JP7843250B2 - 可溶性ｇｐｃ３のイムノアッセイにおける可溶性ｇｐｃ３含有検体の処理方法 - Google Patents

Description

本発明は、可溶性グリピカン－３（ＧＰＣ３）のイムノアッセイにおける可溶性ＧＰＣ３含有検体の処理方法などに関する。

ＧＰＣ３は、そのＣ末端に存在するグリコシルフォスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーを介して細胞膜に結合している、ヘパラン硫酸鎖を有するプロテオグリカンであるグリピカンファミリーに属する約６５ｋＤａの分子量を有するタンパク質である。ＧＰＣ３は、ゴルジ体においてＦｕｒｉｎと呼ばれる酵素により３５８位のアルギニン残基と３５９位のセリン残基との間で切断されてＮ末端断片（約４０ｋＤａ）およびＧＰＩアンカー含有Ｃ末端断片（約３０ｋＤａ）を生成する。しかし、このような２つの断片は通常、ジスルフィド結合により連結していることが確認されている。したがって、ＧＰＣ３は、ジスルフィド結合により連結された２つの断片を含む全長型タンパク質の形態において、ＧＰＩアンカーを介して細胞膜に結合していると考えられている。

ＧＰＣ３はまた、肝臓癌等の癌において特異的な発現が認められるタンパク質であるため、ＧＰＣ３を標的とする癌患者の検査に有用な方法の開発が模索されている。例えば、特許文献１では、可溶性ＧＰＣ３の測定による癌患者の検査方法が提案されている。また、特許文献２では、ＧＰＣ３のＮ末端領域に存在する異なるエピトープに結合する異なる２つの抗体を用いるＧＰＣ３の測定方法が提案されている。

国際公開第２００４／０３８４２０号 国際公開第２０１５／０９７９２８号

本発明の課題は、可溶性ＧＰＣ３の検査に有用な方法および試薬を提供することである。

本発明者らは、鋭意検討した結果、可溶性ＧＰＣ３のイムノアッセイにおいて、検体を還元剤で処理することにより、陽性検体と陰性検体との判別精度を向上できることを見出した。本発明者らはまた、可溶性ＧＰＣ３のイムノアッセイにおいて、検体を還元剤および界面活性剤の双方で処理することにより、陽性検体と陰性検体との判別精度を向上できること、およびマトリックス効果を低減できることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕可溶性ＧＰＣ３含有検体を還元剤と混合することを含む、可溶性ＧＰＣ３のイムノアッセイにおける可溶性ＧＰＣ３含有検体の処理方法。
〔２〕還元剤が、０．０５～１，０００ｍＭの終濃度で用いられる、〔１〕の方法。
〔３〕可溶性ＧＰＣ３含有検体を界面活性剤とさらに混合することを含む、〔１〕または〔２〕の方法。
〔４〕界面活性剤が、０．００５～１０重量％の終濃度で用いられる、〔３〕の方法。
〔５〕イムノアッセイが、可溶性ＧＰＣ３中の異なる２種以上のエピトープに対する異なる２種以上の抗体を用いるサンドイッチイムノアッセイである、〔１〕～〔４〕のいずれかの方法。
〔６〕可溶性ＧＰＣ３含有検体が血液検体である、〔１〕～〔５〕のいずれかの方法。
〔７〕可溶性ＧＰＣ３含有検体が、癌に罹患している被験体から得られる、〔１〕～〔６〕のいずれかの方法。
〔８〕癌が肝臓癌である、〔７〕の方法。
〔９〕下記（ａ）および（ｂ）を含む、可溶性ＧＰＣ３のイムノアッセイ方法：
（ａ）可溶性ＧＰＣ３含有検体を還元剤と混合すること；および
（ｂ）（ａ）で得られた混合液中の可溶性ＧＰＣ３量を、可溶性ＧＰＣ３に対する１種以上の抗体を用いて測定すること。
〔１０〕可溶性ＧＰＣ３含有検体を界面活性剤とさらに混合することを含む、〔９〕の方法。
〔１１〕測定が、可溶性ＧＰＣ３中の異なる２種以上のエピトープに対する異なる２種以上の抗体を用いるサンドイッチイムノアッセイにより行われる、〔９〕または〔１０〕の方法。
〔１２〕下記（ａ）および（ｂ）を含む、可溶性ＧＰＣ３のイムノアッセイ試薬：
（ａ）還元剤；および
（ｂ）可溶性ＧＰＣ３に対する１種以上の抗体。
〔１３〕さらに（ｃ）界面活性剤を含む、〔１２〕のイムノアッセイ試薬。
〔１４〕可溶性ＧＰＣ３に対する１種以上の抗体が、可溶性ＧＰＣ３中の異なる２種以上のエピトープに対する異なる２種以上の抗体であり、かつ、前記イムノアッセイ試薬がサンドイッチイムノアッセイ用である、〔１２〕または〔１３〕のイムノアッセイ試薬。
〔１５〕前記試薬が癌の診断用である、〔１２〕～〔１４〕のいずれかのイムノアッセイ試薬。

本発明によれば、可溶性ＧＰＣ３のイムノアッセイにおいて、陽性検体と陰性検体との判別精度を向上できる。したがって、本発明は、可溶性ＧＰＣ３のイムノアッセイにおいて、特定の状態（例、癌等の疾患）に対する高い診断感度の実現に有用である。

図１は、ウェスタンブロッティング（ＷＢ）による、抗原タンパク質中の抗体Ａおよび抗体Ｂの認識部位の解析を示す図である。抗原タンパク質として、ヒトＧＰＣ３の１－５５９番目のアミノ酸残基からなる組み換えヒトＧＰＣ３（ｒｈＧＰＣ３）、およびＧＰＣ３高発現のヒト肝癌細胞ＨｅｐＧ２の培養上清を用いた。レーン中にアプライしたタンパク質の量は、それぞれ１．４ｎｇ／レーンと７．２ｎｇ／レーンであった。

本発明は、可溶性ＧＰＣ３のイムノアッセイにおける検体の処理方法を提供する。

本発明では、可溶性ＧＰＣ３は、ＧＰＣ３発現細胞から分泌される可溶性ＧＰＣ３をいう。可溶性ＧＰＣ３としては、任意の被験体由来の可溶性ＧＰＣ３を利用することができる。このような被験体としては、例えば、哺乳動物（例、ヒト、サル等の霊長類；マウス、ラット、ウサギ等の齧歯類；ウシ、ブタ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の有蹄類、イヌ、ネコ等の食肉類）、鳥類（例、ニワトリ）が挙げられる。好ましくは、被験体は、ヒト等の哺乳動物である。ＧＰＣ３は、動物において広く保存されており、特に哺乳動物間ではそのアミノ酸配列が高度に保存されている。臨床応用の観点からは、被験体は、好ましくはヒトである。したがって、可溶性ＧＰＣ３は、好ましくはヒト可溶性ＧＰＣ３である。

好ましくは、ヒト可溶性ＧＰＣ３は、５８０個のアミノ酸残基からなるヒトＧＰＣ３タンパク質（アクセッション番号：Ｐ５１６５４．１）における３５８位のアルギニン残基と３５９位のセリン残基との間の切断により生成するＮ末端断片、またはヒトＧＰＣ３タンパク質のＣ末端に存在するＧＰＩアンカーの切断により遊離する可溶性全長型ＧＰＣ３である。可溶性全長型ＧＰＣ３としては、例えば、ヒトＧＰＣ３タンパク質における３５８位のアルギニン残基と３５９位のセリン残基との間の切断により生成するＮ末端断片とＣ末端断片がジスルフィド結合を介して互いに連結したＧＰＣ３断片が挙げられる。より具体的には、このようなヒト可溶性ＧＰＣ３は、（ａ）配列番号１のアミノ酸配列における１～３５８位のアミノ酸残基からなるＮ末端断片またはそのバリアント、（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列における１～３５８位のアミノ酸残基からなるＮ末端断片またはそのバリアントと、配列番号１のアミノ酸配列における３５９～５６０位のアミノ酸残基からなる可溶性Ｃ末端断片またはそのバリアントとがジスルフィド結合によって連結した可溶性全長型ＧＰＣ３、あるいは（ｃ）人種間および／または個人間において天然に生じ得るそれらの変異体である。このような変異体は、（ａ）Ｎ末端断片またはそのバリアント、または（ｂ）可溶性全長型ＧＰＣ３またはそのバリアントに対して、人種間および／または個人間において天然に生じ得る１個以上のアミノ酸残基の変異（例、置換、挿入、欠失）が導入されたものである。このような変異体におけるアミノ酸残基の変異の個数は、例えば１～３０個、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１５個、さらにより好ましくは１～１０個、特に好ましくは１個、２個、３個、４個又は５個であってもよい。

本発明では、イムノアッセイとは、可溶性ＧＰＣ３に対する１種以上の抗体を用いる可溶性ＧＰＣ３のイムノアッセイをいう。抗体としては、例えば、ポリクローナル抗体、およびモノクローナル抗体が挙げられる。好ましくは、抗体は、モノクローナル抗体である。抗体はまた、アイソタイプにより特定することができる。このようなアイソタイプとしては、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、およびＩｇＹが挙げられる。好ましくは、抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、またはＩｇＡであり、より好ましくはＩｇＧ、またはＩｇＭであり、さらにより好ましくはＩｇＧである。抗体はさらに、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体であってもよい。抗体はまた、可変領域および定常領域を各々含む重鎖および軽鎖を含む全長抗体もしくはその断片であってもよい。抗体断片としては、例えば、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、およびＦｖが挙げられる。また、抗体は、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）やＶＨＨ抗体であってもよい。

本発明で用いられる、可溶性ＧＰＣ３に対する抗体は、１種以上である限り特に限定されず、１種、２種、３種、４種、または５種であってもよい。本発明において可溶性ＧＰＣ３に対する２種以上の抗体が用いられる場合、このような２種以上の抗体は、同一または異なるエピトープを認識することができる。好ましくは、このような２種以上の抗体は、異なるエピトープを認識してもよい。可溶性ＧＰＣ３のイムノアッセイにおいて利用可能なエピトープ（例、サンドイッチアッセイで利用可能な異なる２種以上のエピトープ）、および当該エピトープに対する抗体としては種々のものが知られているので（例、国際公開第２０１５／０９７９２８号、国際公開第２００４／０３８４２０号、国際公開第２００４／０２２７３９号を参照）、本発明では、このような既知のエピトープおよびそれに対する抗体を用いてもよい。また、可溶性ＧＰＣ３に対する抗体は市販されているため、本発明では市販抗体を用いることもできる。簡便なイムノアッセイ等の観点から、可溶性ＧＰＣ３に対する１種または２種の抗体の使用が好ましい。本発明で用いられる、可溶性ＧＰＣ３に対する抗体は、ＧＰＣ３のＮ末端断片中の領域に結合する能力を有する抗体であることが好ましく、ＧＰＣ３のＮ末端断片中の領域に特異的に結合する能力を有する抗体であることがより好ましい。

イムノアッセイは、可溶性ＧＰＣ３に対する１種以上の抗体を用いる任意のイムノアッセイにより行うことができる。このようなイムノアッセイとしては、例えば、化学発光イムノアッセイ（ＣＬＩＡ）〔例、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ）〕、免疫比濁法（ＴＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）（例、直接ＥＬＩＳＡ、間接ＥＬＩＳＡ、競合ＥＬＩＳＡ、およびサンドイッチＥＬＩＳＡ）、放射イムノアッセイ（ＲＩＡ）、ラテックス凝集反応法、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、およびイムノクロマトグラフィー法、ウェスタンブロッティング、免疫染色が挙げられる。

イムノアッセイはまた、可溶性ＧＰＣ３に対する標識抗体および固相抗体を含む、可溶性ＧＰＣ３に対する２種以上の抗体を用いる任意のイムノアッセイにより行うことができる。標識抗体は、標識物質で標識された抗体またはイムノアッセイの工程において標識物質で標識される抗体である。標識物質としては、例えば、蛍光物質、発光物質、色素、および酵素が挙げられる。固相抗体は、固相に固定された抗体またはイムノアッセイの工程で固相に固定される抗体である。固相としては、例えば、粒子（例、マイクロ粒子、ナノ粒子、マイクロビーズ、ナノビーズ、マイクロスフェア、ナノスフェア）、支持体（例、メンブレン）、および基板（例、プレート）が挙げられる。固相は、磁性を有する固相（例、磁性粒子）であってもよい。

イムノアッセイはまた、任意の様式において行うことができる。このような様式としては、例えば、直接法、間接法、競合法、およびサンドイッチ法が挙げられる。好ましくは、イムノアッセイは、可溶性ＧＰＣ３の異なる２種以上のエピトープに対する異なる２種以上の抗体を用いるサンドイッチイムノアッセイにより行われてもよい。このようなサンドイッチイムノアッセイでは、可溶性ＧＰＣ３の異なる２種以上のエピトープに対する異なる２種以上の抗体として、可溶性ＧＰＣ３に対する標識抗体および固相抗体を含む２種以上の抗体が用いられる。簡便なイムノアッセイ等の観点から、イムノアッセイは、可溶性ＧＰＣ３中の異なる２種のエピトープに対する２種の抗体（標識抗体および固相抗体）を用いるサンドイッチイムノアッセイにより行われてもよい。可溶性ＧＰＣ３の異なる２種のエピトープに対する２種の抗体（標識抗体および固相抗体）は、Ｎ末端断片の異なるエピトープに対する２種の抗体であっても、Ｃ末端断片の異なるエピトープに対する２種の抗体であってもよい。あるいは、このような２種の抗体は、Ｎ末端断片のエピトープに対する１種の抗体と、Ｃ末端断片のエピトープに対する１種の抗体との組合せであってもよい。好ましくは、このような２種の抗体は、Ｎ末端断片の異なるエピトープに対する２種の抗体である。

本発明による可溶性ＧＰＣ３含有検体の処理方法は、可溶性ＧＰＣ３含有検体を還元剤と混合することを含む。これにより、可溶性ＧＰＣ３含有検体および還元剤の混合液が生成する。

可溶性ＧＰＣ３含有検体は、上述の可溶性ＧＰＣ３を含有する任意の検体である。可溶性ＧＰＣ３含有検体としては、例えば、被験体から得られる液体検体（例、血液、リンパ液、尿、乳汁、唾液、涙液）、被験体から得られる組織の抽出液検体、被験体から回収できる洗浄液検体（例、気管支等の粘膜組織を洗浄して得られるもの）、被験体由来の細胞培養物から得られる検体、および組換え可溶性ＧＰＣ３を含む検体（例、可溶性ＧＰＣ３標品）、ならびにこれらの検体を処理（例、分画）して得られる液体検体が挙げられる。可溶性ＧＰＣ３を豊富に含む検体の簡便な入手等の観点から、可溶性ＧＰＣ３含有検体は、好ましくは、血液検体（例、全血、血清、血漿）である。

特定の実施形態では、可溶性ＧＰＣ３含有検体は、特定の状態にある被験体から得られる検体であってもよい。このような被験体としては、例えば、特定の疾患に罹患している被験体、および特定の疾患に罹患している可能性がある被験体が挙げられる。特定の疾患としては、例えば、癌（例、肝臓癌、前立腺癌、悪性黒色腫）、肝臓疾患（例、肝炎、肝硬変）が挙げられる（例えば、国際公開第２００４／０３８４２０号；国際公開第２００７／０８１７９０号；国際公開第２００５／０３９３８０；Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｙｐｉｃａｎ－３－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＴＬｓ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ａｎｄ ｌｉｖｅｒ ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ，Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２２，ｐ．１４９－５４，２００９を参照）。

可溶性ＧＰＣ３含有検体を還元剤と混合する場合、任意の還元剤を使用することができる。このような還元剤としては、例えば、２－（ジメチルアミノ）エタンチオール（ＤＥＡＥＴ）、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、２－メルカプトエチルアミン、２－メルカプトエタノール、ジチオトレイトール、チオグリセロール、亜硫酸ナトリウム、およびボロハイドライド、ならびにそれらの塩が挙げられる。塩としては、例えば、金属塩（例、ナトリウム塩、カリウム塩等の一価の金属塩、およびカルシウム塩、マグネシウム塩等の二価の金属塩）、無機塩（例、フッ化物、塩化物、臭化物、ヨウ化物等のハロゲン化物塩、およびアンモニウム塩）、有機塩（例、アルキル基で置換されたアンモニウム塩）、および酸付加塩（例、硫酸、塩酸、臭化水素酸、硝酸、リン酸等の無機酸との塩、および酢酸、シュウ酸、乳酸、クエン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸等の有機酸との塩）が挙げられる。溶液中で高度に安定である還元剤の使用等の観点では、ＤＥＡＥＴ、もしくはＴＣＥＰ、またはそれらの塩が好ましい。

還元剤は、陰性検体からの検出シグナル強度（例、カウント）を低減できる終濃度で用いることができる。終濃度とは、混合の際の濃度である。したがって、終濃度は、混合により生成する混合液中の濃度としても表現できる。このような終濃度は、例えば０．０５～１，０００ｍＭ、好ましくは０．５～５００ｍＭ、より好ましくは１～３００ｍＭ、さらにより好ましくは３～２００ｍＭである。

可溶性ＧＰＣ３含有検体および還元剤の混合では、可溶性ＧＰＣ３含有検体を界面活性剤とさらに混合することを含んでいてもよい。このような場合、可溶性ＧＰＣ３含有検体、還元剤、および界面活性剤の混合液が生成する。

界面活性剤としては、例えば、非イオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、および陽イオン性界面活性剤、ならびにそれらの塩が挙げられる。塩は、上述のものと同様である。非イオン性界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、およびポリオキシエチレンアルキルエーテルを挙げることができる。ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルとしては、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミタート（Ｔｗｅｅｎ４０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート（Ｔｗｅｅｎ６０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ８０）が挙げられる。ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルとしては、例えば、ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）、ポリオキシエチレン（８）オクチルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１１４）、ポリオキシエチレン（３０）オクチルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－３０５）、およびポリオキシエチレン（４０）オクチルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－４０５）が挙げられる。ポリオキシエチレンアルキルエーテルとしては、ポリオキシエチレン（２３）ラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ３５）、ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテル（Ｂｒｉｊ５８）が挙げられる。非イオン性界面活性剤の好ましい例としては、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０）、およびポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）が挙げられる。両イオン性界面活性剤としては、例えば、スルホベタイン型界面活性剤が挙げられる。スルホベタイン型界面活性剤としては、例えば、３－［（３－コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］－１－プロパンスルホナート（ＣＨＡＰＳ）、３－［３－コラミドプロピル］ジメチルアンモニオ）－２－ヒドロキシプロパンスルホナート（ＣＨＡＰＳＯ）、Ｎ－ドデシル－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アンモニオ－１－プロパンスルホネート、Ｎ－テトラデシル－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アンモニオ－１－プロパンスルホネート、およびＮ－ヘキサデシル－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アンモニオ－１－プロパンスルホネートが挙げられる。陰イオン性界面活性剤としては、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、Ｎ－ラウロイルサルコシンナトリウム（ＮＬＳ）ドデシル硫酸リチウム、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、およびデオキシコール酸塩が挙げられる。陽イオン界面活性剤としては、例えば、デシルトリメチルアンモニウムクロライド、ドデシルトリメチルアンモニウムクロライド、テトラデシルトリメチルアンモニウムクロライド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロライド、デシルトリメチルアンモニウムブロマイド、ドデシルトリメチルアンモニウムブロマイド、テトラデシルトリメチルアンモニウムブロマイド、およびヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロマイドが挙げられる。好ましくは、界面活性剤は、非イオン性界面活性剤、もしくは両イオン性界面活性剤、またはそれらの塩である。

界面活性剤は、陰性検体からの検出シグナル強度を低減する還元剤の効果を増強できる、および／または検体のマトリックス効果を低減できる終濃度で用いることができる。終濃度とは、混合の際の濃度である。したがって、終濃度は、混合により生成する混合液中の濃度としても表現できる。このような終濃度は、例えば０．００５～１０重量％、好ましくは０．０１～９重量％、より好ましくは０．０２～７．５重量％、さらにより好ましくは０．０５～６重量％、特に好ましくは０．０５～５重量％である。

好ましくは、還元剤および界面活性剤は、陰性検体からの検出シグナル強度の低減、および／または検体のマトリックス効果の低減において効果を増強することができる比率で用いることができる。このような比率は、還元剤１ｍＭあたりの界面活性剤の濃度範囲により規定することができる。還元剤１ｍＭあたりの界面活性剤の濃度範囲は、例えば０．００００２５～３重量％、好ましくは０．００００５～０．１重量％、より好ましくは０．０００５～０．０１重量％、さらにより好ましくは０．００５～０．０５重量％である。

可溶性ＧＰＣ３含有検体が還元剤および界面活性剤の双方と混合される場合、混合は、同時または別々に行うことができる。混合が同時に行われる場合、可溶性ＧＰＣ３含有検体を、還元剤および界面活性剤の混合液と混合することができる。混合が別々に行われる場合、可溶性ＧＰＣ３含有検体を、先ず還元剤、次に界面活性剤と混合してもよく、または先ず界面活性剤、次に還元剤と混合してもよい。

還元剤および／または界面活性剤は、水溶液中に溶解して用いることができる。このような水溶液としては、例えば、水（例、蒸留水、滅菌水、滅菌蒸留水、純水）、および緩衝液が挙げられる。緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、クエン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、炭酸緩衝液、ＨＰＥＰＳ緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液が挙げられる。緩衝液のｐＨは、還元剤の種類および濃度等の因子に応じて変動するが、還元剤の効果の向上等の観点から、１．０～９．０（好ましくは４．０～６．０）であってもよい。所望のｐＨ範囲で還元剤の効果を安定して発揮させる等の観点から、水溶液は、好ましくは緩衝液である。水溶液は、有機溶媒（例、アルコール）等の他の成分を含んでいてもよい。可溶性ＧＰＣ３含有検体と、還元剤および／または界面活性剤を含む水溶液とで混合されるべき容量の比率（可溶性ＧＰＣ３含有検体：還元剤および／または界面活性剤を含む水溶液）は、例えば１０：１～１：１０であり、好ましくは５：１～１：５であり、より好ましくは２：１～１：２である。

混合は、還元剤単独、または還元剤および界面活性剤の双方による検体の処理に十分な条件下で行われる。このような温度条件は、例えば１５～６０℃、好ましくは２０～５０℃、より好ましくは２５～４５℃である。混合時間は、例えば、３０秒以下である。迅速な処理等の観点から、混合時間は、好ましくは２０秒以下であり、より好ましくは１５秒以下である。このような条件下で混合することにより、陰性検体からの検出シグナル強度を低減することができる。

本発明の方法は、混合後に、さらに混合液をインキュベートすることを含んでいてもよい。インキュベート時間は、還元剤の種類および濃度、界面活性剤の併用の有無、界面活性剤の種類および濃度、混合時間、および検出シグナル強度において所望される低減度、ならびに抗体を用いた測定（イムノアッセイ）が行われる場合には、それに要する時間等の因子に応じて変動するが、例えば１２０分以下、好ましくは６０分以下、より好ましくは３０分以下である。迅速な処理等の観点から、インキュベート時間は、さらにより好ましくは２０分以下であり、特に好ましくは１０分以下、または５分以下であってもよい。インキュベート温度は、上述の混合における温度条件と同様である。

本発明はまた、下記（ａ）および（ｂ）を含む、可溶性ＧＰＣ３のイムノアッセイ方法を提供する：
（ａ）可溶性ＧＰＣ３含有検体を還元剤と混合すること；および
（ｂ）（ａ）で得られた混合液中の可溶性ＧＰＣ３量を、可溶性ＧＰＣ３に対する１種以上の抗体を用いて測定すること。

可溶性ＧＰＣ３のイムノアッセイ方法における各種要素の定義、例、および好ましい例は、本発明による可溶性ＧＰＣ３含有検体の処理方法において述べたものと同様である。

工程（ａ）は、本発明による可溶性ＧＰＣ３含有検体の処理方法と同様にして行うことができる。工程（ｂ）は、上述のイムノアッセイにより行うことができる。工程（ａ）および（ｂ）は、並行してまたは別々に行うことができる。例えば、工程（ａ）および（ｂ）が並行して行われる場合、可溶性ＧＰＣ３含有検体、還元剤（および界面活性剤）、ならびに可溶性ＧＰＣ３に対する１種以上の抗体を同時に混合することにより、還元剤（および界面活性剤）による可溶性ＧＰＣ３含有検体の処理と抗原抗体反応を同時に行うことができる。しかし、陰性検体からの検出シグナル強度（例、カウント）を十分に低減させるためには、還元剤（および界面活性剤）による可溶性ＧＰＣ３含有検体の処理を十分に行い、次いで、可溶性ＧＰＣ３に対する１種以上の抗体を用いた抗原抗体反応により可溶性ＧＰＣ３量を測定することが好ましい。また、本発明で用いられる抗体がジスルフィド結合を含む場合、抗体と還元剤を長時間共存させると、還元剤は、抗体中のジスルフィド結合の切断により抗体を破壊するので、イムノアッセイの測定精度に影響し得る。したがって、本発明で用いられる抗体がジスルフィド結合を含む場合、工程（ａ）および（ｂ）は、別々に行われることが好ましい。勿論、本発明で用いられる抗体がジスルフィド結合を含まない場合（例、単鎖抗体）、工程（ａ）および（ｂ）を並行して行うこともまた好ましい。

本発明はさらに、下記（ａ）および（ｂ）を含む、可溶性ＧＰＣ３のイムノアッセイ試薬を提供する：
（ａ）還元剤；および
（ｂ）可溶性ＧＰＣ３に対する１種以上の抗体。

本発明の試薬は、さらに（ｃ）界面活性剤を含んでいてもよい。

構成成分（ａ）～（ｃ）の還元剤、抗体、および界面活性剤の定義、例、および好ましい例は、本発明による可溶性ＧＰＣ３含有検体の処理方法において述べたものと同様である。

特定の実施形態では、本発明の試薬は、可溶性ＧＰＣ３に対する１種以上の抗体が、可溶性ＧＰＣ３中の異なる２種以上のエピトープに対する異なる２種以上の抗体であり、かつ、前記試薬がサンドイッチイムノアッセイ用である試薬であってもよい。好ましくは、このような試薬は、上記２種以上の抗体として、可溶性ＧＰＣ３に対する標識抗体および／または固相抗体を含む。あるいは、このような試薬は、標識物質で標識された標識抗体および／または固相に固定された固相抗体を含まない場合、標識物質および／または固相を含んでいてもよい。標識物質としては、例えば、蛍光物質、発光物質、色素、および酵素が挙げられる。標識物質が酵素である場合、このような試薬は、酵素の基質（例、検出シグナルを発生する基質、または酵素により検出シグナルを発生する生成物に変換される基質、あるいは、検出シグナルを発生する基質、または酵素により検出シグナルを発生する生成物に変換される基質を利用する他の酵素反応と共役し得る反応における基質）を含んでいてもよい。固相は、上述したものと同様である。

本発明の試薬は、特定の状態の判定（例、疾患の診断）に用いることができる。特定の状態（例、疾患）は、上述したものと同様である。好ましくは、本発明の試薬は、肝臓癌、前立腺癌等の癌の診断に用いることができる。

以下、実施例を参照して本発明をより詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。

参考例１：グリピカン－３（ＧＰＣ３）と抗体の反応性の確認
ＧＰＣ３の１－５５９番目のアミノ酸残基からなる組み換えヒトＧＰＣ３（ｒｈＧＰＣ３）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）抗原、またはＧＰＣ３高発現のヒト肝癌細胞ＨｅｐＧ２の培養上清を用いたウェスタンブロッティングにより、抗ＧＰＣ３抗体Ａおよび抗ＧＰＣ３抗体Ｂ（いずれもモノクローナルＩｇＧ抗体）の認識部位の解析を行った。

ｒｈＧＰＣ３とＨｅｐＧ２培養上清にＳＤＳ－ＰＡＧＥ用サンプルバッファーを添加し、それぞれ１．４ｎｇタンパク質／レーンと７．２ｎｇタンパク質／レーンとなるようにｒｈＧＰＣ３とＨｅｐＧ２培養上清を５－２０％のポリアクリルアミドゲル（スーパーセットエース５－２０％、ＷＡＫＯ）にアプライした。電気泳動（３０ｍＡ、６０分）後、トランスブロット（登録商標）ＳＤセミドライ電気泳動転写セル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いてブロッティングメンブレン（イモビロンＩＳＥＱ、メルクミリポア）へタンパク質を転写した（１５Ｖ、６０分）。ブロッティングメンブレンを、ＴＢＳ－Ｔで軽く洗った後、ブロッキング液（０．５％ＥＣＬ Ｂｌоｃｋ（ＧＥヘルスケア ライフサイエンス）、０．５％ＢＳＡ、ＴＢＳ－Ｔ）中で１時間、室温で振とうした。ＴＢＳ－Ｔで２回洗浄後、ブロッティングメンブレンを、反応液（ブロッキング液をＴＢＳ－Ｔで２倍希釈）で１μｇ／ｍＬに各々希釈した抗ＧＰＣ３抗体Ａと抗ＧＰＣ３抗体Ｂとを含む溶液中で４℃で一晩振とうした。ＴＢＳ－Ｔで４回洗浄後、ブロッティングメンブレンを、反応液で２０，０００倍希釈したＰＯＤ標識抗マウス Ｆ（ａｂ’）_２（Ｊａｃｋｓｏｎ）を含む溶液中で１時間振とう後、ＴＢＳ－Ｔで洗浄した。発色反応はＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｆｅｍｔｏ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて行い、ケミルミイメージングシステム（ＦＵＳＩＯＮ ＳＹＳＴＥＭ、ビルバー・ルーマット）を用いて現像した。ウェスタンブロッティングの解析結果を図１に示す。
その結果、抗ＧＰＣ３抗体Ａと抗ＧＰＣ３抗体Ｂはいずれも、ＧＰＣ３のＮ末端断片（３５８番目のアミノ酸残基よりもＮ末端側の断片）に相当する４０ｋＤａのバンドに反応した（図１）。このことは、抗ＧＰＣ３抗体Ａおよび抗ＧＰＣ３抗体Ｂは、ＧＰＣ３のＮ末端領域を認識することを示す。したがって、抗ＧＰＣ３抗体Ａおよび抗ＧＰＣ３抗体Ｂが可溶性ＧＰＣ３を認識することが確認された。

参考例２：抗ＧＰＣ３抗体固相化粒子の調製
１０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．０）中で磁性粒子に抗ＧＰＣ３抗体Ａを添加して、０．２ｍｇ／ｍＬ 抗ＧＰＣ３抗体Ａおよび０．０１ｇ／ｍＬ 磁性粒子を含む懸濁液を得た。この懸濁液をゆるやかに攪拌しながら５℃で１時間インキュベートして、抗ＧＰＣ３抗体Ａを磁性粒子に固相化した。その後、磁性粒子を磁石で集磁し、磁性粒子を洗浄液（５０ｍＭ トリス緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２．０％ＢＳＡ、ｐＨ７．２）にて洗浄し、抗ＧＰＣ３抗体Ａ固相化粒子を得た。測定では、抗ＧＰＣ３抗体Ａ固相化粒子を、粒子希釈液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液、１ｍＭ ＥＤＴＡ２Ｎａ、０．１％ ＮａＮ_３、２．０％ＢＳＡ、ｐＨ７．２）中に懸濁した。

参考例３：アルカリホスファターゼ標識抗ＧＰＣ３抗体の調製
脱塩したアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）とＮ－（４－マレイミドブチリロキシ）－スクシンイミド（ＧＭＢＳ）（終濃度０．３ｍｇ／ｍＬ）を混合し、３０℃で１時間静置して、ＡＬＰをマレイミド化した。次いで、カップリング用反応液（１００ｍＭリン酸緩衝液、１ｍＭ ＥＤＴＡ２Ｎａ、ｐＨ６．３）中で、Ｆａｂ’化した抗ＧＰＣ３抗体Ｂと、マレイミド化ＡＬＰを１：１のモル比で混合し、２５℃で１時間反応させた。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ １０／３００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のカラムクロマトグラフィーを用いて、精製用緩衝液（５０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ＮａＮ_３、ｐＨ８．０）で、流速０．５ｍＬ／ｍｉｎで主要ピークを分取して精製し、ＡＬＰ標識抗ＧＰＣ３抗体Ｂを得た。測定では、ＡＬＰ標識抗ＧＰＣ３抗体Ｂを標識体希釈液（５０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．３ｍＭ ＺｎＣｌ_２、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．１％ ＮａＮ_３、２．０％ ＢＳＡ、ｐＨ６．８）中に懸濁した。

参考例４：可溶性ＧＰＣ３の測定
前処理液２０μＬを反応槽に分注し、次に検体２０μＬを反応槽に分注した。前処理液と検体の混合液を、３７℃で６．５分間インキュベーションした後、反応槽に抗ＧＰＣ３抗体Ａ固相化粒子５０μＬを分注し、混合液を攪拌した。混合液を３７℃で８分間インキュベーションし、Ｂ／Ｆ分離・洗浄を行った。ＡＬＰ標識抗ＧＰＣ３抗体Ｂ ５０μＬを反応槽に分注した後、混合液を攪拌した。混合液を３７℃で８分間インキュベーションし、Ｂ／Ｆ分離・洗浄を行った。その後、化学発光基質である３－（２’－スピロアダマンタン）－４－メトキシ－４－（３’’－ホスホリルオキシ）フェニル－１，２－ジオキセタン・２ナトリウム塩（ＡＭＰＰＤ）を含むルミパルス基質液２００μＬを反応槽に分注し、混合液を攪拌した。その後、混合液を３７℃で４分間インキュベーションし、次に、発光量をルミノメーターで測定した。実際の測定は、全自動化学発光酵素免疫測定システム（ルミパルスＬ２４００（富士レビオ社製））にて行った。

実施例１：可溶性ＧＰＣ３の測定における還元剤ＤＥＡＥＴによる検体の前処理
健常人由来の血清検体（陰性検体）、およびα－フェトプロテイン（ＡＦＰ）陽性である肝臓がん患者由来の血清検体（Ｔｒｉｎａ社）（陽性検体）を、可溶性ＧＰＣ３評価用検体として使用した。前処理液として、６．２５ｍＭ～６００ｍＭの２－（ジメチルアミノ）エタンチオール塩酸塩（ＤＥＡＥＴ）を含むリン酸緩衝液（１０ｍＭリン酸緩衝液，６．２５～６００ｍＭ ＤＥＡＥＴ，ｐＨ６．０）を用いた。コントロール液として、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を用いた。陰性検体、陽性検体および緩衝液サンプル（１０ｍＭリン酸緩衝液）を、それぞれ、前処理液と体積比１：１で混合し、３７℃で６．５分間反応させた（前処理あり）。同様に、陰性検体、陽性検体および緩衝液サンプルを、それぞれ、コントロール液と混合し、反応させた（前処理なし）。

各検体について、参考例４に記載の測定方法により可溶性ＧＰＣ３を測定した。各検体のカウントを表１に示す。また、カウントから下記計算式により算出された（１）低下率（％）、（２）陽性と陰性のカウント差（％）、および（３）マトリックス差（％）を表１に示す。

計算式
（１）低下率（％）＝１００－（各ＤＥＡＥＴ濃度の「前処理あり」のカウント／「前処理なし」のカウント）×１００
（２）陽性と陰性のカウント差（％）＝（陽性検体のカウント平均値）／（陰性検体のカウント平均値）×１００
（３）マトリックス差（％）＝（緩衝液サンプルのカウント）／（陰性検体のカウント平均値）×１００

低下率（％）は、個別検体における前処理の影響を評価するための指標である。陰性検体の低下率が大きいほど、また、陽性検体の低下率が小さいほど、陰性検体と陽性検体の測定値の差が広がり、両者をより区別可能となるため、高い診断感度を実現できる。したがって、陰性検体の低下率が大きいほど、また、陽性検体の低下率が小さいほど、可溶性ＧＰＣ３の測定系の前処理条件として有用である。

陽性と陰性のカウント差（％）は、前処理による陽性検体と陰性検体のカウントの差を評価するための指標である。陽性と陰性のカウント差（％）が大きいほど、高い診断感度を実現できるため、可溶性ＧＰＣ３の測定系に有用である。

マトリックス差（％）は、緩衝液サンプルと陰性検体のカウントの差を評価するための指標である。検体を用いたイムノアッセイでは、検体に含まれる物質によって免疫反応が影響することがある（マトリックス効果）。マトリックス差（％）が１００％に近いほど、マトリックス効果の低減を実現できる。低減したマトリックス効果は、検体種に依存しない真値の出力を達成できるため、可溶性ＧＰＣ３の測定系に有用である。

表１に示すように、陰性検体をＤＥＡＥＴで前処理した場合、検討した全ての濃度（６．２５ｍＭ～６００ｍＭ）において陰性検体のカウントは低下し、その低下率は非常に大きかった。一方、陽性検体をＤＥＡＥＴで前処理した場合、陽性検体のカウントは低下しないか、または低下しても陰性検体に比べてその低下率は小さかった。特に、ＤＥＡＥＴを５０ｍＭ～４００ｍＭの濃度で添加した場合、陽性と陰性のカウント差（％）は、非常に大きかった。このことは、還元剤ＤＥＡＥＴによる検体の前処理が可溶性ＧＰＣ３の測定における陽性検体と陰性検体との判別精度を向上できることを示す。また、ＤＥＡＥＴで陰性検体を前処理した場合、マトリックス差が１００％に近づき、マトリックス効果が低減された。したがって、還元剤ＤＥＡＥＴによる検体の前処理は、可溶性ＧＰＣ３の測定に有用であることが確認された。

実施例２：可溶性ＧＰＣ３の測定における還元剤２ＭＥＡによる検体の前処理
前処理液として、６．２５ｍＭ～１００ｍＭの２－メルカプトエチルアミン塩酸塩（２ＭＥＡ）を含むリン酸緩衝液（１０ｍＭリン酸緩衝液，６．２５～１００ｍＭ ２ＭＥＡ，ｐＨ６．０）を用いた。コントロール液として、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を用いた。陰性検体、陽性検体および緩衝液サンプルを、それぞれ、前処理液と体積比１：１で混合し、３７℃で６．５分間反応させた（前処理あり）。同様に、陰性検体、陽性検体および緩衝液サンプルを、それぞれ、コントロール液と混合し、反応させた（前処理なし）。

各検体について、参考例４に記載の測定方法により可溶性ＧＰＣ３を測定した。各検体のカウントを表２に示す。また、実施例１と同様に、低下率（％）、陽性と陰性のカウント差（％）、およびマトリックス差（％）を算出した。

表２に示すように、陰性検体を２ＭＥＡで前処理した場合、検討した全ての濃度（６．２５ｍＭ～１００ｍＭ）において陰性検体のカウントは低下し、その低下率は非常に大きかった。一方、陽性検体を２ＭＥＡで前処理した場合、陽性検体のカウントは低下しないか、または低下しても陰性検体に比べてその低下率は小さかった。このことは、還元剤２ＭＥＡによる検体の前処理が可溶性ＧＰＣ３の測定における陽性検体と陰性検体との判別精度を向上できることを示す。また、２ＭＥＡで陰性検体を前処理した場合、マトリックス差が１００％に近づき、マトリックス効果が低減された。したがって、還元剤２ＭＥＡによる検体の前処理は、可溶性ＧＰＣ３の測定に有用であることが確認された。

実施例３：可溶性ＧＰＣ３の測定における還元剤ＴＣＥＰによる検体の前処理
前処理液として、６．２５ｍＭ～１００ｍＭのトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）を含むリン酸緩衝液（１０ｍＭリン酸緩衝液，６．２５～1００ｍＭ ＴＣＥＰ，ｐＨ６．０）を用いた。コントロール液として、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を用いた。陰性検体、陽性検体および緩衝液サンプルを、それぞれ、前処理液と体積比１：１で混合し、３７℃で６．５分間反応させた（前処理あり）。同様に、陰性検体、陽性検体および緩衝液サンプルを、それぞれ、コントロール液と混合し、反応させた（前処理なし）。

各検体について、参考例４に記載の測定方法により可溶性ＧＰＣ３を測定した。各検体のカウントを表３に示す。また、実施例１と同様に、低下率（％）、陽性と陰性のカウント差（％）、およびマトリックス差（％）を算出した。

表３に示すように、陰性検体をＴＣＥＰで前処理した場合、検討した全ての濃度（６．２５ｍＭ～１００ｍＭ）において陰性検体のカウントは低下し、その低下率は非常に大きかった。一方、陽性検体をＴＣＥＰで前処理した場合、陽性検体のカウントは低下しないか、または低下しても陰性検体に比べてその低下率は小さかった。このことは、還元剤ＴＣＥＰによる検体の前処理が可溶性ＧＰＣ３の測定における陽性検体と陰性検体との判別精度を向上できることを示す。また、ＴＣＥＰで陰性検体を前処理した場合、マトリックス差が１００％に近づき、マトリックス効果が低減された。したがって、還元剤ＴＣＥＰによる検体の前処理は、可溶性ＧＰＣ３の測定に有用であることが確認された。

（実施例１～３のまとめ）
実施例１～３の結果を考慮すると、還元剤による検体の前処理は、還元剤の種類および構造にかかわらず、可溶性ＧＰＣ３の測定における陽性検体と陰性検体との判別精度を向上できると考えられる。また、還元剤による陰性検体の前処理は、マトリックス効果の低減により、検体種に依存しない真値の出力を実現できると考えられる。したがって、還元剤による検体の前処理は、可溶性ＧＰＣ３の測定に有用である。

実施例４：可溶性ＧＰＣ３の測定における還元剤と界面活性剤の組合せによる検体の前処理
前処理液として、表４Ａに示す試験例２～１１のリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を用いた。試験例２～１１のリン酸緩衝液は、還元剤としてＤＥＡＥＴ、および界面活性剤として３－［（３－コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］－１－プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、またはポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート（Ｔｗｅｅｎ２０）を含んでいた。コントロール液として、表４Ａに示す試験例１の１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を用いた。陰性検体、陽性検体および緩衝液サンプルを、それぞれ、前処理液と体積比１：１で混合し、３７℃で６．５分間反応させた（前処理あり）。同様に、陰性検体、陽性検体および緩衝液サンプルを、それぞれ、コントロール液と混合し、反応させた（前処理なし）。

各検体について、参考例４に記載の測定方法により可溶性ＧＰＣ３を測定した。各検体のカウントを表４Ｂに示す。また、実施例１と同様に、低下率（％）、陽性と陰性のカウント差（％）、およびマトリックス差（％）を算出した。

表４に示すように、陰性検体を還元剤と界面活性剤の組合せで前処理した場合、検討した全ての界面活性剤濃度（各０．１～１０重量％）において陰性検体のカウントは低下し、その低下率は非常に大きかった。一方、陽性検体を還元剤と界面活性剤の組合せで前処理した場合、陽性検体のカウントの低下率は陰性検体に比べて小さかった。特に、界面活性剤を所定の濃度で添加した場合（０．１～２．５重量％ ＣＨＡＰＳ、および０．１～１０重量％ Ｔｗｅｅｎ２０）、陽性と陰性のカウント差（％）は、非常に大きかった。また、還元剤と界面活性剤の組合せで陰性検体を前処理した場合、マトリックス差がより１００％に近づき、マトリックス効果をさらに低減された。このことは、還元剤と界面活性剤の組合せによる検体の前処理が可溶性ＧＰＣ３の測定における陽性検体と陰性検体との判別精度を向上できること、および検体のマトリックス効果を低減できることを示す。したがって、還元剤と界面活性剤の組合せによる検体の前処理は、可溶性ＧＰＣ３の測定に有用であることが確認された。

Claims (15)

1. 可溶性ＧＰＣ３含有検体を還元剤と混合することを含む、可溶性ＧＰＣ３のイムノアッセイにおける可溶性ＧＰＣ３含有検体の処理方法であって、
   イムノアッセイが、可溶性ＧＰＣ３中の異なる２種以上のエピトープに対する異なる２種以上の抗体を用いるサンドイッチイムノアッセイである、方法。
2. 還元剤が、０．０５～１，０００ｍＭの終濃度で用いられる、請求項１記載の方法。
3. 可溶性ＧＰＣ３含有検体を界面活性剤とさらに混合することを含む、請求項１または２記載の方法。
4. 界面活性剤が、０．００５～１０重量％の終濃度で用いられる、請求項３記載の方法。
5. 界面活性剤が、非イオン性界面活性剤、もしくは両イオン性界面活性剤、またはそれらの塩である、請求項３または４記載の方法。
6. 可溶性ＧＰＣ３含有検体が血液検体である、請求項１～５のいずれか一項記載の方法。
7. 可溶性ＧＰＣ３含有検体が、癌に罹患している被験体から得られる、請求項１～６のいずれか一項記載の方法。
8. 癌が肝臓癌である、請求項７記載の方法。
9. 下記（ａ）および（ｂ）を含む、可溶性ＧＰＣ３のイムノアッセイ方法：
   （ａ）可溶性ＧＰＣ３含有検体を還元剤と混合すること；および
   （ｂ）（ａ）で得られた混合液中の可溶性ＧＰＣ３量を、可溶性ＧＰＣ３中の異なる２種以上のエピトープに対する異なる２種以上の抗体を用いてサンドイッチイムノアッセイにより測定すること。
10. 可溶性ＧＰＣ３含有検体を界面活性剤とさらに混合することを含む、請求項９記載の方法。
11. 界面活性剤は、非イオン性界面活性剤、もしくは両イオン性界面活性剤、またはそれらの塩である、請求項１０記載の方法。
12. 下記（ａ）および（ｂ）を含む、可溶性ＧＰＣ３のサンドイッチイムノアッセイ試薬：
    （ａ）還元剤；および
    （ｂ）可溶性ＧＰＣ３中の異なる２種以上のエピトープに対する異なる２種以上の抗体。
13. さらに（ｃ）界面活性剤を含む、請求項１２記載のサンドイッチイムノアッセイ試薬。
14. 界面活性剤は、非イオン性界面活性剤、もしくは両イオン性界面活性剤、またはそれらの塩である、請求項１３記載のサンドイッチイムノアッセイ試薬。
15. 前記試薬が癌の診断用である、請求項１２～１４のいずれか一項記載のサンドイッチイムノアッセイ試薬。