型に添加するのと同時に添加される。
一部の実施形態では、ペプチドのＮ末端のメチオニン残基および切断可能部分をコードするヌクレオチド配列は、ＤＮＡ構築物またはＲＮＡ構築物にコードすることができる。切断可能部分は、ペプチドの少なくとも１個のＮ末端アミノ酸残基が切断可能部分の前またはその中にあるように位置する。一部の実施形態では、方法は、ペプチドの１個のＮ末端アミノ酸残基が切断可能部分の前またはその中にあるように位置する切断可能部分をコードすることを含む。一部の実施形態では、１個のＮ末端アミノ酸残基は、メチオニン残基である。切断可能部分は、酵素、例えば切断可能部分に特異的なプロテアーゼを使用して切断することができ、これは、ペプチドの残りから切断可能部分を切断することもできる。
本明細書に記載されるＤＮＡまたはＲＮＡ構築物にコードされ得る切断可能部分の例としては、酵素によって切断される任意の切断可能部分が挙げられる。一部の実施形態では、切断可能部分は、プロテアーゼによって切断され得る。切断部分は、切断部分に特異的な酵素を使用して、ペプチドを切断することができる。酵素は、例えば、第Ｘａ因子、ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ、ＡｃＴＥＶ（商標）プロテアーゼ、ＷＥＬＱｕｔプロテアーゼ、Ｇｅｎｅｎａｓｅ（商標）、小ユビキチン様修飾因子（ＳＵＭＯ）タンパク質、Ｕｌｐ１プロテアーゼ、またはエンテロキナーゼであり得る。Ｕｌｐ１プロテアーゼは、アミノ酸配列よりもむしろ三次構造を認識することによって、特異的な様式で切断部分を切断し得る。エンテロキナーゼ（エンテロペプチダーゼ）も、候補ペプチドから切断部分を切断するために使用することができる。エンテロキナーゼは、以下の切断部位：ＤＤＤＤＫ（配列番号１８８）で、リジンの後を切断することができる。エンテロキナーゼは、タンパク質基質の配列およびコンフォメーションに応じて、他の塩基性残基で切断することもできる。
一部の実施形態では、切断可能部分は、小ユビキチン様修飾因子（ＳＵＭＯ）タンパク質であり得る。ＳＵＭＯドメインは、ＳＵＭＯに特異的なプロテアーゼを使用して、ペプチドを切断することができる。一部の実施形態では、切断可能部分は、エンテロキナーゼ切断部位：ＤＤＤＤＫ（配列番号１８８）であり得る。プロテアーゼは、例えば、Ｕｌｐ１プロテアーゼまたはエンテロキナーゼであり得る。Ｕｌｐ１プロテアーゼは、アミノ酸配列よりもむしろＳＵＭＯの三次構造を認識することによって、特異的な様式でＳＵＭＯを切断し得る。エンテロキナーゼ（エンテロペプチダーゼ）は、以下の切断部位：ＤＤＤＤＫ（配列番号１８８）で、リジンの後を切断するために使用することもできる。エンテロキナーゼは、タンパク質基質の配列に応じて、他の塩基性残基で切断することもできる。
ペプチドをコードする構築物の翻訳の間またはその後、Ｎ末端アミノ酸残基（例えば、ＳＵＭＯドメイン）を効率的に切断して、適当にフォールドされたペプチドを産生することができる。一部の実施形態では、少なくとも１つのＮ末端アミノ酸残基が切断されて、ペプチドが産生される。一部の実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれよりも多くのＮ末端アミノ酸残基が切断されてペプチドが産生される。Ｎ末端アミノ酸は、任意のアミノ酸残基であり得る。Ｎ末端アミノ酸残基は、メチオニンアミノ酸残基であり得る。したがって、この適当にフォールドされたペプチドは、Ｎ末端メチオニンを有して構築されず、無細胞ｉｎ ｖｉｔｒｏ法によって産生される高多様性ペプチドライブラリーの一部であり得る。
ペプチドをコードする構築物の翻訳後、Ｎ末端アミノ酸残基を切断して、高多様性ペプチドライブラリーのためのペプチドを産生することができる。一部の実施形態では、少なくとも１つのＮ末端アミノ酸残基が切断されて、ペプチドが産生される。一部の実施形態では、１つまたは複数のＮ末端アミノ酸が切断され、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、またはそれよりも多くのＮ末端アミノ酸残基が切断されて、ペプチドが産生される。Ｎ末端アミノ酸は、任意のアミノ酸残基であり得る。Ｎ末端アミノ酸残基は、メチオニンアミノ酸残基であり得る。
一部の実施形態では、ＤＮＡまたはＲＮＡ構築物は、ピューロマイシンを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡまたはＲＮＡ構築物は、停止コドンを欠くスペーサー配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、アフィニティータグ精製によって（例えば、ＦＬＡＧタグを用いて）精製される。一部の実施形態では、ペプチドは、ＨａｌｏＴａｇ酵素配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、アビジンまたはストレプトアビジンを含む。
哺乳動物発現のために、ＣＭＶペプチドをコードする構築物は、哺乳動物発現ベクターにＣ末端ＨｉｓタグがありまたはなしのＣ末端のＦｌａｇタグを用いて設計された。ペプチドを、製造業者の推奨に従って、Ｅｘｐｉ２９３ＦまたはＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において、一過性トランスフェクションによって発現させた。
ペプチドを、細胞培養上清から、抗Ｆｌａｇアフィニティークロマトグラフィー（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）でまたはＮｉアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２で事前に平衡化された親水性樹脂（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）において行った。
あるいは、ペプチドを、２３ｍＭのリン酸ナトリウム、５００ｍＭの塩化ナトリウム、５００ｍＭのイミダゾール、ｐＨ７．４のカラム緩衝液を使用して、ＳＥＣ精製なしで、Ｎｉアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。
哺乳動物細胞において産生されたペプチドを、２８０ｎｍのＵＶによって定量化した一方、ＣＦＰＳで産生されたペプチドを、標準タンパク質と比べて、サンドイッチＥＬＩＳＡによって定量化した。
Ｖ．ペプチド交換
ｐ＊ＭＨＣ多量体を使用して、本明細書に記載されるｉｎ ｓｉｔｕまたはｉｎ ｖｉｔｒｏペプチド交換反応によって多様な固有のペプチドエピトープロードｐＭＨＣ多量体のライブラリーまたはそのマイクロアレイを生成する。一部の実施形態では、ペプチド交換反応は、マルチウェルフォーマットで、天然の条件下で行われる。結合は、ＭＨＣ構造の安定性をモニターするＥＬＩＳＡなどのいくつかの技法によって、または蛍光偏光などのペプチド結合をモニターする生物物理学的技法によって決定される。ジペプチド交換またはＵＶ媒介交換を介したペプチド交換の非限定的な例示を、実施例４に詳細に記載する。
一部の実施形態では、プレースホルダペプチドまたはペプチド断片の解離効率を測定するために、蛍光標識化プレースホルダペプチドは、標識されていない交換ペプチドの存在下、交換反応において使用される。蛍光標識化ｐ＊ＭＨＣ多量体のアリコートは、未処理のままか、または異なる期間ペプチド交換条件（例えば、ＵＶ曝露）に曝露される。残っているＰ＊ＭＨＣ含有プレースホルダペプチドの量は、ｐ＊ＭＨＣ複合体の低減をモニターする蛍光分析によってモニターされる。
一部の実施形態では、プレースホルダペプチドは、交換されたペプチドエピトープよりもＭＨＣペプチド結合溝に対して低い親和性を有し、ステップ（ｄ）は、競合アッセイにおいて、ｐ＊ＭＨＣ単量体を過剰のペプチドエピトープと接触させることを含む。一部の実施形態では、プレースホルダペプチドは、交換されたペプチドエピトープよりも約１０倍低いＫＤを有する。
ＭＨＣ分子のペプチド結合溝に結合するペプチドは、天然に存在するペプチドであり得るが、特定のＭＨＣ分子またはそれが属するスーパータイプファミリーのＢおよびＦポケットの結合特異性の知識を使用して合成的に作出することもできる。好適なリガンドは、ＭＨＣ複合体の利用可能な３Ｄ構造、および個々のＭＨＣ分子の結合性ポケット特異性に対する知識を使用して生成することができる。
ＭＨＣ Ｉポリペプチドのペプチド結合特異性は、カップリングされた様式におけるＢおよびＦ結合性ポケットの生理化学的特性によって主に支配される。ＢおよびＦ結合性ポケットは、典型的には、ＭＨＣのペプチド結合溝におけるペプチドの結合を定義するペプチド中の「アンカー残基」に結合する。ＭＨＣ分子のペプチド結合溝のアミノ酸残基において観察された多様性は、個々のＭＨＣ分子のペプチド結合および提示レパートリーを定義する（Chang et al. 2011; Frontiers in Bioscience, Landmark Edition, Vol. 16:3014-3035）。アンカー残基に対するポケットの特異性は、例えばSidney et al. (BMC Immunology Vol. 9:1, 2008)に記載されるように、多数のＭＨＣ分子について解明されている。
本開示は、ｐ＊ＭＨＣ多量体を産生するステップであって、結合溝中のペプチドがプレースホルダペプチドである、ステップ；ｐ＊ＭＨＣ多量体を還元剤と接触させて、プレースホルダペプチドを除去するステップ；およびＭＨＣペプチド結合溝中のペプチドエピトープの結合のために十分な条件下でｐ＊ＭＨＣ多量体をＭＨＣペプチドエピトープと接触させるステップを含む、ｐ＊ＭＨＣ多量体を産生する方法をさらに提供する。
２つの接触ステップは、好ましくは、ＭＨＣペプチドエピトープを有するＭＨＣ分子を含む試料、および還元剤を提供することによって行われる。ＭＨＣペプチドエピトープは、還元剤が添加される時に存在することが好ましい。一部の実施形態では、１つのＭＨＣペプチドエピトープが、反応ごとに添加される。一部の実施形態では、２つまたはそれよりも多くのペプチドエピトープが反応に添加される。
一部の実施形態では、ペプチド交換は、混合物の温度を約３０℃～３７℃の間に上昇させることによって誘導される。一部の実施形態では、混合物は、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、または３７℃に上昇させる。
一部の実施形態では、ペプチド交換は、混合物のｐＨを約ｐＨ２．５～５．５の間に低減することによって誘導される。一部の実施形態では、ペプチド交換は、混合物のｐＨを約ｐＨ９～１１に増加させることによって誘導される。
一部の実施形態では、プレースホルダペプチドは、記載されるｐＭＨＣ複合体を形成するための光切断可能部分を含む（例えば、Toebes et al. Nat. Med. 12:246-251, 2006；Bakker et al. PNAS 105:3825-383, 2008；Frosig et al., Cytometry Part A, 87A:967-975, 2015；Chang et al., Eur. J. Immunol. 43:1109-1120, 2013）。一部の実施形態では、プレースホルダペプチドは、（２－ニトロ）フェニル側鎖を含有する非天然アミノ酸を含む。一部の実施形態では、アミノ酸は、３－アミノ－３－（２－ニトロ）フェニル－プロピオン酸を含むＵＶ感受性β－アミノ酸である。一部の実施形態では、ＵＶ感受性アミノ酸は、（２－ニトロ）フェニルグリシンである。
一部の実施形態では、プレースホルダペプチドは、ＨＬＡ－Ａ２ペプチドである。一部の実施形態では、ＨＬＡ－Ａ２プレースホルダペプチドは、ｐ＊Ａ２、ＫＩＬＧＣＶＦＪＶ（配列番号１５）またはＧＩＬＧＦＶＦＪＬ（配列番号７）（ここで、Ｊは、３－アミノ－３－（２－ニトロ）フェニル－プロピオン酸である）である。
一部の実施形態では、プレースホルダペプチドは、光切断可能部分を含有する、ＨＬＡ－Ａ１、－Ａ３、Ａ１１または－Ｂ７ペプチドである。一部の実施形態では、プレースホルダペプチドは、Ａ＊０１：０１、ＳＴＡＰＧＪＬＥＹ（配列番号１６）；Ａ＊０３：０１、ＲＩＹＲＪＧＡＴＲ（配列番号１７）；Ａ＊１１：０１、ＲＶＦＡＪＳＦＩＫ（配列番号１８）；Ａ＊２４：０２、ＶＹＧＪＶＲＡＣＬ（配列番号１１）；Ｂ＊０７：０２、ＡＡＲＧＪＴＬＡＭ（配列番号１４）；Ｂ＊３５：０１、ＫＰＩＶＶＬＪＧＹ（配列番号１９）；Ｃ＊０３：０４、ＦＶＹＧＪＳＫＴＳＬ（配列番号２０）、Ｂ＊０８：０１、ＦＬＲＧＲＡＪＧＬ（配列番号２１）；Ｃ＊０７：０２、ＶＲＩＪＨＬＹＩＬ（配列番号２２）；Ｃ＊０４：０１、ＱＹＤＪＡＶＹＫＬ（配列番号２３）；Ｂ＊１５：０１、ＩＬＧＰＪＧＳＶＹ（配列番号２４）；Ｂ＊４０：０１、ＴＥＡＤＶＱＪＷＬ（配列番号２５）；Ｂ＊５８：０１、ＩＳＡＲＧＱＪＬＦ（配列番号２６）；およびＣ＊０８：０１、ＫＡＡＪＤＬＳＨＦＬ（配列番号２７）（ここで、Ｊは、３－アミノ－３－（２－ニトロ）フェニル－プロピオン酸である）からなる群から選択される。他の実施形態では、プレースホルダペプチドは、配列番号７～２７または２７１～２７９のいずれか１つに示される配列を有する。
一部の実施形態では、プレースホルダペプチドは、蛍光標識をさらに含む。そのような実施形態では、蛍光標識は、プレースホルダペプチド中のシステイン残基に付着している。
長波長ＵＶによる照射の際に、ペプチドは、安定なｐＭＨＣ単量体または多量体の形成を容易にするために、１つまたは複数のペプチドの存在下で切断され、ＭＨＣ複合体から解離する。典型的には、ＭＨＣペプチド交換は、本明細書に記載されるペプチドリガンドのハイスループットスクリーニングのためのマルチウェルフォーマットで行われる。ペプチド－受容可能ＭＨＣ分子と効率的に結合し、それを安定化するペプチド候補のみが、ＭＨＣ複合体の解離を防止する。ペプチド交換は、ＥＬＩＳＡまたは蛍光偏光などのいくつかの技法によって、例えば、Rodenko et al. (Nat. Protocol. 1:1120-1132, 2006)に一般に記載されるようにモニターすることができる。
生じるｐＭＨＣ多量体は、その後、ゲル濾過ＨＰＬＣおよびＭＨＣ ＥＬＩＳＡによって分析されて、３つのパラメーター：ＭＨＣ再フォールディングの効率、ＵＶ曝露の非存在下でのｐＭＨＣ複合体の安定性、および複合体のＵＶ感受性が決定される。
ある特定のジペプチドは、ＭＨＣクラスＩ分子のフォールディングおよびペプチド交換を支援することができる。ジペプチドは、ＭＨＣクラスＩ分子のＦポケットに特異的に結合して、ペプチド交換を促進し、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊２７：０５、およびＨ－２Ｋｂ分子におけるペプチド交換についてこれまでに記載され、検証されている（Saini et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 Sep 17; 110(38):15383-8）。
したがって、一部の実施形態では、ペプチドまたは目的のペプチドとのプレースホルダペプチドのペプチド交換は、ＭＨＣクラスＩ分子における迅速なペプチド交換を触媒するジペプチドによって触媒される（例えば、Saini et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2015 Jan 6; 112(1):202を参照されたい）。好適なジペプチドは、疎水性の第２の残基を有するものである。一部の実施形態では、ジペプチドは、グリシル－ロイシン（ＧＬ）、グリシル－バリン（ＧＶ）、グリシル－メチオニン（ＧＭ）、グリシル－シクロヘキシルアラニン（ＧＣｈａ）、グリシル－ホモロイシン（ＧＨｌｅ）、またはグリシル－フェニルアラニン（ＧＦ）である。
別の実施形態では、ペプチドまたは目的のペプチド（peotides）とのプレースホルダペプチドのペプチド交換は、Overall et al. (2020) Nature Comm. 11:1909に記載されるように、例えば分子シャペロンＴＡＰＢＰＲを使用するシャペロン媒介ペプチド交換によって達成される。
ＶＩ．ｐＭＨＣライブラリーの産生
一態様では、多様なロードペプチドエピトープを含むｐＭＨＣ多量体のライブラリーを産生する方法が本明細書に提供される。ペプチド交換されたバーコード化ｐＭＨＣライブラリーの調製におけるさまざまなステップは、図１８に概略的に示される。これらのステップは、バーコード化ライブラリーを調製するための当技術分野において公知の標準的な方法を使用し、単一細胞配列決定の使用、多孔性ヒドロゲルの使用、ペプチドコードアンプリコン（バーコード）を生成するための単一鋳型ＰＣＲの使用、および液滴中のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳（ＩＶＴＴ）の使用を含む。
プールされたバーコード化ＵＶペプチド交換ＭＨＣ四量体による単一細胞配列決定の非限定的な例示を、実施例９に記載する。バーコード化ＵＶペプチド交換ＭＨＣ四量体プールのハイスループット産生のための多孔性ヒドロゲルの産生の非限定的な例示を、実施例１０に詳細に記載する。ペプチドコードアンプリコンを生成するための単一鋳型ＰＣＲの使用の非限定的な例示を、実施例１１に詳細に記載する。ヒドロゲル上のバーコード化可能な交換の準備ができているＭＨＣ四量体のローディングの非限定的な例示を、実施例１２に記載する。ペプチドの液滴中のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳（ＩＶＴＴ）およびロードされたＭＨＣ四量体へのＵＶ交換の非限定的な例示を、実施例１３に詳細に記載する。ＵＶペプチド交換されたバーコード化ｐＭＨＣ四量体のヒドロゲルからの放出の非限定的な例示を、実施例１４に詳細に記載する。
一部の実施形態では、方法は、（ａ）（ｉ）ＭＨＣＩ重鎖ポリペプチドまたはその機能的断片、（ｉｉ）β２－ミクログロブリンポリペプチドまたはその機能的断片、（ｉｉｉ）コンジュゲーション部分、および（ｉｖ）各ＭＨＣＩ単量体のペプチド結合溝中で結合したプレースホルダペプチドをそれぞれ含む、複数のプレースホルダペプチドロードＭＨＣＩ（ｐ＊ＭＨＣＩ）単量体を提供するステップ；（ｂ）複数の多量体化ドメインを提供するステップであって、多量体化ドメインの各サブユニットが、コンジュゲーション部分を含む、ステップ；（ｃ）２つまたはそれよりも多くのｐ＊ＭＨＣＩ単量体と多量体化ドメインとの間の共有結合的コンジュゲーションのために十分な条件下でｐ＊ＭＨＣＩ単量体および多量体化ドメインを組み合わせて、ｐ＊ＭＨＣＩ多量体を産生するステップ；ならびに（ｄ）複数のｐ＊ＭＨＣＩ多量体中のプレースホルダペプチドを複数の固有のＭＨＣＩペプチドエピトープを含むペプチドライブラリーで置き換えて、複数のペプチドロードＭＨＣＩ（ｐＭＨＣＩ）多量体を産生するステップを含む。
一部の実施形態では、方法は、（ａ）（ｉ）ＭＨＣＩ重鎖ポリペプチドまたはその機能的断片、（ｉｉ）β２－ミクログロブリンポリペプチドまたはその機能的断片、（ｉｉｉ）コンジュゲーション部分、および（ｉｖ）各ＭＨＣＩ単量体のペプチド結合溝中で結合したプレースホルダペプチドをそれぞれ含む、複数のプレースホルダペプチドロードＭＨＣＩ（ｐ＊ＭＨＣＩ）単量体を提供するステップ；（ｂ）複数の多量体化ドメインを提供するステップであって、多量体化ドメインの各サブユニットが、コンジュゲーション部分を含み、多量体化ドメインが、少なくとも１つの非共有結合部位を含む、ステップ；（ｃ）２つまたはそれよりも多くのｐ＊ＭＨＣＩ単量体と多量体化ドメインとの間の共有結合的コンジュゲーションのために十分な条件下で複数のｐ＊ＭＨＣＩ単量体および複数の多量体化ドメインを組み合わせて、複数のｐ＊ＭＨＣＩ多量体を産生するステップ；（ｄ）ｐ＊ＭＨＣＩ多量体のペプチド結合溝中で結合したプレースホルダペプチドを複数の固有のレスキューペプチドエピトープで置き換えて、複数のｐＭＨＣＩ多量体を産生するステップ；ならびに（ｅ）オリゴヌクレオチドバーコードを多量体化ドメイン上の非共有結合部位に結合させるステップを含む。
一部の実施形態では、方法は、（ａ）（ｉ）ＭＨＣＩ重鎖ポリペプチドまたはその機能的断片、（ｉｉ）β２－ミクログロブリンポリペプチドまたはその機能的断片、（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）のＣ末端にコンジュゲーション部分を含むペプチドリンカー、および（ｉｖ）各ＭＨＣＩ単量体のペプチド結合溝中で結合したプレースホルダペプチドをそれぞれ含む、複数のプレースホルダペプチドロードＭＨＣＩ（ｐ＊ＭＨＣＩ）単量体を提供するステップ；（ｂ）多量体化ドメインの各サブユニットのＮ末端にコンジュゲーション部分を含むペプチドリンカーを含む複数の多量体化ドメインを提供するステップ；（ｃ）多量体化ドメインへの２つまたはそれよりも多くのｐ＊ＭＨＣＩ単量体間の共有結合的コンジュゲーションのために十分な条件下で複数のｐ＊ＭＨＣＩ単量体および複数の多量体化ドメインを組み合わせて、複数のｐ＊ＭＨＣＩ多量体を産生するステップ；ならびに（ｄ）ｐ＊ＭＨＣＩ多量体のペプチド結合溝中で結合したプレースホルダペプチドを複数の固有のレスキューペプチドエピトープで置き換えて、複数のｐＭＨＣＩ多量体を産生するステップを含む。
ＶＩＩ．標識化
ｐＭＨＣ多量体は、例えばフローサイトメトリーまたは顕微鏡法を介して、ペプチド－ＭＨＣ多量体と結合するＴ細胞の識別を可能にする蛍光標識とコンジュゲートすることができる。Ｔ細胞は、例えば蛍光標識細胞分取により、蛍光標識に基づいて選択することもできる。
一部の実施形態では、１つまたは複数の検出可能な標識は、リンカーにコンジュゲートされる。本発明によれば、「検出可能な標識」は、系における生物学的または化学的特徴または変化、例えば試料中の標的物質の存在の検出を可能にする任意の分子または官能基である。
使用され得る検出可能な標識の例としては、フルオロフォア、発色団、電子化学発光標識、生物発光標識、ポリマー、ポリマー粒子、ビーズもしくは他の固体表面、金もしくは他の金属粒子または重原子、スピン標識、放射性同位元素、酵素基質、ハプテン、抗原、量子ドット、アミノヘキシル、ピレン、核酸もしくは核酸アナログ、またはタンパク質、例えば受容体、ペプチドリガンドもしくは基質、酵素、および抗体（抗体断片を含む）が挙げられる。
使用され得るポリマー粒子標識の例としては、ポリスチレン、ＰＭＭＡまたはシリカのマイクロ粒子、ビーズ、またはラテックス粒子が挙げられ、これらは、蛍光色素、またはポリマーミセル、または色素、酵素もしくは基質を含有するカプセルが埋め込まれ得る。使用され得る金属粒子の例としては、金粒子およびコーティング金粒子が挙げられ、これらは、銀染色によって変換され得る。コンジュゲートされ得るハプテンの例としては、一部の実施形態では、フルオロフォア、ｍｙｃ、ニトロチロシン、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、２，４－ジニトロフェニル、ジゴキシゲニン、ブロモデオキシウリジン、スルホネート、アセチルアミノフルレン、トリニトロフェノール水銀、およびエストラジオールである。
使用され得る酵素の例は、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、ベータ－ガラクトシダーゼ（ＧＡＬ）、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ、ベータ－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ、βグルクロニダーゼ、インベルターゼ、キサンチンオキシダーゼ、ホタルルシフェラーゼ、およびグルコースオキシダーゼ（ＧＯ）を含む。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）のために一般に使用される基質の例としては、３，３’－ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、ニッケル増強を伴うジアミノベンジジン、３－アミノ－９－エチルカルバゾール（ＡＥＣ）、ベンジジン二塩酸塩（ＢＤＨＣ）、ハンカー－イエーツ試薬（ＨＹＲ）、インドファンブルー（ＩＢ）、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、４－クロロ－１－ナフトール（ＣＮ）、アルファ－ナフトールピロニン（．アルファ．－ＮＰ）、ｏ－ジアニシジン（ＯＤ）、５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）、塩化２－（ｐ－ヨードフェニル）－３－ｐ－ニトロフェニル－５－フェニルテトラゾリウム（ＩＮＴ）、テトラニトロブルーテトラゾリウム（ＴＮＢＴ）、．デルタ．－ブロモ－クロロ－Ｓ－インドキシル－ベータ－Ｄ－ガラクトシド／フェロ－フェリシアン化物（ＢＣＩＧ／ＦＦ）が挙げられる。アルカリホスファターゼのために一般に使用される基質の例としては、ナフトール－ＡＳ－Ｂ１－ホスフェート／ファストレッドＴＲ（ＮＡＢＰ／ＦＲ）、ナフトール－ＡＳ－ＭＸ－ホスフェート／ファストレッドＴＲ（ＮＡＭＰ／ＦＲ）、ナフトール－ＡＳ－Ｂ１－ホスフェート／ファストレッドＴＲ（ＮＡＢＰ／ＦＲ）、ナフトール－ＡＳ－ＭＸ－ホスフェート／ファストレッドＴＲ（ＮＡＭＰ／ＦＲ）、ナフトール－ＡＳ－Ｂ１－ホスフェート／ｎｅｗ ｆｕｓｃｈｉｎ（ＮＡＢＰ／ＮＦ）、ブロモクロロインドリルホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウム（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ）、ｂ－ブロモ－クロロ－Ｓ－インドリル－ベータ－デルタ－ガラクトピラノシド（ＢＣＩＧ）が挙げられる。
使用され得る発光標識の例としては、ルミノール、イソルミノール、アクリジニウムエステル、１，２－ジオキセタン、およびピリドピリダジンが挙げられる。電気化学発光標識の例としては、ルテニウム誘導体が挙げられる。使用され得る放射性標識の例としては、ヨウ素、コバルト、セレン、水素、炭素、硫黄、およびリンの放射性同位元素が挙げられる。
一部の「検出可能な標識」は「色標識」も含み、ここで、系における生物学的な変化または事象は、色の存在または色の変化によってアッセイされ得る。「色標識」の例は、発色団、フルオロフォア、化学発光化合物、電気化学発光標識、生物発光標識、および基質の色の変化を触媒する酵素である。
「フルオロフォア」は、本明細書で記載される場合、１つまたは複数の波長での電磁放射による励起の際に、検出可能な電磁放射を発する分子である。多種多様なフルオロフォアが、当技術分野において公知であり、検出可能な分子標識としての使用のために化学者によって開発されており、本明細書に提供されるｐＭＨＣ多量体にコンジュゲートされ得る。例としては、ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＩＮ（商標）またはその誘導体、例えば、ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＩＮ（登録商標）－５－イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、５－（および６）－カルボキシＦＬＵＯＲＥＳＣＥＩＮ（登録商標）、５－または６－カルボキシＦＬＵＯＲＥＳＣＥＩＮ（登録商標）、６－（ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＩＮ（登録商標））－５－（および６）－カルボキサミドヘキサン酸、ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＩＮ（登録商標）イソチオシアネート、ローダミンまたはその誘導体、例えば、テトラメチルローダミンおよびテトラメチルローダミン－５－（および－６）イソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）が挙げられる。他のフルオロフォアとしては、クマリン色素、例えば、（ジエチル－アミノ）クマリンまたは７－アミノ－４－メチルクマリン－３－酢酸、スクシンイミジルエステル（ＡＭＣＡ）；スルホローダミン１０１スルホニルクロリド（ＴｅｘａｓＲｅｄ（登録商標）またはＴｅｘａｓＲｅｄ（登録商標）スルホニルクロリド；５－（および－６）－カルボキシローダミン１０１、スクシンイミジルエステル、５－（および－６）－カルボキシ－Ｘ－ローダミン、スクシンイミジルエステル（ＣＸＲ）としても公知；リサミンまたはリサミン誘導体、例えば、リサミンローダミンＢスルホニルクロリド（ＬｉｓＲ）；５－（および－６）－カルボキシＦＬＵＯＲＥＳＣＥＩＮ（登録商標）、スクシンイミジルエステル（ＣＦＩ）；ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＩＮ（登録商標）５－イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）；７－ジエチルアミノクマリン－３－カルボン酸、スクシンイミジルエステル（ＤＥＣＣＡ）；５－（および－６）－カルボキシテトラメチル－ローダミン、スクシンイミジルエステル（ＣＴＭＲ）；７－ヒドロキシクマリン－３－カルボン酸、スクシンイミジルエステル（ＨＣＣＡ）；６－＞ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＩＮ（登録商標）．－５－（および－６）－カルボキサミドヘキサン酸（ＦＣＨＡ）；Ｎ－（４，４－ジフルオロ－５，７－ジメチル－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－３－インダセンプロピオン酸、スクシンイミジルエステル；５，７－ジメチルＢＯＤＩＰＹ（登録商標）プロピオン酸、スクシンイミジルエステル（ＤＭＢＰ）としても公知；「活性化ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＩＮ（登録商標）誘導体」（ＦＡＰ）、Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｃ．から入手可能；エオシン－５－イソチオシアネート（ＥＩＴＣ）；エリスロシン－５－イソチオシアネート（ＥｒｌＴＣ）；およびＣａｓｃａｄｅ（登録商標）ブルーアセチルアジド（ＣＢＡＡ）（１－ヒドロキシ－３，６，８－ピレン－トリスルホン酸のＯ－アセチル化誘導体）が挙げられる。本発明において有用なさらに他の可能性のあるフルオロフォアとしては、蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質およびそのアナログまたは誘導体、蛍光アミノ酸、例えば、チロシンおよびトリプトファン、およびそれらのアナログ、蛍光ヌクレオシド、ならびに他の蛍光分子、例えば、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、ＣＹ５．ＴＭ、ＣＹ５．ＴＭ．５、Ｃｙ７、ＩＲ色素、Ｄｙｏｍｉｃｓ色素、フィコエリトリン、オレゴングリーン４８８、パシフィックブルー、ローダミングリーン、ならびにＡｌｅｘａ色素が挙げられる。蛍光標識のさらに他の例としては、Ｒ－フィコエリトリンオラロフィコエリトリン、無機蛍光標識、例えば、コーティングされたＣｄＳｅナノ結晶のような半導体材料に基づく粒子のコンジュゲートが挙げられる。
上記のフルオロフォアおよび他のもののいくつかは、Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｃ．（Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇ．）、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ．）、またはＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．）などの企業から市販されている。
検出可能な標識は、例えば、光標識の場合では、反射率、透過率、光散乱、旋光度および蛍光、もしくはこれらの組合せ、または放射性標識の場合では、フィルム、シンチレーション計数、もしくはホスホイメージングによってを含む多数の方法によって検出することができる。例えば、Larsson, 1988, Immunocytochemistry: Theory and Practice, (CRC Press, Boca Raton, Fla.)；Methods in Molecular Biology, vol. 80 1998, John D. Pound (ed.) (Humana Press, Totowa, N.J.)を参照されたい。一部の実施形態では、２つ以上の検出可能な標識が用いられた。
ＶＩＩＩ．識別子／バーコード化
ある特定の実施形態では、本開示のコンジュゲート化多量体は、識別子タグまたは標識、例えばオリゴヌクレオチドバーコードを含み、これは、コンジュゲート化多量体の識別を容易にする。典型的には、識別子タグ、例えばオリゴヌクレオチドバーコードは、多量体化ドメイン上の結合部位に結合する識別子タグ、例えばオリゴヌクレオチドバーコード上の結合性部分を通してなどで、コンジュゲート化多量体の多量体化ドメインに付着される。例えば、多量体化ドメインがストレプトアビジンまたはアビジンである場合、ｐＭＨＣＩ単量体がビオチン結合部位以外の部位で多量体化ドメインにコンジュゲートされるので、コンジュゲート化多量体は、識別子タグのビオチン化形態、例えばビオチン化オリゴヌクレオチドバーコードを使用して、識別子タグ、例えばオリゴヌクレオチドバーコードで標識され得る。次いで、コンジュゲート化多量体の標識化は、ビオチン化識別子タグ、例えばビオチン化オリゴヌクレオチドバーコードとのコンジュゲート化多量体のインキュベーションによって容易に達成される。ビオチン化オリゴヌクレオチドを使用するコンジュゲート化多量体のバーコード化の非限定的な例示を、実施例８に詳細に記載する。
別の実施形態では、コンジュゲート化多量体は、多量体のペプチド部分において、識別子タグ、例えばオリゴヌクレオチドバーコードで標識される。すなわち、バーコード標識化ＭＨＣ結合性ペプチドを、バーコード標識化ペプチドによるコンジュゲート化多量体のロードへの本明細書に記載される交換反応において使用することができる。
典型的には、オリゴヌクレオチドバーコードは、１０から５０よりも多くのヌクレオチドの範囲の固有のオリゴヌクレオチド配列である。バーコードは、３’および５’末端の共有される増幅配列、ならびに中央に固有の配列を有する。この配列は、配列決定によって明らかにすることができ、所与の分子のための特異的なバーコードとして機能し得る。
一実施形態では、バーコードの核酸構成要素（典型的にはＤＮＡ）は特定の構造を有する。したがって、一実施形態では、少なくとも１つの核酸分子は、少なくとも５’の第１のプライマー領域、中央領域（バーコード領域）、および３’の第２のプライマー領域で構成される。この方法では、中央領域（バーコード領域）は、プライマーセットによって増幅することができる。また、核酸分子の長さは変わり得る。したがって、他の実施形態では、少なくとも１つの核酸分子は、２０～１００個のヌクレオチド、例えば３０～１００個、例えば３０～８０個、例えば３０～５０個のヌクレオチドの範囲の長さを有する。一実施形態では、核酸識別子は、４０ヌクレオチド長～１２０ヌクレオチド長である。コンジュゲート化多量体へのオリゴヌクレオチドバーコードのカップリングも変わり得る。したがって、一実施形態では、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドバーコードは、コンジュゲート化多量体内のストレプトアビジンまたはアビジンと相互作用するビオチン結合性ドメインを介して前記コンジュゲート化多量体に連結される。他のカップリング部分も、コンジュゲート化多量体との適切な結合部位（例えば、コンジュゲート化多量体の多量体化ドメイン内）の利用性、および付着を容易にするためにオリゴヌクレオチドバーコード分子に付着され得る適切な対応する結合性ドメインに応じて使用され得る。
さらなる実施形態では、少なくともオリゴヌクレオチドバーコード分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、および／または人工ヌクレオチド、例えばＰＬＡもしくはＬＮＡを含むか、あるいはこれらからなる。好ましくは、他のヌクレオチドであるが、ＤＮＡが、例えば安定性を増加させるために含まれ得る。
バーコード技術の使用は、当技術分野において周知であり、例えば、Shiroguchi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 2012 Jan. 24; 109(4):1347-52；およびSmith et al., Nucleic Acids Research, 2010 July; 38(13)11:e142を参照されたい。バーコード技術を使用するためのさらなる方法および組成物は、Ｕ．Ｓ．２０１６／００６０６２１号に記載されるものが挙げられる。ＭＨＣ多量体を特異的に標識するためのバーコード技術の使用も記載されており、例えば、Bentzen et al., Nature Biotech. 34:10: 1037-1045, 2016；Bentzen and Hadrup, Cancer Immunol. Immunotherap. 66:657-666, 2017を参照されたい。コンジュゲート化多量体と結合することができる好適な結合性部分とのそれらのコンジュゲート化（例えば、ビオチン化）を含むバーコードオリゴヌクレオチドを調製するための標準的な方法は、当技術分野において公知であり、コンジュゲート化多量体を標識するためのバーコードオリゴヌクレオチドを調製するために適用することができる。
カスタマイズ可能なＤＮＡバーコードライブラリーを生成するための方法は公開されている。プログラムとしては、それぞれ９６～５８７バーコードから構成されるＧｅｎｅｒａｔｏｒおよびｎｘＣｏｄｅ、ならびにＴｈｅ ＤＮＡ Ｂａｒｃｏｄｅｓ Ｐａｃｋａｇｅ ａｎｄ ＴａｇＤソフトウェア（１００，０００バーコードから構成されるライブラリーを生成することを報告している）が挙げられる。
各種の大スケールバーコードライブラリーの調製は、当技術分野において記載されており、その手法は、ｐＭＨＣコンジュゲート化多量体ライブラリーを標識するためのバーコードライブラリーを得るために使用することができる。例えば、Ｘｕらは、それらの識別モチーフの最大の多様性を維持しながら、類似の増幅特性を有する配列を有する２４０，０００の固有の２５－ｍｅｒオリゴヌクレオチドのセットを記載している（Xu et al. PNAS 106:2289-2294, 2008）。Ｗａｎｇらは、粒子群の最適化を使用するバーコードセットの構築を記載している（Wang et al. IEEE/ACM Trans. Comput. Biol. Bioinform. 15:999-1002）。Ｌｙｏｎｓは、最大で１００万メンバーのＤＮＡバーコードの大スケールライブラリーの生成を記載している（Lyons, Sci. Reports 7:13899, 2017）。
一部の場合では、固有の分子識別子バーコードは、標的核酸の一端にタグ化されたヌクレオチドの連続配列によってコードされる。他の場合では、固有の分子識別子（ＵＭＩ）バーコードは、不連続配列によってコードされる。不連続ＵＭＩは、標的核酸の第１の端にバーコードの一部分、および標的核酸の第２の端にバーコードの一部分を有することができる。一部の場合では、ＵＭＩは、標的核酸の第１の端に可変長バーコード配列および第２の端に第２の識別子配列を含有する不連続バーコードである。一部の場合では、ＵＭＩは、標的核酸の第１の端に可変長バーコード配列および第２の端に第２の識別子配列を有する不連続バーコードであり、ここで、第２の識別子配列は、トランスポザーゼ断片化事象の位置、例えばトランスポザーゼ断片化部位およびトランスポザーゼ末端挿入事象によって決定される。
一部の場合では、バーコードは、「可変長バーコード」である。本明細書で使用される場合、可変長バーコードは、長さによって集団中の他の可変長バーコードオリゴヌクレオチドと異なるオリゴヌクレオチドであり、これは、バーコード中の連続ヌクレオチドの数によって識別することができる。一部の場合では、可変長に加えて、上記の段落に記載されるように、可変長バーコードについての追加のバーコードの複雑さが、可変ヌクレオチド配列の使用によって提供され得る。
例示的な実施形態では、可変長バーコードは、０から５以下のヌクレオチドの長さを有し得る。そのような可変長バーコードは、「［０－５］」という用語によって表され得る。そのような実施形態では、そのような可変長バーコードに付着される標的核酸の集団が、少なくとも１個のヌクレオチドを有する可変長バーコードに付着される（例えば、１つのみ、２つのみ、３つのみ、４つのみ、または５つのみのヌクレオチドを有する可変長バーコードに付着される）少なくとも１つの標的核酸を含むと予想されることが理解される。そのような実施形態では、そのような可変長バーコードに付着される標的核酸の集団が、可変長バーコードを含有しない（すなわち、０の長さを有する可変長バーコード）少なくとも１つの標的核酸、および／または１つのヌクレオチドのみを有する可変長バーコードを含有する少なくとも１つの標的核酸、および／または２つのヌクレオチドのみを有する可変長バーコードを含有する少なくとも１つの標的核酸、および／または３つのヌクレオチドのみを有する可変長バーコードを含有する少なくとも１つの標的核酸、および／または４つのヌクレオチドのみを有する可変長バーコードを含有する少なくとも１つの標的核酸、および／または５つのヌクレオチドのみを有する可変長バーコードを含有する少なくとも１つの標的核酸を含み得ることがさらに理解される。そのような実施形態では、［０－５］可変長バーコードは、それ自体によって、同じ配列の５つの異なる標的核酸分子を固有に識別する（区別する）ことができる。さらに、そのような実施形態では、［０－５］可変長バーコードは、それぞれの異なる標的核酸配列について、第１の配列の５つの異なる標的核酸分子、第２の配列の５つの異なる標的核酸分子などを固有に識別する（区別する）ことができる。さらには、バーコード標識化ＭＨＣ多量体は、単一細胞選別およびＴＣＲ配列決定と組み合わせて使用することができ、ここで、ＴＣＲの特異性は、共付着バーコードによって決定することができる。これは、我々が、同じ試料から並行して可能性のある１０００＋の異なる抗原反応性Ｔ細胞についてのＴＣＲ特異性を識別すること、およびＴＣＲ配列を抗原特異性とマッチさせることを可能にする。この技術の将来の可能性は、ＴＣＲ配列に基づく抗原応答性を予測する能力に関する。
バーコード標識化ＭＨＣ多量体ライブラリーの複雑さは、所与の個体中の関連するＴＣＲの個別化された選択を可能にする。
バーコードは、多量体に共付着され、特定のペプチド－ＭＨＣ複合体に対する特異的標識としての役割を果たす。この方法では、少なくとも１０００～１０，００またはそれよりも多くの異なるペプチド－ＭＨＣ多量体を混合することができ、血液または他の生物学的検体からのＴ細胞との特異的な相互作用、未結合ＭＨＣ多量体の洗い流し、ＤＮＡバーコードの配列の決定を可能にする。目的の細胞集団を選択する場合、バックグラウンドレベルを上回って存在するバーコードの配列は、所与の細胞集団中に存在する抗原応答性細胞の識別のためのフィンガープリントを提供する。それぞれの特異的なバーコードについての配列リードの数は、特異的Ｔ細胞の頻度と相関し、頻度は、リードの頻度をＴ細胞のインプット頻度と比較することによって推定することができる。
ＤＮＡバーコードは、抗原特異的Ｔ細胞のための特異的標識としての役割を果たし、例えば単一細胞選別、機能分析または表現型評価後に、Ｔ細胞の特異性を決定するために使用することができる。この方法では、抗原特異性は、Ｔ細胞受容体配列（単一細胞配列決定法によって明らかにされ得る）ならびに抗原特異的細胞の機能的および表現型的特徴の両方に関連し得る。
バーコード標識化ＭＨＣ多量体ライブラリーは、所与のＴ細胞クローンまたはＴＣＲ形質導入／トランスフェクト細胞へのＭＨＣ多量体結合の定量的評価のために使用することができる。バーコード標識の配列決定は、いくつかの異なる標識が同じ細胞集団において同時に決定されるのを可能にするので、この戦略は、関連するペプチド－ＭＨＣ多量体のライブラリーと比べて、所与のＴＣＲのアビディティーを決定するために使用することができる。最終読み取りにおける異なるＤＮＡ－バーコード配列の相対的寄与は、ライブラリー中の異なるペプチド－ＭＨＣ多量体のそれぞれに対するＴＣＲ結合の定量的寄与に基づいて決定される。タイトレーションに基づく分析により、単一試料にすべてマージされた、ペプチド－ＭＨＣ多量体の大きなライブラリーに関連して、ＴＣＲの定量的な結合特性を決定することが可能である。この特定の目的のために、ＭＨＣ多量体ライブラリーは、関連ペプチド配列またはアラニン置換ペプチドライブラリーを特異的に保持し得る。
一部の実施形態では、固有の識別子は、複数の試料の各試料のために使用することができる。一部の実施形態では、識別子は、２つまたはそれよりも多くの試料の間で共有することができる。一部の実施形態では、識別子は、すべての試料間で共有される一部の配列、および１つの試料に固有である他の配列を含むことができる。一部の実施形態では、識別子は、すべての試料間で共有される配列、および１つの試料に固有の配列を含むことができる。一部の実施形態では、試料間で共有される配列は、増幅（例えば、好適なプライマーによるＰＣＲ増幅）の識別子のために使用することができる。一部の実施形態では、１つの試料に固有の配列または試料のサブセット間で共有される配列は、ｑＰＣＲによる検出または定量化のために使用することができる（例えば、加水分解プローブ、例えばＴａｑＭａｎプローブのための配列）。一部の実施形態では、１つの試料に固有の配列または試料のサブセット間で共有される配列は、配列決定を介した検出または定量化のために使用することができる。
一部の実施形態では、識別子は、固有のインシリコで生成された配列を含むことができ、各識別子配列は、複数の試料のうちの１つの試料に割り当てることができ、識別子－試料割り当ては、データベースに保存することができる。一部の実施形態では、識別子は、ペプチドまたはタンパク質のすべてまたは部分をコードするヌクレオチド配列を含むことができる。一部の実施形態では、識別子は、オープンリーディングフレームをコードするヌクレオチド配列を含むことができる。一部の実施形態では、識別子は、プロモーター配列を含むヌクレオチド配列を含むことができる。一部の実施形態では、識別子は、ＤＮＡ結合性タンパク質、例えば転写因子またはポリメラーゼ酵素のための結合部位を含むヌクレオチド配列を含むことができる。一部の実施形態では、識別子は、ヌクレアーゼ、例えば制限酵素によって標的にされる１または複数の配列を含むことができる。一部の実施形態では、識別子は、配列のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写および翻訳に必要なすべての配列エレメントを含むことができる。一部の実施形態では、識別子は、配列のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写および翻訳に必要なすべての配列エレメントを含まない。
一部の実施形態では、識別子は、ビオチン化ヌクレオチド配列を含むことができる。一部の実施形態では、識別子は、ビオチン化プライマーによるＰＣＲ増幅によってビオチン化され得る。一部の実施形態では、識別子は、Ｋｌｅｎｏｗ ＤＮＡポリメラーゼ酵素、ニック翻訳、またはＴ７、Ｔ３、およびＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを含むＲＮＡポリメラーゼを標識する混合プライマーの使用による、ビオチン化標識、例えばビオチンｄＵＴＰ標識の酵素的組み込みによってビオチン化され得る。一部の実施形態では、識別子は、光ビオチン化によってビオチン化することができる、例えば、光活性化可能ビオチンを試料に添加し、試料にＵＶ光を照射することができる。
一部の実施形態では、識別子は、例えば、鋳型ＤＮＡのＰＣＲ増幅を介して、鋳型ポリヌクレオチドから生成することができる。一部の実施形態では、鋳型ポリヌクレオチドは、オープンリーディングフレームをコードするヌクレオチド配列を含むことができる。一部の実施形態では、鋳型ポリヌクレオチドは、プロモーター配列を含むヌクレオチド配列を含むことができる。一部の実施形態では、鋳型ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ結合性タンパク質、例えば転写因子またはポリメラーゼ酵素のための結合部位を含むヌクレオチド配列を含むことができる。一部の実施形態では、鋳型ポリヌクレオチドは、ヌクレアーゼ、例えば制限酵素によって標的にされる１または複数の配列を含むことができる。一部の実施形態では、鋳型ポリヌクレオチドは、配列のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写および翻訳に必要なすべての配列エレメントを含むことができる。一部の実施形態では、鋳型ポリヌクレオチドは、配列のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写および翻訳に必要なすべての配列エレメントを含まない。
付着された識別子（例えば、オリゴヌクレオチドバーコード）を有するｐＭＨＣ多量体は、複数のＴ細胞とともにインキュベートし、それに続いて単一細胞コンパートメントへのＴ細胞の選別を行うことができる。Ｔ細胞は溶解され、識別子を含む溶解されたＴ細胞から核酸が産生される。核酸はプールされ、配列決定される。識別子により、ペプチド識別子を同じコンパートメントからのＴ細胞配列とマッチさせることが可能である。ＴＣＲ抗原特異性プロファイルは、コンパートメントからＴＣＲ配列（例えば、可変領域、超可変領域、またはＣＤＲ）を識別すること、および同じコンパートメントからのペプチド識別子リードを定量化することによって決定される。
ペプチドライブラリーのペプチドについて結合親和性を示す多数のＴＣＲを識別することができ、特異的ＴＣＲに対する結合親和性を示す多数のペプチドを識別することができる。
ＴＣＲ結合親和性の増加をもたらす識別されたＴＣＲ－抗原対の抗原におけるエピトープ突然変異を、識別することができる。
疾患関連タンパク質の対照と関連するペプチドおよびＴＣＲ配列を識別することができ、ワクチンおよび細胞療法を設計するために使用することができる。
治療に対する応答を評価するために、配列決定された各ペプチド識別子について、対応するＴＣＲ配列が識別される。ペプチドライブラリーの一部のペプチドについて結合親和性を示す多数のＴＣＲが識別され、一部のＴＣＲに対する結合親和性を示す多数のペプチドが識別される。対象は長期的に追跡され、アッセイの結果を比較して、免疫療法に対する成功した応答に関連するペプチドおよびＴＣＲ配列が識別される。
ＩＸ．ベクターおよびポリヌクレオチド
本明細書に記載されるタンパク質のいずれかをコードする核酸配列も本開示に含まれる。当業者に認識されるように、第３の塩基縮重のために、ほとんどすべてのアミノ酸は、コードするヌクレオチド配列中で２つ以上のトリプレットコドンによって表すことができる。加えて、マイナーな塩基対変化は、コードされるアミノ酸配列において保存的置換をもたらし得るが、遺伝子産物の生物活性を実質的に変更するとは予想されない。したがって、本明細書に記載されるタンパク質をコードする核酸配列は、配列中でわずかに改変され得、そのそれぞれの遺伝子産物をさらに依然としてコードし得る。
本明細書に記載されるさまざまなタンパク質またはポリペプチドのいずれかをコードする核酸は、化学的に合成されてもよい。コドン使用頻度は、細胞中での発現を改善するために選択されてもよい。そのようなコドン使用頻度は、選択される細胞型に依存する。特定化されたコドン使用頻度のパターンは、Ｅ．ｃｏｌｉおよび他の細菌、ならびに哺乳動物細胞、植物細胞、酵母細胞および昆虫細胞のために発達している。例えば、Mayfield et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100(2):438-442 (Jan. 21, 2003); Sinclair et al., Protein Expr. Purif., 26(I):96-105 (October 2002)；Connell, N.D., Curr. Opin. Biotechnol., 12(5):446-449 (October 2001)；Makrides et al., Microbiol. Rev., 60(3):512-538 (September 1996)；およびSharp et al., Yeast, 7(7):657-678 (October 1991)を参照されたい。
核酸操作のための一般技法は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)、またはAusubel, F. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing and Wiley-Interscience, New York (1987)および定期的更新に記載されている。一般に、ポリペプチドをコードするＤＮＡは、哺乳動物、ウイルスまたは昆虫遺伝子に由来する好適な転写または翻訳調節エレメントに作動可能に連結されている。そのような調節エレメントは、転写プロモーター、転写を制御する必要に応じたオペレーター配列、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写および翻訳の終結を制御する配列を含む。通常複製起点によって付与される宿主中で複製する能力、および形質転換体の認識を容易にする選択遺伝子が、追加で組み込まれる。
本明細書に記載されるタンパク質は、直接的にだけでなく、好ましくは、シグナル配列、または成熟タンパク質もしくはポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種ポリペプチドとの融合ポリペプチドとして、組換え的に産生されてもよい。選択された異種シグナル配列は、好ましくは、宿主細胞によって認識およびプロセシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）ものである。
天然のシグナル配列を認識およびプロセシングしない原核宿主細胞のために、シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、１ｐｐ、または熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される原核シグナル配列によって置換される。
酵母分泌のために、天然のシグナル配列は、例えば、酵母インベルターゼリーダー、因子リーダー（ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓおよびＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓアルファ因子リーダーを含む）、または酸ホスファターゼリーダー、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓグルコアミラーゼリーダー、または米国特許第５，６３１，１４４号に記載されるシグナル配列によって置換されていてもよい。哺乳動物細胞発現では、哺乳動物シグナル配列、およびウイルス分泌リーダー、例えば単純ヘルペスｇＤシグナルが利用可能である。そのような前駆体領域のためのＤＮＡは、リーディングフレームにおいて、タンパク質をコードするＤＮＡにライゲーションされていてもよい。
発現およびクローニングベクターは両方とも、１つまたは複数の選択された宿主細胞におけるベクターの複製を可能にする核酸配列を含有する。一般に、クローニングベクターでは、この配列は、ベクターが宿主染色体ＤＮＡとは無関係に複製することを可能にするものであり、複製起点または自己複製する配列を含む。そのような配列は、各種の細菌、酵母およびウイルスについて周知である。プラスミドｐＢＲ３２２由来の複製起点は、ほとんどのグラム陰性菌に好適であり、２ミクロンプラスミドの起点は、酵母に好適であり、さまざまなウイルスの起点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶまたはＢＰＶ）は、哺乳動物細胞におけるクローニングベクターのために有用である。一般に、複製起点の構成要素は、哺乳動物発現ベクターのために必要ではない（ＳＶ４０起点は、典型的には、それが初期プロモーターを含有する理由だけで使用され得る）。
発現およびクローニングベクターは、選択マーカーとも称される選択遺伝子を含有していてもよい。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセート、またはテトラサイクリン（tracycline）に対する耐性を付与するタンパク質、（ｂ）栄養要求性の欠乏を補うタンパク質、または（ｃ）複合培地からは利用可能ではない重要な栄養素、例えば、ＢａｃｉｌｌｉのＤ－アラニンラセマーゼをコードする遺伝子を供給するタンパク質をコードする。
発現およびクローニングベクターは、通常、宿主生物体によって認識され、本明細書に記載されるタンパク質、例えばフィブロネクチンに基づくスキャフォールドタンパク質をコードする核酸に作動可能に連結されているプロモーターを含有する。原核生物宿主での使用に好適なプロモーターとしては、ｐｈｏＡプロモーター、ベータ－ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、ならびにハイブリッドプロモーター、例えばｔａｎプロモーターが挙げられる。しかしながら、他の公知の細菌プロモーターが好適である。細菌系における使用のためのプロモーターは、本明細書に記載されるタンパク質をコードするＤＮＡに作動可能に連結されたシャイン－ダルガーノ（Ｓ．Ｄ．）配列も含有する。プロモーター配列は、真核生物について公知である。事実上、すべての真核遺伝子は、転写が開始される部位からおよそ２５～３０塩基上流に位置するＡＴリッチ領域を有する。多くの遺伝子の転写の開始から７０～８０塩基上流で見出される別の配列は、ＣＮＣＡＡＴ領域（ここで、Ｎは、任意のヌクレオチドであり得る）である。ほとんどの真核遺伝子の３’末端に、コード配列の３’末端でのポリＡテイルの付加のためのシグナルであり得るＡＡＴＡＡＡ配列がある。これらの配列のすべてが、好適には、真核発現ベクターに挿入される。
酵母宿主での使用のための好適なプロモートする配列の例としては、３－ホスホグリセリン酸キナーゼ、または他の糖分解酵素、例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース－６－リン酸イソメラーゼ、３－ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼのためのプロモーターが挙げられる。
哺乳動物宿主細胞におけるベクターからの転写は、例えば、ウイルス、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２など）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、最も好ましくは、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のゲノムから得られるプロモーターによって、異種哺乳動物プロモーター、例えば、熱ショックプロモーター由来のアクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーターから、制御され得、但し、そのようなプロモーターは、宿主細胞系と適合性である。
高等真核生物による本明細書に記載されるタンパク質をコードするＤＮＡの転写は、多くの場合、ベクターへのエンハンサー配列の挿入によって増加する。多くのエンハンサー配列が、哺乳動物遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α－フェトプロテイン、およびインスリン）から現在公知である。しかしながら、典型的には、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーが使用される。例としては、複製起点の後側（ｂｐ１００～２７０）のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。真核細胞プロモーターの活性化について増強するエレメントに対して、Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982)も参照されたい。エンハンサーは、ペプチドコード配列に対して５’または３’位でベクターにスプライシングされ得るが、好ましくは、プロモーターから５’の部位に位置する。
真核宿主細胞（例えば、酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、または他の多細胞生物体由来の有核細胞）において使用される発現ベクターは、転写の終結のためおよびｍＲＮＡを安定化するために必要な配列も含有する。そのような配列は、真核生物またはウイルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’および時折３’非翻訳領域から通常利用可能である。これらの領域は、本明細書に記載されるタンパク質をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分において、ポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含有する。１つの有用な転写終結構成要素は、ウシ成長ホルモンのポリアデニル化領域である。ＷＯ９４／１１０２６号およびそこに開示されている発現ベクターを参照されたい。
組換えＤＮＡは、タンパク質を精製するために有用であり得る任意の種類のタンパク質タグ配列を含むこともできる。タンパク質タグの例としては、限定されるものではないが、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、またはＧＳＴタグが挙げられる。細菌、真菌、酵母および哺乳動物細胞宿主での使用のための適切なクローニングおよび発現ベクターは、Cloning Vectors: A Laboratory Manual, (Elsevier, New York (1985))において見出すことができ、その関連する開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
発現構築物は、当業者に明らかであるように、宿主細胞に対して適切な方法を使用して、宿主細胞に導入される。宿主細胞に核酸を導入するための各種の方法は、当技術分野において公知であり、限定されるものではないが、電気穿孔；塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ－デキストランまたは他の物質を用いるトランスフェクション；微粒子銃；リポフェクション；および感染（ベクターが感染病原体である場合）が挙げられる。
好適な宿主細胞としては、原核生物、酵母、哺乳動物細胞、または細菌細胞が挙げられる。好適な細菌としては、グラム陰性またはグラム陽性生物体、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．が挙げられる。酵母、好ましくはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種由来の酵母、例えばＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅも、ポリペプチドの産生のために使用され得る。さまざまな哺乳動物または昆虫細胞培養系を、組換えタンパク質を発現させるために用いることもできる。昆虫細胞における異種タンパク質の産生のためのバキュロウイルス系は、Luckow et al. (Bio/Technology, 6:47 (1988))によって概説されている。好適な哺乳動物宿主細胞系の例としては、内皮細胞、ＣＯＳ－７サル腎臓細胞、ＣＶ－１、Ｌ細胞、Ｃ１２７、３Ｔ３、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ヒト胚腎臓細胞、ＨｅＬａ、２９３、２９３Ｔ、およびＢＨＫ細胞系が挙げられる。精製されたポリペプチドは、好適な宿主／ベクター系を培養して、組換えタンパク質を発現させることによって調製される。多くの適用のために、小さなサイズの多くの本明細書に記載されるポリペプチドは、発現のための好ましい方法としてＥ．ｃｏｌｉにおいて発現されるであろう。次いで、タンパク質は、培養培地または細胞抽出物から精製される。
本発明のタンパク質を産生するために使用される宿主細胞は、各種の培地中で培養され得る。市販の培地、例えば、ハムＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍａ））、ＲＰＭＩ－１６４０（Ｓｉｇｍａ）、およびダルベッコ改変イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ））は、宿主細胞を培養するために好適である。加えて、Ham et al., Meth. Enzymol., 58:44 (1979)、Barites et al., Anal. Biochem., 102:255 (1980)、米国特許第４，７６７，７０４号、同第４，６５７，８６６号、同第４，９２７，７６２号、同第４，５６０，６５５号、同第５，１２２，４６９号、同第６，０４８，７２８号、同第５，６７２，５０２号、または米国特許第ＲＥ３０，９８５号に記載される多くの培地が、宿主細胞のための培養培地として使用され得る。これらの培地のいずれかは、必要により、ホルモンおよび／または他の増殖因子（インスリン、トランスフェリン、または上皮増殖因子など）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸塩など）、緩衝液（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（アデノシンおよびチミジンなど）、抗生物質（ゲンタマイシン薬など）、微量元素（マイクロモル濃度範囲の最終濃度で通常存在する無機化合物として定義される）、およびグルコースまたは同等のエネルギー源が補充されていてもよい。任意の他の必要な補充物はまた、当業者に公知であろう適切な濃度で含まれ得る。培養条件、例えば、温度、ｐＨ等は、発現のために選択された宿主細胞で以前に使用されているものであり、当業者に明らかである。
本明細書に記載されるタンパク質はまた、無細胞翻訳系を使用して産生させることができる。そのような目的のために、ポリペプチドをコードする核酸は、ｍＲＮＡを産生するようにｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写を可能にし、利用される特定の無細胞系におけるｍＲＮＡの無細胞翻訳を可能にするように改変されなければならない（哺乳動物もしくは酵母の無細胞翻訳系などの真核生物、または細菌の無細胞翻訳系などの原核生物）。
本明細書に記載されるタンパク質はまた、化学合成によって産生することができる（例えば、Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd Edition, The Pierce Chemical Co., Rockford, Ill. (1984)に記載される方法によって）。タンパク質に対する改変はまた、化学合成によって産生することができる。
本発明のタンパク質は、タンパク質化学の分野において一般に公知のタンパク質のための単離／精製方法によって精製することができる。非限定的な例としては、抽出、再結晶、塩析（例えば、硫酸アンモニウムまたは硫酸ナトリウムを用いる）、遠心分離、透析、限外濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲル濾過、ゲル浸透クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動、向流分配、またはこれらの任意の組合せが挙げられる。精製後、ポリペプチドは、異なる緩衝液に交換されてもよく、および／または限定されるものではないが、濾過および透析を含む当技術分野において公知の各種の方法のいずれかによって濃縮されてもよい。
精製されたポリペプチドは、好ましくは、少なくとも８５％純粋、または好ましくは少なくとも９５％純粋、最も好ましくは少なくとも９８％純粋である。純度の正確な数値にかかわらず、ポリペプチドは、その意図される使用のために十分純粋である。
Ｘ．使用の方法
本発明の別の態様は、例えば試料中の、抗原応答性Ｔ細胞を検出するための方法に関する。一般に、方法は、本開示の複数のｐＭＨＣコンジュゲート化多量体を提供するステップ；コンジュゲート化多量体を前記試料と接触させるステップ；および試料内の抗原応答性Ｔ細胞へのコンジュゲート化多量体の結合を検出し、それによって複数のコンジュゲート化多量体中に存在する抗原ペプチドに対するＴ細胞応答を検出するステップを含む。一実施形態では、結合は、コンジュゲート化多量体に連結されたオリゴヌクレオチドバーコードのバーコード領域を増幅することによって検出される。典型的には、ｐＭＨＣＩコンジュゲート化多量体について、抗原応答性Ｔ細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞であり、そのＴＣＲは、ペプチドが結合したＭＨＣクラスＩ分子を認識する一方、ｐＭＨＣＩＩコンジュゲート化多量体について、抗原応答性Ｔ細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞であり、そのＴＣＲは、ペプチドが結合したＭＨＣクラスＩＩ分子を認識する。
このコンジュゲート化多量体技術は、単一試料中の多数の（潜在的に＞１０００）異なる抗原特異的Ｔ細胞の検出を可能にする。技術は、例えば、Ｔ細胞エピトープマッピング、免疫認識の発見、診断検査、およびワクチン接種または免疫関連療法後の免疫反応性の測定のために使用することができる。治療的使用のために、ｐＭＨＣコンジュゲート化多量体は、治療のために、例えば養子Ｔ細胞移入療法のために投与される抗原特異的Ｔ細胞の識別および選択を可能にする。
Ａ．アッセイ
本発明の一実施形態では、ＭＨＣ多量体は、フローサイトメトリーまたはフローサイトメトリー様分析を使用する液状試料中の個々のＴ細胞の検出のために使用することができる。
液状細胞試料は、フローサイトメーターを使用して分析することができ、レーザービームがストリームを通過して、個々の細胞を検出および計数することが可能である。ＭＨＣ多量体を使用する特異的Ｔ細胞の識別のために、細胞は、細胞をＭＨＣ多量体とともにインキュベートし、次いで離された細胞のストリームを作出するノズルに、細胞を大体積の液体で強引に通すことによって、蛍光標識化ＭＨＣ多量体で染色される。各細胞はレーザービームを通過し、細胞に結合した任意の蛍光色素は励起され、それによって蛍光を発する。感受性光電子増倍管は、放たれた蛍光を検出し、細胞に結合したＭＨＣ多量体の量についての情報を提供する。この方法によって、ＭＨＣ多量体は、液状試料中の個々のＴ細胞および／または特異的Ｔ細胞集団を識別するために使用することができる。
フローサイトメトリー分析においてＭＨＣ多量体によって分析され得る細胞試料としては、限定されるものではないが、血液試料もしくはその画分、Ｔ細胞系（ハイブリドーマ、トランスフェクト細胞）およびホモジネートされた脾臓のような組織、リンパ節、腫瘍、脳、またはＴ細胞を含む任意の他の組織が挙げられる。
血液試料を分析する場合、全血は、フローサイトメーターにおける分析の前に、赤血球の溶解を伴ってまたは伴わずに、使用することができる。溶解試薬は、ＭＨＣ多量体による染色の前または後に添加することができる。赤血球を溶解せずに血液試料を分析する場合、１種または複数のゲーティング試薬を、赤血球からリンパ球を区別するために含めてもよい。好ましいゲーティング試薬は、赤血球上の表面タンパク質に特異的なマーカー分子であり、試料の残っている細胞由来のこの細胞集団の減算を可能にする。例として、蛍光色素標識化ＣＤ４５特異的マーカー分子、例えば抗体は、フローサイトメーターが赤血球と染色された白血球との間を区別することを可能にするトリガー識別物を設定するために使用することができる。
全血の分析の代替として、リンパ球は、例えばＦＩＣＯＬＬ（登録商標）－Ｈｙｐａｑｕｅ勾配のような標準手順を使用して、フローサイトメトリー分析の前に精製することができる。別の可能性は、例えば固体支持体上に固定化された抗体または他のＴ細胞特異的マーカーに試料を添加することによって、血液試料からＴ細胞を単離することである。次いで、Ｔ細胞に特異的なマーカーを、固体支持体上に付着させ、洗浄後、特異的Ｔ細胞を溶出させることができる。次いで、この精製されたＴ細胞集団は、ＭＨＣ多量体と一緒に、フローサイトメトリー分析のために使用することができる。
Ｔ細胞はまた、ロゼット形成によって、他のリンパ球または血液細胞から精製され得る。ヒトＴ細胞は、Ｅロゼット形成とも呼ばれる、ヒツジ赤血球との自発的ロゼットを形成する。Ｅロゼット形成は、リンパ球をヒツジ赤血球とともにインキュベートし、それに続いて密度勾配、例えばＦＩＣＯＬＬ（登録商標）Ｈｙｐａｑｕｅ勾配上で精製することによって行うことができる。
Ｔ細胞を能動的に単離する代わりに、Ｂ細胞、ＮＫ細胞または他の細胞集団のような所望されない細胞を、分析の前に除去することができる。所望されない細胞の除去のための好ましい方法は、固体支持体に固定化された所望されない細胞に特異的なマーカー分子またはその上の１種もしくは複数の表面タンパク質とともに試料をインキュベートすることである。例としては、所望されない細胞上の表面受容体に特異的な抗体または他のマーカー分子、例えばＣＤ１９、ＣＤ５６、ＣＤ１４、ＣＤ１５または他のものに対するマーカーでコーティングされたビーズの使用が挙げられる。簡潔には、特異的表面マーカーでコーティングされたビーズを、細胞試料に添加する。適切な表面受容体を有する所望のＴ細胞とは異なる細胞を、ビーズに結合させる。ビーズは、例えば遠心分離または磁気引き抜き（磁気ビーズを使用する場合）によって除去され、残っている細胞は、Ｔ細胞について富化されている。
別の例は、所望されない細胞に特異的な抗体または他のマーカーでコーティングされた材料を有するカラムを使用するアフィニティークロマトグラフィーである。
あるいは、特異的抗体またはマーカーは、補体と一緒に血液試料に添加され、それによって抗体またはマーカーによって認識された細胞を死滅させることができる。
さまざまなゲーティング試薬を、分析に含めることができる。ここで、ゲーティング試薬は、固有の表面タンパク質または細胞内構成要素または細胞内分泌構成要素への結合によって、細胞のサブセットを識別する標識化抗体または他の標識化マーカー分子を意味する。ＭＨＣ多量体を使用する場合の好ましいゲーティング試薬は、Ｔ細胞の主要なサブセットを識別するＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、およびＣＤ８に対する抗体およびマーカー分子である。他の好ましいゲーティング試薬は、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３７、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ５６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＣＲ７、ＣＣＲ５、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ７５、ＣＤ９４、ＣＤ９９、ＣＤ１０７ｂ、ＣＤ１０９、ＣＤ１５２、ＣＤ１５３、ＣＤ１５４、ＣＤ１６０、ＣＤ１６１、ＣＤ１７８、ＣＤｗ１９７、ＣＤｗ２１７、Ｃｄ２２９、ＣＤ２４５、ＣＤ２４７、Ｆｏｘｐ３に対する抗体およびマーカー、または異なるリンパ球、リンパ球集団もしくは他の細胞集団に固有の特異的タンパク質を認識する他の抗体もしくはマーカー分子である。インターロイキン、例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＩ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－２１；インターフェロン、例えば、ＩＮＦγ、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、または他のサイトカインもしくはケモカインに対する抗体およびマーカーも挙げられる。
ゲーティング試薬は、試料へのＭＨＣ多量体の添加の前、その後、またはそれと同時に添加することができる。ＭＨＣ多量体で標識した後、およびフローサイトメーターにおける分析の前に、染色された細胞を、固定試薬（例えば、ホルムアルデヒド、エタノールまたはメタノール）で処理して、細胞表面にＭＨＣ多量体を架橋結合させることができる。染色された細胞は、固定なしで直接分析することもできる。
フローサイトメーターは、一実施形態では、特定の細胞型を分離および収集するために用意され得る。これは、細胞選別と呼ばれる。フローサイトメーターにおける選別と組み合わされたＭＨＣ多量体は、抗原特異的Ｔ細胞集団を単離するために使用することができる。上記に記載されたゲーティング試薬は、単離されるＴ細胞集団をさらに特定化することを含み得る。次いで、単離および収集された特異的Ｔ細胞集団は、本明細書の他の場所に記載されるように、さらに操作することができる、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏで拡大することができる。
試料中のＭＨＣペプチド特異的Ｔ細胞の濃度の直接決定は、ＭＨＣ多量体および関連するゲーティング試薬で血液試料または他の細胞試料を染色すること、それに続いて公知の濃度の計数ビーズの正確な量の添加によって得ることができる。一般に、計数ビーズは、フローサイトメーターによって認識された場合に、目的の細胞の状況にそれらを置く散乱性を有する微小粒子である。それらは、抗体、蛍光色素もしくは他のマーカー分子で標識され得るか、またはそれらは未標識であり得る。一部の実施形態では、ビーズは、フローサイトメーターのほとんどのチャネルにおいて蛍光を発するポリマー中に埋め込まれた分子を有するポリスチレンビーズである。ここで、「計数ビーズ」および「微小粒子」という用語は、互換的に使用される。
使用のために好適なビーズまたは微小粒子としては、ゲルクロマトグラフィーのために使用されるもの、例えばＳＥＰＨＡＤＥＸ（登録商標）などのゲル濾過媒体が挙げられる。この選別の好適なマイクロビーズとしては、限定されるものではないが、４０～１２０μｍのビーズサイズを有するＳＥＰＨＡＤＥＸ（登録商標）Ｇ－１０（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈカタログ番号２７，１０３－９）、４０～１２０μｍのビーズサイズを有するＳＥＰＨＡＤＥＸ（登録商標）Ｇ－１５（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号２７，１０４－７）、２０～５０μｍのビーズサイズを有するＳＥＰＨＡＤＥＸ（登録商標）Ｇ－２５（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号２７，１０６－３）、２０～８０μｍのビーズサイズを有するＳＥＰＨＡＤＥＸ（登録商標）Ｇ－２５（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号２７，１０７－１）、５０～１５０μｍのビーズサイズを有するＳＥＰＨＡＤＥＸ（登録商標）Ｇ－２５（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号２７，１０９－８）、１００～３００μｍのビーズサイズを有するＳＥＰＨＡＤＥＸ（登録商標）Ｇ－２５（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号２７，１１０－１）、２０～５０μｍのビーズサイズを有するＳＥＰＨＡＤＥＸ（登録商標）Ｇ－５０（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号２７，１１２－８）、２０～８０μｍのビーズサイズを有するＳＥＰＨＡＤＥＸ（登録商標）Ｇ－５０（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号２７，１１３－６）、５０～１５０μｍのビーズサイズを有するＳＥＰＨＡＤＥＸ（登録商標）Ｇ－５０（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号２７，１１４－４）、１００～３００μｍのビーズサイズを有するＳＥＰＨＡＤＥＸ（登録商標）Ｇ－５０（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈカタログ番号２７，１１５－２）、２０～５０μｍのビーズサイズを有するＳＥＰＨＡＤＥＸ（登録商標）Ｇ－７５（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号２７，１１６－０）、４０～１２０μｍのビーズサイズを有するＳＥＰＨＡＤＥＸ（登録商標）Ｇ－７５（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号２７，１１７－９）、２０～５０μｍのビーズサイズを有するＳＥＰＨＡＤＥＸ（登録商標）Ｇ－１００（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈカタログ番号２７，１１８－７）、４０～１２０μｍのビーズサイズを有するＳＥＰＨＡＤＥＸ（登録商標）Ｇ－１００（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号２７，１１９－５）、４０～１２０μｍのビーズサイズを有するＳＥＰＨＡＤＥＸ（登録商標）Ｇ－１５０（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号２７，１２１－７）、および４０～１２０μｍのビーズサイズを有するＳＥＰＨＡＤＥＸ（登録商標）Ｇ－２００（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号２７，１２３－３）が挙げられる。
本明細書に記載される方法および組成物における使用のための他の好ましい粒子は、プラスチックマイクロビーズを含む。プラスチックマイクロビーズは通常固体であるが、それらは、内部が中空であってもよく、ベシクルおよび他のマイクロキャリアであり得る。それらは、本明細書に記載される方法において機能するために、完全な球形である必要はない。ポリスチレン、ポリアクリルアミドおよび他のラテックス材料などのプラスチック材料が、ビーズを製造するために用いられ得るが、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレンなどのような他のプラスチック材料も使用され得る。
計数ビーズは、分析される試料の正確な体積を測定するための参照集団として使用される。試料は、フローサイトメーターにおいて分析され、ＭＨＣ特異的Ｔ細胞の量は、例えば所定のゲーティング戦略を使用し、次いでこの数を同じ試料中の計数された計数ビーズの量と相関させて、決定される。
Ｔ細胞の活性化状態の同時検出と組み合わされた試料中の特異的Ｔ細胞の検出はまた、ＭＨＣ多量体と一緒に、上方調節または下方調節された表面に露出した受容体に特異的なマーカー分子を使用して、測定することができる。マーカー分子およびＭＨＣ多量体は、同じ標識または異なる標識分子で標識することができ、同時または順次または別々に試料に添加することができる。
１．顕微鏡法を使用する液状試料中の個々のＴ細胞の検出
液状試料中の個々のＴ細胞の検出のための別の好ましい方法は、顕微鏡法を使用することである。顕微鏡法は、光学、電子および走査プローブ顕微鏡法、明視野顕微鏡法、暗視野顕微鏡法、位相差顕微鏡法、微分干渉顕微鏡法、蛍光顕微鏡法、共焦点レーザー走査顕微鏡法、Ｘ線顕微鏡法、透過型電子顕微鏡法、走査型電子顕微鏡法、原子間力顕微鏡、走査トンネル顕微鏡、および光子力顕微鏡を含む任意の種類の顕微鏡法を含む。これは、以下の通り行うことができる：Ｔ細胞の懸濁液をＭＨＣ多量体に添加し、試料を洗浄し、次いで各細胞に結合したＭＨＣ多量体の量を測定する。結合したＭＨＣ多量体は、直接標識されてもよく、または標識化マーカー分子の添加により測定されてもよい。次いで、試料は、スライド上に、または同様に個々の細胞を区別することができる薄層上に広げられ、標識化細胞は、顕微鏡を使用して識別される。標識の種類に応じて、異なる種類の顕微鏡が使用され得る、例えば、蛍光標識が使用される場合、蛍光顕微鏡が分析のために使用される。例えば、ＭＨＣ多量体は、蛍光色素で標識され得るか、または結合したＭＨＣ多量体は、蛍光抗体で検出され得る。次いで、結合した蛍光ＭＨＣ多量体を有する細胞は、例えば免疫蛍光顕微鏡または共焦点蛍光顕微鏡を使用して、可視化することができる。
２．免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）
ＩＨＣは、ＭＨＣ多量体を、例えば固形組織の切片中で、特異的Ｔ細胞を直接検出するために使用することができる方法である。一部の実施形態では、固定または凍結組織試料の切片を、ＭＨＣ多量体とともにインキュベートして、ＭＨＣ多量体を組織中の特異的Ｔ細胞に結合させる。ＭＨＣ多量体は、蛍光色素、発色団、または検出することができる任意の他の標識分子で標識され得る。ＭＨＣ多量体の標識化は、直接、または第２のマーカー分子を通してであり得る。例として、ＭＨＣ多量体は、例えば二次抗体によって認識され得るタグで標識され得、必要に応じて、ＨＲＰまたは別の標識で標識され得る。次いで、結合したＭＨＣ多量体は、その蛍光もしくは吸光度（フルオロフォアまたは発色団について）によって、またはこのタグもしくはＭＨＣ多量体の別の構成要素（例えば、タンパク質鎖の１つ、１つまたは複数の多量体化ドメイン上の標識）に対する酵素標識化抗体の添加によって、検出される。酵素は、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）またはアルカリホスファターゼ（ＡＰ）であり得、これらは両方とも、ｉｎ ｓｉｔｕで無色物質を着色反応産物に変換する。この着色した沈殿物は、ＭＨＣ多量体の結合部位を識別し、例えば光学顕微鏡下で可視化することができる。ＭＨＣ多量体はまた、例えばＨＲＰまたはＡＰで直接標識することができ、追加の抗体なしでＩＨＣにおいて使用することができる。
一部の実施形態では、固形組織中のＴ細胞の検出は、組織切片が染色の前に作製され、ホルマリン中で固定される、パラフィンに包埋された組織の使用を含む。抗体は、ホルマリン固定組織切片の染色のために使用される標準的な試薬であり、これらの抗体は、多くの場合、線状エピトープを認識する。対照的に、ほとんどのＭＨＣ多量体は、ＴＣＲ上の立体構造エピトープを認識すると予想される。この場合では、ＴＣＲの天然の構造は、固定組織中で少なくとも部分的に保存されている必要がある。
他の実施形態では、染色は、凍結組織ブロックからの組織切片で行われた。この種類の染色では、固定は、ＭＨＣ多量体染色の後に行われる。
３．免疫蛍光顕微鏡法
一部の実施形態では、ＭＨＣ多量体は、固形組織の切片中の特異的Ｔ細胞を識別するために使用することができる。酵素反応による結合したＭＨＣ多量体の可視化の代わりに、ＭＨＣ多量体は、蛍光色素で標識されるか、または結合したＭＨＣ多量体は、蛍光抗体によって検出される。結合した蛍光ＭＨＣ多量体を有する細胞は、免疫蛍光顕微鏡または共焦点蛍光顕微鏡において可視化することができる。この方法は、本明細書の他の箇所に記載される液状試料中のＴ細胞の検出のために記載される原理を使用する液状試料中のＴ細胞の検出のために使用することもできる。
４．ｉｎ ｖｉｖｏでの固形組織中のＴ細胞の検出
ＭＨＣ多量体はまた、ｉｎ ｖｉｖｏでの固形組織中のＴ細胞の検出のために使用され得る。Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ検出のために、標識化ＭＨＣ多量体は、調査される個体の身体に注射される。ＭＨＣ多量体は、例えば常磁性同位元素で標識されていてもよい。磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）スキャナーまたは電子スピン共鳴（ＥＳＲ）スキャナーを使用して、次いで、Ｔ細胞に結合するＭＨＣ多量体を測定および局在化することができる。一般に、診断的イメージングの可視化のための任意の従来の方法を利用することができる。通常、ガンマおよび陽電子放出放射性同位元素が、ＭＲＩのためのカメラおよび常磁性同位元素のために使用される。
５．固体支持体上に固定化されたＴ細胞の検出
いくつかの適用では、固体または半固体支持体上にＴ細胞を固定化することが有利であり得る。そのような支持体は、固定化、分離などのために適している任意のものであり得る。非限定的な例としては、粒子、ビーズ、生分解性粒子、シート、ゲル、フィルター、膜（例えば、ナイロン膜）、繊維、毛細管、針、マイクロタイターストリップ、管、プレートもしくはウェル、コーム、ピペットチップ、マイクロアレイ、チップ、スライド、または実際に任意の固体表面材料が挙げられる。固体または半固体支持体は、これが所望される場合、標識されていてもよい。支持体はまた、散乱特性またはサイズを有していてもよく、これは、同じ性質、例えば異なるサイズもしくは散乱特性、色または強度の粒子の支持体の中での区別を可能にする。
ＭＨＣ多量体を固定化されたＴ細胞の検出のために使用することができる方法の例は、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）である。ＥＬＩＳＡは、抗体－抗原相互作用の検出のために最初は使用された結合アッセイである。検出は、酵素反応に基づき、通常使用される酵素は、例えば、ＨＲＰおよびＡＰである。ＭＨＣ多量体は、精製されたＴＣＲおよびマイクロタイタープレートのウェルに固定化されたＴ細胞の分析のためのＥＬＩＳＡに基づくアッセイにおいて使用することができる。結合したＭＨＣ多量体は、ＭＨＣ多量体（例えば、１つまたは複数の多量体化ドメインまたはＭＨＣタンパク質）への例えばＨＲＰまたはＡＰの直接化学的カップリングによって、あるいは例えばＭＨＣ多量体に結合するＨＲＰもしくはＡＰカップリング抗体または他のマーカー分子によってのいずれかで標識され得る。次いで、酵素標識の検出は、ＨＲＰまたはＡＰ酵素によって検出可能産物（例えば、着色した）に変えられる基質（例えば、無色）の添加によってである。
固体支持体は、例えば、ガラス、シリカ、ラテックス、プラスチック、または任意のポリマー材料製であり得る。支持体はまた、生分解性材料から作られていてもよい。一般的に言えば、支持体の性質は重要ではなく、各種の材料が使用され得る。支持体の表面は、疎水性または親水性であり得る。非磁気ポリマービーズも適用可能であり得る。そのようなものは、広範囲の製造業者、例えば、Ｄｙｎａｌ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ＡＳ、Ｑｉａｇｅｎ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓｅｒｏｔｅｃ、Ｓｅｒａｄｙｎｅ、Ｍｅｒｃｋ、Ｎｉｐｐｏｎ Ｐａｉｎｔ、Ｃｈｅｍａｇｅｎ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｐｒｏｌａｂｏ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ａｇｏｗａ、およびＢａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手可能である。
好適な支持体の別の例は、磁気ビーズまたは粒子である。「磁気」という用語は、本明細書のいずれの箇所においても使用される場合、支持体が、磁場に置かれた場合にそれに付与される磁気モーメントを有することができ、したがって、その磁場の作用下で動くことが可能であることを意味することが意図される。言い換えれば、磁気ビーズまたは粒子を含む支持体は、磁気凝集によって容易に除去され得、これは、ビーズまたは粒子を溶液から、迅速に、簡便かつ効率的に分離する方法を提供する。磁気ビーズおよび粒子は、好適には、常磁性または超常磁性であり得る。超常磁性ビーズおよび粒子は、例えば、ＥＰ０１０６８７３号に記載されている。磁気ビーズおよび粒子は、いくつかの製造業者、例えば、Ｄｙｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＳＡ（Ｏｓｌｏ、Ｎｏｒｗａｙ、以前はＤｙｎａｌ ＡＳ、例えばＤＹＮＡＢＥＡＤＳ．ＲＴＭ．）から入手可能である。
６．マイクロチップＭＨＣ多量体技術
ＭＨＣ多量体のマイクロアレイを、固体支持体上の異なるＭＨＣ多量体の固定化によって形成して、その位置が、この位置に固定化されたＭＨＣ－ペプチド複合体または特異的な空のＭＨＣの識別を特定化する空間配列を形成することができる。標識化細胞が、マイクロアレイ（例えば、血液細胞）上を通過すると、マイクロアレイ中のＭＨＣ多量体に特異的なＴＣＲを持つ細胞が固定化される。したがって、標識は、マイクロアレイの特定の領域に位置し、これは、細胞に結合するＭＨＣ多量体の識別を可能にし、したがって、固定化されたＭＨＣ多量体に対する認識特異性を有する例えばＴ細胞の識別を可能にする。あるいは、細胞は、それらがＭＨＣ多量体に結合した後に標識され得る。標識は、ＭＨＣ多量体に結合すると予想される細胞型に特異的であり得るか、または標識は、一般に細胞を染色し得る（例えば、ＤＮＡに結合する標識）。あるいは、サイトカイン捕捉抗体を、固体支持体上のＭＨＣと一緒に同時スポットすることができ、結合した抗原特異的Ｔ細胞からのサイトカイン分泌を分析することができる。これは、特異的ＭＨＣ－ペプチド複合体を認識および結合すると、Ｔ細胞がサイトカインを分泌するように刺激するためである可能性がある。
７．ｐＭＨＣ多量体を使用するＴ細胞の間接的検出
試料中のＴ細胞はまた、ＭＨＣ多量体を使用して、間接的に検出されてもよい。間接的検出では、Ｔ細胞の数または活性は、ＴＣＲ－ＭＨＣ－ペプチド複合体相互作用の結果である事象の検出によって測定される。ＭＨＣ多量体とＴ細胞との間の相互作用は、Ｔ細胞を刺激し、Ｔ細胞集団の細胞分裂および増殖においてＴ細胞の活性化をもたらし、または代わりに、Ｔ細胞の不活性化をもたらす。これらのメカニズムのすべては、これらの事象を検出することが可能な検出方法を使用して測定することができる。
活性化の測定の例としては、特異的な可溶性因子、例えば、フローサイトメトリーによるセクションに記載されるような、フローサイトメトリーを使用して測定することができるサイトカインの分泌の測定、活性化マーカーの発現の測定、例えばフローサイトメトリーおよび／またはＥＬＩＳＡ様の方法による、例えば、ＣＤ２７およびＣＤ２８、ならびに／または他の受容体の発現の測定、ならびにＴ細胞エフェクター機能、例えば、当業者に公知のクロム放出アッセイのような細胞傷害性アッセイにおいて測定することができるＣＤ８ Ｔ細胞傷害性の測定が挙げられる。
増殖の測定の例としては、限定されるものではないが、ｍＲＮＡの測定、チミジンの組み込みまたはブロモ－２’－デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）のような他の分子の組み込みの測定が挙げられる。
Ｔ細胞の不活性化の測定の例としては、限定されるものではないが、特異的ＴＣＲの遮断の効果の測定、およびアポトーシスの測定が挙げられる。
Ｔ細胞の多様な集団と接触する場合、例えば対象の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）の試料中に含有される場合、試料中のＴ細胞によって認識されるｐＭＨＣを含有するこれらの四量体は、マッチしたＴ細胞に結合する。反応の内容物は、蛍光フローサイトメトリーを使用して分析されて、それらに結合したＭＨＣ四量体を有するＴ細胞が決定、定量化および／または単離される。
Ｂ．スクリーニング
本開示のコンジュゲート化多量体は、各種の異なるスクリーニングアッセイにおいて使用することができる。例えば、一実施形態では、１つまたは複数の抗原に由来する蛍光標識化ペプチドのライブラリーは、プレースホルダペプチドの放出および抗原由来ペプチドの結合を誘導する条件下でプレースホルダペプチドを含むｐＭＨＣ多量体に適用される。ペプチド交換は、蛍光偏光アッセイによってモニターされる。プレースホルダペプチドの使用は、生理学的条件下で空のペプチド－受容可能ＭＨＣ多量体の生成を可能にする。このスクリーニング手法は、ＭＨＣ分子に結合するペプチドリガンドを識別するために使用することができる。ペプチド交換反応は、マルチウェルフォーマットで、天然の条件下で行うことができる。結合は、ＭＨＣ構造の安定性をモニターするＥＬＩＳＡなどのいくつかの技法によって、または蛍光偏光などのペプチド結合をモニターする生物物理学的技法によって決定することができる。このスクリーニング手法は、ＭＨＣリガンドについてのペプチドセット（病原体ゲノム、腫瘍関連抗原または自己免疫抗原に由来するものなど）を精査するために使用することもできる。
本明細書に開示されるｐＭＨＣコンジュゲート化多量体およびそのライブラリーは、免疫細胞受容体への抗原特異的結合の便利な検出および定量化を可能にするいくつかのスクリーニング方法において使用することができる。そのようなコンジュゲート化多量体ライブラリーは、例えば、所与の抗原に特異的なＴ細胞の検出、所与の試料におけるＴ細胞特異性のマルチプレックス検出、特異性とのＴＣＲ配列のマッチング（例えば、単一細胞配列決定を介して）、競合的ＴＣＲ親和性決定、所与のＴＣＲのコンセンサス特異性配列の決定、または目的の配列に対するＴ細胞の抗原応答性のマッピングを可能にし得る。コンジュゲート化多量体は、特定のＭＨＣ Ｉポリペプチドに特異的な受容体を持つナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の検出において使用することもできる。
得られるｐＭＨＣコンジュゲート化多量体ライブラリーは、例えばSimon et al, Cancer Immunol Res, 2014, 2(12):1230-1244に記載される抗原反応性Ｔ細胞を決定するためのＴ細胞スクリーニングにおいて使用されてもよい。
一部の実施形態では、本開示は、ＴＣＲ発現細胞－ｐＭＨＣ対を単離するための方法であって、複数のＴＣＲ発現細胞を本明細書に記載されるｐＭＨＣ多量体ライブラリーと接触させるステップ、複数のコンパートメントを生成するステップであって、複数のコンパートメントがライブラリーのｐＭＨＣに結合した複数のＴＣＲ発現細胞のうちの１つのＴＣＲ発現細胞を含み、それによってコンパートメント中のＴＣＲ発現細胞－ｐＭＨＣ対を単離する、ステップを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、ＴＣＲ発現細胞は、Ｔ細胞、例えば、ｐＭＨＣＩ多量体ライブラリーを使用する場合にはＣＤ８＋Ｔ細胞、またはｐＭＨＣＩＩ多量体ライブラリーを使用する場合にはＣＤ４＋Ｔ細胞である。一部の実施形態では、細胞は、ＴＣＲを発現するように、トランスフェクトまたは形質導入され得る。一部の実施形態では、非リンパ球細胞は、ＴＣＲを発現するように、トランスフェクトまたは形質導入され得る。
Ｃ．識別する方法
本開示のｐＭＨＣコンジュゲート化多量体は、例えばｐＭＨＣＩコンジュゲート化多量体のライブラリーにより複数のＴ細胞をスクリーニングすることによって、目的の抗原特異的Ｔ細胞を識別するために使用することができる。さまざまな実施形態では、ライブラリーは、１０より多く、１００より多く、５００より多く、１０００、２，０００より多く、５，０００より多く、１０，０００より多く、１０６より多く、１０７より多く、１０８より多く、１０９より多く、または１０１０より多くの多様な固有のペプチドロードｐＭＨＣコンジュゲート化多量体を含む。識別手法は、単一コンパートメント中にライブラリーのｐＭＨＣコンジュゲート化多量体に結合した複数の細胞のうちの１つの細胞をコンパートメント化することを含み得、ここで、ｐＭＨＣコンジュゲート化多量体は、固有の識別子を含み、コンパートメント化細胞に結合した各ｐＭＨＣコンジュゲート化多量体についての固有の識別子を決定する。コンパートメントは、別々の空間、例えば、ウェル、プレート、分割された境界、位相シフト、容器、ベシクル、細胞などであり得る。
一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法は、ＴＣＲに結合する複数のペプチドを識別するために使用することができる。一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法は、ｐＭＨＣと結合する複数のＴＣＲを識別するために使用することができる。一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法は、複数のｐＭＨＣと結合する複数のＴＣＲ（例えば、病原体ライブラリー、がんライブラリー、または自己免疫ライブラリーに由来するｐＭＨＣ多量体に結合する複数のＴＣＲ）を識別するために使用することができる。
一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法は、ＴＣＲ抗原特異性を識別するために使用される。
一部の実施形態では、選択されたＴ細胞上のＴＣＲの識別は、配列決定（例えば、ＴＣＲの可変領域、超可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列決定）によって決定される。一部の実施形態では、ＴＣＲに結合する結合したｐＭＨＣのペプチドの識別は、配列決定によって（例えば、本明細書に開示される識別子を使用して）決定される。
一実施形態では、本開示のｐＭＨＣコンジュゲート化多量体は、フローサイトメトリーによる抗原特異的Ｔ細胞の検出のために使用することができ、またはＴ細胞精製のために使用することができる。本開示の組成物および方法は、ｐＭＨＣＩ多量体を使用する場合に細胞傷害性Ｔ細胞（すなわち、ＣＤ８＋Ｔ細胞）抗原、およびｐＭＨＣＩＩ多量体を使用する場合にヘルパーＴ細胞（すなわち、ＣＤ４＋Ｔ細胞）抗原の迅速な識別に十分に適している、ペプチドロードＭＨＣ多量体の非常に大きなコレクションの産生を可能にする。
一実施形態では、固体表面に付着されるｐＭＨＣコンジュゲート化多量体は、Ｔ細胞機能を精査するために使用することができる。固体表面に固定されたペプチド－ＭＨＣ抗原性複合体は、ＴＣＲを通してＴ細胞活性を刺激するように機能して、それによってＴＣＲ刺激の後、下流のＴ細胞機能の研究を可能にし得る。
一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法は、識別されたＭＨＣ結合性ペプチド中のどのような突然変異がＴＣＲ結合に影響を及ぼすかを決定するために使用される。一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法は、ＴＣＲ結合親和性の増強または低減をもたらす識別されたＭＨＣ結合性ペプチド中の突然変異を識別するために使用される。一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法は、ＴＣＲ結合親和性を保持する識別されたＭＨＣ結合性ペプチド中の突然変異を識別するために使用される。一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法は、ＴＣＲ結合親和性の喪失をもたらす識別されたＭＨＣ結合性ペプチド中の突然変異を識別するために使用される。
一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法は、本明細書に記載される方法を使用して識別されたＴＣＲ中のどのような突然変異がペプチドエピトープの結合を変更するかを決定するために使用される。一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法は、ペプチドエピトープに対する結合親和性の減少または増加をもたらすＴＣＲ中の突然変異を識別するために使用される。一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法は、ペプチドエピトープの結合を保持するＴＣＲ中の突然変異を識別するために使用することができる。一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法は、ペプチドエピトープの結合の喪失をもたらすＴＣＲ中の突然変異を識別するために使用することができる。
一部の実施形態では、本明細書に開示される方法は、複数の対象由来のＴ細胞において行われる。一部の実施形態では、多数の対象からのデータの分析は、多数の対象によって認識されるＭＨＣ結合性ペプチドエピトープの識別を可能にする。一部の実施形態では、多数の対象からのデータの分析は、多数のＴＣＲクローン型によって認識されるＭＨＣ結合性ペプチドエピトープの識別を可能にする。一部の実施形態では、多数の対象からのデータの分析は、多数の患者、例えば、多数のがん患者、自己免疫状態を有する多数の患者、または病原体に対する防御免疫を有する多数の患者によって認識されるＭＨＣ結合性ペプチドエピトープの識別を可能にする。一部の実施形態では、多数の対象からのデータの分析は、異なるＨＬＡ型または対立遺伝子を含む対象において認識されるＭＨＣ結合性ペプチドエピトープの識別を可能にする。一部の実施形態では、多数の対象からのデータの分析は、収束性の抗原結合を示すＴＣＲの別個の超可変領域または相補性決定領域の配列の識別を可能にする。
一部の実施形態では、本明細書に開示される方法は、複数のライブラリーを使用して行われる。一部の実施形態では、多数のライブラリーからのデータの分析は、ライブラリー、例えば、病原体の多数の株、多数のがんの型、多数のがん患者、多数の自己免疫疾患、または多数の自己免疫状態に存在するＴＣＲ親和性を示す抗原の間の共有される反応性ＭＨＣ結合性ペプチドエピトープの識別を可能にする。一部の実施形態では、多数のライブラリーからのデータの分析は、ライブラリー、例えば、病原体株、がん、状態、または患者のサブセットに存在する抗原の中での別個の反応性ＨＭＣＩ結合性ペプチドエピトープの識別を可能にする。
一部の実施形態では、本開示のｐＭＨＣコンジュゲート化多量体ライブラリーを使用して識別されたＴ細胞は、遺伝子発現分析（例えば、ＲＮＡ－ｓｅｑ、ｑＰＣＲ）に付される。一部の実施形態では、遺伝子発現分析は、本開示のライブラリー中のペプチドに対して特異性を示す受容体を持つとして識別された細胞において実施される。例えば、病原体ライブラリー、がんライブラリー、または自己免疫ライブラリーに由来するｐＭＨＣコンジュゲート化多量体に結合するＴＣＲを発現することが決定された細胞が、遺伝子発現分析に付される。遺伝子発現分析は、包括的であり得るか、または標的化され得る。発現について分析される遺伝子としては、限定されるものではないが、公知の機能を有する遺伝子、免疫エフェクター分子（例えば、パーフォリン、グランザイム、サイトカイン、ケモカイン）、免疫チェックポイント分子、炎症促進性分子、抗炎症性分子、系列マーカー、インテグリン、セレクチン、リンパ球メモリーマーカー、死受容体、カスパーゼ、細胞周期チェックポイント分子、酵素、ホスファターゼ、キナーゼ、リパーゼをコードする遺伝子、および代謝関連遺伝子が挙げられる。
一部の実施形態では、遺伝子発現分析は、ｐＭＨＣコンジュゲート化多量体ライブラリースクリーニングとともに実施することができる。一部の実施形態では、遺伝子発現分析は、ｐＭＨＣコンジュゲート化多量体ライブラリースクリーニング結果の分析後に実施することができる。一部の実施形態では、遺伝子発現分析は、ｐＭＨＣコンジュゲート化多量体ライブラリースクリーニング結果の分析前に実施することができる。一部の実施形態では、遺伝子発現分析は、本明細書に記載される方法を使用して産生されたｐＭＨＣ－Ｔ細胞受容体の対形成から目的の細胞として識別された細胞の免疫タイピングを可能にする。
本明細書に記載される方法および組成物は、スクリーニングアッセイのために使用することができる。例えば、本明細書に記載される複数のｐＭＨＣコンジュゲート化多量体を含むライブラリーは、Ｔ細胞試料と接触され、限定されるものではないが、Ｔ細胞増殖、Ｔ細胞傷害性、Ｔ細胞増殖の抑制、Ｔ細胞による抑制、およびＴ細胞のサイトカイン産生を含む１つまたは複数のＴ細胞機能が決定される。
一部の実施形態では、次いで、機能的特性を誘導することができるｐＭＨＣコンジュゲート化多量体は、ペプチドライブラリーサブセットにすることができる。例えば、ライブラリーサブセットは、ＴＣＲへの結合の際にＴ細胞の増殖を、ＴＣＲへの結合の際に細胞傷害性を、ＴＣＲへの結合の際にＴ細胞抑制を、ＴＣＲへの結合の際にＴ細胞による抑制を、ＴＣＲへの結合の際にサイトカイン産生を、またはこれらの任意の組合せを誘導するｐＭＨＣコンジュゲート化多量体を含むことができる。増殖は、例えば、色素希釈アッセイ（例えば、ＣＦＳＥ希釈アッセイ）、またはＤＮＡ複製の定量化（例えば、ＢｒｄＵ組み込みアッセイ）によって決定することができる。細胞傷害性は、例えば、死細胞による細胞内酵素の放出（例えば、乳酸デヒドロゲナーゼ）、色素排除アッセイ（例えば、ヨウ化プロピジウム）、またはフローサイトメトリーもしくはｑＰＣＲによる細胞傷害性マーカー（例えば、グランザイム、ＣＤ１０７ａ）の発現に基づくアッセイによって決定することができる。サイトカイン産生は、例えば、ＥＬＩＳＡ、マルチプレックスイムノアッセイ、細胞内サイトカイン染色、ＥＬＩＳＰＯＴ、ウエスタンブロット、またはｑＰＣＲによって決定することができる。Ｔ細胞抑制は、例えば、Ｔ細胞クローンをエフェクター細胞および標的抗原とともに共培養し、増殖、細胞傷害性、サイトカイン産生、活性化マーカーの発現などを測定することによって決定することができる。
一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法は、防御免疫、非防御免疫、または自己免疫に関連する抗原特異的Ｔ細胞エフェクタークローンを識別するために使用される。一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法は、アネルギー、消耗、寛容原性特性、自己免疫特性、炎症特性、または抗炎症性特性（例えば、Ｔｒｅｇ）を示す抗原特異的Ｔ細胞エフェクタークローンを識別するために使用される。一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法は、ある特定のエフェクターまたはメモリー特性（例えば、ナイーブ、ターミナルエフェクター、エフェクターメモリー、セントラルメモリー、レジデントメモリー、ＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ１７、ＴＨ９、ＴＣ１、ＴＣ２、ＴＣ１７、ある特定のサイトカインの産生）を示す抗原特異的Ｔ細胞エフェクタークローンを識別するために使用される。
一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法を使用して識別されたＴＣＲは、治療的介入の一部として使用される。例えば、ＴＣＲ配列、ＴＣＲ可変領域配列、またはＣＤＲ配列は、同じ抗原特異性の改変Ｔ細胞を生成するために、Ｔ細胞にトランスフェクトまたは形質導入され得る。改変Ｔ細胞は、拡大され、所望のエフェクター表現型（例えば、ＴＨ１、ＴＣ１、Ｔｒｅｇ）に極性化され、対象に注入され得る。一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法を使用して識別された多数のＴＣＲは、オリゴクローナル療法において使用される。
一部の実施形態では、本明細書に開示される方法を使用して識別されたペプチド、リガンド、アゴニスト、アンタゴニスト、抗原、またはエピトープは、治療的介入の一部として使用される。一部の実施形態では、ペプチド、抗原、またはエピトープは、例えば、抗原提示細胞、人工抗原提示細胞、固定化されたペプチド、または可溶性ペプチドを使用して、ｅｘ ｖｉｖｏで細胞の集団を拡大するために使用される。一部の実施形態では、拡大された細胞が患者に注入される。一部の実施形態では、末梢血リンパ球が拡大される。一部の実施形態では、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）が拡大される。一部の実施形態では、ＴＨ１細胞が拡大される。一部の実施形態では、細胞傷害性Ｔリンパ球が拡大される。一部の実施形態では、調節性Ｔ細胞が拡大される。
一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法は、ワクチン、例えば、サブユニットワクチン、ある範囲の防御抗原に対する適用範囲を誘発するワクチン、またはユニバーサルワクチンの開発における使用のためのＭＨＣ結合性抗原ペプチドを識別するために使用される。
一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法は、病状の診断のために使用することができる。一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法は、臨床的判断、例えば、処置の選択、予後因子の識別、処置応答もしくは疾患の進行のモニタリング、または予防的手段の実施を導くために使用される。
一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法は、病状に対する処置の選択および／または設計において、特に、養子移入Ｔ細胞療法における使用のための抗原特異的Ｔ細胞（例えば、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞および／またはＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞）またはそれらに由来するＴＣＲの選択において使用することができる。例えば、ｐＭＨＣコンジュゲート化多量体は、目的の抗原、例えば、がん抗原または病原体抗原と反応する患者試料内のＴ細胞を識別して、それによってｉｎ ｖｉｔｒｏでの拡大のためにこれらの細胞を選択し、それに続いて患者に再導入するために使用することができる。また、そのような抗原特異的Ｔ細胞から識別されたＴＣＲは、配列決定され得、患者における治療目的の抗原に結合するＴＣＲを発現する細胞の集団を増加させるためにＴ細胞に組換え的に導入され得る。
ＸＩ．組成物およびキット
別の態様では、本開示は、本明細書に記載される方法における使用のための組成物およびキットを含む。一実施形態では、本開示は、ｐＭＨＣコンジュゲーション多量体組成物を提供する。一実施形態では、ｐＭＨＣコンジュゲーション多量体は、ｐＭＨＣコンジュゲーション四量体である。一実施形態では、四量体の多量体化ドメインは、ストレプトアビジンまたはアビジンである。一実施形態では、ｐＭＨＣコンジュゲーション四量体は、ストレプトアビジンまたはアビジンのビオチン結合部位以外の部位でストレプトアビジンまたはアビジン分子に共有結合的にコンジュゲートされた４つのＭＨＣ単量体を含む。一実施形態では、４つのＭＨＣ単量体は、ＭＨＣ結合性ペプチドをそれぞれ含み（すなわち、それがロードされており）、ここで、各単量体は、同じＭＨＣ結合性ペプチドを含む。一実施形態では、ＭＨＣコンジュゲーション四量体は、ストレプトアビジンまたはビオチンのビオチン結合部位に結合したビオチン化オリゴヌクレオチドバーコードをさらに含む。一実施形態では、ｐＭＨＣコンジュゲーション多量体（例えば、四量体）は、ｐＭＨＣクラスＩコンジュゲーション多量体（例えば、四量体）である。別の実施形態では、ｐＭＨＣコンジュゲーション多量体（例えば、四量体）は、ｐＭＨＣクラスＩＩコンジュゲーション多量体（例えば、四量体）である。
一実施形態では、本開示は、複数のｐＭＨＣコンジュゲーション多量体組成物を含むキットを含む。一実施形態では、複数のｐＭＨＣコンジュゲーション多量体の各ｐＭＨＣコンジュゲーション多量体は、ｐＭＨＣコンジュゲーション四量体である。一実施形態では、各四量体の多量体化ドメインは、ストレプトアビジンまたはアビジンである。一実施形態では、各ＭＨＣコンジュゲーション四量体は、ストレプトアビジンまたはアビジンのビオチン結合部位以外の部位でストレプトアビジンまたはアビジン分子に共有結合的にコンジュゲートされた４つのＭＨＣ単量体を含む。一実施形態では、４つのＭＨＣ単量体は、ＭＨＣ結合性ペプチドをそれぞれ含み、ここで、各単一四量体内の各ＭＨＣ単量体は、同じＭＨＣ結合性ペプチドを含み（すなわち、それがロードされており）、複数のコンジュゲーション四量体内の各ＭＨＣコンジュゲーション四量体は、異なるＭＨＣ結合性ペプチドを含み（すなわち、それがロードされており）、それによってＭＨＣ結合性ペプチドのライブラリーが形成される。一実施形態では、複数のＭＨＣコンジュゲーション四量体内の各ＭＨＣコンジュゲーション四量体は、ストレプトアビジンまたはビオチンのビオチン結合部位に結合したビオチン化オリゴヌクレオチドバーコードをさらに含む。一実施形態では、複数のｐＭＨＣコンジュゲート多量体（例えば、四量体）の各ｐＭＨＣコンジュゲート多量体は、ｐＭＨＣクラスＩコンジュゲーション多量体（例えば、四量体）である。別実施形態では、複数のｐＭＨＣコンジュゲート多量体（例えば、四量体）内の各ｐＭＨＣコンジュゲート多量体は、ｐＭＨＣクラスＩＩコンジュゲーション多量体（例えば、四量体）である。
下記は、本発明を行うための具体的な実施形態の例である。この例は、例示的な目的のためにのみ提供され、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
本発明の実施は、他に指示されない限り、当業者の技能内のタンパク質化学、生化学、組換えＤＮＡ技法、および薬理学の従来の方法を用いる。そのような技法は、文献において完全に説明されている。例えば、T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993)；A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., current addition)；Sambrook, et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989)；Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.)；Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990)；Carey and Sundberg Advanced Organic Chemistry 3rd Ed. (Plenum Press) Vols A and B (l992)を参照されたい。
他に述べられない限り、すべての試薬および化学物質は、商業的供給源から入手し、さらなる精製なしで使用した。
（実施例１）
ソルターゼタグを有する交換可能ペプチドＭＨＣクラスＩ多量体の生成
この実施例では、ＭＨＣ Ｉ重鎖を、発現させ、β２－ミクログロブリン（β２ｍ）および交換可能ペプチドと複合体化し、その結果、ＭＨＣ重鎖は、ストレプトアビジン（ＳＡｖ）と翻訳後カップリングして、バーコード化可能な交換可能ＭＨＣ Ｉ四量体を形成することが可能なＣ末端ソルターゼタグを含有する。ＭＨＣ Ｉ重鎖およびＳＡｖは、Ｃ末端ソルターゼタグ（そのアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号１および３に示される）とともに発現される。次いで、ソルターゼ酵素（配列番号６に示されるアミノ酸配列を有する）を使用して、ＧＧＧ－ＸクリックハンドルペプチドをＭＨＣ ＩにまたはＧＧＧ－ＹクリックハンドルペプチドをＳＡｖにコンジュゲートさせ、ここで、クリックハンドルペプチドは、アルキン（Ｘ）もしくはアジド（Ｙ）、またはその逆などのクリック部分を含有する。次いで、銅支援アルキン－アジド環化付加または無銅アルキン－アジド環化付加によるその後のＳＡｖへのＭＨＣ Ｉの化学的コンジュゲーションは、交換可能ペプチドロードＭＨＣ Ｉ四量体をもたらす。
ＨＬＡおよびβ２ｍ発現および再フォールディング。本明細書でＨＬＡ－Ａ２－Ｓｏｒｔｔａｇと称される、Ｓｏｒｔｔａｇ（Ｃ末端ソルターゼタグ、６×Ｈｉｓタグを含有する）に連結されたＨＬＡ－Ａ＊０２：０１（そのアミノ酸配列は配列番号１に示される）およびβ２ｍ（そのアミノ酸配列は配列番号２に示される）をコードする細菌発現プラスミドを生成した。ＨＬＡ－Ａ２－Ｓｏｒｔｔａｇおよびβ２ｍを、Ｅ．Ｃｏｌｉにおいて、封入体中で発現させた。封入体を、精製し、ＨＬＡ－Ａ２－Ｓｏｒｔｔａｇについて１ｍＭもしくは０．１ｍＭのＤＴＴ、またはβ２ｍについて０．１ｍＭのＤＴＴを含有する尿素緩衝液（２０ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ６．０、８Ｍの尿素、１０ｍＭのＥＤＴＡ）に可溶化した。ＵＶ不安定性プレースホルダペプチド（ＧＩＬＧＦＶＦＪＬ（配列番号７）、ここで、Ｊは、３－アミノ－３－（２－ニトロ）フェニルプロピオン酸である）を化学的に合成した。ＨＬＡ－Ａ２を、マイナーな改変を伴う以前に記載されたプロトコール（Garboczi, et al., PNAS, 89: 3429-3433, 1992；Rodenko, et al., Nat Protoc., 1:1120-32, 2006）に従って、β２ｍおよびプレースホルダペプチドで再フォールドさせた。簡潔には、以下の構成要素を、撹拌しながら、事前に冷却された再フォールド緩衝液（１００ｍＭのトリス、ｐＨ８．０、０．４Ｍのアルギニン－ＨＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭの還元グルタチオン、０．５ｍＭの酸化グルタチオン、０．２ｍＭのＰＭＳＦ）に、示された最終濃度で以下の順序で添加した：ペプチド（４５ｕＭ）、β２ｍ（３ｕＭ）、および次いでＨＬＡ－Ａ２－Ｓｏｒｔｔａｇ（１．５ｕＭ）可溶化封入体。再フォールド反応物を、撹拌しながら、４℃で終夜インキュベートした。翌日、β２ｍおよびＨＬＡ－Ａ２－Ｓｏｒｔｔａｇ可溶化封入体を、それぞれ、６ｕＭおよび３ｕＭの最終濃度で再フォールド反応物に添加した。４日目に、再フォールド反応物を、遠心分離とそれに続く０．２ｕＭフィルターを通す濾過によって、任意の沈殿物を清澄化した。次いで、再フォールド反応物を、１０ｋＤａのＭｉｎｉｍａｔｅ ＴＦＦカプセル（Ｐａｌｌ）を有するＭｉｎｉｍａｔｅタンジェント流濾過システム（Ｐａｌｌ）および１００００Ｄａ分子量カットオフ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を有するＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５遠心分離フィルターを使用して濃縮した。濃縮された再フォールド反応物を、ＳＥＣ緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．２、１５０ｍＭのＮａＣｌ）中で事前に平衡化されたＨｉＬｏａｄ ２６／６００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００調製グレード（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）におけるサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって精製した。単量体ＨＬＡ－Ａ２－Ｓｏｒｔｔａｇ／β２ｍ／ペプチド複合体に対応する精製画分をプールし、濃縮した。ＨＬＡ－Ａ２、β２ｍ、およびＮＬＶＰＭＶＡＴＶ（配列番号８）ペプチド（ＮＬＶと省略）の再フォールディングおよび精製のために、同様の手順を続けた。
ソルターゼを使用するＨＬＡ－Ａ２－Ｓｏｒｔｔａｇへのクリックハンドルペプチドのコンジュゲーション。ＨＬＡ－Ａ２を、トランスペプチダーゼのソルターゼを使用して、クリックハンドルペプチドで酵素的に改変した。５つの増強突然変異を含有するソルターゼ酵素（Chen, PNAS 2011 108(28) 11399-11404）（そのアミノ酸配列は配列番号６に示される）を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、（Antos, Curr Protoc Protein Sci, 2009 doi:10.1002/0471140864.ps1503s56）に従って精製した。Ｎ末端にトリグリシンとそれに続いてＰＥＧリンカー（ＰＥＧ４またはＰＥＧ５）を含有するクリックハンドルペプチドを、１）プロパルギルグリシン（ＧＧＧ－アルキン、アルキンまたはＡｌｋと称される）、２）スルホ－ＤＢＣＯ（ＧＧＧ－ＤＢＣＯまたはＤＢＣＯと称される）、または３）ピコリルアジド（ＧＧＧ－アジド、アジドまたはＡｚと称される）に合成的に連結した。Ｃ末端アミド化を有するＧＧＧ－ＰＥＧ５－アルキンペプチドは、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）によって合成された。Ｃ末端アミド化を有するＧＧＧ－ＰＥＧ４－アジドペプチドおよびＧＧＧ－ＰＥＧ４－ＤＢＣＯペプチドは、Ｃｌｉｃｋ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｔｏｏｌｓ（Ｓｃｏｔｔｓｄａｌｅ、ＡＺ）によって合成された。
ＨＬＡ－Ａ２／β２ｍ／ペプチド単量体（１００～１５０ｕＭ）、クリックハンドルペプチド（６～１０ｍＭのＧＧＧ－アルキン、ＧＧＧ－ＤＢＣＯ、またはＧＧＧ－アジド）、ソルターゼ（５～６ｕＭ）および１０ｍＭのＣａＣｌ２を混合し、４℃で最大で４時間インキュベートして、ＨＬＡ－クリックハンドル融合物を生成した。反応混合物を、上記に記載されるようにＳＥＣによって精製して、残留ソルターゼおよびクリックハンドルペプチドを除去した。単量体ＨＬＡ－クリックハンドル／β２ｍ／ペプチド複合体に対応する精製画分をプールし、濃縮した。
ＳＡｖ発現、精製、およびソルターゼを使用するＳＡｖへのクリックハンドルペプチドのコンジュゲーション。Ｃ末端ソルターゼタグおよび６×Ｈｉｓタグを含有する全長ＳＡｖ（そのアミノ酸配列は配列番号３に示される）を、標準的な方法によって、ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞において発現させた。ＳＡｖを、上記に記載されるように、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）およびＳＥＣによって、可溶性画分から精製した。ＳＡｖは、天然の四量体を形成し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにおいて安定な四量体として移動する（Waner M.J., et al., 2004, doi: 10.1529/biophysj.104.047266）。四量体ＳＡｖに対応する精製画分をプールし、濃縮した。ＳＡｖクリックハンドル融合物を、ＳＡｖ（７０～１５０ｕＭ）、クリックハンドルペプチド（３～１０ｍＭのＧＧＧ－ＤＢＣＯまたはＧＧＧ－アジド）、ソルターゼ（６ｕＭ）およびＣａＣｌ２（１０ｍＭ）を４℃で最大で４時間混合することによって生成した。反応混合物をＳＥＣによって精製して、残留ソルターゼおよびペプチドを除去し、ＳＡｖクリックハンドル融合物に対応する精製画分をプールし、濃縮した。ＳＡｖへのコンジュゲーションの程度を、未処理ＳＡｖ試料の異なる量と比べて抗６×Ｈｉｓ反応性のバンド強度の喪失の度合いを決定することによる抗Ｈｉｓウエスタンブロット解析によって評価した（図３Ａ）。
クリックされたペプチド／ＭＨＣクラスＩ－ＳＡｖ多量体の生成。クリックされたＨＬＡ－ストレプトアビジン融合物の生成を、いくつかの異なるクリックケミストリーフォーマット（例えば、Agard NJ, Prescher JA, Bertozzi CR J Am Chem Soc. 2004 Nov 24; 126(46):15046-7；およびHong, V., et al., Angew Chem Int Ed Engl. 2009 ; 48(52): 9879-9883. doi:10.1002/anie.200905087にさらに記載されるクリックケミストリー）を使用して、本明細書に記載する。ＳＡｖは、ＳＤＳ耐性四量体を形成するので、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを、反応の程度をモニターし、ＳＡｖ上のＨＬＡの価数を決定するために用いることができる（Waner M.J., et al., 2004, doi: 10.1529/biophysj.104.047266）。
１）無銅アルキン－アジド環化付加によるクリックされた多量体の形成を、ＨＬＡ－Ａ２－ＤＢＣＯ／ＮＬＶ（１５０ｕＭ）をＳＡｖ－Ａｚ（ＳＡ単量体について５０ｕＭ）と混合すること、および氷上で３時間インキュベートすることによって行った。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は、付着した１、２、３および４つのＨＬＡ分子を有する四量体ＳＡの形成を確認した（図３Ｂ）。副産物は、ＤＢＣＯとβ２ｍまたはＨＬＡ－Ａ２上のシステイン残基との所望されない副反応に寄与したことが観察された（van Geel, R, Bioconjugate Chem. 2012, 23(3): 392-398. doi.org/10.1021/bc200365k）。
２）共有結合的にコンジュゲートされた多量体ＨＬＡはまた、異なる比のＨＬＡ－Ａ２－Ａｚ／ＮＬＶおよびＳＡ－ＤＢＣＯ（３：１および２：１）を室温または氷上（示さない）で１．５～３．０時間混合することによって調製した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は、ＨＬＡ－Ａ２－ＤＢＣＯ－ＳＡｖ－Ａｚと比較して所望されない副反応産物のレベルが低減されて、四量体、三量体、二量体および単量体のＨＬＡ－Ａ２－Ａｚ－ＳＡｖ－ＤＢＣＯ種の形成を示す（図３Ｃ）。
３）共有結合的に連結されたＨＬＡ－Ａ２およびＳＡｖを生成するための追加の方法は、銅支援アルキン－アジド環化付加によるものであった。ＨＬＡ－Ａ２－Ａｌｋ－ＳＡｖ－Ａｚを、氷上、以下の反応構成要素を混合することによって生成した：ＨＬＡ－Ａ２－Ａｌｋ／ＧＩＬＧＦＶＦＪＬ（配列番号７）／β２ｍ（１００～１３０ｕＭ）、ＳＡｖ－Ａｚ（ＳＡ単量体について７０～８０ｕＭ）、硫酸銅（０．５ｍＭ）、ＢＴＴＡＡ（２．５ｍＭ）およびアスコルビン酸（５ｍＭ）。反応を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによってモニターし、４時間後、反応混合物をＳＥＣによって精製して、未反応のＨＬＡ、ＳＡｖ、および他の反応構成要素を、精製されたＨＬＡ－Ａ２－アルキン－ＳＡｖ－Ａｚ多量体から分離した。ＳＥＣ画分を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析し、大部分の四量体／三量体種に対応する画分をプールし、濃縮した。ペプチド／ＨＬＡ－Ａ２－アルキン－ＳＡｖ－Ａｚ／β２ｍ試料を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析し、これは、ボイルなし／還元なし試料について明らかな四量体および三量体種、ならびに非常に少量の単量体を示したが、ボイルおよび還元されたゲルの分析は、およそ５３ｋＤａで、ＨＬＡ－Ａ２－ＡｌｋおよびＳＡｖ－Ａｚ単量体の共有結合的連結を確認する（図３Ｄ）。変性条件下での質量分析も、ＨＬＡ－Ａ２とＳＡｖとの間のアジド－アルキン融合物の形成を確認した（示さない）。ＨＬＡ－アルキン－ＳＡｖ－Ａｚフォーマットは、図３Ｅに示されるように、ＨＬＡ－Ａ０１：０１、ＨＬＡ－Ａ＊０３：０１およびＨＬＡ－Ａ＊２４：０２についても生成した。
（実施例２）
インテインタグを有する交換可能ペプチドＭＨＣクラスＩ多量体の生成
この実施例では、Ｃ末端Ｎ－インテインタグを有するＭＨＣＩ重鎖を発現させ、Ｎ末端Ｃ－インテインタグを有するストレプトアビジン（ＳＡ）を発現させ、それに続いてインテイン媒介コンジュゲーションを行って、交換可能なペプチドロードＭＨＣ Ｉ四量体を作出する。インテインについての配列およびタンパク質をコンジュゲートするためのその使用は、例えば、Stevens, et al. J. Am. Chem. Soc., 138, 2162-2165, 2016；Shah et al. J. Am. Chem. Soc., 134, 11338-11341, 2012；およびVila-Perello et al., J. Am. Chem. Soc., 135, 286-292, 2013にさらに記載されており、それらのそれぞれの全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
ＨＬＡ－Ａ２（ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１）を、Ｃ末端でのＮｐｕ Ｎ－インテイン断片との融合物として、ＢＬ２１（ＤＥ３）において発現させた（そのアミノ酸配列は配列番号４に示される）。ストレプトアビジンを、Ｎｐｕ－Ｃ－インテイン断片およびＣ末端ＦｌａｇタグとのＮ末端融合物とともに、ＢＬ２１（ＤＥ３）において発現させた（そのアミノ酸配列は配列番号５に示される）。ＨＬＡ－Ａ２－Ｎ－インテインおよびＣ－インテイン－ＳＡｖは、細菌封入体において発現した。封入体を、単離し、尿素緩衝液（２５ｍＭのＭＥＳ、８Ｍの尿素、１０ｍＭのＥＤＴＡ、０．１ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ６．０）に可溶化した。ＨＬＡ－Ａ２－Ｎ－インテインを、β２ｍおよびＵＶ不安定性プレースホルダペプチド（ＧＩＬＧＦＶＦＪＬ（配列番号７）（ここで、Ｊは、３－アミノ－３－（２－ニトロ）フェニルプロピオン酸である）で再フォールドさせた。以下の構成要素を、実施例１に記載されるように、撹拌しながら、事前に冷却された再フォールド緩衝液に添加した。再フォールド反応物を、１００００Ｄａ ＭＷＣＯを有するＡｍｉｃｏｎ撹拌セル、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｂｉｏｍａｘ限外濾過ディスク（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、およびＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５遠心分離フィルターユニット１０，０００ＭＷＣＯ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して濃縮した。濃縮された再フォールド反応物を、ＳＥＣ緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．２、１５０ｍＭのＮａＣｌ）中で事前に平衡化されたＨｉＬｏａｄ ２６／６００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００調製グレード（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）におけるサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって精製した。単量体ＨＬＡ－Ａ２－Ｎ－インテイン／β２ｍ／ペプチド複合体に対応する精製画分をプールし、１００～２００ｕＭに濃縮した。Ｃ－インテイン－ＳＡｖを、同じ手法によって再フォールドした：簡潔には、尿素－可溶化Ｃ－インテイン－ＳＡｖを、実施例１に記載されるプロトコールに従って、事前に冷却された再フォールド緩衝液に注入し、再フォールドさせ、記載されるように、１０Ｋ ＭＷＣＯ膜を有するＡｍｉｃｏｎ撹拌セルにおいて濃縮し、上記に記載されるように、サイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。ＳＥＣ精製されたＣ－インテイン－ＳＡｖを、１００～２００ｕＭに濃縮した。
ＨＬＡ－Ａ２－Ｎ－インテイン／β２ｍ／ペプチド複合体とＣ－インテイン－ＳＡｖとの間のスプライシング反応を、ＨＬＡ－Ａ２－インテインおよびＣ－インテイン－ＳＡ構成要素の両方に、０．５ｍＭの最終濃度までトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）を添加することによって行った。すべての構成要素は、氷上で保った。四量体種の好ましい形成のために、ストレプトアビジンを、ＨＬＡ－Ａ２－インテインに対して等モル量が達成されるまで１６時間の期間にわたって、５増分で添加した。還元なし／ボイルなし条件下での反応のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は、より高次のＭＷ種の形成を示すが、ボイル／還元試料は、ＨＬＡ－Ａ２－ＳＡｖ融合物について予想されるサイズと一致する、およそ５２ｋＤａの種を示した（図４）。
（実施例３）
ビオチン化およびストレプトアビジンへのカップリングを介した交換可能ＭＨＣＩ四量体の産生
Ｃ末端Ａｖｉｔａｇを有するＨＬＡ－Ａ＊０２重鎖を、Ｅ．Ｃｏｌｉにおいて、封入体中で発現させた。Ａｖｉｔａｇのアミノ酸配列は、配列番号１６１に示される。文献の方法（Altman & Davis, Curr Protoc Immunol. 2003;Chapter 17:Unit 17.3; Rodenko et. al., Nat Protoc. 2006;1(3):1120-32）に従って、精製された封入体を、尿素に可溶化させ、ベータ－２－ミクログロブリンおよびペプチドＮＬＶＰＭＶＡＴＶ（配列番号８）または条件付けリガンドＧＩＬＧＦＶＦＪＬ（配列番号７）（ここで、Ｊは、２－ニトロフェニルアミノ酸残基である）で再フォールドさせた。次いで、重鎖、β－２－ミクログロブリンおよびペプチドを含むＳＥＣ精製されたＭＨＣ単量体を、ビオチンリガーゼを使用してビオチン化し、次いで、再びＳＥＣ精製を１回行った。ストレプトアビジンを、１０の別々のアリコート中のビオチン化ＭＨＣ単量体に添加して、ＭＨＣ単量体わたるわずかなモル過剰のビオチン部位を達成した。ペプチド交換（実施例４に記載される通り）を、ビオチン媒介ストレプトアビジン四量体、またはビオチン化ＨＬＡ単量体のいずれかにおいて実施する。後者の場合では、単量体は、交換後にストレプトアビジンで四量体化される。
（実施例４）
ジペプチドまたはＵＶ交換を介したペプチド交換
実施例１において上記に記載されるように産生されたＨＬＡ－Ａ＊０２：０１－Ａｌｋ－ＳＡｖ－Ａｚコンジュゲート化四量体、および実施例３と同様に産生されたビオチン媒介ＨＬＡ－Ａ＊０２四量体を、２つの方法のいずれかによって交換した。ジペプチド交換のために、プレースホルダペプチド（例えば、ＧＩＬＧＦＶＦＪＬ（配列番号７））がロードされた５ｕＭのＭＨＣ四量体を、３０倍過剰のＮＬＶＰＭＶＡＴＶ（配列番号８）ペプチドとともに、１０ｍＭのＧＭジペプチドの存在下または非存在下、室温で３時間インキュベートした（Saini et al., PNAS 2006;112(1):202-206）。ＵＶ交換のために、プレースホルダペプチド（ＧＩＬＧＦＶＦＪＬ（配列番号７））がロードされた２～１０ｕＭのＭＨＣ単量体または０．５～２．５ｕＭのＭＨＣ四量体を、３０～１００倍モル過剰のＮＬＶＰＭＶＡＴＶ（配列番号８）（または他のペプチド）とともに、氷上で１時間インキュベートし、それに続いて試料から２～５ｃｍを保持したランプからの３６５ｎｍのＵＶ光に３０分間曝露した。ＵＶ曝露は、交換を完了させるために、３０℃での３０分のインキュベーションに続く場合があった。ペプチド交換の効率を、示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）、ＥＬＩＳＡ、および細胞染色／フローサイトメトリーによってモニターした。
ＤＳＦのために、０．２５ｍｇ／ｍｌのＨＬＡ－Ａ＊０２四量体を、等体積の２０×Ｓｙｐｒｏ Ｏｒａｎｇｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｓ６６５０）と混合し、ｑＰＣＲ機器（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｑｕａｎｔ Ｓｔｕｄｉｏ ３）において、２５℃から９９℃まで０．０５℃の勾配に付した。溶融曲線の第１の誘導体におけるピークは、ｐＭＨＣのＴｍを示す。図５Ａにおいて見られるように、実施例１と同様に産生されたＨＬＡ－Ａ＊０２：０１－Ａｌｋ－ＳＡｖ－Ａｚコンジュゲート化四量体のＴｍは、プレースホルダＧＩＬＧＦＶＦＪＬ（配列番号７）ペプチドからＮＬＶＰＭＶＡＴＶ（配列番号８）へのＵＶ交換の際に、４０℃から６１℃にシフトする。ＵＶ交換後のＴｍは、ビオチン化単量体に交換され、それに続いて四量体化された（業界標準）か、またはビオチン媒介四量体に直接交換された、ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ（配列番号８）について観察されたＴｍと同一である（図５Ｂ）。これらのデータは、多量体状態がＵＶ交換の効率に対して影響を有さないこと、および本発明のコンジュゲート化四量体が業界標準のｐＭＨＣと同じ安定性を有することを確認する。
フローサイトメトリーのために、ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ（配列番号８）（または他のペプチド）とともに拡大された１０＾５個のドナーＴ細胞を、上記のように産生されたｐＭＨＣ四量体で染色した。すべてのｐＭＨＣを、ＰＢＳと１０％のＦＢＳに希釈し、抗ＣＤ８－ＢＶ７８５で染色し、抗Ｆｌａｇ－ＡＰＣまたは抗ストレプトアビジン－ＰＥ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を二次として使用した。図６Ａ～Ｆにおいて見られるように、ビオチン媒介四量体形態において実施されたジペプチド交換またはＵＶ交換は、業界標準の方法（ビオチン化単量体の再フォールディング後またはＵＶ交換後の四量体化）によって産生されたものと、同じレベルの拡大されたＴ細胞への結合を示すＨＬＡ－Ａ＊０２四量体を産生する。図７は、拡大されたＴ細胞に対して、ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ（配列番号８）ペプチドにＵＶ交換されたＨＬＡ－Ａ＊０２：０１－Ａｌｋ－ＳＡｖ－Ａｚコンジュゲート化四量体の高親和性結合を示す。
ＥＬＩＳＡはまた、四量体における交換をモニターするためにも使用され、ｐＭＨＣ安定性の別の指標である。最初に、プレートを抗ストレプトアビジン抗体でコーティングし、それに続いてｐＨ５．４で、クエン酸－リン酸緩衝液中で四量体の捕捉を行い、次いで、ＨＲＰコンジュゲート化抗β２－ミクログロブリン（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用して読み取った。図８Ａにおいて見られるように、ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ（配列番号８）突然変異体ペプチドのパネルは、効率的に、ある範囲のＥＬＩＳＡシグナルを生成する、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１－Ａｌｋ－ＳＡｖ－Ａｚコンジュゲート化四量体にＵＶ交換され得る。ビオチン媒介ＨＬＡ－Ａ＊０２四量体にＵＶ交換された類似のペプチドのより小さいパネルも、ある範囲のＥＬＩＳＡシグナルを生成し（図８Ｃ）、これは、ＤＳＦによって測定されたＴｍと正に相関した（図８Ｂ）。
（実施例５）
ＨＬＡ－Ａ＊０１：０１を用いて産生されたコンジュゲート化四量体
ペプチドＳＴＡＰＧＪＬＥＹ（配列番号１６）で再フォールドされたＨＬＡ－Ａ＊０１：０１単量体を、上記の実施例１に記載されるように、ＨＬＡ－Ａ＊０１：０１－Ａｌｋ－ＳＡｖ－Ａｚコンジュゲート化四量体の構築およびＱＣ’ｄのために使用した。図９Ａおよび図９Ｂにおいて見られるように、ＨＬＡ－Ａ＊０１：０１－Ａｌｋ－ＳＡｖ－Ａｚコンジュゲート化四量体は、低パーセンテージの凝集体（３％）を伴ってより高次の多量体であった。コグネイトペプチドＶＴＥＨＤＴＬＬＹ（配列番号１０）の存在下でのＵＶ処理は、有効なペプチド交換を示すＤＳＦ溶融曲線における特徴的なシフトをもたらした（図９Ｃ）。交換されたＨＬＡ－Ａ＊０１：０１－Ａｌｋ－ＳＡｖ－Ａｚコンジュゲート化四量体は、ビオチンを介してストレプトアビジンにコンジュゲートされたＶＴＥＨＤＴＬＬＹペプチド（配列番号１０）で再フォールドされたＨＬＡ－Ａ＊０１：０１と同様に、ＶＴＥＨＤＴＬＬＹペプチド（配列番号１０）とともに拡大されたＰＢＭＣに強く結合した（図９Ｄ）。予想通り、結合は、ＵＶ交換の非存在下で観察されなかった。
（実施例６）
ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２を用いて産生されたコンジュゲート化四量体
ペプチドＶＹＧＪＶＲＡＣＬ（配列番号１１）で再フォールドされたＨＬＡ－Ａ＊２４：０２単量体を、上記の実施例１に記載されるように、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２－Ａｌｋ－ＳＡｖ－Ａｚコンジュゲート化四量体の構築およびＱＣ’ｄのために使用した。図１０Ａおよび図１０Ｂにおいて見られるように、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２－Ａｌｋ－ＳＡｖ－Ａｚコンジュゲート化四量体は、低パーセンテージの凝集体（６％）を伴ってより高次の多量体であった。コグネイトペプチドＱＹＤＰＶＡＡＬＦ（配列番号１２）の存在下でのＵＶ処理は、有効なペプチド交換を示すＤＳＦ溶融曲線における特徴的なシフトをもたらした（図１０Ｃ）。交換されたＨＬＡ－Ａ＊２４：０２－Ａｌｋ－ＳＡｖ－Ａｚコンジュゲート化四量体は、ビオチンを介してストレプトアビジンにコンジュゲートされたＱＹＤＰＶＡＡＬＦペプチド（配列番号１２）で再フォールドされたＨＬＡ－Ａ＊２４：０２と同様に、ＱＹＤＰＶＡＡＬＦペプチド（配列番号１２）とともに拡大されたＰＢＭＣに強く結合した（図１０Ｄ）。予想通り、結合は、ＵＶ交換の非存在下で観察されなかった。
（実施例７）
ＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２を用いて産生されたコンジュゲート化四量体
ペプチドＡＡＲＧＪＴＬＡＭ（配列番号１４）で再フォールドされたＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２単量体を、上記の実施例１に記載されるように、ＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２－Ａｌｋ－ＳＡｖ－Ａｚコンジュゲート化四量体の構築およびＱＣ’ｄのために使用した。図１１Ａおよび図１１Ｂにおいて見られるように、ＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２－Ａｌｋ－ＳＡｖ－Ａｚコンジュゲート化四量体は、検出可能な凝集体なしの多量体であった。コグネイトペプチドＲＰＨＥＲＮＧＦＴＶＬ（配列番号１３）の存在下でのＵＶ処理後、交換されたＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２－Ａｌｋ－ＳＡｖ－Ａｚコンジュゲート化四量体は、ビオチンを介してストレプトアビジンにコンジュゲートされたＲＰＨＥＲＮＧＦＴＶＬペプチド（配列番号１３）で再フォールドされたＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２と同様に、ＲＰＨＥＲＮＧＦＴＶＬペプチド（配列番号１３）とともに拡大されたＰＢＭＣに強く結合した（図１１Ｃ）。予想通り、結合は、ＵＶ交換の非存在下で観察されなかった。
（実施例８）
ＵＶ交換四量体のバーコード化およびプール化
交換されたＨＬＡ－Ａ＊０２：０１－Ａｌｋ－ＳＡｖ－Ａｚコンジュゲート化四量体は、ストレプトアビジンに対するビオチン結合部位が空であったという事実に起因して、識別性オリゴヌクレオチドタグ（バーコード）で容易に標識された。５’ビオチン化オリゴヌクレオチドを、２：１のオリゴ：四量体のモル比で添加し、４℃で３０分間インキュベートし、それに続いて４００：１のビオチン：四量体のモル比で、４℃で３０分間、ビオチンでクエンチした。バーコード化を、４～１２％のビス－トリスゲル上での電気泳動、それに続いてニトロセルロースへのブロッティングおよび抗Ｆｌａｇ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ番号ＭＡ１－９１８７８－Ｄ８００）で染色を行うことによって確認した。図１２において見られるように、四量体出発材料と比べたゲルのシフトは、オリゴヌクレオチドバーコードによる適正な標識化を示す。
（実施例９）
プールされたバーコード化ＵＶ交換四量体による単一細胞配列決定
ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ（配列番号８）の１９２個の異なるＡＰＬバリアントについてＵＶ交換された個々のＨＬＡ－Ａ＊０２：０１－Ａｌｋ－ＳＡｖ－Ａｚコンジュゲート化四量体試料を、個々に、オリゴヌクレオチド標識にコンジュゲートさせ、プールし、ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ（配列番号８）－拡大Ｔ細胞において染色し、単一細胞配列決定に付した。分析された結果を図１３のヒートマップに示し、ＡＰＬバリアントのサブセットのクローン型特異的結合を示す。
（実施例１０）
バーコード化ＵＶ交換四量体プールのハイスループット産生のための多孔性ヒドロゲルの産生
ヒドロゲルビーズを、アクリルアミド単量体ユニットおよびビス－アクリルアミド架橋剤ユニットを異なる相対濃度で、アクリル化オリゴヌクレオチドプライマーの混合物と一緒に混合し、マイクロ流体ドロップメーカーを使用して液滴に封入し、架橋が完了するまで混合物をインキュベートすることによって産生した。この実施例では、事前に架橋された水性ミックスは、１０％のＴＥＢＳＴ（トリス－ＥＤＴＡ緩衝生理食塩水とＴｗｅｅｎ－２０）中に、０．７５％のビス－アクリルアミド、３％のアクリルアミド、２５ｕＭの５’－アクリル化フォワードプライマー、０．５％過硫酸アンモニウムを含んでいた。水性混合物のすべての試薬を混合および撹拌した。混合物に、１．５％のＴＥＭＥＤおよび１％の００８－ＦｌｕｏｒｏＳｕｒｆａｃｔａｎｔを補充し、液滴に封入し、室温で１時間インキュベートし、次いで、終夜のインキュベートのために６０℃のオーブンに移し、このようにして、ヒドロゲルを形成した。ヒドロゲルビーズを、２０％の１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ－パーフルオロ－１－オクタノール（ＰＦＯ）で１回洗浄し、次いで、ＴＥＢＳＴで３回洗浄し、次いで、低ＴＥ（１ｍＭのトリス－Ｃｌ ｐＨ７．５、０．１ｍＭのＥＤＴＡ）で３回洗浄した。ヒドロゲルビーズは、使用まで、ＴＥＢＳＴ中、４℃で保存した。
（実施例１１）
ペプチドコードアンプリコンを生成するための単一鋳型ＰＣＲ
ＳＵＭＯドメイン－ペプチド融合物をコードする線状ＤＮＡ鋳型を、単一鋳型条件下で液滴中、ヒドロゲルビーズ上でＰＣＲ増幅し、ここで、各液滴は、最大で単一のＤＮＡ鋳型を得た。実施例１０において産生された１．４ｍｌのヒドロゲルビーズを、２ｍｌの反応体積で以下の通りのＰＣＲ構成要素と一緒に混合した：４００ｕｌのＱ５反応緩衝液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、４０ｕｌの１０ｍＭのｄＮＴＰ、４０ｕｌの１ｕＭのフォワードプライマー、４０ｕｌの２５ｕＭの５’－ビオチン化リバースプライマー、４０ｕｌの０．１ｐｇ／ｕｌの線状ＤＮＡ鋳型（または鋳型のミックス）、８ｕｌの２０％のＩＧＥＰＡＬ、および２０ｕＬのＱ５ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）。混合物を、液滴に封入し、３５サイクルのＰＣＲに付した。等体積の１００％のパーフルオロオクタノール（ＰＦＯ）の添加による液滴溶解の後、ヒドロゲルを、１０体積の低ＴＥで５回洗浄した。ヒドロゲルビーズのアリコート（各１０ｕｌ）を、アンプリコン内を切断するＸｂａＩで、３７℃で１時間消化し、１．２％のアガロースゲル上をＰＣＲ上清と一緒に泳動させて、アンプリコンの収率および品質を定量化した（図１４）。単一鋳型条件が有効であることは、ヒドロゲルをストレプトアビジン－ＰＥで標識することによって実証され、ここで、バルク増幅ヒドロゲルの１００％と比較して、わずか２３％の液滴増幅ヒドロゲルが染色された（図１５）。
（実施例１２）
ヒドロゲル上のバーコード化可能な交換の準備ができているコンジュゲート化四量体のローディング
ＰＣＲ増幅されたヒドロゲルを、ＵＶ不安定性ペプチド（例えば、ＧＩＬＧＦＶＦＪＬ（配列番号７））がロードされた５０～５００ｎＭのＨＬＡ－Ａ＊０２：０１－Ａｌｋ－ＳＡｖ－Ａｚコンジュゲート化四量体と、体積で１：１で混合し、周辺光から保護し、氷上で２時間インキュベートした。図１６Ａにおいて見られるように、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１－Ａｌｋ－ＳＡｖ－Ａｚコンジュゲート化四量体のローディングを、洗浄し、抗Ｆｌａｇ－ＡＰＣまたは抗β２Ｍ－Ａｌｅｘａ４８８で染色することによって確認した。図１６Ｂに示されるように、ロードされた四量体の品質を、アンプリコン内を切断するベンゾナーゼまたはＳｍａＩで放出させることによって定量化し、それに続いて抗ストレプトアビジン捕捉によるＥＬＩＳＡ、および抗Ｆｌａｇ－ＨＲＰまたは抗β２Ｍ－ＨＲＰ検出を行った。
（実施例１３）
液滴中のペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳（ＩＶＴＴ）およびロードされた四量体へのＵＶ交換
１２０ｕｌのヒドロゲルビーズを、１２０ｕｌのＰＵＲＥｘｐｒｅｓｓ溶液Ａ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、９０ｕｌのＰＵＲＥｘｐｒｅｓｓ溶液Ｂ（ＮＥＢ）、６ｕｌのＲＮＡｓｅ ＯＵＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、および１．２ＵのＵｌｐ１プロテアーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む、２４０ｕｌのＩＶＴＴマスターミックスとともに液滴に共封入する。液滴を、振とうせずに、３０℃で４時間インキュベートし、次いで、試料から２～５ｃｍを保持したランプからの３６５ｎｍのＵＶ光への３０分の曝露によってＵＶ交換した。ＵＶ曝露は、交換を完了させるために、３０℃での３０分のインキュベーションに続いた。Ｄ－ビオチンを、液滴を破壊する前に、ＩＶＴＴ反応に、５００ｕＭの最終濃度まで添加し、次いで、等体積の１００％のＰＦＯの添加によって液滴の破壊を達成した。ヒドロゲルビーズを、１０体積のＰＢＳと２％のＢＳＡで５回洗浄した。図１７Ａおよび１７Ｂに示されるように、十分なペプチドが、ＰＣＲアンプリコンから産生されて、機能的交換四量体を生成することができる。
（実施例１４）
単一鎖多量体ペプチド－ＭＨＣの放出および分析
ＵＶ交換ｐＭＨＣは、ペプチドコード領域の上流のアンプリコン内で切断するＳｍａＩによる消化によって洗浄されたヒドロゲルから放出され、その結果、四量体は、図１６Ｂに示されるように、自己識別性オリゴヌクレオチドタグ（バーコード）とともに放出された。放出されたｐＭＨＣを、図１６Ｂに示されるように、ＥＬＩＳＡによって定量化し、図１８に示されるように、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞において染色した。液滴中の産生のための全プロセスは、図１９に概略的に要約される。
（実施例１５）
コンジュゲート化ペプチド／ＭＨＣクラスＩＩ－ＳＡｖ多量体の生成
ソルターゼを使用するＭＨＣ ＩＩ－Ｓｏｒｔａｇへのクリックハンドルペプチドのコンジュゲーション。ＭＨＣ ＩＩ αおよびβ鎖の配列を、以下の通り組換え的に発現させた：α鎖細胞外ドメイン配列を、ストレプトアビジン（ＳＡｖ）と翻訳後カップリングして、バーコード化可能な交換可能ＭＨＣ ＩＩ多量体を形成することが可能なＣ末端ソルターゼタグとともに発現させた。α鎖は、診断目的のためにＭｙｃタグも含有した。ｓｏｒｔａｇおよびＭｙｃタグを有するα鎖細胞外ドメインのアミノ酸配列を配列番号１９１に示す。β鎖を、Ｎ末端低親和性プレースホルダペプチド（ＣＬＩＰペプチド、その配列は配列番号１８９に示される）とそれに続く可撓性リンカー、β鎖細胞外ドメイン、およびヒスチジン精製タグとともに組換え的に発現させた。プレースホルダペプチド、可撓性リンカーおよびＨｉｓタグを有するβ鎖細胞外ドメインのアミノ酸配列を配列番号１９２に示す。可撓性リンカーは、ペプチドとβ鎖との間の接続を特異的プロテアーゼによって破壊するのを可能にする切断部位を含有し、このようにしてその後のペプチド交換を促進する。そこにロードされた共有結合的プレースホルダペプチドを有するＭＨＣＩＩ分子は、本明細書で、Ｐ＊ＭＨＣＩＩと称される。
ｐ＊ＭＨＣＩＩ αおよびβ鎖は、ＣＨＯ細胞において共発現され、安定なヘテロ二量体として発現媒体に分泌された。ＣＨＯ発現後、ｐ＊ＭＨＣＩＩを、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって精製した。次いで、ソルターゼ酵素を使用して、ＧＧＧ－Ｘペプチドをｐ＊ＭＨＣＩＩ α鎖にコンジュゲートさせた（図２０、ステップ１）（ここで、Ｘは、アジド、アルキン、または任意のクリック可能な化学部位であり得る）。化学的コンジュゲーション反応を実施するために、ｐ＊ＭＨＣＩＩ（３０～５０ｕＭ）、クリックハンドルペプチド（６～１０ｍＭのＧＧＧ－アルキン、ＧＧＧ－ＤＢＣＯ、またはＧＧＧ－アジド）、ソルターゼ（５～６ｕＭ）および１０ｍＭのＣａＣｌ２を混合し、４℃で最大で２時間インキュベートして、ｐ＊ＭＨＣＩＩ－クリックハンドル融合物を生成した。反応混合物を、ＳＥＣによって精製して、残留ソルターゼおよびクリックハンドルペプチドを除去した。ｐ＊ＭＨＣＩＩ－クリックハンドル融合物に対応する精製画分をプールし、濃縮した。クリックハンドルの添加は、ソルターゼ媒介ライゲーションの成功を検証する、コンジュゲート化タンパク質のサイズのシフトを引き起こした（図２１Ａ）。
コンジュゲート化ｐ＊ＭＨＣＩＩ－ＳＡｖ多量体の生成。クリックハンドルＰ＊ＭＨＣＩＩの発現、精製、およびソルターゼを使用するＳＡｖへのコンジュゲーションは、図２０のステップ２に示され、ＭＨＣＩ多量体について実施例１に本質的に記載されるように行った。銅支援アルキン－アジド環化付加を使用して、共有結合的に連結されたｐ＊ＭＨＣＩＩおよびＳＡｖを生成した（図２０、ステップ３）。ｐ＊ＭＨＣＩＩ－Ａｌｋ－ＳＡｖ－Ａｚを、氷上、以下の反応構成要素を混合することによって生成した：ＭＨＣ ＩＩ－Ａｌｋ（５０ｕＭ）、ＳＡｖ－Ａｚ（ＳＡ単量体について２５ｕＭ）、硫酸銅（０．５ｍＭ）、ＢＴＴＡＡ（２．５ｍＭ）およびアスコルビン酸（５ｍＭ）。反応を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによってモニターし（図２１Ｂ）、４時間後、反応混合物をＳＥＣによって精製して、未反応のＨＬＡ、ＳＡｖ、および他の反応構成要素を、精製されたｐ＊ＭＨＣＩＩ－Ａｌｋ－ＳＡｖ－Ａｚ多量体から分離した（図２１Ｃ）。ＳＡｖおよびβ鎖は、多量体種に対応する画分を区別することを可能にする、それぞれ、ＦＬＡＧおよびＨｉｓタグを含有した（図２１Ｄおよび２１Ｅ）。多量体画分は、明らかな四量体および三量体種を示した。より重要には、遊離ＳＡｖ種は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット解析下、多量体画分から採取されたボイル試料中で観察されなかった（図２１Ｄ）。これは、主要な種が、各ＳＡｖサブユニットが、ｐ＊ＭＨＣＩＩサブユニットに共有結合的に連結されている四量体であることを示す。
（実施例１６）
ｐＭＨＣ ＩＩ多量体は、交換可能であり、コグネイトエピトープ特異的ＴＣＲと結合する
リンカー消化およびペプチド交換
ｐ＊ＭＨＣＩＩ－Ａｌｋ－ＳＡｖ－Ａｚ多量体（これ以降、ｐ＊ＭＨＣＩＩ－ＳＡｖ）を、１ｍＭのＣａＣｌ２の存在下、５：１（ｗ／ｗ）の比で、第Ｘａ因子（ＮＥＢ）によって、４℃で終夜消化した（図２０、ステップ４）。次いで、プロテアーゼを、製造業者の推奨に従って（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１，５－ダンシル－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ａｒｇクロロメチルケトン阻害剤の添加によって不可逆的に不活性化した。消化された試料は、消化されていない試料よりも素早く移動し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ変性条件下で新たに切断されたペプチドの除去を示した（図２２Ａ）。
切断されたｐ＊ＭＨＣＩＩ－ＳＡｖ（これ以降、ｐ↓ＭＨＣＩＩ－ＳＡｖ）が交換されたペプチドと結合するかどうかを試験するために、ＥＬＩＳＡ結合アッセイを行った。このアッセイでは、インフルエンザＡ型ウイルス（赤血球凝集素、ＨＡ、そのアミノ酸配列は配列番号１９３に示される）由来のビオチン化ペプチドエピトープがロードされたが、切断されたプレースホルダペプチドは、穏和な酸性ｐＨ条件下で除去された（図２０、ステップ５）。次いで、交換のレベルを、新たにスワップされたビオチン化ペプチドへのストレプトアビジン－ＨＲＰの結合のモニタリングによって決定した。ストレプトアビジン上の遊離ビオチン結合部位は、交換反応の前に、過剰の遊離ビオチンでブロッキングした。このステップは、任意の検出されるビオチン化ペプチドのみがペプチド結合性ポケットに結合することができることを確実にした。交換緩衝液組成物は以下の通りであった：１００ｍＭのクエン酸ナトリウム ｐＨ５．５、５０ｍＭの塩化ナトリウム、１％のオクチルグルコシド（ｖ／ｖ）、１×のＳＩＧＭＡＦＡＳＴプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）および０．１ｍＭのＤＴＴ。１５０μｌのペプチド交換反応物を、９６ウェルプレートにおいて調製し、ここで、各ウェルは、１×交換緩衝液、３０ｎＭのｐ↓ＭＨＣＩＩ－ＳＡｖ、およびＨＡ－ビオチン化ペプチド、ＨＡ－非ビオチン化ペプチドまたは緩衝液のいずれかの５倍連続希釈物から構成される。６ｎＭのｐ↓ＭＨＣＩＩ単量体とＨＡ－ビオチン化ペプチドの５倍連続希釈物とのインキュベーションは、陽性対照として含まれた。交換反応を、３７℃での終夜インキュベーション後、１：１５（ｖ／ｖ）の１Ｍのトリス－ＨＣｌ、ｐＨ１０の添加により酸性ｐＨを中和することによって、停止した。９６チャネルの卓上ピペッターを使用して、各ウェルからの１００μｌを、（１００ｎｇ／ウェル）Ｌ２４３立体配座感受性抗体（Ａｂｃａｍ）で事前にコーティングされたＥＬＩＳＡプレートに移し、洗浄し（３×ＰＢＳ－Ｔ）、２％（ｖ／ｖ）のＢＳＡが補充されたＰＢＳ－Ｔでブロッキングした。室温で１時間のインキュベーション後、プレートを、洗浄し（３×ＰＢＳ－Ｔ）、ＳＡ－ＨＲＰとともに暗所で３０分間インキュベートし、再び洗浄し（３×ＰＢＳ－Ｔ）、ＨＲＰ基質および停止溶液を使用して発色させた。ペプチド濃度とＳＡ－ＨＲＰ結合のレベルとの間の正の相関が、両方の単量体ｐ↓ＭＨＣＩＩおよびｐ↓ＭＨＣＩＩ－ＳＡｖについて観察された（図２１Ｂ）。これは、両方の種が、プレースホルダペプチドがビオチン化－ＨＡペプチドと交換されたことを示す。非ビオチン化ペプチドまたは緩衝液のいずれかとのインキュベーションは、検出可能なシグナルを生じず、ビオチン化エピトープの結合が特異的であったことを暗示した。単量体ｐ↓ＭＨＣＩＩとは対照的に、ｐ↓ＭＨＣＩＩ－ＳＡｖについての曲線は、右にシフトし、より高いペプチド濃度で飽和に達しなかった。多量体は、少なくとも４倍大きなサイズであり、これは、捕捉抗体および／またはＳＡ－ＨＲＰ読み取りプローブへの結合を妨げる可能性がある。
可溶性ＴＣＲへの交換ｐ↓ＭＨＣＩＩ－ＳＡｖの結合
Wagner et al. J Biol Chem., 294:5790-5804, 2019に記載されるように、ＨＡ－ペプチドエピトープ特異的可溶性ＴＣＲであるＦ１１を、ＦＣドメインに融合し、産生した（図２０、ステップ６）。簡潔には、Ｆ１１細胞外アルファおよびベータ鎖をコードするＤＮＡを、マウスＩｇＧｋ鎖リーダー配列の下流のｐＤＴ５プラスミドにクローニングした。ヒトＴＣＲ定常ドメインは、追加の鎖間ジスルフィド結合を含有した。Ｃ－アルファドメインは、ヒトＩｇＧ１の上部ヒンジ配列（ＶＥＰＫＳＣ；配列番号２７０）、コアおよび下部ヒンジ、次いでＦｃドメインが続いた。天然のＩｇＧ１軽鎖システインを、Ｃ－ベータのＣ末端に挿入して、上部ヒンジシステインと対形成させ、ＴＣＲヘテロ二量体化をさらに安定化した。追加の改変は、Ｎ連結グリコシル化部位の除去を含んでいた。アルファ－Ｆｃおよびベータドメインをコードするプラスミドを、一過性トランスフェクションによってＥｘｐｉ－ＣＨＯ細胞において発現させ、産物を、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって清澄化上清から精製した。
交換反応を、２つの相違を伴って、実施例１において上記に記載されるように行った：単一の管を、９６ウェルプレートの代わりに使用した、およびタンパク質濃度を変えた。１．７５μＭのｐ↓ＭＨＣＩＩ－ＳＡｖを、交換緩衝液の存在下、１００μＭのＨＡペプチドとともにインキュベートした。反応を停止し、氷上で保った後、バイオレイヤー干渉（ＢＬＩ）アッセイを、ＢＬＩ緩衝液（ＰＢＳ＋０．０２％のＴｗｅｅｎ２０、０．１％のＢＳＡ、０．０５％のアジ化ナトリウム）中、３０℃で、Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ９６機器（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用して行った。Ｆ１１ ＴＣＲを、抗ｈＩｇＧ Ｆｃ捕捉バイオセンサー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）上に、０．６ｎｍのローディングシグナルまでロードした。ＢＬＩ緩衝液で洗浄した後、バイオセンサーを、１４ｎＭの交換ｐ↓ＭＨＣＩＩ－ＳＡｖ、１２５ｎＭの非交換ｐ＊ＭＨＣＩＩ－ＳＡｖまたはＢＬＩ緩衝液のいずれかを含有するウェルに移動させて、会合動態を測定した（図２２Ｃ）。解離動態を測定するために、バイオセンサーを、多量体を欠くＢＬＩ緩衝液に移動して戻した。ＢＬＩ応答シグナルの有意な増加が、ＨＡ－交換ｐ↓ＭＨＣＩＩ－ＳＡｖについて観察され、Ｆ１１ ＴＣＲとの強い会合を示唆した（図２２Ｃ）。対照的に、非交換ｐ＊ＭＨＣＩＩ－ＳＡｖは、非常に少ない会合を示し、Ｆ１１－ＴＣＲとＨＡを提示する多量体との間の相互作用が特異的であることを示した。バイオセンサーがＢＬＩ緩衝液に浸された場合に、会合は観察されなかった。ＨＡ交換ｐ↓ＭＨＣＩＩ－ＳＡｖは、Ｆ１１－ＴＣＲからの非常にわずかな解離を示した。この結果は、高アビディティーの多量体相互作用の特徴である緊密なＴＣＲ－ＭＨＣ ＩＩ結合を示す。
抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞への交換ｐ↓ＭＨＣＩＩ－ＳＡｖのライブラリーの結合
インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）ペプチド（配列番号２８１）および９つの他の対照ペプチドについてＵＶ交換された個々のＤＲＢ１＊０１：０１－ＳＡｖコンジュゲート化四量体試料を、オリゴヌクレオチドで標識し、プールした。その後、プールを使用して、ＨＡ－拡大ＣＤ４＋Ｔ細胞を染色し、これを選別し、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１四量体プールで染色された対照エピトープＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号２８２）－拡大細胞が添加された後、単一細胞配列決定に付した。分析された結果を、図２３のヒートマップに示し、ＨＡロードＤＲＢ１＊０１：０１四量体についてのクローン型特異的結合を示す。
参照による組み込み
本出願において引用された各特許、公開および非特許文献は、それぞれが個々に参照により組み込まれるかのように、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (21)

  1. （ａ）２つまたはそれよりも多くのＭＨＣ単量体；
    （ｂ）４つのサブユニットを含み、少なくとも１つのビオチン結合部位を有するストレプトアビジンまたはアビジン；および
    （ｃ）オリゴヌクレオチドバーコード
    を含むバーコード標識化ＭＨＣ多量体であって、
    各ＭＨＣ単量体が、共有結合的連結を通して前記ストレプトアビジンまたはアビジンのサブユニットの１つに結合されており、
    前記オリゴヌクレオチドバーコードが、ビオチン部分を含み、前記ストレプトアビジンまたはアビジン上の前記ビオチン結合部位に非共有結合されている、
    ＭＨＣ多量体。
  2. 前記ＭＨＣ多量体が、前記多量体の各ＭＨＣ単量体上にロードされたＭＨＣ結合性ペプチドをさらに含む、請求項１に記載のＭＨＣ多量体。
  3. 前記ＭＨＣ多量体が、少なくとも３個のＭＨＣ単量体を含む、請求項１または２に記載のＭＨＣ多量体。
  4. 前記ＭＨＣ多量体が４つのＭＨＣ単量体を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のＭＨＣ多量体。
  5. 各ＭＨＣ単量体および前記ストレプトアビジンまたはアビジンの各サブユニットが、コンジュゲーション部分を含み、各コンジュゲーション部分が、ｓｏｒｔａｇモチーフを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のＭＨＣ多量体。
  6. 前記ＭＨＣ単量体が、ＭＨＣクラスＩ（ＭＨＣＩ）単量体である、請求項１～５のいずれか一項に記載のＭＨＣ多量体。
  7. 各ＭＨＣＩ単量体が、ヒトＭＨＣＩ重鎖ポリペプチドまたはその機能的断片、およびヒトβ２－ミクログロブリンポリペプチドまたはその機能的断片を含む、請求項６に記載のＭＨＣ多量体。
  8. 各ＭＨＣＩ単量体が、ヒトＭＨＣＩ重鎖ポリペプチドまたはその機能的断片、およびヒトβ２－ミクログロブリンまたはその機能的断片を含む融合タンパク質である、請求項７に記載のＭＨＣ多量体。
  9. バーコードペプチドロード主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ（ｐＭＨＣＩ）多量体を産生する方法であって、
    （ａ）（ｉ）ＭＨＣＩ重鎖ポリペプチドまたはその機能的断片、（ｉｉ）β２－ミクログロブリンポリペプチドまたはその機能的断片、（ｉｉｉ）コンジュゲーション部分、および（ｉｖ）各ＭＨＣＩ単量体のペプチド結合溝中で結合したプレースホルダペプチドをそれぞれ含む、２つまたはそれよりも多くのプレースホルダペプチドロードＭＨＣＩ（ｐ＊ＭＨＣＩ）単量体を提供するステップ；
    （ｂ）ストレプトアビジンまたはアビジンを提供するステップであって、前記ストレプトアビジンまたはアビジンの各サブユニットが、コンジュゲーション部分を含み、前記ストレプトアビジンまたはアビジンが、少なくとも１つのビオチン結合部位を含む、ステップ；
    （ｃ）前記２つまたはそれよりも多くのｐ＊ＭＨＣＩ単量体と前記ストレプトアビジンまたはアビジンとの間の共有結合的コンジュゲーションのために十分な条件下で前記ｐ＊ＭＨＣＩ単量体および前記ストレプトアビジンまたはアビジンを組み合わせて、ｐ＊ＭＨＣＩ多量体を産生するステップ；
    （ｄ）前記ｐ＊ＭＨＣＩ多量体中の前記ｐ＊ＭＨＣＩ単量体のそれぞれの前記ペプチド結合溝中で結合した前記プレースホルダペプチドをレスキューペプチドエピトープで置き換えて、ｐＭＨＣＩ多量体を産生するステップ；ならびに
    （ｅ）ビオチン部分を含むオリゴヌクレオチドバーコードを前記ストレプトアビジンまたはアビジン上の前記ビオチン結合部位に非共有結合させるステップ
    を含む、方法。
  10. 前記ｐＭＨＣＩ多量体が、少なくとも３個のｐＭＨＣＩ単量体を含む、請求項９に記載の方法。
  11. 前記ｐＭＨＣＩ多量体が、４つのｐＭＨＣＩ単量体を含む、請求項９または１０に記載の方法。
  12. 各ｐ＊ＭＨＣＩ単量体の前記コンジュゲーション部分が、Ｘを含み、前記ストレプトアビジンまたはアビジンの各サブユニットの前記コンジュゲーション部分が、Ｙを含み、
    （ｉ）Ｘが、歪んだアルキンであり、Ｙが、アジドである；
    （ｉｉ）Ｘが、末端アルキンであり、Ｙが、アジドである；
    （ｉｉｉ）Ｘが、アジドであり、Ｙが、末端アルキンである；
    （ｉｖ）Ｘが、アジドであり、Ｙが、歪んだアルキンである；
    （ｖ）Ｘが、ジエンであり、Ｙが、ジエノフィルである；
    （ｖｉ）Ｘが、ジエノフィルであり、Ｙが、ジエンである；
    （ｖｉｉ）Ｘが、チオールであり、Ｙが、アルケンである；または
    （ｖｉｉｉ）Ｘが、アルケンであり、Ｙが、チオールである、
    請求項９～１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記アジドが、銅キレート化アジドである、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記銅キレート化アジドが、ピコリルアジドである、請求項１３に記載の方法。
  15. 各コンジュゲーション部分が、ｓｏｒｔａｇモチーフを含む、請求項９～１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 各ｐ＊ＭＨＣＩ単量体が、ヒトＭＨＣＩ重鎖ポリペプチドまたはその機能的断片、およびヒトβ２－ミクログロブリンポリペプチドまたはその機能的断片を含む、請求項９～１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 請求項６～８のいずれか一項に記載の複数のＭＨＣ多量体を含むポリペプチドライブラリーであって、前記ＭＨＣ多量体のそれぞれが、ペプチドロードＭＨＣクラスＩ（ｐＭＨＣＩ）多量体である、ポリペプチドライブラリー。
  18. ＭＨＣ多量体が結合したリンパ球を単離する方法であって、前記方法が、
    （ａ）複数のリンパ球を請求項１７に記載のポリペプチドライブラリーと接触させるステップ；ならびに
    （ｂ）複数のコンパートメントを生成するステップであって、各コンパートメントが、前記ポリペプチドライブラリーのｐＭＨＣＩ多量体に結合したリンパ球、および捕捉支持体を含む、ステップ
    を含む、方法。
  19. 前記複数のリンパ球が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、またはＮＫ細胞である、請求項１８に記載の方法。
  20. ｐＭＨＣ多量体に結合したＴ細胞を識別する方法であって、前記方法が、
    （ａ）複数のリンパ球を請求項１７のポリペプチドライブラリーと接触させるステップ；（ｂ）単一のコンパートメント中に前記ポリペプチドライブラリーのｐＭＨＣＩ多量体に結合した前記複数のリンパ球のうちの１つのリンパ球をコンパートメント化するステップであって、前記ｐＭＨＣＩ多量体が、固有の識別子を含む、ステップ；および
    （ｃ）前記コンパートメント化されたリンパ球に結合した前記ｐＭＨＣＩについての前記固有の識別子を決定するステップ
    を含む、方法。
  21. 請求項１７に記載のライブラリーを産生する方法であって、
    （ａ）（ｉ）ＭＨＣＩ重鎖ポリペプチドまたはその機能的断片、（ｉｉ）β２－ミクログロブリンポリペプチドまたはその機能的断片、（ｉｉｉ）コンジュゲーション部分、および（ｉｖ）各ＭＨＣＩ単量体のペプチド結合溝中で結合したプレースホルダペプチドをそれぞれ含む、複数のプレースホルダペプチドロードＭＨＣＩ（ｐ＊ＭＨＣＩ）単量体を提供するステップ；
    （ｂ）複数のストレプトアビジンまたはアビジンを提供するステップであって、前記ストレプトアビジンまたはアビジンの各サブユニットが、コンジュゲーション部分を含み、各ストレプトアビジンまたはアビジンが、少なくとも１つのビオチン結合部位を含む、ステップ；
    （ｃ）前記ｐ＊ＭＨＣＩ単量体と前記ストレプトアビジンまたはアビジンとの間の共有結合的コンジュゲーションのために十分な条件下で前記複数のｐ＊ＭＨＣＩ単量体および前記複数のストレプトアビジンまたはアビジンを接触させて、複数のｐ＊ＭＨＣＩ多量体を産生するステップ；
    （ｄ）前記ｐ＊ＭＨＣＩ多量体の前記ペプチド結合溝中で結合した前記プレースホルダペプチドを複数の固有のレスキューペプチドエピトープで置き換えて、複数のｐＭＨＣＩ多量体を産生するステップ；ならびに
    （ｅ）ビオチン部分を含むオリゴヌクレオチドバーコードを前記ストレプトアビジンまたはアビジンの前記ビオチン結合部位に非共有結合させるステップ
    を含む、方法。
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