JP7841789B2 - 高濃度細胞保存液及び高濃度細胞保存方法 - Google Patents
高濃度細胞保存液及び高濃度細胞保存方法Info
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Description
本発明は、高濃度細胞保存液及び高濃度細胞保存方法に係り、特に細胞を凍結しない状態で保存するための高濃度細胞保存液及び高濃度細胞保存方法に関するものである。
近年、患者から採取した細胞を利用した再生医療が行われている。
患者に細胞医薬品（細胞製剤）を直接投与する場合には、患者の負担を軽減すべく、高い細胞濃度で調製された細胞製剤を用いることが好ましい。しかしながら、高い細胞濃度で細胞を保存すると細胞生存率が下がってしまうという問題がある。
そのため、現状の細胞治療では、高濃度の細胞製剤を調製した後、速やかに患者に投与する必要があって、高度な細胞加工施設をもつ大学病院などで細胞製剤による治療を受ける必要がある。
患者に細胞医薬品（細胞製剤）を直接投与する場合には、患者の負担を軽減すべく、高い細胞濃度で調製された細胞製剤を用いることが好ましい。しかしながら、高い細胞濃度で細胞を保存すると細胞生存率が下がってしまうという問題がある。
そのため、現状の細胞治療では、高濃度の細胞製剤を調製した後、速やかに患者に投与する必要があって、高度な細胞加工施設をもつ大学病院などで細胞製剤による治療を受ける必要がある。
特許文献１には、細胞を非凍結状態で保存する液体組成物の発明が開示されているところ、当該液体組成物では高い細胞濃度で細胞を保存することは想定されていない。
また、特許文献２には、幹細胞を凍結状態で保存する凍結保存液の発明が開示されており、例えば幹細胞を１×１０４～１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞濃度で保存することが開示されている。しかしながら、あくまで細胞を凍結状態で保存する細胞保存液であるため、解凍操作が別途必要となり、凍結融解の際には生細胞数の残存率が下がってしまう。そのため、細胞を凍結しない状態で保存できることが好ましい。
また、特許文献２には、幹細胞を凍結状態で保存する凍結保存液の発明が開示されており、例えば幹細胞を１×１０４～１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞濃度で保存することが開示されている。しかしながら、あくまで細胞を凍結状態で保存する細胞保存液であるため、解凍操作が別途必要となり、凍結融解の際には生細胞数の残存率が下がってしまう。そのため、細胞を凍結しない状態で保存できることが好ましい。
例えば、細胞を高い細胞濃度で保存でき、また高い生存率で維持できる細胞保存液があれば、細胞加工施設をもつ大学病院での細胞治療に限られず、細胞加工施設から離れた医療機関であっても細胞治療を行うことが可能となる。なお、非凍結状態の細胞医薬品（細胞製剤）を市場に導入する場合には、交通事情や患者の事情等を考慮して、細胞を７２時間以上保存することが可能な細胞保存液であると好ましい。
そのほか、細胞治療用途に限られず、上記のような細胞保存液であれば、研究用試薬その他の用途に広く用いることができ、有益なものとなる。
そのほか、細胞治療用途に限られず、上記のような細胞保存液であれば、研究用試薬その他の用途に広く用いることができ、有益なものとなる。
本発明の目的は、新規な高濃度細胞保存液及び高濃度細胞保存方法を提供することにある。
本発明の他の目的は、細胞を凍結しない状態で高い細胞濃度で保存でき、また高い生存率で維持できる高濃度細胞保存液及び高濃度細胞保存方法を提供することにある。
本発明の他の目的は、細胞を凍結しない状態で高い細胞濃度で保存でき、また高い生存率で維持できる高濃度細胞保存液及び高濃度細胞保存方法を提供することにある。
本発明者らは、鋭意研究した結果、細胞を凍結しない状態で高い細胞濃度で保存でき、また高い生存率で維持できる細胞保存液を製造することが可能であることを明らかにして、本発明を完成するに至った。
具体的には、主として基礎培地と、基礎培地に添加される添加剤との好適な組み合わせを鋭意研究した結果、細胞を凍結しない状態であっても、細胞を少なくとも１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞濃度で保存できる細胞保存液を製造可能であることを明らかにした。例えば、当該細胞保存液に細胞を懸濁し、細胞を１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞濃度で４℃で保存したときに、７２時間経過後における細胞生存率が８０％以上であることを明らかにした。また、医薬的に移植可能な成分で製造できることを明らかにした。
具体的には、主として基礎培地と、基礎培地に添加される添加剤との好適な組み合わせを鋭意研究した結果、細胞を凍結しない状態であっても、細胞を少なくとも１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞濃度で保存できる細胞保存液を製造可能であることを明らかにした。例えば、当該細胞保存液に細胞を懸濁し、細胞を１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞濃度で４℃で保存したときに、７２時間経過後における細胞生存率が８０％以上であることを明らかにした。また、医薬的に移植可能な成分で製造できることを明らかにした。
従って、前記課題は、本発明の高濃度細胞保存液によれば、細胞を凍結しない状態で保存する細胞保存液であって、基礎培地と、前記基礎培地に添加される添加剤と、を含有し、前記基礎培地は、細胞培養に用いられる培地であって、前記添加剤は、遺伝子組み換えアルブミンと、アスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導体と、を少なくとも含み、前記細胞を少なくとも１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞濃度で保存し、前記細胞を１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞濃度で４℃で保存したときに、７２時間経過後における細胞生存率が８０％以上であって、前記細胞が機能を維持した状態であって、細胞傷害がみられない状態で前記細胞が保存され、前記細胞は、ヒト由来の体細胞又はヒト由来の幹細胞であり、前記基礎培地は、ＲＰＭＩ１６４０及びＤＭＥＭからなる群より選択される少なくとも１種類の培地であり、前記遺伝子組み換えアルブミンの濃度が０．１～２．０（ｗ／ｖ）％であって、前記アスコルビン酸又は前記アスコルビン酸誘導体の濃度が０．１～１０ｍｇ／ｍＬであること、により解決される。
上記構成により、細胞を凍結しない状態で高い細胞濃度で保存でき、また高い生存率で維持できる高濃度細胞保存液及び高濃度細胞保存方法を実現できる。
上記構成により、細胞を凍結しない状態で高い細胞濃度で保存でき、また高い生存率で維持できる高濃度細胞保存液及び高濃度細胞保存方法を実現できる。
このとき、前記遺伝子組み換えアルブミンは、遺伝子組み換えヒト血清アルブミンであって、前記細胞保存液は、細胞移植に用いられると良い。
また、前記細胞を１×１０８～１×１０９ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞濃度で保存すると良い。
また、前記細胞を１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞濃度で４℃で保存したときに、７２時間経過後における細胞生存率が８０％以上であると良い。より好ましくは、１７０時間経過後における細胞生存率が８０％以上であると良い。
上記構成により、細胞を凍結しない状態でより高い細胞濃度で保存でき、より高い生存率で維持できる高濃度細胞保存液を実現できる。特に、患者に細胞製剤を直接移植するにあたって、患者の負担を軽減し、好適に細胞治療を行うことが可能な細胞保存液を提供できる。
また、前記細胞を１×１０８～１×１０９ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞濃度で保存すると良い。
また、前記細胞を１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞濃度で４℃で保存したときに、７２時間経過後における細胞生存率が８０％以上であると良い。より好ましくは、１７０時間経過後における細胞生存率が８０％以上であると良い。
上記構成により、細胞を凍結しない状態でより高い細胞濃度で保存でき、より高い生存率で維持できる高濃度細胞保存液を実現できる。特に、患者に細胞製剤を直接移植するにあたって、患者の負担を軽減し、好適に細胞治療を行うことが可能な細胞保存液を提供できる。
また前記課題は、本発明の高濃度細胞保存方法によれば細胞保存液に細胞を懸濁し、前記細胞を凍結しない状態で少なくとも１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞濃度で保存する方法であって、前記細胞保存液は、基礎培地と、前記基礎培地に添加される添加剤と、を含有し、前記基礎培地は、細胞培養に用いられる培地であって、前記添加剤は、遺伝子組み換えアルブミンと、アスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導体と、を少なくとも含み、前記細胞を１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞濃度で４℃で保存したときに、７２時間経過後における細胞生存率が８０％以上であって、前記細胞が機能を維持した状態であって、細胞傷害がみられない状態で前記細胞が保存され、前記細胞は、ヒト由来の体細胞又はヒト由来の幹細胞であり、前記基礎培地は、ＲＰＭＩ１６４０及びＤＭＥＭからなる群より選択される少なくとも１種類の培地であり、前記遺伝子組み換えアルブミンの濃度が０．１～２．０（ｗ／ｖ）％であって、前記アスコルビン酸又は前記アスコルビン酸誘導体の濃度が０．１～１０ｍｇ／ｍＬであることによっても解決される。
本発明の高濃度細胞保存液及び高濃度細胞保存方法によれば、細胞を凍結しない状態で高い細胞濃度で保存し、また高い生存率で維持することが可能となる。
以下、本発明の実施形態について、図１～図９を参照しながら説明する。
本実施形態は、細胞を凍結しない状態で高い細胞濃度で保存し、また高い生存率で維持することを可能とする「高濃度細胞保存液」に関する。また、「高濃度細胞保存方法」に関する。
本実施形態は、細胞を凍結しない状態で高い細胞濃度で保存し、また高い生存率で維持することを可能とする「高濃度細胞保存液」に関する。また、「高濃度細胞保存方法」に関する。
＜細胞保存液の概要＞
「細胞保存液」とは、細胞を保存するための液体組成物であって、細胞治療（遺伝子治療）を行うために細胞を保存しておくものである。本実施形態では、細胞を凍結しない状態（非凍結状態）で保存する液体組成物である。
「非凍結状態」とは、１～２０℃の状態であること、好ましくは１～１５℃、より好ましくは１～１０℃、より好ましくは１～５℃、より好ましくは４℃の状態である。
なお、本実施形態の細胞保存液は、細胞製剤として利用するものに限られず、研究用試薬その他の用途に広く用いることができる。
「細胞保存液」とは、細胞を保存するための液体組成物であって、細胞治療（遺伝子治療）を行うために細胞を保存しておくものである。本実施形態では、細胞を凍結しない状態（非凍結状態）で保存する液体組成物である。
「非凍結状態」とは、１～２０℃の状態であること、好ましくは１～１５℃、より好ましくは１～１０℃、より好ましくは１～５℃、より好ましくは４℃の状態である。
なお、本実施形態の細胞保存液は、細胞製剤として利用するものに限られず、研究用試薬その他の用途に広く用いることができる。
「高濃度細胞保存液」とは、細胞を高い細胞濃度で保存する細胞保存液である。
例えば、細胞を少なくとも１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ（１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上）の細胞濃度で保存するもの、好ましくは５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、より好ましくは１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上の細胞濃度で保存するものである。あるいは、細胞を１×１０７～１×１０９ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、より好ましくは５×１０７～１×１０９ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、より好ましくは１×１０８～１×１０９ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、より好ましくは１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞濃度で保存するものである。
細胞を１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上（好ましくは１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上）の細胞濃度で保存（非凍結保存）することで、患者に細胞製剤（非凍結細胞製剤）を直接移植する際に移植容量を減らし、患者の負担を低くできる。
また、細胞を１×１０９ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下の細胞濃度で保存することで、高い細胞生存率を維持することができる。
例えば、細胞を少なくとも１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ（１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上）の細胞濃度で保存するもの、好ましくは５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、より好ましくは１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上の細胞濃度で保存するものである。あるいは、細胞を１×１０７～１×１０９ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、より好ましくは５×１０７～１×１０９ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、より好ましくは１×１０８～１×１０９ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、より好ましくは１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞濃度で保存するものである。
細胞を１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上（好ましくは１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上）の細胞濃度で保存（非凍結保存）することで、患者に細胞製剤（非凍結細胞製剤）を直接移植する際に移植容量を減らし、患者の負担を低くできる。
また、細胞を１×１０９ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下の細胞濃度で保存することで、高い細胞生存率を維持することができる。
「高い細胞生存率」とは、細胞を１×１０７～１×１０９ｃｅｌｌｓ／ｍＬ（好ましくは１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）の細胞濃度で４℃で保存したときに、７２時間経過後における細胞生存率が７０％以上、好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上であると良い。あるいは、上記細胞濃度で４℃で保存したときに、９６時間経過後における細胞生存率が７０％以上、好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上であると良い。
あるいは、上記細胞濃度で４℃で保存したときに、１２０時間経過後における細胞生存率が７０％以上、好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上であると良い。
あるいは、上記細胞濃度で４℃で保存したときに、１７０時間経過後における細胞生存率が７０％以上、好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上であると良い。あるいは、１４４時間経過後、１６８時間経過後における細胞生存率についても上記と同様であると良い。
「細胞生存率」は、後述の試験例１で用いられた方法で算出されると良い。
なお、非凍結状態の細胞製剤として市場に導入する場合には、全国の医療機関に輸送することを目的とし、細胞を７２時間以上保存できる細胞保存液であると良い。そして、患者に直接移植できる成分で構成されると良い。
あるいは、上記細胞濃度で４℃で保存したときに、１２０時間経過後における細胞生存率が７０％以上、好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上であると良い。
あるいは、上記細胞濃度で４℃で保存したときに、１７０時間経過後における細胞生存率が７０％以上、好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上であると良い。あるいは、１４４時間経過後、１６８時間経過後における細胞生存率についても上記と同様であると良い。
「細胞生存率」は、後述の試験例１で用いられた方法で算出されると良い。
なお、非凍結状態の細胞製剤として市場に導入する場合には、全国の医療機関に輸送することを目的とし、細胞を７２時間以上保存できる細胞保存液であると良い。そして、患者に直接移植できる成分で構成されると良い。
細胞保存液によって保存される「細胞」は、特に限定されず、種々の細胞を採用することができる。例えば、体細胞、幹細胞などが挙げられる。
「体細胞」としては、線維芽細胞、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、好中球、赤血球、血小板、マクロファージ、単球、骨細胞、周皮細胞、樹状細胞、ケラチノサイト、脂肪細胞、上皮細胞、表皮細胞、内皮細胞、血管内皮細胞、肝実質細胞、軟骨細胞、卵丘細胞、神経細胞（ニューロン）、グリア細胞（オリゴデンドロサイト、ミクログリア、アストロサイト）、心筋細胞、筋細胞、膵臓ベータ細胞、メラニン細胞及び造血前駆細胞などが含まれる。好ましくは、脂肪細胞であると良く、より好ましくは前脂肪細胞（初代培養によって採取できる、増殖性を獲得した脂肪細胞）であると良く、より好ましくは哺乳動物由来の前脂肪細胞であると良く、より好ましくはヒト由来の前脂肪細胞であると良い。脂肪細胞（前脂肪細胞）であれば、細胞製剤の投与にあたって投与制限や年齢制限がなく、腫瘍化リスクが低く、細胞治療に好適である。これら体細胞は、遺伝子治療を目的とした外来遺伝子がそのゲノムＤＮＡに組み込まれたものであっても良い。
「幹細胞」としては、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性腫瘍細胞、胚性生殖幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、筋幹細胞、生殖幹細胞、腸幹細胞、癌幹細胞、毛包幹細胞などが含まれる。好ましくは間葉系幹細胞であると良く、より好ましくはヒト由来の間葉系幹細胞であると良い。これら幹細胞は、遺伝子治療を目的とした外来遺伝子がそのゲノムＤＮＡに組み込まれたものであっても良い。
「体細胞」としては、線維芽細胞、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、好中球、赤血球、血小板、マクロファージ、単球、骨細胞、周皮細胞、樹状細胞、ケラチノサイト、脂肪細胞、上皮細胞、表皮細胞、内皮細胞、血管内皮細胞、肝実質細胞、軟骨細胞、卵丘細胞、神経細胞（ニューロン）、グリア細胞（オリゴデンドロサイト、ミクログリア、アストロサイト）、心筋細胞、筋細胞、膵臓ベータ細胞、メラニン細胞及び造血前駆細胞などが含まれる。好ましくは、脂肪細胞であると良く、より好ましくは前脂肪細胞（初代培養によって採取できる、増殖性を獲得した脂肪細胞）であると良く、より好ましくは哺乳動物由来の前脂肪細胞であると良く、より好ましくはヒト由来の前脂肪細胞であると良い。脂肪細胞（前脂肪細胞）であれば、細胞製剤の投与にあたって投与制限や年齢制限がなく、腫瘍化リスクが低く、細胞治療に好適である。これら体細胞は、遺伝子治療を目的とした外来遺伝子がそのゲノムＤＮＡに組み込まれたものであっても良い。
「幹細胞」としては、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性腫瘍細胞、胚性生殖幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、筋幹細胞、生殖幹細胞、腸幹細胞、癌幹細胞、毛包幹細胞などが含まれる。好ましくは間葉系幹細胞であると良く、より好ましくはヒト由来の間葉系幹細胞であると良い。これら幹細胞は、遺伝子治療を目的とした外来遺伝子がそのゲノムＤＮＡに組み込まれたものであっても良い。
＜細胞保存液の構成＞
高濃度細胞保存液は、基礎培地と、基礎培地に添加される添加剤と、を含有するものである。
主として基礎培地と添加剤の組み合わせによって、細胞を凍結しない状態であっても、高濃度の細胞で高い生存率を維持したまま保存できる細胞保存液を製造することができる。
高濃度細胞保存液は、基礎培地と、基礎培地に添加される添加剤と、を含有するものである。
主として基礎培地と添加剤の組み合わせによって、細胞を凍結しない状態であっても、高濃度の細胞で高い生存率を維持したまま保存できる細胞保存液を製造することができる。
（基礎培地）
「基礎培地」は、細胞培養に用いられる培地であって、液体培地であると良い。すなわち、基礎培地として、従来のリンゲル液（乳酸リンゲル液）や生理食塩液のような緩衝塩類溶液は用いられない。
「基礎培地」としては、ＲＰＭＩ１６４０（Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ １６４０）、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）、αＭＥＭ、ＥＭＥＭ、及びＦ－１２（Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ－１２ Ｍｅｄｉｕｍ）からなる群より選択される少なくとも１種類の培養用培地であると良い。好ましくは、ＲＰＭＩ１６４０、ＤＭＥＭであると良く、より好ましくはＲＰＭＩ１６４０であると良い。
基礎培地にこれらの培地を採用することで、細胞の生存に必要なアミノ酸やビタミン類などが含有されるため、高い細胞濃度で細胞を所定時間保存できることが確認されている。特に、ＲＰＭＩ１６４０、ＤＭＥＭを採用することで、適切な代謝状態が維持され、細胞の保存性が向上する。特に、ＲＰＭＩ１６４０を採用することで、抗酸化作用を持つグルタチオンが含有されていることにより、さらに細胞の保存性が向上する。
「基礎培地」は、細胞培養に用いられる培地であって、液体培地であると良い。すなわち、基礎培地として、従来のリンゲル液（乳酸リンゲル液）や生理食塩液のような緩衝塩類溶液は用いられない。
「基礎培地」としては、ＲＰＭＩ１６４０（Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ １６４０）、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）、αＭＥＭ、ＥＭＥＭ、及びＦ－１２（Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ－１２ Ｍｅｄｉｕｍ）からなる群より選択される少なくとも１種類の培養用培地であると良い。好ましくは、ＲＰＭＩ１６４０、ＤＭＥＭであると良く、より好ましくはＲＰＭＩ１６４０であると良い。
基礎培地にこれらの培地を採用することで、細胞の生存に必要なアミノ酸やビタミン類などが含有されるため、高い細胞濃度で細胞を所定時間保存できることが確認されている。特に、ＲＰＭＩ１６４０、ＤＭＥＭを採用することで、適切な代謝状態が維持され、細胞の保存性が向上する。特に、ＲＰＭＩ１６４０を採用することで、抗酸化作用を持つグルタチオンが含有されていることにより、さらに細胞の保存性が向上する。
基礎培地としてＲＰＭＩ１６４０を用いた場合には、好ましくはＲＰＭＩ１６４０（Ｌ－グルタミン含有）であると良い。
基礎培地としてＤＭＥＭを用いた場合には、好ましくは低グルコース含有ＤＭＥＭであると良い。
基礎培地としてＤＭＥＭを用いた場合には、好ましくは低グルコース含有ＤＭＥＭであると良い。
なお、上記細胞培養に用いられる培地は、「緩衝塩類溶液」に培地の必須成分が含まれたものであっても良い。培地の必須成分とは、例えば「アミノ酸」、「ビタミン類」、「その他の成分」である。
「緩衝塩類溶液」としては、リンゲル液、乳酸リンゲル液、酢酸リンゲル液、生理食塩水、ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）及びダルベッコリン酸緩衝液などが含まれる。
「アミノ酸」としては、Ｌ－アラニン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－システイン、Ｌ－シスチン、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－グルタミン、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－ヒドロキシプロリン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン及びＬ－バリン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－ロイシンなどが含まれる。
「ビタミン類」としては、アスコルビン酸（アスコルビン酸誘導体）のほか、イノシトール、ビオチン、パントテン酸、コリン、葉酸、ナイアシン、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、ビタミンＢ１２などが含まれる。
「その他の成分」としては、糖、還元型グルタチオン、ナトリウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩やカリウム塩以外の無機塩、抗生物質、血清及び脂肪酸などが含まれる。
上記の「アミノ酸」「ビタミン類」「その他の添加物」は、添加剤として適宜添加されても良い。
「緩衝塩類溶液」としては、リンゲル液、乳酸リンゲル液、酢酸リンゲル液、生理食塩水、ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）及びダルベッコリン酸緩衝液などが含まれる。
「アミノ酸」としては、Ｌ－アラニン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－システイン、Ｌ－シスチン、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－グルタミン、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－ヒドロキシプロリン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン及びＬ－バリン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－ロイシンなどが含まれる。
「ビタミン類」としては、アスコルビン酸（アスコルビン酸誘導体）のほか、イノシトール、ビオチン、パントテン酸、コリン、葉酸、ナイアシン、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、ビタミンＢ１２などが含まれる。
「その他の成分」としては、糖、還元型グルタチオン、ナトリウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩やカリウム塩以外の無機塩、抗生物質、血清及び脂肪酸などが含まれる。
上記の「アミノ酸」「ビタミン類」「その他の添加物」は、添加剤として適宜添加されても良い。
基礎培地は、高濃度細胞保存液の全量に対して５０（ｖ／ｖ）％以上含有されるように調製されると良く、好ましくは７０（ｖ／ｖ）％以上、より好ましくは８０（ｖ／ｖ）％以上含有されるように調製されると良い。
「添加剤」は、基礎培地に添加されることで細胞の生存率を保持する機能を有する。
主要な「添加剤」として、遺伝子組み換えアルブミンと、アスコルビン酸とが基礎培地に添加されると良い。
主要な「添加剤」として、遺伝子組み換えアルブミンと、アスコルビン酸とが基礎培地に添加されると良い。
（遺伝子組み換えアルブミン）
アルブミンは、抗酸化作用、細胞同士の凝集の阻害、また基礎培地中の栄養成分の細胞への輸送の役割を有する。さらに、細胞が保存容器に吸着することを阻害し、細胞の利用が困難になることを抑制できる。
アルブミンについて血液から抽出することが可能であるが、不要な不純物も多く含まれる。遺伝子組み換えアルブミンは、遺伝子組み換え技術により製造されたアルブミンであり、不純物や外来因子の含量が極めて少ないものである。
添加するアルブミンは、遺伝子組み換えアルブミンが好ましく、さらに好ましくは遺伝子組み換えヒト血清アルブミン（ｒＨＡ）であると良い。
遺伝子組み換えアルブミンは、遺伝子組み換え技術により製造されたアルブミンであって、異種由来成分が除去されたものである。
なお、遺伝子組み換えアルブミンの代わりに、遺伝子組み換えタンパクが基礎培地に添加されても良い。この場合には、アルブミンのように分子量２万～１０万のタンパク（低分子量のタンパク）が用いられると良い。
アルブミンは、抗酸化作用、細胞同士の凝集の阻害、また基礎培地中の栄養成分の細胞への輸送の役割を有する。さらに、細胞が保存容器に吸着することを阻害し、細胞の利用が困難になることを抑制できる。
アルブミンについて血液から抽出することが可能であるが、不要な不純物も多く含まれる。遺伝子組み換えアルブミンは、遺伝子組み換え技術により製造されたアルブミンであり、不純物や外来因子の含量が極めて少ないものである。
添加するアルブミンは、遺伝子組み換えアルブミンが好ましく、さらに好ましくは遺伝子組み換えヒト血清アルブミン（ｒＨＡ）であると良い。
遺伝子組み換えアルブミンは、遺伝子組み換え技術により製造されたアルブミンであって、異種由来成分が除去されたものである。
なお、遺伝子組み換えアルブミンの代わりに、遺伝子組み換えタンパクが基礎培地に添加されても良い。この場合には、アルブミンのように分子量２万～１０万のタンパク（低分子量のタンパク）が用いられると良い。
遺伝子組み換えアルブミンは、高濃度細胞保存液の全量に対して０．０１～２０（ｗ／ｖ）％含有されるように調製されると良く、好ましくは０．０１～１０（ｗ／v）％、より好ましくは０．０１～５．０（ｗ／ｖ）％、より好ましくは０．１～２．０（ｗ／ｖ）％含有されるように調製されると良い。
０．０１（ｗ／ｖ）％未満であると、生存率の低下が確認されている。また、２０（ｗ／ｖ）％を超えると、高濃度細胞保存液の粘度が高まるため、著しく操作性が低下する。
０．０１（ｗ／ｖ）％未満であると、生存率の低下が確認されている。また、２０（ｗ／ｖ）％を超えると、高濃度細胞保存液の粘度が高まるため、著しく操作性が低下する。
（アスコルビン酸、アスコルビン酸誘導体）
アスコルビン酸は、抗酸化作用を有し、細胞の生存維持に機能する。アスコルビン酸誘導体は、同様に抗酸化作用を有する。好ましくは、アスコルビン酸を用いると良い。
アスコルビン酸誘導体としては、アスコルビン酸ナトリウム、アスコルビルリン酸ナトリウム、リン酸アスコルビルマグネシウム、アスコルビルグルコシド、グリセリルアスコルビン酸、ビスグリセリルアスコルビン酸、Ｌアスコルビン酸パルミチン酸エステル、テトラへキシルデカン酸アスコルビル、アスコルビン酸２リン酸などが含まれる。
基礎培地にこれら添加剤を添加することで、高い細胞濃度で細胞を所定時間保存できることが確認されている。特に、遺伝子組み換えアルブミン及びアスコルビン酸を両方添加することで、より高い細胞濃度で細胞を所定時間保存できる。
アスコルビン酸は、抗酸化作用を有し、細胞の生存維持に機能する。アスコルビン酸誘導体は、同様に抗酸化作用を有する。好ましくは、アスコルビン酸を用いると良い。
アスコルビン酸誘導体としては、アスコルビン酸ナトリウム、アスコルビルリン酸ナトリウム、リン酸アスコルビルマグネシウム、アスコルビルグルコシド、グリセリルアスコルビン酸、ビスグリセリルアスコルビン酸、Ｌアスコルビン酸パルミチン酸エステル、テトラへキシルデカン酸アスコルビル、アスコルビン酸２リン酸などが含まれる。
基礎培地にこれら添加剤を添加することで、高い細胞濃度で細胞を所定時間保存できることが確認されている。特に、遺伝子組み換えアルブミン及びアスコルビン酸を両方添加することで、より高い細胞濃度で細胞を所定時間保存できる。
アスコルビン酸（アスコルビン酸誘導体）は、高濃度細胞保存液の全量に対して０．１～１０ｍｇ／ｍＬ含有されるように調製されると良く、好ましくは０．１～５ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは０．１～２ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは０．１～１ｍｇ／ｍＬ含有されるように調製されると良い。
アスコルビン酸が０．１ｍｇ／ｍＬ未満または１０ｍｇ／ｍＬを超えると、細胞生存率が低下することが確認されている。
アスコルビン酸が０．１ｍｇ／ｍＬ未満または１０ｍｇ／ｍＬを超えると、細胞生存率が低下することが確認されている。
（その他の添加剤）
その他の「添加剤」として、ナトリウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩及びカリウム塩以外の無機塩、アミノ酸、ビタミン類、抗生物質、血清、脂肪酸、糖などが基礎培地に適宜添加されても良い。
アミノ酸としては、例えばＬ－アラニン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－システイン、Ｌ－シスチン、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－グルタミン、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－ヒドロキシプロリン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、Ｌ－バリン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－ロイシンなどが挙げられる。
ビタミン類としては、上記アスコルビン酸のほか、例えばビオチン、パントテン酸、コリン、葉酸、ナイアシン、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、ビタミンＢ１２などが挙げられる。
その他の「添加剤」として、ナトリウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩及びカリウム塩以外の無機塩、アミノ酸、ビタミン類、抗生物質、血清、脂肪酸、糖などが基礎培地に適宜添加されても良い。
アミノ酸としては、例えばＬ－アラニン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－システイン、Ｌ－シスチン、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－グルタミン、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－ヒドロキシプロリン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、Ｌ－バリン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－ロイシンなどが挙げられる。
ビタミン類としては、上記アスコルビン酸のほか、例えばビオチン、パントテン酸、コリン、葉酸、ナイアシン、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、ビタミンＢ１２などが挙げられる。
細胞保存液（高濃度細胞保存液）により細胞を懸濁させた高濃度細胞懸濁液は、０．０５ｍＬ以上の任意の容量で保存されると良い。好ましくは０．０５～５００ｍＬであり、より好ましくは０．０５～１００ｍＬであり、より好ましくは０．０５ｍＬ～５０ｍＬで保存されると良い。
凍結しない状態で保存する際に用いられる保存容器は特に限定されないが、これらの容量を確保できる汎用的なシリンジ、バッグ、チューブ、バイアル又はアンプルなどが用いられると良い。
なお、これら保存容器に細胞製剤を無菌的に収めると良い。それにより、高度な無菌施設を持たない医療機関や研究施設であっても細胞移植にそのまま利用することができる。
凍結しない状態で保存する際に用いられる保存容器は特に限定されないが、これらの容量を確保できる汎用的なシリンジ、バッグ、チューブ、バイアル又はアンプルなどが用いられると良い。
なお、これら保存容器に細胞製剤を無菌的に収めると良い。それにより、高度な無菌施設を持たない医療機関や研究施設であっても細胞移植にそのまま利用することができる。
＜高濃度細胞保存方法＞
高濃度細胞保存方法は、上記基礎培地と上記添加剤を含む細胞保存液に細胞を懸濁し、細胞を凍結しない状態で少なくとも１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞濃度で保存する方法である。
高濃度細胞保存方法は、上記基礎培地と上記添加剤を含む細胞保存液に細胞を懸濁し、細胞を凍結しない状態で少なくとも１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞濃度で保存する方法である。
＜細胞保存液を用いた高濃度細胞懸濁液の製造方法＞
高濃度細胞懸濁液の製造方法として、例えば「ＬＣＡＴ遺伝子導入ヒト前脂肪細胞」を保存する「高濃度細胞懸濁液」を製造する場合には、主として下記の工程を行う。
本製造方法では、ＬＣＡＴ遺伝子を導入するヒト前脂肪細胞を調製する第１の工程と、ＬＣＡＴ遺伝子導入ヒト前脂肪細胞を作製する第２の工程と、細胞保存液を調製する第３の工程と、細胞を回収、洗浄、濃縮し、濃縮した細胞を保存容器に保存する第４の工程と、を行い、「高濃度細胞懸濁液」を製造することができる。
より詳しくは、後述の実施例に示す通りである。
高濃度細胞懸濁液の製造方法として、例えば「ＬＣＡＴ遺伝子導入ヒト前脂肪細胞」を保存する「高濃度細胞懸濁液」を製造する場合には、主として下記の工程を行う。
本製造方法では、ＬＣＡＴ遺伝子を導入するヒト前脂肪細胞を調製する第１の工程と、ＬＣＡＴ遺伝子導入ヒト前脂肪細胞を作製する第２の工程と、細胞保存液を調製する第３の工程と、細胞を回収、洗浄、濃縮し、濃縮した細胞を保存容器に保存する第４の工程と、を行い、「高濃度細胞懸濁液」を製造することができる。
より詳しくは、後述の実施例に示す通りである。
以下、本発明の実施例について詳しく説明する。なお、本発明は本実施例に限定されるものではない。
本発明の高濃度細胞保存液を用いて５種類の細胞（ＬＣＡＴ遺伝子導入ヒト前脂肪細胞、ヒト前脂肪細胞、ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞、ＦＶＩＩＩ遺伝子導入ヒト前脂肪細胞、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞）を高濃度で４℃で保存し、一定の時間経過後の細胞の生存率を検証した。
上記細胞保存液について「基礎培地」をＲＰＭＩ１６４０培地またはＤＭＥＭ培地とし、「添加剤」を遺伝子組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＡ）、アスコルビン酸（ＡＡ）とした。
比較例として、リンゲル液を主体とした既製品を用いた。
本発明の高濃度細胞保存液を用いて５種類の細胞（ＬＣＡＴ遺伝子導入ヒト前脂肪細胞、ヒト前脂肪細胞、ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞、ＦＶＩＩＩ遺伝子導入ヒト前脂肪細胞、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞）を高濃度で４℃で保存し、一定の時間経過後の細胞の生存率を検証した。
上記細胞保存液について「基礎培地」をＲＰＭＩ１６４０培地またはＤＭＥＭ培地とし、「添加剤」を遺伝子組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＡ）、アスコルビン酸（ＡＡ）とした。
比較例として、リンゲル液を主体とした既製品を用いた。
＜実施例１＞
下記工程（１－１）～（１－４）のように、高濃度細胞保存液を調製し、当該細胞保存液に「ＬＣＡＴ遺伝子導入ヒト前脂肪細胞」を懸濁した高濃度細胞懸濁液を調製し、保存した。
工程（１－１）ＬＣＡＴ遺伝子を導入するヒト前脂肪細胞の調製
健常なヒトより得た脂肪組織（１０ｇ）を５０ｍＬ遠心チューブに１ｇずつ分注し、３ｍＬの２ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼ（Ｎｏｒｄｍａｒｋ社製）、４０μｇ／ｍＬゲンタマイシン（高田製薬社製）、４μｇ／ｍＬバンコマイシン（ファイザー社製）を含むＨＢＳＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）をそれぞれ加えた後、３７℃で１時間振とうした。
次に、２０％ＦＢＳ（ニチレイバイオサイエンス社製）、４０μｇ／ｍＬゲンタマイシン、４μｇ／ｍＬバンコマイシンを含有する「ＤＭＥＭ／Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ－１２ Ｈａｍ（ＤＭＥＭ－ＨＡＭ／２０％ＦＢＳ（ＧＭ－ＶＣＭ），Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）」を１０ｍＬ加えて攪拌した後、４００×ｇで１分間遠心し、沈殿画分を含む溶液を除去した。
さらに、ＤＭＥＭ－ＨＡＭ／２０％ＦＢＳ（ＧＭ－ＶＣＭ）を１０ｍＬ加えて攪拌した後、４００×ｇで１分間遠心し、沈殿画分を含む溶液を除去する一連の操作を２回行い、ヒト前脂肪細胞を含む上清画分を得た。
このようにして得たヒト前脂肪細胞を含む上清画分を４４０μｍメッシュでろ過した後、元の５０ｍＬ遠心チューブにＤＭＥＭ－ＨＡＭ／２０％ＦＢＳ（ＧＭ－ＶＣＭ）を１０ｍＬ加えて洗浄し、洗浄液もろ過した。
このようにして得たろ液を、予め３７℃に保温した、ＤＭＥＭ－ＨＡＭ／２０％ＦＢＳ（ＧＭ－ＶＣＭ）を満たした１５０ｃｍ２フラスコに加え、さらに気泡がフラスコ内にできるだけ残らないようにＤＭＥＭ－ＨＡＭ／２０％ＦＢＳ（ＧＭ－ＶＣＭ）を加えた後、フラスコを密封した。
３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内にフラスコの底面（培養面）が天井面となるように設置し、７日間天井培養した。７日後にフラスコ内の培養液を除去し、培養面をＤ－ＰＢＳで洗浄した後、トリプシン処理を行うことで、ヒト前脂肪細胞を回収した（４．５×１０７ｃｅｌｌｓ）。
下記工程（１－１）～（１－４）のように、高濃度細胞保存液を調製し、当該細胞保存液に「ＬＣＡＴ遺伝子導入ヒト前脂肪細胞」を懸濁した高濃度細胞懸濁液を調製し、保存した。
工程（１－１）ＬＣＡＴ遺伝子を導入するヒト前脂肪細胞の調製
健常なヒトより得た脂肪組織（１０ｇ）を５０ｍＬ遠心チューブに１ｇずつ分注し、３ｍＬの２ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼ（Ｎｏｒｄｍａｒｋ社製）、４０μｇ／ｍＬゲンタマイシン（高田製薬社製）、４μｇ／ｍＬバンコマイシン（ファイザー社製）を含むＨＢＳＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）をそれぞれ加えた後、３７℃で１時間振とうした。
次に、２０％ＦＢＳ（ニチレイバイオサイエンス社製）、４０μｇ／ｍＬゲンタマイシン、４μｇ／ｍＬバンコマイシンを含有する「ＤＭＥＭ／Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ－１２ Ｈａｍ（ＤＭＥＭ－ＨＡＭ／２０％ＦＢＳ（ＧＭ－ＶＣＭ），Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）」を１０ｍＬ加えて攪拌した後、４００×ｇで１分間遠心し、沈殿画分を含む溶液を除去した。
さらに、ＤＭＥＭ－ＨＡＭ／２０％ＦＢＳ（ＧＭ－ＶＣＭ）を１０ｍＬ加えて攪拌した後、４００×ｇで１分間遠心し、沈殿画分を含む溶液を除去する一連の操作を２回行い、ヒト前脂肪細胞を含む上清画分を得た。
このようにして得たヒト前脂肪細胞を含む上清画分を４４０μｍメッシュでろ過した後、元の５０ｍＬ遠心チューブにＤＭＥＭ－ＨＡＭ／２０％ＦＢＳ（ＧＭ－ＶＣＭ）を１０ｍＬ加えて洗浄し、洗浄液もろ過した。
このようにして得たろ液を、予め３７℃に保温した、ＤＭＥＭ－ＨＡＭ／２０％ＦＢＳ（ＧＭ－ＶＣＭ）を満たした１５０ｃｍ２フラスコに加え、さらに気泡がフラスコ内にできるだけ残らないようにＤＭＥＭ－ＨＡＭ／２０％ＦＢＳ（ＧＭ－ＶＣＭ）を加えた後、フラスコを密封した。
３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内にフラスコの底面（培養面）が天井面となるように設置し、７日間天井培養した。７日後にフラスコ内の培養液を除去し、培養面をＤ－ＰＢＳで洗浄した後、トリプシン処理を行うことで、ヒト前脂肪細胞を回収した（４．５×１０７ｃｅｌｌｓ）。
工程（１－２）ＬＣＡＴ遺伝子導入ヒト前脂肪細胞の作製
遺伝子導入のために、レトロウイルスベクターを下記のように作製した。
ヒト肝癌細胞株のｃＤＮＡライブラリよりクローニングしたＬＣＡＴ遺伝子をｐＤＯＮ－ＡＩベクタープラスミド（タカラバイオ社製）に挿入した。挿入したＬＣＡＴ遺伝子の５’末端スタートコドン（ＡＴＧ）の上流にＫｏｚａｋ配列を付加し、３‘末端の終止コドンを修飾しｐｏｌｙＡシグナルを除去し、ヒトＬＣＡＴ遺伝子搭載レトロウイルスベクタープラスミドを作製した。
このプラスミドより、パッケージングシステム（タカラバイオ社製）を利用して、ヒト細胞に導入可能なヒトＬＣＡＴ遺伝子搭載レトロウイルスベクター液を得た。
遺伝子導入のために、レトロウイルスベクターを下記のように作製した。
ヒト肝癌細胞株のｃＤＮＡライブラリよりクローニングしたＬＣＡＴ遺伝子をｐＤＯＮ－ＡＩベクタープラスミド（タカラバイオ社製）に挿入した。挿入したＬＣＡＴ遺伝子の５’末端スタートコドン（ＡＴＧ）の上流にＫｏｚａｋ配列を付加し、３‘末端の終止コドンを修飾しｐｏｌｙＡシグナルを除去し、ヒトＬＣＡＴ遺伝子搭載レトロウイルスベクタープラスミドを作製した。
このプラスミドより、パッケージングシステム（タカラバイオ社製）を利用して、ヒト細胞に導入可能なヒトＬＣＡＴ遺伝子搭載レトロウイルスベクター液を得た。
上記工程（１－１）の天井培養開始から６日後（ヒト前脂肪細胞の回収前日）、Ｄ－ＰＢＳで希釈した２０μｇ／ｍＬのＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（タカラバイオ社製）溶液を浮遊細胞用２２５ｃｍ２フラスコに４５ｍＬ加え、４℃で一晩静置した。
次に、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ溶液を除去した後、Ｄ－ＰＢＳで１回洗浄し、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎコートフラスコとした。ヒトＬＣＡＴ遺伝子搭載レトロウイルスベクター液を２０％ＦＢＳ、４０μｇ／ｍＬゲンタマイシンを含有するＤＭＥＭ－ＨＡＭ／２０％ＦＢＳ（ＧＭ）で５×１０８ＲＮＡｃｏｐｉｅｓ／ｍＬに希釈した後、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎコートフラスコに４５ｍＬ添加し、３２℃で５時間静置した。５時間後、ベクター液を除去し、ウイルスベクターコートフラスコとした。
次に、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ溶液を除去した後、Ｄ－ＰＢＳで１回洗浄し、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎコートフラスコとした。ヒトＬＣＡＴ遺伝子搭載レトロウイルスベクター液を２０％ＦＢＳ、４０μｇ／ｍＬゲンタマイシンを含有するＤＭＥＭ－ＨＡＭ／２０％ＦＢＳ（ＧＭ）で５×１０８ＲＮＡｃｏｐｉｅｓ／ｍＬに希釈した後、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎコートフラスコに４５ｍＬ添加し、３２℃で５時間静置した。５時間後、ベクター液を除去し、ウイルスベクターコートフラスコとした。
上記工程（１－１）で回収したヒト前脂肪細胞を２２５ｃｍ２フラスコ１枚あたり２．２５×１０６ｃｅｌｌｓをウイルスベクターコートフラスコに播種し、遺伝子導入を開始した。遺伝子導入から２日後、４０μｇ／ｍＬゲンタマイシンを含有する細胞培養用培地「ＭＳＦ－ＢＭ／ＭＳＦ－ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ａ（島津ダイアグノスティクス社製）」に、培地交換した。更に２日後、フラスコ内の細胞を回収し、ＬＣＡＴ遺伝子導入ヒト前脂肪細胞とした。
試験開始まで、細胞は３００×ｇ、４℃、５分間の遠心分離により沈殿させ、細胞凍結保存液（ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ１：日本全薬工業社製）に懸濁し、－８０℃で凍結保存した。
試験開始まで、細胞は３００×ｇ、４℃、５分間の遠心分離により沈殿させ、細胞凍結保存液（ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ１：日本全薬工業社製）に懸濁し、－８０℃で凍結保存した。
工程（１－３）細胞保存液の調製
「基礎培地」となるＲＰＭＩ１６４０（Ｌ－グルタミン含有）培地（ナカライテスク社製）５００ｍＬに対し、「遺伝子組換えヒト血清アルブミン」となるＲｅｃｏｍｂｕｍｉｎ Ｅｌｉｔｅ（Ａｌｂｕｍｅｄｉｘ社）を１０ｍＬ添加し、混和した。
さらに、「アスコルビン酸」となるビタミンＣ注「フソー」－５００ｍｇ（扶桑薬品工業社製）を１ｍＬ添加し、混和した。フィルターろ過滅菌を行い、細胞保存液（細胞を懸濁させる前の保存液）とした。
上記のように調製して、アルブミン濃度を０．２（ｗ／ｖ）％、アスコルビン酸濃度を０．５ｍｇ／ｍＬとした。実施例２、３の濃度も同様とした。
「基礎培地」となるＲＰＭＩ１６４０（Ｌ－グルタミン含有）培地（ナカライテスク社製）５００ｍＬに対し、「遺伝子組換えヒト血清アルブミン」となるＲｅｃｏｍｂｕｍｉｎ Ｅｌｉｔｅ（Ａｌｂｕｍｅｄｉｘ社）を１０ｍＬ添加し、混和した。
さらに、「アスコルビン酸」となるビタミンＣ注「フソー」－５００ｍｇ（扶桑薬品工業社製）を１ｍＬ添加し、混和した。フィルターろ過滅菌を行い、細胞保存液（細胞を懸濁させる前の保存液）とした。
上記のように調製して、アルブミン濃度を０．２（ｗ／ｖ）％、アスコルビン酸濃度を０．５ｍｇ／ｍＬとした。実施例２、３の濃度も同様とした。
工程（１－４）細胞の回収、洗浄、濃縮及び保存
上記工程（１－２）において凍結保存したＬＣＡＴ遺伝子導入ヒト前脂肪細胞を解凍し、Ｎｕｎｃイージーフィルセルファクトリー（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用い、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で、増殖させた。
培養液を除去し、培養面をＤ－ＰＢＳで洗浄した後、トリプシン処理を行った。上記工程（１－３）で調製した細胞保存液を用いて細胞を回収した後、３，０００×ｇ、４℃で３分間遠心し、上清を除去した。更に、細胞保存液で懸濁し、３，０００×ｇ、４℃で３分間遠心し、上清除去を３回行い、細胞を洗浄した。細胞濃度を測定した後、３，０００×ｇ、４℃で５分間遠心し、１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように細胞保存液で懸濁した。保存容器に細胞懸濁液を分注し、４℃で保存を開始した。
上記工程（１－１）～（１－４）を経て、高濃度細胞保存液に「ＬＣＡＴ遺伝子導入ヒト前脂肪細胞」を懸濁した、実施例１の高濃度細胞懸濁液を得た。
上記工程（１－２）において凍結保存したＬＣＡＴ遺伝子導入ヒト前脂肪細胞を解凍し、Ｎｕｎｃイージーフィルセルファクトリー（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用い、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で、増殖させた。
培養液を除去し、培養面をＤ－ＰＢＳで洗浄した後、トリプシン処理を行った。上記工程（１－３）で調製した細胞保存液を用いて細胞を回収した後、３，０００×ｇ、４℃で３分間遠心し、上清を除去した。更に、細胞保存液で懸濁し、３，０００×ｇ、４℃で３分間遠心し、上清除去を３回行い、細胞を洗浄した。細胞濃度を測定した後、３，０００×ｇ、４℃で５分間遠心し、１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように細胞保存液で懸濁した。保存容器に細胞懸濁液を分注し、４℃で保存を開始した。
上記工程（１－１）～（１－４）を経て、高濃度細胞保存液に「ＬＣＡＴ遺伝子導入ヒト前脂肪細胞」を懸濁した、実施例１の高濃度細胞懸濁液を得た。
＜実施例２＞
下記のように、高濃度細胞保存液を調製し、当該細胞保存液に遺伝子を導入しない「ヒト前脂肪細胞」を懸濁した高濃度細胞懸濁液を調製し、保存した。
健常なヒトより得た脂肪組織から、実施例１の工程（１－１）の方法に従い、ヒト前脂肪細胞を回収した。試験開始まで、細胞凍結保存液（ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ１）に懸濁し、－８０℃で凍結保存した。
実施例１の工程（１－３）の方法に従って細胞保存液を調製し、工程（１－４）の方法に従って細胞の回収、洗浄、濃縮及び保存を行った。
上記を経て、高濃度細胞保存液に「ヒト前脂肪細胞」を懸濁した、実施例２の高濃度細胞懸濁液を得た。
下記のように、高濃度細胞保存液を調製し、当該細胞保存液に遺伝子を導入しない「ヒト前脂肪細胞」を懸濁した高濃度細胞懸濁液を調製し、保存した。
健常なヒトより得た脂肪組織から、実施例１の工程（１－１）の方法に従い、ヒト前脂肪細胞を回収した。試験開始まで、細胞凍結保存液（ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ１）に懸濁し、－８０℃で凍結保存した。
実施例１の工程（１－３）の方法に従って細胞保存液を調製し、工程（１－４）の方法に従って細胞の回収、洗浄、濃縮及び保存を行った。
上記を経て、高濃度細胞保存液に「ヒト前脂肪細胞」を懸濁した、実施例２の高濃度細胞懸濁液を得た。
＜実施例３＞
下記のように、高濃度細胞保存液を調製し、当該細胞保存液に「ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞」を懸濁した高濃度細胞懸濁液を調製し、保存した。
ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を培養し、細胞を増殖させた。試験開始まで、細胞凍結保存液（ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ１）に懸濁し、－８０℃で凍結保存した。
実施例１の工程（１－３）の方法に従って細胞保存液を調製し、工程（１－４）の方法に従って細胞の回収、洗浄、濃縮及び保存を行った。
上記を経て、高濃度細胞保存液に「ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞（ヒト脂肪由来幹細胞）」を懸濁した、実施例３の高濃度細胞懸濁液を得た。
下記のように、高濃度細胞保存液を調製し、当該細胞保存液に「ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞」を懸濁した高濃度細胞懸濁液を調製し、保存した。
ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を培養し、細胞を増殖させた。試験開始まで、細胞凍結保存液（ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ１）に懸濁し、－８０℃で凍結保存した。
実施例１の工程（１－３）の方法に従って細胞保存液を調製し、工程（１－４）の方法に従って細胞の回収、洗浄、濃縮及び保存を行った。
上記を経て、高濃度細胞保存液に「ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞（ヒト脂肪由来幹細胞）」を懸濁した、実施例３の高濃度細胞懸濁液を得た。
＜比較例１、２＞
細胞懸濁保存液として市販されているデキストラン４０、トレハロース含有乳酸リンゲルを、比較例１の細胞保存液として利用した。
また、細胞洗浄保存液として市販されているトレハロース含有乳酸リンゲルを、比較例２の細胞保存液として利用した。
具体的には、下記工程（２－１）～（２－４）のように調製した。
細胞懸濁保存液として市販されているデキストラン４０、トレハロース含有乳酸リンゲルを、比較例１の細胞保存液として利用した。
また、細胞洗浄保存液として市販されているトレハロース含有乳酸リンゲルを、比較例２の細胞保存液として利用した。
具体的には、下記工程（２－１）～（２－４）のように調製した。
工程（２－１）ヒト前脂肪細胞の調製
実施例１の工程（１－１）の方法に従い、２ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼ、４０μｇ／ｍＬゲンタマイシン、４μｇ／ｍＬバンコマイシンを含むＨＢＳＳの代わりに、２ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼ、４００μｇ／ｍＬバンコマイシンを含むＨＢＳＳを使用した。
また、ＤＭＥＭ－ＨＡＭ／２０％ＦＢＳ（ＧＭ－ＶＣＭ）の代わりにＤＭＥＭ－ＨＡＭ／２０％ＦＢＳ（ＧＭ）を使用して、ヒト前脂肪細胞を得た。
実施例１の工程（１－１）の方法に従い、２ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼ、４０μｇ／ｍＬゲンタマイシン、４μｇ／ｍＬバンコマイシンを含むＨＢＳＳの代わりに、２ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼ、４００μｇ／ｍＬバンコマイシンを含むＨＢＳＳを使用した。
また、ＤＭＥＭ－ＨＡＭ／２０％ＦＢＳ（ＧＭ－ＶＣＭ）の代わりにＤＭＥＭ－ＨＡＭ／２０％ＦＢＳ（ＧＭ）を使用して、ヒト前脂肪細胞を得た。
工程（２－２）ＬＣＡＴ遺伝子導入ヒト前脂肪細胞の調製
実施例１の工程（１－２）の方法に従い、ＭＳＦ－ＢＭ／ＭＳＦ－ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ａの代わりにＭｅｓｅｎＰＲＯ ＲＳ Ｍｅｄｉｕｍ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いて、ＬＣＡＴ遺伝子導入ヒト前脂肪細胞を作製した。
試験開始まで、細胞凍結保存液（ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ１）に懸濁し、－８０℃で凍結保存した。
実施例１の工程（１－２）の方法に従い、ＭＳＦ－ＢＭ／ＭＳＦ－ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ａの代わりにＭｅｓｅｎＰＲＯ ＲＳ Ｍｅｄｉｕｍ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いて、ＬＣＡＴ遺伝子導入ヒト前脂肪細胞を作製した。
試験開始まで、細胞凍結保存液（ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ１）に懸濁し、－８０℃で凍結保存した。
工程（２－３）比較用の細胞洗浄液の調製
「基礎培地」の代わりに「細胞洗浄液」となるリンゲル液（大塚製薬工場社製）５００ｍＬに対し、「添加剤」となる２５％献血アルブミン（日本血液製剤機構社製）１０ｍＬを添加し、混和した。フィルターろ過を行うことで、比較用の細胞洗浄液とした。
「基礎培地」の代わりに「細胞洗浄液」となるリンゲル液（大塚製薬工場社製）５００ｍＬに対し、「添加剤」となる２５％献血アルブミン（日本血液製剤機構社製）１０ｍＬを添加し、混和した。フィルターろ過を行うことで、比較用の細胞洗浄液とした。
工程（２－４）細胞の回収、洗浄、濃縮及び保存
実施例１の工程（１－４）の方法に従って、上記工程（２－３）で調製した細胞洗浄液を用いて細胞の回収及び洗浄を行い、０．５×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、比較例１、比較例２でそれぞれ懸濁し、４℃で保存を開始した。
上記工程（２－１）～（２－４）を経て、リンゲル液を主体とした既製品の細胞保存液に「ＬＣＡＴ遺伝子導入ヒト前脂肪細胞」を懸濁した、比較例１、２の高濃度細胞懸濁液を得た。
実施例１の工程（１－４）の方法に従って、上記工程（２－３）で調製した細胞洗浄液を用いて細胞の回収及び洗浄を行い、０．５×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、比較例１、比較例２でそれぞれ懸濁し、４℃で保存を開始した。
上記工程（２－１）～（２－４）を経て、リンゲル液を主体とした既製品の細胞保存液に「ＬＣＡＴ遺伝子導入ヒト前脂肪細胞」を懸濁した、比較例１、２の高濃度細胞懸濁液を得た。
＜試験例１：細胞形態による生細胞率の算出（異なる細胞種）＞
実施例１、２、３、比較例１、２の高濃度細胞懸濁液について、保存終了直後の細胞の形態に基づく生細胞率の評価を行った。
それぞれ４℃での保存開始から０時間、４８時間、７２時間後に各保存容器内の高濃度細胞懸濁液（実施例：１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、比較例：０．５×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を抜き取り、各細胞培養用培地による段階希釈を経て５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞懸濁液に調整した。
これら細胞懸濁液の「総細胞濃度」及び「死細胞濃度」を、ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ ＮＣ－１００（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ社製）を用いて測定した。「死細胞濃度」はヨウ化プロピジウム染色により染色された細胞数に基づき算出した。両者の測定値をもとに「生細胞率（％）」を算出した。
なお、「生細胞率（％）」は、「細胞生存率（％）」に相当するものである。
実施例１、２、３、比較例１、２の高濃度細胞懸濁液について、保存終了直後の細胞の形態に基づく生細胞率の評価を行った。
それぞれ４℃での保存開始から０時間、４８時間、７２時間後に各保存容器内の高濃度細胞懸濁液（実施例：１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、比較例：０．５×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を抜き取り、各細胞培養用培地による段階希釈を経て５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞懸濁液に調整した。
これら細胞懸濁液の「総細胞濃度」及び「死細胞濃度」を、ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ ＮＣ－１００（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ社製）を用いて測定した。「死細胞濃度」はヨウ化プロピジウム染色により染色された細胞数に基づき算出した。両者の測定値をもとに「生細胞率（％）」を算出した。
なお、「生細胞率（％）」は、「細胞生存率（％）」に相当するものである。
（試験例１の結果、考察）
各実施例、比較例における生細胞率（細胞生存率）の経時的変化をまとめたものを図１に示す。なお、遺伝子組換えヒト血清アルブミンを「ｒＨＡ」、アスコルビン酸を「ＡＡ」と表記した。
試験例１の結果から、実施例１、２、３の高濃度細胞懸濁液（１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）では、細胞の種類に依存せず、保存開始から７２時間経過後も高い細胞生存率を示した。具体的には、高濃度細胞保存液によって細胞を４℃で保存したときに、７２時間経過後における細胞生存率が８０％以上、より具体的には８５％以上、より具体的には９０％以上、より具体的には９５％以上の細胞生存率を示すことが分かった（実施例１：９８．３％、実施例２：９７．８％、実施例３：９５．９％）。
なお、上記試験を複数実施し、同様の試験結果となることが確認された。
各実施例、比較例における生細胞率（細胞生存率）の経時的変化をまとめたものを図１に示す。なお、遺伝子組換えヒト血清アルブミンを「ｒＨＡ」、アスコルビン酸を「ＡＡ」と表記した。
試験例１の結果から、実施例１、２、３の高濃度細胞懸濁液（１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）では、細胞の種類に依存せず、保存開始から７２時間経過後も高い細胞生存率を示した。具体的には、高濃度細胞保存液によって細胞を４℃で保存したときに、７２時間経過後における細胞生存率が８０％以上、より具体的には８５％以上、より具体的には９０％以上、より具体的には９５％以上の細胞生存率を示すことが分かった（実施例１：９８．３％、実施例２：９７．８％、実施例３：９５．９％）。
なお、上記試験を複数実施し、同様の試験結果となることが確認された。
比較例１、２の高濃度細胞懸濁液では、細胞生存率の減少が認められた。具体的には、リンゲル液を主体とした既製品の細胞保存液によって細胞を４℃で保存したときに、７２時間経過後における細胞生存率が６０％未満を示すことが分かった（比較例１：５５．４％、比較例２：５１．５％）。
なお、細胞濃度が低い場合（例えば１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬよりも低い場合）には、比較例１、２のようなリンゲル液を主体とした細胞保存液であっても保存できることが確認されている。他方で、細胞濃度が高い場合（例えば１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬの場合）には、リンゲル液等を用いた組成では困難であることが示された。
なお、細胞濃度が低い場合（例えば１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬよりも低い場合）には、比較例１、２のようなリンゲル液を主体とした細胞保存液であっても保存できることが確認されている。他方で、細胞濃度が高い場合（例えば１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬの場合）には、リンゲル液等を用いた組成では困難であることが示された。
＜試験例２：細胞内脱水素酵素活性の測定による細胞生存評価＞
試験例１は細胞の形態のみを検証している。細胞が機能を維持した状態で適切に保存されているか確認すべく、保存終了後の細胞を培養容器に播種し、２０時間後の代謝活性を測定することによる細胞生存の評価を行なった。
実施例１、２、３、比較例１、２の高濃度細胞懸濁液について、それぞれ４℃での保存開始から０時間、４８時間、７２時間後に各保存容器内の細胞懸濁液を抜き取り、各細胞培養用培地による段階希釈を経て４×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞懸濁液に調整し、９６ウェルプレートに１００μＬずつ播種した。また、細胞を含まない培地のみを添加したウェルを準備した。
これらを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で２０時間培養した後、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ－８（同仁化学研究所社製）の添付プロトコルに従って試験を行い、波長４５０ｎｍの吸光度測定によって光学濃度値（ＯＤ値：Ｏｐｔｉｃａｌ Ｄｅｎｓｉｔｙ）を得た。
各試験サンプルのＯＤ値から培地のみのＯＤ値を引いた値を算出し、また０時間保存の値を１とした場合の相対値（光学濃度比）を算出した。
試験例１は細胞の形態のみを検証している。細胞が機能を維持した状態で適切に保存されているか確認すべく、保存終了後の細胞を培養容器に播種し、２０時間後の代謝活性を測定することによる細胞生存の評価を行なった。
実施例１、２、３、比較例１、２の高濃度細胞懸濁液について、それぞれ４℃での保存開始から０時間、４８時間、７２時間後に各保存容器内の細胞懸濁液を抜き取り、各細胞培養用培地による段階希釈を経て４×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞懸濁液に調整し、９６ウェルプレートに１００μＬずつ播種した。また、細胞を含まない培地のみを添加したウェルを準備した。
これらを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で２０時間培養した後、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ－８（同仁化学研究所社製）の添付プロトコルに従って試験を行い、波長４５０ｎｍの吸光度測定によって光学濃度値（ＯＤ値：Ｏｐｔｉｃａｌ Ｄｅｎｓｉｔｙ）を得た。
各試験サンプルのＯＤ値から培地のみのＯＤ値を引いた値を算出し、また０時間保存の値を１とした場合の相対値（光学濃度比）を算出した。
（試験例２の結果、考察）
各実施例、比較例におけるＯＤ値比（光学濃度比）の経時的変化をまとめたものを図２に示す。
試験例２の結果から、比較例１、２の高濃度細胞懸濁液と異なり、実施例１、２、３の高濃度細胞懸濁液では、保存開始から７２時間経過後も高い代謝活性を持つことが示され（高いＯＤ値比であることが示され）、細胞の生存が維持されていることが分かった。
より具体的には、実施例１、２、３について高濃度細胞保存液によって細胞を４℃で保存したときに、７２時間経過後における０時間保存に対するＯＤ値比が０．５以上、より具体的には０．６以上、より具体的には０．７以上の値を示すことが分かった（実施例１：０．９３１、実施例２：０．８７６、実施例３：０．７０８）。
各実施例、比較例におけるＯＤ値比（光学濃度比）の経時的変化をまとめたものを図２に示す。
試験例２の結果から、比較例１、２の高濃度細胞懸濁液と異なり、実施例１、２、３の高濃度細胞懸濁液では、保存開始から７２時間経過後も高い代謝活性を持つことが示され（高いＯＤ値比であることが示され）、細胞の生存が維持されていることが分かった。
より具体的には、実施例１、２、３について高濃度細胞保存液によって細胞を４℃で保存したときに、７２時間経過後における０時間保存に対するＯＤ値比が０．５以上、より具体的には０．６以上、より具体的には０．７以上の値を示すことが分かった（実施例１：０．９３１、実施例２：０．８７６、実施例３：０．７０８）。
＜試験例３：培養液中の乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の検出による細胞傷害評価＞
高濃度細胞保存液に保存された細胞に対するダメージを評価すべく、細胞膜損傷により誘導される遊離ＬＤＨ量を測定した。
実施例１、２、３の高濃度細胞懸濁液について、それぞれ４℃での保存開始から０時間、４８時間、７２時間後に抜き取った細胞を、各細胞培養用培地による段階希釈を経て４×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整し、１２ウェルプレートに１０００μＬずつ２ウェルに播種した。また、細胞を含まない培地のみを添加したウェルを２ウェル準備した。
これらを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で２０時間培養した後、各試験サンプル２ウェルのうちの１ウェルにＬＤＨ細胞毒性アッセイキット（ナカライテスク社製）に付属するＬｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒを添加し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で３０分間培養した。
３０分後に、各試験サンプルの培養液を回収し、５，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離した。遠心分離後の上清を回収し、解析まで－８０℃で凍結保存した。ＬＤＨ細胞毒性アッセイキットの添付プロトコルに従って試験を行い、波長４９２ｎｍの吸光度測定によりＯＤ値を得た。各試験サンプルのＯＤ値から培地のみのＯＤ値を引いた値を算出し、Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒを添加したサンプルに対する相対値を算出した。
高濃度細胞保存液に保存された細胞に対するダメージを評価すべく、細胞膜損傷により誘導される遊離ＬＤＨ量を測定した。
実施例１、２、３の高濃度細胞懸濁液について、それぞれ４℃での保存開始から０時間、４８時間、７２時間後に抜き取った細胞を、各細胞培養用培地による段階希釈を経て４×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整し、１２ウェルプレートに１０００μＬずつ２ウェルに播種した。また、細胞を含まない培地のみを添加したウェルを２ウェル準備した。
これらを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で２０時間培養した後、各試験サンプル２ウェルのうちの１ウェルにＬＤＨ細胞毒性アッセイキット（ナカライテスク社製）に付属するＬｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒを添加し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で３０分間培養した。
３０分後に、各試験サンプルの培養液を回収し、５，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離した。遠心分離後の上清を回収し、解析まで－８０℃で凍結保存した。ＬＤＨ細胞毒性アッセイキットの添付プロトコルに従って試験を行い、波長４９２ｎｍの吸光度測定によりＯＤ値を得た。各試験サンプルのＯＤ値から培地のみのＯＤ値を引いた値を算出し、Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒを添加したサンプルに対する相対値を算出した。
（試験例３の結果、考察）
各実施例におけるＯＤ値の相対値の経時的変化をまとめたものを図３に示す。
試験例３の結果から、実施例１、２、３の高濃度細胞懸濁液では、保存開始から７２時間経過後も低いＯＤ値の相対値を示し、細胞傷害はみられないことが分かった。
より具体的には、実施例１、２、３について高濃度細胞保存液によって細胞を４℃で保存したときに、７２時間経過後におけるＬｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒを添加したサンプルに対する相対値が１０％以下、より具体的には８％以下の値を示すことが分かった（実施例１：２．３３％、実施例２：３．７５％、実施例３：７．８０％）。
各実施例におけるＯＤ値の相対値の経時的変化をまとめたものを図３に示す。
試験例３の結果から、実施例１、２、３の高濃度細胞懸濁液では、保存開始から７２時間経過後も低いＯＤ値の相対値を示し、細胞傷害はみられないことが分かった。
より具体的には、実施例１、２、３について高濃度細胞保存液によって細胞を４℃で保存したときに、７２時間経過後におけるＬｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒを添加したサンプルに対する相対値が１０％以下、より具体的には８％以下の値を示すことが分かった（実施例１：２．３３％、実施例２：３．７５％、実施例３：７．８０％）。
＜実施例４＞
上記実施例２のように調製して、高濃度細胞保存液に「ヒト前脂肪細胞」を懸濁した、実施例４の高濃度細胞懸濁液を得た。
上記高濃度細胞懸濁液について、「細胞濃度」を１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬとし、「基礎培地」をＲＰＭＩ１６４０（Ｌ－グルタミン含有）培地とし、「添加剤」を遺伝子組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＡ）、アスコルビン酸（ＡＡ）とした。
また、アルブミンの濃度を０．１（ｗ／ｖ）％、０．２（ｗ／ｖ）％、２．０（ｗ／ｖ）％とし、アスコルビン酸の濃度を０．１ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬとした。
上記実施例２のように調製して、高濃度細胞保存液に「ヒト前脂肪細胞」を懸濁した、実施例４の高濃度細胞懸濁液を得た。
上記高濃度細胞懸濁液について、「細胞濃度」を１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬとし、「基礎培地」をＲＰＭＩ１６４０（Ｌ－グルタミン含有）培地とし、「添加剤」を遺伝子組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＡ）、アスコルビン酸（ＡＡ）とした。
また、アルブミンの濃度を０．１（ｗ／ｖ）％、０．２（ｗ／ｖ）％、２．０（ｗ／ｖ）％とし、アスコルビン酸の濃度を０．１ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬとした。
＜試験例４：細胞形態による生細胞率の算出（異なる濃度の添加剤）＞
試験例１と同様にして、アルブミンの濃度、アスコルビン酸の濃度が異なる実施例４の高濃度細胞懸濁液について、生細胞率の評価を行った。
試験例１と同様にして、アルブミンの濃度、アスコルビン酸の濃度が異なる実施例４の高濃度細胞懸濁液について、生細胞率の評価を行った。
（試験例４の結果、考察）
アルブミン濃度、アスコルビン酸濃度が異なる実施例４における生細胞率（細胞生存率）の経時的変化をまとめたものを図４、図５に示す。なお、遺伝子組み換えヒト血清アルブミンを「ｒＨＡ」、アスコルビン酸を「ＡＡ」と表記した。
試験例４－１の結果から、アルブミン濃度（ｒＨＡ濃度）を０．１～２．０（ｗ／ｖ）％とした場合の実施例４の高濃度細胞懸濁液（１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）では、保存開始から７２時間経過後も高い細胞生存率を示した。具体的には、細胞を４℃で保存したときに、７２時間経過後における細胞生存率が９０％以上を示すことが分かった（ｒＨＡ濃度０．１（ｗ／ｖ）％：９４．８％、ｒＨＡ濃度０．２（ｗ／ｖ）％：９４．１％、ｒＨＡ濃度２．０（ｗ／ｖ）％：９７．１％）。
また試験例４－２の結果から、アスコルビン酸濃度（ＡＡ濃度）を０．１ｍｇ／ｍＬ～１０ｍｇ／ｍＬとした場合の実施例４の高濃度細胞懸濁液では、保存開始から７２時間経過後も高い生存率を示した。具体的には、細胞を４℃で保存したときに、７２時間経過後における細胞生存率が９０％以上の生存率を示すことが分かった（ＡＡ濃度０．１ｍｇ／ｍＬ：９４．４％、ＡＡ濃度０．５ｍｇ／ｍＬ：９４．１％、ＡＡ濃度１ｍｇ／ｍＬ：９５．０％、ＡＡ濃度２ｍｇ／ｍＬ：９６．７％、ＡＡ濃度５ｍｇ／ｍＬ：９７．５％、ＡＡ濃度１０ｍｇ／ｍＬ：９７．４％）。
上記試験を複数実施し、同様の試験結果となることが確認された。
なお、実施例４の高濃度細胞懸濁液について、試験例２と同様の細胞生存評価を行い、細胞の生存維持を確認した。また、試験例３と同様の細胞傷害評価を行い、細胞傷害はみられないことを確認した。
アルブミン濃度、アスコルビン酸濃度が異なる実施例４における生細胞率（細胞生存率）の経時的変化をまとめたものを図４、図５に示す。なお、遺伝子組み換えヒト血清アルブミンを「ｒＨＡ」、アスコルビン酸を「ＡＡ」と表記した。
試験例４－１の結果から、アルブミン濃度（ｒＨＡ濃度）を０．１～２．０（ｗ／ｖ）％とした場合の実施例４の高濃度細胞懸濁液（１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）では、保存開始から７２時間経過後も高い細胞生存率を示した。具体的には、細胞を４℃で保存したときに、７２時間経過後における細胞生存率が９０％以上を示すことが分かった（ｒＨＡ濃度０．１（ｗ／ｖ）％：９４．８％、ｒＨＡ濃度０．２（ｗ／ｖ）％：９４．１％、ｒＨＡ濃度２．０（ｗ／ｖ）％：９７．１％）。
また試験例４－２の結果から、アスコルビン酸濃度（ＡＡ濃度）を０．１ｍｇ／ｍＬ～１０ｍｇ／ｍＬとした場合の実施例４の高濃度細胞懸濁液では、保存開始から７２時間経過後も高い生存率を示した。具体的には、細胞を４℃で保存したときに、７２時間経過後における細胞生存率が９０％以上の生存率を示すことが分かった（ＡＡ濃度０．１ｍｇ／ｍＬ：９４．４％、ＡＡ濃度０．５ｍｇ／ｍＬ：９４．１％、ＡＡ濃度１ｍｇ／ｍＬ：９５．０％、ＡＡ濃度２ｍｇ／ｍＬ：９６．７％、ＡＡ濃度５ｍｇ／ｍＬ：９７．５％、ＡＡ濃度１０ｍｇ／ｍＬ：９７．４％）。
上記試験を複数実施し、同様の試験結果となることが確認された。
なお、実施例４の高濃度細胞懸濁液について、試験例２と同様の細胞生存評価を行い、細胞の生存維持を確認した。また、試験例３と同様の細胞傷害評価を行い、細胞傷害はみられないことを確認した。
＜実施例５、６＞
上記実施例１のように、高濃度細胞保存液に「ＬＣＡＴ遺伝子導入ヒト前脂肪細胞」を懸濁した、実施例５、６の高濃度細胞懸濁液を得た。
実施例５について、「細胞濃度」を１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬとし、「基礎培地」をＲＰＭＩ１６４０（Ｌ－グルタミン含有）とし、「添加剤」を遺伝子組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＡ）、アスコルビン酸（ＡＡ）、ピルビン酸ナトリウム（ＳＰ）とした。アルブミン濃度を０．５（ｗ／ｖ）％、アスコルビン酸濃度を５ｍｇ／ｍＬ、ピルビン酸ナトリウム濃度を１ｍＭとした。
実施例６について、「細胞濃度」を１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬとし、「基礎培地」をＤＭＥＭ（低グルコース）（ナカライテスク社製）とし、「添加剤」を遺伝子組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＡ）、アスコルビン酸（ＡＡ）とした。アルブミン濃度を０．５（ｗ／ｖ）％、アスコルビン酸濃度を５ｍｇ／ｍＬとした。
なお、実施例５の上記ＲＰＭＩ１６４０にはピルビン酸ナトリウムが含まれていないため、ピルビン酸ナトリウムを別途添加することとした。実施例６のＤＭＥＭにはピルビン酸ナトリウム含まれるため、同等の組成条件とした。
上記実施例１のように、高濃度細胞保存液に「ＬＣＡＴ遺伝子導入ヒト前脂肪細胞」を懸濁した、実施例５、６の高濃度細胞懸濁液を得た。
実施例５について、「細胞濃度」を１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬとし、「基礎培地」をＲＰＭＩ１６４０（Ｌ－グルタミン含有）とし、「添加剤」を遺伝子組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＡ）、アスコルビン酸（ＡＡ）、ピルビン酸ナトリウム（ＳＰ）とした。アルブミン濃度を０．５（ｗ／ｖ）％、アスコルビン酸濃度を５ｍｇ／ｍＬ、ピルビン酸ナトリウム濃度を１ｍＭとした。
実施例６について、「細胞濃度」を１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬとし、「基礎培地」をＤＭＥＭ（低グルコース）（ナカライテスク社製）とし、「添加剤」を遺伝子組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＡ）、アスコルビン酸（ＡＡ）とした。アルブミン濃度を０．５（ｗ／ｖ）％、アスコルビン酸濃度を５ｍｇ／ｍＬとした。
なお、実施例５の上記ＲＰＭＩ１６４０にはピルビン酸ナトリウムが含まれていないため、ピルビン酸ナトリウムを別途添加することとした。実施例６のＤＭＥＭにはピルビン酸ナトリウム含まれるため、同等の組成条件とした。
＜試験例５：細胞形態による生細胞率の算出（異なる基礎培地）＞
試験例１と同様にして、基礎培地が異なる実施例５、６の高濃度細胞懸濁液について、生存率の評価を行った。
試験例１と同様にして、基礎培地が異なる実施例５、６の高濃度細胞懸濁液について、生存率の評価を行った。
（試験例５の結果、考察）
実施例５、６における生細胞率（細胞生存率）の経時的変化をまとめたものを図６に示す。なお、遺伝子組換えヒト血清アルブミンを「ｒＨＡ」、アスコルビン酸を「ＡＡ」、ピルビン酸ナトリウムを「ＳＰ」と表記した。
試験例５の結果から、基礎培地を「ＲＰＭＩ１６４０」、「ＤＭＥＭ」とした実施例５、６の高濃度細胞懸濁液（１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）では、保存開始から７２時間経過後も高い細胞生存率を示した。具体的には、細胞を４℃で保存したときに、７２時間経過後における細胞生存率が８０％以上であることが示された（実施例５：９０．９％、実施例６：８４．２％）。
また、基礎培地は「ＤＭＥＭ」よりも「ＲＰＭＩ１６４０」とした方が、細胞生存率が高いことが示された。上記試験を複数実施し、同様の試験結果となることが確認された。
なお、実施例５、６の高濃度細胞懸濁液について、試験例２と同様の細胞生存評価を行い、細胞の生存維持を確認した。
実施例５、６における生細胞率（細胞生存率）の経時的変化をまとめたものを図６に示す。なお、遺伝子組換えヒト血清アルブミンを「ｒＨＡ」、アスコルビン酸を「ＡＡ」、ピルビン酸ナトリウムを「ＳＰ」と表記した。
試験例５の結果から、基礎培地を「ＲＰＭＩ１６４０」、「ＤＭＥＭ」とした実施例５、６の高濃度細胞懸濁液（１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）では、保存開始から７２時間経過後も高い細胞生存率を示した。具体的には、細胞を４℃で保存したときに、７２時間経過後における細胞生存率が８０％以上であることが示された（実施例５：９０．９％、実施例６：８４．２％）。
また、基礎培地は「ＤＭＥＭ」よりも「ＲＰＭＩ１６４０」とした方が、細胞生存率が高いことが示された。上記試験を複数実施し、同様の試験結果となることが確認された。
なお、実施例５、６の高濃度細胞懸濁液について、試験例２と同様の細胞生存評価を行い、細胞の生存維持を確認した。
＜実施例７＞
下記工程（７－１）～（７－３）のように高濃度細胞保存液を調製し、当該細胞保存液に「ＦＶＩＩＩ遺伝子導入ヒト前脂肪細胞」を懸濁した高濃度細胞懸濁液を調製し、保存した。
工程（７－１）ＦＶＩＩＩ遺伝子を導入するヒト前脂肪細胞の調製
健常なヒトより得た脂肪組織から、実施例１の工程（１－１）の方法に従い、ヒト前脂肪細胞を回収した。試験開始まで、細胞凍結保存液（ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ１）に懸濁し、－８０℃で凍結保存した。
下記工程（７－１）～（７－３）のように高濃度細胞保存液を調製し、当該細胞保存液に「ＦＶＩＩＩ遺伝子導入ヒト前脂肪細胞」を懸濁した高濃度細胞懸濁液を調製し、保存した。
工程（７－１）ＦＶＩＩＩ遺伝子を導入するヒト前脂肪細胞の調製
健常なヒトより得た脂肪組織から、実施例１の工程（１－１）の方法に従い、ヒト前脂肪細胞を回収した。試験開始まで、細胞凍結保存液（ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ１）に懸濁し、－８０℃で凍結保存した。
工程（７－２）ＦＶＩＩＩ遺伝子導入ヒト前脂肪細胞の作製
遺伝子導入のために、レンチウイルスベクターを下記のように作製した。
最初に、ヒトＦＶＩＩＩ遺伝子におけるＢドメインのＮ型糖鎖修飾されるＡｓｎ残基の個数をＮ末端側から数えて５個とし、かつ、フューリン認識部位の機能が欠損され、７５８番目のＰｒｏ残基がＴｈｒ残基に置換された「ＦＶＩＩＩ改変体」を作製した。この「ＦＶＩＩＩ改変体」に、シグナルペプチドを付加した塩基配列をｐＬＶＳＩＮベクタープラスミド（タカラバイオ社製）に挿入し、ヒトＦＶＩＩＩ遺伝子搭載レンチウイルスベクタープラスミドを作製した。
このプラスミドより、パッケージングシステム（タカラバイオ社製）を利用して、ヒト細胞に導入可能なヒトＦＶＩＩＩ遺伝子搭載レンチウイルスベクター液を得た。
上記工程（７－１）において凍結させた前脂肪細胞を解凍し、１５０ｃｍ２フラスコを用い、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で一晩培養した。
翌日に培養液を除去し、培養面をＤ－ＰＢＳで洗浄した後、トリプシン処理を行うことで、前脂肪細胞を回収した。本工程において得たヒトＦＶＩＩＩ遺伝子搭載レンチウイルスベクター液を１×１０９ＲＮＡｃｏｐｉｅｓ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬプロタミン硫酸塩含有、細胞濃度２．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、ＭＳＦ－ＢＭ／ＭＳＦ－Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ａで調整した。そして、２５ｃｍ２フラスコに５ｍＬを播種して遺伝子導入を開始し、翌日に培地交換を行った。
１回目の遺伝子導入から２日目および７日目にも同様に遺伝子導入操作を行い（計３回）、「ＦＶＩＩＩ遺伝子導入ヒト前脂肪細胞」とした。
試験開始まで、細胞は３００×ｇ、４℃、５分間の遠心分離により沈殿させ、細胞凍結保存液（ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ１）に懸濁し、－８０℃で凍結保存した。
遺伝子導入のために、レンチウイルスベクターを下記のように作製した。
最初に、ヒトＦＶＩＩＩ遺伝子におけるＢドメインのＮ型糖鎖修飾されるＡｓｎ残基の個数をＮ末端側から数えて５個とし、かつ、フューリン認識部位の機能が欠損され、７５８番目のＰｒｏ残基がＴｈｒ残基に置換された「ＦＶＩＩＩ改変体」を作製した。この「ＦＶＩＩＩ改変体」に、シグナルペプチドを付加した塩基配列をｐＬＶＳＩＮベクタープラスミド（タカラバイオ社製）に挿入し、ヒトＦＶＩＩＩ遺伝子搭載レンチウイルスベクタープラスミドを作製した。
このプラスミドより、パッケージングシステム（タカラバイオ社製）を利用して、ヒト細胞に導入可能なヒトＦＶＩＩＩ遺伝子搭載レンチウイルスベクター液を得た。
上記工程（７－１）において凍結させた前脂肪細胞を解凍し、１５０ｃｍ２フラスコを用い、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で一晩培養した。
翌日に培養液を除去し、培養面をＤ－ＰＢＳで洗浄した後、トリプシン処理を行うことで、前脂肪細胞を回収した。本工程において得たヒトＦＶＩＩＩ遺伝子搭載レンチウイルスベクター液を１×１０９ＲＮＡｃｏｐｉｅｓ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬプロタミン硫酸塩含有、細胞濃度２．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、ＭＳＦ－ＢＭ／ＭＳＦ－Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ａで調整した。そして、２５ｃｍ２フラスコに５ｍＬを播種して遺伝子導入を開始し、翌日に培地交換を行った。
１回目の遺伝子導入から２日目および７日目にも同様に遺伝子導入操作を行い（計３回）、「ＦＶＩＩＩ遺伝子導入ヒト前脂肪細胞」とした。
試験開始まで、細胞は３００×ｇ、４℃、５分間の遠心分離により沈殿させ、細胞凍結保存液（ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ１）に懸濁し、－８０℃で凍結保存した。
工程（７－３）細胞の回収、洗浄、濃縮及び保存
実施例１の工程（１－３）の方法に従って、基礎培地を「ＲＰＭＩ１６４０（Ｌ－グルタミン含有）培地」とする細胞保存液を調製し、工程（１－４）の方法に従って、細胞の回収、洗浄、濃縮及び保存を行った。
上記を経て、基礎培地を「ＲＰＭＩ１６４０（Ｌ－グルタミン含有）培地」とする高濃度細胞保存液に「ＦＶＩＩＩ遺伝子導入ヒト前脂肪細胞」を懸濁した、実施例７の高濃度細胞懸濁液を得た。
実施例１の工程（１－３）の方法に従って、基礎培地を「ＲＰＭＩ１６４０（Ｌ－グルタミン含有）培地」とする細胞保存液を調製し、工程（１－４）の方法に従って、細胞の回収、洗浄、濃縮及び保存を行った。
上記を経て、基礎培地を「ＲＰＭＩ１６４０（Ｌ－グルタミン含有）培地」とする高濃度細胞保存液に「ＦＶＩＩＩ遺伝子導入ヒト前脂肪細胞」を懸濁した、実施例７の高濃度細胞懸濁液を得た。
＜実施例８＞
下記のように、高濃度細胞保存液を調製し、当該細胞保存液に「ヒト骨髄由来間葉系幹細胞」を懸濁した高濃度細胞懸濁液を調製し、保存した。
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社製）を培養し、細胞を増殖させた。試験開始まで、細胞凍結保存液（ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ１）に懸濁し、－８０℃で凍結保存した。
実施例１の工程（１－３）の方法に従って細胞保存液を調製し、工程（１－４）の方法に従って細胞の回収、洗浄、濃縮及び保存を行った。
上記を経て、基礎培地を「ＲＰＭＩ１６４０培地」とする高濃度細胞保存液に「ヒト骨髄由来間葉系幹細胞」を懸濁した、実施例８の高濃度細胞懸濁液を得た。
下記のように、高濃度細胞保存液を調製し、当該細胞保存液に「ヒト骨髄由来間葉系幹細胞」を懸濁した高濃度細胞懸濁液を調製し、保存した。
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社製）を培養し、細胞を増殖させた。試験開始まで、細胞凍結保存液（ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ１）に懸濁し、－８０℃で凍結保存した。
実施例１の工程（１－３）の方法に従って細胞保存液を調製し、工程（１－４）の方法に従って細胞の回収、洗浄、濃縮及び保存を行った。
上記を経て、基礎培地を「ＲＰＭＩ１６４０培地」とする高濃度細胞保存液に「ヒト骨髄由来間葉系幹細胞」を懸濁した、実施例８の高濃度細胞懸濁液を得た。
＜試験例６：細胞形態による生細胞率の算出（異なる細胞種）＞
試験例１と同様にして、細胞の種類が異なる実施例１、２、７、８、比較例１、２の高濃度細胞懸濁液について、細胞生存率の評価を行った。
なお、実施例１、２、７について複数のサンプルで試験を行った。
試験例１と同様にして、細胞の種類が異なる実施例１、２、７、８、比較例１、２の高濃度細胞懸濁液について、細胞生存率の評価を行った。
なお、実施例１、２、７について複数のサンプルで試験を行った。
（試験例６の結果、考察）
細胞の種類が異なる実施例、比較例における生細胞率（細胞生存率）の経時的変化をまとめたものを図７に示す。なお、遺伝子組み換えヒト血清アルブミンを「ｒＨＡ」、アスコルビン酸を「ＡＡ」と表記した。
試験例６の結果から、実施例１、２、７、８の高濃度細胞懸濁液（１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）では、細胞の種類に依存せず、保存開始から７２時間経過後も高い細胞生存率を示した。具体的には、高濃度細胞保存液によって細胞を４℃で保存した時に、７２時間経過後における細胞生存率が８０％以上、より具体的には８５％以上、より具体的には９０％以上、より具体的には９５％以上の細胞生存率を示すことがわかった（実施例１：９８．４％（ｎ＝３）、実施例２：９６．７％（ｎ＝４）、実施例７：９６．７％（ｎ＝３）、実施例８：９５．３％（ｎ＝１））。
なお、実施例７、８について、試験例２、３と同様の細胞生存評価、細胞傷害評価を併せて行っており、保存開始から７２時間経過後も高い代謝活性を持つこと、また細胞傷害はみられないことをそれぞれ確認した。
細胞の種類が異なる実施例、比較例における生細胞率（細胞生存率）の経時的変化をまとめたものを図７に示す。なお、遺伝子組み換えヒト血清アルブミンを「ｒＨＡ」、アスコルビン酸を「ＡＡ」と表記した。
試験例６の結果から、実施例１、２、７、８の高濃度細胞懸濁液（１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）では、細胞の種類に依存せず、保存開始から７２時間経過後も高い細胞生存率を示した。具体的には、高濃度細胞保存液によって細胞を４℃で保存した時に、７２時間経過後における細胞生存率が８０％以上、より具体的には８５％以上、より具体的には９０％以上、より具体的には９５％以上の細胞生存率を示すことがわかった（実施例１：９８．４％（ｎ＝３）、実施例２：９６．７％（ｎ＝４）、実施例７：９６．７％（ｎ＝３）、実施例８：９５．３％（ｎ＝１））。
なお、実施例７、８について、試験例２、３と同様の細胞生存評価、細胞傷害評価を併せて行っており、保存開始から７２時間経過後も高い代謝活性を持つこと、また細胞傷害はみられないことをそれぞれ確認した。
＜実施例９、１０＞
上記実施例２のように、高濃度細胞保存液に、遺伝子を導入しない「ヒト前脂肪細胞」を懸濁した、実施例９、１０の高濃度細胞懸濁液を得た。
実施例９について、「細胞濃度」を１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬとし、「基礎培地」をＲＰＭＩ１６４０とし、「添加剤」を遺伝子組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＡ）、アスコルビン酸（ＡＡ）とした。アルブミン濃度を０．２（ｗ／ｖ）％、アスコルビン酸濃度を０．５ｍｇ／ｍＬとした。
実施例１０について、「細胞濃度」を１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬとし、「基礎培地」をＤＭＥＭ（低グルコース）とし、「添加剤」を遺伝子組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＡ）、アスコルビン酸（ＡＡ）とした。アルブミン濃度を０．２（ｗ／ｖ）％、アスコルビン酸濃度を０．５ｍｇ／ｍＬとした。
上記実施例２のように、高濃度細胞保存液に、遺伝子を導入しない「ヒト前脂肪細胞」を懸濁した、実施例９、１０の高濃度細胞懸濁液を得た。
実施例９について、「細胞濃度」を１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬとし、「基礎培地」をＲＰＭＩ１６４０とし、「添加剤」を遺伝子組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＡ）、アスコルビン酸（ＡＡ）とした。アルブミン濃度を０．２（ｗ／ｖ）％、アスコルビン酸濃度を０．５ｍｇ／ｍＬとした。
実施例１０について、「細胞濃度」を１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬとし、「基礎培地」をＤＭＥＭ（低グルコース）とし、「添加剤」を遺伝子組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＡ）、アスコルビン酸（ＡＡ）とした。アルブミン濃度を０．２（ｗ／ｖ）％、アスコルビン酸濃度を０．５ｍｇ／ｍＬとした。
＜実施例１１、１２＞
上記実施例１のように、高濃度細胞保存液に「ＬＣＡＴ遺伝子導入ヒト前脂肪細胞」を懸濁した、実施例１１、１２の高濃度細胞懸濁液を得た。
実施例１１について、「細胞濃度」を１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬとし、「基礎培地」をＲＰＭＩ１６４０（Ｌ－グルタミン含有）とし、「添加剤」を遺伝子組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＡ）、アスコルビン酸（ＡＡ）とした。アルブミン濃度を０．２（ｗ／ｖ）％、アスコルビン酸濃度を０．５ｍｇ／ｍＬとした。
実施例１２について、「細胞濃度」を１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬとし、「基礎培地」をＤＭＥＭ（低グルコース）とし、「添加剤」を遺伝子組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＡ）、アスコルビン酸（ＡＡ）とした。アルブミン濃度を０．２（ｗ／ｖ）％、アスコルビン酸濃度を０．５ｍｇ／ｍＬとした。
上記実施例１のように、高濃度細胞保存液に「ＬＣＡＴ遺伝子導入ヒト前脂肪細胞」を懸濁した、実施例１１、１２の高濃度細胞懸濁液を得た。
実施例１１について、「細胞濃度」を１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬとし、「基礎培地」をＲＰＭＩ１６４０（Ｌ－グルタミン含有）とし、「添加剤」を遺伝子組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＡ）、アスコルビン酸（ＡＡ）とした。アルブミン濃度を０．２（ｗ／ｖ）％、アスコルビン酸濃度を０．５ｍｇ／ｍＬとした。
実施例１２について、「細胞濃度」を１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬとし、「基礎培地」をＤＭＥＭ（低グルコース）とし、「添加剤」を遺伝子組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＡ）、アスコルビン酸（ＡＡ）とした。アルブミン濃度を０．２（ｗ／ｖ）％、アスコルビン酸濃度を０．５ｍｇ／ｍＬとした。
なお、実施例９、１１の上記ＲＰＭＩ１６４０にはピルビン酸ナトリウムが含まれていないが、ピルビン酸ナトリウムの有無によって細胞生存率、細胞の生存維持、細胞傷害に影響はほぼないことが確認されたため、ピルビン酸ナトリウムを添加しないこととした。
＜試験例７：細胞形態による生細胞率の算出（異なる基礎培地）＞
試験例５と同様にして、基礎培地が異なる実施例９、１０、１１、１２の高濃度細胞懸濁液について、生存率の評価を行った。
試験例５と同様にして、基礎培地が異なる実施例９、１０、１１、１２の高濃度細胞懸濁液について、生存率の評価を行った。
（試験例７の結果、考察）
実施例９、１０、１１、１２における生細胞率（細胞生存率）の経時的変化をまとめたものを図８に示す。なお、遺伝子組換えヒト血清アルブミンを「ｒＨＡ」、アスコルビン酸を「ＡＡ」と表記した。
試験例７の結果から、基礎培地を「ＲＰＭＩ１６４０」、「ＤＭＥＭ」とし、保存細胞を「ＬＣＡＴ遺伝子導入ヒト前脂肪細胞」、「ヒト前脂肪細胞」とした実施例９、１０、１１、１２の高濃度細胞保存液（１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）では、保存開始から７２時間経過後も高い細胞生存率を示した。具体的には、細胞を４℃で保存した時に、７２時間経過後における細胞生存率が９６％以上であることが示された（実施例９：９７．６％、実施例１０：９６．８％、実施例１１：９８．８％、実施例１２：９７．４％）。
実施例９、１０、１１、１２における生細胞率（細胞生存率）の経時的変化をまとめたものを図８に示す。なお、遺伝子組換えヒト血清アルブミンを「ｒＨＡ」、アスコルビン酸を「ＡＡ」と表記した。
試験例７の結果から、基礎培地を「ＲＰＭＩ１６４０」、「ＤＭＥＭ」とし、保存細胞を「ＬＣＡＴ遺伝子導入ヒト前脂肪細胞」、「ヒト前脂肪細胞」とした実施例９、１０、１１、１２の高濃度細胞保存液（１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）では、保存開始から７２時間経過後も高い細胞生存率を示した。具体的には、細胞を４℃で保存した時に、７２時間経過後における細胞生存率が９６％以上であることが示された（実施例９：９７．６％、実施例１０：９６．８％、実施例１１：９８．８％、実施例１２：９７．４％）。
また、基礎培地は「ＤＭＥＭ」よりも「ＲＰＭＩ１６４０」とした方が、細胞生存率が高いことが示された（実施例９、１１の細胞生存率は、それぞれ実施例１０、１２の細胞生存率よりも高かった）。上記試験を複数実施し、同様の試験結果となることが確認された。
また、実施例９、１１についてピルビン酸ナトリウムを敢えて添加しない方が細胞生存率が高くなることが確認された。
なお、実施例９、１０について、試験例２、３と同様の細胞生存評価、細胞傷害評価を行い、細胞の生存維持を確認し、細胞傷害はみられないことを確認した。
また、実施例９、１１についてピルビン酸ナトリウムを敢えて添加しない方が細胞生存率が高くなることが確認された。
なお、実施例９、１０について、試験例２、３と同様の細胞生存評価、細胞傷害評価を行い、細胞の生存維持を確認し、細胞傷害はみられないことを確認した。
＜試験例８：細胞形態による生細胞率の算出（長期の生存率）＞
試験例１と同様にして、基礎培地が異なる実施例９、１０の高濃度細胞懸濁液について、長期間における生存率の評価を行った。
試験例１と同様にして、基礎培地が異なる実施例９、１０の高濃度細胞懸濁液について、長期間における生存率の評価を行った。
（試験例８の結果、考察）
実施例９、１０における生細胞率（細胞生存率）の経時的変化をまとめたものを図９に示す。
試験例８の結果から、実施例９、１０の高濃度細胞懸濁液（１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）では、保存開始から１７０時間経過後も高い細胞生存率を示した。具体的には、高濃度細胞保存液によって細胞を４℃で保存したときに、１７０時間経過後における細胞生存率が８０％以上を示すことが分かった。特に、基礎培地を「ＲＰＭＩ１６４０培地」とした実施例９の場合には、１７０時間経過後における細胞生存率が９０％以上を示すことが分かった（実施例９：９４．０％、実施例１０：８１．４％）。
なお、上記試験を複数実施し、同様の試験結果となることが確認された。
実施例９、１０における生細胞率（細胞生存率）の経時的変化をまとめたものを図９に示す。
試験例８の結果から、実施例９、１０の高濃度細胞懸濁液（１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）では、保存開始から１７０時間経過後も高い細胞生存率を示した。具体的には、高濃度細胞保存液によって細胞を４℃で保存したときに、１７０時間経過後における細胞生存率が８０％以上を示すことが分かった。特に、基礎培地を「ＲＰＭＩ１６４０培地」とした実施例９の場合には、１７０時間経過後における細胞生存率が９０％以上を示すことが分かった（実施例９：９４．０％、実施例１０：８１．４％）。
なお、上記試験を複数実施し、同様の試験結果となることが確認された。
＜付記＞
実施例１～実施例１２をまとめると以下の通りである。
実施例１：ＬＣＡＴ遺伝子導入ヒト前脂肪細胞、ＲＰＭＩ１６４０
実施例２：ヒト前脂肪細胞、ＲＰＭＩ１６４０
実施例３：ヒト脂肪由来幹細胞、ＲＰＭＩ１６４０
実施例４：ヒト前脂肪細胞、ＲＰＭＩ１６４０、異なる添加剤の濃度
実施例５：ＬＣＡＴ遺伝子導入ヒト前脂肪細胞、ＲＰＭＩ１６４０、ピルビン酸ナトリウム
実施例６：ＬＣＡＴ遺伝子導入ヒト前脂肪細胞、ＤＭＥＭ
実施例７：ＦＶＩＩＩ遺伝子導入ヒト前脂肪細胞、ＲＰＭＩ１６４０
実施例８：ヒト骨髄由来間葉系幹細胞、ＲＰＭＩ１６４０
実施例９：ヒト前脂肪細胞、ＲＰＭＩ１６４０
実施例１０：ヒト前脂肪細胞、ＤＭＥＭ
実施例１１：ＬＣＡＴ遺伝子導入ヒト前脂肪細胞、ＲＰＭＩ１６４０
実施例１２：ＬＣＡＴ遺伝子導入ヒト前脂肪細胞、ＤＭＥＭ
実施例１～実施例１２をまとめると以下の通りである。
実施例１：ＬＣＡＴ遺伝子導入ヒト前脂肪細胞、ＲＰＭＩ１６４０
実施例２：ヒト前脂肪細胞、ＲＰＭＩ１６４０
実施例３：ヒト脂肪由来幹細胞、ＲＰＭＩ１６４０
実施例４：ヒト前脂肪細胞、ＲＰＭＩ１６４０、異なる添加剤の濃度
実施例５：ＬＣＡＴ遺伝子導入ヒト前脂肪細胞、ＲＰＭＩ１６４０、ピルビン酸ナトリウム
実施例６：ＬＣＡＴ遺伝子導入ヒト前脂肪細胞、ＤＭＥＭ
実施例７：ＦＶＩＩＩ遺伝子導入ヒト前脂肪細胞、ＲＰＭＩ１６４０
実施例８：ヒト骨髄由来間葉系幹細胞、ＲＰＭＩ１６４０
実施例９：ヒト前脂肪細胞、ＲＰＭＩ１６４０
実施例１０：ヒト前脂肪細胞、ＤＭＥＭ
実施例１１：ＬＣＡＴ遺伝子導入ヒト前脂肪細胞、ＲＰＭＩ１６４０
実施例１２：ＬＣＡＴ遺伝子導入ヒト前脂肪細胞、ＤＭＥＭ
Claims (7)
- 細胞を凍結しない状態で保存する細胞保存液であって、
基礎培地と、
前記基礎培地に添加される添加剤と、を含有し、
前記基礎培地は、細胞培養に用いられ、前記細胞を保存する培地であって、
前記添加剤は、遺伝子組み換えアルブミンと、アスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導体と、を少なくとも含み、
前記細胞を少なくとも１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞濃度で保存し、
前記細胞を１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞濃度で４℃で保存したときに、７２時間経過後における細胞生存率が８０％以上であって、前記細胞が機能を維持した状態であって、細胞傷害がみられない状態で前記細胞が保存され、
前記細胞は、ヒト由来の体細胞又はヒト由来の幹細胞であり、
前記基礎培地は、ＲＰＭＩ１６４０及びＤＭＥＭからなる群より選択される少なくとも１種類の培地であり、
前記遺伝子組み換えアルブミンの濃度が０．１～２．０（ｗ／ｖ）％であって、
前記アスコルビン酸又は前記アスコルビン酸誘導体の濃度が０．１～１０ｍｇ／ｍＬであることを特徴とする高濃度細胞保存液。 - 前記遺伝子組み換えアルブミンは、遺伝子組み換えヒト血清アルブミンであって、
前記細胞保存液は、細胞移植に用いられることを特徴とする請求項１に記載の高濃度細胞保存液。 - 前記細胞を１×１０８～１×１０９ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞濃度で保存することを特徴とする請求項１に記載の高濃度細胞保存液。
- 前記細胞を１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞濃度で４℃で保存したときに、
Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ－８を用いて７２時間経過後における０時間保存に対するＯＤ値比（光学濃度比）が０．７以上の値を示して前記細胞が機能を維持した状態で保存され、かつ、
ＬＤＨ細胞毒性アッセイキットを用いて７２時間経過後におけるＯＤ値（光学濃度）の相対値が８％以下の値を示して細胞傷害がみられない状態で前記細胞が保存されることを特徴とする請求項１に記載の高濃度細胞保存液。 - 前記細胞を１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞濃度で４℃で保存したときに、７２時間経過後における細胞生存率が８０％以上であって、前記細胞が機能を維持した状態であって、細胞傷害がみられない状態で前記細胞が保存されることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載の高濃度細胞保存液。
- 前記細胞を１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞濃度で４℃で保存したときに、１７０時間経過後における細胞生存率が８０％以上であって、前記細胞が機能を維持した状態であって、細胞傷害がみられない状態で前記細胞が保存されることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載の高濃度細胞保存液。
- 細胞保存液に細胞を懸濁し、前記細胞を凍結しない状態で少なくとも１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞濃度で保存する方法であって、
前記細胞保存液は、基礎培地と、前記基礎培地に添加される添加剤と、を含有し、
前記基礎培地は、細胞培養に用いられ、前記細胞を保存する培地であって、
前記添加剤は、遺伝子組み換えアルブミンと、アスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導体と、を少なくとも含み、
前記細胞を１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞濃度で４℃で保存したときに、７２時間経過後における細胞生存率が８０％以上であって、前記細胞が機能を維持した状態であって、細胞傷害がみられない状態で前記細胞が保存され、
前記細胞は、ヒト由来の体細胞又はヒト由来の幹細胞であり、
前記基礎培地は、ＲＰＭＩ１６４０及びＤＭＥＭからなる群より選択される少なくとも１種類の培地であり、
前記遺伝子組み換えアルブミンの濃度が０．１～２．０（ｗ／ｖ）％であって、
前記アスコルビン酸又は前記アスコルビン酸誘導体の濃度が０．１～１０ｍｇ／ｍＬであることを特徴とする高濃度細胞保存方法。
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