JP7842230B2

JP7842230B2 - 病変標識のための近赤外線蛍光染料搭載高分子微粒子およびその製剤

Info

Publication number: JP7842230B2
Application number: JP2024546230A
Authority: JP
Inventors: ドゥチョイ，ヨン; ジンキム，ヒュン
Original assignee: ナショナルキャンサーセンター
Priority date: 2022-02-04
Filing date: 2023-01-27
Publication date: 2026-04-07
Anticipated expiration: 2043-01-27
Also published as: AU2023216619A1; CA3243661A1; CN118647411A; JP2025506421A; US20240390526A1; EP4473979A1; WO2023149695A1; KR102552104B1

Description

本発明は、近赤外線蛍光染料を搭載した微粒子およびその製剤に関するものであり、具体的には、近赤外線蛍光染料を搭載した微粒子を癌のような病変部位に注入することにより、手術時に病変部位の位置を蛍光画像から正確に特定して精密手術を可能にすることができる微粒子およびその製剤に関するものである。

蛍光画像技術は、磁気共鳴画像、核医学画像、超音波画像と比較して高い敏感度を有しながらもリアルタイムで画像取得が可能であるという大きな利点があるため、手術中に癌などの病変の位置をリアルタイムで確認して除去することができる最も強力な道具として評価される。さらに、近年、内視鏡および腹腔鏡装置に近赤外線蛍光画像化機能を具現することができるシステムが徐々に商業化されるにつれて、蛍光画像を用いた手術は今後患者手術において幅広く使用されると予測される。

腹腔鏡手術（Laparoscopic surgery）は、患者の生体に及ぼす傷害や影響を減らす「最小侵襲手術」方法の一つとして、腹部や胸部を切開する代わりに、0.5～1.5cmのサイズの小さな穴を開けて特殊カメラが装着された内視鏡（腹腔鏡）を入れて腹腔内を見ながら手術道具（鉗子、電気メス、止血縫合器具など）で手術する方式である。腹腔鏡手術は開腹術に比べて手術後の痛みが少なく、切開部位が少ないために見られる速い回復速度、入院期間の短縮などの利点から過去数十年間で発展してきた。近年、このような腹腔鏡手術を応用したロボット手術などが導入されるにつれ、腹腔鏡手術は外科技術の基本として受け入れられている。大腸がん、胃がんなどの手術的治療のためには、腹腔鏡手術を通じて体内がん発生部位を切開して除去する前に、胃腸または大腸の内部に内視鏡を投入し、施術部位、例えばがん発生部位を肉眼で確認する過程が必要である。しかし、従来の施術法では内視鏡を介して得られる視野角度及び範囲と、腹腔鏡を介して得られる視野角度及び範囲が完全に異なるため、切開すべき目標位置を正確に見つけることが困難であり、したがって施術者の熟練度に応じて切開の精度及び切開範囲に差が出るしかなく、切開する範囲も大きくなるしかない。したがって、手術で除去する部位を標識するために、内視鏡を用いて確認された病変に内視鏡用注入針を使用してインディアンインクなどの薬剤を注入し、病変部位を表示した後、インディアンインクで標識された部位を手術時に腹腔鏡を通して肉眼で確認しながら手術を進行する方法が使われている。しかしながら、このような標識法は、筋肉層に誤って注入されたインクによって合併症が生じることもあり、注入した部位でインクまたは染料が周囲に滲むことにより手術で除去される部位が広がる欠点がある。したがって、腹腔鏡手術中に正常組織が除去される部位を最小限に抑えるためには、適切な疾患病変位置を示す「マーキング用」または「マーカー用」造影剤が必要である。

近年、近赤外線蛍光染料を病変の標識に利用しようとする試みが行われている。近赤外線蛍光染料を用いる蛍光画像技術は、深部組織に位置する標識部位も蛍光画像から検出できるだけでなく、少量の蛍光染料を使っても敏感に蛍光信号を検知できるという利点がある。蛍光画像技術は、磁気共鳴画像、核医学画像、超音波画像と比較して高い敏感度を有しながらもリアルタイムで画像取得が可能であるという大きな利点があるため、手術中に癌などの病変の位置をリアルタイムで確認して除去できる最も強力な道具として評価される。従来に試みられている蛍光画像造影剤としては、アメリカ食品医薬品局（FDA）で臨床使用許可を受けた近赤外線蛍光染料であるインドシアニングリーンが血管画像などに用いられてきたが、臨床に適用するには様々な制限点が存在する。インドシアニングリーンは、濃度依存的な凝集（aggregation）現象により蛍光輝度が低下し、水溶液上での化学的不安定性を有して分解しやすい。また、注入部位から周囲組織に急速に広がったり吸収されたりするため、注入した部位より広い範囲で蛍光信号を発生したり、注入後の早い時間内に蛍光信号が弱くなるという欠点がある。このため、病変に対する標識効率を高め、近赤外線蛍光染料の蛍光信号が標識された部位で滲みなく長く高く維持される方法の開発が求められている。

Long Wangらは、センチネルリンパ節を超音波画像と蛍光画像を活用した検出のために、インドシアニングリーン染料を搭載したマイクロバブルを製造した。生分解性高分子であるポリ（Ｄ，Ｌ-ラクチド-コ-グリコリド）（PLGA）で製造されたマイクロバブルは超音波画像造影効果を示し、マイクロバブル中にインドシアニングリーンを搭載することにより、マイクロバブルが注入された場所から移動してセンチネルリンパ節に蓄積されたときに、センチネルリンパ節の位置を超音波画像と近赤外線蛍光画像から確認できるようにした。しかし、前記で言及したように、インドシアニングリーンは水溶液上で互いに凝集する傾向があり不安定であるため、インドシアニングリーンを単独で使用してマイクロバブルに搭載する場合には、インドシアニングリーン分子同士の凝集現象によって蛍光信号の強度が大きく弱まり、時間の経過とともにインドシアニングリーンの分解による蛍光強度のさらなる減少が問題となる。また、マイクロバブルの場合には、製造過程中または生体内加水分解によって殻層に穴ができた場合には、搭載されたインドシアニングリーンが外部に急速に放出されながら蛍光信号の減少と、周囲組織で蛍光信号の滲み現象が現れることがある。

発明の詳細な説明

本発明は、前記のような従来技術の問題点を解決するために案出されたものであり、近赤外線蛍光染料及びヒト血清アルブミン、又は近赤外線蛍光染料及びシクロデキストリンが複合体を形成する近赤外線蛍光染料複合体を搭載した高分子微粒子を開発して本発明を完成した。近赤外線蛍光染料を搭載した微粒子は、微粒子内に搭載されている蛍光染料が強い蛍光信号を発生しながらも長期間微粒子内に留まるようにするため、微粒子が注入された病変の位置を、蛍光画像を通じて正確に、そして長期間判別するようにしてくれる。

本発明で開発された近赤外線蛍光染料が搭載された微粒子およびその製剤を用いて病変の位置を標識する場合には、標識された位置を、蛍光画像を通じて確認しながら手術で正確な病変切除が可能になり、手術時間も画期的に短縮できるようになる。また、微粒子内に搭載された近赤外線蛍光染料を、長期間画像を通じて追跡することができるので、標識された位置で起こる変化を長時間追跡することにも使用できるようになる。

技術的課題

本発明の一例示的目的は、病変標識のための近赤外線蛍光染料を搭載した高分子微粒子で、前記近赤外線蛍光染料はヒト血清アルブミンまたはシクロデキストリンと複合体を形成する、病変の標識のための高分子微粒子を提供することである。

本発明の別の例示的な目的は、前記高分子微粒子の製造方法を提供することである。

本発明のまた別の例示的な目的は、前記高分子微粒子を含む、病変の標識のための組成物を提供することである。

本発明のまた別の例示的な目的は、前記組成物を個体に注入する段階を含む、病変の標識方法を提供することである。

本発明のまた別の例示的な目的は、病変の標識のための前記組成物の用途を提供することである。

本明細書に開示された発明の技術的思想によって達成しようとする技術的課題は、以上で言及した問題点を解決するための課題に限定されず、言及されていない別の課題は、以下の記載から通常の技術者に明確に理解されるだろう。

これを具体的に説明すると次の通りである。一方、本出願で開示された各説明および実施形態は、他の各説明および実施形態にも適用することができる。言い換えれば、本出願で開示された様々な要素の全ての組み合わせが、本出願の範疇に属する。また、以下に記載される具体的な記述によって本出願の範疇が制限されるとはいえない。

前記目的を達成するための一態様として、本発明は病変標識のための近赤外線蛍光染料を搭載した高分子微粒子であって、前記近赤外線蛍光染料はヒト血清アルブミンまたはシクロデキストリンと複合体を形成する、病変の標識のための高分子微粒子を提供する。

前記病変標識とは、手術で除去する病変の位置を手術前に予め標識しておき、手術時に蛍光画像を用いて標識された位置をリアルタイムで確認することにより、正確な手術と手術時間の短縮を可能にするものである。

本発明において、前記近赤外線蛍光染料は、インドシアニングリーン、IRDye 800CW carboxylate(IRDye 800CW)、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、Alexa Fluor 780、Flamma 749、Flamma 774、Flamma 800、FSD Fluor^TM 647、FSD Fluor^TM 680、FSD Fluor^TM 750、FSD Fluor^TM 800、sulfo-cyanine 5 carboxylic acid(Cy5)、sulfo-cyanine 5.5 carboxylic acid(Cy5.5)、 sulfo-cyanine 7 carboxylic acid(Cy7)、またはsulfo-cyanine 7.5 carboxylic acid (Cy7.5)から選択されるいずれかであってもよいが、これらに限定されない。

前記近赤外線蛍光染料は、650nm以上の波長で蛍光信号を発生する染料であってもよい。

前記インドシアニングリーンは、アメリカ食品医薬品局（FDA）で臨床使用許可を受けた蛍光画像造影剤として血管画像などに使用されてきたが、臨床に適用するには様々な制限点が存在する。インドシアニングリーンは、濃度依存的な凝集（aggregation）現象により蛍光輝度が低下し、水溶液上での化学的不安定性を有するので分解しやすい。また、注入部位から周囲組織に急速に広がったり吸収されたりするため、注入した部位より広い範囲で蛍光信号を発生するか、または注入後の早い時間内に蛍光信号が弱くなるという欠点がある。このため、病変に対する標識効率を高め、近赤外線蛍光染料の蛍光信号が標識された部位で滲みなく長く高く維持される方法の開発が求められている。

インドシアニングリーンは水溶液上で互いに凝集する傾向があり、不安定であるため、インドシアニングリーンを単独で使用する場合には、インドシアニングリーン分子同士の凝集現象によって蛍光信号の強度が大きく弱まり、時間の経過とともに、インドシアニングリーンの分解による蛍光強度のさらなる減少が問題となる。

本発明による、近赤外線蛍光染料及びヒト血清アルブミン、又は近赤外線蛍光染料及びシクロデキストリンの複合体が搭載された微粒子は、微粒子内に搭載されている蛍光染料が強い蛍光信号を発生しながらも長期間にわたって微粒子内に留まるようにするため、標的部位の位置を蛍光画像で正確に、そして長期間判別するようにしてくれる。

本発明において、前記複合体を高分子微粒子内に搭載するための製造方法として、water-in-oil-in-water（Ｗ1／Ｏ／Ｗ2）エマルション方法を用いることができる。水に対する溶解度が低い近赤外線蛍光染料を単独で微粒子内に搭載する場合には、微粒子内で近赤外線蛍光染料同士の凝集（aggregation）が起こり、製造された微粒子で発生する蛍光信号の強度が非常に弱く、微粒子内での近赤外線蛍光染料の化学的／物理的安定性も低くなる欠点がある。近赤外線蛍光染料及びヒト血清アルブミン、又は近赤外線蛍光染料及びシクロデキストリンの複合体を形成してこれを微粒子内に搭載する場合には、蛍光染料単独で搭載する場合に発生する凝集現象を防ぐことができ、微粒子で発生する蛍光信号もはるかに強く、蛍光染料の化学的／物理的安定性も高まる。

本発明において、前記高分子は生分解性高分子として、ポリ（ラクチド-コ-グリコリド）（PLGA）、ポリ（ＤＬ-ラクチド-コ-グリコリド）（PDLGA）、ポリ（グリコール酸）（PGA）、ポリ（ラクチド）（PLA）、ポリ（ヒドロキシブチレート）、ポリカプロラクトン（PCＬ）、ポリジオキサノン（PDO）、ポリ（アミノ酸）、ポリアンヒドリド、ポリオルトエステル、またはポリホスファゼンであり得るが、これらに限定されない。

本発明において、前記高分子は、ポリ（エチレンオキシド）（PEG）とブロック共重合体を形成することができる。

一例として、前記高分子は、ポリD、Lラクチド-ポリエチレングリコールブロック共重合体（Poly(D,L-lactide)-block-poly(ethylene glycol)、PDLLA-PEG）とブロック共重合体を形成することである場合もある。

本発明において、前記高分子は、非生分解性高分子であるポリ（メチルメタクリレート）（PMMA）またはポリカーボネート（polycarbonate、PC）であってもよい。

本発明において、前記微粒子は、近赤外線蛍光染料及びヒト血清アルブミン、又は近赤外線蛍光染料及びシクロデキストリンの複合体と共にアルギン酸又はヒアルロン酸をさらに含むことができる。前記の複合体をアルギン酸またはヒアルロン酸ヒドロゲル内に分散させて搭載する場合には、複合体が単独で微粒子内に搭載された場合に比べて蛍光染料同士の凝集現象をよりうまく防ぐことができ、微粒子で発生する蛍光信号が著しく強くなり、蛍光染料の化学的、物理的安定性も高まる。

また、Ｗ１相に存在する近赤外線蛍光染料；近赤外線蛍光染料およびヒト血清アルブミン；または近赤外線蛍光染料およびシクロデキストリンをアルギン酸またはヒアルロン酸のような高分子を用いたヒドロゲルと混合すると、蛍光染料が微粒子から放出される速度をさらに遅くすることができる。

本発明において、前記微粒子は、微粒子内に１以上の空洞（隔離された空間）を含み、前記近赤外線蛍光染料とヒト血清アルブミン、または近赤外線蛍光染料とシクロデキストリンの複合体は、前記空洞に搭載されるものであり得る。

特に、微粒子内に複数の隔離された空間が作られ、そこに近赤外線蛍光染料が搭載されるようにすれば、微粒子の外殻が分解して穴が生じても、微粒子内の隔離された空間に搭載された蛍光染料の早い放出は起こらない。このように微粒子内に複数の隔離された空間を作り、そこに蛍光染料が搭載されるようにすれば、マイクロバブルで起こった蛍光染料の不要な放出問題を解決することができる。

本発明において、前記微粒子は界面活性剤をさらに含むことができる。

前記界面活性剤は、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、Labrafil、Labrasol、ミディアムチェーントリグリセリド（Medium chain triglyceride）、レシチン（Lecitin）、Ｎ-メチルピロリドン（N-methyl pyrrolidone）、ポリビニルピロリドン（Polyvinyl pyrrolidone）、ヒドロプロピルメチルセルロース（Hydropropyl methylcellulose）、ポロキサマー（poloxamer、例えば；ポロキサマー188（P-188）、ポロキサマー407（P-407））、またはトゥイーン（Tween、例えば；トゥイーン80（Tween-80）、トゥイーン20（Tween-20））の中から選択されるいずれであってもよい。

本発明の微粒子は、標識部位への注入のために前記界面活性剤または親水性高分子が溶解した水溶液に分散させることができる。前記親水性高分子の種類には、カルボキシメチルセルロース、ゼラチン、コラーゲン、アルギン酸、ヒアルロン酸などがある。

前記微粒子をヒドロゲル高分子と共にペレットの形態で製造し、標識しようとする部位に注射器を用いて注入する場合には、注入部位から微粒子が移動しないようにし、蛍光染料が周囲組織に放出されることもさらに抑えることができる。ヒドロゲル高分子は、ポロキサマーのような温度感受性高分子であるか、またはイオン架橋反応を引き起こすアルギン酸やヒアルロン酸、またはそれらの誘導体であり得る。

本発明において、前記微粒子は、金属または非金属材料の表面上にコーティングするためのものであり得る。

前記コーティングは、接着剤（adhesives）またはゴム剤によって行われるものであり得る。

本発明の一実施例では、前記微粒子を接着剤（adhesives）またはゴム剤と共に金属および／または非金属材料の表面にコーティングすることによって、金属および／または非金属材料を用いた病変のマーカーを製造することができる。

前記接着剤は、例えば、尿素系、メラミン系、フェノール系、不飽和ポリエステル系、エポキシ系、レゾルシノール系、酢酸ビニル系、ポリビニルアルコール系、塩化ビニル系、ポリビニルアセタール系、アクリル系、飽和ポリエステル系、ポリアミド系、またはポリエチレン系であってもよいが、これらに限定されない。

前記ゴム剤は、例えば、ブタジエンゴム系、ニトリルゴム系、ブチルゴム系、シリコーンゴム系、クロロプレンゴム系、ラテックスを含有しないゴム（latex-free rubber、NFR）、ネオプレン（Neoprene）、天然ラテックス、または合成ラテックスであってもよいが、これらに限定されない。

前記目的を達成するための別の態様として、本発明は、近赤外線蛍光染料とヒト血清アルブミン、または近赤外線蛍光染料とシクロデキストリンの複合体を形成する段階；および前記複合体を高分子微粒子内に搭載する段階を含む、病変の標識のための高分子微粒子の製造方法を提供する。

本発明において、前記複合体を高分子微粒子内に搭載するための方法として、water-in-oil-in-water（Ｗ1／Ｏ／Ｗ2）エマルション方法を用いることができる。

本発明において、前記製造方法で前記近赤外線蛍光染料をヒドロゲル高分子と混合して高分子微粒子内に搭載する段階をさらに含むことができる。

本発明において、微粒子内に搭載された近赤外線蛍光染料の蛍光信号をさらに増加させるための目的として、オイル（oil）相で高分子と界面活性剤を混合して微粒子を製造することができる。

前記目的を達成するためのまた別の態様として、本発明は、前記高分子微粒子を含む、病変の標識のための組成物を提供する。

前記蛍光染料、高分子、微粒子、および界面活性剤は前述の通りである。

本発明において、前記微粒子は、メチルセルロース、アルギン酸、ヒアルロン酸、ポリビニルアルコール、コラーゲン、ゼラチン、Tween、Poloxamer、またはポリビニルピロリドンと混合されているものであってもよい。具体的には、前記微粒子は、メチルセルロース、アルギン酸、ヒアルロン酸、ポリビニルアルコール、コラーゲン、ゼラチン、Tween、Poloxamer、またはポリビニルピロリドンが溶けている水溶液に分散している形態であってもよい。

本発明において、前記病変の標識のための組成物は、注射器を介して注入が可能になるように作製されたものであり得る。

本発明において、前記病変の標識のための組成物は、液体または固体ペレット状であり得、具体的には固体ペレット状であり得る。

前記目的を達成するためのまた別の態様として、本発明は、前記組成物を個体に注入する段階を含む、病変の標識方法を提供する。

本発明の一実施例では、前記個体は特に限定されないが、例えば、ヒト、サル、牛、馬、羊、豚、鶏、七面鳥、ウズラ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ウサギ、またはモルモットを含み、具体的には哺乳類、より具体的にはヒトであり得る。

前記目的を達成するためのまた別の態様として、本発明は、病変の標識のための前記組成物の用途を提供する。

本発明による近赤外線蛍光染料搭載微粒子は、がんのような病変の位置に注入したときに、蛍光画像を通じて病変の位置をリアルタイムで正確に判別できるようにし、病変の切除のための手術の精度を画期的に高め、手術にかかる時間を大幅に短縮することができる。近赤外線蛍光染料とヒト血清アルブミン、または近赤外線蛍光染料とシクロデキストリンの複合体を形成し、これを微粒子内に搭載するか、または近赤外線蛍光染料をヒドロゲル高分子に混合して搭載することにより、近赤外線蛍光染料単独で微粒子を製造する場合に比べて微粒子で発生する蛍光の強度が強く、微粒子内での蛍光染料の安定性を向上させ、標識された部位を長期間蛍光画像で確認できるようになる。

図１は、近赤外線蛍光染料複合体を搭載した高分子微粒子の形態および製剤のための組成を示すものである。図２は、同濃度のインドシアニングリーン（ICG）とインドシアニングリーン - ヒト血清アルブミン（ICG-HSA）複合体を水溶液に溶かして得られた蛍光スペクトル資料である。ICGがHSAと複合体を形成するときに、より高い蛍光信号を示すことがわかる。図３は、（a）ICG-PLGA（P-188なし）および（b）ICG-HSA-PLGA（P-188なし）、（c）ICG-HSA-PLGA（P-188 0.1％）微粒子の走査電子顕微鏡写真である。図４は、ICG-HSA溶液およびICG-PLGA（P-188なし）、ICG-HSA-PLGA（P-188なし）、ICG-HSA-PLGA（P-188 0.1％）微粒子分散液の蛍光信号比較のための蛍光スペクトルである。全ての試料は、ICG基準30μＭ当量（equivalent）で濃度を合わせた。ICGが単独で搭載されたICG-PLGA（P-188なし）微粒子分散液の場合、ICG-HSAに比べて蛍光信号が6.8倍低く、ICG-HSA複合体を搭載する場合、より高い蛍光信号を発生する微粒子を製造できることがわかる。図５は、（a）ICG-HSA-PLGA（P-188 0.5％）微粒子表面および（b）ICG-HSA-PLGA（P-188 0.5％）微粒子断面、（c）ICG-HSA-PLGA （P-188 1.0％）微粒子表面、（d）ICG-HSA-PLGA（P-188 1.0％）微粒子断面に対する走査電子顕微鏡写真である。図６は、ICG-HSA溶液およびICG-PLGA（P-188なし）、ICG-HSA-PLGA（P-188 0.5％）、ICG-HSA-PLGA（P-188 1.0％）微粒子分散液の蛍光信号比較のための蛍光スペクトルである。図７は、（a）ICG-HSAおよび（b）ICG-HSA-PLGA（P-188 0.5％）、（c）ICG-HSA-PLGA（P-188 1.0％）微粒子分散液の蛍光画像写真（λ_ex＝780／20 nm、λ_em＝845／40 nm）である。図８は、（a）ICG-HSAおよび（b）ICG-HSA-PLGA（P-188 0.5％）、（c）ICG-HSA-PLGA（P-188 1.0％）微粒子分散液をSKH-1 ヘアレスマウスの皮下に注入し、経時的に蛍光画像を撮影した写真（λ_ex＝780／20 nm、λ_em＝845／40 nm）である。図９は、ICG-HSAおよびICG-HSA-PLGA（P-188 0.5％）、ICG-HSA-PLGA（P-188 1.0％）微粒子分散液をSKH-1 ヘアレスマウスの皮下に注入し、経時的に注入部位での蛍光信号のROI（Region of interest）値を分析したグラフである。図１０は、ICG-HSA-Alginate-PLGA、PDLLA-PEG（P-188 0.1％）微粒子（a）表面および（b）断面の走査電子顕微鏡写真である。図１１は、ICG-HSA溶液およびICG-PLGA（P-188なし）、ICG-HSA-Alginate-PLGA、PDLLA-PEG（P-188 0.1％）微粒子分散液の蛍光信号比較のための蛍光スペクトルである。図１２は、（a）ICG-HSAおよび（b）ICG-HSA-Alginate-PLGA、PDLLA-PEG（P-188 0.1％）微粒子分散液の蛍光画像写真（λ_ex＝780／20 nm、λ_em＝845／40 nm）である。図１３は、（a）ICG-HSAおよび（b）ICG-HSA-Alginate-PLGA、PDLLA-PEG（P-188 0.1％）微粒子分散液をSKH-1 ヘアレスマウスの皮下に注入し、経時的に蛍光画像を撮影した写真（λ_ex＝780／20 nm、λ_em＝845／40 nm）である。図１４は、ICG-HSAおよびICG-HSA-Alginate-PLGA、PDLLA-PEG（P-188 0.1％）微粒子分散液をSKH-1 ヘアレスマウスの皮下に注入し、経時的に注入部位での蛍光信号のROI（Region of interest）値を分析したグラフである。図１５は、ICG-HSA-PMMA（P-188 1.0％）微粒子（a）表面および（b）断面の走査電子顕微鏡写真である。図１６は、ICG-HSA溶液およびICG-PLGA（P-188なし）、ICG-HSA-PMMA（P-188 1.0％）微粒子分散液の蛍光信号比較のための蛍光スペクトルである。図１７は、（a）ICG-HSAおよび（b）ICG-HSA-PMMA（P-188 1.0％）微粒子分散液の蛍光画像写真（λ_ex＝780／20 nm、λ_em＝845／40 nm）である。図１８は、（a）ICG-HSAおよび（b）ICG-HSA-PMMA（P-188 1.0％）微粒子分散液をSKH-1 ヘアレスマウスの皮下に注入し、経時的に蛍光画像を撮影した写真（λ_ex＝780／20 nm、λ_em＝845／40 nm）である。図１９は、ICG-HSAおよびICG-HSA-PMMA（P-188 1.0％）微粒子分散液をSKH-1 ヘアレスマウスの皮下に注入し、経時的に注入部位での蛍光信号のROI(Region of interest）値を分析したグラフである。図２０は、（a）ICG-Alginate-PLGA（P-188なし）および（b）ICG-Alginate-PLGA（P-188 0.1％）微粒子の走査電子顕微鏡写真である。図２１は、ICG-HSA溶液およびICG-PLGA（P-188なし）、ICG-Alginate-PLGA（P-188なし）、ICG-Alginate-PLGA（P-188 1.0％）微粒子分散液の蛍光信号比較のための蛍光スペクトルである。図２２は、（a）ICG-HSA-Alginate-PLGA（P-188 0.1％）微粒子表面、（b）ICG-HSA-Alginate-PLGA（P-188 0.5％）微粒子表面、（c）ICG -HSA-Alginate-PLGA （P-188 0.5％）微粒子断面の走査電子顕微鏡写真である。図２３は、ICG-HSA溶液およびICG-PLGA（P-188なし）、ICG-HSA-Alginate-PLGA（P-188 0.1％）、ICG-HSA-Alginate-PLGA（P-188 0.5％）微粒子分散液の蛍光信号比較のための蛍光スペクトルである。図２４は、（a）ICG-HSAおよび（b）ICG-HSA-Alginate-PLGA（P-188 0.1％）、（c）ICG-HSA-Alginate-PLGA（P-188 0.5％）微粒子分散液の蛍光画像写真（λ_ex＝780／20 nm、λ_em＝845／40 nm）である。図２５は、（a）ICG-HSAおよび（b）ICG-HSA-Alginate-PLGA（P-188 0.5％）微粒子分散液をSKH-1 ヘアレスマウスの皮下に注入し、経時的に蛍光画像を撮影した写真（λ_ex＝780／20 nm、λ_em＝845／40 nm）である。図２６は、ICG-HSAおよびICG-HSA-Alginate-PLGA（P-188 0.5％）微粒子分散液をSKH-1 ヘアレスマウスの皮下に注入し、経時的に注入部位での蛍光信号のROI(Region of interest) 値を分析したグラフである。図２７は、（a）ICG-HSA-Alginate-PLGA（Tween 0.5％）微粒子球表面、（b）ICG-HSA-Alginate-PLGA（Tween 0.5％）微粒子断面の走査電子顕微鏡写真である。図２８は、ICG-HSA溶液およびICG-PLGA（P-188なし）、ICG-HSA-Alginate-PLGA（Tween 0.5％）微粒子分散液の蛍光信号比較のための蛍光スペクトルである。図２９は、（a）ICG-HSAおよび（b）ICG-HSA-Alginate-PLGA（Tween 0.5％）微粒子分散液の蛍光画像写真（λ_ex＝780／20 nm、λ_em＝845／40 nm）である。図３０は、（a）ICG-HSAおよび（b）ICG-HSA-Alginate-PLGA（Tween 0.5％）微粒子分散液をSKH-1 ヘアレスマウスの皮下に注入し、経時的に蛍光画像を撮影した写真（λ_ex＝780／20 nm、λ_em＝845／40 nm）である。図３１は、ICG-HSAおよびICG-HSA-Alginate-PLGA（Tween 0.5％）微粒子分散液をSKH-1 ヘアレスマウスの皮下に注入し、経時的に注入部位での蛍光信号のROI(Region of interest）値を分析したグラフである。図３２は、（a）ICG-mCD-Alginate-PLGA（P-188 0.1％）微粒子表面、（b）ICG-mCD-Alginate-PLGA（P-188 0.1％）微粒子断面の走査電子顕微鏡写真である。図３３は、（a）ICG溶液およびICG-mCD、（b）ICG-HSA溶液およびICG-PLGA（P-188なし）、ICG-mCD-Alginate-PLGA（P-188 0.1％）微粒子分散液の蛍光信号比較のための蛍光スペクトルである。図３４は、（a）ICG-HSAおよび（b）ICG-mCD-Alginate-PLGA（P-188 0.1％）微粒子分散液の蛍光画像写真（λ_ex＝780／20 nm、λ_em＝845／40 nm）である。図３５は、（a）ICG-HSAおよび（b）ICG-mCD-Alginate-PLGA（P-188 0.1％）微粒子分散液をSKH-1 ヘアレスマウスの皮下に注入し、経時的に蛍光画像を撮影した写真（λ_ex＝780／20 nm、λ_em＝845／40 nm）である。図３６は、ICG-HSAおよびICG-mCD-Alginate-PLGA（P-188 0.5％）微粒子分散液をSKH-1 ヘアレスマウスの皮下に注入し、経時的に注入部位での蛍光信号のROI（Region of interest）値を分析したグラフである。図３７は、Cy7およびCy7-HSA溶液の濃度による蛍光信号強度比較グラフである（λ_ex＝730 nm、λ_em＝780 nm（Cy7）、λ_em＝786 nm（Cy7-HSA））。図３８は、（a）Cy7-PMMA（P-188なし）微粒子表面および（b）Cy7-PMMA（P-188なし）微粒子断面、（c）Cy7-HSA-PMMA（P-188なし）微粒子表面、（d）Cy7-HSA-PMMA（P-188なし）微粒子断面、（e）Cy7-HSA-PMMA（P-188 1.0％）微粒子表面、（f）Cy7-HSA-PMMA（P-188 1.0％）微粒子断面の走査電子顕微鏡写真である。図３９は、Cy7水溶液、Cy7-HSA水溶液、Cy7-PMMA（P-188なし）微粒子分散液、Cy7-HSA-PMMA（P-188なし）微粒子分散物、Cy7-HSA-PMMA（P-188 1.0％）微粒子分散液を同じCy7濃度（30μＭ）で準備し、これらの蛍光スペクトルを比較したグラフである（λ_ex＝730 nm）。図４０は、Cy7.5およびCy7.5-HSA溶液の濃度による蛍光信号強度比較グラフである（λ_ex＝730 nm、λ_em=810 nm(Cy7.5)、λ_em=824 nm(Cy7.5) -HSA））。図４１は、（a）Cy7.5-PMMA（P-188なし）微粒子表面および（b）Cy7.5-PMMA（P-188なし）微粒子断面、（c）Cy7.5-HSA-PMMA （P-188なし）微粒子表面、（d）Cy7.5-HSA-PMMA（P-188なし）微粒子断面、（e）Cy7.5-HSA-PMMA（P-188 1.0％）微粒子表面、（f）Cy7.5-HSA-PMMA（P-188 1.0％）微粒子断面の走査電子顕微鏡写真である。図４２は、Cy7.5水溶液およびCy7.5-HSA水溶液、Cy7.5-PMMA（P-188なし）微粒子分散液、Cy7.5-HSA-PMMA（P-188なし）微粒子分散液、Cy7.5-HSA-PMMA（P-188 1.0％）微粒子分散液を同じCy7.5濃度（30μＭ）で準備し、これらの蛍光スペクトルを比較したグラフである（λ_ex＝730 nm）。図４３は、（a）Cy7.5-PC（P-188なし）微粒子表面および（b）Cy7.5-PC（P-188なし）微粒子断面、（c）Cy7.5-HSA-PC（P-188なし）微粒子表面、（d）Cy7.5-HSA-PC（P-188なし）微粒子断面の走査電子顕微鏡写真である。図４４は、Cy7.5-PC（P-188なし）およびCy7.5-HSA-PC（P-188なし）微粒子分散液を同じCy7.5濃度で準備し、これらの蛍光スペクトルを比較したグラフである（λ_ex＝730 nm）。図４５は、Flamma774およびFlamma774-HSA溶液の濃度による蛍光信号強度比較グラフである（λ_ex＝730 nm、λ_em＝812 nm（Flamma774）、λ_em＝818 nm（Flamma774-HSA)）。図４６は、（a）Flamma774-PMMA（P-188なし）微粒子表面および（b）Flamma774-PMMA（P-188なし）微粒子断面、（c）Flamma774-HSA-PMMA（P-188なし）微粒子表面、（d）Flamma774-HSA-PMMA （P-188なし）微粒子断面、（e）Flamma774-HSA-PMMA （P-188 1.0％）微粒子表面、（f）Flamma774-HSA-PMMA （P-188 1.0％）微粒子断面の走査電子顕微鏡写真である。図４７は、Flamma774溶液、Flamma774-HSA溶液、Flamma774-PMMA（P-188なし）微粒子分散液、Flamma774-HSA-PMMA（P-188なし）微粒子分散液、Flamma774-HSA-PMMA（P-188 1.0％）微粒子分散液の蛍光信号比較のための蛍光スペクトルである。図４８は、Alexa750およびAlexa750-HSA溶液の濃度による蛍光信号強度比較グラフである（λ_ex＝730 nm、λ_em＝776 nm）。図４９は、（a）Alexa750-PMMA（P-188なし）微粒子および（b）Alexa750-HSA-PMMA（P-188なし）微粒子、（c）Alexa750-HSA-PMMA（P-188 1.0％）微粒子断面の走査電子顕微鏡写真である。図５０は、Alexa750溶液およびAlexa750-HSA溶液、Alexa750-PMMA（P-188なし）微粒子分散液、Alexa750-HSA-PMMA（P-188なし）微粒子分散液およびAlexa750-HSA-PMMA（P-188 1.0％）微粒子分散液の蛍光信号比較のための蛍光スペクトルである。図５１は、IRDye 800CWおよびIRDye 800CW-HSA溶液の濃度による蛍光信号強度比較グラフである（λ_ex＝730 nm、λ_em＝806 nm（IRDye 800CW）、λ_em＝810 nm（IRDye 800CW-HSA））。図５２は、（a）IRDye 800CW-PMMA（P-188なし）微粒子表面および（b）IRDye 800CW-PMMA（P-188なし）微粒子断面、（c）IRDye 800CW-HSA-PMMA（P-188なし）微粒子表面、（d）IRDye 800CW-HSA-PMMA（P-188なし）微粒子断面、（e）IRDye 800CW-HSA-PMMA（P-188 1.0％）微粒子表面、（f）IRDye 800CW-HSA-PMMA （P-188 1.0％）微粒子断面の走査電子顕微鏡写真である。図５３は、IRDye 800CW溶液およびIRDye 800CW-HSA溶液、IRDye 800CW-PMMA（P-188なし）微粒子分散液、IRDye 800CW-HSA-PMMA（P-188なし）微粒子分散物およびIRDye 800CW-HSA-PMMA（P-188 1.0％）微粒子分散液の蛍光信号比較のための蛍光スペクトルである。図５４は、微粒子を界面活性剤または高分子溶液に分散させた組成物を製造するために、ICG-HSA-PLGA（P-188 0.5％）微粒子を0.5％ sodium methylcellulose/0.1％ Tween 80、1% sodium Alginate、1% sodium hyaluronate、2% sodium methylcellulose、2% poly(vinyl alcohol)、0.1％ collagen、5% gelatin、10% Tween 80、40% poloxamer 188、5% polyvinyl pyrrolidone水溶液に分散させて撮影した写真である。図５５は、ICG-HSA-PLGA（P-188 0.5％）微粒子を１％ヒアルロン酸ナトリウム（sodium hyaluronate）および５％ゼラチン（gelatin）水溶液にそれぞれ分散させて凍結乾燥することにより、微粒子を含む円筒状ペレットを製造した写真である。図５６は、微粒子を界面活性剤または高分子溶液に分散させた組成物を製造するために、ICG-HSA-PMMA（P-188 1.0％）微粒子を0.5％メチルセルロースナトリウム（sodium methylcellulose）／0.1％トゥイーン 80、1% アルギン酸ナトリウム（sodium Alginate）、1% ヒアルロン酸ナトリウム（sodium hyaluronate）、2% メチルセルロースナトリウム（sodium methylcellulose）、2% ポリビニルアルコール（poly(vinylalcohol)）、0.1％コラーゲン（collagen）、5% ゼラチン（gelatin）、10% トゥイーン 80、40% ポロキサマー-188（P-188）、5% ポリビニルピロリドン（polyvinyl pyrrolidone）水溶液に分散させて撮影した写真である。図５７は、ICG-HSA-PMMA（P-188 1.0％）微粒子を1% アルギン酸ナトリウム（sodium Alginate）、1% ヒアルロン酸ナトリウム（sodium hyaluronate）、2% メチルセルロースナトリウム（sodium methylcellulose）、2% ポリビニルアルコール（poly(vinylalcohol)）、5% ゼラチン（gelatin）、40% ポロキサマー-188、５％ポリビニルピロリドン水溶液に分散させて凍結乾燥することにより、微粒子を含む円筒状ペレットを製造した写真である。図５８は、IRDye 800CW-HSA-PMMA（P-188なし）微粒子をラテックス溶液に分散させた後、金属クリップの表面にコーティングし乾燥して製造した、蛍光微粒子がコーティングされた金属クリップの写真である。図５９は、IRDye 800CW-HSA-PMMA（P-188なし）微粒子がコーティングされた金属クリップに対する近赤外線蛍光画像（λ_ex＝780／20 nm、λ_em＝845／40 nm）である。

以下、本発明を以下の実施例を通じてより詳細に説明する。しかしながら、これらの実施例は本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例のみに限定されるものではない。

実施例１：インドシアニングリーン溶液とインドシアニングリーン／ヒト血清アルブミン複合体の蛍光信号の比較

近赤外線蛍光染料であるインドシアニングリーン（Indocyanine green(ジアグノグリーン株)、ICG、第一薬品（株））0.5 mgを蒸留水1mLに溶解した後、蒸留水で希釈して30μM濃度のインドシアニングリーン溶液を製造した。インドシアニングリーン溶液と蛍光信号を比較するためのインドシアニングリーン/ヒト血清アルブミン（Human serum albumin、HSA、SKプラズマ）複合体は、0.5 mgのインドシアニングリーン粉末を0.214 mLのヒト血清アルブミン溶液（20％濃度）と0.786 mLの蒸留水混合溶液に溶解した後、蒸留水で希釈して30μＭ濃度のインドシアニングリーン／ヒト血清アルブミン複合体（ICG-HSA）を製造した。蛍光スペクトル比較のために、前記製造した溶液をそれぞれ200 μLずつ分取して96ウェルプレートに入れ、多機能マイクロプレートリーダー（SPARK、Tecan Trading AG、Zurich、Switzerland）を用いて蛍光スペクトル（λ_ex＝730 nm）を測定した。

同濃度のインドシアニングリーン溶液とインドシアニングリーン／ヒト血清アルブミン複合体溶液の蛍光スペクトル測定結果、図２と同様に、インドシアニングリーン／ヒト血清アルブミン複合体がインドシアニングリーンよりも1.5倍高い蛍光信号を発生したことが確認できた。

実施例２：ICGまたはICG-HSAを搭載したPLGA微粒子の製造および分析
２-１.ICG搭載のPLGA微粒子製造
近赤外線蛍光染料であるインドシアニングリーンが単独で搭載されたPLGA微粒子であるICG-PLGA（P-188なし）をWater-in-oil-in-water（Ｗ1／Ｏ／Ｗ2）エマルション方法により製造した。

具体的には、インドシアニングリーン（Indocyanine green、ICG、Selleck chem）0.75 mgを1.5 mLの蒸留水に加えて溶解し、Ｗ１溶液を製造した。ポリビニルアルコール（Poly(vinylalcohol)、PVA、シグマアルドリッチ）3.6 ｇを180 mLの蒸留水に添加した後、85 ℃条件で600 rpmで撹拌しながら溶解し、常温まで冷却してＷ２溶液を製造した。ポリ-D,L-ラクチド-ポリグリコリド共重合体（Poly(D,L-lactide-co-glycolid)、PLGA、； MW 192,000-240,000 Da、Evonik）1.08 gを塩化メチレン（Dichloromethane、DCM、シグマアルドリッチ）15 mLに加えて溶解し、オイル溶液を製造した。前記製造されたＷ１溶液をオイル溶液に添加した後、40秒間水槽型超音波装置で超音波処理を行い、一次エマルション（water-in-oil）を製造した。前記製造された一次エマルションは、準備されたＷ２溶液を、機械式撹拌機を用いて1000 rpmで撹拌しながら添加して二次エマルション（water-in-oil-in-water）を製造した。前記製造されたエマルションを10分間1000 rpmで撹拌した後、40℃の温度条件で磁気撹拌機を用いて280 rpmで21時間撹拌して塩化メチレン溶媒を除去した。その後、14,000 rpmで５分間遠心分離して、インドシアニングリーンを搭載したPLGA高分子微粒子の粒子を収得した。上澄み液を除去し、蒸留水を添加して再分散後遠心分離する過程を３回繰り返して微粒子を洗浄した。洗浄した微粒子の粒子は液体窒素を用いて急冷後凍結乾燥して微粒子粉末を収得した。

２-２．ICG-HSAを搭載したPLGA微粒子の製造
インドシアニングリーン/ヒト血清アルブミン複合体を搭載したPLGA微粒子（ICG-HSA-PLGA（P-188なし））製造のため、インドシアニングリーン（ジアグノグリーン株、第一薬品）0.75 mgをヒト血清アルブミン（Human serum albumin、HSA、SKプラズマ）0.322 mL（20％濃度、64.335 mg）と蒸留水1.178 mL混合溶液に溶解してW1溶液を製造した。ポリビニルアルコール3.6ｇを180 mLの蒸留水に添加した後、85 ℃の条件で600 rpmで撹拌しながら溶解し、常温まで冷却してＷ２溶液を製造した。PLGA1.08ｇを塩化メチレン15 mLに加えて溶解し、オイル溶液を製造した。前記製造されたＷ１溶液をオイル溶液に添加後、40秒間水槽型超音波装置で超音波処理を行い、一次エマルション（water-in-oil）を製造した。前記製造されて準備されたＷ２溶液を機械式撹拌機を用いて1000 rpmで撹拌しながら一次Ｗ／Ｏエマルションを添加して二次エマルション（water-in-oil-in-water）を製造した。前記製造されたエマルションを10分間1000 rpmで撹拌した後、40℃の温度条件で磁気撹拌機を用いて280 rpmで21時間撹拌して塩化メチレン溶媒を除去した。その後、14,000 rpmで５分間遠心分離して、インドシアニングリーンを搭載したPLGA高分子微粒子の粒子を収得した。上澄み液を除去し、蒸留水を添加して再分散後遠心分離する過程を３回繰り返して微粒子を洗浄した。洗浄した微粒子の粒子は液体窒素を用いて急冷後凍結乾燥して微粒子粉末を収得した。

２-３．界面活性剤（ポロキサマー）を含むICG-HSA搭載のPLGA微粒子の製造
有機溶媒相にPLGA等の高分子と共に界面活性剤を追加混合したときの効果を見るために、界面活性剤がPLGAに添加された微粒子を製造した。界面活性剤であるポロキサマー-188（Poloxamer 188、P-188、BASF）を0.1％（oil相）含むICG-HSA搭載のPLGA微粒子（ICG-HSA-PLGA（P-188 0.1％））製造のため、インドシアニングリーン（ジアグノグリーン株、第一薬品）0.75 mgをヒト血清アルブミン（Human serum albumin、HSA、ＳＫプラズマ）0.322 mL（20％濃度、64.335 mg）と蒸留水1.178 mLの混合溶液に溶解してＷ１溶液を製造した。ポリビニルアルコール（polyvinyl alcohol）3.6ｇを180 mL蒸留水に添加した後、85℃の条件で600 rpmで撹拌しながら溶解し、常温まで冷却してＷ２溶液を製造した。PLGA1.08ｇとポロキサマー-188（Poloxamer-188、P-188、BASF）16.5 mgを塩化メチレン15 mLに加えて溶解し、オイル溶液を製造した。前記製造されたＷ１溶液をオイル溶液に添加後、40秒間水槽型超音波装置で超音波処理を行い、一次エマルション（water-in-oil）を製造した。前記で製造された一次エマルションは、準備されたＷ２溶液を、機械式撹拌機を用いて1000 rpmで撹拌しながら添加して二次エマルション（water-in-oil-in-water）を製造した。前記製造されたエマルションを10分間1000 rpmで撹拌した後、40℃の温度条件で磁気撹拌機を用いて280 rpmで21時間撹拌して塩化メチレン溶媒を除去した。その後、14,000 rpmで５分間遠心分離して、インドシアニングリーンを搭載したPLGA高分子微粒子の粒子を収得した。上澄み液を除去し、蒸留水を添加して再分散後遠心分離する過程を３回繰り返して微粒子を洗浄した。洗浄した微粒子の粒子は液体窒素を用いて急冷後凍結乾燥して微粒子粉末を収得した。

２-４．微粒子内のインドシアニングリーン含量及び蛍光強度の分析
前記製造した微粒子内のインドシアニングリーンの含量及び搭載率評価のため、微粒子溶解溶液中のインドシアニングリーンの濃度を紫外／可視光線吸光分析器を用いて定量した。インドシアニングリーン0.5 mgをヒト血清アルブミン0.214 mL（20％濃度、42.89 mg）と蒸留水0.786 mLの混合溶液に溶解し、高濃度のインドシアニングリーン／ヒト血清アルブミン複合体溶液を準備した。前記高濃度の複合体溶液を蒸留水で希釈して、0.065～6.54 μＭの間の13種類の濃度の標準溶液を準備した。前記標準溶液として紫外／可視光線吸光分析器を用いて吸光度を測定し、検量線を作製した後、PLGA微粒子10 mgを１mLのジメチルスルホキシド（Dimethylsulfoxide、DMSO、Daejung Chemicals & Metals Co. Ltd.）溶媒に入れて溶解した溶液を紫外／可視光線吸光分析器を用いて吸光度を分析し、前記検量線に代入して濃度を測定した。測定された複合体の濃度を以下の式に代入して微粒子内のインドシアニングリーン含量および搭載効率を評価した。

微粒子内のインドシアニングリーンの含量＝微粒子10 mg内のインドシアニングリーンの重量／10 mg（微粒子の重量）

微粒子内のインドシアニングリーン搭載率＝（微粒子全体に搭載されたインドシアニングリーンの重量／微粒子搭載に使用されたインドシアニングリーンの重量）×100％

前記合成された微粒子の粒子形態およびサイズ分析のために、走査電子顕微鏡（JSM-7800F Prime、JEOL Ltd、Japan）分析を行った。微粒子粉末を走査電子顕微鏡サンプルホルダー上に付着したカーボンテープに貼り付けた後、60秒間スパッタリングを介して Pt／Pdを表面上にコーティングした後、走査電子顕微鏡写真を5 kV加速電圧で分析した。粒子径は得られた写真でランダムに100 個の粒子径を測定して平均値で求めた。

前記製造した微粒子とインドシアニングリーン／ヒト血清アルブミン複合体との蛍光信号比較のために、同濃度のインドシアニングリーンの複合体溶液と微粒子分散液を製造した。インドシアニングリーン粉末0.5 mgを0.214 mLのヒト血清アルブミン溶液（20％濃度）と0.786 mLの蒸留水の混合溶液に溶解した後、蒸留水で希釈して30 μＭ濃度のインドシアニングリーン／ヒト血清アルブミン複合体（ICG- HSA）を製造した。前記定量で評価されたPLGA微粒子内のインドシアニングリーンの含量を情報を用いて、インドシアニングリーンの濃度が30μＭとなるように0.3 mLの蒸留水に添加して分散液を製造した。蛍光スペクトル比較のために、前記製造した溶液と分散液をそれぞれ200μＬずつ分取して96ウェルプレートに入れ、多機能マイクロプレートリーダー（SPARK、Tecan Trading AG、Zurich、Switzerland）を用いて蛍光スペクトル（λ_ex＝730 nm）を測定した。

微粒子内のインドシアニングリーンの定量結果 ICG-PLGA（P-188なし）微粒子内のインドシアニングリーンの搭載率は3.99%で、1mgの微粒子内に43.6 ngが搭載されていることを確認した。ICG-HSA-PLGA（P-188なし）微粒子の場合、搭載率が8.39％で、1 mgの微粒子内のインドシアニングリーンの含量が93.6 ngであることを確認した。ICG-HSA-PLGA合成時の一次エマルション相基準0.1％ポロキサマー-188含有条件で製造したICG-HSA-PLGA（P-188 0.1％）の場合、ICG-HSA-PLGA（P-188なし）に比べてインドシアニングリーンの搭載率は5.26％で、１ mg微粒子内のインドシアニングリーン含量が59.7 ngに減少したことを確認した。これは、親水性官能基と疎水性官能基の両方を有するポロキサマー-188が、PLGAに均等に分布し、親水性を有するインドシアニングリーン/ヒト血清複合体をPLGA上に均等に分布させると同時に、水が通過する通路は形成して合成過程中に蛍光染料が一部溶出されるためと判断される。

走査電子顕微鏡写真により確認した前記３つの微粒子の粒子形態は球形を呈していることを確認し（図３、（a）ICG-PLGA、（b）ICG-HSA-PLGA、（c）ICG-HSA -PLGA（P-188 0.1％））、平均粒子のサイズは、ICG-PLGA(witout P-188)、ICG-HSA-PLGA（P-188なし）、ICG-HSA-PLGA（P-188 0.1％）順に67.5±24.6μｍ、85.4±28.7μｍ、77.5±20.2μｍで、全てマクロファージ作用を回避可能な粒子20μｍ以上であることを確認した。

蛍光スペクトル（図4）から分かるように、ICGが単独で搭載されたICG-PLGA（P-188なし）微粒子分散液の場合、ICG-HSAに比べて蛍光信号が6.8倍低いことが確認できた。これは、インドシアニングリーンがPLGAに搭載されるとき、蛍光染料の凝集を防止できず、信号減少効果が現れると判断される。ICG-HSA-PLGA（P-188なし）およびICG-HSA-PLGA（P-188 0.1％）微粒子分散液の場合も、ICG-HSAに比べて2.8倍以下で蛍光信号が減少したが、ICG-PLGA（P-188なし）に比べて2.4倍で蛍光信号がより高いことを確認した。これにより、ICGのみをPLGAに搭載することよりもICG-HSA形態でPLGAに搭載する場合、より高い蛍光信号を有する手術用マーカー微粒子を得ることができることを確認した。これは、HSAがICGの凝集を防止して蛍光信号の減少を一部防止できるからである。ポロキサマー-188が0.1％含まれるように製造した微粒子の場合、ポロキサマー-188なしでICG-HSAが搭載されたPLGA微粒子と同様の蛍光強度を示し、ICG-PLGA微粒子に比べてより高い蛍光信号を示した。

実施例３：ポロキサマー-188 濃度別ICG-HSA-PLGA微粒子の製造及び蛍光強度分析
３-１．微粒子の製造および実験方法
本実施例では、ポロキサマー-188の濃度を高めて微粒子を製造し、微粒子の蛍光強度に与える影響を観察した。一次エマルション相基準ポロキサマー-188（Poloxamer 188、P-188、BASF）を0.5％（oil相）含むICG-HSA搭載PLGA微粒子（ICG-HSA-PLGA（P-188 0.5％））の製造のために、インドシアニングリーン0.75 mgをヒト血清アルブミン0.322 mL（20％濃度、64.335 mg）と蒸留水1.178 mLの混合溶液に溶解してＷ１溶液を製造した。ポリビニルアルコール3.6ｇを180 mLの蒸留水に添加した後、85 ℃の条件で600 rpmで撹拌しながら溶解し、常温まで冷却してＷ２溶液を製造した。PLGA1.08ｇとポロキサマー-188 82.5 mgを塩化メチレン15 mLに加えて溶解し、オイル溶液を製造した。前記製造されたＷ１溶液をオイル溶液に添加した後、40秒間水槽型超音波装置で超音波処理を行い、一次エマルション（water-in-oil）を製造した。前記製造された一次エマルションは、準備されたＷ２溶液を、機械式撹拌機を用いて1000 rpmで撹拌しながら添加して二次エマルション（water-in-oil-in-water）を製造した。前記製造されたエマルションを10分間1000 rpmで撹拌した後、40 ℃の温度条件で磁気撹拌機を用いて280 rpmで21時間撹拌して塩化メチレン溶媒を除去した。その後、14,000 rpmで５分間遠心分離してインドシアニングリーンを搭載したPLGA高分子微粒子の粒子を収得した。上澄み液を除去し、蒸留水を添加して再分散後遠心分離する過程を３回繰り返して微粒子を洗浄した。洗浄した微粒子の粒子は液体窒素を用いて急冷後凍結乾燥して微粒子粉末を収得した。

一次エマルション相基準ポロキサマー-188を1.0％(oil相)含むICG-HSA搭載PLGA微粒子（ICG-HSA-PLGA（P-188 1.0％））の製造のため、インドシアニングリーン0.75 mgをヒト血清アルブミン0.322 mL（20％濃度、64.335 mg）と蒸留水1.178 mLの混合溶液に溶解してＷ１溶液を製造した。ポリビニルアルコール3.6ｇを180 mL蒸留水に添加した後、85 ℃の条件で、600rpmで撹拌しながら溶解し、常温まで冷却してＷ２溶液を製造した。PLGA1.08ｇとポロキサマー-188 165 mgを塩化メチレン15 mLに加えて溶解し、オイル溶液を製造した。前記製造されたＷ１溶液をオイル溶液に添加後、40秒間水槽型超音波装置で超音波処理を行い、一次エマルション（water-in-oil）を製造した。前記製造された一次エマルションは、準備されたＷ２溶液を、機械式撹拌機を用いて1000 rpmで撹拌しながら添加して二次エマルション（water-in-oil-in-water）を製造した。前記製造されたエマルションを10分間1000 rpmで撹拌した後、40℃の温度条件で磁気撹拌機を用いて280 rpmで21時間撹拌して塩化メチレン溶媒を除去した。その後、14,000 rpmで５分間遠心分離してインドシアニングリーンを搭載したPLGA高分子微粒子の粒子を収得した。上澄み液を除去し、蒸留水を添加して再分散後遠心分離する過程を３回繰り返して微粒子を洗浄した。洗浄した微粒子の粒子は液体窒素を用いて急冷後凍結乾燥して微粒子粉末を収得した。

前記製造した微粒子内のインドシアニングリーンの含量及び搭載率評価のため、微粒子溶解溶液中のインドシアニングリーンの濃度を紫外／可視光線吸光分析器を用いて定量した。インドシアニングリーン0.5 mgをヒト血清アルブミン0.214 mL（20％濃度、42.89mg）と蒸留水0.786 mLの混合溶液に溶解し、高濃度のインドシアニングリーン／ヒト血清アルブミン複合体溶液を準備した。前記高濃度の複合体溶液を蒸留水で希釈して、0.065～6.54μＭの間の13種類の濃度の標準溶液を準備した。前記標準溶液で紫外／可視光線吸光分析器を用いて吸光度を測定し、検量線を作った後、PLGA微粒子10 mgを1 mLのジメチルスルホキシド溶媒に入れて溶解した溶液を紫外／可視光線吸光分析器を用いて吸光度を分析し、前記検量線に代入して濃度を測定した。測定された複合体の濃度を以下の式に代入して微粒子内のインドシアニングリーン含量および搭載効率を評価した。

前記合成された微粒子の粒子形態およびサイズ分析のために、走査電子顕微鏡分析を行った。製造した微粒子の断面分析のために、剃刀刃で微粒子粉末を粉砕した。微粒子表面及び断面測定用微粒子粉末を走査電子顕微鏡サンプルホルダー上に付着したカーボンテープに貼り付けた後、60秒間スパッタリングによりPt／Pdを表面上にコーティングした後、走査電子顕微鏡写真を５kV加速電圧で分析した。粒子径は得られた写真でランダムに100 個の粒子径を測定して平均値で求めた。

前記製造した微粒子とインドシアニングリーン／ヒト血清アルブミン複合体との蛍光信号比較のために、同濃度のインドシアニングリーンの複合体溶液と微粒子分散液を製造した。インドシアニングリーン粉末0.5 mgを0.214 mLのヒト血清アルブミン溶液（20％濃度）と0.786 mLの蒸留水の混合溶液に溶解した後、蒸留水で希釈して30μＭ濃度のインドシアニングリーン／ヒト血清アルブミン複合体（ICG- HSA）0.3 mLを製造した。前記定量で評価されたPLGA微粒子内のインドシアニングリーンの含量を、情報を用いてインドシアニングリーンの濃度が30μＭとなるように0.3 mL蒸留水に添加して分散液を製造した。蛍光スペクトル比較のために、前記製造した溶液と分散液をそれぞれ200μＬずつ分取して96ウェルプレートに入れ、多機能マイクロプレートリーダーを用いて蛍光スペクトル（λ_ex＝730 nm）を測定した。蛍光画像は、同じ溶液300μＬをマイクロチューブに入れた後、蛍光画像装置（IVIS Lumina XR、Xenogen Corporation-Caliper、CA、USA）を用いて分析（λ_ex＝780／20 nm、λ_em＝845／40 nm）した。

動物モデルで手術用マーカー微粒子の蛍光持続性評価のために、0.5 ％カルボキシメチルセルロース（Sodium carboxymethyl cellulose、シグマアルドリッチ）および0.1 ％トゥイ―ン（Tween 80、シグマアルドリッチ）を含む注射用生理食塩水を用いて製造した30μM ICG濃度のICG-HSA溶液と微粒子分散液100μLを1 mL注射器（21Gニードル）を用いてSKH-1 ヘアレスマウス（オリエントバイオ社）皮下に注入した後、経時的な蛍光信号を蛍光画像装置（IVIS Lumina XR）を用いて撮影（λ_ex＝780／20 nm、λ_em＝845／40 nm）した。

３-２．インドシアニングリーン搭載率および蛍光強度比較分析
ICG-HSA-PLGA微粒子製造時の一次エマルション相基準ポロキサマー-188の濃度を0.5％に増加して製造したICG-HSA-PLGA（P-188 0.5％）微粒子内のICGの搭載率は13.8%であり、１mgの微粒子内のインドシアニングリーンの含量が124.2 ngで、ICG-HSA-PLGA（P-188 0.1％）に比べてインドシアニングリーンの搭載率と含量が増加したことが確認できた。ICG-HSA-PLGA微粒子製造時の一次エマルション相基準ポロキサマー-188の濃度を1.0％に増加して製造したICG-HSA-PLGA（P-188 1.0％）微粒子内のICGの搭載率は8.71%であり、1 mgの微粒子内のインドシアニングリーンの含量が72.7 ngで、ICG-HSA-PLGA（P-188 0.1％）よりもインドシアニングリーンの搭載率と含量が増加することを確認した。

ICG-HSA-PLGA（P-188 0.5％）とICG-HSA-PLGA（P-188 1.0％）微粒子の走査電子顕微鏡の写真測定結果、２つの微粒子はそれぞれ59.8±19.6μmと68.0±27.6 μm平均粒子径を有する球状を呈しており（図５、（a、b：ICG-HSA-PLGA（P-188 0.5％）、c、d：ICG-HSA-PLGA（P-188 1.0％））、２つの微粒子とも走査電子顕微鏡断面を評価した結果、PLGA微粒子内部に複数の小さな球状空間を有することが確認できた。PLGAマイクロバブル（microbubble）の場合には、表面の厚さが薄く、表面が分解して穴が開いた場合、マイクロバブル内部に搭載された染料が急速に溶出する欠点があるのに対し、本発明で製造された微粒子の場合のように染料が搭載された複数の球状空間が互いに隔離されている場合には、微粒子の表面が一部分解して穴が開いても搭載された蛍光染料の溶出を防止することができ、標識部位で長期間蛍光染料が高い濃度で微粒子内に維持できるようにする利点がある。

図６のICG-HSA-PLGA（P-188 0.5％）およびICG-HSA-PLGA（P-188 1.0％）分散液の蛍光スペクトルで、ICG-HSAに比べてそれぞれ2.1 倍と3.6 倍、ICG-PLGA （P-188なし）に比べて14 倍と25 倍の高い蛍光信号が確認できた。この結果により、一次エマルション相基準0.5 ％以上のポロキサマー-188を含んで微粒子を製造する場合、非常に高い蛍光信号が得られることが分かる。

微粒子分散液を蛍光画像装置で撮影した場合でも（図７、a：ICG-HSA、b：ICG-HSA-PLGA（P-188 0.5％）、c：ICG-HSA-PLGA（P-188 1.0％））ICG-HSA-PLGA（P-188 0.5％）とICG-HSA-PLGA（P-188 1.0％）微粒子で強い蛍光信号が発生することを確認した。

図８は、ICG-HSA溶液とICG-HSA-PLGA（P-188 0.5％）、ICG-HSA-PLGA（P-188 1.0％）微粒子分散液をSKH-1 ヘアレスマウスの皮下に注入し、経時的な蛍光画像（λ_ex＝780／20 nm、λ_em＝845／40 nm）を示したものである。ICG-HSAを注入した場合には投与部位で蛍光の滲みが激しく、投与１日後からは蛍光信号がほとんど検知されないことを確認した（図８-a）。一方、ICG-HSA-PLGA（P-188 0.5％）（図８-b）、ICG-HSA-PLGA（P-188 1.0％）（図８-c）微粒子分散液の場合、1日目までは標識された領域で発生する蛍光信号がやや減少したが、30日までに蛍光信号の滲みがなく強い蛍光信号が維持され、蛍光画像から標識部位を明確に確認することができることが分かった。

前記蛍光画像写真から分析した標識部位での蛍光信号に対するROI値を図９に示した。ICG-HSAの場合、注入後の蛍光信号が急速に減少し、１日後には6.4％レベルに蛍光が低くなり、２日後には蛍光がほとんど消えたことを確認した。

ICG-HSA-PLGA（P-188 0.5％）、ICG-HSA-PLGA（P-188 1.0％）微粒子分散液の場合には、5時間目に最も高い蛍光強度を示し、1日後それぞれ46％と65％の蛍光が残り、30日後には26％と48％の蛍光がまだ残っていることを確認した。この結果から、ICG-HSA-PLGA（P-188 0.5％）、ICG-HSA-PLGA（P-188 1.0％）微粒子の場合、標識部位で蛍光染料の滲みがなく、30日以上強い蛍光信号が維持できることを確認した。

実施例４：PLGA以外の他の高分子を用いた微粒子の製造及び分析
４-１：PLGAおよびPDLLA-PEGブロック共重合体を用いた微粒子の製造および分析
微粒子製造のために、ポリＤ、Ｌラクチド-ポリエチレングリコールブロック共重合体（Poly(D,L-lactide)-block-poly(ethylene glycol)、PDLLA-PEG、シグマアルドリッチ）が使用され、 PDLLAとPEGブロックの分子量はそれぞれ20,000および5,000 Daであるものを使用した。ICG-HSA-Alginate-PLGAおよびPDLLA-PEG（P-188 0.1％）微粒子の製造のために、まずインドシアニングリーン（ICG）0.75 mgをヒト血清アルブミン（HSA）0.322 mL（20%濃度、64.335 mg）と蒸留水0.278 mLに溶解し、アルギン酸ナトリウム（Soidum Alginate、ALG、Kimica）6 mgを0.6 mLの蒸留水に溶解した溶液を混合してＷ１溶液を製造した。ポリビニルアルコール3.6ｇを180 mLの蒸留水に添加した後、85℃の条件で600 rpmで撹拌しながら溶解し、常温まで冷却してＷ２溶液を製造した。PLGA1.08ｇとPDLLA-PEG0.12 mg、ポロキサマー-188（P-188）16.5 mgを塩化メチレン15 mLに加えて溶解し、オイル溶液を製造した。前記製造されたＷ１溶液をオイル溶液に添加後、40秒間水槽型超音波装置で超音波処理を行った。4.304 mg／mL濃度の塩化カルシウム（Calcium chloride、CaCl₂、シグマアルドリッチ）0.3 mLをさらに添加して40秒間超音波処理した結果、Ｗ１相に溶けているアルギン酸がイオン架橋を起こしてゲル化した一次エマルション（water-in- oil）を製造した。Ｗ２溶液を、機械式撹拌機を用いて1000 rpmで撹拌しながら前記製造された一次エマルションを添加して二次エマルション（water-in-oil-in-water）を製造した。前記製造されたエマルションを10分間1000 rpmで撹拌した後、40℃の温度条件で磁気撹拌機を用いて280 rpmで21時間撹拌して塩化メチレン溶媒を除去した。その後、14,000 rpmで５分間遠心分離してインドシアニングリーンを搭載したPLGA高分子微粒子の粒子を収得した。上澄み液を除去し、蒸留水を添加して再分散後遠心分離過程を３回繰り返して微粒子を洗浄した。洗浄した微粒子の粒子は凍結乾燥して、最終的に、ICG-HSA-Alginate-PLGA、PDLLA-PEG（P-188 0.1％）微粒子粉末を収得した。

前記製造した微粒子内のインドシアニングリーンの含量及び搭載率評価のため、微粒子を溶かし、溶液中のインドシアニングリーンの濃度を紫外／可視光線吸光分析器を用いて定量した。

前記合成された微粒子の粒子形態およびサイズ分析のために、走査電子顕微鏡分析を行った。製造した微粒子の断面分析のために、剃刀刃で微粒子の粒子を切断した。微粒子粉末を走査電子顕微鏡サンプルホルダー上に付着したカーボンテープに貼り付けた後、60秒間スパッタリングを介してPt／Pdを表面上にコーティングした後、走査電子顕微鏡写真を５kV加速電圧で分析した。粒子径は得られた写真でランダムに100個の粒子径を測定して平均値で求めた。

前記製造した微粒子とインドシアニングリーン／ヒト血清アルブミン複合体との蛍光信号比較のために、同濃度のインドシアニングリーンの複合体溶液と微粒子分散液を製造した。インドシアニングリーン粉末0.5 mgを0.214 mLのヒト血清アルブミン溶液（20％濃度）と0.786 mLの蒸留水の混合溶液に溶解した後、蒸留水で希釈して30μＭ濃度のインドシアニングリーン／ヒト血清アルブミン複合体（ICG- HSA）0.3 mLを製造した。前記定量で評価されたPLGA、PDLLA-PEG微粒子内のインドシアニングリーンの含量を、情報を用いてインドシアニングリーンの濃度が30μＭとなるように、0.3 mL蒸留水に添加して微粒子分散液を製造した。蛍光スペクトル比較のために、前記製造した溶液と微粒子分散液をそれぞれ200μLずつ分取して96ウェルプレートに入れ、多機能マイクロプレートリーダーを用いて蛍光スペクトル（λ_ex＝730 nm）を測定した。蛍光画像は、同じ溶液300μLをマイクロチューブに入れた後、蛍光画像装置（IVIS Lumina XR）を用いて分析（λ_ex＝780／20 nm、λ_em＝845／40 nm）した。

動物モデルから注入された微粒子の蛍光強度変化を評価するために、0.5％カルボキシメチルセルロース（Sodium carboxymethyl cellulose、シグマアルドリッチ）および0.1％トゥイ―ン（Tween 80、シグマアルドリッチ）を含む注射用生理食塩水を用いて微粒子分散液を準備し、このような分散液100μLをSKH-1 ヘアレスマウスの皮下に注入した。経時的な蛍光信号を、蛍光画像装置（IVIS Lumina XR）を用いて撮影（λ_ex＝780／20 nm、λ_em＝845／40 nm）した。

ICG-HSA-Alginate-PLGA、PDLLA-PEG（P-188 0.1％）微粒子のインドシアニングリーン搭載率は15.8%で、微粒子1 mgあたりのインドシアニングリーン含量が234.6 ngで、従来の条件よりインドシアニングリーン含量が増加したことを確認した。

ICG-HSA-Alginate-PLGA、PDLLA-PEG（P-188 0.1％）微粒子は、74.3±18.2 μmの平均粒子径を有する球状の粒子で、マクロファージの食細胞作用を回避するための適切なサイズを有していることを確認した（図１０（a））。また、粒子断面の走査電子顕微鏡写真（図１０（b））において、粒子の内部がICG-HSA-PLGA（P-188 0.5％）またはICG-HSA-PLGA（P-188 1.0％）と同様に、複数の隔離された小さな球状空間を含んでいるため、搭載された蛍光染料の溶出を防止することができ、長期間の蛍光染料標識に非常に適した形態であることを確認した。

図１１のICG-HSA-Alginate-PLGA、PDLLA-PEG（P-188 0.1％）微粒子分散液の蛍光スペクトルは、ICG-HSAに比べて2.3倍、ICG-PLGA（P-188なし）に比べて15倍の高い蛍光信号を確認することができた。

微粒子分散液の蛍光画像比較結果（図１２）、ICG-HSA-Alginate-PLGA、PDLLA-PEG（P-188 0.1％）微粒子分散液（図12-b）の蛍光信号がICG-HSA溶液（図12-a）よりもより高く示されることを再度確認した。

図１３は、ICG-HSA溶液とICG-HSA-Alginate-PLGA、PDLLA-PEG（P-188 0.1％）微粒子分散液をSKH-1 ヘアレスマウスの皮下に注入し、経時的な蛍光画像(λ_ex= 780／20 nm、λ_em＝845／40 nm）を撮影したものである。ICG-HSAの場合、5時間まで蛍光信号が見られ、1日後からは蛍光信号が見られないことを確認した（図13-ａ）。一方、ICG-HSA-Alginate-PLGA、PDLLA-PEG（P-188 0.1％）微粒子分散液（図13-ｂ）の場合、7日後に蛍光標識された領域は徐々に減少するが、30日まで蛍光信号が高く維持されることを確認した。蛍光画像写真から分析したROI値をグラフで示した結果（図１４）、ICG-HSAとは異なり、ICG-HSA-Alginate-PLGA、PDLLA-PEG（P-188 0.1％）微粒子を投与した場合は、1日後に７９％の蛍光信号と30日後に３２％の蛍光信号を維持することを確認した。これは、ICG-HSA-Alginate-PLGA、PDLLA-PEG（P-188 0.1％）微粒子を用いると、30日以上病変部位の蛍光標識が可能であることを確認した。

実施例４-２：PMMA高分子を用いた微粒子の製造及び分析
PMMA微粒子の製造のために、ポリメチルメタクリレート（Poly(methyl methacrylate)、PMMA；MW 120,000 Da、シグマアルドリッチ）高分子を用いて、ICG-HSA-PMMA（P-188 1.0％）微粒子を製造した。インドシアニングリーン（indocyanine green（ICG））0.75 mgをヒト血清アルブミン（HSA）0.322 mL（20％濃度、64.335 mg）と蒸留水1.178 mLの混合溶液に溶解してＷ１溶液を製造した。ポリビニルアルコール3.6ｇを180 mLの蒸留水に添加した後、85℃の条件で600 rpmで撹拌しながら溶解し、常温まで冷却してＷ２溶液を製造した。PMMA1.08ｇとポロキサマー-188（P-188）165 mgを塩化メチレン15 mLに加えて溶解し、オイル溶液を製造した。前記製造されたＷ１溶液をオイル溶液に添加した後、探針型超音波装置で３分間（１分超音波処理＋30秒休止繰り返し）超音波処理を行い、１次エマルション（water-in-oil）を製造した。準備されたＷ２溶液を、機械式撹拌機を用いて1000 rpmで撹拌しながら、前記製造された一次エマルション溶液を、シリンジポンプを用いて30mL／minの速度で添加して二次エマルション（water-in-oil-in-water）を製造した。前記製造されたエマルションは、10分間1000 rpmで撹拌した後、40℃の温度条件で磁気撹拌機を用いて280rpmで21時間撹拌して塩化メチレン溶媒を除去する。その後、14,000 rpmで５分間遠心分離して、インドシアニングリーンを搭載したPMMA高分子微粒子の粒子を収得した。上澄み液を除去し、蒸留水を添加して再分散後遠心分離する過程を３回繰り返してPMMA微粒子を洗浄した。洗浄した微粒子の粒子は凍結乾燥して微粒子粉末を収得した。

前記製造した微粒子とインドシアニングリーン／ヒト血清アルブミン複合体との蛍光信号比較のために、同濃度のインドシアニングリーンの複合体溶液と微粒子分散液を製造した。インドシアニングリーン粉末0.5 mgを0.214 mLのヒト血清アルブミン溶液（20％濃度）と0.786 mLの蒸留水の混合溶液に溶解した後、蒸留水で希釈して30μＭ濃度のインドシアニングリーン／ヒト血清アルブミン複合体（ICG- HSA）0.3 mLを製造した。前記定量で評価されたPMMA微粒子内のインドシアニングリーンの含量を、情報を用いてインドシアニングリーンの濃度が30μＭとなるように、0.3 mL蒸留水に添加して微粒子分散液を製造した。蛍光スペクトル比較のために、前記製造した溶液と微粒子分散液をそれぞれ200μLずつ分取して96ウェルプレートに入れ、多機能マイクロプレートリーダーを用いて蛍光スペクトル（λ_ex＝730 nm）を測定した。蛍光画像は、同じ溶液300μLをマイクロチューブに入れた後、蛍光画像装置（IVIS Lumina XR）を用いて分析（λ_ex＝780／20 nm、λ_em＝845／40 nm）した。

ICG-HSA-PMMA（P-188 1.0％）微粒子のインドシアニングリーン搭載率は44.0%で、微粒子1 mgあたりインドシアニングリーン含量が370.3 ngと高く出た。

ICG-HSA-PMMA（P-188 1.0％）微粒子は、49.0±18.7μmの平均粒子径を有する球状の粒子で、マクロファージの食細胞作用を回避するための適切なサイズを有していることを確認した（図１５（a））。また、粒子断面の走査電子顕微鏡写真（図１５（b））で粒子の内部が複数の隔離された小さな球状空間を含んでいるため、この空間に搭載された蛍光染料の溶出を防止することができ、長期間の蛍光染料標識に非常に適した形態であることを確認した。

図１６のICG-HSA-PMMA（P-188 1.0％）微粒子分散液の蛍光スペクトルは、ICG-HSAに比べて同等レベルの蛍光信号を、ICG-PLGA（P-188なし）に比べて７倍の高い蛍光信号が見えることを確認することができた。

ICG-HSA-PMMA（P-188 1.0％）微粒子分散液の蛍光画像比較結果（図１７）、ICG-HSA溶液と同様に高い蛍光信号を発生することを確認した。

図１８は、ICG-HSA溶液とICG-HSA-PMMA（P-188 1.0％）微粒子分散液をSKH-1 ヘアレスマウスの皮下に注入し、経時的な蛍光画像（λ_ex=780/20 nm、λ_em＝845／40 nm）を撮影した結果である。ICG-HSA(図１８-a)とは異なり、ICG-HSA-PMMA（P-188 1.0％）微粒子(図１８-b)を投与した場合には、蛍光染料の滲み現象がなく30日まで高い蛍光信号が維持されることを確認した。

蛍光画像写真から分析したROI値をグラフで示した結果（図１９）、ICG-HSAとは異なり、ICG-HSA-PMMA（P-188 1.0％）微粒子分散液の場合、1日後に55%の蛍光が残り、30日後も36％レベルの蛍光強度が維持されることを確認した。この結果から、ICG-HSA-PMMA（P-188 1.0％）微粒子の場合、標識された病変で30日以上の蛍光信号を維持することができる蛍光マーカーとして有用性があることを確認した。

前記実施例から、ICGを単独で搭載して微粒子を製造する場合には、非常に弱い蛍光信号を発生する微粒子が得られ、ICG-HSA複合体を用いて微粒子を製造するか、またはICG-HSAをアルギン酸高分子と混合した後、イオン架橋を介してゲル化をすると、高い蛍光信号を発生する微粒子を製造することができることが確認された。

実施例５：アルギン酸水和ゲルを用いたICG搭載PLGA微粒子の製造及び分析
本実施例では、ICGをアルギン酸と混合してＷ１溶液を作り、カルシウムを用いてアルギン酸をイオン架橋させる場合にも、ICG搭載微粒子の蛍光信号を高くすることができるかを分析した。ICGがアルギン酸水和ゲル中に含まれるPLGA微粒子（ICG-Alginate-PLGA（P-188なし））製造のために、インドシアニングリーン（ICG）0.75 mgを蒸留水0.6 mLに溶解した溶液とアルギン酸ナトリウム(Soidum Alginate)6 mgを0.6 mLの蒸留水に溶解した溶液を混合してＷ１溶液を製造した。ポリビニルアルコール3.6 ｇを180 mLの蒸留水に添加した後、85 ℃の条件で600 rpmで撹拌しながら溶解し、常温まで冷却してＷ２溶液を製造した。PLGA 1.08 ｇを塩化メチレン15 mLに加えて溶解し、オイル溶液を製造した。前記製造されたＷ１溶液をオイル溶液に添加後、40秒間水槽型超音波装置で超音波処理を行い、アルギン酸のイオン架橋を誘導するために、4.304 mg／mL濃度の塩化カルシウム（Calcium chloride、CaCl₂、シグマアルドリッチ）0.3 mLをさらに添加し、40秒間超音波処理してアルギン酸がゲル化した一次エマルション（water-in-oil）を製造した。機械式撹拌機を用いて、Ｗ２溶液を1000 rpmで撹拌しながら、ここで製造された一次エマルションを添加して二次エマルション（water-in-oil-in-water）を製造した。前記製造されたエマルションを10分間1000 rpmで撹拌した後、40℃の温度条件で磁気撹拌機を用いて280 rpmで21時間撹拌して塩化メチレン溶媒を除去した。その後、14,000 rpmで5分間遠心分離し、インドシアニングリーンを搭載したPLGA高分子微粒子であるICG-Alginate-PLGA（P-188なし）粒子を収得した。上澄み液を除去し、蒸留水を添加して再分散後遠心分離する過程を３回繰り返して微粒子を洗浄した。洗浄した微粒子の粒子は凍結乾燥して微粒子粉末を収得した。

次に、一次エマルション相基準ポロキサマー-188（P-188）を0.1％（oil相）にさらに混合したICG-Alginate-PLGA微粒子であるICG-Alginate-PLGA（P-188 0.1％）微粒子を製造した。インドシアニングリーン（ICG）0.75 mgを蒸留水0.6 mLに溶解した溶液とアルギン酸ナトリウム（Soidum Alginate）6 mgを0.6 mLの蒸留水に溶解した溶液とを混合してＷ１溶液を製造した。ポリビニルアルコール3.6ｇを180 mLの蒸留水に添加した後、85℃の条件で600 rpmで撹拌しながら溶解し、常温まで冷却してＷ２溶液を製造した。PLGA1.08ｇとポロキサマー-188（P-188）16.5 mgを塩化メチレン15 mLに加えて溶解し、オイル溶液を製造した。前記製造されたＷ１溶液をオイル溶液に添加後、40秒間水槽型超音波装置で超音波処理を行い、アルギン酸高分子のイオン架橋結合形成を誘導するために、4.304 mg／mL濃度の塩化カルシウム（Calcium chloride、CaCl₂、シグマアルドリッチ）0.3 mLをさらに添加し、40秒間超音波処理してアルギン酸がゲル化した一次エマルションを製造した。Ｗ２溶液を、機械式撹拌機を用いて1000 rpmで撹拌しながら製造された一次エマルションを添加して二次エマルション（water-in-oil-in-water）を製造した。前記製造されたエマルションを10分間1000 rpmで撹拌した後、40℃の温度条件で磁気撹拌機を用いて280 rpmで21時間撹拌して塩化メチレン溶媒を除去した。その後、14,000rpmで５分間遠心分離してインドシアニングリーンを搭載したPLGA高分子微粒子の粒子を収得した。上澄み液を除去し、蒸留水を添加して再分散後遠心分離する過程を３回繰り返して微粒子を洗浄した。洗浄した微粒子の粒子は凍結乾燥して微粒子粉末を収得した。

前記製造した微粒子内のインドシアニングリーンの含量及び搭載率評価のため、微粒子溶解溶液中のインドシアニングリーンの濃度を紫外／可視光線吸光分析器を用いて定量した。PLGA微粒子10 mgを1 mLのジメチルスルホキシド（Dimethylsulfoxide, DMSO）溶媒に入れ、溶解した溶液を紫外/可視光線吸光分析器を用いて吸光度を分析し、標準検量曲線と比較してインドシアニングリーンの濃度を測定した。

前記合成された微粒子の粒子形態およびサイズ分析のために、走査電子顕微鏡（JSM-7800F Prime）分析を行った。微粒子粉末を走査電子顕微鏡サンプルホルダー上に付着したカーボンテープに貼り付けた後、60秒間スパッタリングを介してPt／Pdを表面上にコーティングした後、走査電子顕微鏡写真を５kV加速電圧で分析した。粒子径は得られた写真でランダムに100個の粒子径を測定して平均値で求めた。

前記製造した微粒子とインドシアニングリーン／ヒト血清アルブミン複合体との蛍光信号比較のために、同濃度のインドシアニングリーンの複合体溶液と微粒子分散液を製造した。インドシアニングリーン粉末0.5 mgを0.214 mLのヒト血清アルブミン溶液（20％濃度）と0.786 mLの蒸留水混合溶液に溶解した後、蒸留水で希釈して30μＭ濃度のインドシアニングリーン／ヒト血清アルブミン複合体（ICG- HSA）0.3 mLを製造した。前記定量で評価されたPLGA微粒子内のインドシアニングリーンの含量を、情報を用いてインドシアニングリーンの濃度が30μＭとなるように、0.3 mLの蒸留水に添加して微粒子分散液を製造した。蛍光スペクトル比較のために、前記製造した溶液と微粒子分散液をそれぞれ200μLずつ分取して96ウェルプレートに入れ、多機能マイクロプレートリーダーを用いて蛍光スペクトル（λ_ex＝730 nm）を測定した。

ICG-Algiante-PLGA（P-188なし）微粒子内のインドシアニングリーンの搭載率は5.79％で、1 mgの微粒子内のインドシアニングリーンの含量は69.0 ngである。一次エマルション相基準で0.1％ポロキサマー-188を添加したICG-Algiante-PLGA（P-188 0.1％）微粒子の場合、インドシアニングリーンの搭載率は9.21%に増加し、1 mg微粒子内のインドシアニングリーン含量も84.3 ngに増加した。

図２０の走査電子顕微鏡写真において、ICG-Algiante-PLGA（P-188なし）とICG-Algiante-PLGA（P-188 0.1％）の２つの微粒子は、それぞれ84.5±33.2 μmと70.2±21.1 μmの平均粒子径を有する球状の粒子であることを確認し、これにより、マクロファージの食細胞作用を効果的に回避可能であることを確認した。

図２１のICG-Algiante-PLGA（P-188なし）とICG-Algiante-PLGA（P-188 0.1％）微粒子分散液の蛍光スペクトルは、ICG-PLGA（P-188なし）微粒子と比較するとき、ICG-Algiante-PLGA（P-188なし）微粒子は蛍光がわずかに増加し、ICG-Algiante-PLGA（P-188 0.1％）微粒子は5倍のより高い蛍光信号を確認することができた。この結果から、アルギン酸のゲル化条件にポロキサマー-188を添加した場合、高い蛍光信号を示す微粒子を製造することができることがわかった。

実施例６：ICG-HSAをアルギン酸水和ゲルに混合したPLGA微粒子の製造および分析
ICG-HSA複合体がアルギン酸高分子と混合し、アルギン酸高分子をカルシウムでイオン架橋させた条件で高分子微粒子を製造して蛍光信号を分析した。

アルギン酸をICG-HSAと混合し、ポロキサマー-188（P-188）をoil相に添加したICG-HSA搭載PLGA微粒子であるICG-HSA-Alginate-PLGA（P-188 0.1％）微粒子の製造ために、インドシアニングリーン（ICG）75 mgをヒト血清アルブミン（HSA）0.322 mL（20％濃度、64.335 mg）と蒸留水0.278 mLを混合した溶液を準備し、ここにアルギン酸ナトリウム（Soidum Alginate、ALG 、Kimica）6 mgを0.6 mLの蒸留水に溶解した溶液を混合してＷ１溶液を製造した。ポリビニルアルコール3.6ｇを180 mL蒸留水に添加した後、85℃の条件で600 rpmで撹拌しながら溶解し、常温まで冷却してＷ２溶液を製造した。PLGA1.08ｇとポロキサマー-188（P-188）16.5 mgを塩化メチレン15 mLに加えて溶解し、オイル溶液を製造した。前記製造されたＷ１溶液をオイル溶液に添加後、40秒間水槽型超音波装置で超音波処理を行い、4.304 mg／mL濃度の塩化カルシウム（Calcium chloride、CaCl₂、シグマアルドリッチ）0.3 mLをさらに添加して40秒間超音波処理することにより、アルギン酸がゲル化した一次エマルション（water-in-oil）を製造した。Ｗ２溶液を、機械式撹拌機を用いて1000 rpmで撹拌しながら一次エマルションを添加して二次エマルション（water-in-oil-in-water）を製造した。前記製造されたエマルションを10分間1000 rpmで撹拌した後、40℃の温度条件で磁気撹拌機を用いて280 rpmで21時間撹拌して塩化メチレン溶媒を除去した。その後、14,000 rpmで５分間遠心分離してインドシアニングリーンを搭載したPLGA高分子微粒子の粒子を収得した。上澄み液を除去し、蒸留水を添加して再分散後遠心分離する過程を３回繰り返して微粒子を洗浄した。洗浄した微粒子の粒子は凍結乾燥して微粒子粉末を収得した。

アルギン酸をICG-HSAと混合し、ポロキサマー-188（P-188）をoil相に添加したICG-HSA搭載PLGA微粒子であるICG-HSA-Alginate-PLGA（P-188 0.5％）微粒子の製造ために、インドシアニングリーン（ICG）75 mgをヒト血清アルブミン（HSA）0.322 mL（20％濃度、64.335 mg）と蒸留水0.278 mLを混合した溶液を準備し、ここにアルギン酸ナトリウム（Soidum Alginate、ALG、Kimica）６mgを0.6 mL蒸留水に溶解した溶液を混合してＷ１溶液を製造した。ポリビニルアルコール3.6ｇを180 mL蒸留水に添加した後、85℃の条件で600 rpmで撹拌しながら溶解し、常温まで冷却してＷ２溶液を製造した。PLGA1.08ｇとポロキサマー-188（P-188）82.5 mgを塩化メチレン15 mLに加えて溶解し、オイル溶液を製造した。前記製造されたＷ１溶液をオイル溶液に添加後、40秒間水槽型超音波装置で超音波処理を行い、4.304 mg／mL濃度の塩化カルシウム（Calcium chloride、CaCl₂、シグマアルドリッチ）0.3mLを添加して40秒間さらに超音波処理して、アルギン酸がゲル化した一次エマルション（water-in-oil）を製造した。Ｗ２溶液を、機械式撹拌機を用いて1000 rpmで撹拌しながら一次エマルションを添加して二次エマルション（water-in-oil-in-water）を製造した。前記製造されたエマルションを10分間1000 rpmで撹拌した後、40℃の温度条件で磁気撹拌機を用いて280 rpmで21時間撹拌して塩化メチレン溶媒を除去した。その後、14,000 rpmで５分間遠心分離してインドシアニングリーンを搭載したPLGA高分子微粒子の粒子を収得した。上澄み液を除去し、蒸留水を添加して再分散後遠心分離する過程を３回繰り返して微粒子を洗浄した。洗浄した微粒子の粒子は凍結乾燥して微粒子粉末を収得した。

前記製造した微粒子内のインドシアニングリーンの含量及び搭載率を分析した。

前記合成された微粒子の粒子形態とサイズ分析、および断面形状を観察するために走査電子顕微鏡分析を行った。粒子径は得られた写真でランダムに100個の粒子径を測定して平均値で求めた。

前記製造した微粒子とインドシアニングリーン／ヒト血清アルブミン複合体との蛍光信号比較のために、同濃度のインドシアニングリーンの複合体溶液と微粒子分散液を製造した。蛍光スペクトル比較のために、前記製造した溶液と微粒子分散液をそれぞれ200μLずつ分取して96ウェルプレートに入れ、多機能マイクロプレートリーダーを用いて蛍光スペクトル（λ_ex＝730 nm）を測定した。蛍光画像は、同じ溶液300μLをマイクロチューブに入れた後、蛍光画像装置（IVIS Lumina XR）を用いて分析（λ_ex＝780／20 nm、λ_em＝845／40 nm）した。

動物モデルで蛍光マーカー微粒子の蛍光標識効能評価のために製造した30μM ICG濃度のICG-HSA溶液と微粒子を0.5％カルボキシメチルセルロース(Sodium carboxymethyl cellulose, シグマアルドリッチ)および0.1％トゥイ―ン（Tween 80、シグマアルドリッチ）を含む注射用生理食塩水を用いて分散させ、微粒子分散液100μLを、シリンジを用いてSKH-1 ヘアレスマウスの皮下に注入した後、経時的な蛍光信号を、蛍光画像装置（IVIS Lumina XR）を用いて撮影（λ_ex＝780／20 nm、λ_em＝845／40 nm）した。

ICG-HSA-Alginate-PLGA（P-188 0.1％）とICG-HSA-Alginate-PLGA（P-188 0.5％）微粒子内のインドシアニングリーンの搭載率はそれぞれ10.5％と7.62%であり、1 mg微粒子内のインドシアニングリーン含量は108.7 ngと61.6 ngと分析された。

ICG-HSA-Alginate-PLGA（P-188 0.1％）とICG-HSA-Alginate-PLGA（P-188 0.5％）微粒子は、77.8±26.5μm、67.9±24.1μmの平均粒子径を有する球状の粒子として（図２２）、マクロファージの食細胞作用回避のために適したサイズを有することを確認した。また、図２２（c）の微粒子断面写真から分かるように、微粒子内部は隔離された複数の球状空間で構成されているので、マイクロバブル形態の構造よりも蛍光染料の放出を良好に抑制できることが分かる。

図２３の蛍光スペクトルによる蛍光信号の比較結果、ICG-HSA-Alginate-PLGA（P-188 0.1％）は、ICG-HSAと同様の蛍光信号を示し、ICG-PLGA（P-188なし）に比べて6.4倍高い蛍光信号を示し、ICG-HSA-Alginate-PLGA（P-188 0.5％）微粒子の場合、ICG-HSAより2.5倍高い蛍光信号を見せ、ICG-PLGA（P-188なし）に比べて17倍高い蛍光信号を見せることがわかった。

蛍光画像写真（図２４）でも製造されたICG-HSA-Alginate-PLGA（P-188 0.1％）（図8C - b）とICG-HSA-Alginate-PLGA（P-188 0.5％）（図8C - c）微粒子分散液が強い蛍光信号を発生していることが確認できた。

図２５は、ICG-HSA溶液とICG-HSA-Alginate-PLGA（P-188 0.5％）微粒子分散液をSKH-1 ヘアレスマウスの皮下に注入し、経時的に蛍光画像を撮影した(λ_ex=780 ／20 nm、λ_em＝845／40 nm）写真である。ICG-HSA(図２５-ａ)の場合に1日後からは蛍光信号が見られないこととは異なり、ICG-HSA-Alginate-PLGA（P-188 0.5％）微粒子分散液(図２５-ｂ)を投与した場合には30日までに高い蛍光信号が維持されることを確認した。

前記蛍光画像写真で分析したROI値をグラフで示した結果（図２６）、ICG-HSA-Alginate-PLGA（P-188 0.5％）微粒子分散液の場合には投与1日後に80%の蛍光が残っており、30日後にも４６％の高い蛍光信号が見られることを確認した。

これらの結果は、ICG-HSA-Alginate-PLGA（P-188）微粒子が蛍光マーカーとして非常に有用であることを確認した。

実施例７：界面活性剤としてトゥイーン（Tween）を適用した微粒子の製造及び分析
本実施例では、界面活性剤であるP-188の代わりに他の種類の界面活性剤を使用できることを示すために、トゥイーンを用いて微粒子を製造し分析を行った。インドシアニングリーン（ICG）0.75 mgをヒト血清アルブミン（HSA）0.322 mL（20%濃度、64.335 mg）と蒸留水0.278 mLに混合した溶液とアルギン酸ナトリウム（Soidum Alginate）6 mgを0.6 mLの蒸留水に溶解した溶液を混合してＷ１溶液を製造した。ポリビニルアルコール3.6ｇを180 mLの蒸留水に添加した後、85℃の条件で600 rpmで撹拌しながら溶解し、常温まで冷却してＷ２溶液を製造した。PLGA1.08ｇとトゥイーン（Tween 80、シグマアルドリッチ）82.5 mgを塩化メチレン15 mLに加えて溶解し、オイル溶液を製造した。前記製造されたＷ１溶液をオイル溶液に添加後、40秒間水槽型超音波装置で超音波処理を行い、4.304 mg／mL濃度の塩化カルシウム（Calcium chloride、CaCl₂、シグマアルドリッチ）0.3 mLをさらに添加し、40秒間超音波処理してアルギン酸がゲル化した一次エマルション（water-in-oil）を製造した。Ｗ２溶液を、機械式撹拌機を用いて1000 rpmで撹拌しながら前記一次エマルションを添加して二次エマルション（water-in-oil-in-water）を製造した。前記製造されたエマルションを10分間1000 rpmで撹拌した後、40℃の温度条件で磁気撹拌機を用いて280 rpmで21時間撹拌して塩化メチレン溶媒を除去した。その後、14,000 rpmで５分間遠心分離してインドシアニングリーンを搭載したPLGA高分子微粒子の粒子を収得した。上澄み液を除去し、蒸留水を添加して再分散後遠心分離する過程を３回繰り返して微粒子を洗浄した。洗浄した微粒子は凍結乾燥して微粒子粉末を収得した。

前記製造した微粒子内のインドシアニングリーンの含量及び搭載率評価のため、微粒子溶解溶液中のインドシアニングリーンの濃度を紫外／可視光線吸光分析器を用いて定量した。測定された複合体の濃度を用いて、微粒子内のインドシアニングリーン含量および搭載効率を評価した。

前記合成された微粒子の粒子形態とサイズ、および微粒子断面の分析のために、走査電子顕微鏡分析を行った。微粒子表面及び断面分析用微粒子粉末を走査電子顕微鏡サンプルホルダー上に付着したカーボンテープに貼り付けた後、60秒間スパッタリングを介してPt／Pdを表面上にコーティングした後、走査電子顕微鏡写真を５kV加速電圧で分析した。粒子径は得られた写真でランダムに100個の粒子径を測定して平均値で求めた。

製造された微粒子とインドシアニングリーン／ヒト血清アルブミン複合体との蛍光信号比較のために、同濃度のインドシアニングリーンの複合体溶液と微粒子分散液を製造した。蛍光スペクトル比較のために、前記製造した溶液と微粒子分散液をそれぞれ200μLずつ分取して96ウェルプレートに入れ、多機能マイクロプレートリーダーを用いて蛍光スペクトル（λ_ex＝730 nm）を測定した。蛍光画像は、同じ溶液300μLをマイクロチューブに入れた後、蛍光画像装置（IVIS Lumina XR）を用いて分析（λ_ex＝780／20 nm、λ_em＝845／40 nm）した。

ICG-HSA-Algiante-PLGA （P-188 0.5％）微粒子製造条件でoil相に溶解する界面活性剤であるポロキサマー-188をトゥイ―ンに置き換えたICG-HSA-Algiante-PLGA（Tween 0.5％）微粒子の場合、微粒子内のインドシアニングリーンの搭載率が9.68％であり、１mgの微粒子内のインドシアニングリーンの含量が81.0 ngであると確認された。

図２７の走査電子顕微鏡写真で見られるように、ICG-HSA-Algiante-PLGA（Tween 0.5％）微粒子は球状の粒子形態を有しており（図２７（a））、平均粒子径は66.1± 26.0μｍでマクロファージの食細胞作用回避に適したサイズを有していた。また、粒子の断面走査電子顕微鏡写真で確認できるように（図２７（b））、微粒子内部は複数の隔離された小さな球状に画分されており、以前の実施例の結果と同様に搭載された蛍光染料の放出が抑制される構造を有していることを確認した。

ICG-HSA-Algiante-PLGA（Tween 0.5％）微粒子分散液は、ICG-HSAに比べて2倍、ICG-PLGA（P-188なし）に比べて13倍高い蛍光信号を示した（図２８）。

図２９の蛍光画像写真から、ICG-HSA-Algiante-PLGA（P-188 0.5％）（図２９-ｂ）微粒子分散液が強い蛍光信号を発生することを確認した。

図３０は、ICG-HSA溶液（図３０-a）とICG-HSA-Alginate-PLGA（Tween 0.5％）微粒子分散液（図３０-b）をSKH-1 ヘアレスマウスの皮下に注入し、経時的な蛍光画像（λ_ex＝780／20 nm、λ_em＝845／40 nm）を撮影した写真である。ICG-HSAを注入した場合と異なり、ICG-HSA-Alginate-PLGA（P-188 0.5％）微粒子分散液の場合、周囲組織への蛍光滲み現象がなく、投与部位で30日間蛍光信号が高く維持されることを確認した。

前記蛍光画像写真で分析したROI値をグラフで示した結果（図３１）、ICG-HSA-Alginate-PLGA（Tween 0.5％）微粒子分散液の場合、1日後に70%の蛍光が残っており、30日後にも52%の蛍光が依然として残っていることを確認した。この結果から界面活性剤であるポロキサマー-188をトゥイ―ンのような他の界面活性剤に置き換えて微粒子を製造しても高い蛍光信号を発生しながらも病変部位を長期間蛍光標識できる微粒子を製造できることが分かった。

実施例８：インドシアニングリーン／シクロデキストリン複合体を搭載した微粒子の製造及び分析
インドシアニングリーンをシクロデキストリン（cyclodextrin、mCD）と複合体を形成し、これを搭載した微粒子を製造し、蛍光の強度および蛍光マーカーとしての効用性を分析した。インドシアニングリーン/シクロデキストリン複合体搭載PLGA微粒子（（ICG-mCD-Alginate-PLGA（P-188 0.1％））製造のために、インドシアニングリーン（ICG）0.375 mgを0.3 mLのエタノールに溶解した溶液と1.790 mgのメチルシクロデキストリン（Methylcyclodextrin、mCD、シグマアルドリッチ）を0.6 mLの蒸留水に溶解した溶液を混合し、6時間撹拌した。これをアルギン酸ナトリウム（Soidum Alginate）3.6 mgを0.648 mLの蒸留水に溶解した溶液と混合してＷ１溶液を製造した。ポリビニルアルコール3.6ｇを180 mLの蒸留水に添加した後、85℃の条件で600 rpmで撹拌しながら溶解し、常温まで冷却してＷ２溶液を製造した。PLGA1.08ｇとポロキサマー-188（P-188）16.5 mgを塩化メチレン15mLに加えて溶解し、オイル溶液を製造した。前記製造されたＷ１溶液をオイル溶液に添加後、40秒間水槽型超音波装置で超音波処理を行い、10.76 mg／mL濃度の塩化カルシウム（Calcium chloride、CaCl₂、シグマアルドリッチ）0.072 mLを添加して40秒間さらに超音波処理して、アルギン酸がゲル化した一次エマルション（water-in-oil）を製造した。Ｗ２溶液を、機械式撹拌機を用いて1000 rpmで撹拌しながら一次エマルションを添加して二次エマルション（water-in-oil-in-water）を製造した。前記製造されたエマルションを10分間1000 rpmで撹拌した後、40℃の温度条件で磁気撹拌機を用いて280 rpmで21時間撹拌して塩化メチレン溶媒を除去した。その後、14,000 rpmで５分間遠心分離してインドシアニングリーンを搭載したPLGA高分子微粒子の粒子を収得した。上澄み液を除去し、蒸留水を添加して再分散後遠心分離する過程を３回繰り返して微粒子を洗浄した。洗浄した微粒子の粒子は凍結乾燥して微粒子粉末を収得した。

前記製造した微粒子内のインドシアニングリーンの含量および搭載率を分析した。

前記合成された微粒子の粒子形態とサイズ分析、および断面の形状を観察するために、走査電子顕微鏡分析を行った。粒子径は得られた写真でランダムに100個の粒子径を測定して平均値で求めた。

前記製造した微粒子とインドシアニングリーン／ヒト血清アルブミン複合体との蛍光信号比較のために、同濃度のインドシアニングリーンの複合体溶液と微粒子分散液を製造した。インドシアニングリーン粉末0.5 mgを0.214 mLのヒト血清アルブミン溶液（20％濃度）と0.786 mLの蒸留水の混合溶液に溶解した後、蒸留水で希釈して30μＭ濃度のインドシアニングリーン／ヒト血清アルブミン複合体（ICG- HSA）0.3 mLを製造した。前記定量で評価されたPLGA微粒子内のインドシアニングリーンの含量を、情報を用いてインドシアニングリーンの濃度が30μＭとなるように、0.3 mL蒸留水に添加して微粒子分散液を製造した。蛍光スペクトル比較のために、前記製造した溶液と分散液をそれぞれ200μLずつ分取して96ウェルプレートに入れ、多機能マイクロプレートリーダーを用いて蛍光スペクトル（λ_ex＝730 nm）を測定した。蛍光画像は、同じ溶液300μLをマイクロチューブに入れた後、蛍光画像装置（IVIS Lumina XR）を用いて分析（λ_ex＝780／20 nm、λ_em＝845／40 nm）した。

動物モデルで蛍光マーカー微粒子の蛍光標識効能評価のために製造した30μM ICG濃度のICG-HSA溶液と微粒子を0.5％カルボキシメチルセルロース(Sodium carboxymethyl cellulose, シグマアルドリッチ)および0.1％トゥイーン（Tween 80、シグマアルドリッチ）を含む注射用生理食塩水を用いて分散させ、微粒子分散液100μLを、シリンジを用いてSKH-1 ヘアレスマウスの皮下に注入した後、経時的な蛍光信号を、蛍光画像装置（IVIS Lumina XR）を用いて撮影（λ_ex＝780／20 nm、λ_em＝845／40 nm）した。

インドシアニングリーン/シクロデキストリンを搭載したICG-mCD-Alginate-PLGA （P-188 0.1％）微粒子内のインドシアニングリーンの搭載率は11.4%であり、1 mg微粒子内のインドシアニングリーンの含量は76.3 ngと確認された。

ICG-mCD-Alginate-PLGA（P-188 0.1％）微粒子も球状の粒子として（図３２（a））、平均65.0±26.0μmでマクロファージの食細胞作用回避に適したサイズを有していた。また、図３２（b）の微粒子断面写真から分かるように、微粒子内部は隔離された複数の球状空間で構成されているので、マイクロバブル形態の構造よりは蛍光染料の放出を良好に抑制できることが分かる。

図３３（a）の蛍光スペクトルから分かるように、ICG-mCDはICGに比べて1.5倍高い蛍光信号を示すことがわかり、これはmCDと複合体を形成すれば、水溶液上でICG同士の凝集現象を防ぐことができ、ICGの化学的／物理的安定性も増加させることを意味する。

ICG-mCD複合体を用いて製造したICG-mCD-Algiante-PLGA（P-188 0.1％）微粒子分散液の場合、ICG-PLGA（P-188なし）微粒子分散液より4.2倍高い蛍光信号を示すことを確認した。

また、図３４の蛍光画像から、ICG-mCD-Algiante-PLGA微粒子分散液（右）は高い蛍光信号を発生することを確認した。

図３５において、ICG-mCD-Algiante-PLGA（P-188 0.1％）微粒子分散液（図３５-ｂ）は、投与部位で蛍光の滲み現象がなく、30日まで蛍光信号が維持されることを確認した。ICG-HSA（図３５-ａ）の場合、以前の実施例と同じ態様を示した。

前記蛍光画像写真で分析したROI値をグラフで示した結果（図３６）、ICG-mCD-Algiante-PLGA（P-188 0.1％）微粒子分散液の場合、注入1日後に32%の蛍光が残り、30日後でも29%の蛍光が依然として高く残っていることを確認した。この結果、インドシアニングリーン／シクロデキストリン複合体を搭載した（ICG-mCD-Algiante-PLGA（P-188 0.1％））微粒子も30日以上の蛍光信号が維持でき、蛍光マーカーとして効用性があることを確認した。

実施例９：Cy7-ヒト血清アルブミン複合体を搭載した微粒子の製造及び分析
インドシアニングリーンの以外にも、他の近赤外線蛍光染料を搭載した微粒子も製造が可能で、明るい蛍光を発生することを示す証明実験を行った。このために、微粒子内に搭載される蛍光染料としては、sulfo-cyanine 7 carboxylic acid（Cy7）、sulfo-cyanine 7.5 carboxylic acid（Cy7.5）、Flamma 774 carboxylic acid（Flamma774）、Alexa fluor 750 carboxylic acid（Alexa 750）、およびIRDye 800CW carboxylate（IRDye 800CW）を使用し、ポリメチルメタクリレート（Poly(methyl methacrylate)）とポリカーボネート（polycarbonate、PC）高分子を用いて微粒子を製造し、効能を評価した。

９-１：Cy7溶液とCy7-HSA複合体の濃度による蛍光信号の比較
近赤外線蛍光染料であるsulfo-cyanine7 carboxylic acid（Cy7、Lumiprobe）0.48 mgを蒸留水1 mLに溶解した後、蒸留水で希釈して、100、70、50、40、30、20、10、5、4、3、2、1μＭ濃度のCy7溶液を製造した。Cy7溶液と蛍光信号を比較するためのCy7-ヒト血清アルブミン（Human serum albumin、HSA、SKプラズマ）複合体を製造した。0.48 mgのCy7粉末を、0.214 mLのヒト血清アルブミン溶液（20％濃度）と0.786 mLの蒸留水混合溶液に溶解した後、蒸留水で希釈して、100、70、50、40、30、20、10、5、4、3、2、1μＭ濃度のCy7-ヒト血清アルブミン複合体（Cy7-HSA）を製造した。蛍光スペクトル比較のために、前記製造した溶液をそれぞれ200μLずつ分取して96ウェルプレートに入れ、多機能マイクロプレートリーダー（SPARK、Tecan Trading AG、Zurich、Switzerland）を用いて蛍光強度（λ_ex＝730 nm、λ_em＝780 nm（Cy7）、λ_em=786 nm（Cy7-HSA））を測定した。Cy7蛍光染料は780 nmで発光（emission）ピークを見せるが、HSAと複合体を形成した後には786 nmで発光ピークをみせた。

1～100μM濃度のCy7溶液とCy7-HSA複合体溶液の蛍光強度を比較した図３７と同様に、10μM以上の濃度でCy7-HSA溶液がCy7溶液よりもより高い蛍光信号を発生することが確認でき、Cy7.5-HSA溶液がCy7.5溶液より30μＭ濃度で1.2倍、測定最大濃度である100μＭ濃度で1.3倍高い蛍光信号を発生することを確認した。

９-２：Cy7とCy7-HSA複合体を搭載したPMMA微粒子の製造および分析
近赤外蛍光染料であるCy7を搭載したPMMA微粒子を製造するために、Cy7-PMMA（P-188なし）、Cy7 0.81 mgを蒸留水1.691 mLに溶解してW1溶液を製造した。ポリビニルアルコール3.6 g を180 mLの蒸留水に添加した後、85℃の条件で600 rpmで撹拌しながら溶解し、常温まで冷却してＷ２溶液を製造した。PMMA1.217ｇを塩化メチレン16.909 mLに加えて溶解し、オイル溶液を製造した。前記製造されたＷ１溶液をオイル溶液に添加した後、探針型超音波装置で３分間（１分超音波処理＋30秒休止繰り返し）超音波処理を行い、一次エマルション（water-in-oil）を製造した。準備されたＷ２溶液を、機械式撹拌機を用いて1000 rpmで撹拌しながら、前記製造された一次エマルション溶液を、シリンジポンプを用いて10 mL／minの速度で添加して二次エマルション（water-in-oil-in-water）を製造した。前記製造されたエマルションは、10分間1000 rpmで撹拌した後、40℃の温度条件で磁気撹拌機を用いて280 rpmで21時間撹拌して塩化メチレン溶媒を除去した。その後、14,000 rpmで５分間遠心分離してCy7を搭載したPMMA高分子微粒子の粒子を収得した。上澄み液を除去し、蒸留水を添加して再分散後遠心分離する過程を３回繰り返してPMMA微粒子を洗浄した。洗浄した微粒子の粒子は凍結乾燥して微粒子粉末を収得した。

近赤外線蛍光染料Cy7-HSA複合体を搭載したPMMA微粒子を製造するために（Cy7-HSA-PMMA（P-188なし））、Cy7 0.81 mgをヒト血清アルブミン（HSA）0.363 mL（20%濃度、72.553 mg）と蒸留水1.328mLに溶解してＷ１溶液を製造した。ポリビニルアルコール3.6ｇを180 mLの蒸留水に添加した後、85℃の条件で600 rpmで撹拌しながら溶解し、常温まで冷却してＷ２溶液を製造した。PMMA1.217ｇを塩化メチレン16.909 mLに加えて溶解し、オイル溶液を製造した。前記製造されたＷ１溶液をオイル溶液に添加後、探針型超音波装置で３分間（１分超音波処理＋30秒休止繰り返し）超音波処理を行い、一次エマルション（water-in-oil）を製造した。準備されたＷ２溶液を、機械式撹拌機を用いて1000 rpmで撹拌しながら、前記製造された一次エマルション溶液を、シリンジポンプを用いて10 mL／minの速度で添加して二次エマルション（water-in-oil-in-water）を製造した。前記製造されたエマルションを10分間1000 rpmで撹拌した後、40℃の温度条件で磁気撹拌機を用いて280 rpmで21時間撹拌して塩化メチレン溶媒を除去した。その後、14,000 rpmで５分間遠心分離してCy7-HSAを搭載したPMMA高分子微粒子の粒子を収得した。上澄み液を除去し、蒸留水を添加して再分散後遠心分離する過程を３回繰り返してPMMA微粒子を洗浄した。洗浄した微粒子の粒子は凍結乾燥して微粒子粉末を収得した。

一次エマルション相ポロキサマー-188の濃度を1.0％で含み、近赤外線蛍光染料Cy7-HSA複合体を搭載したPMMA微粒子を製造するために（Cy7-HSA-PMMA（P-188 1.0％））、 Cy7 0.81 mgをヒト血清アルブミン（HSA）0.363 mL（20％濃度、72.553 mg）と蒸留水1.328 mLに溶解してＷ１溶液を製造した。ポリビニルアルコール3.6ｇを180 mL蒸留水に添加した後、85℃の条件で600 rpmで撹拌しながら溶解し、常温まで冷却してＷ２溶液を製造した。PMMA1.217ｇとポロキサマー-188（P-188）186 mgを塩化メチレン16.909 mLに加えて溶解し、オイル溶液を製造した。前記製造されたＷ１溶液をオイル溶液に添加後、探針型超音波装置で３分間（１分超音波処理＋30秒休止繰り返し）超音波処理を行い、一次エマルション（water-in-oil）を製造した。準備されたＷ２溶液を、機械式撹拌機を用いて1000 rpmで撹拌しながら、前記製造された一次エマルション溶液を、シリンジポンプを用いて10mL／minの速度で添加して二次エマルション（water-in-oil-in-water）を製造した。前記製造されたエマルションを１０分間1000 rpmで撹拌した後、40℃の温度条件で磁気撹拌機を用いて280 rpmで21時間撹拌して塩化メチレン溶媒を除去した。その後、14,000 rpmで５分間遠心分離してCy7-HSAを搭載したPMMA高分子微粒子の粒子を収得した。上澄み液を除去し、蒸留水を添加して再分散後遠心分離する過程を３回繰り返してPMMA微粒子を洗浄した。洗浄した微粒子の粒子は凍結乾燥して微粒子粉末を収得した。

前記製造した微粒子内のCy7の含量及び搭載率評価のために、微粒子を溶かし、溶液中のCy7の濃度を紫外／可視光線吸光分析器を用いて定量した。

前記合成された微粒子の粒子形態およびサイズ分析のために、走査電子顕微鏡分析を行った。製造した微粒子の断面分析のために、剃刀刃で微粒子の粒子を切断した。微粒子粉末を走査電子顕微鏡サンプルホルダー上に付着したカーボンテープに貼り付けた後、60秒間スパッタリングを介してPt／Pdを表面上にコーティングした後、走査電子顕微鏡写真を5kV加速電圧で分析した。粒子径は得られた写真でランダムに100個の粒子径を測定して平均値で求めた。

前記製造した微粒子とCy7-ヒト血清アルブミン複合体との蛍光信号比較のために、同じ濃度のCy7の複合体溶液と微粒子分散液を製造した。Cy7粉末0.48 mgを0.214 mLのヒト血清アルブミン溶液（20％濃度）と0.786 mLの蒸留水の混合溶液に溶解した後、蒸留水で希釈して30μＭ濃度のCy7-ヒト血清アルブミン複合体（Cy7-HSA）0.3 mLを製造した。前記定量で評価されたPMMA微粒子内のCy7の含量を、情報を用いてCy7の濃度が30μＭとなるように、0.3 mL蒸留水に添加して微粒子分散液を製造した。蛍光スペクトル比較のために、前記製造した溶液と微粒子分散液をそれぞれ200μLずつ分取して96ウェルプレートに入れ、多機能マイクロプレートリーダーを用いて蛍光スペクトル（λ_ex＝730 nm）を測定した。

PMMA微粒子製造時にCy7のみを搭載して製造したCy7-PMMA（P-188なし）微粒子内のCy7の搭載率は6.98％であり、1 mgの微粒子内のCy7の含量が46.5 ngであることを確認した。Cy7-HSAを搭載して製造したCy7-HSA-PMMA（P-188なし）と一次エマルション相基準1.0％ポロキサマー-188を添加して製造したCy7-HSA-PMMA（1.0％P-188）微粒子内のCy7搭載率は、25.8%、19.1%であり、1mgの微粒子内のCy7の含量が162.0 ng、104.8 ngで、Cy7のみを搭載したCy7-PMMA（P-188なし）微粒子よりも高い含量のCy7を搭載していることを確認した。

Cy7-PMMA （P-188なし）、Cy7-HSA-PMMA （P-188なし）、Cy7-HSA-PMMA (1.0％ P-188)微粒子の走査電子顕微鏡写真を分析した結果、各微粒子はそれぞれ56.7±21.3μｍ、53.7±16.1μｍ、59.0±20.0μｍの平均粒子径を有する球状の粒子で、マクロファージの食細胞作用を回避するための適切なサイズを有していることを確認した（図３８（a、c、d））。また、各微粒子の走査電子顕微鏡断面（図３８（b、d、f））を観察した結果、PMMA微粒子の内部には複数の隔離された小さな球状空間を含んでいるため、搭載された蛍光染料の溶出を防止することができ、長期間の蛍光染料標識に非常に適した形態であることを確認した。

図３９のCy7-PMMA（P-188なし）微粒子分散液の蛍光スペクトルでは、Cy7-HSAに比べて4.2倍低い蛍光信号を確認することができ、Cy7-HSA-PMMA（P-188なし）とCy7-HSA-PMMA（1.0％ P-188）微粒子分散液の蛍光スペクトルでは、Cy7-HSAに比べてそれぞれ2.5倍と2.8倍、Cy7-PMMA（P-188なし）に比べてそれぞれ10倍と12倍の高い蛍光信号が確認された。この結果から、近赤外線蛍光染料であるCy7を単独で搭載する場合よりも、Cy7-HSAの複合体形態で搭載した場合に非常に高い蛍光信号を得ることができることが分かる。

実施例１０：Cy7.5-ヒト血清アルブミン複合体を搭載した微粒子の製造および分析
１０-１：Cy7.5溶液とCy7.5-HSA複合体の濃度による蛍光信号の比較
近赤外線蛍光染料であるsulfo-cyanine7.5 carboxylic acid（Cy7.5, Lumiprobe）0.70 mgを蒸留水1 mLに溶解した後、蒸留水で希釈して、100、70、50、40、30、20、10、5、４、3、2、1μＭ濃度のCy7.5溶液を製造した。Cy7.5溶液と蛍光信号を比較するためのCy7.5-ヒト血清アルブミン(Human serum albumin, HSA, SKプラズマ)複合体は、0.70 mgのCy7.5粉末を0.214 mLのヒト血清アルブミン溶液(20%濃度)と0.786 mLの蒸留水の混合溶液に溶解した後、蒸留水で希釈して、100、70、50、40、30、20、10、5、4、3、2、1μＭ濃度のCy7.5-ヒト血清アルブミン複合体（Cy7.5-HSA）を製造した。蛍光スペクトル比較のために、前記製造した溶液をそれぞれ200μLずつ分取して96ウェルプレートに入れ、多機能マイクロプレートリーダー（SPARK、Tecan Trading AG、Zurich、Switzerland）を用いて蛍光スペクトル（λ_ex＝730 nm、λ_em＝810 nm（Cy7.5）、λ_em=824 nm（Cy7.5-HSA））を測定した。Cy7.5蛍光染料は810 nmで発光（emissin）ピークを見せるが、HSAと複合体を形成した後では824 nmで発光ピークを見せた。

1～100μM濃度のCy7.5溶液とCy7.5-HSA複合体溶液の蛍光強度を比較した図４０と同様に、10μM以上の濃度でCy7.5-HSA溶液がCy7.5溶液よりもより高い蛍光信号を発生することが確認でき、Cy7.5-HSA溶液がCy7.5溶液より30μＭ濃度で1.1倍、測定最大濃度である100μＭ濃度で1.2倍高い蛍光信号を発生することを確認した。

１０-２：Cy7.5とCy7.5-HSA複合体を搭載したPMMA微粒子の製造及び分析
近赤外線蛍光染料Cy7.5のみを搭載したPMMA（Cy7.5-PMMA（P-188なし））微粒子を製造するために、Cy7.5 1.18 mgを蒸留水1.691 mLに溶解してＷ１溶液を製造した。ポリビニルアルコール3.6ｇを180 mLの蒸留水に添加した後、85℃の条件で600 rpmで撹拌しながら溶解し、常温まで冷却してＷ２溶液を製造した。PMMA 1.217 ｇを塩化メチレン16.909 mLに加えて溶解し、オイル溶液を製造した。前記製造されたＷ１溶液をオイル溶液に添加後、探針型超音波装置で３分間（１分超音波処理＋30秒休止繰り返し）超音波処理を行い、一次エマルション（water-in-oil）を製造した。準備されたＷ２溶液を、機械式撹拌機を用いて1000 rpmで撹拌しながら、前記製造された一次エマルション溶液を、シリンジポンプを用いて10 mL／minの速度で添加して、二次エマルション（water-in-oil-in-water）を製造した。前記製造されたエマルションを10分間1000 rpmで撹拌した後、40℃の温度条件で磁気撹拌機を用いて280 rpmで21時間撹拌して塩化メチレン溶媒を除去した。その後、14,000rpmで５分間遠心分離して、Cy7.5を搭載したPMMA高分子微粒子の粒子を収得した。上澄み液を除去し、蒸留水を添加して再分散後遠心分離する過程を３回繰り返してPMMA微粒子を洗浄した。洗浄した微粒子の粒子は凍結乾燥して微粒子粉末を収得した。

近赤外線蛍光染料Cy7.5-HSA複合体を搭載したPMMA微粒子であるCy7.5-HSA-PMMA（P-188なし）を製造した。Cy7.5 1.18 mgをヒト血清アルブミン（HSA）0.363 mL（20％濃度、72.553 mg）と蒸留水1.328 mLに溶解してＷ１溶液を製造した。ポリビニルアルコール3.6ｇを180 mLの蒸留水に添加した後、85℃の条件で600 rpmで撹拌しながら溶解し、常温まで冷却してＷ２溶液を製造した。PMMA1.217ｇを塩化メチレン16.909 mLに加えて溶解し、オイル溶液を製造した。前記製造されたＷ１溶液をオイル溶液に添加後、探針型超音波装置で３分間（１分超音波処理＋30秒休止繰り返し）超音波処理を行い、一次エマルション（water-in-oil）を製造した。準備されたＷ２溶液を、機械式撹拌機を用いて1000 rpmで撹拌しながら、前記製造された一次エマルション溶液を、シリンジポンプを用いて10mL／minの速度で添加して二次エマルション（water-in-oil-in-water）を製造した。前記製造されたエマルションを10分間1000 rpmで撹拌した後、40℃の温度条件で磁気撹拌機を用いて280 rpmで21時間撹拌して塩化メチレン溶媒を除去した。その後、14,000 rpmで５分間遠心分離してCy7.5-HSAを搭載したPMMA高分子微粒子の粒子を収得した。上澄み液を除去し、蒸留水を添加して再分散後遠心分離する過程を３回繰り返してPMMA微粒子を洗浄した。洗浄した微粒子の粒子は凍結乾燥して微粒子粉末を収得した。

一次エマルション相ポロキサマー-188の濃度を1.0％で含み、近赤外線蛍光染料Cy7.5-HSA複合体を搭載したPMMA微粒子であるCy7.5-HSA-PMMA（P-188 1.0％）を製造した。Cy7.5 1.18 mgをヒト血清アルブミン（HSA）0.363 mL（20％濃度、72.553 mg）と蒸留水1.328 mLに溶解してＷ１溶液を製造した。ポリビニルアルコール3.6ｇを180 mLの蒸留水に添加した後、85℃の条件で600 rpmで撹拌しながら溶解し、常温まで冷却してＷ２溶液を製造した。PMMA1.217ｇとポロキサマー-188（P-188）186 mgを塩化メチレン16.909 mLに加えて溶解し、オイル溶液を製造した。前記製造されたＷ１溶液をオイル溶液に添加後、探針型超音波装置で３分間（１分超音波処理＋30秒休止繰り返し）超音波処理を行い、一次エマルション（water-in-oil）を製造した。準備されたＷ２溶液を、機械式撹拌機を用いて1000 rpmで撹拌しながら、前記製造された一次エマルション溶液を、シリンジポンプを用いて10 mL／minの速度で添加して、二次エマルション（water-in-oil-in-water）を製造した。前記製造されたエマルションを10分間1000 rpmで撹拌した後、40℃の温度条件で磁気撹拌機を用いて280 rpmで21時間撹拌して塩化メチレン溶媒を除去した。その後、14,000rpmで５分間遠心分離して、Cy7.5-HSAを搭載したPMMA高分子微粒子の粒子を収得した。上澄み液を除去し、蒸留水を添加して再分散後遠心分離する過程を３回繰り返してPMMA微粒子を洗浄した。洗浄した微粒子の粒子は凍結乾燥して微粒子粉末を収得した。

前記製造した微粒子内のCy7.5の含量及び搭載率評価のために、微粒子を溶かし、溶液中のCy7.5の濃度を紫外／可視光線吸光分析器を用いて定量した。

前記製造した微粒子とCy7.5-ヒト血清アルブミン複合体との蛍光信号比較のために、同濃度のCy7.5の複合体溶液と微粒子分散液を製造した。Cy7.5粉末0.70 mgを0.214 mLのヒト血清アルブミン溶液（20％濃度）と0.786 mLの蒸留水の混合溶液に溶解した後、蒸留水で希釈して30μＭ濃度のCy7.5-ヒト血清アルブミン複合体（Cy7-HSA）0.3 mLを製造した。前記定量で評価されたPMMA微粒子内のCy7.5の含量を、情報を用いてCy7.5の濃度が30μＭとなるように、0.3 mLの蒸留水に添加して微粒子分散液を製造した。蛍光スペクトル比較のために、前記製造した溶液と微粒子分散液をそれぞれ200μLずつ分取して96ウェルプレートに入れ、多機能マイクロプレートリーダーを用いて蛍光スペクトル（λ_ex＝730 nm）を測定した。

PMMA微粒子製造時にCy7.5を搭載して製造したCy7.5-PMMA（P-188なし）微粒子内のCy7.5の搭載率は4.10%であり、1mgの微粒子内のCy7.5の含量が39.8 ngであることを確認した。Cy7.5-HSAを搭載して製造したCy7.5-HSA-PMMA（P-188なし）と一次エマルション相基準1.0％ポロキサマー-188を添加して製造したCy7.5-HSA-PMMA（1.0％ P-188）の微粒子内のCy7.5搭載率は、14.0%、15.6%であり、1 mgの微粒子内のCy7.5の含量が128.7 ng、124.7 ngで、Cy7.5のみを搭載したCy7.5-PMMA(P-188なし）微粒子よりもより高い含量のCy7.5を搭載していることを確認した。

Cy7.5-PMMA（P-188なし）、Cy7.5-HSA-PMMA（P-188なし）、Cy7.5-HSA-PMMA（1.0％ P-188）微粒子の走査電子顕微鏡写真を分析した結果、各微粒子はそれぞれ57.9±18.4 μｍ、58.0±16.0 μｍ、65.9±24.4 μｍの平均粒子径を有する球状の粒子で、マクロファージの食細胞作用を回避するための適切なサイズを有していることを確認した（図４１（a、c、e））。また、各微粒子の走査電子顕微鏡断面（図４１（b、d、f））を評価した結果、PMMA微粒子内部は複数の隔離された小さな球状空間を含んでいるため、搭載された蛍光染料の溶出を防止することができ、長期間の蛍光染料標識に非常に適した形態であることを確認した。

図４２のCy7.5-PMMA（P-188なし）微粒子分散液の蛍光スペクトルでCy7.5-HSAに比べて5.0倍低い蛍光信号が確認でき、Cy7.5-HSA-PMMA(P-188なし）とCy7.5-HSA-PMMA（1.0％ P-188）微粒子分散液の蛍光スペクトルでは、Cy7.5-HASに比べてそれぞれ1.3倍と1.6倍、Cy7.5-PMMA（P-188なし）に比べて6.4倍と8.2倍の高い蛍光信号が確認できた。この結果から、近赤外線蛍光染料であるCy7.5も単独で搭載する場合よりも、Cy7.5-HSAの複合体形態で搭載した場合、非常に高い蛍光信号が得られることが分かる。

１０-３：Cy7.5およびCy7.5-HSA搭載ポリカーボネート微粒子の製造および分析
近赤外線蛍光染料Cy7.5を搭載したポリカーボネート（PC）微粒子であるCy7.5-PC（P-188なし）を製造した。Cy7.5 1.18 mgを蒸留水1.691 mLに溶解してＷ１溶液を製造した。ポリビニルアルコール3.6ｇを180 mLの蒸留水に添加した後、85℃の条件で600 rpmで撹拌しながら溶解し、常温まで冷却してＷ２溶液を製造した。PC1.217ｇを塩化メチレン16.909mLに加えて溶解し、オイル溶液を製造した。前記製造されたＷ１溶液をオイル溶液に添加後、探針型超音波装置で３分間（１分超音波処理＋30秒休止繰り返し）超音波処理を行い、一次エマルション（water-in-oil）を製造した。準備されたＷ２溶液を、機械式撹拌機を用いて1000 rpmで撹拌しながら、前記製造された一次エマルション溶液を、シリンジポンプを用いて10 mL／minの速度で添加して、二次エマルション（water-in-oil-in-water）を製造した。前記製造されたエマルションを10分間1000 rpmで撹拌した後、40℃の温度条件で磁気撹拌機を用いて280 rpmで21時間撹拌して塩化メチレン溶媒を除去した。その後、14,000rpmで５分間遠心分離して、Cy7.5を搭載したPC高分子微粒子の粒子を収得した。上澄み液を除去し、蒸留水を添加して再分散後遠心分離する過程を３回繰り返してPC微粒子を洗浄した。洗浄した微粒子の粒子は凍結乾燥して微粒子粉末を収得した。

Cy7.5-HSA複合体を搭載したPC微粒子であるCy7.5-HSA-PC(P-188なし)を製造した。Cy7.5 1.18 mgをヒト血清アルブミン（HSA）0.363 ｍＬ（20％濃度、72.553 mg）と蒸留水1.328ｍＬに溶解してＷ１溶液を製造した。ポリビニルアルコール3.6ｇを180 mLの蒸留水に添加した後、85℃の条件で600 rpmで撹拌しながら溶解し、常温まで冷却してＷ２溶液を製造した。PC1.217ｇを塩化メチレン16.909 mLに加えて溶解し、オイル溶液を製造した。前記製造されたＷ１溶液をオイル溶液に添加後、探針型超音波装置で３分間（１分超音波処理＋３０秒休止繰り返し）超音波処理を行い、一次エマルション（water-in-oil）を製造した。準備されたＷ２溶液を、機械式撹拌機を用いて1000 rpmで撹拌しながら、前記製造された一次エマルション溶液を、シリンジポンプを用いて10 mL／minの速度で添加して、二次エマルション（water-in-oil-in-water）を製造した。前記製造されたエマルションを10分間1000 rpmで撹拌した後、40℃の温度条件で磁気撹拌機を用いて280 rpmで21時間撹拌して塩化メチレン溶媒を除去した。その後、14,000rpmで５分間遠心分離して、Cy7.5-HSAを搭載したPC高分子微粒子の粒子を収得した。上澄み液を除去し、蒸留水を添加して再分散後遠心分離する過程を３回繰り返してPC微粒子を洗浄した。洗浄した微粒子の粒子は凍結乾燥して微粒子粉末を収得した。

前記製造した微粒子内のCy7.5の含量および搭載率評価のために、微粒子を溶かし、溶液中のCy7.5の濃度を紫外／可視光線吸光分析器を用いて定量した。

前記製造した微粒子とCy7.5-ヒト血清アルブミン複合体との蛍光信号比較のために、同濃度のCy7.5の複合体溶液と微粒子分散液を製造した。Cy7.5粉末0.70 mgを0.214 mLのヒト血清アルブミン溶液（20％濃度）と0.786 mLの蒸留水混合溶液に溶解した後、蒸留水で希釈して30μＭ濃度のCy7.5－ヒト血清アルブミン複合体（Cy7-HSA）0.3 mLを製造した。前記定量で評価されたＰＣ微粒子内のCy7.5の含量を情報を用いてCy7.5の濃度が３０μＭとなるように、0.3mLの蒸留水に添加して微粒子分散液を製造した。蛍光スペクトル比較のために、前記製造した溶液と微粒子分散液をそれぞれ200μLずつ分取して96ウェルプレートに入れ、多機能マイクロプレートリーダーを用いて蛍光スペクトル（λ_ex＝730 nm）を測定した。

PMMA微粒子製造時にCy7.5を搭載して製造したCy7.5-PMMA（P-188なし）微粒子内のCy7.5の搭載率は2.08%であり、1 mgの微粒子内のCy7.5の含量が20.2 ngであることを確認した。Cy7.5-HSAを搭載して一次エマルション相基準1.0％ポロキサマー-188を添加して製造したCy7.5-HSA-PMMA（1.0％Ｐ-188）微粒子内のCy7.5搭載率は11.8％であり、1 mgの微粒子内のCy7.5の含量が108.6ngで、Cy7.5-PMMA（P-188なし）微粒子よりもより高い含量のCy7.5を搭載していることを確認した。

Cy7.5-PMMA（P-188なし）とCy7.5-HSA-PMMA（P-188なし）微粒子の走査電子顕微鏡写真の分析結果、各微粒子は58.3±19.0μmと55.2±19.5μmの平均粒子径を有する球形の粒子で、マクロファージの食細胞作用を回避するための適切なサイズを有することを確認した（図４３（a、c））。また、各微粒子の走査電子顕微鏡断面（図４３（b、d））を観察した結果、ＰＭＭＡ微粒子内部は複数の隔離された小さな球状空間を含んでいるため、搭載された蛍光染料の溶出を防止することができ、長期間の蛍光染料標識に非常に適した形態であることを確認した。

図４４のCy7.5-HSA-PC（P-188なし）微粒子分散液の蛍光スペクトルでCy7.5-PC（P-188なし）に比べて2.2倍の高い蛍光信号を確認することができた。この結果から、PC高分子をベースとする微粒子に近赤外線蛍光染料であるCy7.5を単独で搭載する場合よりも、Cy7.5-HSAの複合体形態で搭載した場合、非常に高い蛍光信号が得られることが分かる。

実施例１１：Flamm774-ヒト血清アルブミン複合体を搭載した微粒子の製造及び分析
１１-１：Flamma774溶液とFlamma774-HSA複合体の濃度による蛍光信号の比較
近赤外蛍光染料であるFlamma774 carboxylic acid（Flamma774、Bioacts）0.60 mgを蒸留水1 mLに溶解した後、蒸留水で希釈して、100、70、50、40、30、20、10、5、4、3、2、1μＭ濃度のFlamma774溶液を製造した。Flamma774溶液と蛍光信号を比較するためのFlamma774-ヒト血清アルブミン(Human serum albumin, HSA, SKプラズマ)複合体は、0.60 mgのFlamma774粉末を0.214 mLのヒト血清アルブミン溶液（20%濃度）と0.786 mLの蒸留水との混合溶液に溶解した後、蒸留水で希釈して、100、70、50、40、30、20、10、5、4、3、2、1μM濃度のFlamma774-ヒト血清アルブミン複合体（Flamma774-HSA）を製造した。蛍光スペクトル比較のために、前記製造した溶液をそれぞれ200μLずつ分取して96ウェルプレートに入れ、多機能マイクロプレートリーダー（SPARK、Tecan Trading AG、Zurich、Switzerland）を用いて蛍光スペクトル（λ_ex＝730 nm、λ_em＝812 nm（Flamma774）、λ_em＝818 nm（Flamma774-HSA））を測定した。Flamma774蛍光染料は812 nmで発光（emission）ピークをみせるが、HSAと複合体を形成した後には818 nmで発光ピークを見せた。

1～100μM濃度のFlamma774溶液とFlamma774-HSA複合体溶液の蛍光強度を比較した図４５と同様に、全範囲の濃度ではFlamma774-HSA溶液がFlamma774溶液よりもより高い蛍光信号を発生することが確認でき、Flamma774-HSA溶液がFlamma774溶液より30μＭ濃度で1.3倍、測定最大濃度である100μＭ濃度で1.3倍高い蛍光信号を発生することを確認した。

１１-２：Flamma774とFlamma774-HSA複合体を搭載したPMMA微粒子の製造及び分析
近赤外線蛍光染料Flamma774を搭載したPMMA微粒子であるFlamma774-PMMA（P-188なし）を製造した。Flamma774 1.01 mgを蒸留水1.691 mLに溶解してW1溶液を製造した。ポリビニルアルコール3.6ｇを180 mLの蒸留水に添加した後、85℃の条件で600 rpmで撹拌しながら溶解し、常温まで冷却してＷ２溶液を製造した。PMMA1.217ｇを塩化メチレン16.909 mLに加えて溶解し、オイル溶液を製造した。前記製造されたＷ１溶液をオイル溶液に添加後、探針型超音波装置で３分間（１分超音波処理＋30秒休止繰り返し）超音波処理を行い、一次エマルション（water-in-oil）を製造した。準備されたＷ２溶液を、機械式撹拌機を用いて1000 rpmで撹拌しながら、前記製造された一次エマルション溶液を、シリンジポンプを用いて10 mL／minの速度で添加して、二次エマルション（water-in-oil-in-water）を製造した。前記製造されたエマルションを10分間1000 rpmで撹拌した後、40℃の温度条件で磁気撹拌機を用いて280 rpmで21時間撹拌して塩化メチレン溶媒を除去した。その後、14,000 rpmで５分間遠心分離して、Flamma774を搭載したPMMA高分子微粒子の粒子を収得した。上澄み液を除去し、蒸留水を添加して再分散後遠心分離する過程を３回繰り返してPMMA微粒子を洗浄した。洗浄した微粒子の粒子は凍結乾燥して微粒子粉末を収得した。

Flamma774-HSA複合体を搭載したPMMA微粒子であるFlamma774-HSA-PMMA（P-188なし）を製造した。Flamma774 1.01 mgをヒト血清アルブミン（HSA）0.363 mL（20％濃度、72.553 mg）および蒸留水1.328 mLに溶解してW1溶液を製造した。ポリビニルアルコール3.6ｇを180 mLの蒸留水に添加した後、85℃の条件で600 rpmで撹拌しながら溶解し、常温まで冷却してＷ２溶液を製造した。PMMA 1.217ｇを塩化メチレン 16.909 mLに加えて溶解し、オイル溶液を製造した。前記製造されたＷ１溶液をオイル溶液に添加後、探針型超音波装置で３分間（１分超音波処理＋30秒休止繰り返し）超音波処理を行い、一次エマルション（water-in-oil）を製造した。準備されたＷ２溶液を、機械式撹拌機を用いて1000 rpmで撹拌しながら、前記製造された一次エマルション溶液を、シリンジポンプを用いて10 mL／minの速度で添加して、二次エマルション（water-in-oil-in-water）を製造した。前記製造されたエマルションを10分間1000 rpmで撹拌した後、40℃の温度条件で磁気撹拌機を用いて280 rpmで21時間撹拌して塩化メチレン溶媒を除去した。その後、14,000 rpmで５分間遠心分離して、Flamma774-HSAを搭載したPMMA高分子微粒子の粒子を収得した。上澄み液を除去し、蒸留水を添加して再分散後遠心分離する過程を３回繰り返してPMMA微粒子を洗浄した。洗浄した微粒子の粒子は凍結乾燥して微粒子粉末を収得した。

一次エマルション相ポロキサマー-188の濃度を1.0％で含み、近赤外線蛍光染料Flamma774-HSA複合体を搭載したPMMA微粒子であるFlamma774-HSA-PMMA（P-188 1.0％）を製造した。Flamma774 1.01 mgをヒト血清アルブミン（HSA）0.363mL（20％濃度、72.553 mg）と蒸留水1.328 mLに溶解してW1溶液を製造した。ポリビニルアルコール3.6ｇを180 mLの蒸留水に添加した後、85℃の条件で600 rpmで撹拌しながら溶解し、常温まで冷却してＷ２溶液を製造した。PMMA 1.217ｇとポロキサマー-188（P-188）186 mgを塩化メチレン16.909 mLに加えて溶解し、オイル溶液を製造した。前記製造されたＷ１溶液をオイル溶液に添加後、探針型超音波装置で３分間（１分超音波処理＋30秒休止繰り返し）超音波処理を行い、一次エマルション（water-in-oil）を製造した。準備されたＷ２溶液を、機械式撹拌機を用いて1000 rpmで撹拌しながら、前記製造された一次エマルション溶液を、シリンジポンプを用いて10 mL／minの速度で添加して、二次エマルション（water-in-oil-in-water）を製造した。前記製造されたエマルションを10分間1000 rpmで撹拌した後、40℃の温度条件で磁気撹拌機を用いて280 rpmで21時間撹拌して塩化メチレン溶媒を除去した。その後、14,000 rpmで５分間遠心分離して、Flamma774-HSAを搭載したPMMA高分子微粒子の粒子を収得した。上澄み液を除去し、蒸留水を添加して再分散後遠心分離する過程を３回繰り返してPMMA微粒子を洗浄した。洗浄した微粒子の粒子は凍結乾燥して微粒子粉末を収得した。

前記製造した微粒子内のFlmma774の含量及び搭載率評価のために、微粒子を溶かし、溶液中のFlmma774の濃度を紫外／可視光線吸光分析器を用いて定量した。

前記製造した微粒子とFlmma774-ヒト血清アルブミン複合体との蛍光信号比較のために、同濃度のFlmma774の複合体溶液と微粒子分散液を製造した。Flmma774粉末0.60mgを0.214 mLのヒト血清アルブミン溶液（20%濃度）と0.786 mLの蒸留水の混合溶液に溶解した後、蒸留水で希釈して30μM濃度のFlmma774-ヒト血清アルブミン複合体（Flmma774-HSA）0.3 mLを製造した。前記定量で評価されたPMMA微粒子内のFlmma774の含量を、情報を用いてFlmma774の濃度が30μＭとなるように、0.3 mLの蒸留水に添加して微粒子分散液を製造した。蛍光スペクトル比較のために、前記製造した溶液と微粒子分散液をそれぞれ200μLずつ分取して96ウェルプレートに入れ、多機能マイクロプレートリーダーを用いて蛍光スペクトル（λ_ex＝730 nm）を測定した。

PMMA微粒子の製造時にFlamma774を搭載して製造したFlamma774-PMMA（P-188なし）微粒子内のFlamma774の搭載率は5.08%であり、1 mgの微粒子内のFlamma774の含量が42.3 ngであることを確認した。Flamma774-HSAを搭載して製造したFlamma774-HSA-PMMA（P-188なし）と一次エマルション相基準1.0％ポロキサマー-188を添加して製造したFlamma774-HSA-PMMA（1.0％P-188）の微粒子内のFlamma774搭載率は23.3%、21.6%であり、1 mgの微粒子内のFlamma774の含量が183.0 ng、148.6 ngで、Flamma774のみを搭載したFlamma774-PMMA（P-188なし）微粒子よりもより高い含量のFlamma774を搭載していることを確認した。

Flamma774-PMMA（P-188なし）、Flamma774-HSA-PMMA（P-188なし）、Flamma774-HSA-PMMA（1.0％ P-188）微粒子の走査電子顕微鏡写真を分析した結果、各微粒子はそれぞれ56.8±19.2 μm、62.5±19.3 μm、55.8±19.3 μmの平均粒子径を有する球状の粒子で、マクロファージの食細胞作用を回避するための適切なサイズを有することを確認した（図４６（a、c、e））。また、各微粒子の走査電子顕微鏡断面（図４６（b、d、f））を分析した結果、PMMA微粒子内部は複数の隔離された小さな球状空間を含んでいるため、搭載された蛍光染料の溶出を防止することができ、長期間の蛍光染料標識に非常に適した形態であることを確認した。

図４７のFlamma774-PMMA（P-188なし）微粒子分散液の蛍光スペクトルで、Flamma774-HSAに比べて4.5倍低い蛍光信号を確認することができ、Flamma774-HSA-PMMA（P-188なし）とFlamma774-HSA-PMMA（1.0％ P-188）微粒子分散液の蛍光スペクトルで、Flamma774-HSAに比べてそれぞれ1.4倍と2.3倍、Flamma774-PMMA（P-188なし）に比べてそれぞれ6.2倍と10.4倍の高い蛍光信号を確認することができた。この結果から、近赤外線蛍光染料であるFlamma774も単独で搭載する場合よりも、Flamma774-HSAの複合体形態で搭載した場合、非常に高い蛍光信号が得られることが分かる。

実施例１２：Alexa750-ヒト血清アルブミン複合体を搭載した微粒子の製造及び分析
１２-１：Alexa750溶液とAlexa750-HSA複合体の濃度による蛍光信号の比較
近赤外蛍光染料であるAlexa fluor^TM 750 carboxylic acid, tris（triethylammonium）salt（Alexa750, Thermo Fisher Scientific）0.77 mgを蒸留水1 mLに溶解した後、蒸留水で希釈して、100、70、50、40、30、20、10、5、4、3、2、1μM濃度のAlexa750溶液を製造した。Alexa750溶液と蛍光信号を比較するためのAlexa750-ヒト血清アルブミン（Human serum albumin、HSA、SKプラズマ）複合体は、0.77 mgのAlexa750粉末を0.214 mLのヒト血清アルブミン溶液（20％濃度）と0.786 mLの蒸留水の混合溶液に溶解した後、蒸留水で希釈して、100、70、50、40、30、20、10、5、4、3、2、1μM濃度のAlexa750-ヒト血清アルブミン複合体（Alexa750-HSA）を製造した。蛍光スペクトル比較のために、前記製造した溶液をそれぞれ200μLずつ分取して96ウェルプレートに入れ、多機能マイクロプレートリーダー（SPARK、Tecan Trading AG、Zurich、Switzerland）を用いて蛍光スペクトル（λ_ex＝730 nm、λ_em＝776 nm）を測定した。

1～100μM濃度のAlexa750溶液とAlexa750-HSA複合体溶液の蛍光強度を比較した図４８と同様に、全範囲の濃度でAlexa750-HSA溶液がAlexa750溶液よりもより高い蛍光信号を発生することが確認でき、Alexa750-HSA溶液がAlexa750溶液より30μＭ濃度で1.1倍、測定最大濃度である100μＭ濃度で1.1倍高い蛍光信号を発生することを確認した。

１２-２：Alexa750とAlexa750-HSA複合体を搭載したPMMA微粒子の製造および分析
近赤外線蛍光染料Alexa750を搭載したPMMA微粒子であるAlexa750-PMMA（P-188なし）を製造した。Alexa750 1.31 mgを蒸留水1.691 mLに溶解してW1溶液を製造した。ポリビニルアルコール3.6ｇを180 mLの蒸留水に添加した後、85℃の条件で600 rpmで撹拌しながら溶解し、常温まで冷却してＷ２溶液を製造した。PMMA 1.217ｇを塩化メチレン16.909 mLに加えて溶解し、オイル溶液を製造した。前記製造されたＷ１溶液をオイル溶液に添加後、探針型超音波装置で３分間（１分超音波処理＋30秒休止繰り返し）超音波処理を行い、一次エマルション（water-in-oil）を製造した。準備されたＷ２溶液を、機械式撹拌機を用いて1000 rpmで撹拌しながら、前記製造された一次エマルション溶液を、シリンジポンプを用いて10 mL／minの速度で添加して、二次エマルション（water-in-oil-in-water）を製造した。前記製造されたエマルションを10分間1000 rpmで撹拌した後、40℃の温度条件で磁気撹拌機を用いて280 rpmで21時間撹拌して塩化メチレン溶媒を除去した。その後、14,000 rpmで５分間遠心分離して、Alexa750を搭載したPMMA高分子微粒子の粒子を収得した。上澄み液を除去し、蒸留水を添加して再分散後遠心分離する過程を３回繰り返してPMMA微粒子を洗浄した。洗浄した微粒子の粒子は凍結乾燥して微粒子粉末を収得した。

近赤外線蛍光染料Alexa750-HSA複合体を搭載したPMMA微粒子であるAlexa750-HSA-PMMA（P-188なし）を製造した。Alexa750 1.31 mgをヒト血清アルブミン（HSA）0.363 mL（20％濃度、72.553 mg）と蒸留水1.328 mLに溶解してW1溶液を製造した。ポリビニルアルコール3.6ｇを180 mLの蒸留水に添加した後、85℃の条件で600 rpmで撹拌しながら溶解し、常温まで冷却してＷ２溶液を製造した。PMMA 1.217ｇを塩化メチレン16.909 mLに加えて溶解し、オイル溶液を製造した。前記製造されたＷ１溶液をオイル溶液に添加後、探針型超音波装置で３分間（１分超音波処理＋30秒休止繰り返し）超音波処理を行い、一次エマルション（water-in-oil）を製造した。準備されたＷ２溶液を、機械式撹拌機を用いて1000 rpmで撹拌しながら、前記製造された一次エマルション溶液を、シリンジポンプを用いて10 mL／minの速度で添加して、二次エマルション（water-in-oil-in-water）を製造した。前記製造されたエマルションを10分間1000 rpmで撹拌した後、40℃の温度条件で磁気撹拌機を用いて280 rpmで21時間撹拌して塩化メチレン溶媒を除去した。その後、14,000 rpmで５分間遠心分離して、Alexa750-HSAを搭載したPMMA高分子微粒子の粒子を収得した。上澄み液を除去し、蒸留水を添加して再分散後遠心分離する過程を３回繰り返してPMMA微粒子を洗浄した。洗浄した微粒子の粒子は凍結乾燥して微粒子粉末を収得した。

一次エマルション相ポロキサマー-188の濃度を1.0％で含み、近赤外線蛍光染料Alexa750-HSA複合体を搭載したPMMA微粒子であるAlexa750-HSA-PMMA（P-188 1.0％）を製造した。Alexa750 1.31 mgをヒト血清アルブミン（HSA）0.363 mL（20％濃度、72.553 mg）蒸留水1.328 mLに溶解してW1溶液を製造した。ポリビニルアルコール3.6ｇを180 mLの蒸留水に添加した後、85℃の条件で600 rpmで撹拌しながら溶解し、常温まで冷却してＷ２溶液を製造した。PMMA 1.217ｇとポロキサマー-188（P-188）186 mgを塩化メチレン16.909 mLに加えて溶解し、オイル溶液を製造した。前記製造されたＷ１溶液をオイル溶液に添加後、探針型超音波装置で３分間（１分超音波処理＋30秒休止繰り返し）超音波処理を行い、一次エマルション（water-in-oil）を製造した。準備されたＷ２溶液を、機械式撹拌機を用いて1000 rpmで撹拌しながら、前記製造された一次エマルション溶液を、シリンジポンプを用いて10 mL／minの速度で添加して、二次エマルション（water-in-oil-in-water）を製造した。前記製造されたエマルションを10分間1000 rpmで撹拌した後、40℃の温度条件で磁気撹拌機を用いて280 rpmで21時間撹拌して塩化メチレン溶媒を除去した。その後、14,000 rpmで５分間遠心分離して、Alexa750-HSAを搭載したPMMA高分子微粒子の粒子を収得した。上澄み液を除去し、蒸留水を添加して再分散後遠心分離する過程を３回繰り返してPMMA微粒子を洗浄した。洗浄した微粒子の粒子は凍結乾燥して微粒子粉末を収得した。

前記製造した微粒子内のAlexa750の含量及び搭載率評価のために、微粒子を溶かし、溶液中のAlexa750の濃度を紫外／可視光線吸光分析器を用いて定量した。

前記製造した微粒子とAlexa750-ヒト血清アルブミン複合体との蛍光信号比較のために、同濃度のAlexa750の複合体溶液と微粒子分散液を製造した。Alexa750粉末0.77mgを0.214 mLのヒト血清アルブミン溶液（20%濃度）と0.786 mLの蒸留水の混合溶液に溶解した後、蒸留水で希釈し30μM濃度のAlexa750-ヒト血清アルブミン複合体（Alexa750-HSA）0.3 mLを製造した。前記定量で評価されたPMMA微粒子内のAlexa750の含量を、情報を用いてAlexa750の濃度が30μＭとなるように、0.3 mLの蒸留水に添加して微粒子分散液を製造した。蛍光スペクトル比較のために、前記製造した溶液と微粒子分散液をそれぞれ200μLずつ分取して96ウェルプレートに入れ、多機能マイクロプレートリーダーを用いて蛍光スペクトル（λ_ex＝730 nm）を測定した。

PMMA微粒子の製造時にAlexa750を搭載して製造したAlexa750-PMMA（P-188なし）微粒子内のAlexa750の搭載率は14.1％であり、1 mgの微粒子内のAlexa750の含量が151.8 ngであることを確認した。Alexa750-HSAを搭載して製造したAlexa750-HSA-PMMA（P-188なし）微粒子内のAlexa750の搭載率は9.61%であり、1 mgの微粒子内のAlexa750の含量が97.7ngであることを確認した。１次エマルション相基準1.0％ポロキサマー-188を添加して製造したAlexa750-HSA-PMMA（1.0％P-188）微粒子内のAlexa750の搭載率は21.2％であり、１mgの微粒子内のAlexa750の含量が188.1 ngで、他の２つの微粒子よりもより高い含量のAlexa750を搭載していることを確認した。

Alexa750-PMMA（P-188なし）、Alexa750-HSA-PMMA（P-188なし）、Alexa750-HSA-PMMA（1.0％ P-188）微粒子はそれぞれ53.0±15.8μm、54.6 ±20.3μm、57.7±19.6μmの平均粒子径を有する球状の粒子として、マクロファージの食細胞作用を回避するための適切なサイズを有することを確認した。各微粒子の走査電子顕微鏡断面（図４９）を評価した結果、PMMA微粒子内部は複数の隔離された小さな球状空間を含んでいるため、搭載された蛍光染料の溶出を防止することができ、長期間の蛍光染料標識に非常に適した形態であることを確認した。

図５０のAlexa750-PMMA（P-188なし）微粒子分散液の蛍光スペクトルで、Alexa750-HSAに比べて6.5倍低い蛍光信号が確認でき、Alexa750-HSA-PMMA（P-188なし）とAlexa750-HSA -PMMA（1.0％ P-188）微粒子分散液の蛍光スペクトルで、Alexa750-HASに比べてそれぞれ2.0倍と1.9倍、Alexa750-PMMA（P-188なし）に比べて13倍と12倍の高い蛍光信号が確認できた。この結果から、近赤外線蛍光染料であるAlexa750も単独で搭載する場合よりも、Alexa750-HSAの複合体形態で搭載した場合、非常に高い蛍光信号が得られることが分かる。

実施例１３：IRDye 800CW-ヒト血清アルブミン複合体を搭載した微粒子の製造および分析
１３-１：IRDye 800CW溶液とIRDye 800CW-HSA複合体の濃度による蛍光信号の比較
近赤外蛍光染料であるIRDye（登録商標） 800CW carboxylate（IRDye 800CW、LI-COR、Inc.）0.70 mgを蒸留水1 mLに溶解した後、蒸留水で希釈して、100、70、50、40、30、20、10、5、4、3、2、1 μＭ濃度のAlexa750溶液を製造した。IRDye 800CW溶液と蛍光信号を比較するためのIRDye 800CW-ヒト血清アルブミン（Human serum albumin、HSA、SKプラズマ）複合体は、0.70 mgのIRDye 800CW粉末を0.214 mLのヒト血清アルブミン溶液（20％濃度）と0.786 mLの蒸留水の混合溶液に溶解した後、蒸留水で希釈して、100、70、50、40、30、20、10、5、4、3、2、1μM濃度のIRDye 800CW/ヒト血清アルブミン複合体（IRDye 800CW-HSA）を製造した。蛍光スペクトル比較のために、前記製造した溶液をそれぞれ200μLずつ分取して96ウェルプレートに入れ、多機能マイクロプレートリーダー（SPARK、Tecan Trading AG、Zurich、Switzerland）を用いて蛍光スペクトル（λ_ex＝730 nm、λ_em＝806 nm（IRDye 800CW）、λ_em＝810 nm（IRDye 800CW-HSA））を測定した。IRDye 800CW蛍光染料は806 nmで発光（emission）ピークを見せるが、HSAと複合体を形成した後には810 nmで発光ピークを見せた。

1～100 μM濃度のIRDye 800CW溶液とIRDye 800CW-HSA複合体溶液の蛍光強度を比較した図５１と同様に、3μM以上の濃度でIRDye 800CW-HSA溶液がIRDye 800CW溶液よりもより高い蛍光信号を発生することが確認でき、IRDye 800CW-HSA溶液がIRDye 800CW溶液より30μM濃度で1.1倍、測定最大濃度である100μM濃度で1.1倍高い蛍光信号を発生することを確認した。

１３-２：IRDye 800CWとIRDye 800CW-HSA複合体を搭載したPMMA微粒子の製造および分析
近赤外線蛍光染料のIRDye 800CWを搭載したPMMA微粒子であるIRDye 800CW-PMMA（P-188なし）を製造した。IRDye 800CW 1.19 mgを蒸留水1.691 mLに溶解してW1溶液を製造した。ポリビニルアルコール3.6ｇを180 mLの蒸留水に添加した後、85℃の条件で600 rpmで撹拌しながら溶解し、常温まで冷却してＷ２溶液を製造した。PMMA 1.217ｇを塩化メチレン16.909 mLに加えて溶解し、オイル溶液を製造した。前記製造されたＷ１溶液をオイル溶液に添加後、探針型超音波装置で３分間（１分超音波処理＋30秒休止繰り返し）超音波処理を行い、一次エマルション（water-in-oil）を製造した。準備されたＷ２溶液を、機械式撹拌機を用いて1000 rpmで撹拌しながら、前記製造された一次エマルション溶液を、シリンジポンプを用いて10 mL／minの速度で添加して、二次エマルション（water-in-oil-in-water）を製造した。前記製造されたエマルションを10分間1000 rpmで撹拌した後、40℃の温度条件で磁気撹拌機を用いて280 rpmで21時間撹拌して塩化メチレン溶媒を除去した。その後、14,000 rpmで５分間遠心分離して、IRDye 800CWを搭載したPMMA高分子微粒子の粒子を収得した。上澄み液を除去し、蒸留水を添加して再分散後遠心分離する過程を３回繰り返してPMMA微粒子を洗浄した。洗浄した微粒子の粒子は凍結乾燥して微粒子粉末を収得した。

近赤外線蛍光染料のIRDye 800CW-HSA複合体を搭載したPMMA微粒子であるIRDye 800CW-HSA-PMMA（P-188なし）を製造した。IRDye 800CW1.19 mgをヒト血清アルブミン（HSA）0.363 mL（20％濃度、72.553 mg）と蒸留水1.328 mLに溶解してＷ１溶液を製造した。ポリビニルアルコール3.6ｇを180 mLの蒸留水に添加した後、85℃の条件で600 rpmで撹拌しながら溶解し、常温まで冷却してＷ２溶液を製造した。PMMA 1.217ｇを塩化メチレン16.909 mLに加えて溶解し、オイル溶液を製造した。前記製造されたＷ１溶液をオイル溶液に添加後、探針型超音波装置で３分間（１分超音波処理＋30秒休止繰り返し）超音波処理を行い、一次エマルション（water-in-oil）を製造した。準備されたＷ２溶液を、機械式撹拌機を用いて1000 rpmで撹拌しながら、前記製造された一次エマルション溶液を、シリンジポンプを用いて10 mL／minの速度で添加して、二次エマルション（water-in-oil-in-water）を製造した。前記製造されたエマルションを10分間1000 rpmで撹拌した後、40℃の温度条件で磁気撹拌機を用いて280 rpmで21時間撹拌して塩化メチレン溶媒を除去した。その後、14,000 rpmで５分間遠心分離して、IRDye 800CW-HSAを搭載したPMMA高分子微粒子の粒子を収得した。上澄み液を除去し、蒸留水を添加して再分散後遠心分離する過程を３回繰り返してPMMA微粒子を洗浄した。洗浄した微粒子の粒子は凍結乾燥して微粒子粉末を収得した。

一次エマルション相ポロキサマー-188の濃度を1.0％で含み、近赤外線蛍光染料のIRDye 800CW-HSA複合体を搭載したPMMA微粒子であるIRDye 800CW-HSA-PMMA（P-188 1.0％）を製造した。IRDye 800CW1.19 mgをヒト血清アルブミン（HSA）0.363 mL（20％濃度、72.553 mg）と蒸留水1.328 mLに溶解してＷ１溶液を製造した。ポリビニルアルコール3.6ｇを180 mLの蒸留水に添加した後、85℃の条件で600 rpmで撹拌しながら溶解し、常温まで冷却してＷ２溶液を製造した。PMMA 1.217ｇとポロキサマー-188（P-188）186 mgを塩化メチレン16.909 mLに加えて溶解し、オイル溶液を製造した。前記製造されたＷ１溶液をオイル溶液に添加後、探針型超音波装置で３分間（１分超音波処理＋30秒休止繰り返し）超音波処理を行い、一次エマルション（water-in-oil）を製造した。準備されたＷ２溶液を、機械式撹拌機を用いて1000 rpmで撹拌しながら、前記製造された一次エマルション溶液を、シリンジポンプを用いて10 mL／minの速度で添加して、二次エマルション（water-in-oil-in-water）を製造した。前記製造されたエマルションを10分間1000 rpmで撹拌した後、40℃の温度条件で磁気撹拌機を用いて280 rpmで21時間撹拌して塩化メチレン溶媒を除去した。その後、14,000 rpmで５分間遠心分離して、IRDye 800CW-HSAを搭載したPMMA高分子微粒子の粒子を収得した。上澄み液を除去し、蒸留水を添加して再分散後遠心分離する過程を３回繰り返してPMMA微粒子を洗浄した。洗浄した微粒子の粒子は凍結乾燥して微粒子粉末を収得した。

前記製造した微粒子内のIRDye 800CWの含量及び搭載率評価のために、微粒子を溶かし、溶液中のIRDye 800CWの濃度を紫外／可視光線吸光分析器を用いて定量した。

前記製造した微粒子とIRDye 800CW-ヒト血清アルブミン複合体の蛍光信号比較のために、同濃度のAlexa750の複合体溶液と微粒子分散液を製造した。IRDye 800CW粉末0.70 mgを0.214 mLのヒト血清アルブミン溶液（20%濃度）と0.786 mLの蒸留水混合溶液に溶解した後、蒸留水で希釈して30μM濃度のIRDye 800CW-ヒト血清アルブミン複合体（IRDye 800CW-HSA）0.3 mLを製造した。前記定量で評価されたPMMA微粒子内のIRDye 800CWの含量を、情報を用いてIRDye 800CWの濃度が30μＭとなるように、0.3mLの蒸留水に添加して微粒子分散液を製造した。蛍光スペクトル比較のために、前記製造した溶液と微粒子分散液をそれぞれ200μLずつ分取して96ウェルプレートに入れ、多機能マイクロプレートリーダーを用いて蛍光スペクトル（λ_ex＝730 nm）を測定した。

PMMA微粒子の製造時にIRDye 800CWを搭載して製造したIRDye 800CW-PMMA（P-188なし）微粒子内のIRDye 800CWの搭載率は10.7%であり、1 mgの微粒子内のIRDye 800CWの含量が104.4 ngであることを確認した。IRDye 800CW-HSAを搭載して製造したIRDye 800CW-HSA-PMMA（P-188なし）微粒子と1次エマルション相基準1.0％ポロキサマー-188を添加して製造したIRDye 800CW-HSA-PMMA（1.0％ P-188）の微粒子内のIRDye 800CWの搭載率は、19.5％、19.0％であり、1 mgの微粒子内のIRDye 800CWの含量が179.6ng、152.8ngで、IRDye 800CW-PMMA（P-188なし）微粒子よりもより高い含量のIRDye 800CWを搭載していることを確認した。

IRDye 800CW-PMMA （P-188なし）、IRDye 800CW-HSA-PMMA（P-188なし）、IRDye 800CW-HSA-PMMA（1.0％ P-188）微粒子の走査電子顕微鏡写真を分析した結果、各微粒子はそれぞれ55.8±19.7 μｍ、66.6±13.8 μｍ、59.8±17.3 μｍの平均粒子径を有する球状の粒子で、マクロファージの食細胞作用を回避するための適切なサイズを有することを確認した（図５２（a、c、e））。また、各微粒子の走査電子顕微鏡断面（図５２（b、d、f））を分析した結果、PMMA微粒子内部は複数の隔離された小さな球状空間を含んでいるため、搭載された蛍光染料の溶出を防止することができ、長期間の蛍光染料標識に非常に適した形態であることを確認した。

図５３のIRDye 800CW-PMMA（P-188なし）微粒子分散液の蛍光スペクトルでIRDye 800CW-HSAに比べて6.2倍低い蛍光信号を確認することができ、IRDye 800CW-HSA-PMMA（P-188なし）と IRDye 800CW-HSA-PMMA（1.0％ P-188）微粒子分散液の蛍光スペクトルでは、IRDye 800CW-HSAに比べてそれぞれ4.0倍と3.9倍、IRDye 800CW-PMMA（P-188なし）に比べてそれぞれ25倍と24倍の高い蛍光信号を確認することができた。この結果から、近赤外線蛍光染料であるIRDye 800CWも単独で搭載する場合よりも、IRDye 800CW-HSAの複合体形態で搭載した場合、非常に高い蛍光信号が得られることが分かる。

実施例１４：PLGA微粒子の分散組成物の製造および微粒子を含むペレット形態のマーカーの製造および分析
生分解性高分子の代表例として、PLGA高分子を用いて製造した微粒子を種々の他の界面活性剤または生体適合性高分子物質に分散させ、注射投与のための分散水溶液組成物を製造した。本実施例で使用した微粒子は、ICG-HSA-PLGA（P-188 0.5％）である。微粒子の分散のために、0.5％ sodium methylcellulose（シグマアルドリッチ）/0.1％ Tween 80（シグマアルドリッチ）を注射用生理食塩水に溶解した溶液、1% Sodium Alginate（Kimica）、1% Sodium hyaluronate（MW 1M）（Lifecore biomedical）、2% soidum methylcellulose（シグマアルドリッチ）、2% poly（vinyl alcohol）（シグマアルドリッチ）、0.1％ Collagen（Collagen from calf skin, シグマアルドリッチ）、5% gelatin（Gelatin from porcine、シグマアルドリッチ）、10％ Tween 80（シグマアルドリッチ）、40％ poloxamer 188（BASF）、5％ Polyvinyl pyrrolidone（シグマアルドリッチ）溶液を製造した後、ICG-HSA-PLGA（P-188 0.5％）微粒子内のインドシアニングリーンの濃度が30μＭとなるように各溶液に微粒子を分散した。

固体形態の病変標識用製剤を製造するために、乾燥されたペレット形態のマーカーを製造した。このために、１％ sodium hyaluronateおよび５％ gelatin水溶液に分散した微粒子を円筒型の枠に移し、液体窒素を用いて急冷し凍結乾燥して固体ペレット形態の蛍光マーカーを製造した。

微粒子を種々の他の界面活性剤及び生体適合性高分子物質に分散させた組成物を製造した結果を図５４に示した。ICG-HSA-PLGA（P-188 0.5％）微粒子が使用された全ての組成物溶液に均一に分散されていることを確認した。

また、図５５により、１％ sodium hyaluronateおよび５％ gelatin溶液に分散した微粒子を用いて製造した固体ペレットの形態の蛍光マーカーが製造可能であることが確認できる。

実施例１５：PMMA微粒子の分散組成物の製造および微粒子を含むペレット形態のマーカーの製造および分析
非生分解性高分子の代表例として、PMMA高分子を用いて製造した微粒子を種々の他の界面活性剤または生体適合性高分子物質に分散させ、注射投与のための分散水溶液組成物を製造した。本実施例で使用した微粒子はICG-HSA-PMMA（P-188 1.0％）微粒子である。

微粒子の分散のために、0.5％ sodium methylcellulose（シグマアルドリッチ）/0.1％ Tween 80（シグマアルドリッチ）を注射用生理食塩水に溶解した溶液、1% Sodium Alginate、1% Sodium hyaluronate、2% soidum methylcellulose、2% poly（vinyl alcohol）、0.1％ Collagen、5% gelatin、10% Tween 80、40% poloxamer 188、5% Polyvinyl pyrrolidone溶液を製造した後、ICG-HSA-PMMA（P-188 1.0％）微粒子内のインドシアニングリーンの濃度が30μＭとなるように、各溶液に微粒子を分散した。

固体形態の病変標識用製剤を製造するために、乾燥されたペレット形態のマーカーを製造した。このために、1% アルギン酸ナトリウムおよび1%ヒアルロン酸ナトリウム、2% メチルセルロースナトリウム、2% ポリ（ビニルアルコール）、5% ゼラチン、40% ポロキサマー-188、5% ポリビニルピロリドン水溶液に分散した微粒子を円筒型の枠に移し、液体窒素を用いて急冷し凍結乾燥して固体ペレット形態の蛍光マーカーを製造した。

分散した結果、図５６と同様に、ICG-HSA-PMMA（P-188 1.0％）微粒子を種々の他の界面活性剤及び生体適合性高分子物質に分散させた組成物を製造した結果、ICG-HSA-PMMA（P-188 1.0％）微粒子が使用された全ての組成物溶液に均一に分散していることを確認した。

また、図５７の結果によれば、1％アルギン酸ナトリウムおよび1％ヒアルロン酸ナトリウム、2％メチルセルロースナトリウム、2％ポリ（ビニルアルコール）、5％ゼラチン、40％ポロキサマー-188、5％ポリビニルピロリドン溶液に分散した微粒子を用いて製造した固体ペレット形態の蛍光マーカーが製造可能であることが確認できた。

実施例１６：微粒子がコーティングされた金属クリップ形態の近赤外線蛍光マーカーの製造および分析
本実施例では、金属及び非金属材料の表面に蛍光染料を搭載した微粒子をコーティングすることにより、金属及び非金属材料を用いた蛍光マーカーの製造が可能であることを見せようとした。このために、PMMA高分子を用いて製造した微粒子であるIRDye 800CW-HSA-PMMA（P-188なし）微粒子をラテックス溶液に分散させた後、クリップ表面にコーティングし乾燥して、蛍光染料搭載微粒子がコーティングされた金属クリップを製造した。

IRDye 800CW-HSA-PMMA（P-188なし）微粒子が分散したコーティング液製造のために、微粒子の濃度が135.03 mg/mLとなるように、ラテックス溶液（Acrylonitrile-Butadinene Copolymer 36%, water 64%）に分散させてコーティング溶液を製造した。その後、コーティング溶液２μLを金属クリップの両方の表面に均一にコーティングした。溶液を金属クリップ表面にコーティングした後、常温で24時間乾燥させ、その後100℃で30分間熱処理することによって、IRDye 800CW-HSA-PMMA（P-188なし）微粒子がコーティングされた蛍光マーカー機能が可能な金属クリップを製造した。

IRDye 800CW-HSA-PMMA（P-188なし）微粒子コーティング金属クリップの蛍光マーカーとしての効能を評価するために、IRDye 800CW-HSA-PMMA（P-188なし）微粒子がコーティングされた蛍光クリップの片面を切断し、コーティング面を上向きにして蛍光画像を撮影した（λ_ex＝780／20 nm、λ_em＝845／40 nm）。

図５８の写真に示すように、微粒子は金属クリップの表面に均一にコーティングされたことが確認できた。

微粒子がコーティングされた金属クリップの蛍光画像から分析されたROI（Region of interest）値は4.92×10⁵ であり、同濃度のICG-HSA複合体に比べてより強い蛍光信号を発生することを確認した。図５８及び５９の結果から、近赤外線蛍光染料を搭載した微粒子を金属クリップ等にコーティングすることにより、様々な形態の蛍光マーカーの製造が可能であることが確認できた。

以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者は、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく他の具体的な形態で実施できることを理解するだろう。これに関連して、以上で記述した実施例はすべての面で例示的なものであり、限定的なものではないことを理解すべきである。本発明の範囲は、前記詳細な説明よりは後述する特許請求の範囲の意味および範囲、そしてその等価概念から導出されるすべての変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれることと解釈されるべきである。

Claims

病変標識のための近赤外線蛍光染料を搭載した高分子微粒子であって、
当該高分子微粒子内に１つ以上の空洞を含み、
当該高分子微粒子の粒子径が20μｍ以上であり、
前記近赤外線蛍光染料はヒト血清アルブミンまたはシクロデキストリンと複合体を形成し、
前記複合体は前記空洞に搭載される、病変の標識のための高分子微粒子。
前記近赤外線蛍光染料は、インドシアニングリーン、IRDye 800CWカルボキシレート（IRDye 800CW）、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、Alexa Fluor 780、Flamma 749、Flamma 774、Flamma 800、FSD Fluor^TM 647、FSD Fluor^TM 680、FSD Fluor^TM 750、FSD Fluor^TM 800、スルホシアニン 5 カルボキシル酸（Cy5）、スルホシアニン 5.5 カルボキシル酸（Cy5.5）、スルホシアニン 7 カルボキシル酸（Cy7）、またはスルホシアニン 7.5 カルボキシル酸（Cy7.5）から選択されるいずれかである、請求項１に記載の高分子微粒子。
前記高分子が、ポリ（ラクチド-コ-グリコリド）（PLGA）、ポリ（ＤＬ-ラクチド-コ-グリコリド）（PDLGA）、ポリ（グリコール酸）（PGA）、ポリ（ラクチド）（PLA）、ポリ(ヒドロキシブチレート)、ポリカプロラクトン（PCL）、ポリジオキサノン（PDO）、ポリ（アミノ酸）、ポリアンヒドリド、ポリオルトエステル、またはポリホスファゼンである、請求項１に記載の高分子微粒子。
前記高分子とポリ（エチレンオキシド）（PEG）のブロック共重合体を含む、請求項３に記載の高分子微粒子。
前記高分子は、ポリ（メチルメタクリレート）（PMMA）またはポリカーボネート（PC）である、請求項１に記載の高分子微粒子。
前記微粒子は、アルギン酸またはヒアルロン酸をさらに含む、請求項１に記載の高分子微粒子。
前記微粒子は、界面活性剤をさらに含む、請求項１に記載の高分子微粒子。
前記界面活性剤は、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、Labrafil、Labrasol、ミディアムチェーントリグリセリド（Medium chain triglyceride）、レシチン（Lecitin）、N-メチルピロリドン（N-methyl pyrrolidone）、ポリビニルピロリドン（Polyvinyl pyrrolidone）、ヒドロプロピルメチルセルロース（Hydropropyl methylcellulose）、Poloxamer、またはTweenから選択されるいずれかである、請求項７に記載の高分子微粒子。
前記微粒子は、金属または非金属材料の表面上にコーティングするためのものである、請求項１に記載の高分子微粒子。
前記コーティングは、接着剤（adhesives）またはゴム剤によって行われるものである、請求項９に記載の高分子微粒子。
近赤外線蛍光染料とヒト血清アルブミン、または近赤外線蛍光染料とシクロデキストリンの複合体を形成する段階；および、water-in-oil-in-water（Ｗ1／Ｏ／Ｗ2）エマルション方法を用いて前記複合体を、粒子径が20μｍ以上である、１つ以上の空洞を含む高分子微粒子の空洞に搭載する段階を含む、病変の標識のための高分子微粒子の製造方法。
前記近赤外線蛍光染料をヒドロゲル高分子と混合して高分子微粒子内に搭載する段階をさらに含む、請求項１１に記載の病変の標識のための高分子微粒子の製造方法。
請求項１～１０のいずれか一項の高分子微粒子を含む、病変の標識のための組成物。
前記微粒子は、メチルセルロース、アルギン酸、ヒアルロン酸、ポリビニルアルコール、コラーゲン、ゼラチン、Tween、Poloxamer、またはポリビニルピロリドンと混合されているものである、請求項１３に記載の病変の標識のための組成物。
前記組成物は、注射器を介して注入が可能なものである、請求項１４に記載の病変の標識のための組成物。
前記組成物は、固体ペレット形状である、請求項１３に記載の病変の標識のための組成物。