JP7843824B2 - 抗体および使用方法 - Google Patents

抗体および使用方法

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Description

本発明は、ＳＬＡＭＦ６タンパクに結合することができる抗体、およびその使用に関す
る。
はじめに
本発明の態様には、ＮＴＢ－ＡまたはＣＤ３５２としても知られるＳＬＡＭファミリー
メンバー６（ＳＬＡＭＦ６）に対する抗体および他の治療用タンパク、かかる抗体および
治療用タンパクをコードする核酸、抗体および他の治療用タンパクを調製する方法、なら
びにＳＬＡＭＦ６に対する抗体および他の治療用タンパクを用いることによる癌などの疾
患の治療方法が含まれる。
標的抗原ＳＬＡＭＦ６はシングルパスタイプＩ膜タンパクであり、免疫グロブリンスー
パーファミリーおよびＣＤ２サブファミリーのメンバーである（J Exp Med. 2001 Aug 6;
194(3):235-46）。その活性は、小さな細胞質アダプタータンパク、ＳＨ２Ｄ１Ａ／ＳＡ
Ｐおよび／またはＳＨ２Ｄ１Ｂ／ＥＡＴ－２の有無によって制御されている。このタンパ
クは、天然細胞毒性レセプター（J. Exp. Med. 194:235-246(2001)）の高表面密度を発現
するナチュラルキラー細胞（ＮＫ）においてのみ細胞溶解活性を誘発する。ＮＫ細胞にお
ける正のシグナル伝達はＶＡＶ１のリン酸化を意味する。ＮＫ細胞活性化はＳＨ２Ｄ１Ｂ
に依存し、ＳＨ２Ｄ１Ａには依存しないようである。ＳＬＡＭＦ１と共に、ＳＬＡＭＦ６
は、胸腺細胞ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞系列のポジティブセレクションとその後
の増殖と分化との間の移行を制御する。
ＳＬＡＭＦ６はまた、ＩＬ‐１７分泌の増加につながるヘルパーＴ細胞Ｔｈ１７表現型
へのＴ細胞分化を促進し、共刺激活性はＳＨ２Ｄ１Ａ（J. Immunol. 177:3170-3177(2006
)）を必要とする。さらに、ＩＬ－１７促進剤（J. Biol. Chem. 287:38168-38177(2012)
）へのＲＯＲＣのリクルートメントを促進する。ＳＬＡＭＦ１およびＣＤ８４／ＳＬＡＭ
Ｆ５とともに、ＳＬＡＭＦ６は体液性免疫応答の負の調節因子である可能性がある。ＳＨ
２Ｄ１Ａ／ＳＡＰが存在しない場合、ＳＬＡＭＦ６はＣＤ４＋Ｔ細胞およびＮＫＴ細胞に
負のシグナルを伝達することができる。また、Ｔ細胞：Ｂ細胞の接着を阻害することによ
って胚中心形成を負に調節するし、この機能は、おそらくＳＨ２Ｄ１Ａ／ＳＡＰが存在し
ない場合にＩＴＳＭを介してＰＴＰＮ６／ＳＨＰ－１との会合が増加することを示唆して
いる。
ＷＯ２００８／０２７７３９は、抗ＮＴＢ－Ａ抗体および上記抗体を含む医薬組成物を
開示している。また、ＮＴＢ－Ａに結合し、ＮＴＢ－Ａの発現によって特徴づけられる血
液悪性腫瘍などの疾患を治療するために、上記抗体を使用する方法も記載されている。
ＷＯ２０１４／１００７４０およびＷＯ２０１７／００４３３０は、ＮＴＢ－Ａに特異
的に結合する抗体薬物結合体を含む抗体、およびこれらをＮＴＢ－Ａ発現細胞の活性を検
出または調節するために使用する方法を開示している。また、ＮＴＢ－Ａ発現細胞に関連
する疾患、例えば多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫および急性骨髄性白血病の治療方法
も開示される。
ＷＯ２０１５／１０４７１１は、ｅｘ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの改良されたＴ
細胞調節のための、ならびに癌および他の病理の治療のための組成物および方法を記載し
ている。より具体的には、本発明の実施形態は、癌患者の治療、感受性患者における血球
減少症の予防および治療、ならびに改善された細胞組成物のｅｘ ｖｉｖｏ調製のための
水溶性ＮＴＢ－Ａポリペプチドまたはそのアゴニストの使用を対象とする。
本発明の態様は、ＳＬＡＭＦ６に対する特異的抗体、ＳＬＡＭＦ６および腫瘍関連抗原
に対する二重特異性抗体、本発明のこのような抗体をコードする核酸、本発明の抗体をコ
ードする宿主細胞、本発明の抗体を調製するための方法、および小細胞肺癌、非小細胞肺
癌（扁平上皮癌および腺癌を含む）、メラノーマを含む皮膚癌、乳癌（ＴＮＢＣを含む）
、結腸直腸癌、胃（gastric）癌、卵巣癌、子宮癌、前立腺癌、腎臓癌、肝細胞癌を含む
肝臓癌、膵臓癌、頭頸部癌、鼻咽頭癌、食道癌、膀胱癌および他の尿路上皮癌、胃（stom
ach）癌、神経膠腫、神経膠芽腫、精巣、甲状腺、骨、胆嚢および胆管、子宮、副腎癌、
肉腫、ＧＩＳＴ、神経内分泌腫瘍、および血液悪性腫瘍を含むがこれらに限定されないヒ
トの癌などの疾患の治療方法を含む。
本明細書に記載される抗体は、ＳＬＡＭＦ６（配列番号１１）に結合する抗体を提供す
る。好ましくは、前記抗体は、ＳＬＡＭＦ６（配列番号１２）の細胞外ドメインに結合す
る。本発明の態様は、本明細書に記載される抗体によって認識されるＳＬＡＭＦ６タンパ
ク上のエピトープに結合するか、または本明細書に記載される抗体との結合に関してクロ
ス競合（cross-compete、クロスコンピート）し、好ましくは、本明細書に記載される抗
体のヒトＳＬＡＭＦ６に対する結合親和性の少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、
少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、
少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、
少なくとも約９８％または少なくとも約９９％を保持する抗体、またはその抗原結合フラ
グメントを含む。いくつかの実施形態において、抗体は単離された抗体である。
本発明の態様は、ＳＬＡＭＦ６に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを含み
、前記抗体は、重鎖可変領域を含み、重鎖可変領域は、配列番号５の配列を含むＣＤＲ－
Ｈ１配列、配列番号６または配列番号１５の配列を含むＣＤＲ－Ｈ２配列、および配列番
号７の配列を含むＣＤＲ－Ｈ３配列を含み、いくつかの実施形態では、抗体または抗原結
合フラグメントは、配列番号８または配列番号１６の配列のいずれか１つを含むＣＤＲ－
Ｌ１、配列番号９または配列番号１７の配列のいずれか１つを含むＣＤＲ－Ｌ２、および
配列番号１０の配列を含むＣＤＲ－Ｌ３からなる群から選択される少なくとも１つのＣＤ
Ｒ配列を含む軽鎖可変領域をさらに含む。
いくつかの実施形態において、ＳＬＡＭＦ６に結合する抗体またはその抗原結合フラグ
メントは、表１に示されるように、重鎖および軽鎖ＣＤＲの８つの組合せのうちの１つを
含む重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む。
いくつかの好ましい態様において、ＳＬＡＭＦ６に結合する抗体またはその抗原結合フ
ラグメントは、配列番号５を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号６を含むＣＤＲ－Ｈ２、および
配列番号７を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域と、配列番号８を含むＣＤＲ－Ｌ１、
配列番号９を含むＣＤＲ－Ｌ２、および配列番号１０を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変
領域を含む。
別の好ましい実施形態では、ＳＬＡＭＦ６に結合する抗体またはその抗原結合フラグメ
ントは、配列番号５を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１５を含むＣＤＲ－Ｈ２、および配列
番号７を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１６を含むＣＤＲ－Ｌ１、配
列番号１７を含むＣＤＲ－Ｌ２、および配列番号１０を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む。
さらなる態様において、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントは、本明細書に
記載される親抗体と比較して可変ＣＤＲを含む。したがって、本発明は、親抗体の変異体
可変領域を含む変異体抗体またはその抗原結合フラグメントを提供し、親抗体またはその
抗原結合フラグメントが、配列番号５の配列を含むＣＤＲ－Ｈ１配列、配列番号１５の配
列を含むＣＤＲ－Ｈ２配列、および配列番号７の配列を含むＣＤＲ－Ｈ３配列を含む重鎖
可変領域と、配列番号１６の配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１７の配列を含むＣＤＲ
－Ｌ２、および配列番号１０の配列を含むＣＤＲ－Ｌ３とを含む軽鎖可変領域とを含み、
一実施形態では、変異抗体またはその抗原結合フラグメントは、特定の用途の１から５個
もしくは１から４個もしくは１から３個の置換、付加もしくは欠失を有するＣＤＲ－Ｈ１
、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２およびＣＤＲ－Ｌ３のセッ
トにおいて、集合的に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個のア
ミノ酸の置換、付加、および／もしくは欠失いずれか１つまたは複数において、１、２、
３、４、５もしくは６個のアミノ酸の置換、付加、および／もしくは欠失を有し、抗体ま
たはその抗原結合フラグメントがＳＬＡＭＦ６に特異的な結合を保持する。好ましくは、
バリエーションは置換であり、好ましくは、置換は、保存的置換または可変領域中のアミ
ノ酸をヒト生殖細胞系からの対応するアミノ酸に戻すための置換である。さらなる実施形
態において、本発明の変形例抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号５の配列
を含むＣＤＲ－Ｈ１配列；配列番号１５の配列を含むＣＤＲ－Ｈ２配列；および配列番号
７の配列を含むＣＤＲ－Ｈ３配列；ならびに配列番号１６の配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；配
列番号１７の配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；および配列番号１０の配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を
含む軽鎖可変領域を含み、前記ＣＤＲ配列の１つ以上は、上記に列挙した対応する親ＣＤ
Ｒ配列と約７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％
、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるように
改変される。
いくつかの実施形態において、配列番号１もしくは配列番号１３に記載される重鎖可変
領域、または配列番号１もしくは配列番号１３に記載される配列と約８０％、８５％、９
０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一
である配列、および／または配列番号２もしくは配列番号１４に記載される軽鎖可変領域
、または配列番号２もしくは配列番号１４と約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％
、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一である配列を含む抗体
またはその抗原結合フラグメントが提供される。さらなる実施形態では、配列番号１もし
くは配列番号１３と比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１
２個のアミノ酸置換、付加および／または欠失を含む重鎖可変領域、および／または配列
番号２もしくは配列番号１４と比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１
１または１２個のアミノ酸置換および／または欠失を含む軽鎖可変領域を含む抗体または
その抗原結合フラグメントが提供される。好ましくは、変異体は置換、より好ましくは保
存的置換を含む。
アミノ酸置換、付加および／または欠失は、フレームワーク領域内および／またはＣＤ
Ｒ内にあり得ることがさらに明らかであろう。
一実施形態では、配列番号１の配列を含む重鎖可変領域、および配列番号２の配列を含
む軽鎖可変領域を含む抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
一実施形態では、配列番号１３の配列を含む重鎖可変領域、および配列番号１４の配列
を含む軽鎖可変領域を含む抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
一実施形態では、配列番号１８を含む重鎖配列および配列番号１９を含む軽鎖配列を含
む全長抗体が提供される。
本発明のさらに別の態様において、配列番号１または配列番号１３の３つの重鎖ＣＤＲ
および配列番号２または配列番号１４の３つの軽鎖ＣＤＲを含む、ＳＬＡＭＦ６に特異的
に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントが提供され、ＣＤＲはＫａｂａｔによっ
て定義されるか、または、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングシステムによって定義される。好
ましくは、前記抗体、またはＳＬＡＭＦ６に特異的に結合するその抗原結合フラグメント
は、ＫａｂａｔまたはＣｈｏｔｈｉａナンバリングシステムによって定義される、配列番
号１３の３つの重鎖ＣＤＲおよび配列番号１４の３つの軽鎖ＣＤＲを含む。
配列番号１３～１９は、配列番号１および２の配列に基づくヒト化抗体配列である。当
業者は、配列番号１８～１９は、完全長の機能的抗体、すなわち定常領域およびＦｃ領域
を産生するのに必要な可変領域以外の領域を含む完全長の重鎖および軽鎖配列であること
を容易に理解するであろう。当業者は、抗体が産生される生物の可変領域由来のアミノ酸
をヒト生殖細胞系配列由来のアミノ酸で置き換えることにより、これらをヒト対象に投与
したときの抗体の免疫原性効果を最小限にするために、配列がヒト化されることを理解す
るであろう。アミノ酸置換の大部分はフレームワーク領域で起こるが、非臨界位置で起こ
るＣＤＲからの多数のアミノ酸は置換され得、そのような置換は、好ましくは、性質にお
いて保存的であるか、または特定の位置のアミノ酸を対応するヒト生殖細胞系に存在する
アミノ酸に戻す。この場合、置換されたＣＤＲからのアミノ酸は、構造モデルを用いて、
ＣＤＲ領域におけるパラトープ面残基と非パラトピック残基とを識別することにより同定
された。これにより、抗体を単純なＣＤＲグラフトよりも高度にヒト化することができる
。
本発明において、配列番号１３は、配列番号１のＣＤＲ２（配列番号６）と比較した場
合、ＣＤＲ２（配列番号１５）における２つのアミノ酸置換を含んでいる。具体的には、
配列番号６の１６位にＫ－Ｑ置換があり、配列番号６の１７位にＤ－Ｇ置換がある。
本発明において、配列番号１４は、配列番号２のＣＤＲ１（配列番号８）と比較した場
合、ＣＤＲ１（配列番号１６）における３つのアミノ酸置換を含んでいる。具体的には、
配列番号８の１位にＳ－Ｑ置換；配列番号８の４位にＳ－Ｑ置換；および配列番号８の５
位にＳ－Ｄ置換がある。配列番号１４は、配列番号２（配列番号９）のＣＤＲ２と比較す
ると、ＣＤＲ２（配列番号１７）における１個のアミノ酸置換をさらに含む。具体的には
、配列番号９の７位にＳ－Ｔ置換が存在する。
これらのヒト化配列は、親抗体と比較した場合、異なる、選択的な抗体を表すものでは
なく、免疫原性を最小限にするために構造モデリングを用いてヒト生殖細胞系により密接
に対応するように改変されただけの同じ特性を有する同じ抗体に関するものであることが
、当業者には理解されるであろう。
いくつかの実施形態において、抗体または抗原結合フラグメントは、５ｎＭ、４ｎＭ、
３ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ以下の結合親和性（ＫＤ）を有する。
いくつかの実施形態において、抗体または抗原結合フラグメントは、モノクローナル抗
体である。いくつかの態様において、抗体は、キメラ、ヒト化、またはヒト抗体である。
いくつかの実施形態において、重鎖可変領域は、フレームワーク配列を含む。いくつかの
実施形態において、フレームワーク配列の少なくとも一部は、ヒトコンセンサスフレーム
ワーク配列を含む。いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域は、フレームワーク配列
を含む。いくつかの実施形態において、フレームワーク配列の少なくとも一部は、ヒトコ
ンセンサスフレームワーク配列を含む。
また、Ｌ２３４ＡやＬ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）のような抗体低ヒンジ内の残基の置換を含
む、抗体エフェクター機能を緩和するための代替的ストラテジーも採用されている。これ
らの残基はＣＨ２ドメイン上のＦｃ－γ受容体結合部位の一部を形成し、これらの残基の
抗体アイソタイプ間の交換は、ＡＤＣＣにおけるそれらの重要性を同定する、より大きな
またはより小さなエフェクター機能を有した。これらの位置でのアラニン置換は、ヒトお
よびマウス抗体の両方においてＡＤＣＣを減少させるのに効果的であるが、これらの置換
はＣＤＣ活性を減少させるのにあまり効果的ではない（Lo M et al, J Biol Chem. 2017
Mar 3;292(9):3900-3908）。いくつかの実施形態において、抗体または抗原結合フラグメ
ントは、ＦＣガンマレセプターへの結合を減少させるように操作されたＦｃ変異体であり
、それにより低減されたエフェクター機能およびＡＤＣＣ活性がもたらされる。
いくつかの実施形態において、抗体、または抗原結合フラグメントは、Ｆｃサイレンシ
ングされた操作されたＩｇＧ１抗体、または１つ以上のＦｃレセプターへの結合を減少さ
せた、または、全く有さない抗原結合フラグメントである。別の実施形態では、抗体はＩ
ｇＧ４抗体である。
いくつかの実施形態において、抗体、または抗原結合フラグメントは、Ｔ細胞細胞傷害
性および／またはＮＫ細胞傷害性を媒介する二重特異性抗体または抗原結合フラグメント
である。いくつかの実施形態において、抗体または抗原結合フラグメントは、免疫細胞の
活性化を誘導および／または増強することができる。一実施形態では、免疫細胞は好まし
くはＴ細胞である。別の実施形態では、免疫細胞は好ましくはＮＫ細胞である。当業者は
、用語誘導および／または増強とは、免疫細胞によるサイトカイン放出を誘導および／ま
たは増強し、および／または前記免疫細胞の増殖を誘導および／または増強し、および／
または細胞殺傷活性を誘導および／または増強することを指すことができることを理解す
るであろう。本文脈において使用されるように、「誘導する」または「誘導」という用語
は、免疫細胞の活性化を引き起こすこと、または抗体または抗原結合フラグメントの非存
在下で見られる活性化レベルを上回るように免疫細胞の活性化を増加させることを意味す
ることは、当業者には容易に明らかであろう。本文脈において使用される「増強する」と
いう用語は、すでに活性化された免疫細胞の活性化レベルを増加させることを指す。
いくつかの実施形態において、抗体または抗原結合フラグメントは、ＳＬＡＭＦ６タン
パク（例えば、配列番号１１）に結合し、１つまたは複数の追加の結合標的に結合する、
二重特異性または多重特異性抗体または抗原結合フラグメントであり、好ましくは、前記
追加の結合標的は、１つまたは複数の腫瘍抗原である。さらなる実施形態において、１つ
以上のさらなる結合標的は、免疫調節分子である。一実施形態では、追加の結合標的はＰ
Ｄ－Ｌ１である。一実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは２価である。
別の実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは４価である。別の実施形態で
は、抗体またはその抗原結合フラグメントは３価である。
いくつかの実施形態において、抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ
）２、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ＦＶＴＣＲ、ｓｃＦｖ、ｄＡｂおよび単一ドメイン抗体か
らなる群より選択される。
本発明の別の態様では、本発明の抗体の重鎖および／または本発明の抗体の軽鎖をコー
ドする１以上の核酸が提供される。本発明の抗体の重鎖および軽鎖は、単一の核酸分子上
に、または２つの別個の核酸分子によって一緒にコードされ得ることが理解されるであろ
う。
別の態様では、本発明の核酸の１つ以上を含むベクターが提供される。
本発明の別の態様では、本発明の抗体の重鎖および／または軽鎖、またはその両方をコ
ードする１以上の核酸を含有する宿主細胞が提供される。いくつかの実施形態において、
該宿主細胞は、核酸が発現される条件下で増殖される。他の実施形態において、本発明の
抗体を回収する方法が提供される。
本発明の態様は、抗体、またはその抗原結合フラグメントを作製する方法を含み、該方
法は、該抗体、または抗原結合フラグメントが宿主細胞中で発現される条件下で宿主細胞
を培養すること、および任意に該抗体または抗原結合フラグメントを単離することを含む
。
本発明の態様は、本明細書に記載されるような抗体または抗原結合フラグメントと、薬
学的に許容される担体とを含む薬学的組成物を含む。
ある態様において、医薬組成物または医薬は、有効量の第２の治療薬をさらに含む。
本発明のさらなる態様において、障害を治療する方法が提供され、該方法は、それを必
要とする患者に、ＳＬＡＭＦ６（配列番号１１）に結合する本発明の抗体または抗原結合
フラグメントを投与することを含む。一実施形態では、障害は癌である。
さらなる態様において、本発明の抗体または抗原結合フラグメントの有効量を、それを
必要とする対象に投与することを含む、癌を治療する方法が提供される。
一実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号５を含むＣＤＲ－Ｈ１
、配列番号６または配列番号１５を含むＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号７を含むＣＤＲ－
Ｈ３を含む重鎖可変領域と、配列番号８または配列番号１６を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番
号９または配列番号１７を含むＣＤＲ－Ｌ２、および配列番号１０を含むＣＤＲ－Ｌ３を
含む軽鎖可変領域とを含む。
好ましくは、重鎖可変領域は、配列番号５を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１５を含むＣ
ＤＲ－Ｈ２、および配列番号７を含むＣＤＲ－３を含む。
好ましくは、軽鎖可変領域は、配列番号１６を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１７を含む
ＣＤＲ－Ｌ２、および配列番号１０を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む。
いくつかの実施形態において、癌を治療する方法が提供され、ここで、それを必要とす
る患者に本発明の抗体または抗原結合フラグメントが投与され、本発明の前記抗体または
抗原結合フラグメントが、免疫反応、例えば、細胞傷害性Ｔ細胞応答および／またはＮＫ
細胞応答を誘導しおよび／または増強する。
さらなる実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＳＬＡＭＦ６（
配列番号１１）および腫瘍特異的抗原に結合する二重特異性または多重特異性抗体または
その抗原結合フラグメントを含む。
いくつかの実施形態において、癌は、小細胞肺癌、非小細胞肺癌（扁平上皮癌および腺
癌を含む）、メラノーマを含む皮膚癌、乳癌（ＴＮＢＣを含む）、結腸直腸癌、胃（gast
ric）癌、卵巣癌、子宮癌、前立腺癌、腎臓癌、肝細胞癌を含む肝臓癌、膵臓癌、頭頸部
癌、鼻咽頭癌、食道癌、膀胱癌および他の尿路上皮癌、胃（stomach）癌、神経膠腫、神
経膠芽腫、精巣、甲状腺、骨、胆嚢および胆管、子宮、副腎癌、肉腫、ＧＩＳＴ、神経内
分泌腫瘍、および血液悪性腫瘍からなる群より選択される。
本発明のさらなる態様によれば、予防または治療に使用するための本発明の抗体または
抗原結合フラグメントが提供される。
好ましくは、抗体または抗原結合フラグメントは、癌の予防または治療に使用するため
のものである。
本発明のさらなる態様によれば、癌の治療のための医薬の製造における本発明による抗
体または抗原結合フラグメントの使用が提供される。
いくつかの実施形態において、これまでの態様に係る癌は、小細胞肺癌、非小細胞肺癌
（扁平上皮癌および腺癌を含む）、メラノーマを含む皮膚癌、乳癌（ＴＮＢＣを含む）、
結腸直腸癌、胃（gastric）癌、卵巣癌、子宮癌、前立腺癌、腎臓癌、肝細胞癌を含む肝
臓癌、膵臓癌、頭頸部癌、鼻咽頭癌、食道癌、膀胱癌および他の尿路上皮癌、胃（stomac
h）癌、神経膠腫、神経膠芽腫、精巣、甲状腺、骨、胆嚢および胆管、子宮、副腎癌、肉
腫、ＧＩＳＴ、神経内分泌腫瘍、および血液悪性腫瘍からなる群から選択される。
図１ａは、親マウス１Ｂ３抗体（配列番号１）の重鎖の可変領域のアミノ酸配列を示す。図１ｂは、親マウス１Ｂ３抗体（配列番号２）の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列を示す。 図２ａは、ヒト化抗体Ｈｕ_１Ｂ３（配列番号１３）の重鎖の可変領域のアミノ酸配列を示す。図２ｂは、ヒト化抗体Ｈｕ_１Ｂ３（配列番号１４）の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列を示す。 図３ａは、１Ｂ３親マウス抗体配列の重鎖可変領域およびヒト化重鎖可変領域１Ｂ３配列の配列アラインメントを示す。図３ｂは、１Ｂ３親マウス抗体配列の軽鎖可変領域およびヒト化軽鎖可変領域Ｈｕ_１Ｂ３配列の配列アラインメントを示す。 図４は、Ｒａｊｉ細胞を発現する１Ｂ３に対する抗体１Ｂ３の特異的用量依存的結合を示す。 図５は、別の臨床段階のＳＬＡＭＦ６抗体と比較して、抗体Ｈｕ_１Ｂ３がＴ細胞活性化時にＩＦＮγ産生を媒介する能力を増強したことを示す。 図６は、抗体１Ｂ３が、原発性ＮＳＣＬＣ腫瘍サンプルから単離された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を誘導して、ｅｘ ｖｉｖｏアッセイにおいてインターフェロンガンマを産生し得ることを示す。 図７は、抗体１Ｂ３が、原発性乳癌試料から単離されたＴＩＬを誘導して、ｅｘ ｖｉｖｏアッセイにおいてインターフェロンガンマを産生し得ることを示す。このアッセイは、抗体１Ｂ３がペンブロリズマブと比較した場合、活性が増強されることを示す。 図８は、抗体１Ｂ３が、原発性結腸直腸癌試料から単離されたＴＩＬを誘導して、ｅｘ ｖｉｖｏアッセイにおいてインターフェロンガンマを産生し得ることを示す。このアッセイは、抗体１Ｂ３がペンブロリズマブと比較した場合、活性が増強されることを示す。 図９は、抗体Ｈｕ_１Ｂ３を用いて単離されたＴ細胞上に存在するＳＬＡＭＦ６を活性化すると、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖が誘導されることを示す。 図１０は、ＭＬＲアッセイであり、抗体Ｈｕ_１Ｂ３が、ＩＦＮｙ放出の増加によって強調されるように、ＤＣ媒介Ｔ細胞活性化を誘導し得ることを示す。 図１１は、抗ＳＬＡＭＦ６抗体Ｈｕ_１Ｂ３が活性化Ｔ細胞を誘導し、用量依存的にグランザイムＢを産生することができることを示す。 図１２は、抗体Ｈｕ_１Ｂ３がＣＤ８＋Ｔ細胞上のパーフォリン発現を用量依存的にアップレギュレートすることを示している。 図１３は、Ｈｕ_１Ｂ３抗体が、ヒトＳＬＡＭＦ６ ＥＣＤ－ｍＩｇＧ２ａ Ｆｃ融合タンパクの存在下で、ＰＢＭＣの表面上のレセプターへの結合を遮断されることを示す。 図１４は、Seattle Geneticsによって産生される抗ＳＬＡＭＦ６抗体よりも有意に少ないＳＬＡＭＦ６発現細胞へのヒト化抗体Ｈｕ_１Ｂ３盛り込みを示す。 図１５は、Ｈｕ_１Ｂ３の添加が、抗ｈｅｒ２抗ＣＤ３Ｂｉ特異的抗体と共に使用される場合、ＳＫＢＲ－３細胞に対するリンパ球細胞毒性を増強することを示す。 図１６は、Ｈｕ_１Ｂ３の添加が、抗ｈｅｒ２抗ＣＤ３Ｂｉ特異的抗体と共に使用される場合、ＳＫＢＲ－３細胞に対するリンパ球細胞毒性を増強することを示す。 図１７は、Ｈｕ_１Ｂ３の添加が、抗ｈｅｒ２抗ＣＤ３二重特異的抗体とともに用いた場合のＨＣＴ１１６細胞に対するリンパ球細胞毒性を増強することを示す。 図１８は、Ｈｕ_１Ｂ３の添加が、抗ｈｅｒ２抗ＣＤ３二重特異性抗体と共に使用される場合、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞に対するリンパ球細胞毒性を増強することを示す。 図１９は、各種抗体で９６時間リンパ球を活性化した後、抗体ＨＵ_１Ｂ３はウレルマブ（抗ＣＤ１３７）またはアイソタイプのいずれよりも有意に多くのＳＫＢＲ－３細胞の死をもたらすことを示している。 図２０は、固定濃度の抗Ｈｅｒ２／抗ＣＤ３二重特異性抗体と共に使用した場合、Ｈｕ_１Ｂ３の添加がＳＫＢＲ－３細胞に対するリンパ球細胞毒性を用量依存的に増強することを示す。 図２１ａおよび２１ｂは、可能な（enabling）二重特異性抗体の非存在下でのＨｕ_１Ｂ３の添加は、ＳＫＢＲ－３細胞に対するリンパ球細胞毒性も増強することを示す。
本発明の態様としては、ＳＬＡＭＦ６に対する抗体、このような抗体をコードする核酸
、本願の抗体をコードするこのような核酸を含む宿主細胞、抗ＳＬＡＭＦ６抗体を調製す
るための方法、および、ＳＬＡＭＦ６を介した障害、例えば、小細胞肺癌、非小細胞肺癌
（扁平上皮癌および腺癌を含む）、メラノーマを含む皮膚癌、乳癌（ＴＮＢＣを含む）、
結腸直腸癌、胃（gastric）癌、卵巣癌、子宮癌、前立腺癌、腎臓癌、肝細胞癌を含む肝
臓癌、膵臓癌、頭頸部癌、鼻咽頭癌、食道癌、膀胱癌および他の尿路上皮癌、胃（stomac
h）癌、神経膠腫、神経膠芽腫、精巣、甲状腺、骨、胆嚢および胆管、子宮、副腎癌、肉
腫、ＧＩＳＴ、神経内分泌腫瘍、および血液悪性腫瘍を含むが、これらに限定されないヒ
トの癌などの疾患の治療方法が挙げられる。
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「１つの（ａ）」、
「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が別途明確に指示しない限り、
複数の参照を含むことに留意されたい。そのように、特許請求の範囲は、任意の任意の要
素を除外するようにドラフトすることができることにさらに留意されたい。そのように、
この記述は、特許請求の範囲の要素の記載に関連して、「唯一の」、「のみ」などのよう
な排他的な用語の使用、または「否定的である」限定の使用のための先行する基礎として
役立つことを意図している。
本開示を読むことにより当業者には明らかであるように、本明細書に記載され図示され
た個々の態様の各々は、本発明の範囲または趣旨から逸脱することなく、他のいくつかの
態様のいずれかの特徴から容易に分離または組み合わせることができる個別の構成要素お
よび特徴を有する。引用した方法のいずれも、引用した事象の順序で、または、論理的に
可能なその他任意の順序で、実行することができる。
定義
本明細書を解釈するために、以下の定義が適用され、適切な場合はいつでも、単数形で
使用される用語も複数形を含み、その逆も同様である。
「ＳＬＡＭＦ６」という用語は、本明細書で使用する場合、特に明記しない限り、霊長
類（例えば、ヒト、霊長類、およびげっ歯類（例えば、マウスおよびラット））などの哺
乳類を含む、任意の脊椎動物源由来の任意の天然ＳＬＡＭＦ６タンパクを指す。ＳＬＡＭ
Ｆ６タンパクは、ＳＬＡＭＦ６様タンパクとも呼ばれる。ヒトＳＬＡＭＦ６のアミノ酸配
列は、本明細書中で配列番号１１に提供される。
「ＳＬＡＭＦ６」という用語は、「全長」の未処理ＳＬＡＭＦ６ならびに細胞内のプロ
セシングから生じる任意の形態のＳＬＡＭＦ６を包含する。この用語はまた、ＳＬＡＭＦ
６の天然に存在する変異体、例えば、スプライス変異体、対立遺伝子変異体およびアイソ
フォームを包含する。この用語は、ＳＬＡＭＦ６ポリペプチドの天然に存在する切断型ま
たは分泌型（例えば、細胞外ドメイン配列）を包含する。本明細書に記載のＳＬＡＭＦ６
ポリペプチドは、ヒト組織タイプまたは別の供給源などの様々な供給源から単離すること
ができ、または組換えまたは合成の方法によって調製することができる。「天然配列ＳＬ
ＡＭＦ６ポリペプチド」は、自然由来の対応するＳＬＡＭＦ６ポリペプチドと同じアミノ
酸配列を有するポリペプチドを含む。そのような天然配列ＳＬＡＭＦ６ポリペプチドは、
自然から単離することができ、または組換えまたは合成手段によって産生することができ
る。本明細書で使用される「ＳＬＡＭＦ６エピトープ」という用語は、本明細書に記載の
ＣＤＲ配列の少なくとも１つまたは複数を含む抗体によって結合される、および／または
実施例に示されるような抗ＳＬＡＭＦ６抗体の結合プロファイルによって例示されるエピ
トープを指す。
「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、例えば、１つの抗ＳＬＡＭＦ６モノ
クローナル抗体（アゴニスト、アンタゴニスト、中和抗体、全長または完全なモノクロー
ナル抗体を含む）、ポリエピトピー特異性を有する抗ＳＬＡＭＦ６抗体組成物、ポリクロ
ーナル抗体、多価抗体、少なくとも２つのインタクト抗体から形成される多重特異性抗体
（例えば、所望の生物学的活性を示す限り、二重特異性抗体）、一本鎖抗ＳＬＡＭＦ６抗
体、およびＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖおよびＦＶ－ＴＣＲフラグメン
トを含む抗ＳＬＡＭＦ６抗体の抗原結合フラグメント、ダイアボディ、単一ドメイン抗体
（ｓｄＡｂ）を、それらが所望の生物学的または免疫学的活性を示す限り、具体的に包含
する。用語「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、本明細書中の用語「抗体」と交換可能に使用
される。抗体は、キメラ、ヒト、ヒト化および／または親和性成熟させたものであり得る
。いくつかの実施形態において、少なくとも抗体は、本明細書で定義されるような６つの
ＣＤＲのセットを含むことが当業者によって理解され、それらには、従来の抗体（モノク
ローナル抗体とポリクローナル抗体の両方を含む）、ヒト化、ヒトおよび/またはキメラ
抗体、抗体フラグメント、操作された抗体（例えば、以下に概説されるようなアミノ酸修
飾を伴う）、多重特異性抗体（二重特異性抗体を含む）、および当技術分野で知られ、本
明細書で論じられる他の類似体が含まれるが、これらに限定されない。
他の実施形態では、本明細書で使用される用語「抗体」は、限定されないが、Ｎａｎｏ
ｂｏｄｙ（登録商標）、Ｕｎｉｂｏｄｙ（登録商標）およびｓｃＦｖフラグメントを含む
、６つのＣＤＲを含まない構造を指すことが理解されるであろう。
「抗ＳＬＡＭＦ６抗体」、「ＳＬＡＭＦ６抗体」、または「ＳＬＡＭＦ６に結合する抗
体」という用語は、ＳＬＡＭＦ６を標的とする診断および／または治療薬として有用であ
るような十分な親和性でＳＬＡＭＦ６に結合することができる抗体を指す。特定の実施形
態では、抗ＳＬＡＭＦ６抗体は、異なる種由来のＳＬＡＭＦ６の間で保存されているＳＬ
ＡＭＦ６のエピトープに結合する。
「単離された抗体」は、その環境の成分から同定されおよび分離され、並びに／または
回収されたものである。その環境の混入（汚染）成分は、抗体の治療的使用を妨げる材料
であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク性または非タンパク性溶質を含むことがで
きる。
標的分子への抗体の結合に関して、「特異的結合」または特定のポリペプチドまたは特
定のポリペプチド標的上のエピトープに対して「特異的に結合する」もしくは「特異的」
という用語は、非特異的相互作用とは測定可能に異なる結合を意味する。特異的結合は、
例えば、対照分子（一般に、結合活性を有さない類似の構造の分子である）の結合と比較
して、分子の結合を決定することによって測定することができる。
用語「アンタゴニスト」は、最も広い意味で使用され、天然のＳＬＡＭＦ６ポリペプチ
ドの生物学的活性を部分的または完全にブロック、阻害、または中和する任意の分子を含
む。適切なアンタゴニスト分子としては、具体的に、アンタゴニスト抗体または抗体フラ
グメント、天然ＳＬＡＭＦ６ポリペプチド、ペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド
、低分子有機分子などのフラグメントまたはアミノ酸配列変異体、が挙げられる。ＳＬＡ
ＭＦ６ポリペプチドのアンタゴニストを同定するための方法は、ＳＬＡＭＦ６ポリペプチ
ドを候補アンタゴニスト分子と接触させ、ＳＬＡＭＦ６ポリペプチドに通常関連する１つ
以上の生物学的活性の検出可能な変化を測定することを含み得る。
「アゴニスト」という用語は、最も広い意味で使用され、天然のＳＬＡＭＦ６ポリペプ
チドの生物学的活性を増強する任意の分子を含む。適切なアゴニスト分子には、ＳＬＡＭ
Ｆ６リガンドポリペプチド、ペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子有機分
子などの、アゴニスト抗体または抗体フラグメント、フラグメントまたはアミノ酸配列変
異体が具体的に含まれる。ＳＬＡＭＦ６ポリペプチドのアゴニストを同定するための方法
は、ＳＬＡＭＦ６ポリペプチドを候補アゴニスト分子と接触させ、ＳＬＡＭＦ６ポリペプ
チドと通常関連する１つ以上の生物学的活性の検出可能な変化を測定することを含み得る
。
「腫瘍」とは、本明細書で使用する場合、悪性または良性を問わず、すべての新生物細
胞の成長および増殖、ならびにすべての前癌性および癌性の細胞および組織を指す。
本明細書で使用される「予測的」および「予後的」という用語はまた、予測または予後
判定のための方法が、本方法を実施する者が、抗ＳＬＡＭＦ６抗体を含む抗癌剤による治
療に反応する可能性がより高いとみなされる患者を（通常、治療の前に、しかし必ずしも
そうではない）選択することを可能にすることを意味する場合において、交換可能である
。
ＳＬＡＭＦ６タンパク
ＵＮＩＰＲＯＴによれば、ＳＬＡＭＦ６は、免疫グロブリンスーパーファミリーおよび
ＣＤ２サブファミリーのシングルパスタイプＩ膜タンパクである。タンパクは、配列番号
１１のアミノ酸２２～２２６の間の細胞外ドメイン、アミノ酸２２７～２４７の間の１つ
の膜貫通領域、およびアミノ酸２４８～３３１の間の１つの細胞質領域からなる。
いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、ヒトＳＬＡＭＦ６に結合する。本明細
書で使用される「ヒトＳＬＡＭＦ６」または「ヒトＳＬＡＭＦ６タンパク」は、本明細書
で定義される配列番号１１のタンパクを指す。
本発明の実施形態による抗体は、ある場合には、ヒト以外の種由来のＳＬＡＭＦ６タン
パクと交差反応し得る。例えば、前臨床試験および毒性試験を容易にするために、本発明
の抗体は、ネズミまたは霊長類のＳＬＡＭＦ６タンパクと交差反応し得る。あるいは、特
定の実施形態では、抗体は、ヒトＳＬＡＭＦ６タンパクに特異的であってもよく、種また
は他のタイプの非ヒト交差反応性を示さなくてもよい。
抗体
本発明の態様は、本明細書に記載されるように、抗ＳＬＡＭＦ６抗体、一般的に治療抗
体および／または診断抗体を含む。本発明の方法における使用を見出す抗体は、本明細書
にさらに記載されるように、伝統的な抗体ならびに抗体誘導体、抗原結合フラグメントお
よび模倣物を含む、本明細書に記載されるような多数のフォーマットのいずれかをとるこ
とができる。いくつかの実施形態において、抗体は、本明細書に定義される６つのＣＤＲ
のセット（本明細書に記載される少数のアミノ酸変化を含む）から選択される１つまたは
複数のＣＤＲを有する。上記でレビューしたように、本明細書で使用される用語「抗体」
は、種々の構造を指す。
いくつかの実施形態において、ＩｇＧアイソタイプは、本発明において使用される。一
実施形態では、ＦｃサイレンシングされたＩｇＧ１アイソタイプ抗体が使用される。別の
実施形態では、ＩｇＧ４アイソタイプ抗体が使用される。
抗体の各鎖のアミノ末端部分は、抗原認識に主に関与する約１００～１１０個以上のア
ミノ酸の可変領域を含む。可変領域では、重鎖および軽鎖のＶドメインのそれぞれに対し
て３つのループが集まり、抗原結合部位を形成する。各ループは相補性決定領域（以下、
「ＣＤＲ」という。）と呼ばれ、アミノ酸配列の変異が最も顕著である。「可変」とは、
可変領域の特定のセグメントが抗体間で配列が大きく異なることを意味する。可変領域内
の可変性は均等に分布していない。その代わり、Ｖ領域は、１５～３０個のアミノ酸から
なるフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる比較的不変の伸長領域からなり、それぞれ９
～１５個のアミノ酸からなる「超可変領域」と呼ばれる極端な可変性を有する短い領域に
よって隔てられている。
各ＶＨおよびＶＬは、３つの超可変領域（「相補的決定領域」、「ＣＤＲ」）および４
つのＦＲから構成され、アミノ末端からカルボキシ末端へ、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－
ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４の順に配列される。
超可変領域は、一般に、軽鎖可変領域における２４－３４（ＣＤＲ－Ｌ１；「Ｌ」は軽
鎖）、５０－５６（ＣＤＲ－Ｌ２）および８９－９７（ＣＤＲ－Ｌ３）並びに重鎖可変領
域における約３１－３５Ｂ（ＣＤＲ－Ｈ１；「Ｈ」は重鎖、５０－６５（ＣＤＲ－Ｈ２）
および９５－１０２（ＣＤＲ－Ｈ３）由来のアミノ酸残基、Kabat et al., SEQUENCES OF
PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5th Ed. Public Health Service, National Ins
titutes of Health, Bethesda, Md. (1991) および／または超可変ループ（例えば、軽鎖
可変領域における残基２６－３２（ＣＤＲ－Ｌ１）、５０－５２（ＣＤＲ－Ｌ２）および
９１－９６（ＣＤＲ－Ｌ３）、および重鎖可変領域において２６－３２（ＣＤＲ－Ｈ１）
、５３－５５（ＣＤＲ－Ｈ２）および９６－１０１（ＣＤＲ－Ｈ３）を形成するこれらの
残基、Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917を包含する。本発明の具体
的なＣＤＲを以下に記載する。
本明細書全体を通して、Ｋａｂａｔナンバリングシステムは、可変ドメイン中の残基（
およそ、軽鎖可変領域の残基１～１０７および重鎖可変領域の残基１～１１３）を参照す
る場合に、一般に使用される（例えば、上記Kabat et al., (1991)）。
ＣＤＲは、抗体の抗原結合部位、より具体的にはエピトープ結合部位の形成に寄与する
。１つの抗原が複数のエピトープをもつことがある。
免疫グロブリンのＩｇＧサブクラスには、重鎖にいくつかの免疫グロブリンドメインが
ある。本明細書における「免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメイン」とは、別個の三次構造を有
する免疫グロブリンの領域を意味する。本発明において興味深いのは、定常重鎖（ＣＨ）
ドメインおよびヒンジドメインを含む重鎖ドメインである。ＩｇＧ抗体との関連では、Ｉ
ｇＧアイソタイプはそれぞれ３つのＣＨ領域をもつ。
重鎖の別のタイプのＩｇドメインはヒンジ領域である。本明細書における「ヒンジ」ま
たは「ヒンジ領域」または「抗体ヒンジ領域」または「免疫グロブリンヒンジ領域」とは
、抗体の第１および第２の定常ドメイン間のアミノ酸を含むフレキシブル（柔軟性）ポリ
ペプチドを意味する。
本発明において特に興味深いのは、Ｆｃ領域である。本明細書で使用される「Ｆｃ」ま
たは「Ｆｃ領域」または「Ｆｃドメイン」とは、第１の定常領域免疫グロブリンドメイン
および場合によってはヒンジの一部を除く抗体の定常領域を含むポリペプチドを意味する
。したがって、Ｆｃは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＧの最後の２つの定常領域免疫グロ
ブリンドメイン、ＩｇＥおよびＩｇＭの最後の３つの定常領域免疫グロブリンドメイン、
およびこれらのドメインに対するフレキシブルヒンジＮ末端を指す。ＩｇＡおよびＩｇＭ
については、ＦｃはＪ鎖を含むことができる。ＩｇＧについては、Ｆｃドメインは、免疫
グロブリンドメインＣγ２およびＣγ３（Ｃγ２およびＣγ３）と、Ｃγ１（Ｃγ１）と
Ｃγ２（Ｃγ２）の間の下部ヒンジ領域とを含む。Ｆｃ領域の境界は様々であり得るが、
ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、そのカルボキシル末端への残基Ｃ２２６またはＰ２３
０を含むように定義され、ここで、番号付けは、ＫａｂａｔにおけるようなＥＵインデッ
クスに従う。いくつかの実施形態において、アミノ酸改変は、例えば、１以上のＦｃγＲ
レセプターまたはＦｃＲｎレセプターへの結合を改変するために、Ｆｃ領域に対して行わ
れる。
いくつかの実施形態において、抗体は完全長である。本明細書における「全長抗体」と
は、本明細書に概説されるような１つ以上の修飾を任意に含む可変領域および定常領域を
含む、抗体の天然の生物学的形成を構成する構造を意味する。
あるいは、抗体は、抗原結合フラグメント、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、ミ
ニボディー、ドメイン抗体、合成抗体（本明細書では「抗体模倣物」と呼ばれることもあ
る）、キメラ抗体、ヒト化抗体、抗体溶融物（「抗体コンジュゲート」と呼ばれることも
ある）、およびそれぞれの抗原結合フラグメントを含むが、これらに限定されない様々な
構造とすることができ、一セットのＣＤＲの使用に依存する構造は、「抗体」の定義内に
含まれる。
１つの実施形態において、抗体は抗原結合フラグメントである。特異的抗原結合抗体フ
ラグメントとしては、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなるＦａｂフラ
グメント、（ｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント、（ｉｉｉ）単
一抗体のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント、（ｉｖ）単一可変領域から
なるｄＡｂフラグメント（参照により全体が組み込まれるWard et al., 1989, Nature 34
1:544-546）、（ｖ）単離されたＣＤＲ領域、（ｖｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、２
つの連結されたＦａｂフラグメントを含む２価フラグメント、（ｖｉｉ）単鎖Ｆｖ分子（
ｓｃＦｖ）であって、ＶＨドメインおよびＶＬドメインが、２つのドメインが結合して抗
原結合部位を形成することを可能にするペプチドリンカーによって連結されるもの（参照
により全体が組み込まれるBird et al., 1988, Science 242:423-426, Huston et al., 1
988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:5879-5883）、（ｖｉｉｉ）二重特異性一本鎖
Ｆｖ（参照により全体が組み込まれる国際公開第０３／１１１６１号、）および（ｉｘ）
「ダイアボディー」または「トリアボディー」、遺伝子融合により構築された多価または
多重特異的フラグメント（それらの全体において参照により組み込まれるTomlinson et.
al., 2000, Methods Enzymol. 326:461-479; WO94/13804; Holliger et al., 1993, Proc
. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448）が含まれるが、これらに限定されない。
キメラおよびヒト化抗体
いくつかの実施形態において、抗体は、異なる種、例えば、キメラ抗体および／または
ヒト化抗体からの混合物であり得る。すなわち、本発明において、ＣＤＲセットは、本明
細書中の配列によって具体的に記載されるもの以外のフレームワークおよび定常領域と共
に使用することができる。
一般に、「キメラ抗体」と「ヒト化抗体」とは、複数の種からの領域を結合する抗体を
いい、例えば、「キメラ抗体」は、典型的に、マウス（またはラット、場合によっては）
からの可変領域およびヒトからの定常領域を含む。「ヒト化抗体」とは、一般に、ヒト抗
体に見られる配列について交換された可変ドメインフレームワーク領域を有する非ヒト抗
体をいう。一般に、ヒト化抗体において、ＣＤＲを除く抗体全体は、ヒト起源のポリヌク
レオチドによってコードされるか、またはそのＣＤＲ内を除いてそのような抗体と同一で
ある。ＣＤＲは、その一部または全部が非ヒト生物に由来する核酸によってコードされて
おり、ヒト抗体可変領域のベータシートフレームワークに移植されて抗体を作製し、その
特異性は生着されたＣＤＲによって決定される。このような抗体の作製は、例えば、WO 9
2/11018, Jones, 1986, Nature 321:522-525, Verhoeyen et al., 1988, Science 239:15
34-1536に記載されており、全て参照により完全に組み込まれている。１つの実施形態に
おいて、本発明の抗体は、多重特異性抗体、特に二重特異性抗体であり得、時に「ダイア
ボディ」とも呼ばれる。これらは、２つ（またはそれ以上）の種々の抗原、または同じ抗
原上の異なるエピトープに結合する抗体である。ダイアボディーは、当技術分野で公知の
種々の方法（Holliger and Winter, 1993, Current Opinion Biotechnol. 4:446-449、参
照により完全に組み込まれる）で製造することができ、例えば、化学的に、またはハイブ
リッドハイブリドーマから製造することができる。
一実施形態においては、抗体はミニボディである。ミニボディーは、ＣＨ３ドメインに
結合したｓｃＦｖを含む抗体様タンパクを最小化する。参照により完全に援用する、Hu e
t al., 1996, Cancer Res. 56:3055-3061。場合によっては、ｓｃＦｖは、Ｆｃ領域に結
合することができ、ヒンジ領域の一部または全体を含むことができる。ミニボディは、Ｃ
ＤＲの完全なセットを有していないにもかかわらず、「抗体」の定義内に含まれることに
留意されたい。
本発明の抗体は、一般に、単離または組換え体である。
いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、組換えタンパク、単離タンパクまたは
実質的に純粋なタンパクである。「単離された」タンパクは、それが通常その天然状態で
会合している物質の少なくともいくつかを伴わず、例えば、所与の試料中の全タンパクの
少なくとも約５重量％、または少なくとも約５０重量％を構成する。単離されたタンパク
は、状況に応じて、全タンパク含量の５～９９．９重量％を構成し得ることが理解される
。例えば、タンパクは、誘導性プロモーターまたは高発現プロモーターを使用することに
よって、かなり高い濃度で作製され得、その結果、タンパクは、増加した濃度レベルで作
製される。組換えタンパクの場合、その定義は、それが天然に産生されない当該技術分野
で公知である広範な生物および／または宿主細胞における抗体の産生を含む。通常、単離
されたポリペプチドは、少なくとも１つの精製工程によって調製される。「単離された抗
体」とは、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指す。例えば、
ＳＬＡＭＦ６に特異的に結合する単離された抗体は、ＳＬＡＭＦ６以外の抗原に特異的に
結合する抗体を実質的に含まない。
異なる特異性を有する単離されたモノクローナル抗体は、明確に定義された組成物中で
組み合わせることができる。したがって、例えば、本発明の抗体は、以下にさらに論じら
れるように、任意に、および個別に、製剤中に含まれ得るか、または除外され得る。
特定の抗原またはエピトープに対する特異的結合は、例えば、少なくとも約１０－４Ｍ
、少なくとも約１０－５Ｍ、少なくとも約１０－６Ｍ、少なくとも約１０－７Ｍ、少なく
とも約１０－８Ｍ、少なくとも約１０－９Ｍ、あるいは少なくとも約１０－１０Ｍ、少な
くとも約１０－１１Ｍ、少なくとも約１０－１２Ｍ以上の抗原またはエピトープについて
のＫＤを有する抗体によって示すことができ、ここで、ＫＤは、特定の抗体－抗原相互作
用の解離速度を指す。典型的には、抗原に特異的に結合する抗体は、対照分子と比較して
抗原またはエピトープについて２０－、５０－、１００－、５００－、１０００－、５０
００－、１０，０００－倍以上低いＫＤを有するであろう。
また、特定の抗原またはエピトープに対する特異的結合は、例えば、ＫＡまたはＫａが
特定の抗体－抗原相互作用の会合速度を指す場合、対照と比較してエピトープに対して少
なくとも２０－、５０－、１００－、５００－、１０００－、５０００－、１０，０００
－倍以上の抗原またはエピトープに対するＫＡまたはＫａを有する抗体によって示すこと
ができる。
ＳＬＡＭＦ６に対する抗体の結合能力を評価するための標準的なアッセイは、タンパク
または細胞レベルで行うことができ、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、ＲＩＡ
、オクテット（登録商標）、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）アッセイおよびフローサイトメ
トリー分析を含み、当該分野で公知である。適切なアッセイは、実施例に詳細に記載され
る。抗体の結合動態（例えば、結合親和性）はまた、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）または
Ｏｃｔｅｔ（登録商標）システム解析などにより、当技術分野で公知の標準的アッセイに
より評価することができる。
ＳＬＡＭＦ６抗体
本発明は、ＳＬＡＭＦ６ポリペプチドまたはその一部に結合するＳＬＡＭＦ６抗体を提
供する。ＳＬＡＭＦ６アミノ酸配列の実施例は、配列番号１１に提供される。主題のＳＬ
ＡＭＦ６抗体は、腫瘍における免疫応答を増強するために、免疫細胞活性化、例えば、Ｔ
細胞活性化および／またはＮＫ細胞活性化を誘導または増強することができる。これらの
抗体は、本明細書では、「抗ＳＬＡＭＦ６」抗体、または説明を容易にするために、「Ｓ
ＬＡＭＦ６抗体」と称される。
いくつかの態様において、主題のＳＬＡＭＦ６抗体は、Ｔ細胞、特にその表面にＳＬＡ
ＭＦ６を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞と接触すると、サイトカイン放出または
増殖を誘導および／または増強することができる。この状況におけるサイトカイン放出ま
たはＴ細胞増殖は、いくつかの方法で測定することができる。１つの実施形態において、
本発明のＳＬＡＭＦ６抗体は、ＥＬＩＳＡなどの標準アッセイを使用して、活性化Ｔ細胞
と接触される。さらなる実施形態において、対象のＳＬＡＭＦ６抗体は、ＮＫ細胞活性化
および殺傷を誘導および／または増強することができる。
一実施形態では、抗体は、以下のＣＤＲを含む抗体であり；加えて、以下で論じるよう
に、これらのＣＤＲ配列はまた、以前に記載されたように、限られた数のアミノ酸変異体
を含有することができる：
いくつかの実施形態において、抗体は、配列番号５、１５、７、１６、１７および１０
に提供される少なくとも１つ以上のＣＤＲ配列のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形
態において、抗体は、配列番号５、１５、７、１６、１７および１０で提供されるＣＤＲ
配列の１つまたは複数のアミノ酸配列と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、
９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
本明細書には、本発明のＣＤＲセットを含む可変重鎖および軽鎖、ならびに全長重鎖お
よび軽鎖（例えば、定常領域も含む）も開示される。当業者には理解されるように、本発
明のＣＤＲセットは、マウス、ヒト化またはヒト定常領域（フレームワーク領域を含む）
に組み込むことができる。本発明の態様は、本明細書に開示される重鎖可変領域配列（配
列番号１３）および軽鎖可変領域配列（配列番号１４）と少なくとも約８０％、８５％、
９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である重鎖可変領域および軽
鎖可変領域を含む。
いくつかの実施形態において、本発明は、本明細書に記載される本発明のＳＬＡＭＦ６
モノクローナル抗体（すなわち、本明細書に記載される本発明のモノクローナル抗体とＳ
ＬＡＭＦ６タンパクと結合するためにクロス競合する能力を有する抗体）として、ヒトＳ
ＬＡＭＦ６上の同じエピトープに結合するか、またはそれとクロス競合する抗体を提供す
る。交差競合すると考えられる抗体については、参照抗体のブロック結合を必ずしも完全
に遮断するわけではないことが理解されるであろう。いくつかの実施形態において、参照
抗体の結合は、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、７５、８０、
８５、９０、９５、９７、９８または９９％減少する。
抗体修飾
本発明はさらに、「抗体誘導体」または「抗体類似体」と呼ばれることもある変異体抗
体を提供する。すなわち、ＣＤＲにおけるアミノ酸修飾（親和性成熟）、Ｆｃ領域におけ
るアミノ酸修飾、グリコシル化変異体、および他のタイプの共有結合修飾（例えば、薬物
結合体の結合などのための）を含むが、これらに限定されない、本発明の抗体に対して行
うことができる多くの修飾がある。
「変異体」とは、少なくとも１つのアミノ酸の改変により親ポリペプチドの配列とは異
なるポリペプチド配列を意味する。いくつかの実施形態において、親ポリペプチドは、配
列番号１もしくは２、１３もしくは１４に列挙される全長可変重鎖または軽鎖のいずれか
であるか、または配列番号５～１０、１５、１６もしくは１７のいずれかに開示されるＣ
ＤＲ配列の１つもしくは複数である。いくつかの実施形態において、アミノ酸の改変は、
置換、挿入および／または欠失を含むことができ、前者が多くの場合に好ましい。いくつ
かの実施形態において、置換は、保存的置換であり得る。
一般に、変異体は、本明細書中に記載されるように、抗体の機能が依然として存在する
限り、任意の数の改変を含むことができる。例えば、抗体はヒトＳＬＡＭＦ６に特異的に
結合するはずである。同様に、アミノ酸変異体がＦｃ領域内で生成される場合、例えば、
変異体抗体は、抗体の特定用途または表示のために必要な受容体結合機能を維持すべきで
ある。
主題の抗体の「変異体」は、本明細書に記載されるように、列挙されたＣＤＲ配列の１
つまたは複数、１つまたは複数のフレームワーク領域、または抗体の１つまたは複数の定
常領域（例えば、Ｆｃ領域）のいずれかにおいて、アミノ酸変異を有するようにすること
ができる。
いくつかの実施形態において、親配列と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、
９または１０個のアミノ酸の改変が一般的に利用され、その目的は、最小数の改変で機能
を改変することであることが多い。いくつかの実施形態において、１～５個（１、２、３
、４または５個）の修飾（例えば、個々のアミノ酸置換、挿入および／または欠失）があ
り、１～２、１～３および１～４からも多くの実施形態において使用が見出される。例え
ば、いくつかの実施形態において、本発明の抗体のＣＤＲ配列の１つ以上は、１つ以上、
例えば、１、２、３、４または５個のアミノ酸改変、好ましくは１－４、１－３、１また
は２個の改変を個々に含み得る。一般に、４、５、６、７、８、９、または１０個以下の
変化は、ＣＤＲのセット内で行われる。
アミノ酸修飾の数は、例えば、野生型または遺伝子操作されたタンパクのＦｃ領域に１
～５個の修飾、ならびに例えばＦｖ領域に１～５個の修飾を有することが望ましいであろ
うことに留意されたい。変異体ポリペプチド配列は、好ましくは、親配列（例えば、可変
領域配列、定常領域配列、および／または例えば抗体１Ｂ３のＣＤＲおよび／または重鎖
および軽鎖配列）に対して少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２
％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するで
あろう。
本明細書中の「アミノ酸置換」または「置換」とは、親ポリペプチド配列中の特定の位
置のアミノ酸を別のアミノ酸と置換することを意味し、本明細書中で使用される「アミノ
酸挿入」または「挿入」とは、親ポリペプチド配列中の特定の位置のアミノ酸を付加する
ことを意味する。本明細書中で使用される「アミノ酸欠失」または「欠失」とは、親ポリ
ペプチド配列中の特定の位置のアミノ酸を除去することを意味する。
本明細書で用いられる「親ポリペプチド」、「親タンパク」、「前駆体ポリペプチド」
、または「前駆体タンパク」とは、変異体を生成するためにその後修飾される未修飾ポリ
ペプチドを意味する。一般に、本明細書で用いられる親ポリペプチドは、１Ｂ３ポリペプ
チド、例えば１Ｂ３ ＶＨ鎖もしくはＶｌまたはＣＤＲ配列を指すこととしてもよい。し
たがって、本明細書で用いられる場合、「親抗体」とは、変異体抗体を生成するために修
飾される抗体を意味する。
本明細書における「野生型」または「ＷＴ」または「ナイーブ（天然型）」とは、対立
遺伝子変異を含む、天然に見出されるアミノ酸配列または核酸配列を意味する。ＷＴタン
パク、ポリペプチド、抗体、免疫グロブリン、ＩｇＧなどは、意図的に修飾されていない
アミノ酸配列または核酸配列を有する。
本明細書における「変異型（変異体）Ｆｃ領域」とは、少なくとも１つのアミノ酸の改
変により野生型Ｆｃ配列とは異なるＦｃ配列を意味する。Ｆｃ変異体は、Ｆｃポリペプチ
ド自体、Ｆｃ変異体ポリペプチドを含む組成物、またはアミノ酸配列を意味し得る。
いくつかの実施形態において、本発明の抗ＳＬＡＭＦ６抗体は、変異型Ｆｃドメインか
ら構成される。当技術分野で知られているように、抗体のＦｃ領域は、多数のＦｃレセプ
ターおよびリガンドと相互作用し、エフェクター機能と呼ばれる重要な機能能力のアレイ
を付与する。適当な修飾は、１つ以上の位置で、特にＦｃレセプターへの結合を減少また
は沈黙（サイレンス）する特定のアミノ酸置換に対して行うことができる。
上記に概説した変更に加えて、他の変更を加えることができる。例えば、分子は、ＶＨ
およびＶＬドメインを連結するジスルフィド架橋の取り込みによって安定化され得る（参
照により完全に組み込まれる、Reiter et al., 1996, Nature Biotech. 14:1239-1245）
。
さらに、システインでの修飾は、以下にさらに記載される抗体－薬物結合体（ＡＤＣ）
適用において特に有用である。いくつかの態様において、抗体の定常領域は、薬物部分の
より特異的かつ制御された配置を可能にするように、特に「チオール反応性」である１つ
以上のシステインを含有するように操作することができる。例えば、参照によりその全体
が本明細書に組み込まれる米国特許第７，５２１，５４１号を参照されたい。
さらに、以下に概説するように、抗体の様々な共有結合修飾がなされ得る。
抗体の共有結合的修飾は、本発明の範囲内に含まれ、一般的には翻訳後に行われるが、
必ずしも行われるわけではない。例えば、抗体の特定のアミノ酸残基を、選択された側鎖
またはＮ－またはＣ－末端残基と反応することができる有機誘導体化剤と反応させること
によって、抗体のいくつかの種類の共有結合修飾が分子に導入される。
加えて、当業者には理解されるように、標識（蛍光、酵素、磁気、放射性などを含む）
は、抗体（ならびに本発明の他の組成物）にすべて加えることができる。
二重特異的分子
別の態様では、本発明は、本発明の抗ＳＬＡＭＦ６抗体またはそのフラグメントを含む
二重特異性および多重特異性分子を含む。本発明の抗体またはその抗原結合フラグメント
は、別の機能的分子、例えば別のペプチドまたはタンパク（例えば、受容体に対する別の
抗体またはリガンド）に誘導体化または連結して、２つの異なる結合部位または標的分子
に結合する二重特異性分子を生成することができる。いくつかの実施形態において、本発
明の抗体、またはその抗原結合フラグメントは、少なくとも２つの機能的分子、例えば、
他のペプチドまたはタンパク（例えば、受容体に対する他の抗体またはリガンド）に誘導
体化または連結して、少なくとも３つの異なる結合部位または標的分子に結合する多特異
的分子を生成することができる。本発明の二重特異性または多重特異性分子を作製するた
めに、本発明の抗体は、機能的に（例えば、化学的カップリング、遺伝的溶融、非共有結
合またはその他により）、二重特異性または多重特異性分子が生じるように、別の抗体、
抗体フラグメント、ペプチドまたは結合模倣物などの１つまたは複数の他の結合分子に連
結することができる。
したがって、本発明は、第１の標的エピトープ（すなわち、ＳＬＡＭＦ６）のための少
なくとも１つの第１の結合ドメインと、第２の標的エピトープのための第２の結合ドメイ
ンとを含む二重特異性分子を含む。第２の標的エピトープは、第１の結合特異性によって
結合されたものと同じ標的タンパク上に存在してもよく、または第２の標的エピトープは
、第１の結合特異性によって結合されたものとは異なる標的タンパク上に存在してもよい
。第２の標的エピトープは、第１の標的エピトープ（すなわち、ＳＬＡＭＦ６）と同じ細
胞上に存在してもよく、または第２の標的エピトープは、第１の標的エピトープを示す細
胞によって示されない標的上に存在してもよい。本明細書で使用される場合、用語「結合
特異性」は、少なくとも１つの抗体可変ドメインを含む部分を指す。
本発明の別の実施形態では、第２の標的エピトープは腫瘍細胞上に存在する。したがっ
て、本発明の態様は、ＳＬＡＭＦ６発現エフェクター細胞（例えば、ＳＬＡＭＦ６発現細
胞傷害性Ｔ細胞）および第２の標的エピトープを発現する腫瘍細胞の両方に結合すること
ができる二重特異性分子を含む。
１つの実施形態において、本発明の二重特異性抗体は、合計２つまたは３つの抗体可変
ドメインを有することができ、ここで、二重特異性抗体の第１の部分は、ヒト免疫エフェ
クター細胞上に位置するエフェクター抗原に特異的に結合することによってヒト免疫エフ
ェクター細胞の活性を動員することができ、エフェクター抗原はＳＬＡＭＦ６であり、第
１の部分は、少なくとも１つの抗体可変ドメインからなり、二重特異性抗体の第２の部分
は、エフェクター抗原以外の標的抗原に特異的に結合することができ、標的抗原は、ヒト
免疫エフェクター細胞以外の標的細胞上に位置し、第２の部分は、少なくとも１つの抗体
可変ドメインを含む。
結合タンパクが多特異的である本発明の実施形態において、分子は、抗腫瘍、結合特異
性および抗ＳＬＡＭＦ６結合特異性に加えて、第３の結合特異性をさらに含むことができ
る。１つの実施形態において、第３の結合特異性は、抗増強因子（ＥＦ）部分、例えば、
細胞傷害活性に関与する表面タンパクに結合し、それによって標的細胞に対する免疫応答
を増加させる分子である。「抗増強因子部分」は、抗体、機能性抗体フラグメント、所定
の分子、例えば抗原または受容体に結合し、それによって標的細胞抗原に対する結合決定
基の効果の増強をもたらすリガンドであり得る。「抗増強因子部分」は、標的細胞抗原に
結合し得る。あるいは、抗増強因子部分は、第１および第２の結合特異性が結合する実体
（エンティティ）とは異なる実体に結合することができる。例えば、抗増強因子部分は、
細胞傷害性Ｔ細胞（例えば、標的細胞に対する増加した免疫応答をもたらすＣＤ２、ＣＤ
３、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＩＣＡＭ－１または他の免疫細胞を介して）
と結合することができる。
１つの実施形態において、本発明の二重特異性タンパクは、結合特異性として、少なく
とも１つの抗体、またはその抗原結合フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａ
ｂ’）２、Ｆｖ、ＦＶＴＣＲ、Ｆｄ、ｄＡｂもしくは一本鎖Ｆｖを含む）を含む。抗体は
また、軽鎖もしくは重鎖二量体、またはその任意の最小フラグメント、例えば、米国特許
第４，９４６，７７８号に記載されているようなＦｖもしくは単鎖構築物であってもよく
、その含有量は参照により明示的に組み込まれる。
いくつかの実施形態において、本発明の二重特異性分子に用いることができる抗体は、
ラット、マウス、ヒト、キメラまたはヒト化モノクローナル抗体である。
二重特異性分子の特異的標的への結合は、例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラ
ジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ＦＡＣＳ分析、バイオアッセイ（例えば、成長抑制）、
またはウェスタンブロットアッセイによって確認することができる。これらのアッセイの
各々は、一般に、目的の複合体に特異的な標識された試薬（例えば、抗体）を用いること
によって、目的のタンパク－抗体複合体の存在を検出する。
本発明の１つの実施形態において、二重特異性抗体は、４つの抗原結合領域を含有する
四価抗体である。好ましい態様において、抗体は、第１の抗原を標的とする２つのＦａｂ
ドメインを含み、それぞれが重鎖および軽鎖Ｆａｂ領域からなる。これらは天然ＩｇＧの
Ｆａｂｓと同じ立体配座で配列されている。抗体はさらに、第２の抗原を標的とする２つ
のキメラＦａｂドメインを含み、これらは、それぞれが可変重鎖ドメインを含むキメラ「
重鎖」鎖を含む２つのキメラポリペプチドドメインからなり、これは、そのＣ末端を介し
て、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のアルファ鎖またはベータ鎖の定常領域のＮ末端、および可
変軽鎖ドメインを含むキメラ「軽」鎖に連結され、これは、そのＣ末端を介してＴＣＲの
ベータ鎖またはアルファ鎖の定常領域のＮ末端にそれぞれ連結されている。
キメラの「重鎖」および「軽鎖」は、キメラＦａｂドメインに配置され、これらは、キメ
ラ「重鎖」鎖のＴＣＲのアルファ鎖またはベータ鎖の定常領域のＣ末端を、天然Ｆａｂド
メインの重鎖の可変領域のＮ末端に結合することによって天然Ｆａｂドメインに連結され
ている。したがって、全体的なシンメトリー構造は、２つの異なる抗原の各々を二価の様
式で標的とする二重特異性抗体を生成し、したがって、第１の抗原を標的とする天然のＦ
ａｂドメインおよび第２の抗原を標的とするキメラＦａｂドメインは、そのような四価抗
体の両アームに存在する。
別の実施形態では、キメラＦａｂドメインはＦｃドメインの近位に位置し、その結果、
キメラ「重」鎖を含むＴＣＲの定常領域のα鎖またはβ鎖の定常領域のＣ末端が天然ヒン
ジのＮ末端に結合し、天然ＦａｂドメインがＦｃドメインの先端に位置し、その結果、天
然Ｆａｂドメインを含む重鎖のＣＨ１ドメインのＣ末端がキメラＦａｂドメインを含む可
変重鎖のＮ末端に結合する。
別の実施形態では、２つの異なる抗体アームから構成される非対称三価フォーマットが
使用され、その結果、１つのアームが単一のＦａｂドメイン（天然またはキメラ）を有し
、二重特異性抗体の第２のアームが上記のようにＦａｂドメイン（天然およびキメラ）の
両方を有する。２つの異なるアームのヘテロ二量体化は、当技術分野（例えば、ノブ－イ
ントゥ－ホール（knobs-into-wholes）、静電ステアリングなど）に記載されているよう
に、Ｆｃドメインにおける抗体工学を介して可能にされる。
さらに別の実施形態では、２つの異なる抗体アームから構成される非対称二価フォーマ
ットを使用して、一方のアームが単一のＦａｂドメイン、天然またはキメラを有し、他方
のアームがそれぞれ単一のＦａｂ結合ドメイン、キメラまたは天然を有するようにしても
よい。２つの異なるアームのヘテロ二量体化は、当技術分野で十分に記載されているＦｃ
ドメインにおける抗体工学（例えば、ノブ－イントゥ－ホール（knobs-into-wholes）、
静電ステアリングなど）を介して可能である。
グリコシル化
共有結合による修飾のもう一つのタイプは、グリコシル化の変化である。例えば、アグ
リコシル化された抗体（すなわち、グリコシル化を欠く抗体）を作製することができる。
グリコシル化は、例えば、抗原に対する抗体の親和性を増大させるように変化させること
ができる。このような炭水化物修飾は、例えば、抗体配列内のグリコシル化の１以上の部
位を変化させることによって達成することができる。例えば、１つ以上の可変領域フレー
ムワークグリコシル化部位の除去をもたらし、それによってその部位でのグリコシル化を
除去する１つ以上のアミノ酸置換を行うことができる。このようなグリコシル化は、抗原
に対する抗体の親和性を増大させる可能性がある。このようなアプローチは、Ｃｏらによ
り米国特許第５，７１４，３５０号および第６，３５０，８６１号にさらに詳細に記載さ
れており、位置２９７でアスパラギンを除去することにより達成することができる。
抗体の別のタイプの共有結合修飾は、例えば、すべて参照により完全に組み込まれる、
NektarTherapeuticsの2005-2006PEGカタログ（Nektar Webサイトで入手可能）、米国特許
第４，６４０，８３５号、第４，４９６，６８９号、第４，３０１，１４４号、第４，６
７０，４１７号、第４，７９１，１９２号、または第４，１７９，３３７号に記載されて
いる方法で、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアル
キレンなどの様々なポリオールを含むがこれらに限定されない様々な非タンパク質性ポリ
マーに抗体を結合することを含む。さらに、当技術分野で公知であるように、アミノ酸置
換は、ＰＥＧなどのポリマーの添加を容易にするために、抗体内の様々な位置で行われ得
る。例えば、参照により全体的に組み込まれる、米国特許出願公開第２００５／０１１４
０３７号を参照のこと。
さらなる実施形態において、例えば、診断または検出目的のための本発明の抗体の使用
において、抗体は、標識を含み得る。本明細書において「標識された」とは、化合物が、
6th Edition of the Molecular Probes Handbook by Richard P. Hauglandに記載されて
いるような化合物の検出を可能にするために結合された少なくとも１つの部分、元素、同
位体または化学化合物を有することを意味する。
本発明の抗体の製造方法
本発明はさらに、開示された抗ＳＬＡＭＦ６抗体を産生するための方法を提供する。こ
れらの方法は、本発明の抗体をコードする単離核酸を含有する宿主細胞を培養することを
包含する。当業者には理解されるように、これは、抗体の性質に応じて、様々な方法で行
うことができる。いくつかの実施形態において、本発明の抗体が全長の伝統的抗体である
場合、例えば、宿主細胞は、抗体が産生され、単離され得るような条件下で培養され得る
、重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードする核酸を含有する。
本発明の抗体の可変重鎖および軽鎖は、本明細書に開示され（タンパクおよび核酸配列
の両方）；当技術分野で理解されるように、これらを容易に増強して、完全長の重鎖およ
び軽鎖を生成することができる。すなわち、本明細書に概説されるように、ＶＨおよびＶ
ＬセグメントをコードするＤＮＡフラグメントを提供した場合、これらのＤＮＡフラグメ
ントは、例えば、可変領域遺伝子を全長抗体鎖遺伝子に、Ｆａｂフラグメント遺伝子に、
またはｓｃＦｖ遺伝子に変換するために、標準的な組換えＤＮＡ技術によってさらに操作
することができる。これらの操作において、ＶＬまたはＶＨををコードする核酸を含有し
、するＤＮＡフラグメントは、抗体定常領域または柔軟なリンカーなどの別のタンパクを
コードする別のＤＮＡフラグメントに動作可能に（作動的に）連結される。この文脈で使
用される「動作可能に連結された」という用語は、２つのＤＮＡフラグメントによってコ
ードされるアミノ酸配列がインフレームのままであるように、２つのＤＮＡフラグメント
が連結されることを意味することを意図している。
ＶＨ領域をコードする単離されたＤＮＡは、ＶＨをコードするＤＮＡを重鎖定常領域を
コードする別のＤＮＡ分子（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）に動作可能に連結することに
よって、全長重鎖遺伝子に変換することができる。ラット重鎖定常領域遺伝子の配列は当
技術分野で公知であり（例えば、Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins
of Immunological Interest, Fifth Edition, US Department of Health and Human Serv
ices, NIH Publication No. 91-3242参照）、これらの領域を包含するＤＮＡフラグメン
トは、標準的なＰＣＲ増幅で得ることができる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、
ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤ定常領域であり得る。１つの
好ましい態様において、重鎖定常領域は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４定常領域である。Ｆａ
ｂフラグメント重鎖遺伝子の場合、ＶＨをコードするＤＮＡは、重鎖ＣＨ１定常領域のみ
をコードする別のＤＮＡ分子と動作可能に連結することができる。
ＶＬ領域をコードする単離されたＤＮＡは、ＶＬをコードするＤＮＡを軽鎖定常領域を
コードする別のＤＮＡ分子、ＣＬに動作可能に連結することによって、完全長軽鎖遺伝子
（およびＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換することができる。ラット軽鎖定常領域遺伝子の配列
は当技術分野で公知であり（例えば、Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Prote
ins of Immunological Interest, Fifth Edition, US Department of Health and Human
Services, NIH Publication No. 91-3242参照）、これらの領域を包含するＤＮＡフラグ
メントは、標準的なＰＣＲ増幅により得ることができる。１つの好ましい態様において、
軽鎖定常領域はカッパまたはラムダ定常領域である。
ｓｃＦｖ抗体フラグメントをコードするポリヌクレオチド配列を作製するために、ＶＨ
－およびＶＬをコードするＤＮＡフラグメントは、ＶＬおよびＶＨ配列が、柔軟性リンカ
ーによって連結されたＶＬおよびＶＨ領域を有する、連続する一本鎖タンパクとして発現
され得るように、柔軟性リンカーをコードする別のフラグメント、例えば、アミノ酸配列
（Ｇｌｙ４－Ｓｅｒ）３をコードする別のフラグメントに動作可能に連結される（例えば
、Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-554）。
本発明の態様は、本発明の抗体をコードする核酸を含む。そのようなポリヌクレオチド
は、重鎖および軽鎖の各々の可変領域および定常領域の両方をコードするが、本明細書に
記載の組成物に従って本発明によって他の組合せも企図される。本発明の態様は、開示さ
れたポリヌクレオチドに由来するオリゴヌクレオチドフラグメント、およびこれらのポリ
ヌクレオチドに相補的な核酸配列を含む。
本発明の実施形態によるポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮ
Ａ、核酸アナログ、および合成ＤＮＡの形態であってもよいし、またはこれらを含むこと
としてもよい。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ分子は、二本鎖または一本鎖であっ
てもよく、一本鎖の場合、コード（センス）鎖または非コード（アンチセンス）鎖であっ
てもよい。ポリペプチドをコードするコード配列は、本明細書に提供されるコード配列と
同一であってもよく、または、遺伝コードの冗長性または縮重の結果として、本明細書に
提供されるＤＮＡと同一のポリペプチドをコードする異なるコード配列であってもよい。
いくつかの実施形態において、本発明の抗体をコードする核酸は、染色体外であるか、
またはそれが導入される宿主細胞のゲノムに組み込まれるように設計され得る発現ベクタ
ーに組み込まれる。発現ベクターは、任意の数の適切な調節配列（転写および翻訳制御配
列、プロモーター、リボソーム結合部位、エンハンサー、複製起点などを含むが、これら
に限定されない）、または他の成分（選択遺伝子など）を含有することができ、これらの
全ては当技術分野で周知であるように作動可能に連結されている。場合によっては、２つ
の核酸が使用され、それぞれが異なる発現ベクター（例えば、第１の発現ベクター中の重
鎖、第２の発現ベクター中の軽鎖）に入れられるか、あるいはそれらを同じ発現ベクター
中に入れることができる。調節配列の選択を含む発現ベクターの設計は、宿主細胞の選択
、所望のタンパクの発現レベルなどの因子に依存し得ることは、当業者には理解されよう
。
一般に、核酸および／または発現は、選択された宿主細胞に適宜任意の方法（例えば、
形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーション、感染）を用いて組換え宿主
細胞を作製するために適宜宿主細胞に導入することができ、その結果、核酸分子は、１以
上の発現制御要素（例えば、ベクターにおいて、細胞内の処理によって作製された構築物
において、宿主細胞ゲノムに組み込まれる）に作動可能に連結される。得られた組換え宿
主細胞は、発現に適した条件下（例えば、誘導物質の存在で、適切な非ヒト動物中で、適
切な塩、成長因子、抗生物質、栄養的サプリメントなどを添加した適切な培養培地中で）
で維持することができ、それによりコードされたポリペプチドが産生される。いくつかの
実施形態において、重鎖および軽鎖は、同じ宿主細胞において産生される。いくつかの実
施形態において、重鎖は、１つの宿主細胞において産生され、軽鎖は、別の宿主細胞にお
いて産生される。
発現のための宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は当技術分野で公知であり、Americ
an Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡから入手可能な多く
の不死化細胞株を含み、これには、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨＥＫ
２９３細胞、ＦＳ２９３、Ｅｘｐｉ２９３、ＮＳＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスタ
ー腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えばＨｅｐＧ２
）、および多くの他の細胞株が含まれるが、これらに限定されない。細菌、酵母、昆虫、
および植物を含むがこれらに限定されない非哺乳動物細胞も、組換え抗体を発現するため
に使用することができる。いくつかの実施形態において、抗体は、ウシまたはニワトリの
ようなトランスジェニック動物において産生され得る。
抗体分子生物学、発現、精製、およびスクリーニングのための一般的な方法は、例えば
、米国特許第４，８１６，５６７号、第４，８１６，３９７号、第６，３３１，４１５号
および第７，９２３，２２１号、ならびに、Antibody Engineering, edited by Konterma
nn & Dubel, Springer, Heidelberg, 2001 and 2010 Hayhurst & Georgiou, 2001, Curr
Opin Chem Biol 5:683-689; Maynard & Georgiou, 2000, Annu Rev Biomed Eng 2:339-76
; and Morrison, S. (1985) Science 229:1202を参照のこと。
医薬組成物
本発明の態様は、薬学的に許容される担体と共に製剤化された、本発明の１つ以上（ま
たはその組み合わせ）の抗体、またはその抗原結合フラグメントを含有する組成物、例え
ば、医薬組成物を含む。そのような組成物は、本発明の抗体または二重特異性分子の１つ
または組み合わせ（例えば、２つ以上の異なる）を含むことができる。例えば、本発明の
医薬組成物は、標的抗原上の異なるエピトープに結合するか、または相補的活性を有する
抗体の組合せを含むことができる。
本発明の医薬組成物は、併用療法、すなわち、他の薬剤と組み合わせて投与することも
できる。例えば、併用療法は、少なくとも１つの他の抗腫瘍剤、または抗炎症性もしくは
免疫抑制剤と組み合わせた本発明の抗体を含むことができる。併用療法において使用され
得る治療薬の例は、本発明の抗体の使用に関するセクションにおいて以下により詳細に記
載される。
本明細書中で使用される場合、「薬学的に許容可能な担体」は、生理学的に適合する任
意のおよびすべての溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌剤および防黴剤、等張剤およ
び吸収遅延剤などを含む。好ましくは、担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄ま
たは表皮投与（例えば、注射または注入による）に適している。投与経路に応じて、活性
化合物、すなわち、抗体または抗体フラグメントは、化合物を不活性化し得る酸および他
の自然状態の動作から化合物を保護するために、物質中にコーティングされ得る。
本発明の薬学的化合物は、１種以上の薬学的に許容される塩を含むことができる。「薬
学的に許容可能な塩」は、親化合物の所望の生物学的活性を保持し、いかなる望ましくな
い毒性学的効果も付与しない塩を指す（例えば、Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm.
Sci. 66:1-19）。本発明の薬学的組成物はまた、薬学的に受容可能な抗酸化剤を含み得
る。本発明の医薬組成物に使用され得る適切な水性および非水性担体の実施例としては、
水、エタノール、ポリオール（グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコ
ールなど）、およびそれらの適切な混合物、植物油（オリーブ油など）、ならびに注射可
能な有機エステル（オレイン酸エチルなど）が挙げられる。適切な流動性は、例えば、レ
シチンなどのコーティング物質を使用することにより、分散剤の場合は必要な粒子サイズ
を維持することにより、および界面活性剤を使用することにより維持される。
これらの組成物は、防腐剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤などのアジュバントも含んで
よい。微生物の存在の予防は、上記の滅菌手順と、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば
パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などの含有との両方によって確保さ
れ得る。砂糖、塩化ナトリウムおよび類似物などの等張剤を組成物中に含むことも望まし
い。さらに、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンのような吸収を遅延させる薬
剤を含有させることによって、注射可能な医薬形態の長期吸収がもたらされ得る。
薬学的に許容可能な担体には、滅菌水溶液または分散液、および滅菌注射溶液または分
散液の即時調製のための滅菌粉末が含まれる。薬学的に活性な物質のための上記媒体およ
び薬剤の使用は、当技術分野において公知である。任意の従来の媒体または薬剤が活性化
合物と相溶しない場合を除き、本発明の医薬組成物におけるその使用が企図される。補足
的な活性化合物も組成物に組み込むことができる。
投与計画は、最適な所望の反応（例えば、治療反応）を提供するように調節される。例
えば、ボーラスを単回投与しても、時間をかけ数回に分けて投与してもよいし、あるいは
治療状況の緊急性によって示されるように、用量は比例して減少または増加させてもよい
。投与の容易さおよび投薬量の均一性のために、投薬単位形態で非経口組成物を処方する
ことは特に有利である。本明細書で使用される場合、「投与単位形態」は、治療される対
象のための単一の投与量として適した物理的に別個の単位を指し、各単位は、必要な医薬
担体と関連して所望の治療効果を生じるように計算された所定量の活性化合物を含有する
。本発明の投与単位形態についての説明は、（ａ）活性化合物の特有の特徴および達成さ
れるべき特定の治療効果、および（ｂ）個人の感受性の治療のためにそのような活性化合
物を配合する技術に固有の制限によって方向づけられ、それに直接依存する。
抗体の投与のためには、投与量は、宿主体重の約０．０００１～１００ｍｇ／ｋｇ、約
０．００１～５０ｍｇ／ｋｇ、約０．００１～１０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１～１０ｍｇ／
ｋｇ、および、より通常には、０．０１～５ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。例えば、投与
量は、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０
．５ｍｇ／ｋｇ、０．７５ｍｇ／ｋｇ体重、１ｍｇ／ｋｇ体重、３ｍｇ／ｋｇ体重、４ｍ
ｇ／ｋｇ体重、５ｍｇ／ｋｇ体重、７．５ｍｇ／ｋｇ体重もしくは１０ｍｇ／ｋｇ体重、
または０．１～５ｍｇ／ｋｇの範囲内または１～１０ｍｇ／ｋｇの範囲内であり得る。治
療レジメンの実施例としては、毎日、隔日、１週間に２回、１週間に１回、２週間に１回
、３週間に１回、４週間に１回、１ヶ月に１回、３ヶ月に１回、または３～６ヶ月に１回
の投与がある。本発明の抗ＳＬＡＭＦ６抗体のための好ましい投薬計画は、静脈内投与を
介して１ｍｇ／ｋｇ体重、３ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇ体重を含み
、抗体は、以下の投薬計画の１つを用いて与えられる：（ｉ）６つの投薬のために毎週、
その後は毎月；（ｉｉ）毎週；（ｉｉｉ）３ｍｇ／ｋｇ体重を１回、続いて毎週１ｍｇ／
ｋｇ体重。
いくつかの方法では、異なる結合特異性を有する２つ以上のモノクローナル抗体が同時
に投与され、その場合、投与される各抗体の用量は、示される範囲内に収まる。いくつか
の実施形態において、抗体は、複数回投与される。単回投与の間隔は、例えば、週単位、
月単位、３ヶ月ごと、または年単位とすることができる。間隔は、患者の標的抗原に対す
る抗体の血中濃度を測定することによって示されるように、不規則であってもよい。いく
つかの実施形態では、投与量は、約１～１０００μｇ／ｍｌのプラズマ抗体濃度を達成す
るように調整され、いくつかの方法では、約２５～３００μｇ／ｍｌである。
いくつかの実施形態において、抗体は、徐放性製剤として投与することができ、その場
合、それほど頻繁ではない投与が必要である。投与量および頻度は、患者における抗体の
半減期によって異なる。一般に、ヒト抗体は最も長い半減期を示し、次いでヒト化抗体、
キメラ抗体、および非ヒト抗体が続く。投与量および投与頻度は、処理が予防的であるか
治療的であるかによって異なり得る。予防的適用では、比較的低用量が長期間にわたって
比較的頻繁ではない間隔で投与される。患者によっては、生涯にわたって処理を受け続け
る場合もある。治療的適用では、疾患の進行が減少または終了するまで、好ましくは患者
が疾患の症状の部分的または完全な改善を示すまで、比較的短い間隔で比較的高い用量が
時に必要とされる。その後、患者は予防レジメンを投与され得る。
本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の投与量レベルは、患者に毒性であることなく
、特定の患者、組成物、および投与様式について所望の治療応答を達成するのに有効な活
性成分の量を得るように変更され得る。選択される投与量レベルは、使用される本発明の
特定の組成物、またはそのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与経路、投与時間、使
用される特定の化合物の排泄速度、治療の期間、使用される特定の組成物と組み合わせて
使用される他の薬物、化合物および／または材料、治療される患者の年齢、性別、体重、
状態、全身の健康および既往歴、ならびに医学分野で周知の同様の因子を含む様々な薬物
動態学的因子に依存する。
本発明の抗体の「治療的に有効な投与量」は、好ましくは、疾患症状の重症度の減少、
疾患無症状期間の頻度および期間の増加、または疾患苦痛による機能障害もしくは身体障
害の予防をもたらす。例えば、「治療的に有効な投与量」は、好ましくは、未治療の対象
と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、より好ま
しくは少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、さらにより好ましくは少なくとも約６
０％、少なくとも約７０％、さらにより好ましくは少なくとも約８０％、少なくとも約９
０％、または少なくとも約９５％細胞成長または腫瘍増殖を阻害する。腫瘍増殖を阻害す
る化合物の能力は、ヒト腫瘍における有効性を予測する動物モデル系において評価するこ
とができる。あるいは、組成物のこの特性は、細胞増殖を阻害する化合物の能力を試験す
ることによって評価することができ、このような阻害は、当業者に公知のアッセイによっ
てインビトロで測定することができる。治療的に有効な量の治療用化合物は、対象におけ
る腫瘍サイズを減少させるか、または他の方法で症状を改善することができる。当業者は
、対象の大きさ、対象の症状の重症度、および選択された特定の組成物または投与経路の
ような因子に基づいて、そのような量を決定することができる。
本発明の組成物は、当技術分野で公知の様々な方法の１つ以上を使用して、１つ以上の
投与経路を介して投与することができる。当業者には理解されるように、投与の経路およ
び／または様式は、所望の結果に応じて変化する。本発明の抗体のための好ましい投与経
路は、例えば注射または注入による静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄または他
の非経口投与経路を含む。本明細書中で使用される「非経口投与」という表現は、通常注
射による、経腸および局所投与以外の投与様式を意味し、限定されるものではないが、静
脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管内、皮
下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射および注入を含む。
あるいは、本発明の抗体は、局所、表皮または粘膜経路のような非経口経路を介して、
例えば、鼻腔内、経口、膣内、直腸内、舌下または局所的に投与することができる。
活性化合物は、インプラント、経皮パッチ、およびマイクロカプセル化送達システムを
含む制御放出製剤などの、化合物を急速放出から保護する担体を用いて調製することがで
きる。エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオ
ルトエステル、およびポリ乳酸のような、生分解性の、生体適合性ポリマーを使用するこ
とができる。上記製剤の調製のための多くの方法は、特許化されているか、または当業者
に一般的に知られている（Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems (
1978) J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., N.Yを参照）。
特定の実施形態において、本発明のモノクローナル抗体は、インビボでの適切な分布を
確実にするように製剤化することができる。例えば、血液脳関門（ＢＢＢ）は多くの親水
性の高い化合物を排除する。本発明の治療用化合物がＢＢＢを通過することを確実にする
ために（所望であれば）、例えばリポソーム中に製剤化することができる。リポソームを
製造する方法については、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号；第５，３７４，５
４８号；および第５，３９９，３３１号を参照されたい。リポソームは、特定の細胞また
は器官に選択的に輸送され、したがって標的化薬物送達を増強する１以上の部分を含み得
る（例えば、V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685参照）。例示的な標的部
分には、葉酸またはビオチン（例えば、米国特許第５，４１６，０１６号参照）；マンノ
シド（Umezawa et al. (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038）；抗体（P.G
. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. A
gents Chemother. 39:180）；サーファクタントタンパクＡレセプター（Briscoe et al.
(1995) Am. J. Physiol. 1233:134); p120 (Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 26
9:9090）；K. Keinanen；M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J.J. Killion; I
.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273も参照のこと。
用途と方法
本発明の抗体、抗体組成物および方法は、免疫介在性障害の診断および治療を含む多数
のインビトロおよびインビボの診断および治療的有用性を有する。
いくつかの態様において、これらの分子は、様々な障害を治療、予防および／または診
断するために、培養、インビトロまたはエクスビボで細胞に、またはヒト対象に、例えば
インビボで投与することができる。本明細書で使用される場合、用語「対象」は、ヒトお
よび非ヒト動物を含むことを意図する。非ヒト動物には、全ての脊椎動物、例えば、哺乳
動物、例えば、非ヒト霊長類、および非哺乳動物が含まれる。好ましい対象には、ヒト患
者が含まれる。本発明の抗体を別の薬剤と一緒に投与する場合、２つは、順序を決めてま
たは同時に投与することができる。
ＳＬＡＭＦ６に対する本発明の抗体の特異的結合を考えると、本発明の抗体は、免疫細
胞の表面上のＳＬＡＭＦ６発現を特異的に検出するために使用することができ、さらに、
免疫親和性精製を介してＳＬＡＭＦ６を精製するために使用することができる。
さらに、免疫細胞上のＳＬＡＭＦ６の発現を考慮すると、本発明の抗体、抗体組成物お
よび方法は、腫瘍形成性疾患、例えば、小細胞肺癌、非小細胞肺癌（扁平上皮癌および腺
癌を含む）、メラノーマを含む皮膚癌、乳癌（ＴＮＢＣを含む）、結腸直腸癌、胃（gast
ric）癌、卵巣癌、子宮癌、前立腺癌、腎臓癌、肝細胞癌を含む肝臓癌、膵臓癌、頭頸部
癌、鼻咽頭癌、食道癌、膀胱癌および他の尿路上皮癌、胃（stomach）癌、神経膠腫、神
経膠芽腫、精巣、甲状腺、骨、胆嚢および胆管、子宮、副腎癌、肉腫、ＧＩＳＴ、神経内
分泌腫瘍、および血液悪性腫瘍などの腫瘍細胞の存在を特徴とする疾患を有する対象を治
療するために使用することができる。
１つの実施形態において、本発明の抗体は、癌、例えば、小細胞肺癌、非小細胞肺癌（
扁平上皮癌および腺癌を含む）、メラノーマを含む皮膚癌、乳癌（ＴＮＢＣを含む）、結
腸直腸癌、胃（gastric）癌、卵巣癌、子宮癌、前立腺癌、腎臓癌、肝細胞癌を含む肝臓
癌、膵臓癌、頭頸部癌、鼻咽頭癌、食道癌、膀胱癌および他の尿路上皮癌、胃（stomach
）癌、神経膠腫、神経膠芽腫、精巣、甲状腺、骨、胆嚢および胆管、子宮、副腎癌、肉腫
、ＧＩＳＴ、神経内分泌腫瘍、および血液悪性腫瘍の治療に使用される。
さらなる実施態様において、本発明の抗体は、例えば、小細胞肺癌、非小細胞肺癌（扁
平上皮癌および腺癌を含む）、メラノーマを含む皮膚癌、乳癌（ＴＮＢＣを含む）、結腸
直腸癌、胃（gastric）癌、卵巣癌、子宮癌、前立腺癌、腎臓癌、肝細胞癌を含む肝臓癌
、膵臓癌、頭頸部癌、鼻咽頭癌、食道癌、膀胱癌および他の尿路上皮癌、胃（stomach）
癌、神経膠腫、神経膠芽腫、精巣、甲状腺、骨、胆嚢および胆管、子宮、副腎癌、肉腫、
ＧＩＳＴ、神経内分泌腫瘍、および血液悪性腫瘍のような癌の治療のための医薬の製造に
使用される。
１つの実施形態において、本発明の抗体（例えば、モノクローナル抗体、抗体フラグメ
ント、Ｎａｎｏｂｏｄｙ（商標）、多重特異性および二重特異性分子および組成物など）
は、ＳＬＡＭＦ６の量（レベル）、またはその膜表面にＳＬＡＭＦ６を含有する免疫細胞
の量を検出するために使用することができ、これらの量は、その後、診断のために特定の
疾患症状と関連させることができる。
別の実施形態では、本発明の抗体（例えば、モノクローナル抗体、多重特異性および二
重特異性分子および組成物）は、最初に、インビトロでの治療的または診断的使用に関連
する結合活性について試験することができる。例えば、本発明の組成物は、以下の実施例
に記載されるフローサイトメトリーアッセイを使用して試験され得る。
いくつかの実施形態において、本発明の抗体（例えば、モノクローナル抗体、多重特異
性および二重特異性分子および組成物）は、疾患の治療および診断においてさらなる有用
性を有する。例えば、モノクローナル抗体、多重特異性または二重特異性分子は、以下の
生物学的活性の１つ以上をインビボまたはインビトロで誘発するために使用することがで
きる：免疫細胞の活性化を誘発および／または増強すること；ＳＬＡＭＦ６を発現するヒ
トエフェクター細胞の存在下で細胞のファゴサイトーシスまたはＡＤＣＣを媒介すること
、またはＳＬＡＭＦ６リガンドのＳＬＡＭＦ６への結合を遮断すること。
特定の実施形態では、抗体（例えば、モノクローナル抗体、多重特異性および二重特異
性分子および組成物）は、様々な疾患を治療、予防または診断するためにインビボで使用
される。関連する疾患の実施例としては、とりわけ、小細胞肺癌、非小細胞肺癌（扁平上
皮癌および腺癌を含む）、メラノーマを含む皮膚癌、乳癌（ＴＮＢＣを含む）、結腸直腸
癌、胃（gastric）癌、卵巣癌、子宮癌、前立腺癌、腎臓癌、肝細胞癌を含む肝臓癌、膵
臓癌、頭頸部癌、鼻咽頭癌、食道癌、膀胱癌および他の尿路上皮癌、胃（stomach）癌、
神経膠腫、神経膠芽腫、精巣、甲状腺、骨、胆嚢および胆管、子宮、副腎癌、肉腫、ＧＩ
ＳＴ、神経内分泌腫瘍、および血液悪性腫瘍に示されるヒトの癌組織が挙げられる。
本発明の抗体組成物（例えば、モノクローナル抗体、多重特異性および二重特異性分子
および組成物）をインビボおよびインビトロで投与する適切な経路は、当業者に周知であ
り、当業者によって選択することができる。例えば、抗体組成物は、注射（例えば、静脈
内または皮下）によって投与することができる。使用される分子の適切な投与量は、対象
の年齢および重量、ならびに抗体組成物の濃度および／または製剤に依存する。
前述のように、本発明の抗体は、１つ以上の追加の治療剤、例えば、免疫賦活剤、細胞
毒性剤、放射性毒性剤または免疫抑制剤と同時投与することができる。抗体は、（免疫複
合体として）作用物質に連結され得るか、または作用物質から分離して投与され得る。後
者の場合（別々の投与）、抗体は、薬剤の前、後、または薬剤と同時に投与することがで
き、または他の既知の治療、例えば、抗癌療法、例えば放射線療法と同時投与することが
できる。そのような治療薬剤には、とりわけ、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、シ
スプラチンブレオマイシン硫酸塩、カルムスチン、クロラムブシル、およびシクロフォス
ファミドヒドロキシ尿素のような抗腫瘍薬が含まれ、これらは、それ自体が、患児に対し
て毒性または亜毒性である水準でのみ効果的である。本発明の抗体との同時投与に適した
他の薬剤には、癌の治療に使用される他の薬剤、例えばアバスチン（登録商標）、５ＦＵ
およびゲムシタビンが含まれる。本発明の抗ＳＬＡＭＦ６抗体またはその抗原結合フラグ
メントと化学療法剤との同時投与は、ヒト腫瘍細胞に対して細胞毒性効果をもたらす異な
るメカニズムを介して作用する２つの抗癌剤を提供する。このような同時投与は、薬物に
対する耐性の発生または腫瘍細胞の抗原性の変化による問題を解決することができる。
標的特異的エフェクター細胞、例えば、本発明の組成物（例えば、モノクローナル抗体
、多重特異性および二重特異性分子）に連結されたエフェクター細胞も、治療剤として使
用することができる。標的化のためのエフェクター細胞は、マクロファージ、好中球また
は単球などのヒト白血球であり得る。他の細胞には、好酸球、ナチュラルキラー細胞およ
び他のＩｇＧまたはＩｇＡレセプターを有する細胞が含まれる。必要に応じて、エフェク
ター細胞を、処置される対象から得ることができる。標的特異的エフェクター細胞は、生
理学的に許容される溶液中の細胞の懸濁液として投与することができる。管理されるセル
の個数は、１０８～１０９のオーダーでよいが、治療目的によって異なる。
標的特異的エフェクター細胞を用いた治療は、他の技術と併せて行うことができる。例
えば、本発明の組成物（例えば、モノクローナル抗体、多重特異性および二重特異性分子
）および／またはこれらの組成物を装備したエフェクター細胞を使用する抗腫瘍療法は、
化学療法と併用することができる。さらに、組み合わせ免疫療法は、２つの異なる細胞傷
害性エフェクター集団を腫瘍細胞拒絶に向けるために使用され得る。
本発明の二重特異性および多重特異性分子はまた、細胞表面上のレセプターのキャッピ
ングおよび除去などにより、エフェクター細胞上のＦｃγＲまたはＦｃγＲ量を調節する
ために使用することができる。抗Ｆｃレセプターの混合物も、この目的のために使用する
ことができる。
本発明の態様は、本発明の抗体組成物（例えば、モノクローナル抗体、二重特異性また
は多重特異性分子）を含むキット、および、例えば、癌の治療におけるそれらの使用のた
めの命令を含む。キットは、さらに、免疫抑制試薬、細胞毒性剤または放射性毒性剤など
の１つ以上の追加の試薬、または本発明の１つ以上の追加の抗体（例えば、第１の抗体と
は別のＳＬＡＭＦ６抗原中のエピトープに結合する相補的活性を有する抗体）を含有する
ことができる。
したがって、本発明の抗体組成物で治療された患者は、抗体の治療効果を増強または増
大する、細胞傷害性または放射毒性剤などの別の治療薬剤を追加投与することができる（
本発明の抗体の投与の前、同時、またはその後）。
他の実施形態において、対象は、例えば、サイトカインで対象を処置することにより、
ＦｃγまたはＦｃγレセプターの発現または活性を調節、例えば、増強または阻害する薬
剤で追加的に処置され得る。多特異的分子による治療中の投与に好ましいサイトカインに
は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（
ＧＭ－ＣＳＦ）、インターフェロン－γ（ＩＦＮ－γ）、および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）
が含まれる。
本発明の組成物（例えば、抗体、多重特異性および二重特異性分子）はまた、例えば、
そのような細胞を標識するために、ＦｃγＲまたはＳＬＡＭＦ６を発現する細胞を標的化
するために使用され得る。そのような使用のために、結合剤は、検出され得る分子に連結
され得る。したがって、本発明は、ＦｃγＲまたはＳＬＡＭＦ６などのＦｃレセプターを
発現するｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞を局在化する方法を提供する。検出可
能な標識は、例えば、放射性同位体、蛍光化合物、酵素、または酵素補因子であり得る。
特定の実施形態において、本発明は、抗体またはその一部とＳＬＡＭＦ６との間の複合
体の形成を可能にする条件下で、試料中のＳＬＡＭＦ６抗原の存在を検出する方法、また
は試料および対照試料を、ＳＬＡＭＦ６に特異的に結合するモノクローナル抗体またはそ
の抗原結合フラグメントと接触させることを含む、ＳＬＡＭＦ６抗原の量を測定する方法
を提供する。次いで、複合体の形成が検出され、ここで、対照試料と比較した試料間の複
合体形成の差異は、試料中のＳＬＡＭＦ６抗原の存在を示す。
他の実施態様において、本発明は、対象における免疫性炎症性疾患、例えば、ヒト癌、
小細胞肺癌、非小細胞肺癌（扁平上皮癌および腺癌を含む）、メラノーマを含む皮膚癌、
乳癌（ＴＮＢＣを含む）、結腸直腸癌、胃（gastric）癌、卵巣癌、子宮癌、前立腺癌、
腎臓癌、肝細胞癌を含む肝臓癌、膵臓癌、頭頸部癌、鼻咽頭癌、食道癌、膀胱癌および他
の尿路上皮癌、胃（stomach）癌、神経膠腫、神経膠芽腫、精巣、甲状腺、骨、胆嚢およ
び胆管、子宮、副腎癌、肉腫、ＧＩＳＴ、神経内分泌腫瘍、および血液悪性腫瘍を治療す
るための方法を提供する。
本明細書において引用されるすべての参考文献は、それらの全体において本明細書に参
照により組み込まれているもの、すべての論文、出版物、特許、特許出願、発表、教科書
、報告書、原稿、パンフレット、書籍、インターネット投稿、ジャーナル記事、定期刊行
物、製品ファクトシートなどを含むが、これらに限定されない。本明細書中の参考文献の
議論は、単にそれらの著者によってなされた主張を要約することを意図しており、いかな
る参考文献も先行技術を構成することを認めるものではなく、出願人が引用された参考文
献の正確性と適切性に異議を申し立てる権利を留保することを認めるものではない。
前述の発明は、理解を明確にするために、例示および例として、いくつかの詳細に記載
されているが、従属請求項の趣旨または範囲から逸脱することなく、特定の変更および修
正をこれらに加えることができることは、本発明の教示に照らして、当業者には容易に明
らかであろう。
本発明は、以下の実施例によってさらに説明されるが、これらはさらに限定するものと
解釈されるべきではない。以下の実施例、配列および図は、本発明の理解を助けるために
提供され、その真の範囲は添付の特許請求の範囲に記載されている。本発明の趣旨から逸
脱することなく、記載された手順に変更を加えることができることが理解される。
実施例：
実施例１：抗体の生成とスクリーニング。
ハイブリドーマ生成
組み換えＥＣＤタンパクを、Alere, San Diego.-SLAMF6-humにて、ＳＬＡＭＦ６ ＥＣ
Ｄ（配列番号１２）に対するマウスＦａｂの生成のためのマウスの免疫化に使用した。免
疫化されたマウス由来のＥＣＤ脾細胞を用いて、工業標準技術を使用してｆａｂのライブ
ラリーを作製した。
二次スクリーニング
Ｆａｂ上澄みを、Ｒａｊｉ細胞の表面に発現されたＳＬＡＭＦ６タンパクおよび活性化
ＰＢＭＣとの結合について試験した。上清をＦＡＣＳ緩衝液で１０分の１に希釈した。
実施例２：ＳＬＡＭＦ６に対するモノクローナル抗体の構造特性
モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖可変領域をコードするｃＤＮＡ配列は、標準的な
ＰＣＲ技術を用いて得られ、標準的なＤＮＡ配列決定技術を用いて配列決定された。画面
から選択された１Ｂ３の重鎖および軽鎖可変領域は、図１に見ることができる。
１Ｂ３の重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、それぞれ配列番号３およ
び１に示す。
１Ｂ３の軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、それぞれ配列番号４およ
び２に示す。
ＣＤＲ領域判定のＫａｂａｔシステムを用いた１Ｂ３ ＶＨ配列のさらなる分析は、配
列番号５、６および７にそれぞれ示されるような重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３
領域の描出を導いた。図１ａは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３をボックスで囲ん
だ１Ｂ３ ＶＨ配列を示している。
ＣＤＲ領域判定のＫａｂａｔシステムを用いた１Ｂ３ ＶＬ配列のさらなる分析は、配
列番号８、９および１０にそれぞれ示されるように、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ
Ｒ３領域の描出をもたらした。図１ｂは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３をボック
スで囲んだ１Ｂ３ ＶＬ配列を示す。
実施例３：フローサイトメトリー分析により測定したＳＬＡＭＦ６に対するＦａｂ上清モ
ノクローナル抗体の特異性
５×１０個の６Ｒａｊｉ細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに入れ、ＦＡＣＳ緩衝液
（ＤＰＢＳ、２％ＦＢＳ）で１回洗浄した。細胞を１２００ｒｐｍで５分間スピニングす
ることによりペレット化した。ペレットをＦＡＣＳ緩衝液（ＤＰＢＳ、２％ＦＢＳ）で１
回洗浄し、再び１２００ｒｐｍで５分間スピニングすることによってペレット化し、ＦＡ
ＣＳ緩衝液に再懸濁した。試験抗体をＦＡＣＳ緩衝液中で３０ｎＭ／ｌに希釈し、図４に
示すように増加量を各ウェルに添加し、これを氷上で３０分間インキュベートした。次い
で、細胞をＦＡＣＳ緩衝液（ＤＰＢＳ、２％ＦＢＳ）で１回洗浄し、ペレット化し、洗浄
し、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。二次ヤギ抗マウス抗体を１μｇ．ｍｌに希釈し、各ウ
ェルに１００μｌを添加し、プレートを氷上で３０分間インキュベートし、次いでＦＡＣ
Ｓ緩衝液（ＤＰＢＳ、２％ＦＢＳ）で１回洗浄した。細胞をペレット化し、２００ｕｌ
ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。試料はＧｕａｖａ Ｅａｓｙｃｙｔｅ Ｐｌｕｓ ＨＴフロ
ーサイトメーターを用いて読み取り、結果はＧｕａｖａ Ｃｙｔｏｓｏｆｔソフトウェア
スイートを用いて分析した。
図４から分かるように、抗体１Ｂ３は、ＳＬＡＭＦ６発現Ｒａｊｉ細胞への用量特異的
依存的結合を示す。
実施例４：抗ＳＬＡＭＦ６抗体がＴ細胞を活性化し、ＩＦＮγ産生を刺激する能力
９６ウェルの非組織培養プレートには、一晩４℃での２５０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３およ
び異なった抗ＳＬＡＭＦ６抗体／アイソタイプ濃度をコーティングした。プレートをＰＢ
Ｓで２回洗浄し、続いてＲ１０培地（１０％ＦＢＳ、１％Ｌ－グルタミン、１％ペニシリ
ン／ストレプトマイシンによるＲＰＭＩ）で３０分間ブロックした。ブロック後、１０万
個のＴ細胞を１００μｌのＲ１０培地に再懸濁し、プレート上に添加した（製造者の指示
に従って、Ｍｉｌｔｅｎｙｉキットコード：１３０－０９６－５３５を用いてＰＢＭＣか
ら単離されたＴ細胞）。プレートを３７℃で７２時間インキュベートし、上清を集め、Ｉ
ＦＮγ ＥＬＩＳＡアッセイに使用するために希釈した。
ＩＦＮγは、ＩＦＮ－ガンマ ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄシステムズ 製
品番号ＤＹ２８５Ｂ）を用いて、製造元の指示に従って測定した。
結果
ヒト化抗体Ｈｕ_１Ｂ３は、ＷＯ２０１７／００４３３０に記載されているＳＬＡＭＦ
６に対するＳｅａｔｌｅ Ｇｎｅｎｅｔｉｃｓ抗体と比較して、低い抗体濃度でのＩＦＮ
γ産生の増加に反映された、ＯＫＴ３前活性化Ｔ細胞における活性の増加を示した（図５
）。このＩＦＮγ産生の誘導は、ＳＬＡＭＦ６に向けられた抗体が、免疫系が阻害された
患者において治療効果を有することを示す。
実施例５：抗体１Ｂ３のヒト化。
ＣＤＲ移植技術を用いてマウス１Ｂ３モノクローナル抗体のヒト化を行った。ヒト化プ
ロセスをガイドし、親マウス残基を保存するか、またはそれらをヒト生殖細胞系対応物で
置換するかの決定を助けるために、１Ｂ３マウスモノクローナル抗体のＦｖの相同分子モ
デルを構築した。
ＣＤＲの定義は、Ｋａｂａｔ命名法に基づいている。１Ｂ３ラットＣＤＲ領域が移植さ
れるヒトフレームワーク受容体領域の選択は、免疫グロブリンＶ領域配列の分析を容易に
するためにＮＣＢＩで開発されたＩｇＢＬＡＳＴを用いて、１Ｂ３マウス可変領域配列を
入力として、ＩＭＧＴマウスおよびヒトＶ遺伝子データベースを検索することによって達
成された。適用されたストラテジーは、個々のヒト抗体配列に見られる特異体細胞突然変
異を含まない天然のヒト配列であるヒト生殖細胞系配列を用いることであった。
重鎖設計
マウス１Ｂ３ハイブリドーマから単離されたＶＨのアミノ酸配列（Ｋａｂａｔナンバリ
ングスキームによるＣＤＲ領域は太字で示されている）を以下に示す。
ヒトフレームワーク受容体ＶＨ領域の選択
マウスＶＨ領域アミノ酸配列を入力としてＩｇＢＬＡＳＴを用いてＩＭＧＴヒトＶＨ遺
伝子データベースを検索することにより、１Ｂ３マウスＣＤＲ領域が移植されるヒトフレ
ームワーク受容体ＶＨ領域の選択を達成した。ヒト生殖細胞系に対する親抗体の配列アラ
インメントに基づいて、最も近い一致エントリを同定した。受容体としての最適なヒト生
殖細胞系の同定は、Ｋａｂａｔによって定義されるようなフレームワーク間の配列同一性
、および／または鎖間界面残基および支持ループと親ＣＤＲの標準的立体配座との同一性
および／または相溶性の順序付けられた基準に基づいた。ヒト生殖細胞系ＩＧＨＶ１‐２
*０２を最も適切な重鎖として選択した。
ＩＧＨＶ１‐２＊０２ヒト生殖細胞系をフレームワーク受容体領域として用いる設計
ヒト化バージョン
Ｋａｂａｔ命名法により定義されるマウスＣＤＲ（太字）をＩＧＨＶ１－２＊０２に移
植し、以下の詳細な配列を得た。多くの残基はフレームワークマウス残基（ＣＤＲ残基の
外側）であり、すなわち、親マウスの１Ｂ３ ＶＨ配列から保存されており、それらは抗
体の完全な活性を維持するために構造的に重要である可能性があるため、保存されている
。
ＩＧＨＶ１－２＊０２ヒト生殖細胞系を用いたヒト化バージョン（ＯＢＴ５７７－１２
－ＶＨＢ）の８６．７％の同一性（Ｖ遺伝子の合計９８残基のうち８５個の同一残基）。
軽鎖設計
マウス１Ｂ３ ＶＬのアミノ酸配列（Ｋａｂａｔ命名法により定義されるＣＤＲ領域を
強調する）を以下に示す。
ヒトフレームワーク受容体ＶＬ領域の選択
マウスＶＬ領域アミノ酸配列を入力としてＩｇＢＬＡＳＴを用いてＩＭＧＴヒトＶＬ遺
伝子データベースを検索することにより、１Ｂ３ ＶＬマウスＣＤＲ領域が移植されるヒ
トフレームワーク受容体ＶＬ領域の選択を達成した。ヒト生殖細胞系に対する親抗体の配
列アラインメントに基づいて、最も近い一致エントリを同定した。受容体としての最適な
ヒト生殖細胞系の同定は、Ｋａｂａｔによって定義されるようなフレームワーク間の配列
同一性、並びに、鎖間界面残基および支持ループと親ＣＤＲの標準的立体配座との同一性
および／または適合性（互換性）の順序付けられた基準に基づいた。この分析から、ヒト
生殖細胞系、ＩＧＫＶ１‐３３＊０１はヒトフレームワーク受容体領域として最良の選択
であると考えられた。したがって、このヒト生殖細胞系は、ヒト化バージョンの設計に使
用された。
ＩＧＫＶ１－３３＊０１ヒト生殖細胞系をフレームワーク受容体領域として用いる設計
ヒト化バージョン
Ｋａｂａｔ番号付けによって定義されるマウスＣＤＲをＩＧＫＶ１－３３＊０１に移植
し、以下の詳細な配列を得た。抗体の完全な活性を維持するために構造的に重要な多数の
残基が保持されている。これにより、８６．３％の同一性を有するヒト化バージョン（９
５中８２アミノ酸残基）が得られた。

ヒト化バージョンとＩＧＫＶ１－３３＊０１ヒト生殖細胞系との８６．３％の同一性（８
２／９５）
実施例６ 腫瘍浸潤リンパ球を伴うＥＬＩＳＰＯＴ
ＮＳＣＬＣ（図６）、乳癌（図７）またはＣＲＣ（図８）腫瘍由来の原発腫瘍由来腫瘍
浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を、マウス１Ｂ３またはペムブロリズマブを１０μｇ／ｍｌ、Ｏ
ＫＴ３を完全ＩＭＤＭ培養培地で１μｇ／ｍｌに希釈して９６時間刺激した。刺激後、Ｔ
ＩＬを回収し、計数し、ＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴプレート（Ｍａｂｔｅｃｈ）上で１０
００００細胞／ウェルでプレーティング（平板培養）した。プレートを３７℃で２４時間
インキュベートし、その後、製造業者の指示に従って開発した。スポット数は、Ｉｍｍｕ
ｎｏＳｐｏｔ（登録商標）シリーズ５ＥＬＩＳＰＯＴアナライザーを用いて読み取り、デ
ータはＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて分析した。
図６は、抗体１Ｂ３が、アイソタイプ抗体よりも有意に高いＩＦＮγ産生を反映してＮ
ＳＣＬＣ由来ＴＩＬを活性化することを示す。
図７は、抗体１Ｂ３がペムブロリズマブよりも有意に多い数の乳癌由来ＴＩＬを活性化
してＩＦＮγを産生することを示す。
図８は、抗体１Ｂ３が、ペムブロリズマブよりも有意に多い数の結腸直腸癌由来ＴＩＬ
を活性化してＩＦＮγを産生することを示す。
実施例７ ヒト化１Ｂ３抗体の結合親和性
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ‐２００の結合親和性実験を２５℃で行った。ＣＭ５チップのフロ
ーセル２、３および４を、ヤギ抗ヒトＩｇＧの最大量５００ＲＵで被覆した。試験抗体を
フローセル２、３および４に捕捉した。フローセル１をブランクに保ち、参照減算に使用
した。チップの上に抗原を流した。抗体への抗原の結合をリアルタイムでモニターした。
観測されたｋｏｎとｋｏｆｆから、ＫＤを決定した。
実施例８ 抗ＳＬＡＭＦ６抗体１Ｂ３を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖アッセイ
方法。
非組織培養処理９６ウェルプレート（BD Falcon, USA）を抗ヒトＣＤ３（ｅBioscience
, USA）抗体２５０ｎｇ／ｍｌ単独またはヒト化抗ＳＬＡＭＦ６抗体（Ｈｕ_１Ｂ３）また
はアイソタイプ対照抗体０、０．２、０．４、０．６、０．９、１．２ｕｇ／ｍｌ）の濃
度でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした翌日、プレートを洗浄し、ＡＩＭ
Ｖ媒体でブロックした。健康なドナーから作製したＰＢＭＣから単離したＴ細胞を、細胞
増殖色素ｅＦｌｕｏｒ（商標）６７０（eBioscience, USA）で染色し、洗浄し、ＦＣＳ、
ペニシリン－ストレプトマイシンを含むＡＩＭ Ｖ（Thermofisher Scientific, USA）培
地入りの抗体被覆プレート（１００μｌ中１００，０００細胞／ウェル）に播種し、組織
培養インキュベーター中で３７℃で７２時間培養した。３日目に細胞を収集し、抗ヒトＣ
Ｄ８と標識されたＦＩＴＣ、抗ヒトＣＤ４と標識されたＢｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅ
ｔ ７１１（商標）、抗ヒトＣＤ６９（Biolegend, USA）と標識されたＰＥ、および固定
可能生存性染料ｅＦｌｕｏｒ（商標）５０６（eBioscience, USA）で染色した。試料をア
チューンＮｘＴフローサイトメーター（Thermofisher Scientific, USA）で分析し、Ｆｌ
ｏｗＪｏソフトウェア（TreeStar, USA）を用いてデータを分析した。
図９は、ＣＤ３の存在下で抗ＳＬＡＭＦ６抗体を用いて単離されたＴ細胞上に存在する
ＳＬＡＭＦ６を刺激すると、アイソタイプまたはＣＤ３単独と比較して、Ｔ細胞増殖が有
意に増加することを示す。
実施例９ 抗ＳＬＡＭＦ６抗体Ｈｕ_１Ｂ３を用いた同種ＰＢＭＣとの一方向混合リンパ球
反応（ＭＬＲ）。
方法：
１つのドナー（ドナー１）から単離されたＴ細胞を、１０％補充ウシ血清および２ｍＭ
Ｌ－グルタミン（培養培地）を含むＲＰＭＩ １６４０培地に再懸濁した。
第２ドナー（ドナー２）由来の凍結保存ＰＢＭＣを、培養培地中で２Ｅ６細胞／ｍｌの
密度で５０ｕｇ／ｍｌのマイトマイシンＣで処理した。培養培地で洗浄してミトマイシン
Ｃを除去する前に、細胞を３７℃で９０分間処理した。
次いで、ドナー１からの１００，０００細胞を、９６ウェル、Ｕ底プレート中のドナー
２からのマイトマイシンＣ処理細胞１００，０００個と組み合わせた。組み合わされた細
胞は、ヒト化抗体Ｈｕ_１Ｂ３の種々の濃度の溶液と対照の溶液中で処理し、６日間、合
計量１００ｕｌの培地／ウェルで培養した。アイソタイプを陰性対照として、抗ＣＤ１３
７ｍＡｂと同様に用い、比較に含めた。
培養上清を６日目に採取し、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ：ＤＹ２８５Ｂ）に
よりＩＦＮ－γの濃度について、製造業者の指示に従って分析した。
図１０は、抗ＳＬＡＭＦ６抗体Ｈｕ_１Ｂ３がサイトカイン放出の用量依存性増加を示
し、Ｔ細胞が抗体の存在によって活性化されていることを示す。また、ＳＬＡＭＦ６の活
性化は、ＣＤ１３７を介した活性化よりも、単離Ｔ細胞からのより高いサイトカイン放出
をもたらすことを示している。
実施例１０ Ｔ細胞からのＳＬＡＭＦ６媒介グランザイムＢおよびパーフォリン放出
ＰＢＭＣ単離
Ｔ細胞単離の第一段階として、ＰＢＭＣはバフィーコート（Stanford Blood Centerか
らのLeucopak）から単離される。血液をＰＢＳ中で１：４の比率（血液１０ｍｌ＋ＰＢＳ
３０ｍｌ）で希釈し、希釈した血液３０ｍｌを１５ｍｌのFicoll-Hypaque（GE-Healthcar
e cat.No.17-1440-03）上に注意深く置く。チューブは、４００ｇ（１４００ｒｐｍ）、
ＲＴで３０分間、ブレーキオフでsorvall遠心装置で遠心される。単球は密度勾配によっ
て分離される。全てのチューブからの細胞白色分画の約１０ｍｌを単一の５０ｍｌチュー
ブにプールし、洗浄し、Cellometerオート２０００を用いて計数する。バフィーコートか
ら生成したＰＢＭＣは、Ｔ細胞単離に使用される。
Ｔ細胞単離
ＰＢＭＣからのＰａｎ Ｔ細胞単離は、ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞を除き、残りのすべ
ての免疫細胞サブセットがビオチン結合抗体で標識され、高磁場中でストレプトアビジン
で被覆されたマイクロビーズによって捕捉されるネガティブセレクションプロセスである
。バフィーコートから単離したＰＢＭＣを洗浄し、ＦＡＣＳ選別緩衝液（ＰＢＳ中０．１
％ＢＳＡ）中に２．５ｅ７細胞／ｍＬの濃度で再懸濁し、Ｐａｎ Ｔ細胞ビオチン－抗体
カクテルを細胞に添加し、抗体細胞懸濁液を１ｍｌピペットを用いて混合し、氷上で５分
間インキュベートする。Ｐａｎ Ｔ細胞マイクロビーズ単離カクテルを混合物に添加し、
氷上でさらに１０分間インキュベートする。ＭＡＣＳ分離法は、未処理のＴ細胞を単離す
るために用いられる。ＰＢＭＣのビオチン標識マイクロビーズ混合物を、高磁場ＭＡＣＳ
セパレーター中でＬＳカラム（Miltneyi Biotec、Cat#130-042-401）上で流し、非Ｔ細胞
を枯渇させたフロースルーを回収し、ＦＡＣＳソーティングバッファーで１回洗浄し、５
％ＦＢＳでＡＩＭＶ完全培地に再懸濁する。
グランザイムＢ ＥＬＩＳＡ
グランザイムＢ機能アッセイのために、非組織培養処理した９６ウェルプレートを、２
５０ｎｇ／ｍｌの抗ヒトＣＤ３（ＯＫＴ３クローン化）（Thermofisher Scientific Cat#
16-0031-85）と組み合わせて、ヒトＨｕ_１Ｂ３またはアイソタイプ対照抗体でコーティ
ングする。各試験抗体を、４．２μｇ／ｍｌで開始し、１００μｌのＰＢＳ中で１０点滴
定のための２：３希釈物で３回コーティングする。プレートを密封し、４℃で一晩インキ
ュベートする。グランザイムＢ機能アッセイセットアップの日に、プレートを洗浄し、５
％ＦＣＳを含むＡＩＭＶ完全培地で２０分間ブロックし、非特異的結合を減少させる。
グランザイムＢ免疫測定は、Ｒ＆Ｄシステム（Cat# DY2906-05）のHuman Granzyme B D
uoSet ELISAキットを使用してセットアップされる。Ｎｕｎｃ－イムノアッセイプレート
をＰＢＳ中で１：６０に希釈したグランザイムＢ捕獲抗体でコーティングし、プレートを
４℃で一晩インキュベートする。翌日、プレートをＥＬＩＳＡ洗浄バッファー（ＰＢＳ＋
０．０５％ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄し、１％ＢＳＡ入りＰＢＳ中でブロッキングする。希
釈緩衝液中で１：６０で希釈した試料１００μｌをブロッキングした後、それぞれのウェ
ルに標準液を加え、４℃で一晩インキュベートする。次の日にプレートを開発し、Ｖｅｒ
ｓａＭａｘチューナブルマイクロプレートリーダーでＯＤ値を捕捉した。グランザイムＢ
放出を定量し、Graphpad Prism 8ソフトウェアを用いてプロットする
結論
グランザイム介在性アポトーシスは、細胞傷害性リンパ球が形質転換細胞を排除するた
めに用いる主要な機構の１つである。このデータは、抗体Ｈｕ_１Ｂ３が腫瘍抑制に重要
な細胞毒性機能を誘導できることを示している。抗体Ｈｕ_１Ｂ３は活性化Ｔ細胞からグ
ランザイムＢを用量依存的に上昇させ（図１１）、ＥＣ５０は０．５１μｇ／ｍｌである
。
パーフォリン細胞内アッセイ
パーフォリン細胞内定量アッセイセットアップ非組織培養処理９６ウェルプレートを、
２５０ｎｇ／ｍｌの抗ヒトＣＤ３（ＯＫＴ３クローン化）（Thermofisher Scientific Ca
t#16-0031-85)と組み合わせて、ヒトＨｕ_１Ｂ３またはアイソタイプ対照抗体でコート（
被覆）する。各試験抗体を、４．２μｇ／ｍｌで開始し、１００μｌのＰＢＳ中で１０点
滴定のための２：３希釈物でコートする。プレートを密封し、４℃で一晩インキュベート
する。グランザイムＢ機能アッセイセットアップの日に、プレートを洗浄し、５％ＦＣＳ
を含むＡＩＭＶ完全培地で２０分間ブロッキングし、非特異的結合を減少させる。このア
ッセイのために、５％ＦＢＳを含む１００μｌのＡＩＭＶ培養培地中でウェル当たり２０
０，０００個のパンＴ細胞を添加し、組織培養インキュベーター中で３７℃で３日間培養
する。アッセイの日に、タンパク輸送阻害剤カクテル（Thermofisher Scientific、Cat#
00-4980-93）を全てのウェルに添加し、細胞外空間へのパーフォリン輸送を防止するため
に４時間培養する。細胞を回収し、Ｔ細胞表面マーカーＣＤ３、ＣＤ４、およびＣＤ８に
ついて染色し、続いてＦＩＸ＆ＰＥＲＭ（商標）細胞透過化キット（Thermofisher Scien
tific、Cat# GAS-004)を用いて細胞内パーフォリン染色を行う。細胞をＡｔｔｕｎｅ Ｎ
ｘＴ ＦＡＣＳアナライザー（Thermofisher Scientific、MD）で分析し、データをＦｌｏ
ｗＪｏソフトウェア（BD Biosciences、San Jose）で分析した。
結論
パーフォリン介在性壊死は、細胞傷害性Ｔリンパ球によって誘導される殺傷の別の主要
なメカニズムであり、Ｈｕ_１Ｂ３は、０．４４μｇ／ｍｌのＥＣ５０で、用量依存的に
ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるパーフォリンのアップレギュレーションを増強する（図１２）
実施例１１ 抗体１Ｂ３の結合エピトープを評価するための競合的結合アッセイ
凍結保存したヒトＰＢＭＣを解凍し、ＦＡＣＳ緩衝液（２％ＦＣＳを含むＤＰＢＳ）に
懸濁液により一度洗浄し、続いて１２００ｒｐｍで５分間遠心分離して細胞をペレット化
し、上清を廃棄した（その後の洗浄に使用したのと同じ方法）。細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液
中でウェル当たり１００，０００細胞で９６ウェルアッセイプレートに分注し、その後、
再度洗浄した。次に、洗浄前の１時間氷上の１００μｌＦＡＣＳバッファーでのＳＬＡＭ
Ｆ６レセプターブロッキングについて、細胞をＳＬＡＭＦ６ ＥＣＤ－ｍＩｇＧ２ａ Ｆｃ
融合タンパク１００ｎＭまたは３００ｎＭで１時間ブロッキングした。ヒト化Ｈｕ_１Ｂ
３抗体またはヒトＩｇＧ１アイソタイプコントロールを、最高濃度１０ｎＭで、１／３連
続希釈で滴定し、次いで、ブロックされたＰＢＭＣに添加し、細胞を氷上で１時間インキ
ュベートし、その後、２回洗浄した。次いで、ＦＡＣＳ緩衝液中１μｇ／ｍＬの濃度の二
次抗体、ヤギ抗ヒト－ＩｇＧ－ＲＰＥ（Southern Biotech、Ref: 2040-05）を、氷上で３
０分間処理細胞に適用した。細胞を含有する未処理のウェルの１つも二次抗体で染色され
、もう１つは二次抗体結合の対照として作用するために染色されていないままにされた。
この最終インキュベーションの後、細胞を再び２回洗浄し、最終細胞ペレットをＦＡＣＳ
緩衝液に再懸濁した。二次抗体の平均蛍光強度は、業界標準プロトコルに従って９６ウェ
ルプレートフォーマットでＡｔｔｕｎｅ ＮｘＴ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ThermoF
ischer Scientific）を用いて各サンプルについて測定され、生のデータはＦｌｏｗＪｏ
解析ソフトを用いて分析された。
図１３に見られるように、Ｈｕ_１Ｂ３抗体は、ヒトＳＬＡＭＦ６ ＥＣＤ－ｍＩｇＧ２
ａ Ｆｃ融合タンパクの存在下でＰＢＭＣの表面上のレセプターへの結合を遮断され、Ｈ
ｕ_１Ｂ３がヒトＳＬＡＭＦ６ ＥＣＤと競合的に結合することを示している。したがって
、Ｈｕ_１Ｂ３はＳＬＡＭＦ６のホモ二量体化エピトープに結合し、アゴニスト抗体とし
て機能するＳＡＰ媒介活性化経路を介して細胞傷害性Ｔ細胞機能を増強すると考えられる
。
実施例１２ Ｈｕ_１Ｂ３抗体の内在化
ＲＡＪＩ、ヒトバーキット（Burkitt）リンパ腫細胞（Cat No CCL-86, American Type
Culture Collection [ATCC], Manassas VA）を、ＲＰＭＩ－１６４０培地（Cellgro, Cat
No 10-041-CM, Mediatech, Manassas VA）中で、１０％ウシ胎児血清（HyClone* Cosmic
Calf Serum, Cat No SH30087-03, Thermo Scientific, Waltham, MA）および１％ピルビ
ン酸ナトリウム（Cellgro, Cat. # 25-000-Cl）を業界標準の無菌技術を使用して添加し
た。ＲＡＪＩ細胞は、２４ウェル用ガラスボトム培養プレートでウェルあたり５×１０５
細胞の密度でプレートされ、増殖培地中で、３７℃で４８時間増殖できた。ウェルは以下
のサンプルについて０時間、０．５時間、１時間、２時間、４時間および２４時間後に調
製した：２次抗体のみの対照、ヒトＩｇＧアイソタイプ対照、抗体Ｈｕ_１Ｂ３、Seattle
genetics由来の臨床抗ＳＬＡＭＦ６抗体（陽性対照）。蛍光対照としては、二次のみの
対照ウェル、抗体対照ウェルを用いなかった。
続いて、すべての抗体インキュベーションおよび洗浄工程を氷冷試薬を用いて氷上で行
った。培養培地をウェルから吸引し、ＩＦ緩衝液（ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（DP
BS, Thermo Scientific, Waltham VA, Cat. # SH30028-03)）＋２％ＦＢＳ）で２回洗浄
した。一次抗体（精製されたＯＢＴヒト化Ｈｕ_１Ｂ３；アイソタイプまたは陽性対照抗
体（Seattle genetics）をＩＦ緩衝液で２ｕｇ／ｍｌに希薄化し、適宜ウェルに２００μ
ｌを１５分間適用した。同じ容量のＩＦ緩衝液のみを、二次抗体対照のために指定された
ウェルに添加した。二次抗体（ヤギ抗ヒトＩｇＧ－Alexa Fluor 488, Invitrogen Cat. #
A11013）をＩＦ緩衝液中で２ｕｇ／ｍＬの濃度に希釈し、さらに１５分間の一次インキュ
ベーションに加えた。
一次および二次抗体標識後、ヒトＩｇＧアイソタイプ対照、二次抗体のみ対照、および
０分後の試験および陽性対照を処理した。細胞をＩＦ緩衝液で２回洗浄し、４％パラホル
ムアルデヒド（ＤＰＢＳで半分に希釈した４％、Cat No 19943, Affymetrix, Santa Clar
a, CA）を含む第２の２４ウェルプレート中に氷上で配置し、内部移行を停止させ、細胞
を固定した。
残りの細胞をＩＦ緩衝液で２回洗浄し、１ｍＬの温めた増殖培地を、３７℃インキュベ
ーターに入れる前に各ウェルに添加した。０時間、０．５時間、１時間、２時間、４時間
、２４時間の細胞を、対照試料について記載したように氷上でパラホルムアルデヒド中に
固定した。
全ての細胞は氷上で少なくとも１５分間固定液中に留まった。細胞をＩＦ緩衝液で洗浄
し、核カウンター染色として、２～３滴のProlong Gold Anti-Fade試薬＋ＤＡＰＩ（Cat
No P-36931, Invitrogen, Grand Island, NY）と共にカバースリップを各ウェルに添加し
た。細胞画像は、Ｌｅｉｃａマイクロスコープ（Leica DMI600B）、Ｌｅｉｃａモノクロ
カメラ（Leica DFC350FX）、ＤＡＰＩ用フィルターセットおよびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ
４８８およびオイル液浸レンズ６３ｘを用いて取得した。画像はＴＩＦＦフォーマットで
保存し、ＩｍａｇｅＪを用いて解析した。
図１４は、ヒト化抗体Ｈｕ_１Ｂ３は、臨床のSeattleGenetics抗体よりも有意に少ない
SLAMF6発現細胞に内在化することを示す。このことは、抗体Ｈｕ_１Ｂ３に結合すると、
レセプターが細胞表面に長時間残るため、Ｔ細胞においてより持続性のある応答を誘導す
ることを示しており、したがって、より有効なアゴニストとなるであろう。
実施例１３ 細胞毒性アッセイ
ＳＫＢｒ３ ＨＣＴ１１６およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１をＡＴＣＣから購入した。細胞
株は、標準的な無菌技術を用いて製造業者（ＡＴＣＣ）の指示に従って維持した。細胞培
養培地は、２ｍＭ Ｌ‐グルタミンおよび２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（コーニング）、１％ペニ
シリン／ストレプトマイシン（Sigma‐Aldrich）、および１０％熱不活化ＦＣＳ（HyClon
e)を含むＲＰＭＩ‐１６４０から構成された。細胞線は指数関数的フェーズで維持され、
５％ＣＯ２を含む３７℃インキュベータで増殖させた。ＳＫＢｒ３は、高コピー数のＨｅ
ｒ２（約５×１０６コピー／細胞）を発現する乳癌細胞株である。ＨＣＴ１１６は低コピ
ー数のＨｅｒ２を発現する大腸癌細胞株である。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１は、低コピー数の
Ｈｅｒ２を発現する乳癌細胞系である。
標的およびエフェクター（ＰＢＭＣ）細胞を、以下の条件下で調製した。アッセイの前
日に、標的細胞をＰＢＳで洗浄し、０．２５％トリプシンと共にインキュベートし、細胞
培養培地に再懸濁した。生存率および細胞濃度は色素排除法により測定した。標的細胞を
９６ウェル組織培養処理プレート中で１０，０００細胞／ウェルでプレーティングした。
細胞は、５％ＣＯ２を用いた３７℃インキュベーターで一晩増殖させた。
アッセイの前日に、凍結したＰＢＭＣを３７℃水浴中で解凍し、細胞培養培地で洗浄し
、そして５％ＣＯ２と共に３７℃インキュベーター中で一晩培養した。翌日、生存率およ
び細胞濃度を色素排除により測定した。ＰＢＭＣを標的細胞に１０：１のＥ：Ｔ比で添加
した。１０，０００標的細胞を１００，０００個のエフェクター細胞と混合した。
二重特異性抗体Ｃｒｉｓ７‐Ｈｅｒ２を細胞毒性アッセイに用いた。抗体はＨｅｒ２と
ＣＤ３εの両方を検出する。Ｃｒｉｓ７－Ｈｅｒ２二重特異性（Bispecific）抗体を１０
０ｎｇ／ｍｌに希薄化し、次いで３倍～０．００１２ｎｇ／ｍｌにまで連続的に希薄した
。さらに、Ｃｒｉｓ７－Ｈｅｒ２＋アゴニスト抗体を検査した。アゴニスト抗体による増
強された細胞毒性を観察するために、Ｃｒｉｓ７‐Ｈｅｒ２二重特異性抗体とアゴニスト
抗体の組合せを含めた。陽性対照として、４－１ＢＢに対する抗体であるウレルマブ（Ur
elumab）を用いた。アイソタイプ（Isotype）を陰性対照として用いた。Ｈｕ_１Ｂ３が被
験物質であった。最終濃度２．５ｕｇ／ｍｌで、ウレルマブ、アイソタイプ、およびＨｕ
_１Ｂ３を用いた。すべての試料を３回実施した。対照には、標的細胞単独または標的細
胞＋エフェクター細胞が含まれた。さらなる対照には、標的細胞およびエフェクター細胞
＋Ｈｕ_１Ｂ３、または、標的細胞およびエフェクター細胞＋アイソタイプ対照を含んだ
。
細胞毒性アッセイを、細胞株に応じて４８～９６時間インキュベートした。インキュベ
ーション後、標的細胞の生存性を測定した。生存能力はＡＴＰの定量に基づいており、Ａ
ＴＰは代謝活性細胞の存在を知らせるシグナルとなる。このアッセイは発光ベースであり
、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）（Promega, Madison, WI）は生細胞を測定
するために使用される試薬であった。アッセイ条件については、製造業者の指示に従い、
全ての工程を室温で行った。簡単に述べると、９６ウェルプレートおよびＣｅｌｌ Ｔｉ
ｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）試薬を室温に３０分間平衡化した。３０分後、細胞培養媒体
を取り除き、ＰＢＳの２００ｕｌで標的セルを洗浄し、洗浄ステップをさらに１回繰り返
した。次に、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）試薬の１００ｕｌをすべてのウ
ェルに加えた。プレートを軌道振盪機上に置き、２５０ｒｐｍで２分間混合し、細胞溶解
を誘導した。プレートを軌道振盪機から取り出し、暗所で１０分間インキュベートして、
発光シグナルを安定化させた。１０分後、試料を不透明壁の９６ウェルプレートに移し、
発光を記録した。
標的細胞の生存率は、生成された発光シグナルに比例した。すべての試料を３回繰り返
して行い、各アッセイ条件について平均を計算した。試料の細胞毒性パーセントを対照に
対して正規化し、対照はエフェクター細胞（標的＋エフェクター）の存在下での標的細胞
の生存性であった。生存率を計算するために、試料の発光信号を対照の発光信号で割った
。細胞毒性は、残った非生存細胞の割合に基づいて計算された。図１５に見られるように
、ＳＫＢｒ３細胞では、二重特異性抗体のみ、または二重特異性抗体＋アイソタイプ対照
は、０．８～１００ｎｇ／ｍｌのより高い濃度で効果的な細胞毒性を有する。ウレルマブ
を添加すると、細胞毒性曲線はわずかに左方に移動するが、５％以下である。しかしなが
ら、２．５ｕｇ／ｍｌのＨｕ_１Ｂ３の添加はＳＫＢＲ‐３細胞の細胞毒性を１０～４０
％増強した。
図１６は、第２のＰＢＭＣドナーにおいて同様の結果が見られることを示している。
図１７は、ＨＣＴ１１６細胞に対するＨｕ_１Ｂ３による増強された細胞毒性を示す。
結腸癌細胞株であるＨＣＴ１１６細胞は、細胞表面に低レベルのＨｅｒ２を発現する。細
胞毒性アッセイは、ＰＢＭＣ、およびＴ細胞係合二重特異性抗体、Ｃｒｉｓ７－Ｈｅｒ２
とともにＨＣＴ１１６細胞を用いて行った。上述のように、Ｈｕ_１Ｂ３をアッセイに添
加して、それがＰＢＭＣに存在するＴ細胞またはＮＫ細胞の機能を増強するかどうかを決
定し、Ｔ細胞およびＮＫ細胞は共活性化受容体であるＳＬＡＭＦ６を共に発現する。デー
タは、Ｔ細胞係合（engaging）二重特異性抗体、Ｃｒｉｓ７‐Ｈｅｒ２による用量依存性
細胞毒性を、試験した種々の濃度で示す。さらに重要なことに、データはＨｕ_１Ｂ３を
添加した場合、細胞毒性の増加が観察されたことを示している。Ｃｒｉｓ７－Ｈｅｒ２特
殊単独または二重特異性抗体＋アイソタイプ対照のＥＣ５０は約０．２５ｎｇ／ｍｌであ
るのに対し、二重特異性抗体＋Ｈｕ_１Ｂ３のＥＣ５０は約０．０７ｎｇ／ｍｌである。
これは細胞毒性の約３．６倍の増加を示す。
図１８は、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞に対するＨｕ_１Ｂ３による増強された細胞毒性
を示す。乳癌細胞株であるＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞は、細胞表面に低レベルのＨｅｒ２
を発現する。細胞毒性アッセイは、上記のように、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を、ＰＢＭ
Ｃ、およびＴ細胞係合二重特異性抗体、Ｃｒｉｓ７－Ｈｅｒ２とともに用いて行った。再
び、Ｈｕ_１Ｂ３は、試験した種々の濃度で、Ｃｒｉｓ７－Ｈｅｒ２二重特異性の細胞毒
性を増強する。具体的には、アイソタイプ対照と比較して、Ｃｒｉｓ７の１ｎｇ／ｍＬで
細胞毒性の４０％の増加が観察された。
図１９は、９６時間のインキュベーション後、二重特異性とＨｕ_１Ｂ３の組合せが、
二重特異性抗体濃度の最低レベルでさえもＳＫＢＲ－３細胞の高いレベル（量）の殺傷を
示したことを示す。一方、これらのレベルでは、二重特異性単独または二重特異性とウレ
ルマブ（Urelumab）の併用、またはアイソタイプ対照のいずれかが、非常に低いレベル（
量）の細胞死をもたらし、または、細胞死をもたらさなかったことから、Ｈｕ_１Ｂ３が
リンパ球の強力な活性化をもたらすことが示唆された。
図２０は、上記の細胞毒性アッセイにおいて、検査抗体の濃度が７．５ｕｇ／ｍｌから
０．００３４ｕｇ／ｍｌの範囲で１／３の希薄化で滴定されるという条件で、二重特異性
Ｃｒｉｓ７－Ｈｅｒ２抗体が一定水準（０．０４５７ｎｇ／ｍｌ）に維持されることを示
している。ＳＫＢＲ－３細胞の用量依存的な殺傷が、ウレルマブまたはアイソタイプ対照
と比較して観察され、さらに、細胞傷害性リンパ球を活性化するＨｕ_１Ｂ３の能力を示
した。
実施例１４ Ｃｒｉｓ７二重特異性の非存在下における細胞毒性アッセイ
別の細胞毒性アッセイを上記のように設定したが、二重特異性抗体は使用しなかった。
単剤のＳＫＢＲ－３による細胞毒性試験には、Ｈｕ_１Ｂ３、アイソタイプ対照、および
ウレルマブのみを用いた。アッセイで使用した濃度範囲は、１ドナーによる１／３希釈で
３３ｕｇ／ｍｌ～０．１３ｕｇ／ｍｌであった。第２ドナーについては、試験抗体をさら
に０．０１５２ｕｇ／ｍｌに希釈した（図２１ｂ）。
図２１ａおよび２１ｂは、ＣＤ３－Ｈｅｒ２二重特異的抗体Ｈｕ_１Ｂ３の非存在下で
、リンパ球を活性化してＳＫＢＲ－３細胞の細胞死を誘導することができることを示す。
これは、細胞殺傷がほとんどみられないウレルマブまたはアイソタイプ対照とは対照的で
ある。
配列表

Claims (27)

  1. ＳＬＡＭＦ６および１つ以上の追加の結合標的に結合する二重特異性抗体または多重特異性抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
    配列番号５を含むＣＤＲ－Ｈ１配列と、
    配列番号６または配列番号１５を含むＣＤＲ－Ｈ２配列と、
    配列番号７を含むＣＤＲ－Ｈ３配列と、
    を含む重鎖可変領域、および
    配列番号８または配列番号１６を含むＣＤＲ－Ｌ１配列と、
    配列番号９または配列番号１７を含むＣＤＲ－Ｌ２配列と、
    配列番号１０を含むＣＤＲ－Ｌ３配列と、
    を含む軽鎖可変領域、
    を含む、二重特異性抗体または多重特異性抗体またはその抗原結合フラグメント。
  2. 前記重鎖可変領域が、
    配列番号５の配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、
    配列番号１５の配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、
    配列番号７の配列を含むＣＤＲ－Ｈ３と、
    を含む、請求項１に記載の二重特異性抗体または多重特異性抗体またはその抗原結合フラグメント。
  3. 前記軽鎖可変領域が、
    配列番号１６の配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、
    配列番号１７の配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、
    配列番号１０の配列を含むＣＤＲ－Ｌ３と、
    を含む、請求項１または請求項２に記載の二重特異性抗体または多重特異性抗体またはその抗原結合フラグメント。
  4. ＳＬＡＭＦ６に結合する二重特異性抗体または多重特異性抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
    配列番号５を含むＣＤＲ－Ｈ１と、
    配列番号１５を含むＣＤＲ－Ｈ２と、
    配列番号７を含むＣＤＲ－Ｈ３と、
    を含む重鎖可変領域、および
    配列番号１６を含むＣＤＲ－Ｌ１と、
    配列番号１７を含むＣＤＲ－Ｌ２と、
    配列番号１０を含むＣＤＲ－Ｌ３と、
    を含む軽鎖可変領域
    を含む、二重特異性抗体または多重特異性抗体またはその抗原結合フラグメント。
  5. ＳＬＡＭＦ６に結合する二重特異性抗体または多重特異性抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
    ｉ）配列番号１の３つの重鎖ＣＤＲおよび配列番号２の３つの軽鎖ＣＤＲ、または
    ｉｉ）配列番号１３の３つの重鎖ＣＤＲおよび配列番号１４の３つの軽鎖ＣＤＲ
    を含み、
    前記ＣＤＲはＫａｂａｔまたはＣｈｏｔｈｉａナンバリングシステムによって定義される、二重特異性抗体または多重特異性抗体またはその抗原結合フラグメント。
  6. 配列番号１３と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である配列を含む重鎖可変領域と、
    配列番号１４と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である配列を含む軽鎖可変領域と、
    をさらに含む、請求項４に記載のＳＬＡＭＦ６に結合する二重特異性抗体または多重特異性抗体またはその抗原結合フラグメント。
  7. 配列番号１３を含む重鎖可変領域と、配列番号１４を含む軽鎖可変領域とを含む、請求項６に記載の二重特異性抗体または多重特異性抗体またはその抗原結合フラグメント。
  8. 前記１つ以上の追加の結合標的がＰＤ‐Ｌ１を含む、請求項１～７のいずれかに記載の二重特異性抗体または多重特異性抗体またはその抗原結合フラグメント。
  9. 前記１つ以上の追加の結合標的がＣＤ３を含む、請求項１～７のいずれかに記載の二重特異性抗体または多重特異性抗体またはその抗原結合フラグメント。
  10. 前記二重特異性抗体または多重特異性抗体またはその抗原結合フラグメントがモノクローナル抗体である、請求項１～９のいずれかに記載の二重特異性抗体または多重特異性抗体またはその抗原結合フラグメント。
  11. 前記二重特異性抗体または多重特異性抗体またはその抗原結合フラグメントが、キメラもしくはヒト化抗体、またはその抗原結合フラグメントである、請求項１～１０のいずれかに記載の二重特異性抗体または多重特異性抗体またはその抗原結合フラグメント。
  12. 前記二重特異性抗体または多重特異性抗体またはその抗原結合フラグメントが、１つ以上のＦｃレセプターへの結合を低減されているもしくは該結合を全く有さないＦｃサイレンシングされた操作されたＩｇＧ１抗体である、または、その抗原結合フラグメントである、請求項１～１１のいずれかに記載の二重特異性抗体または多重特異性抗体またはその抗原結合フラグメント。
  13. 前記二重特異性抗体または多重特異性抗体またはその抗原結合フラグメントが、Ｔ細胞の細胞毒性を誘導および／または増強することができる、請求項１～１２のいずれかに記載の二重特異性抗体または多重特異性抗体またはその抗原結合フラグメント。
  14. 前記抗原結合フラグメントが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ＦＶ－ＴＣＲフラグメント、およびｓｃＦｖからなる群より選択される、請求項１～１３のいずれかに記載の二重特異性抗体または多重特異性抗体またはその抗原結合フラグメント。
  15. ｉ）請求項１～１４のいずれかに記載の二重特異性抗体または多重特異性抗体またはその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域、および／または
    ｉｉ）請求項１～１４のいずれかに記載の二重特異性抗体または多重特異性抗体またはその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域、
    をコードする、ポリヌクレオチド。
  16. 請求項１５に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
  17. ｉ．請求項１５に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター、または
    ｉｉ．請求項１５に記載の二重特異性抗体または多重特異性抗体またはその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドを含む第一の発現ベクターと、請求項１５に記載の二重特異性抗体または多重特異性抗体またはその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドとを含む第二の発現ベクターと、
    を含む宿主細胞。
  18. 二重特異性抗体または多重特異性抗体またはその抗原結合フラグメントを製造する方法であって、請求項１７に記載の宿主細胞を、前記二重特異性抗体または多重特異性抗体またはその抗原結合フラグメントが前記宿主細胞中で発現される条件下で培養することを含む、方法。
  19. 前記二重特異性抗体または多重特異性抗体またはその抗原結合フラグメントを単離することをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
  20. 請求項１～１４のいずれか一項に記載の二重特異性抗体または多重特異性抗体またはその抗原結合フラグメントと、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
  21. 癌の治療に使用するための医薬品の製造における、請求項１～１４または２０のいずれか一項に記載の二重特異性抗体または多重特異性抗体またはその抗原結合フラグメント、または医薬組成物の使用。
  22. 前記癌が、小細胞肺癌、扁平上皮癌および腺癌を含む非小細胞肺癌、メラノーマを含む皮膚癌、ＴＮＢＣを含む乳癌、結腸直腸癌、胃（gastric）癌、卵巣癌、子宮癌、前立腺癌、腎臓癌、肝細胞癌を含む肝臓癌、膵臓癌、頭頸部癌、鼻咽頭癌、食道癌、膀胱癌および他の尿路上皮癌、胃（stomach）癌、神経膠腫、神経膠芽腫、精巣癌、甲状腺癌、骨癌、胆嚢癌および胆管癌、子宮癌、副腎癌、肉腫、ＧＩＳＴ、神経内分泌腫瘍および血液悪性腫瘍からなる群より選択される、請求項２１に記載の使用。
  23. 前記医薬組成物または医薬品が、有効量の第２の治療薬をさらに含む、請求項２１または２２に記載の使用。
  24. 癌の治療に使用するための、請求項１～１４または２０のいずれか一項に記載の二重特異性抗体または多重特異性抗体またはその抗原結合フラグメント、または医薬組成物。
  25. 前記癌が、小細胞肺癌、扁平上皮癌および腺癌を含む非小細胞肺癌、メラノーマを含む皮膚癌、ＴＮＢＣを含む乳癌、結腸直腸癌、胃（gastric）癌、卵巣癌、子宮癌、前立腺癌、腎臓癌、肝細胞癌を含む肝臓癌、膵臓癌、頭頸部癌、鼻咽頭癌、食道癌、膀胱癌および他の尿路上皮癌、胃（stomach）癌、神経膠腫、神経膠芽腫、精巣癌、甲状腺癌、骨癌、胆嚢癌および胆管癌、子宮癌、副腎癌、肉腫、ＧＩＳＴ、神経内分泌腫瘍および血液悪性腫瘍からなる群より選択される、請求項２４に記載の使用のための、二重特異性抗体または多重特異性抗体またはその抗原結合フラグメント、または医薬組成物。
  26. 前記医薬組成物または医薬品が、有効量の第２の治療薬をさらに含む、請求項２４～２５のいずれか一項に記載の使用のための、二重特異性抗体または多重特異性抗体またはその抗原結合フラグメント、または医薬組成物。
  27. 治療に使用するためのまたは医薬品として使用するための、請求項１～１４もしくは２０のいずれか一項に記載の二重特異性抗体もしくは多重特異性抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または医薬組成物。
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