JP7828610B2 - バイオセンサおよびバイオセンサの製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、生体膜中における分子の挙動を調べるバイオセンサおよびその製造方法に関する。

微小なマイクロチップの表面で、人工生体膜中における膜タンパク質の動作を調べるセンサデバイスや、膜タンパク質の機能を利用するためのバイオデバイスの研究が精力的に行われている。

このようなマイクロデバイスとしては、例えば、非特許文献１には、マイクロチップの固体表面に、膜タンパク質の機能を維持するために必要である生体膜を模した流動性のある人工脂質二分子膜を形成したものが開示されている。

一方、二次元層状物質のグラフェンは、機能性炭素材料として電子デバイス分野などで注目されている。グラフェンの特徴として、物理的に大変強固であり、熱伝導度、電子移動度が極めて高い材料であること、また、化学的にも熱的な安定性が非常に高いこと等が知られている。これらの特徴から、グラフェンは、次世代の電子材料として、電極、化学センサ、バイオセンサを初めとする、様々なデバイスの技術分野への応用が期待されている。

グラフェンの製造方法として、例えば特許文献１は、固体基板の一方または両方の主面に、芳香族低分子からなる接着層を形成する接着層形成工程と、金属基板に成長させたグラフェン膜を、前記接着層上に転写するグラフェン膜転写工程と、を有するグラフェン膜の保持方法を開示している。この技術は、製造過程における損傷の少ない状態で、効率的かつ容易にグラフェンを保持することを可能とする、グラフェン膜の保持方法を提供し、また、製造過程における損傷の少ない状態のグラフェン膜を備えた、構造体を提供しようとするものである。
また、例えば、非特許文献２～４では、酸化グラフェンを親水化処理する技術が開示されている。

特開２０２１－５６０１号公報

Ｇｒｏｖｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ａｃｃ． Ｃｈｅｍ． Ｒｅｓ． ２００２， ３５， １４９－１５７． Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ａｄｖ． Ｆｕｎｃｔ． Ｍａｔｅｒ． ２０１５， ２５， ５８０９－５８１５． Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｐｏｌｙｍｅｒ ２０５ （２０２０）， １２２８５１． Ｍａｏ ｅｔ ａｌ．， ＲＳＣ Ａｄｖ．， ２０１６， ６， １１１６３２－１１１６３９．

本発明者らは、グラフェンと脂質二分子膜の性質に着目した。すなわち、二次元層状物質のグラフェンは電気特性に優れ、バイオセンサの電極として幅広い応用が見込まれる。このグラフェン上に脂質二分子膜を形成し膜タンパク質を導入すると、膜タンパク質を流れるイオンの高感度検出が可能となり、定量評価が期待できる。また脂質二分子膜を任意の位置にパターニング・集積化することができれば多チャンネル同時測定系の構築が可能となることが期待される。

しかしながら、グラフェンの表面は疎水性であるため、親水表面で二重膜構造を形成し流動性を維持する脂質膜を配置することが困難であった。例えば、非特許文献２－４に示されているように、酸化グラフェンでは親水化処理の報告例があるが、単層グラフェンでは表面への化学修飾というｗｅｔな化学反応プロセス（種々の薬品や溶媒への暴露、洗浄または乾燥など）に耐えるようにグラフェンを固体基板に担持しておく技術が欠けていた。またグラフェンは疎水性の膜であるため、親水性ポリマーの修飾に用いる水を含んだ環境では、このようなダメージが特に大きく固体基板からはがれやすい。酸化グラフェンは官能基があるため水溶液中に安定に分散するが、グラフェン膜はそのような官能基をもたないため、溶液分散法を使用することができない。

上記事情に鑑み、本発明は、脂質二分子膜内の分子を流れるイオンの高感度検出が可能であり、脂質二分子膜を任意の位置にパターニングおよび集積化することができるバイオセンサを提供することを目的としている。

本発明の一態様は、固体基板、前記固体基板上に設けられたグラフェン膜、前記グラフェン膜上に設けられたリンカー分子、前記リンカー分子に結合した親水性ポリマー、および、前記親水性ポリマーに結合した脂質二分子膜、を備えたバイオセンサである。

本発明の一態様は、固体基板上にグラフェン膜を設けるグラフェン形成工程、前記グラフェン膜上にリンカー分子を設けるリンカー形成工程、前記リンカー分子に親水性ポリマーを結合させる親水性ポリマー形成工程、および前記親水性ポリマーに脂質二分子膜を結合させる脂質二分子膜形成工程、を備えたバイオセンサの製造方法である。

本発明により、脂質二分子膜内の分子を流れるイオンの高感度検出が可能であり、脂質二分子膜を任意の位置にパターニングおよび集積化することができるバイオセンサを提供することが可能となる。

第１の本実施形態に係るバイオセンサの側面概略図である。 第２の本実施形態に係るバイオセンサの側面概略図である。 第２の実施形態のバイオセンサの製造方法を示す側面概略図である。 ポリエチレンイミン修飾グラフェン基板上に形成した脂質二分子膜のローダミン由来の蛍光回復曲線を示すグラフ図である。

以下、本発明に係るバイオセンサ及びその製造方法について、実施形態を示して説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。

＜第１の実施形態＞
（本実施形態のバイオセンサの構成）
図１は、本実施形態に係るバイオセンサ１の側面概略図である。バイオセンサ１は、固体基板２、グラフェン膜３、リンカー分子４、親水性ポリマー５、および脂質二分子膜６を備える。

固体基板２は、デバイスを形成する基板である。また、グラフェン膜３を形成する対象となる部材である。固体基板２の構成素材は、プラスチック、ガラス、石英またはシリコンなどから選択することができる。また、固体基板２は、表面が平坦な形状とするのが好ましい。具体的には、グラフェン膜３との接着部が形成される側にＳｉＯ２等の酸化膜が形成された、酸化膜付シリコン基板などを用いることができる。図に示した形態では、固体基板２としてほぼ表面が平坦なガラス板を使用している。

グラフェン膜３は、グラフェンからなる層である。グラフェンは二次元に配列したＳＰ^２結合の炭素が単原子膜状となった物質であり、膜１枚のグラフェンの厚みは原子１層分で、およそ１ｎｍである。グラフェン膜３の１層を構成するグラフェンは、連続した1枚膜でも複数の膜をパッチワーク状に貼り合わせた形態でもよい。グラフェン膜３を構成するグラフェンの層数については、特に限定されないが、１～５層程度であることが好ましい。

グラフェン膜３は、固体基板２上に従来知られた手段を用いて設けることができる。本実施形態では、別の金属基板上に化学気相成長法（ＣＶＤ法）等を用いて成長させたグラフェン膜３を転写している。グラフェン膜３は、例えば特許文献１に記載の構成で設けられていてもよい。

リンカー分子４は、グラフェン膜３と親水性ポリマー５を接着するための分子である。接着は、化学的な結合であっても、物理的な付着であってもよい。リンカー分子４は、疎水性のグラフェン膜３と親水性の親水性ポリマー５のいずれとも接着可能な構造を有することが好ましい。このような化合物には、例えば疎水的な骨格と、親水的な基の両方を備える化合物を用いることができる。

リンカー分子４は、グラフェン膜３上の少なくとも一部に設けられている。リンカー分子４を設ける部位は、後述する親水性ポリマー５を設ける部位、すなわち脂質二分子膜６を設ける状態によって適宜選択できる。図に示した例では、リンカー分子４は親水性ポリマー５が設けられた部位のみ図示されているが、リンカー分子４はより広くグラフェン膜３上を覆うように設けてもよい。

リンカー分子４には、ピレン骨格を有する分子を用いてもよい。ピレン骨格を有する分子とは、ピレン構造を一部に備える分子である。
リンカー分子４にピレン骨格を有する分子を用いることで、複数の六員環からなるピレン構造が、炭素がＳＰ^２結合しいわゆる六角形格子構造をとったグラフェンの構造と親和性が高く、グラフェンと接着しやすい効果がある。
本実施形態では、ピレン骨格を有する分子として、ピレンブタン酸を用いている。

グラフェン膜３上にリンカー分子４を設ける構造、すなわち、グラフェン膜３とリンカー分子４とが接着する構造としては、リンカー分子４の構造に応じて適宜選択できる。例えば、リンカー分子４にピレンブタン酸を用いる場合、ピレンブタン酸のブタン酸構造側を後述するように活性化した後、有機溶媒で溶液とし、グラフェン膜３上に滴下することでリンカー分子４を接着させてもよい。

親水性ポリマー５は、親水性を有する高分子である。親水性ポリマー５を構成する化合物は適宜選択でき、例えば炭化水素重合高分子、またペプチド重合高分子などであってもよく、単独重合体でも共重合体でもよい。これらの例としては、炭化水素重合高分子としてはポリエチレンイミン、ポリエチレングリコールなどを用いることができる。ペプチド重合高分子としては、タンパク質またはタンパク質由来のポリペプチドを用いることができる。タンパク質由来の高分子としてさらに具体的には、アビジンやビオチン、またはその断片でもよい。

親水性ポリマー５を備えることで、グラフェン膜３と脂質二分子膜６とが、親水性ポリマー５の分子量に相当する距離を隔てて接着する。すなわち、本実施形態のバイオセンサでは、グラフェン膜３と脂質二分子膜６とが親水性ポリマー５の大きさに相当する分子間距離を備えている。したがって、疎水性のグラフェン膜３と親水性の脂質二分子膜６との性質の異なる分子が分子間距離を隔てずに密着しているよりも、安定してグラフェン膜３と脂質二分子膜６を備える構造を保つことができる。

親水性ポリマー５の分子量は、例えば、６００～７５００００などから選択することができる。親水性ポリマー５がこの範囲であると、疎水性のグラフェン膜３と親水性の脂質二分子膜６との分子間距離が適切なものとなる。

親水性ポリマー５をリンカー分子４に結合する手段は、これらの分子の構造に応じて適宜選択することができる。本実施形態では、リンカー分子４のピレンブタン酸のＣＯＯＨ基をスクシンイミドで活性化して親水性ポリマー５と結合させている。

脂質二分子膜６は、脂質分子６２の２分子を構成単位とし、この構成単位が配列して形成された膜である。具体的には、図に示すように、親水性および疎水性部位を有する脂質分子６２が２分子、疎水性部位を向かい合わせとして構成単位を形成し、この構成単位が略平行に配列して膜となっている構造である。換言すれば、脂質分子６２が配列した膜が２膜、疎水性部位を対向するように重ね合わさっている。この構造のため、脂質二分子膜６の表面は膜の表裏とも親水性である。
脂質二分子膜６は、前記脂質分子の他の成分を含んでいることがある。例えば、重ね合わさった２膜の片方または両方を貫通するように膜タンパク質６１を備えていることがある。図に示した例では、膜タンパク質６１は２膜の両方を貫通している。

脂質二分子膜６は、脂質分子６２の種類に応じて適宜選択できる。例えば、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）などの不飽和脂質分子や、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）やなどの飽和脂質分子とコレステロールを構成材料とすることが好ましい。また、脂質分子６２の種類は、１種類でも多種類が混合されていても構わない。

脂質二分子膜６は、後述するように、例えば、脂質分子６２から構成される脂質膜ベシクルを親水性ポリマー修飾グラフェン上に展開することで形成されている。

（本実施形態のバイオセンサの効果）
本実施形態のバイオセンサ１は、グラフェン膜３と脂質二分子膜６を備えているので、脂質二分子膜内の分子を流れるイオンの高感度検出が可能である。

本実施形態のバイオセンサ１は、リンカー分子４および親水性ポリマー５を介してグラフェン膜３と脂質二分子膜６が保持されているので、製造時にこの構成を好適に形成することができ、また、製造後もこの構成を維持しやすい。従来、グラフェン膜３と脂質二分子膜６を備えた構成を形成または維持するのは、グラフェン膜３が疎水性で脂質二分子膜６が親水性であるという性質上困難であった。本実施形態では、リンカー分子４および親水性ポリマー５を備えることで、グラフェン膜３と脂質二分子膜６を保持する構造を形成可能であり、また流動性を維持する脂質二分子膜６を配置することができる。

本実施形態は、グラフェン膜３と脂質二分子膜６の２種類の二次元材料を合体した、新たなバイオ分析用電子デバイスを実現するための要素技術であり、バイオ・医療関連の研究ツールとしての応用や、同分野における産業応用が期待される。

＜第２の実施形態＞
図２は、本実施形態に係るバイオセンサ１Ａの側面概略図である。バイオセンサ１Ａは、グラフェン膜３が、脂質二分子膜６が設けられておらず疎水性の部位３ａと、脂質二分子膜６が設けられ親水性の部位３ｂとを有している。第１の実施形態と同じ構成については、同符号を付して説明を省略する。

本実施形態では、バイオセンサ１Ａのグラフェン膜３上に後述の製造方法で説明するレジスト層を設け、レジスト層にリソグラフィ法等によって一定のパターンを形成した上で、リンカー分子４がパターンの部位に設けられてなる。その後、レジスト層は除去されている。

すなわち、リンカー分子４の設けられた箇所に親水性ポリマー５および脂質二分子膜６が形成されているので、前記パターンの設けられた箇所が親水性の部位３ｂ、設けられなかった箇所が疎水性の部位３ａとなっている。

本実施形態では、第１の実施形態の備えた効果に加えて、リンカー分子４はグラフェン膜３上にパターンを形成するように形成されることもでき、これにより親水性ポリマー５および脂質二分子膜６をグラフェン膜３上の任意の箇所に設けるようにすることができる。これにより、疎水性の部位３ａと親水性の部位３ｂをともに有するグラフェン膜３を備えたバイオセンサ１Ａとすることができ、その性質に応じた分析に応用することができる。脂質二分子膜６を任意のパターンで配置することができ、脂質二分子膜６の形態に応じた分析が可能である。

（本実施形態のバイオセンサの製造方法）
ついで、第２の実施形態のバイオセンサの製造方法について説明する。図２は、本実施形態のバイオセンサの製造方法を示す側面概略図である。
本実施形態のバイオセンサの製造工程は、固体基板上にグラフェン膜を設けるグラフェン形成工程、グラフェン膜上にリンカー分子を設けるリンカー形成工程、リンカー分子に親水性ポリマーを結合させる親水性ポリマー形成工程、および親水性ポリマーに脂質二分子膜を結合させる脂質二分子膜形成工程を備える。
また、本実施形態では、グラフェン形成工程についで、グラフェン層上にレジスト層を形成するレジスト層形成工程、レジスト層にパターンを形成するパターン形成工程、および、親水性ポリマー形成工程についで、レジスト層を除去するレジスト層除去工程を備える。

グラフェン形成工程（図示せず）では、固体基板２や構成するグラフェン膜３の構成に応じて、従来知られた方法で行うことができる。前述したように、本実施形態では、別の金属基板上に化学気相成長法（ＣＶＤ法）等を用いて成長させたグラフェン膜３を転写する。

特に、グラフェン膜３は、例えば特許文献１に記載の構成で設けられていてもよい。この手段では、グラフェン膜３について表面処理プロセスを行う際に、例えば親水性ポリマー５で処理するなどの、水に含んだ処理に対してグラフェン膜３が剥がれる等が起こりづらい、グラフェン固体基板が得られる。このため、電極などのデバイスとして実用可能なサイズ（数ｍｍ四方以上）の固体基板２およびグラフェン膜３を生成することができる。

ついで、本実施形態では、本実施形態では、グラフェン膜３上にリンカー分子４を設けない箇所であるレジスト層３１を形成するレジスト層形成工程を行う。
図２（ａ）に示すように、本実施形態では、レジスト層３１はグラフェン膜３の略全表面を覆うように形成する。レジスト層３１の形成法は、従来知られた電子線レジストの形成法などを用いてもよい。

ついで、図２（ｂ）に示すように、レジスト層３１にパターン３２を形成するパターン形成工程を行う。パターン３２の形成は、例えばリソグラフィ法により行うことができる。具体的には、リソグラフィ法としては、フォトリソグラフィ法、または電子ビームリソグラフィ法を用いることができる。リソグラフィ法により、パターン３２の形状を描画し、現像液により描画した箇所を除去することで、レジスト層３１が除去された箇所としてパターン３２を形成してもよい。

ついで、図３（ｃ）に示すように、グラフェン膜３上にリンカー分子４を設けるリンカー形成工程、およびリンカー分子４に親水性ポリマー５を結合させる親水性ポリマー形成工程を行う。図は、リンカー形成工程および親水性ポリマー形成工程（疎水性のグラフェン膜３上に親水性ポリマー５が設けられるため、水化処理ともいう）を行った後である。

リンカー形成工程において、グラフェン膜３上にリンカー分子４を設ける手段は、リンカー分子４の構造に応じて適宜行ってよい。例えば、リンカー分子４としてピレンブタン酸を用いた場合、リンカー分子４を有機溶媒、例えばジメチルホルムアミド等に溶解し、グラフェン膜３に滴下して、静置して反応を行わせた後、有機溶媒を除去してもよい。
また、親水性ポリマー形成工程に親水性ポリマー５をリンカー分子４に結合できるよう、リンカー分子４を活性化させてからグラフェン膜３上に設けてもよい。この操作は、ピレンブタン酸のＣＯＯＨ基をスクシンイミドで活性化したピレンブタン酸スクシンイミドエステルとする等で行うことができる。

親水性ポリマー形成工程において、親水性ポリマー５をリンカー分子４に結合する手段は、これらの分子の構造に応じて適宜選択することができる。本実施形態では、リンカー分子４の設けられた固体基板２に対して、親水性ポリマー５の水溶液を添加することで、親水性ポリマー５を前述の活性化したリンカー分子４に結合させてもよい。

ついで、図３（ｄ）に示すように、レジスト層３１を除去するレジスト層除去工程を行う。レジスト層３１の除去は、例えば有機溶媒などの化学的な処理や、超音波などの物理的な処理、またはこれらの併用によって行うことができる。有機溶媒としては、例えばアセトンまたはメチルエチルケトン等を用いることができる。

ついで、図３（ｅ）に示すように、親水性ポリマー５に脂質二分子膜を結合させる脂質二分子膜形成工程を行う。図に示した例では、脂質二分子膜は、パターンの形成によりグラフェン膜３の全面を覆っておらず側面が途切れているので、脂質会合して袋状の二分子膜となった脂質膜ベシクルの形状となっている。
本実施形態では、脂質二分子膜として脂質膜ベシクルを別の電極基板上に作成し、ついで、固体基板２上に展開することで、脂質二分子膜６を結合させている。

脂質膜ベシクルを作製する代表的な手法としては。静置水和法や電界形成法がある。ベシクルの作製手法は特に限定されないが，巨大なベシクルが作製しやすく，また反応時間や反応プロセスの簡易性から，電界形成法を採用することが好ましい。
電界形成法は，酸化インジウムスズ（ＩＴＯ）などの電極上に，脂質分子を薄膜化した後，交流電場をかけて水溶液中に巨大脂質膜ベシクルを形成する手法である。サイズのそろったベシクルを得るためには、ＩＴＯ基板上に厚さ数十ｎｍ～数μｍの均一な脂質分子の薄膜を形成することが好ましく、また、交流電場は数百ｍＶ～２Ｖ程度の印加条件が好ましい。該電場範囲よりも低い電場強度では，ベシクルの収量が低く，該電場範囲よりも高い電場強度では、ベシクルの構造破壊や水の電気分解が生じ、ベシクルが製造できない可能性があるからである。

脂質膜ベシクルを固体基板２上に展開するには、前記脂質膜ベシクルの分散液を固体基板２上に添加することで行うことができる。具体的には、固体基板２の略全面に中性の緩衝液を滴下し、さらに脂質膜ベシクル分散液を溶液中に滴下し、静置することで、脂質膜ベシクルを基板上に展開することができる。球状構造を有する脂質膜ベシクルは基板に衝突し、その球状構造が破壊されることで二分子膜を形成し、表面の親水基が親水性ポリマー５に結合する。
なお、このとき、球状構造の破壊を促進する試薬を用いても良い。例えばカルシウムなどの２価陽イオンや膜に穴を開けるペプチドなどを用いることができる。

この実施形態の製造方法によれば、親水性ポリマー５がフォトリソグラフィ法や、電子ビームリソグラフィ法によって設けられていることによって、親水性ポリマー５はグラフェン膜３上の任意の位置に設けられている。すなわち、親水性ポリマー５上に後述する脂質二分子膜６が結合しているので、上記任意の位置に脂質二分子膜６が設けられている。グラフェン膜３上にレジスト層３１およびパターン３２を形成することで、リンカー分子４および親水性ポリマー５がグラフェン膜３上に疎水性を有する箇所を設けることができる。その結果、グラフェン膜３上に疎水面と親水面のそれぞれの領域ができ、グラフェン膜３上に脂質二分子膜のパターニングが行われている。その結果、任意のパターンの形状の脂質二分子膜６上の検査が可能となっている。

他の実施形態として、例えば図１では、複数の親水性ポリマー５に１つの脂質二分子膜６が結合し、その結果、図示では脂質二分子膜６がグラフェン膜３の略全面を覆うように構成されているが、この他に、脂質二分子膜６がグラフェン膜３の一部のみを覆うように形成されていてもよい。この構成は、親水性ポリマー５の相互の距離などの配置のパターンによって調整することができる。

また、本実施形態の製造方法は第２の実施形態のバイオセンサ１Ａの製造方法だが、レジスト層形成工程、パターン形成工程、および、レジスト層除去工程を省けば、第１の実施形態のバイオセンサ１の製造方法とすることもできる。
すなわち、親水性ポリマー５や脂質二分子膜６を設ける位置のパターニングを行う必要がない場合は、前記レジスト層形成、パターン形成工程またはレジスト層除去工程を省略し、グラフェン膜３に対して直接にリンカー形成工程、親水性ポリマー形成工程を行ってもよい。

以上、この発明の実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、この発明の要旨を逸脱しない範囲の設計等も含まれる。

以下、実施例および比較例により、本発明の効果をより明らかなものとする。なお、本発明は、以下の実施例のみに限定されるものではなく、その要旨を変更しない範囲で適宜変更して実施できるものである。

＜親水性高分子ポリマー修飾グラフェン基板の作製＞
固体基板として、１８×１８ｍｍ^２のカバーガラス表面に、銅箔上に化学気相成長したグラフェンを転写した。
次に、グラフェン表面に親水性ポリマーを固定するためのリンカー分子（接着分子）として、ピレンブタン酸を導入した。ピレンブタン酸のＣＯＯＨ基をスクシンイミドで活性化したピレンブタン酸スクシンイミドエステルの０．５ｍＭジメチルホルムアミド溶液を、グラフェン表面に滴下して１時間静置した後、ジメチルホルムアミドで洗浄し、風乾した。

次いで、親水性ポリマーであるポリエチレンイミンを０．３％溶解した水溶液をグラフェン上に滴下した。
ポリエチレンイミンの親水効果を評価するため、ポリエチレンイミン修飾あり・なしでグラフェン表面の接触角を評価したところ、修飾なしでは７５－８０°、修飾ありでは５５－６０°と接触角が変化した。この結果から、修飾による親水化が確認された。

＜巨大脂質膜ベシクルの作製および基板への展開＞
脂質二分子膜は以下のように形成した。ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）のクロロホルム溶液を調製した。その溶液内には，蛍光ラベル剤としてローダミン－ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（Ｒｈｏｄ－ＤＯＰＥ）を０．１モル％含有させた。続いて、ＩＴＯ基板（ガラス上に膜厚１００ｎｍのＩＴＯが薄膜化された基板、サイズ４０×４０ｍｍ、５０～１００Λ）上に、前記クロロホルム溶液２００μＬを均一に塗布した。この基板を、室温で２時間、減圧乾燥して、クロロホルム溶媒を完全に除去することで、均一な脂質分子薄膜をＩＴＯ基板上に形成した。その上に、窓部を有するシリコンゴム（外寸３０×３０ｍｍ、厚さ１ｍｍのシリコンゴムを２０×２０ｍｍのサイズでくり貫いた窓部を有する）を密着して配置し、窓部に２００ｍＭのスクロース水溶液５００μＬを滴下した。さらに，その上部にＩＴＯ基板を気泡が入らないように配置し、シリコンゴム窓部にある溶液をＩＴＯ基板で挟み込んだ。続いて、ＩＴＯ基板にクリップ電極を接合し、室温で交流電場（正弦波、１Ｖ、１０Ｈｚ）を２時間印加することで、電界形成法により巨大脂質膜ベシクルをスクロース溶液中に分散して形成させた。励起波長５６１ｎｍを使用して蛍光観察を行った場合、脂質二分子膜内に一様に存在するローダミン分子の蛍光が観測されることで、脂質二分子膜の評価が可能である。

ついで、ポリエチレンイミン修飾グラフェン基板にＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）を滴下した。さらに、前記巨大脂質膜ベシクル分散液を溶液中に滴下し、静置することで巨大脂質膜ベシクルを基板上に展開した。球状構造を有するベシクルは基板に衝突し、その球状構造が破壊されることで二分子膜を形成する。

形成した脂質二分子膜が流動性を維持しているか、光褪色後蛍光回復法を用いて確認した。ある部分にレーザーを集光し、その部分を褪色（退色）させた後、その部分の蛍光の回復を観察する手法であり褪色した周りの分子が動ける箇所は膜が流動性を維持している。
図４は、ポリエチレンイミン修飾グラフェン基板上に形成した脂質二分子膜のローダミン由来の蛍光回復曲線である。褪色後、蛍光強度は回復しており、形成した脂質分子膜が流動性を維持していることが示された。以上の結果より、本手法でグラフェン表面に安定で流動性のある脂質二分子膜の保持が可能となることが示された。

本発明によれば、固体基板、前記固体基板上に設けられたグラフェン膜、前記グラフェン膜上に設けられたリンカー分子、前記リンカー分子に結合した親水性ポリマー、および、前記親水性ポリマーに結合した脂質二重膜分子、を備えたバイオセンサおよびその製造方法が得られる。

１，１Ａ…バイオセンサ， ２…固体基板， ３…グラフェン膜， ３ａ…疎水性の部位， ３ｂ…親水性の部位， ４…リンカー分子， ５…親水性ポリマー， ６…脂質二分子膜， ６１…膜タンパク質， ３１…レジスト層， ３２…パターン， ６２…脂質分子

Claims (5)

1. 固体基板、
   前記固体基板上に設けられたグラフェン膜、
   前記グラフェン膜上に設けられたリンカー分子、
   前記リンカー分子に結合した親水性ポリマー、および、
   前記親水性ポリマーに結合した脂質二分子膜、
   を備え、
   前記リンカー分子はピレンブタン酸であり、
   前記親水性ポリマーはポリエチレンイミン、ポリエチレングリコール、アビジンもしくはビオチン、またはアビジンもしくはビオチン由来のポリペプチドであり、
   前記グラフェン膜を電極として備える、バイオセンサ。
2. 固体基板上にグラフェン膜を設けるグラフェン形成工程、
   前記グラフェン膜上にリンカー分子を設けるリンカー形成工程、
   前記リンカー分子に親水性ポリマーを結合させる親水性ポリマー形成工程、および
   前記親水性ポリマーに脂質二分子膜を結合させる脂質二分子膜形成工程、
   を備え、
   前記リンカー分子はピレンブタン酸であり、
   前記親水性ポリマーはポリエチレンイミン、ポリエチレングリコール、アビジンもしくはビオチン、またはアビジンもしくはビオチン由来のポリペプチドであり、
   前記グラフェン膜を電極とするよう構成する、バイオセンサの製造方法。
3. 前記グラフェン形成工程についで、
   前記グラフェン膜上にレジスト層を形成するレジスト層形成工程、
   前記レジスト層にパターンを形成するパターン形成工程、および、
   前記親水性ポリマー形成工程についで、
   前記レジスト層を除去するレジスト層除去工程、
   を備えた、請求項２に記載のバイオセンサの製造方法。
4. 前記パターン形成工程は、リソグラフィ法により行う、請求項３に記載のバイオセンサの製造方法。
5. 前記脂質二分子膜形成工程は、電解形成法により作成した脂質膜ベシクルを反応させて行う、請求項２または３に記載のバイオセンサの製造方法。