JP7822652B2 - 新規なｐｄｌ１単一ドメイン抗体の開発 - Google Patents
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Description
技術分野
本発明は、生物医学または生物製薬の技術分野に属し、具体的に、特異的にＰＤＬ１を標的とする単一ドメイン抗体およびその使用に関する。
本発明は、生物医学または生物製薬の技術分野に属し、具体的に、特異的にＰＤＬ１を標的とする単一ドメイン抗体およびその使用に関する。
背景技術
ＰＤ－１／ＰＤＬ１免疫療法（Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）は最も成功している腫瘍免疫療法の一つで、腫瘍治療の革命を起こし、癌治療の変革を率いている。免疫チェックポイント阻害剤は十分に人体自身の免疫系を利用して癌に抵抗するようなもので、ＰＤ－１／ＰＤＬ１シグナル経路を遮断することによって癌細胞を死亡させ、多くの種類の腫瘍を治療する潜在能力を持ち、実質的に末期腫瘍患者の生存期間を改善し、腫瘍患者の「特効」薬になっている。
ＰＤ－１／ＰＤＬ１免疫療法（Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）は最も成功している腫瘍免疫療法の一つで、腫瘍治療の革命を起こし、癌治療の変革を率いている。免疫チェックポイント阻害剤は十分に人体自身の免疫系を利用して癌に抵抗するようなもので、ＰＤ－１／ＰＤＬ１シグナル経路を遮断することによって癌細胞を死亡させ、多くの種類の腫瘍を治療する潜在能力を持ち、実質的に末期腫瘍患者の生存期間を改善し、腫瘍患者の「特効」薬になっている。
現在、国内外において既にいくつかのＰＤ－１抗体およびＰＤ－１阻害剤が市販され、ＰＤ－１抗体に類似し、ＰＤＬ１はＰＤＬ１とＴ細胞の表面のＰＤ－１の結合が媒介する免疫抑制を遮断し、再びＴ細胞を腫瘍細胞を認識して殺傷するように活性化させることで、腫瘍の生長を抑制することができる。ＰＤ－１モノクローナル抗体と違うのは、腫瘍細胞または腫瘍浸潤免疫細胞に発現されたＰＤＬ１と結合するが、ＰＤ－１モノクローナル抗体はＰＤ－１と結合する。
しかしながら、現在のＰＤ－１抗体は以下のことによって制限されている：（１） ＰＤ－１抗体はＰＤ－１およびＰＤＬ１経路の遮断以外、ＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ２経路に影響する可能性があり、間質性肺炎などの副作用の発生につながる；（２） 一部の患者にＰＤ－１モノクローナル抗体の治療が無効かＰＤ－１薬剤耐性の場合があり、このような患者には、代わる薬物が必要である；（３） ＰＤ－１抗体の有効率と安全性はまだ改善が必要である。
そのため、本分野では、より良い治療効果が得られ、適用の範囲がより広くかつ安全性がより良い、ＰＤ－１／ＰＤＬ１シグナル経路を抑制する新規な薬物の開発が切望されている。
発明の概要
本発明の目的は、ＰＤＬ１に対するナノ抗体およびその使用を提供することにある。
本発明の第一の側面では、ＰＤＬ１に対するナノ抗体を提供する。
もう一つの好適な例において、前記ＰＤＬ１に対するナノ抗体は特異的にＰＤＬ１に結合することができる。
本発明の目的は、ＰＤＬ１に対するナノ抗体およびその使用を提供することにある。
本発明の第一の側面では、ＰＤＬ１に対するナノ抗体を提供する。
もう一つの好適な例において、前記ＰＤＬ１に対するナノ抗体は特異的にＰＤＬ１に結合することができる。
もう一つの好適な例において、前記ＰＤＬ１に対するナノ抗体の相補性決定領域ＣＤＲは、以下の群から選ばれる一つまたは複数である：
（１） 配列番号７で示されるＣＤＲ１、配列番号８で示されるＣＤＲ２、および配列番号 ９で示されるＣＤＲ３；
（２） 配列番号１０で示されるＣＤＲ１、配列番号１１で示されるＣＤＲ２、および配列番号 １２で示されるＣＤＲ３；
（３） 配列番号１０で示されるＣＤＲ１、配列番号１３で示されるＣＤＲ２、および配列番号 １４で示されるＣＤＲ３；
（４） 配列番号１０で示されるＣＤＲ１、配列番号１３で示されるＣＤＲ２、および配列番号 １５で示されるＣＤＲ３；
（５） 配列番号７で示されるＣＤＲ１、配列番号１６で示されるＣＤＲ２、および配列番号 １７で示されるＣＤＲ３；
（６） 配列番号１８で示されるＣＤＲ１、配列番号１９で示されるＣＤＲ２、および配列番号 ２０で示されるＣＤＲ３。
（１） 配列番号７で示されるＣＤＲ１、配列番号８で示されるＣＤＲ２、および配列番号 ９で示されるＣＤＲ３；
（２） 配列番号１０で示されるＣＤＲ１、配列番号１１で示されるＣＤＲ２、および配列番号 １２で示されるＣＤＲ３；
（３） 配列番号１０で示されるＣＤＲ１、配列番号１３で示されるＣＤＲ２、および配列番号 １４で示されるＣＤＲ３；
（４） 配列番号１０で示されるＣＤＲ１、配列番号１３で示されるＣＤＲ２、および配列番号 １５で示されるＣＤＲ３；
（５） 配列番号７で示されるＣＤＲ１、配列番号１６で示されるＣＤＲ２、および配列番号 １７で示されるＣＤＲ３；
（６） 配列番号１８で示されるＣＤＲ１、配列番号１９で示されるＣＤＲ２、および配列番号 ２０で示されるＣＤＲ３。
もう一つの好適な例において、上記アミノ酸配列のうちの任意の一つのアミノ酸配列は、さらに、任意に少なくとも１個（たとえば１－３個、好ましくは１－２個、より好ましくは１個）のアミノ酸の付加、欠失、修飾および／または置換を経たもので、かつＰＤＬ１との特異的結合能力を維持できる誘導配列を含む。
もう一つの好適な例において、前記の少なくとも１個のアミノ酸の付加、欠失、修飾および／または置換を経ており、かつＰＤＬ１との特異的結合能力を維持できる誘導配列は、相同性または配列同一性が少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％のアミノ酸配列である。
もう一つの好適な例において、前記のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はＶＨＨ鎖のフレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４によって隔てられている。
もう一つの好適な例において、前記ＰＤＬ１に対するナノ抗体は、さらに、フレームワーク領域ＦＲを含む。
もう一つの好適な例において、前記フレームワーク領域ＦＲは配列番号１－６で示されるアミノ配列由来のものである。
もう一つの好適な例において、前記ＰＤＬ１に対するナノ抗体は、さらに、フレームワーク領域ＦＲを含む。
もう一つの好適な例において、前記フレームワーク領域ＦＲは配列番号１－６で示されるアミノ配列由来のものである。
もう一つの好適な例において、前記のフレームワーク領域ＦＲは以下の群から選ばれる一つまたは複数である：
（１） 配列番号２１で示されるＦＲ１、配列番号２２で示されるＦＲ２、配列番号２３で示されるＦＲ３、および配列番号 ２４で示されるＦＲ４；
（２） 配列番号２５で示されるＦＲ１、配列番号２６で示されるＦＲ２、配列番号２７で示されるＦＲ３、および配列番号 ２４で示されるＦＲ４；
（３） 配列番号２８で示されるＦＲ１、配列番号２９で示されるＦＲ２、配列番号３０で示されるＦＲ３、および配列番号 ２４で示されるＦＲ４；
（４） 配列番号３１で示されるＦＲ１、配列番号２９で示されるＦＲ２、配列番号３２で示されるＦＲ３、および配列番号 ２４で示されるＦＲ４；
（５） 配列番号３３で示されるＦＲ１、配列番号２２で示されるＦＲ２、配列番号３４で示されるＦＲ３、および配列番号 ２４で示されるＦＲ４；
（６） 配列番号３５で示されるＦＲ１、配列番号３６で示されるＦＲ２、配列番号３７で示されるＦＲ３、および配列番号 ２４で示されるＦＲ４。
（１） 配列番号２１で示されるＦＲ１、配列番号２２で示されるＦＲ２、配列番号２３で示されるＦＲ３、および配列番号 ２４で示されるＦＲ４；
（２） 配列番号２５で示されるＦＲ１、配列番号２６で示されるＦＲ２、配列番号２７で示されるＦＲ３、および配列番号 ２４で示されるＦＲ４；
（３） 配列番号２８で示されるＦＲ１、配列番号２９で示されるＦＲ２、配列番号３０で示されるＦＲ３、および配列番号 ２４で示されるＦＲ４；
（４） 配列番号３１で示されるＦＲ１、配列番号２９で示されるＦＲ２、配列番号３２で示されるＦＲ３、および配列番号 ２４で示されるＦＲ４；
（５） 配列番号３３で示されるＦＲ１、配列番号２２で示されるＦＲ２、配列番号３４で示されるＦＲ３、および配列番号 ２４で示されるＦＲ４；
（６） 配列番号３５で示されるＦＲ１、配列番号３６で示されるＦＲ２、配列番号３７で示されるＦＲ３、および配列番号 ２４で示されるＦＲ４。
もう一つの好適な例において、前記のＰＤＬ１に対するナノ抗体のＶＨＨ鎖のアミノ酸配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記のＰＤＬ１に対するナノ抗体はヒト化抗体、ラクダ由来抗体、キメラ抗体を含む。
もう一つの好適な例において、前記のＰＤＬ１に対するナノ抗体はリャマ由来抗体。
もう一つの好適な例において、前記のＰＤＬ１に対するナノ抗体はリャマ由来抗体。
本発明の第二の側面では、ＰＤＬ１に対する抗体であって、一つまたは複数の本発明の第一の側面に記載のＰＤＬ１に対するナノ抗体のＶＨＨ鎖を含む抗体を提供する。
もう一つの好適な例において、前記のＰＤＬ１に対するナノ抗体のＶＨＨ鎖のアミノ酸配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記のＰＤＬ１に対するナノ抗体のＶＨＨ鎖のアミノ酸配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記のＰＤＬ１に対する抗体は、単量体、二価抗体、および／または多価抗体でもよい。
もう一つの好適な例において、前記のＰＤＬ１に対する抗体は二価抗体である。
もう一つの好適な例において、前記のＰＤＬ１に対する抗体は二価抗体である。
本発明の第三の側面では、本発明の第一の側面に記載のＰＤＬ１に対するナノ抗体、または本発明の第二の側面に記載のＰＤＬ１に対する抗体を含む、細胞外ドメインを含有する、キメラ抗原受容体ＣＡＲを提供する。
もう一つの好適な例において、前記細胞外ドメインは、さらに、シグナルペプチドを含む。
もう一つの好適な例において、前記細胞外ドメインは、さらに、ほかの外因性タンパク質を含む。
もう一つの好適な例において、前記細胞外ドメインが含有する抗体は配列番号１－６で示されるアミノ酸配列を有する。
もう一つの好適な例において、前記細胞外ドメインは、さらに、ほかの外因性タンパク質を含む。
もう一つの好適な例において、前記細胞外ドメインが含有する抗体は配列番号１－６で示されるアミノ酸配列を有する。
もう一つの好適な例において、前記細胞外ドメインが含有する抗体はアミノ酸配列が配列番号７－１７との相同性が≧８５％、好ましくは≧９０％、より好ましくは≧９５％であるか、配列番号１－６と比べて１、２または３個のアミノ酸の違いがある。
もう一つの好適な例において、前記のＣＡＲは式Ｉａで示される構造を有する。
Ｌ１－Ｎｂ－Ｈ－ＴＭ－Ｃ－ＣＤ３ζ （Ｉａ）
（式中において、
Ｌはなしか、シグナルペプチド配列である。
Ｎｂは特異的結合ドメインである。
Ｈはなしか、ヒンジ領域である。
ＴＭは膜貫通ドメインである。
Ｃは共刺激シグナルドメインである。
ＣＤ３ζはＣＤ３ζ由来の細胞内シグナル伝達配列（野生型、またはその突然変異体／修飾体を含む）である。
前記「－」は連結ペプチドまたはペプチド結合である。）
もう一つの好適な例において、前記のＣＡＲは式Ｉａで示される構造を有する。
Ｌ１－Ｎｂ－Ｈ－ＴＭ－Ｃ－ＣＤ３ζ （Ｉａ）
（式中において、
Ｌはなしか、シグナルペプチド配列である。
Ｎｂは特異的結合ドメインである。
Ｈはなしか、ヒンジ領域である。
ＴＭは膜貫通ドメインである。
Ｃは共刺激シグナルドメインである。
ＣＤ３ζはＣＤ３ζ由来の細胞内シグナル伝達配列（野生型、またはその突然変異体／修飾体を含む）である。
前記「－」は連結ペプチドまたはペプチド結合である。）
もう一つの好適な例において、前記Ｌは、それぞれ、ＣＤ８、ＧＭ－ＣＳＦ、ＣＤ４、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、またはその突然変異／修飾体、あるいはこれらの組み合わせからなる群から選ばれるタンパク質のシグナルペプチドである。
もう一つの好適な例において、前記ＮｂはＰＤＬ１を標的とする。
もう一つの好適な例において、前記ＮｂはＰＤＬ１ナノ抗体である。
もう一つの好適な例において、前記ＮｂはＰＤＬ１を標的とする。
もう一つの好適な例において、前記ＮｂはＰＤＬ１ナノ抗体である。
もう一つの好適な例において、前記Ｈは、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＩｇＧ、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれるタンパク質のヒンジ領域である。
もう一つの好適な例において、前記ＨはヒトＩｇＧ１ Ｆｃヒンジ領域である。
もう一つの好適な例において、前記ＨはヒトＩｇＧ１ Ｆｃヒンジ領域である。
もう一つの好適な例において、前記ＴＭは、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＣＤ２７８、ＣＤ１５２、ＣＤ２７９、ＣＤ２３３、またはその突然変異／修飾体、あるいはこれらの組み合わせからなる群から選ばれるタンパク質の膜貫通領域である。
もう一つの好適な例において、前記Ｃは、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ１３４、４－１ＢＢ （ＣＤ１３７）、ＰＤ－１、Ｄａｐ１０、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１ （ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ （ＣＤ２７８）、ＮＫＧ２Ｄ、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０Ｌ、２Ｂ４、ＴＬＲ、またはその突然変異／修飾体、あるいはこれらの組み合わせからなる群から選ばれるタンパク質の共刺激ドメインである。
本発明の第四の側面では、以下のものを有する組み換えタンパク質を提供する。
（ｉ）本発明の第一の側面に記載のＰＤＬ１に対するナノ抗体、または本発明の第二の側面に記載のＰＤＬ１に対する抗体、または本発明の第三の側面に記載のキメラ抗原受容体；ならびに
（ｉｉ）任意の発現および／または精製を補助するタグ配列。
もう一つの好適な例において、前記のタグ配列はＦｃタグ、ＨＡタグ、ＧＧＧＳ配列、ＦＬＡＧタグ、Ｍｙｃタグ、６Ｈｉｓタグ、またはこれらの組み合わせを含む。
（ｉ）本発明の第一の側面に記載のＰＤＬ１に対するナノ抗体、または本発明の第二の側面に記載のＰＤＬ１に対する抗体、または本発明の第三の側面に記載のキメラ抗原受容体；ならびに
（ｉｉ）任意の発現および／または精製を補助するタグ配列。
もう一つの好適な例において、前記のタグ配列はＦｃタグ、ＨＡタグ、ＧＧＧＳ配列、ＦＬＡＧタグ、Ｍｙｃタグ、６Ｈｉｓタグ、またはこれらの組み合わせを含む。
もう一つの好適な例において、前記の組み換えタンパク質は特異的にＰＤＬ１に結合する。
もう一つの好適な例において、前記の組み換えタンパク質（またはポリペプチド）は融合タンパク質を含む。
もう一つの好適な例において、前記の組み換えタンパク質は、単量体、二量体、または多量体である。
もう一つの好適な例において、前記の組み換えタンパク質（またはポリペプチド）は融合タンパク質を含む。
もう一つの好適な例において、前記の組み換えタンパク質は、単量体、二量体、または多量体である。
もう一つの好適な例において、前記の組み換えタンパク質は特異的にＰＤＬ１に結合する。
もう一つの好適な例において、前記のタグ配列はＦｃタグである。
もう一つの好適な例において、前記のタグ配列はＦｃタグである。
本発明の第五の側面では、本発明の第一の側面に記載のＰＤＬ１に対するナノ抗体、または本発明の第二の側面に記載のＰＤＬ１に対する抗体、または本発明の第三の側面に記載のキメラ抗原受容体、または本発明の第四の側面に記載の組み換えタンパク質からなる群から選ばれるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。
もう一つの好適な例において、前記ポリヌクレオチドは、本発明の第一の側面に記載のＰＤＬ１に対するナノ抗体、または本発明の第二の側面に記載ののＰＤＬ１に対する抗体からなる群から選ばれるタンパク質をコードする。
もう一つの好適な例において、本発明は本発明のＰＤＬ１に対するナノ抗体をコードする核酸分子に関する。本発明の核酸はＲＮＡ、ＤＮＡまたはｃＤＮＡでもよい。
本発明の第六の側面では、本発明の第五の側面に記載のポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを提供する。
本発明の第六の側面では、本発明の第五の側面に記載のポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを提供する。
もう一つの好適な例において、前記の発現ベクターは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ウイルスベクター、プラスミド、トランスポゾン、ほかの遺伝子導入系、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。好適に、前記発現ベクターはウイルスベクター、たとえば、レンチウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶウイルス、レトロウイルス、またはこれらの組み合わせを含む。
もう一つの好適な例において、前記の発現ベクターは、ｐＴｏｍｏレンチウイルスベクター、ｐｌｅｎｔｉ、ｐＬＶＴＨ、ｐＬＪＭ１、ｐＨＣＭＶ、ｐＬＢＳ．ＣＡＧ、ｐＨＲ、ｐＬＶなどからなる群から選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記の発現ベクターはｐｃＤＮＡ３．４－ｈＩｇＧ１－Ｆｃ２ベクターである。
もう一つの好適な例において、前記の発現ベクターは、さらに、プロモーター、転写エンハンサーエレメントＷＰＲＥ、長鎖末端反復配列ＬＴＲなどからなる群から選ばれるものを含む。
もう一つの好適な例において、前記の発現ベクターはｐｃＤＮＡ３．４－ｈＩｇＧ１－Ｆｃ２ベクターである。
もう一つの好適な例において、前記の発現ベクターは、さらに、プロモーター、転写エンハンサーエレメントＷＰＲＥ、長鎖末端反復配列ＬＴＲなどからなる群から選ばれるものを含む。
本発明の第七の側面では、本発明の第六の側面に記載の発現ベクターを含有するか、あるいはゲノムに本発明の第五の側面に記載のポリヌクレオチドが組み込まれた宿主細胞を提供する。
もう一つの好適な例において、前記の宿主細胞は原核細胞または真核細胞を含む。
もう一つの好適な例において、前記の宿主細胞は、大腸菌、酵母細胞、哺乳動物細胞からなる群から選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記の宿主細胞は２９３Ｆ細胞である。
もう一つの好適な例において、前記の宿主細胞は、大腸菌、酵母細胞、哺乳動物細胞からなる群から選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記の宿主細胞は２９３Ｆ細胞である。
本発明の第八の側面では、本発明の第六の側面に記載の発現ベクターを含有するか、あるいは染色体に外来の本発明の第五の側面に記載のポリヌクレオチドが組み込まれたエンジニアリングされた免疫細胞を提供する。
もう一つの好適な例において、前記エンジニアリングされた免疫細胞は以下の群から選ばれる：
（ｉ） キメラ抗原受容体αβＴ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）；
（ｉｉ） キメラ抗原受容体γδＴ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）；
（ｉｉｉ） キメラ抗原受容体ＮＫＴ細胞（ＣＡＲ－ＮＫＴ細胞）；
（ｉｖ） キメラ抗原受容体ＮＫ細胞（ＣＡＲ－ＮＫ細胞）。
（ｉ） キメラ抗原受容体αβＴ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）；
（ｉｉ） キメラ抗原受容体γδＴ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）；
（ｉｉｉ） キメラ抗原受容体ＮＫＴ細胞（ＣＡＲ－ＮＫＴ細胞）；
（ｉｖ） キメラ抗原受容体ＮＫ細胞（ＣＡＲ－ＮＫ細胞）。
もう一つの好適な例において、前記エンジニアリングされた免疫細胞は自家または他家のαβＴ細胞、γδＴ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、またはこれらの組み合わせを含む。
もう一つの好適な例において、前記エンジニアリングされた免疫細胞はＣＡＲ－Ｔ細胞である。
もう一つの好適な例において、前記エンジニアリングされた免疫細胞はＣＡＲ－Ｔ細胞である。
本発明の第九の側面では、ＰＤＬ１に対するナノ抗体を生成する方法であって、以下の工程を含む方法を提供する：
（ａ） ナノ抗体の生成に適する条件において、本発明の第七の側面に記載の宿主細胞を培養することにより、ＰＤＬ１に対するナノ抗体を含む培養物を得る；
（ｂ） 前記培養物から前記のＰＤＬ１に対するナノ抗体を単離および／または回収する；ならびに
（ｃ） 任意に、工程（ｂ）得られたＰＤＬ１に対するナノ抗体を精製および／または修飾する。
（ａ） ナノ抗体の生成に適する条件において、本発明の第七の側面に記載の宿主細胞を培養することにより、ＰＤＬ１に対するナノ抗体を含む培養物を得る；
（ｂ） 前記培養物から前記のＰＤＬ１に対するナノ抗体を単離および／または回収する；ならびに
（ｃ） 任意に、工程（ｂ）得られたＰＤＬ１に対するナノ抗体を精製および／または修飾する。
本発明の第十の側面では、本発明の第八の側面に記載のエンジニアリングされた免疫細胞を製造する方法であって、本発明の第五の側面に記載のポリヌクレオチドまたは本発明の第六の側面に記載の発現ベクターを免疫細胞内に形質導入することにより、前記エンジニアリングされた免疫細胞を得る工程を含む方法を提供する。
もう一つの好適な例において、前記の方法は、さらに、得られた工学化された免疫細胞に対して機能および有効性の検出を行う工程を含む。
もう一つの好適な例において、前記の方法は、さらに、得られた工学化された免疫細胞に対して機能および有効性の検出を行う工程を含む。
本発明の第十一の側面では、以下のものを含有する免疫複合体を提供する：
（ａ） 本発明第一の側面に記載のＰＤＬ１に対するナノ抗体、または本発明第二の側面に記載のＰＤＬ１に対する抗体、または本発明の第四の側面に記載の組み換えタンパク質；ならびに
（ｂ） 検出可能なマーカー、薬物、サイトカイン、放射性核種、酵素、金ナノ粒子／ナノロッド、磁性ナノ粒子、ウイルスコートタンパク質またはＶＬＰ、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる複合部分。
（ａ） 本発明第一の側面に記載のＰＤＬ１に対するナノ抗体、または本発明第二の側面に記載のＰＤＬ１に対する抗体、または本発明の第四の側面に記載の組み換えタンパク質；ならびに
（ｂ） 検出可能なマーカー、薬物、サイトカイン、放射性核種、酵素、金ナノ粒子／ナノロッド、磁性ナノ粒子、ウイルスコートタンパク質またはＶＬＰ、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる複合部分。
もう一つの好適な例において、前記の（ａ）部分は本発明の第一の側面に記載のＰＤＬ１に対するナノ抗体、または本発明の第二の側面に記載のＰＤＬ１に対する抗体である。
もう一つの好適な例において、前記の（ａ）部分と前記の複合部分は化学結合またはリンカーを介して複合している。
もう一つの好適な例において、前記の（ａ）部分と前記の複合部分は化学結合またはリンカーを介して複合している。
もう一つの好適な例において、前記の放射性核種は、以下のものを含む：
（ｉ） Ｔｃ－９９ｍ、Ｇａ－６８、Ｆ－１８、Ｉ－１２３、Ｉ－１２５、Ｉ－１３１、Ｉｎ－１１１、Ｇａ－６７、Ｃｕ－６４、Ｚｒ－８９、Ｃ－１１、Ｌｕ－１７７、Ｒｅ－１８８、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる診断用同位体；ならびに／あるいは
（ｉｉ） Ｌｕ－１７７、Ｙ－９０、Ａｃ－２２５、Ａｓ－２１１、Ｂｉ－２１２、Ｂｉ－２１３、Ｃｓ－１３７、Ｃｒ－５１、Ｃｏ－６０、Ｄｙ－１６５、Ｅｒ－１６９、Ｆｍ－２５５、Ａｕ－１９８、Ｈｏ－１６６、Ｉ－１２５、Ｉ－１３１、Ｉｒ－１９２、Ｆｅ－５９、Ｐｂ－２１２、Ｍｏ－９９、Ｐｄ－１０３、Ｐ－３２、Ｋ－４２、Ｒｅ－１８６、Ｒｅ－１８８、Ｓｍ－１５３、Ｒａ２２３、Ｒｕ－１０６、Ｎａ２４、Ｓｒ８９、Ｔｂ－１４９、Ｔｈ－２２７、Ｘｅ－１３３、Ｙｂ－１６９、Ｙｂ－１７７、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる治療用同位体。
（ｉ） Ｔｃ－９９ｍ、Ｇａ－６８、Ｆ－１８、Ｉ－１２３、Ｉ－１２５、Ｉ－１３１、Ｉｎ－１１１、Ｇａ－６７、Ｃｕ－６４、Ｚｒ－８９、Ｃ－１１、Ｌｕ－１７７、Ｒｅ－１８８、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる診断用同位体；ならびに／あるいは
（ｉｉ） Ｌｕ－１７７、Ｙ－９０、Ａｃ－２２５、Ａｓ－２１１、Ｂｉ－２１２、Ｂｉ－２１３、Ｃｓ－１３７、Ｃｒ－５１、Ｃｏ－６０、Ｄｙ－１６５、Ｅｒ－１６９、Ｆｍ－２５５、Ａｕ－１９８、Ｈｏ－１６６、Ｉ－１２５、Ｉ－１３１、Ｉｒ－１９２、Ｆｅ－５９、Ｐｂ－２１２、Ｍｏ－９９、Ｐｄ－１０３、Ｐ－３２、Ｋ－４２、Ｒｅ－１８６、Ｒｅ－１８８、Ｓｍ－１５３、Ｒａ２２３、Ｒｕ－１０６、Ｎａ２４、Ｓｒ８９、Ｔｂ－１４９、Ｔｈ－２２７、Ｘｅ－１３３、Ｙｂ－１６９、Ｙｂ－１７７、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる治療用同位体。
もう一つの好適な例において、前記複合部分は薬物または毒素である。
もう一つの好適な例において、前記の薬物はＰＤＬ１高発現疾患を標的治療する薬物である。
もう一つの好適な例において、前記ＰＤＬ１高発現疾患は、胃癌、肺癌、肝臓癌、骨肉腫、乳癌、膵癌、リンパ腫などから選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記の薬物は細胞毒性薬物である。
もう一つの好適な例において、前記の薬物はＰＤＬ１高発現疾患を標的治療する薬物である。
もう一つの好適な例において、前記ＰＤＬ１高発現疾患は、胃癌、肺癌、肝臓癌、骨肉腫、乳癌、膵癌、リンパ腫などから選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記の薬物は細胞毒性薬物である。
もう一つの好適な例において、前記の細胞毒性薬物は、抗チューブリン薬、ＤＮＡ副溝結合試薬、ＤＮＡ複製阻害剤、アルキル化試薬、抗生物質、葉酸拮抗薬、抗代謝薬、化学療法増感剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ビンカアルカロイド、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
特に有用な細胞毒性薬物類の例は、たとえば、ＤＮＡ副溝結合試薬、ＤＮＡアルキル化試薬、およびチューブリン阻害剤を含み、典型的な細胞毒性薬物は、たとえば、オーリスタチン（Ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ）、カンプトテシン（Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）、デュオカルマイシン（Ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎ）、エトポシド（Ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、メイタンシン（Ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ）およびメイタンシノイド（Ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ）（たとえばＤＭ１やＤＭ４）、タキサン（Ｔａｘａｎｅ）、ベンゾジアゼピン類（Ｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅ）またはベンゾジアゼピン含有薬物（Ｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｄｒｕｇ）（たとえばピロロ［１，４］ベンゾジアゼピン類（ＰＢＤ）、インドリノベンゾジアゼピン類（Ｉｎｄｏｌｉｎｏｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅｓ）およびオキサゾリジノベンゾジアゼピン類（Ｏｘａｚｏｌｉｄｉｎｏｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅｓ））、ビンカアルカロイド（Ｖｉｎｃａ ａｌｋａｌｏｉｄ）、またはこれらの組み合わせを含む。
もう一つの好適な例において、前記の毒素は、オーリスタチン類（たとえば、オーリスタチンＥ、オーリスタチンＦ、ＭＭＡＥおよびＭＭＡＦ）、クロルテトラサイクリン、マイタンシノイド、リシン、リシンＡ－鎖、コンブレタスタチン、デュオカルマイシン、ドラスタチン、アドリアマイシン、ダウノルビシン、タキソール、シスプラチン、ｃｃ１０６５、臭化エチジウム、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド（Ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ジヒドロキシアントラセンジオン、アクチノマイシン、ジフテリア毒素、緑膿菌外毒素（ＰＥ）Ａ、ＰＥ４０、アブリン、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、α－八連球菌、ゲロニン、ミトゲリン（Ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン、エノマイシン、クリシン（Ｃｕｒｉｃｉｎ）、クロチン、カリケアミシン、サボンソウ（Ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、糖質コルチコイド、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記複合部分は検出可能なマーカーである。
もう一つの好適な例において、前記複合部分は、蛍光または発光マーカー、放射性マーカー、ＭＲＩ（磁気共鳴画像）またはＣＴ（コンピューターＸ線断層撮影技術）造影剤、または検出可能な生成物を生成させる酵素、放射性核種、生物毒素、サイトカイン（たとえばＩＬ－２など）、抗体、抗体Ｆｃ断片、抗体ｓｃＦｖ断片、金ナノ粒子／ナノロッド、ウイルス粒子、リポソーム、磁性ナノ粒子、プロドラッグ活性化酵素（たとえば、ＤＴ－ジアホラーゼ（ＤＴＤ）またはビフェニルヒドロラーゼ様蛋白質（ＢＰＨＬ））または任意の様態のナノ粒子からなる群から選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記複合部分は、蛍光または発光マーカー、放射性マーカー、ＭＲＩ（磁気共鳴画像）またはＣＴ（コンピューターＸ線断層撮影技術）造影剤、または検出可能な生成物を生成させる酵素、放射性核種、生物毒素、サイトカイン（たとえばＩＬ－２など）、抗体、抗体Ｆｃ断片、抗体ｓｃＦｖ断片、金ナノ粒子／ナノロッド、ウイルス粒子、リポソーム、磁性ナノ粒子、プロドラッグ活性化酵素（たとえば、ＤＴ－ジアホラーゼ（ＤＴＤ）またはビフェニルヒドロラーゼ様蛋白質（ＢＰＨＬ））または任意の様態のナノ粒子からなる群から選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記免疫複合体は、多価（たとえば二価）の本発明の第一の側面に記載のＰＤＬ１に対するナノ抗体のＶＨＨ鎖を含有する。
もう一つの好適な例において、前記多価とは、前記免疫複合体のアミノ酸配列に複数の繰り返した同様か異なる本発明の第一の側面に記載のＰＤＬ１に対するナノ抗体のＶＨＨ鎖が含まれている。
もう一つの好適な例において、前記多価とは、前記免疫複合体のアミノ酸配列に複数の繰り返した同様か異なる本発明の第一の側面に記載のＰＤＬ１に対するナノ抗体のＶＨＨ鎖が含まれている。
本発明の第十二の側面では、活性成分の使用であって、前記活性成分は、本発明の第一の側面に記載のＰＤＬ１に対するナノ抗体、または本発明の第二の側面に記載のＰＤＬ１に対する抗体、または本発明の第三の側面に記載のキメラ抗原受容体、または本発明の第四の側面に記載の組み換えタンパク質、または本発明の第八の側面に記載のエンジニアリングされた免疫細胞、または本発明の第十一の側面に記載の免疫複合体、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれ、前記活性成分は以下のものを製造するためである使用を提供する：
（ａ） ＰＤＬ１高発現疾患を予防および／または治療する薬物；
（ｂ） ＰＤＬ１高発現疾患を検出する試薬。
（ａ） ＰＤＬ１高発現疾患を予防および／または治療する薬物；
（ｂ） ＰＤＬ１高発現疾患を検出する試薬。
もう一つの好適な例において、前記試薬は診断試薬で、好ましくは、前記の診断試薬は検出シートまたは検出プレートである。
もう一つの好適な例において、前記診断試薬は、サンプルにおけるＰＤＬ１タンパク質またはその断片を検出するためのものである。
もう一つの好適な例において、前記ＰＤＬ１高発現疾患は、胃癌、肺癌、肝臓癌、骨肉腫、乳癌、膵癌、リンパ腫などから選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記診断試薬は、サンプルにおけるＰＤＬ１タンパク質またはその断片を検出するためのものである。
もう一つの好適な例において、前記ＰＤＬ１高発現疾患は、胃癌、肺癌、肝臓癌、骨肉腫、乳癌、膵癌、リンパ腫などから選ばれる。
本発明の第十三の側面では、体外においてサンプルにおけるＰＤＬ１タンパク質またはその断片を検出する方法であって、以下の工程を含む方法を提供する：
（１） 体外において、前記サンプルを本発明の第一の側面に記載のＰＤＬ１に対するナノ抗体、または本発明の第二の側面に記載のＰＤＬ１に対する抗体、または本発明の第三の側面に記載のキメラ抗原受容体、または本発明の第四の側面に記載の組み換えタンパク質、または本発明の第八の側面に記載のエンジニアリングされた免疫細胞、または本発明の第十一の側面に記載の免疫複合体、またはこれらの組み合わせと接触させる；
（２） 抗原－抗体複合体が形成したか検出し、ここで、複合体が形成すると、サンプルにＰＤＬ１タンパク質またはその断片が存在することを意味する。
もう一つの好適な例において、前記の検出は診断的なものまたは非診断的なものを含む。
（１） 体外において、前記サンプルを本発明の第一の側面に記載のＰＤＬ１に対するナノ抗体、または本発明の第二の側面に記載のＰＤＬ１に対する抗体、または本発明の第三の側面に記載のキメラ抗原受容体、または本発明の第四の側面に記載の組み換えタンパク質、または本発明の第八の側面に記載のエンジニアリングされた免疫細胞、または本発明の第十一の側面に記載の免疫複合体、またはこれらの組み合わせと接触させる；
（２） 抗原－抗体複合体が形成したか検出し、ここで、複合体が形成すると、サンプルにＰＤＬ１タンパク質またはその断片が存在することを意味する。
もう一つの好適な例において、前記の検出は診断的なものまたは非診断的なものを含む。
本発明の第十四の側面では、以下のものを含有する薬物組成物を提供する：
（ｉ） 活性成分として、本発明の第一の側面に記載のＰＤＬ１に対するナノ抗体、または本発明の第二の側面に記載のＰＤＬ１に対する抗体、または本発明の第三の側面に記載のキメラ抗原受容体、または本発明の第四の側面に記載の組み換えタンパク質、または本発明の第八の側面に記載のエンジニアリングされた免疫細胞、または本発明の第十一の側面に記載の免疫複合体、またはこれらの組み合わせ；ならびに
（ｉｉ） 薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤。
（ｉ） 活性成分として、本発明の第一の側面に記載のＰＤＬ１に対するナノ抗体、または本発明の第二の側面に記載のＰＤＬ１に対する抗体、または本発明の第三の側面に記載のキメラ抗原受容体、または本発明の第四の側面に記載の組み換えタンパク質、または本発明の第八の側面に記載のエンジニアリングされた免疫細胞、または本発明の第十一の側面に記載の免疫複合体、またはこれらの組み合わせ；ならびに
（ｉｉ） 薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤。
もう一つの好適な例において、前記薬物組成物の剤形は、注射剤、冷凍乾燥製剤からなる群から選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記の薬物組成物は、０．０１～９９．９９％の本発明の第一の側面に記載のＰＤＬ１に対するナノ抗体、または本発明の第二の側面に記載のＰＤＬ１に対する抗体、または本発明の第三の側面に記載のキメラ抗原受容体、または本発明の第四の側面に記載の組み換えタンパク質、または本発明の第十一の側面に記載の免疫複合体、またはこれらの組み合わせ、ならびに０．０１～９９．９９％の薬用担体を含み、前記百分率は前記薬物組成物で占める質量百分率である。
もう一つの好適な例において、前記活性成分の中で、前記エンジニアリングされた免疫細胞の濃度が１×１０３－１×１０８個細胞／ｍＬ、好ましくは１×１０４－１×１０７個細胞／ｍＬである。
本発明の第十五の側面では、以下のものを含むキットを提供する：
（１） 本発明の第一の側面に記載のＰＤＬ１に対するナノ抗体、または本発明の第二の側面に記載のＰＤＬ１に対する抗体、または本発明の第三の側面に記載のキメラ抗原受容体、または本発明の第四の側面に記載の組み換えタンパク質、または本発明の第八の側面に記載のエンジニアリングされた免疫細胞、または本発明の第十一の側面に記載の免疫複合体、またはこれらの組み合わせを含有する、第一容器；ならびに／あるいは
（２） 前記第一容器の内容物に対する二次抗体を含有する、第二容器；
あるいは、
前記キットは、下地シート（支持プレート）と、本発明の第一の側面に記載のＰＤＬ１に対する抗体、または本発明の第二の側面に記載のＰＤＬ１に対する抗体、または本発明第三の側面に記載の組み換えタンパク質、または本発明の第八の側面に記載の免疫複合体、またはこれらの組み合わせを含有する測定バーとを含む検出プレートを含有する。
（１） 本発明の第一の側面に記載のＰＤＬ１に対するナノ抗体、または本発明の第二の側面に記載のＰＤＬ１に対する抗体、または本発明の第三の側面に記載のキメラ抗原受容体、または本発明の第四の側面に記載の組み換えタンパク質、または本発明の第八の側面に記載のエンジニアリングされた免疫細胞、または本発明の第十一の側面に記載の免疫複合体、またはこれらの組み合わせを含有する、第一容器；ならびに／あるいは
（２） 前記第一容器の内容物に対する二次抗体を含有する、第二容器；
あるいは、
前記キットは、下地シート（支持プレート）と、本発明の第一の側面に記載のＰＤＬ１に対する抗体、または本発明の第二の側面に記載のＰＤＬ１に対する抗体、または本発明第三の側面に記載の組み換えタンパク質、または本発明の第八の側面に記載の免疫複合体、またはこれらの組み合わせを含有する測定バーとを含む検出プレートを含有する。
もう一つの好適な例において、前記キットに、さらに、説明書が含まれており、前記の明細書の記載に従い、前記のキットは非侵襲的に被験対象のＰＤＬ１の発現を検出するために使用される。
もう一つの好適な例において、前記の検出キットはＰＤＬ１高発現疾患の検出に使用される。
もう一つの好適な例において、前記ＰＤＬ１高発現疾患は、胃癌、肺癌、肝臓癌、骨肉腫、乳癌、膵癌、リンパ腫などから選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記ＰＤＬ１高発現疾患は、胃癌、肺癌、肝臓癌、骨肉腫、乳癌、膵癌、リンパ腫などから選ばれる。
本発明の第十六の側面では、ＰＤＬ１高発現疾患を予防および／または治療する方法であって、必要な対象に本発明の第一の側面に記載のＰＤＬ１に対するナノ抗体、または本発明の第二の側面に記載のＰＤＬ１に対する抗体、または本発明の第三の側面に記載のキメラ抗原受容体、または本発明の第四の側面に記載の組み換えタンパク質、または本発明の第八の側面に記載のエンジニアリングされた免疫細胞、または本発明の第十一の側面に記載の免疫複合体、または本発明の第十四の側面に記載の薬物組成物、またはこれらの組み合わせを施用する工程を含む方法を提供する。
もう一つの好適な例において、前記対象は哺乳動物、たとえば、ヒトを含む。
もう一つの好適な例において、前記ＰＤＬ１高発現疾患は、胃癌、肺癌、肝臓癌、骨肉腫、乳癌、膵癌、リンパ腫などから選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記のエンジニアリングされた免疫細胞または薬物組成物に含まれるＣＡＲ免疫細胞は前記対象由来の細胞（自家細胞）である。
もう一つの好適な例において、前記ＰＤＬ１高発現疾患は、胃癌、肺癌、肝臓癌、骨肉腫、乳癌、膵癌、リンパ腫などから選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記のエンジニアリングされた免疫細胞または薬物組成物に含まれるＣＡＲ免疫細胞は前記対象由来の細胞（自家細胞）である。
もう一つの好適な例において、前記のエンジニアリングされた免疫細胞または薬物組成物に含まれるＣＡＲ免疫細胞は健康な個体由来の細胞（他家細胞）である。
もう一つの好適な例において、前記の方法はほかの治療方法と併用してもよい。
もう一つの好適な例において、前記のほかの治療方法は化学治療、放射線治療、標的治療などの方法を含む。
もう一つの好適な例において、前記の方法はほかの治療方法と併用してもよい。
もう一つの好適な例において、前記のほかの治療方法は化学治療、放射線治療、標的治療などの方法を含む。
本発明の第十七の側面では、ＰＤＬ１高発現疾患に対する診断方法であって、以下の工程を含む方法を提供する：
（ｉ） 診断対象からサンプルを採取し、前記のサンプルを本発明の第一の側面に記載のＰＤＬ１に対するナノ抗体、または本発明の第二の側面に記載のＰＤＬ１に対する抗体、または本発明の第三の側面に記載のキメラ抗原受容体、または本発明の第四の側面に記載の組み換えタンパク質、または本発明の第八の側面に記載のエンジニアリングされた免疫細胞、または本発明の第十一の側面に記載の免疫複合体、またはこれらの組み合わせと接触させる；ならびに
（ｉｉ） 抗原－抗体複合体が形成したか検出し、ここで、複合体が形成すると、前記の対象がＰＤＬ１高発現疾患の確診患者であることを意味する。
（ｉ） 診断対象からサンプルを採取し、前記のサンプルを本発明の第一の側面に記載のＰＤＬ１に対するナノ抗体、または本発明の第二の側面に記載のＰＤＬ１に対する抗体、または本発明の第三の側面に記載のキメラ抗原受容体、または本発明の第四の側面に記載の組み換えタンパク質、または本発明の第八の側面に記載のエンジニアリングされた免疫細胞、または本発明の第十一の側面に記載の免疫複合体、またはこれらの組み合わせと接触させる；ならびに
（ｉｉ） 抗原－抗体複合体が形成したか検出し、ここで、複合体が形成すると、前記の対象がＰＤＬ１高発現疾患の確診患者であることを意味する。
もう一つの好適な例において、前記のサンプルは血液サンプルまたは咽頭スワブサンプル、またはほかの組織器官におけるサンプルである。
もう一つの好適な例において、前記ＰＤＬ１高発現疾患は、胃癌、肺癌、肝臓癌、骨肉腫、乳癌、膵癌、リンパ腫などから選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記ＰＤＬ１高発現疾患は、胃癌、肺癌、肝臓癌、骨肉腫、乳癌、膵癌、リンパ腫などから選ばれる。
本発明の第十八の側面では、組み換えポリペプチドの製造方法であって、前記の組み換えポリペプチドは本発明の第一の側面に記載のＰＤＬ１に対するナノ抗体、または本発明の第二の側面に記載のＰＤＬ１に対する抗体、または本発明の第三の側面に記載のキメラ抗原受容体、または本発明の第四の側面に記載の組み換えタンパク質で、以下の工程を含む方法を提供する：
（ａ） 発現に適切な条件において、本発明の第五の側面に記載の宿主細胞を培養する；ならびに
（ｂ） 培養物から前記の組み換えポリペプチドを単離する。
（ａ） 発現に適切な条件において、本発明の第五の側面に記載の宿主細胞を培養する；ならびに
（ｂ） 培養物から前記の組み換えポリペプチドを単離する。
図面の説明
図１は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによるＰＤＬ１－Ｆｃタンパク質の同定の結果を示す。
図２は、免疫血清のＥＬＩＳＡ検出の結果を示す。
具体的な実施形態
本発明者らは、幅広く深く研究し、大量のスクリーニングを行ったところ、初めて、いくつかのＰＤＬ１に対するナノ抗体およびそれで構築された二価抗体を開発した。具体的に、本発明では、ヒト由来のＰＤＬ１タンパク質でリャマを免疫させ、高品質の免疫ナノ抗体の遺伝子ライブラリーを得た。その後、ＰＤＬ１タンパク質分子をマイクロプレートにカップリングさせ、抗原－抗体の特異的結合の原理を利用し、この形態の抗原でファージディスプレイ技術によって免疫ナノ抗体遺伝子ライブラリー（リャマ重鎖抗体ファージディスプレイ遺伝子ライブラリー）をスクリーニングすることで、ＰＤＬ１特異的ナノ抗体の遺伝子を得た。また、関連する実験結果から、本発明で得られたＰＤＬ１に対するナノ抗体およびそれで構築された二価抗体はいずれも有効にＰＤＬ１タンパク質と結合することができ、同時に遮断機能を有し、そのリガンドであるＰＤ－１との相互作用を遮断することができる。これに基づき、本発明を完成させた。本発明で開発されたＰＤＬ１を標的とするナノ抗体は、胃癌、肺癌、肝臓癌、骨肉腫、乳癌、膵癌、リンパ腫などの疾患を標的治療する、新たな治療手段として有用である。
本発明者らは、幅広く深く研究し、大量のスクリーニングを行ったところ、初めて、いくつかのＰＤＬ１に対するナノ抗体およびそれで構築された二価抗体を開発した。具体的に、本発明では、ヒト由来のＰＤＬ１タンパク質でリャマを免疫させ、高品質の免疫ナノ抗体の遺伝子ライブラリーを得た。その後、ＰＤＬ１タンパク質分子をマイクロプレートにカップリングさせ、抗原－抗体の特異的結合の原理を利用し、この形態の抗原でファージディスプレイ技術によって免疫ナノ抗体遺伝子ライブラリー（リャマ重鎖抗体ファージディスプレイ遺伝子ライブラリー）をスクリーニングすることで、ＰＤＬ１特異的ナノ抗体の遺伝子を得た。また、関連する実験結果から、本発明で得られたＰＤＬ１に対するナノ抗体およびそれで構築された二価抗体はいずれも有効にＰＤＬ１タンパク質と結合することができ、同時に遮断機能を有し、そのリガンドであるＰＤ－１との相互作用を遮断することができる。これに基づき、本発明を完成させた。本発明で開発されたＰＤＬ１を標的とするナノ抗体は、胃癌、肺癌、肝臓癌、骨肉腫、乳癌、膵癌、リンパ腫などの疾患を標的治療する、新たな治療手段として有用である。
用語
本明細書で用いられるように、用語「本発明抗体」、「本発明の抗体」、「本発明のＰＤＬ１に対するナノ抗体」、「本発明ＰＤＬ１に対するナノ抗体」、「ＰＤＬ１に対するナノ抗体」、「ＰＤＬ１に対するナノ抗体」は同様の意味を持ち、入れ替えて使用することができ、いずれも特異的にＰＤＬ１タンパク質（ヒトＰＤＬ１タンパク質を含む）を認識してそれに結合する抗体を指す。
本明細書で用いられるように、用語「本発明抗体」、「本発明の抗体」、「本発明のＰＤＬ１に対するナノ抗体」、「本発明ＰＤＬ１に対するナノ抗体」、「ＰＤＬ１に対するナノ抗体」、「ＰＤＬ１に対するナノ抗体」は同様の意味を持ち、入れ替えて使用することができ、いずれも特異的にＰＤＬ１タンパク質（ヒトＰＤＬ１タンパク質を含む）を認識してそれに結合する抗体を指す。
本発明のナノ抗体の抗体番号および相応する配列番号は下記表１に示す。
注：表における各数値は配列番号を表し、すなわち、「１」は「配列番号１」を表し、表で示されたＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４の配列番号はそのアミノ酸配列の番号である。
本明細書で用いられるように、用語「抗体」または「免疫グロブリン」は同様な構造特徴を持つ、約１５００００ダルトンのヘテロテトラマーの糖タンパク質で、２つの同じ軽鎖（Ｌ）と２つの同じ重鎖（Ｈ）からなるものである。各軽鎖は、重鎖に１つの共有ジスルフィド結合によって結合しているが、重鎖間のジスルフィド結合の数は、免疫グロブリンのアイソタイプによるものである。各重鎖および軽鎖も、それぞれ一定の間隔の鎖内ジスルフィド結合を有する。各重鎖は、１つの末端に可変領域（ＶＨ）を有し、その先に多数の定常領域を有する。各軽鎖は、一方の末端に可変領域（ＶＬ）を有し、他方の末端に定常領域を有する。軽鎖の定常領域は重鎖の一つ目の定常領域と、軽鎖の可変領域は重鎖の可変領域と対向している。特殊なアミノ酸残基が軽鎖と重鎖の可変領域の間に界面を形成している。
本明細書で用いられるように、用語「単一ドメイン抗体」、「ＶＨＨ」、「ナノ抗体（Ｎａｎｏｂｏｄｙ）」、「単一ドメイン抗体（Ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ、ａｄＡｂ、またはナノ抗体ｎａｎｏｂｏｄｙ）」は同様の意味を持ち、かつ入れ替えて使用することができ、クローン抗体の重鎖の可変領域を指し、１つの重鎖可変領域のみからなる単一ドメイン抗体（ＶＨＨ）を構築し、完全な機能を有する最小の抗原結合断片である。通常、まず天然の軽鎖および重鎖の定常領域１（ＣＨ１）が欠けた抗体を得た後、さらに抗体の重鎖の可変領域をクローンし、１つの重鎖可変領域だけからなる単一ドメイン抗体（ＶＨＨ）を構築する。
本明細書で用いられるように、用語「可変」とは、抗体において可変領域のある部分が配列で異なっており、これによって各特定の抗体のその特定の抗原に対する結合および特異性が構成されることを指す。しかし、可変性は、均一に抗体の可変領域全体に分布しているわけではない。軽鎖と重鎖の可変領域における相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域と呼ばれる３つの断片に集中している。可変領域において、比較的に保存的な部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖および軽鎖の可変領域に、それぞれ、基本的にβシート構造となっており、連結ループを形成する３つのＣＤＲで連結され、場合によって部分βシート構造となる４つのＦＲ領域が含まれる。各鎖におけるＣＤＲは、ＦＲ領域で密接し、かつ他方の鎖のＣＤＲと一緒に抗体の抗原結合部位（Ｋａｂａｔら、ＮＩＨ Ｐｕｂｌ． Ｎｏ． ９１－３２４２， 卷Ｉ， ６４７－６６９頁（１９９１）を参照する）を形成している。定常領域は、抗体と抗原との結合には直接関与しないが、たとえば抗体の抗体依存細胞毒性に参与するなどの異なるエフェクター機能を示す。
当業者に知られるように、免疫複合体および融合発現産物は、薬物、毒素、サイトカイン（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ）、放射性核種、酵素およびほかの診断または治療分子と本発明の抗体またはその断片が結合してなる複合体を含む。さらに、本発明は、前記のＰＤＬ１に対するナノ抗体またはその断片と結合した細胞表面マーカーあるいは抗原を含む。
本明細書で用いられるように、用語「重鎖可変領域」と「ＶＨ」は入れ替えて使用することができる。
本明細書で用いられるように、用語「可変領域」と「相補性決定領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ、ＣＤＲ）」は入れ替えて使用することができる。
本明細書で用いられるように、用語「可変領域」と「相補性決定領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ、ＣＤＲ）」は入れ替えて使用することができる。
本発明の一つの好適な実施形態において、前記抗体の重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３という３つの相補性決定領域を含む。
本発明の一つの好適な実施形態において、前記抗体の重鎖は上記重鎖可変領域および重鎖定常領域を含む。
本発明の一つの好適な実施形態において、前記抗体の重鎖は上記重鎖可変領域および重鎖定常領域を含む。
本発明において、用語「本発明の抗体」、「本発明のタンパク質」、または「本発明のポリペプチド」は入れ替えて使用することができ、いずれも特異的にＰＤＬ１タンパク質と結合するポリペプチド、たとえば重鎖可変領域を有するタンパク質またはポリペプチドをいう。これらは、開始のメチオニンを含有してもよく、含有しなくてもよい。
また、本発明は、本発明の抗体のほかのタンパク質あるいは融合発現産物を提供する。具体的に、本発明は、可変領域が本発明の抗体の重鎖可変領域と同様であるか、あるいは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の相同性を持つものであれば、この可変領域を含有する重鎖を有する任意のタンパク質またはタンパク質複合体と融合発現産物（すなわち免疫複合体と融合発現産物）を含む。
一般的に、抗体の抗原結合特性は、重鎖可変領域に位置する３つの特定の領域によって特徴付けられ、可変領域（ＣＤＲ）と呼ばれ、４つのフレームワーク領域（ＦＲ）に分かれ、４つのＦＲのアミノ酸配列が比較的に保存され、直接結合反応に関与しない。これらのＣＤＲは環状構造を形成し、その中のＦＲで形成されるβシートによって空間構造上で近づき、重鎖におけるＣＤＲおよび相応の軽鎖におけるＣＤＲが抗体の抗原結合部位を構成する。同類の抗体のアミノ酸配列の比較によってどのアミノ酸がＦＲあるいはＣＤＲ領域を構成するか確認することができる。
本発明の抗体の重鎖の可変領域は、その少なくとも一部が抗原結合に関与するため、特に注目されている。そのため、ＣＤＲ含有モノクローナル抗体の重鎖可変領域鎖を有する分子は、そのＣＤＲはここで同定されるＣＤＲと９０％以上（好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上）の相同性を持つものであれば、本発明に含まれる。
本発明は、完全の抗体だけではなく、免疫活性を有する抗体の断片または抗体とほかの配列からなる融合タンパク質も含む。そのため、本発明は、さらに、前記抗体の断片、誘導体および類似体を含む。
本明細書で用いられるように、用語「断片」、「誘導体」および「類似体」とは、基本的に本発明の抗体と同じ生物学的機能または活性を維持するポリペプチドをいう。本発明のポリペプチドの断片、誘導体や類似体は、（i）１個または複数個の保存的または非保存的なアミノ酸残基（好ましくは保存的なアミノ酸残基）が置換されたポリペプチドでもよく、このような置換されたアミノ酸残基が遺伝コードでコードされてもされていなくてもよく、あるいは（ii）１個または複数個のアミノ酸残基に置換基があるポリペプチドでもよく、あるいは（iii）成熟のポリペプチドと別の化合物（たとえば、ポリエチレングリコールようなポリペプチドの半減期を延ばす化合物）と融合したポリペプチドでもよく、あるいは（iiiV）付加のアミノ酸配列がこのポリペプチドに融合したポリペプチド（たとえばリーダー配列または分泌配列またはこのポリペプチドを精製するための配列またはタンパク質前駆体配列、あるいは６Ｈｉｓタグと形成した融合タンパク質）でもよい。本明細書の開示に基づき、これらの断片、誘導体および類似体は当業者に公知の範囲に入っている。
本発明の抗体とは、ＰＤＬ１タンパク質と結合する活性を有する、上記ＣＤＲ領域を含むポリペプチドをいう。当該用語は、さらに、本発明の抗体と同じ機能を有する、上記ＣＤＲ領域を含むポリペプチドの変異の様態を含む。これらの突然変異の様態は、１個または複数個（通常は１－５０個、好ましくは１－３０個、より好ましくは１－２０個、最も好ましくは１－１０個）のアミノ酸の欠失、挿入および／または置換、ならびにＣ末端および／またはＮ末端への１個または複数個（通常は２０個以内、好ましくは１０個以内、より好ましくは５個以内）のアミノ酸の付加を含むが、これらに限定されない。たとえば、本分野において、機能が近い、または類似のアミノ酸で置換する場合、通常、蛋白質の機能を変えることがない。また、Ｃ末端および／またはＮ末端への一つまたは複数のアミノ酸の付加も、通常、蛋白質の機能を変えることはない。この用語は、さらに、本発明の抗体の活性断片と活性誘導体を含む。
当該ポリペプチドの変異の様態は、相同配列、保存的変異体、対立遺伝子変異体、天然突然変異体、誘導突然変異体、高いまたは低い厳格さの条件において本発明の抗体のコードＤＮＡと交雑が可能なＤＮＡがコードするタンパク質、および抗本発明の抗体の抗血清で得られるポリペプチドまたはタンパク質を含む。
また、本発明は、ほかのポリペプチド、たとえば抗体またはその断片を含む融合タンパク質を提供する。ほとんど全長のポリペプチドのほか、本発明は、さらに、本発明の抗体の断片を含む。通常、当該断片は本発明の抗体の少なくとも約５０個の連続のアミノ酸、好ましくは少なくとも約５０個の連続のアミノ酸、より好ましくは少なくとも約８０個の連続のアミノ酸、最も好ましくは少なくとも約１００個の連続のアミノ酸を有する。
本発明において、「本発明の抗体の保存的変異体」とは、本発明の抗体のアミノ酸配列と比較すると、１０個以下、好ましくは８個以下、より好ましくは５個以下、最も好ましくは３個以下のアミノ酸が類似または近い性質を持つアミノ酸で置換されてなるポリペプチドをいう。これらの保存的変異ポリペプチドは、表２のようにアミノ酸の置換を行って生成することが好ましい。
さらに、本発明は、上記抗体またはその断片またはその融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子を提供する。本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ形態でもＲＮＡ形態でもよい。ＤＮＡ形態は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは人工合成のＤＮＡを含む。ＤＮＡは、一本鎖でも二本鎖でもよい。ＤＮＡは、コード鎖でも非コード鎖でもよい。
本発明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、成熟ポリペプチドだけをコードするコード配列、成熟ポリペプチドのコード配列および様々な付加コード配列、成熟ポリペプチドのコード配列（および任意の付加コード配列）および非コード配列を含む。
用語「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」は、このポリペプチドをコードするポリヌクレオチドでもよく、さらに付加のコードおよび／または非コード配列を含むポリヌクレオチドでもよい。
本発明は、さらに、上記の配列とハイブリダイズし、かつ２つの配列の間に少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％の相同性を有するポリヌクレオチドに関する。本発明は、特に、厳格な条件で本発明に係るポリヌクレオチドとハイブリダイズできるポリヌクレオチドに関する。本発明において、「厳格な条件」とは、（１）低いイオン強度および高い温度、例えば０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃でのハイブリダイズおよび溶離、あるいは（２）ハイブリダイズ時変性剤、たとえば４２℃で５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％ウシ胎児血清／０．１％ Ｆｉｃｏｌｌなどを入れること、あるいは（３）２つの配列の間の相同性が少なくとも９０％以上、好ましくは９５％以上の時だけハイブリダイズすることである。そして、ハイブリダイズできるポリヌクレオチドがコードするポリペプチドは、成熟ポリペプチドと同じ生物学的機能および活性を有する。
本発明の抗体のヌクレオチド全長配列あるいはの断片は、通常、ＰＣＲ増幅法、組換え法または人工合成の方法で得られる。適用できる方法として、特に断片の長さが短い場合、人工合成の方法で関連配列を合成する。通常、まず多数の小さい断片を合成し、そして連接させることにより、配列の長い断片を得ることができる。また、重鎖のコード配列を発現タグ（たとえば６Ｈｉｓ）一体に融合させ、融合タンパク質を形成してもよい。
関連の配列を獲得すれば、組み換え法で大量に関連配列を獲得することができる。この場合、通常、その配列をベクターにクローンした後、細胞に導入し、さらに通常の方法で増殖させた宿主細胞から関連配列を単離して得る。本発明に係る生物分子（核酸、タンパク質など）は単離の形態で存在する生物分子を含む。
現在、本発明のタンパク質（またはその断片、あるいはその誘導体）をコードするＤＮＡ配列は全部化学合成で獲得することがすでに可能である。さらに、このＤＮＡ配列を本分野で周知の各種の既知のＤＮＡ分子（あるいはベクターなど）や細胞に導入してもよい。また、化学合成で本発明のタンパク質配列に変異を導入することもできる。
さらに、本発明は、上記の適当なＤＮＡ配列および適当なプロモーターあるいは制御配列を含むベクターに関する。これらのベクターは、タンパク質を発現するように、適当な宿主細胞の形質転換に用いることができる。
宿主細胞は、原核細胞、たとえば細菌細胞、あるいは、低等真核細胞、たとえば酵母細胞、あるいは、高等真核細胞、たとえば哺乳動物細胞でもよい。代表例として、大腸菌、ストレプトマイセス属、ネズミチフス菌のような細菌細胞、酵母のような真菌細胞、ミバエＳ２若しくはＳｆ９のような昆虫細胞、ＣＨＯ、ＣＯＳ７、２９３細胞のような動物細胞などがある。
ＤＮＡ組み換えによる宿主細胞の形質転換は当業者に熟知の通常の技術で行ってもよい。宿主が原核細胞、たとえば大腸菌である場合、ＤＮＡを吸収できるコンピテントセルは指数成長期後収集でき、ＣａＣｌ２法で処理し、用いられる工程は本分野では周知のものである。もう一つの方法は、ＭｇＣｌ２を使用する。必要により、形質転換はエレクトロポレーションの方法でもよい。宿主が真核生物の場合、リン酸カルシウム沈殿法、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションのような通常の機械方法、リポフェクションなどのＤＮＡトランスフェクションの方法が用いられる。
得られる形質転換体は通常の方法で培養し、本発明の遺伝子がコードするポリペプチドを発現することができる。用いられる宿主細胞によって、培養に用いられる培地は通常の培地を選んでもよい。宿主細胞の成長に適する条件で培養する。宿主細胞が適当の細胞密度に成長したら、適切な方法（たとえば温度転換もしくは化学誘導）で選んだプロモーターを誘導し、さらに細胞を培養する。
上記の方法における組み換えポリペプチドは細胞内または細胞膜で発現し、あるいは細胞外に分泌することができる。必要であれば、その物理・化学的特性およびほかの特性を利用して各種の単離方法で組み換えタンパク質を単離・精製することができる。これらの方法は、本分野の技術者に熟知である。これらの方法の例として、通用の再生処理、タンパク質沈殿剤による処理（塩析法）、遠心、浸透圧ショック、超音波処理、超遠心、分子篩クロマトグラフィー（ゲルろ過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）およびほかの各種の液体クロマトグラフィー技術、ならびにこれらの方法の組合せを含むが、これらに限定されない。
本発明の抗体は単独に使用してもよく、検出可能ななマーカー（診断目的）、治療剤、ＰＫ（タンパク質キナーゼ）修飾部分またはこれらの任意の組み合わせと結合またはカップリングしてもよい。
診断の目的に使用される検出可能なマーカーは、蛍光または発光マーカー、放射性マーカー、ＭＲＩ（磁気共鳴画像）またはＣＴ（コンピューターＸ線断層撮影技術）造影剤、または検出可能な生成物を生成させる酵素を含むが、これらに限定されない。
本発明の抗体と結合または複合することができる治療剤は、１．放射性核種、２．生物毒素、３．サイトカイン、たとえばＩＬ－２など、４．金ナノ粒子／ナノロッド、５．ウイルス粒子、６．リポソーム、７．磁性ナノ粒子、８．プロドラッグ活性化酵素（たとえば、ＤＴ－ジアホラーゼ（ＤＴＤ）またはビフェニルヒドロラーゼ様蛋白質（ＢＰＨＬ））などを含むが、これらに限定されない。
本発明の抗体と結合または複合することができる治療剤は、１．放射性核種、２．生物毒素、３．サイトカイン、たとえばＩＬ－２など、４．金ナノ粒子／ナノロッド、５．ウイルス粒子、６．リポソーム、７．磁性ナノ粒子、８．プロドラッグ活性化酵素（たとえば、ＤＴ－ジアホラーゼ（ＤＴＤ）またはビフェニルヒドロラーゼ様蛋白質（ＢＰＨＬ））などを含むが、これらに限定されない。
ＰＤＬ１タンパク質
プログラム細胞死リガンド１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ １ ｌｉｇａｎｄ １、ＰＤＬ１）は分化抗原群２７４（Ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ２７４、ＣＤ２７４）またはＢ７ホモログ（Ｂ７ ｈｏｍｏｌｏｇ １、Ｂ７－Ｈ１）とも呼ばれ、ヒトの体内の１種のタンパク質で、ＣＤ２７４遺伝子によってコードされる。ＰＤＬ１は大きさが４０ ｋＤａのＩ型膜貫通タンパク質、一部の特殊な場合（たとえば、妊娠、組織移植、自己免疫疾患、および肝炎のようなある疾患）において、免疫系の抑制に関連するとされている。正常な場合、免疫系はリンパ節または脾臓に集まる外来の抗原に反応し、抗原特異性を有する細胞傷害性Ｔ細胞の発生（ＣＤ８＋ Ｔ細胞の増殖）を促進する。一方、プログラム細胞死受容体１（ＰＤ－１）はプログラム細胞死リガンド１（ＰＤＬ１）と結合すると、抑制性のシグナルを伝達し、リンパ節のＣＤ８＋ Ｔ細胞の増殖を減少させることができ、そしてＰＤ－１はＢｃｌ－２遺伝子を調節することにより、リンパ節における抗原特異性Ｔ細胞の集まりを抑えることができる。
プログラム細胞死リガンド１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ １ ｌｉｇａｎｄ １、ＰＤＬ１）は分化抗原群２７４（Ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ２７４、ＣＤ２７４）またはＢ７ホモログ（Ｂ７ ｈｏｍｏｌｏｇ １、Ｂ７－Ｈ１）とも呼ばれ、ヒトの体内の１種のタンパク質で、ＣＤ２７４遺伝子によってコードされる。ＰＤＬ１は大きさが４０ ｋＤａのＩ型膜貫通タンパク質、一部の特殊な場合（たとえば、妊娠、組織移植、自己免疫疾患、および肝炎のようなある疾患）において、免疫系の抑制に関連するとされている。正常な場合、免疫系はリンパ節または脾臓に集まる外来の抗原に反応し、抗原特異性を有する細胞傷害性Ｔ細胞の発生（ＣＤ８＋ Ｔ細胞の増殖）を促進する。一方、プログラム細胞死受容体１（ＰＤ－１）はプログラム細胞死リガンド１（ＰＤＬ１）と結合すると、抑制性のシグナルを伝達し、リンパ節のＣＤ８＋ Ｔ細胞の増殖を減少させることができ、そしてＰＤ－１はＢｃｌ－２遺伝子を調節することにより、リンパ節における抗原特異性Ｔ細胞の集まりを抑えることができる。
ＰＤ－１／ＰＤＬ１
ＰＤＬ１とＰＤ－１の結合はＴ細胞の活性化を媒介する抑制性シグナルとして、Ｔ細胞の殺傷機能を抑制し、人体の免疫応答に対して負の調節作用を果たす。
ＰＤＬ１とＰＤ－１の結合はＴ細胞の活性化を媒介する抑制性シグナルとして、Ｔ細胞の殺傷機能を抑制し、人体の免疫応答に対して負の調節作用を果たす。
薬物組成物
また、本発明は組成物を提供する。好ましくは、前記の組成物は薬物組成物で、上記の抗体またはその活性断片あるいはその融合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含有する。通常、これらの物質を無毒で不活性で薬学的に許容される水系担体で配合し、ｐＨ値は配合される物質の性質および治療しようとする疾患にもよるが、ｐＨ値は通常５－８程度、好ましくは６－８程度である。配合された薬物組成物は通常の経路で給与することができ、腹膜内、静脈内、あるいは局部給与が含まれるが、これらに限定されない。
また、本発明は組成物を提供する。好ましくは、前記の組成物は薬物組成物で、上記の抗体またはその活性断片あるいはその融合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含有する。通常、これらの物質を無毒で不活性で薬学的に許容される水系担体で配合し、ｐＨ値は配合される物質の性質および治療しようとする疾患にもよるが、ｐＨ値は通常５－８程度、好ましくは６－８程度である。配合された薬物組成物は通常の経路で給与することができ、腹膜内、静脈内、あるいは局部給与が含まれるが、これらに限定されない。
本発明の薬物組成物は、安全有効量（たとえば０．００１－９９ ｗｔ％、好ましくは０．０１－９０ ｗｔ％、より好ましくは０．１－８０ ｗｔ％）の本発明の上記の抗体（またはその複合体）と、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含有する。このような担体は、食塩水、緩衝液、ブドウ糖、水、グリセリン、エタノール、およびこれらの組み合せを含むが、これらに限定されない。薬物の製剤は投与形態に相応する。本発明の薬物組成物は、注射剤としてもよく、たとえば生理食塩水またはブドウ糖およびほかの助剤を含有する水溶液で通常の方法によって製造することができる。薬物組成物は、注射剤、溶液の場合、無菌条件で製造する。活性成分の投与量は治療有効量、たとえば毎日約１０μｇ／ｋｇ体重－約５０ｍｇ／ｋｇ体重である。また、本発明のポリペプチドはほかの治療剤と併用することが出来る。
薬物組成物の使用時、安全有効量の免疫複合体を哺乳動物に施用するが、その安全有効量は、通常、少なくとも約１０μｇ／ｋｇ体重で、かつ多くの場合、約５０ｍｇ／ｋｇ体重未満で、好ましくは当該投与量が約１０μｇ／ｋｇ体重－約１０ｍｇ／ｋｇ体重である。勿論、具体的な投与量は、さらに投与の様態、患者の健康状況などの要素を考えるべきで、すべて熟練の医者の技能範囲以内である。
ＰＤＬ１に対するナノ抗体
本発明において、前記ＰＤＬ１に対するナノ抗体は、単量体、二量体（二価抗体）、四量体（四価抗体）、および／または多量体（多価抗体）を含む。
本発明の一つの好適な例において、前記ＰＤＬ１に対するナノ抗体は、一つまたは複数の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６で示されるアミノ酸配列を有するＶＨＨ鎖を含む。
本発明において、前記ＰＤＬ１に対するナノ抗体は、単量体、二量体（二価抗体）、四量体（四価抗体）、および／または多量体（多価抗体）を含む。
本発明の一つの好適な例において、前記ＰＤＬ１に対するナノ抗体は、一つまたは複数の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６で示されるアミノ酸配列を有するＶＨＨ鎖を含む。
標識された抗体
本発明の一つの好適な例において、前記抗体は検出可能なマーカーを持つものである。より好ましくは、前記のマーカーは、同位元素、コロイド金マーカー、有色マーカーまたは蛍光マーカーからなる群から選ばれる。
本発明の一つの好適な例において、前記抗体は検出可能なマーカーを持つものである。より好ましくは、前記のマーカーは、同位元素、コロイド金マーカー、有色マーカーまたは蛍光マーカーからなる群から選ばれる。
コロイド金マーカーは当業者に既知の方法によって行ってもよい。本発明の一つの好適な形態において、ＰＤＬ１タンパク質に対する抗体をコロイド金で標識し、金コロイドで標識された抗体を得る。
本発明のＰＤＬ１に対するナノ抗体は有効にＰＤＬ１タンパク質に結合することができる。
本発明のＰＤＬ１に対するナノ抗体は有効にＰＤＬ１タンパク質に結合することができる。
検出方法
また、本発明は、ＰＤＬ１タンパク質その断片を検出する方法にも関する。当該方法は、基本的に、細胞および／または組織のサンプルを得る工程と、サンプルを媒体に溶解させる工程と、前記溶解されたサンプルにおけるＰＤＬ１タンパク質のレベルを検出する工程とを含む。
本発明の検出方法において、使用されるサンプルは特に限定されず、代表的な例は細胞保存液に存在する細胞を含有するサンプルである。
また、本発明は、ＰＤＬ１タンパク質その断片を検出する方法にも関する。当該方法は、基本的に、細胞および／または組織のサンプルを得る工程と、サンプルを媒体に溶解させる工程と、前記溶解されたサンプルにおけるＰＤＬ１タンパク質のレベルを検出する工程とを含む。
本発明の検出方法において、使用されるサンプルは特に限定されず、代表的な例は細胞保存液に存在する細胞を含有するサンプルである。
キット
また、本発明は、本発明の抗体（またはその断片）あるいはカセットを含有するキットを提供するが、本発明の一つの好適な例において、前記のキットはさらに容器、使用説明書、緩衝液などを含む。
また、本発明は、本発明の抗体（またはその断片）あるいはカセットを含有するキットを提供するが、本発明の一つの好適な例において、前記のキットはさらに容器、使用説明書、緩衝液などを含む。
また、本発明は、ＰＤＬ１タンパク質のレベルを検出する検出キットであって、ＰＤＬ１タンパク質を認識する抗体と、サンプルを溶解させる分解媒体と、検出に必要な汎用の試薬および緩衝液、たとえば様々な緩衝液、検出マーカー、検出基質などとを含む。当該検出キットは体外診断装置でもよい。
応用
上記のように、本発明の抗体は幅広い生物応用価値および臨床応用価値を有し、その応用はＰＤＬ１タンパク質に関連する疾患の診断と治療、基礎医療研究、生物学研究などの多くの分野にわたる。一つの好適な応用はＰＤＬ１タンパク質に対する臨床診断、予防および治療に使用されることである。
上記のように、本発明の抗体は幅広い生物応用価値および臨床応用価値を有し、その応用はＰＤＬ１タンパク質に関連する疾患の診断と治療、基礎医療研究、生物学研究などの多くの分野にわたる。一つの好適な応用はＰＤＬ１タンパク質に対する臨床診断、予防および治療に使用されることである。
本発明は、哺乳動物腫瘍細胞群または組織を標的とするＴ細胞による免疫応答を刺激する方法であって、哺乳動物に本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞を施用する工程を含む方法も提供する。
一つの実施形態において、本発明は、患者の自己Ｔ細胞（または異系ドナー）を分離し、活性化させて遺伝子改変し、ＣＡＲ－Ｔ細胞が生成した後、同患者の体内に注入する細胞療法を含む。このような方法では、移植片対宿主反応の発生確率が極めて低く、抗原がＴ細胞によってＭＨＣに拘束されずに認識される。また、一つのＣＡＲ－Ｔで当該抗原を発現するすべての癌を治療することができる。抗体療法と異なり、ＣＡＲ－Ｔ細胞は体内で複製可能で、持続的に腫瘍を抑える長期間の持久性が生じる。
一つの実施形態において、本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞は安定した体内増殖を経て数か月から数年の時間で持続することができる。また、ＣＡＲによる免疫応答は養子免疫療法の工程の一部でもよく、ここで、ＣＡＲ－Ｔ細胞はＣＡＲ抗原結合ドメインによって認識される抗原を高発現する腫瘍細胞に対する特異的な免疫応答を誘導することができる。たとえば、本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞はＰＤＬ１高発現の腫瘍細胞に対する特異的な免疫応答を引き起こす。
治療可能な癌は、血管新生がしていない腫瘍または血管新生が基本的にしていない腫瘍、および血管新生がした腫瘍を含む。本発明のＣＡＲで治療する癌の種類は、胃癌、肺癌、肝臓癌、骨肉腫、乳癌、膵癌、リンパ腫などを含むが、これらに限定されない。
通常、本明細書に記載のように、活性化および増殖された細胞は腫瘍などの疾患の治療および予防に使用することができる。そのため、本発明は、癌を治療する方法であって、それが必要な対象に治療有効量の本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞を投与する工程を含む方法を提供する。
本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞は単独で投与するか、あるいは薬物組成物として希釈剤および／またはほかの成分、たとえばＩＬ－２、ＩＬ－１７やほかのサイトカインまたは細胞群と合わせて施用することができる。簡単に言えば、本発明の薬物組成物は、本明細書に記載の標的細胞群を含み、一つまたは複数の薬学または生理学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と合わせてもよい。
本発明の薬物組成物は、治療（または予防）が必要な疾患に適する形態によって施用することができる。施用の数量および頻度は、患者の病症、および患者の疾患の種類と重篤度などの要素によって決まるか、臨床試験によって決定する。
「免疫学的な有効量」、「抗腫瘍有効量」、「腫瘍抑制有効量」または「治療量」と記載する場合、施用される本発明の組成物の精確な量は（患者（対象）の年齢、体重、腫瘍の大きさ、感染または転移の程度および病症の個体差を考慮し、医師によって決められる。本明細書に記載のＴ細胞を含む薬物組成物は、１０４－１０９個細胞／ｋｇ体重の投与量、好ましくは１０５－１０７個細胞／ｋｇ体重の投与量（範囲内におけるすべての整数値を含む）で施用することができる。Ｔ細胞の組成物はこれらの投与量で数回施用してもよい。細胞は、免疫療法で公知の注入技術（たとえばＲｏｓｅｎｂｅｒｇら，ＮｅｗＥｎｇ．Ｊ． ｏｆ Ｍｅｄ．３１９：１６７６，１９８８）によって施用することができる。具体的な患者対する最適な投与量および治療プランは、医学分野の技術者により、患者の疾患の状況をモニタリングすることで容易に決定し、そしてそれによって治療を調整することができる。
対象への組成物の投与は噴霧法、注射、経口、輸液、植込みまたは移植を含む任意の便利な手段によって行ってもよい。本明細書に記載の組成物は皮下、皮内、腫瘍内、節内、脊髄内、筋肉内、静脈内注射または腹膜内で患者に施用されてもよい。一つの実施形態において、本発明のＴ細胞の組成物は皮内または皮下注射によって患者に施用される。もう一つの実施形態において、本発明のＴ細胞の組成物は静脈内注射によって施用することが好ましい。Ｔ細胞の組成物は直接腫瘍、リンパ節または感染の箇所に注入してもよい。
本発明のある実施形態において、本明細書に記載の方法または本分野で既知のほかのＴ細胞を治療的レベルに増殖させる方法によって活性化および増殖した細胞を使用し、任意の数量の関連治療手段と合わせて（たとえば、その前、同時またはその後に）患者に施用し、前記治療手段は、抗ウイルス療法、シドフォビルおよびインターロイキン－２、アザシチジン（ＡＲＡ－Ｃとして知られる）のような試薬で治療するもの、あるいはＭＳ患者に対するナタリズマブによる治療または乾癬患者に対するエファリズマブによる治療またはＰＭＬ患者に対するほかの治療を含むが、これらに限定されない。さらなる実施形態において、本発明のＴ細胞は、化学治療、放射線、免疫抑制剤、たとえばシクロスポリンＡ、アザチオプリン、メトトレキセート、ミコフェノール酸モフェチルやＦＫ５０６、抗体またはほかの免疫治療剤と併用することができる。さらなる実施形態において、本発明の細胞組成物は、骨髄移植、化学治療剤、たとえばフルダラビン、外部光線放射線療法（ＸＲＴ）、シクロホスファミドと併用して（たとえば、その前、同時またはその後に）患者に施用する。たとえば、一つの実施形態において、対象は高投与量の化学治療の後、末梢血幹細胞移植してもよい。一部の実施形態において、移植後、対象は本発明の増殖した免疫細胞の注入を受ける。別の一つの実施形態において、増殖した細胞は外科手術前または外科手術後に施用される。
患者に施用する以上の治療の投与量は治療する病症の精確な属性および治療するレシピエントによって変わる。ヒトへ施用する投与量の比率は本分野で許容される実践によって実施することができる。通常、１回の治療または１回の治療クールに、１×１０５個～１×１０１０個の本発明の修飾されたＴ細胞を、たとえば静脈輸液の手段によって、患者に施用することができる。
試薬、資材および設備
主な試薬
寒天（Ｓｉｇｍａ， ＣＡＴ＃ Ａ１２９６）、ペプトン （Ｓｉｇｍａ， ＣＡＴ＃９３９２６）、酵母抽出物（ＯＸＯＩＤ， ＣＡＴ＃： ＬＰ００２１）、塩化ナトリウム（Ａｌａｄｄｉｎ，ＣＡＴ＃： Ｃ１１１５３３）、塩化カリウム（Ａｌａｄｄｉｎ，ＣＡＴ＃： Ｐ１１２１３３）、硫酸マグネシウム（国薬，ＣＡＴ＃： １００１３０１８）、塩化マグネシウム（国薬，ＣＡＴ＃： １００１２８１８）、ブドウ糖（生工，ＣＡＴ＃： ＧＴ１９９１）、ＳｆｉＩ （ＮＥＢ， ＣＡＴ＃： Ｒ０１２３Ｌ）、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（ＴａＫａＲａ， ＣＡＴ＃： ２０１１Ａ）、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ(商標) ＩＩ １ｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ合成キット（ＴａＫａＲａ， ＣＡＴ＃： ６２１０Ｂ）、ＮｕＨｉ ｐｏｗｅｒ ｍｉｘ（新海生物，ＣＡＴ＃： ＮＨ９３０３）、３ Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２－６）（Ｓｉｇｍａ， ＣＡＴ＃： １２６－９６－５）、ＤＮＡ断片回収キット（ＴａｋａＲａ， ＣＡＴ＃： ９７６１）、ゲル回収キット（Ｑｉａｇｅｎ， ＣＡＴ＃：２８７０６）、天根プラスミドマキシキット（天根，ＣＡＴ＃：ＤＰ１１７）、ＨＲＰ－Ｍ１３（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏ， ＣＡＴ＃： １１９７３－ＭＭ０５）、ＰＥ－抗ヒトＩｇＧ （ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， Ｃａｔ＃：１２－４９９８－８２）、ウサギ抗リャマＩｇＧ （Ｈ＋Ｌ）二次抗体［ＨＲＰ］ （Ｎｏｖｕｓ，ＣＡＴ＃ＮＢＰ１－７５０９５）、ＳＳ３２０感受性細胞（ｉＣａｒＴａｂ）、ｐＣｏｍＦファージディスプレイベクター（ｉＣａｒＴａｂ）、ＮＨＳ－ビオチン（ＡＰＥｘＢＩＯ， ＣＡＴ＃： Ａ８００２）、ＨＲＰ－ストレプトアビジン（Ｂｏｓｔｅｒ， ＣＡＴ＃： ＢＡ１０８８）、ストレプトアビジン磁気ビーズ（ＮＥＢ， ＣＡＴ＃：Ｓ１４２０５）、抗体親和力検出緩衝液：ＨＢＳ－ＥＰ＋ １０Ｘ（ＧＥ， Ｃａｔ＃ ＢＲ１００６６９）、アミノカップリングキット（ＧＥ， Ｃａｔ＃ＢＲ１０００５０）、１０ ｍＭ グリシン ２．５（ＧＥ， Ｃａｔ＃ＢＲ１００３５６）、ＳシリーズＣＭ５チップ（ＧＥ，Ｃａｔ＃２９１４９６０３）、ＰＢＳ（Ｇｂｉｃｏ， ＣＡＴ＃ １４１９０－２５０）、ＤＭＥＭ（Ｇｂｉｃｏ， ＣＡＴ＃ ４１９６５－０６２）、ＲＰＭＩ１６４０（Ｇｂｉｃｏ， ＣＡＴ＃ ６１８７００４４）、ＦＢＳ（Ｇｂｉｃｏ， ＣＡＴ＃ １００９９－１４１）、ゲノムＤＮＡ精製キット（Ｌｉｆｅｔｅｃｈ，ＣＡＴ＃Ｋ０５１２）、ポリブレン（Ｓｉｇｍａ，ＣＡＴ＃１０７６８９－１０Ｇ）、ＬＶｔｒａｎｓｍ形質移入試薬（ｉＣａｒＴａｂ， Ｃａｔ＃ ＬＶＴｒａｎ１００）、リンパ球分離液（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ， ＣＡＴ＃ １８０５１）。
主な試薬
寒天（Ｓｉｇｍａ， ＣＡＴ＃ Ａ１２９６）、ペプトン （Ｓｉｇｍａ， ＣＡＴ＃９３９２６）、酵母抽出物（ＯＸＯＩＤ， ＣＡＴ＃： ＬＰ００２１）、塩化ナトリウム（Ａｌａｄｄｉｎ，ＣＡＴ＃： Ｃ１１１５３３）、塩化カリウム（Ａｌａｄｄｉｎ，ＣＡＴ＃： Ｐ１１２１３３）、硫酸マグネシウム（国薬，ＣＡＴ＃： １００１３０１８）、塩化マグネシウム（国薬，ＣＡＴ＃： １００１２８１８）、ブドウ糖（生工，ＣＡＴ＃： ＧＴ１９９１）、ＳｆｉＩ （ＮＥＢ， ＣＡＴ＃： Ｒ０１２３Ｌ）、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（ＴａＫａＲａ， ＣＡＴ＃： ２０１１Ａ）、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ(商標) ＩＩ １ｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ合成キット（ＴａＫａＲａ， ＣＡＴ＃： ６２１０Ｂ）、ＮｕＨｉ ｐｏｗｅｒ ｍｉｘ（新海生物，ＣＡＴ＃： ＮＨ９３０３）、３ Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２－６）（Ｓｉｇｍａ， ＣＡＴ＃： １２６－９６－５）、ＤＮＡ断片回収キット（ＴａｋａＲａ， ＣＡＴ＃： ９７６１）、ゲル回収キット（Ｑｉａｇｅｎ， ＣＡＴ＃：２８７０６）、天根プラスミドマキシキット（天根，ＣＡＴ＃：ＤＰ１１７）、ＨＲＰ－Ｍ１３（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏ， ＣＡＴ＃： １１９７３－ＭＭ０５）、ＰＥ－抗ヒトＩｇＧ （ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， Ｃａｔ＃：１２－４９９８－８２）、ウサギ抗リャマＩｇＧ （Ｈ＋Ｌ）二次抗体［ＨＲＰ］ （Ｎｏｖｕｓ，ＣＡＴ＃ＮＢＰ１－７５０９５）、ＳＳ３２０感受性細胞（ｉＣａｒＴａｂ）、ｐＣｏｍＦファージディスプレイベクター（ｉＣａｒＴａｂ）、ＮＨＳ－ビオチン（ＡＰＥｘＢＩＯ， ＣＡＴ＃： Ａ８００２）、ＨＲＰ－ストレプトアビジン（Ｂｏｓｔｅｒ， ＣＡＴ＃： ＢＡ１０８８）、ストレプトアビジン磁気ビーズ（ＮＥＢ， ＣＡＴ＃：Ｓ１４２０５）、抗体親和力検出緩衝液：ＨＢＳ－ＥＰ＋ １０Ｘ（ＧＥ， Ｃａｔ＃ ＢＲ１００６６９）、アミノカップリングキット（ＧＥ， Ｃａｔ＃ＢＲ１０００５０）、１０ ｍＭ グリシン ２．５（ＧＥ， Ｃａｔ＃ＢＲ１００３５６）、ＳシリーズＣＭ５チップ（ＧＥ，Ｃａｔ＃２９１４９６０３）、ＰＢＳ（Ｇｂｉｃｏ， ＣＡＴ＃ １４１９０－２５０）、ＤＭＥＭ（Ｇｂｉｃｏ， ＣＡＴ＃ ４１９６５－０６２）、ＲＰＭＩ１６４０（Ｇｂｉｃｏ， ＣＡＴ＃ ６１８７００４４）、ＦＢＳ（Ｇｂｉｃｏ， ＣＡＴ＃ １００９９－１４１）、ゲノムＤＮＡ精製キット（Ｌｉｆｅｔｅｃｈ，ＣＡＴ＃Ｋ０５１２）、ポリブレン（Ｓｉｇｍａ，ＣＡＴ＃１０７６８９－１０Ｇ）、ＬＶｔｒａｎｓｍ形質移入試薬（ｉＣａｒＴａｂ， Ｃａｔ＃ ＬＶＴｒａｎ１００）、リンパ球分離液（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ， ＣＡＴ＃ １８０５１）。
主な資材
５０ ｍＬ Ｆａｌｃｏｎ遠心管（Ｃｏｒｎｉｎｇ， ＣＡＴ＃３５２０７０）、エレクトロポレーションカップ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ ０．２ ｃｍ）、ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ １．５ ｍＬ ＥＰチューブ（ＱＳＰ， ＣＡＴ＃： ５０９－ＧＲＤ－Ｑ）、２００ μＬ ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ ＰＣＲチューブ（Ａｘｙｇｅｎ， ＰＣＲ－０２Ｄ－Ｃ）、Ｔ１２５振とうフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ， ＣＡＴ＃ ４３１１４３）、１５ ｍＬ Ｆａｌｃｏｎ遠心管（Ｃｏｒｎｉｎｇ， ＣＡＴ＃ ４３００５２）、６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ， ＣＡＴ＃ ３５１６）、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ， ＣＡＴ＃ ３３６５）。
５０ ｍＬ Ｆａｌｃｏｎ遠心管（Ｃｏｒｎｉｎｇ， ＣＡＴ＃３５２０７０）、エレクトロポレーションカップ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ ０．２ ｃｍ）、ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ １．５ ｍＬ ＥＰチューブ（ＱＳＰ， ＣＡＴ＃： ５０９－ＧＲＤ－Ｑ）、２００ μＬ ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ ＰＣＲチューブ（Ａｘｙｇｅｎ， ＰＣＲ－０２Ｄ－Ｃ）、Ｔ１２５振とうフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ， ＣＡＴ＃ ４３１１４３）、１５ ｍＬ Ｆａｌｃｏｎ遠心管（Ｃｏｒｎｉｎｇ， ＣＡＴ＃ ４３００５２）、６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ， ＣＡＴ＃ ３５１６）、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ， ＣＡＴ＃ ３３６５）。
主な設備
エレクトロポレーション装置（ＥｐｐｅｎｄｏｒｆＭｕｌｔｉｐｏｒａｔｏｒ）、遠心機（湘儀Ｈ１６５０Ｒ）、恒温インキュベーター（上海精宏ＤＮＰ－９０５２）、恒温振とう培養インキュベーター（朗越ＤＺ－８５Ａ）、クリーンベンチ（ＳＵＺＨＯＵ ＡＮＴＡＩ ＡＩＲ ＴＥＣＨ ＣＯ．，ＬＴＤ．、ＳＷ－ＣＪ－１ＦＤ）、ＰＣＲ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＡＢＩ２７２０）、安全キャビネット（Ｈａｉｅｒ，ＨＲ４０－ＩＩＡ２）、フローサイトメーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ａｔｔｕｎｅ Ｎｘｔ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）、Ｔｈｅｒｍｏ ３１１１ ＣＯ２インキュベーター、ＢｉａＣｏｒｅ Ｔ２００。
エレクトロポレーション装置（ＥｐｐｅｎｄｏｒｆＭｕｌｔｉｐｏｒａｔｏｒ）、遠心機（湘儀Ｈ１６５０Ｒ）、恒温インキュベーター（上海精宏ＤＮＰ－９０５２）、恒温振とう培養インキュベーター（朗越ＤＺ－８５Ａ）、クリーンベンチ（ＳＵＺＨＯＵ ＡＮＴＡＩ ＡＩＲ ＴＥＣＨ ＣＯ．，ＬＴＤ．、ＳＷ－ＣＪ－１ＦＤ）、ＰＣＲ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＡＢＩ２７２０）、安全キャビネット（Ｈａｉｅｒ，ＨＲ４０－ＩＩＡ２）、フローサイトメーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ａｔｔｕｎｅ Ｎｘｔ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）、Ｔｈｅｒｍｏ ３１１１ ＣＯ２インキュベーター、ＢｉａＣｏｒｅ Ｔ２００。
アミノ酸配列
配列番号１（ナノ抗体１７－Ａ０６）
ＭＡＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＶＡＳＧＲＳＦＩＴＹＡＶＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＳＩＮＷＳＧＡＭＴＹＹＴＤＳＶＮＧＲＦＡＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＮＬＫＬＥＤＴＡＶＹＹＣＡＳＴＩＳＡＶＴＰＴＮＧＹＱＮＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号２（ナノ抗体１７－Ｃ１２）
ＭＡＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＴＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＧＦＹＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＧＩＴＷＧＧＳＶＴＳＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＮＴＡＶＹＹＣＡＲＳＰＲＶＴＴＴＰＲＥＦＤＶＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号３（ナノ抗体１７－Ａ０１）
ＭＡＡＶＱＬＶＤＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＧＦＹＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＡＩＴＷＧＧＳＡＩＳＹＥＤＳＡＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＴＲＶＴＴＮＰＲＥＹＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号４（ナノ抗体１７－Ｇ０６）
ＭＡＡＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＧＦＹＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＡＩＴＷＧＧＳＡＩＳＹＤＤＳＡＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＭＲＶＴＴＮＰＲＥＹＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号５（ナノ抗体２３－Ｇ３）
ＭＡＡＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＶＡＳＧＲＳＦＩＴＹＡＶＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＳＶＮＷＳＧＡＭＴＹＹＡＤＡＶＮＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＮＬＫＬＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＴＩＳＡＶＴＰＴＮＧＹＱＮＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号１（ナノ抗体１７－Ａ０６）
ＭＡＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＶＡＳＧＲＳＦＩＴＹＡＶＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＳＩＮＷＳＧＡＭＴＹＹＴＤＳＶＮＧＲＦＡＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＮＬＫＬＥＤＴＡＶＹＹＣＡＳＴＩＳＡＶＴＰＴＮＧＹＱＮＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号２（ナノ抗体１７－Ｃ１２）
ＭＡＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＴＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＧＦＹＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＧＩＴＷＧＧＳＶＴＳＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＮＴＡＶＹＹＣＡＲＳＰＲＶＴＴＴＰＲＥＦＤＶＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号３（ナノ抗体１７－Ａ０１）
ＭＡＡＶＱＬＶＤＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＧＦＹＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＡＩＴＷＧＧＳＡＩＳＹＥＤＳＡＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＴＲＶＴＴＮＰＲＥＹＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号４（ナノ抗体１７－Ｇ０６）
ＭＡＡＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＧＦＹＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＡＩＴＷＧＧＳＡＩＳＹＤＤＳＡＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＭＲＶＴＴＮＰＲＥＹＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号５（ナノ抗体２３－Ｇ３）
ＭＡＡＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＶＡＳＧＲＳＦＩＴＹＡＶＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＳＶＮＷＳＧＡＭＴＹＹＡＤＡＶＮＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＮＬＫＬＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＴＩＳＡＶＴＰＴＮＧＹＱＮＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号６（ナノ抗体２９－Ｈ９）
ＲＬＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＴＹＡＭＳＷＹＲＧＶＰＥＫＥＲＥＬＶＡＦＩＳＳＤＧＧＧＴＴＹＲＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＧＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＧＶＹＹＣＡＲＧＬＡＱＩＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号７（ナノ抗体１７－Ａ０６、２３－Ｇ３のＣＤＲ１）
ＧＲＳＦＩＴＹＡ
配列番号８（ナノ抗体１７－Ａ０６のＣＤＲ２）
ＩＮＷＳＧＡＭＴ
配列番号９（ナノ抗体１７－Ａ０６のＣＤＲ３）
ＡＳＴＩＳＡＶＴＰＴＮＧＹＱＮ
配列番号１０（ナノ抗体１７－Ｃ１２、１７－Ａ０１、１７－Ｇ０６のＣＤＲ１）
ＧＲＴＦＧＦ
配列番号１１（ナノ抗体１７－Ｃ１２のＣＤＲ２）
ＩＴＷＧＧＳＶＴ
配列番号１２（ナノ抗体１７－Ｃ１２のＣＤＲ３）
ＡＲＳＰＲＶＴＴＴＰＲＥＦＤＶ
配列番号１３（ナノ抗体１７－Ａ０１、１７－Ｇ０６のＣＤＲ２）
ＩＴＷＧＧＳＡＩ
配列番号１４（ナノ抗体１７－Ａ０１のＣＤＲ３）
ＡＲＳＴＲＶＴＴＮＰＲＥＹＤＹ
配列番号１５（ナノ抗体１７－Ｇ０６のＣＤＲ３）
ＡＲＳＭＲＶＴＴＮＰＲＥＹＤＹ
配列番号１６（ナノ抗体２３－Ｇ３のＣＤＲ２）
ＶＮＷＳＧＡＭＴ
配列番号１７（ナノ抗体２３－Ｇ３のＣＤＲ３）
ＡＡＴＩＳＡＶＴＰＴＮＧＹＱＮ
配列番号１８（ナノ抗体２９－Ｈ９のＣＤＲ１）
ＧＦＴＦＳＴＹＡ
配列番号１９（ナノ抗体２９－Ｈ９のＣＤＲ２）
ＩＳＳＤＧＧＧＴ
配列番号２０（ナノ抗体２９－Ｈ９のＣＤＲ３）
ＡＲＧＬＡＱＩ
ＶＮＷＳＧＡＭＴ
配列番号１７（ナノ抗体２３－Ｇ３のＣＤＲ３）
ＡＡＴＩＳＡＶＴＰＴＮＧＹＱＮ
配列番号１８（ナノ抗体２９－Ｈ９のＣＤＲ１）
ＧＦＴＦＳＴＹＡ
配列番号１９（ナノ抗体２９－Ｈ９のＣＤＲ２）
ＩＳＳＤＧＧＧＴ
配列番号２０（ナノ抗体２９－Ｈ９のＣＤＲ３）
ＡＲＧＬＡＱＩ
配列番号２１（ナノ抗体１７－Ａ０６のＦＲ１）
ＭＡＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＶＡＳ
配列番号２２（ナノ抗体１７－Ａ０６、２３－Ｇ３のＦＲ２）
ＶＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＳ
配列番号２３（ナノ抗体１７－Ａ０６のＦＲ３）
ＹＹＴＤＳＶＮＧＲＦＡＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＮＬＫＬＥＤＴＡＶＹＹＣ
配列番号２４（ナノ抗体１７－Ａ０６、１７－Ｃ１２、１７－Ａ０１、１７－Ｇ０６、２３－Ｇ３、２９－Ｈ９のＦＲ４）
ＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号２５（ナノ抗体１７－Ｃ１２のＦＲ１）
ＭＡＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＴＬＳＣＡＡＳ
ＭＡＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＶＡＳ
配列番号２２（ナノ抗体１７－Ａ０６、２３－Ｇ３のＦＲ２）
ＶＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＳ
配列番号２３（ナノ抗体１７－Ａ０６のＦＲ３）
ＹＹＴＤＳＶＮＧＲＦＡＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＮＬＫＬＥＤＴＡＶＹＹＣ
配列番号２４（ナノ抗体１７－Ａ０６、１７－Ｃ１２、１７－Ａ０１、１７－Ｇ０６、２３－Ｇ３、２９－Ｈ９のＦＲ４）
ＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号２５（ナノ抗体１７－Ｃ１２のＦＲ１）
ＭＡＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＴＬＳＣＡＡＳ
配列番号２６（ナノ抗体１７－Ｃ１２のＦＲ２）
ＹＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＧ
配列番号２７（ナノ抗体１７－Ｃ１２のＦＲ３）
ＳＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＮＴＡＶＹＹＣ
配列番号２８（ナノ抗体１７－Ａ０１のＦＲ１）
ＭＡＡＶＱＬＶＤＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ
配列番号２９（ナノ抗体１７－Ａ０１、１７－Ｇ０６のＦＲ２）
ＹＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＡ
配列番号３０（ナノ抗体１７－Ａ０１のＦＲ３）
ＳＹＥＤＳＡＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣ
ＹＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＧ
配列番号２７（ナノ抗体１７－Ｃ１２のＦＲ３）
ＳＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＮＴＡＶＹＹＣ
配列番号２８（ナノ抗体１７－Ａ０１のＦＲ１）
ＭＡＡＶＱＬＶＤＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ
配列番号２９（ナノ抗体１７－Ａ０１、１７－Ｇ０６のＦＲ２）
ＹＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＡ
配列番号３０（ナノ抗体１７－Ａ０１のＦＲ３）
ＳＹＥＤＳＡＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣ
配列番号３１（ナノ抗体１７－Ｇ０６のＦＲ１）
ＭＡＡＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ
配列番号３２（ナノ抗体１７－Ｇ０６のＦＲ３）
ＳＹＤＤＳＡＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣ
配列番号３３（ナノ抗体２３－Ｇ３のＦＲ１）
ＭＡＡＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＶＡＳ
配列番号３４（ナノ抗体２３－Ｇ３のＦＲ３）
ＹＹＡＤＡＶＮＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＮＬＫＬＥＤＴＡＶＹＹＣ
配列番号３５（ナノ抗体２９－Ｈ９のＦＲ１）
ＲＬＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ
ＭＡＡＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ
配列番号３２（ナノ抗体１７－Ｇ０６のＦＲ３）
ＳＹＤＤＳＡＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣ
配列番号３３（ナノ抗体２３－Ｇ３のＦＲ１）
ＭＡＡＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＶＡＳ
配列番号３４（ナノ抗体２３－Ｇ３のＦＲ３）
ＹＹＡＤＡＶＮＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＮＬＫＬＥＤＴＡＶＹＹＣ
配列番号３５（ナノ抗体２９－Ｈ９のＦＲ１）
ＲＬＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ
配列番号３６（ナノ抗体２９－Ｈ９のＦＲ２）
ＭＳＷＹＲＧＶＰＥＫＥＲＥＬＶＡＦ
配列番号３７（ナノ抗体２９－Ｈ９のＦＲ３）
ＴＹＲＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＧＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＧＶＹＹＣ
ＭＳＷＹＲＧＶＰＥＫＥＲＥＬＶＡＦ
配列番号３７（ナノ抗体２９－Ｈ９のＦＲ３）
ＴＹＲＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＧＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＧＶＹＹＣ
本発明の主な利点は以下の通りである。
１．本発明のＰＤＬ１ナノ抗体は特異的にＰＤＬ１に結合することができ、高い親和力を有する。
２．本発明のＰＤＬ１ナノ抗体は良いＰＤ－１－ＰＤＬ１遮断活性を有し、そしてＰＤＬ１に対する中和活性が高い。
３．本発明では、同時にＰＤＬ１の一価ナノ抗体および二価のＰＤＬ１ナノ抗体を構築し、そしていずれも明らな遮断活性を有する。
４．本発明のＰＤＬ１ナノ抗体はＰＤ－１およびＰＤＬ１経路のみを遮断し、そしてＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ２経路に影響しないことで、間質性肺炎などの副作用の発生を避け、安全性を向上させることができる。
５．本発明のＰＤＬ１ナノ抗体はより全面的に免疫系が活性化して腫瘍を殺傷するようにさせ、ＰＤ－１に効果がないかＰＤ－１薬剤耐性の患者は明らかに利益を得ることができ、治療効果も得られ、よって患者の適応範囲が広がる。
１．本発明のＰＤＬ１ナノ抗体は特異的にＰＤＬ１に結合することができ、高い親和力を有する。
２．本発明のＰＤＬ１ナノ抗体は良いＰＤ－１－ＰＤＬ１遮断活性を有し、そしてＰＤＬ１に対する中和活性が高い。
３．本発明では、同時にＰＤＬ１の一価ナノ抗体および二価のＰＤＬ１ナノ抗体を構築し、そしていずれも明らな遮断活性を有する。
４．本発明のＰＤＬ１ナノ抗体はＰＤ－１およびＰＤＬ１経路のみを遮断し、そしてＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ２経路に影響しないことで、間質性肺炎などの副作用の発生を避け、安全性を向上させることができる。
５．本発明のＰＤＬ１ナノ抗体はより全面的に免疫系が活性化して腫瘍を殺傷するようにさせ、ＰＤ－１に効果がないかＰＤ－１薬剤耐性の患者は明らかに利益を得ることができ、治療効果も得られ、よって患者の適応範囲が広がる。
６．本発明のＰＤＬ１ナノ抗体はＰＤ－１ － ＰＤＬ１経路を抑制する以外、Ｂ７．１およびＰＤＬ１の共抑制機能を遮断することで、全面的なＴ細胞の機能およびサイトカインの生成の活性化に有利で、よってより良い免疫効果が得られる。
７．本発明のＰＤＬ１ナノ抗体はポリクローナル抗体よりも低価で量産しやすく、生産コストを低下させることで、それによって製造される薬物の価格を下げることができる。
８．本発明のＰＤＬ１ナノ抗体は適用条件が広く、より広い温度範囲において安定で、高温でも作用を発揮することができる。従来の抗体断片と違い、高温におけるナノ抗体の展開が完全に可逆的であることが証明された。また、ナノ抗体は極端なｐＨ値でも安定で、そして胃液においても生存することができる。
９．構造の面において、ナノ抗体は親水の一面が存在するため、従来の抗体と比べ、本発明のＰＤＬ１ナノ抗体は従来の抗体に関連する溶解度および集合性の問題がない。
７．本発明のＰＤＬ１ナノ抗体はポリクローナル抗体よりも低価で量産しやすく、生産コストを低下させることで、それによって製造される薬物の価格を下げることができる。
８．本発明のＰＤＬ１ナノ抗体は適用条件が広く、より広い温度範囲において安定で、高温でも作用を発揮することができる。従来の抗体断片と違い、高温におけるナノ抗体の展開が完全に可逆的であることが証明された。また、ナノ抗体は極端なｐＨ値でも安定で、そして胃液においても生存することができる。
９．構造の面において、ナノ抗体は親水の一面が存在するため、従来の抗体と比べ、本発明のＰＤＬ１ナノ抗体は従来の抗体に関連する溶解度および集合性の問題がない。
以下、具体的な実施例によって、さらに本発明を説明する。これらの実施例は本発明を説明するために用いられるものだけで、本発明の範囲の制限にはならないと理解されるものである。下記実施例で具体的な条件が示されていない実験方法は、通常、たとえばＳａｍｂｒｏｏｋら、「モレキュラー・クローニング：研究室マニュアル」（ニューヨーク、コールド・スプリング・ハーバー研究所出版社、１９８９） に記載の条件などの通常の条件に、あるいは、メーカーのお薦めの条件に従う。特に説明しない限り、百分率および部は重量百分率および重量部である。
実施例１．抗原製造の方案
１．遺伝子合成によってＰＤＬ１細胞外領域（１９ＡＡ－２３８ＡＡ）の配列を製造し、Ｃ末端にＩｇＧ１ Ｆｃタグを付加し、真核発現ベクターにサブクローニングし、抗原ＰＤＬ１－Ｆｃタンパク質発現ベクターを構築した。
２．構築できたＰＤＬ１－Ｆｃタンパク質発現ベクターに対してプラスミド抽出を行い、２９３細胞に一過性形質移入した後、続いて８日培養し、遠心して培養上清を収集し、０．４５ μｍのろ膜でろ過し、ろ液を無菌遠心管に移し、プロテインＡカラムによって精製してＰＤＬ１－Ｆｃタンパク質を得た。
３．ＰＤＬ１－Ｆｃタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥ検出によって同定した。
１．遺伝子合成によってＰＤＬ１細胞外領域（１９ＡＡ－２３８ＡＡ）の配列を製造し、Ｃ末端にＩｇＧ１ Ｆｃタグを付加し、真核発現ベクターにサブクローニングし、抗原ＰＤＬ１－Ｆｃタンパク質発現ベクターを構築した。
２．構築できたＰＤＬ１－Ｆｃタンパク質発現ベクターに対してプラスミド抽出を行い、２９３細胞に一過性形質移入した後、続いて８日培養し、遠心して培養上清を収集し、０．４５ μｍのろ膜でろ過し、ろ液を無菌遠心管に移し、プロテインＡカラムによって精製してＰＤＬ１－Ｆｃタンパク質を得た。
３．ＰＤＬ１－Ｆｃタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥ検出によって同定した。
図１に示すように、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ検出では、ＰＤＬ１－Ｆｃの実際のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分子量が約６５ ｋＤであったことが示され、ＡＣＲＯ社のＰＤＬ１－Ｆｃ製品の電気泳動の検出結果と一致し、かつ本発明のＰＤＬ１－Ｆｃのバンドの純度が高かったことから、発現および精製の効果が良かったことがわかる。
前記精製されたＰＤＬ１－Ｆｃタンパク質は抗原で、免疫原、免疫抗原とも呼ばれる。
前記精製されたＰＤＬ１－Ｆｃタンパク質は抗原で、免疫原、免疫抗原とも呼ばれる。
実施例２．抗原によるリャマの免疫
上記で製造されたＰＤＬ１－Ｆｃタンパク質抗原で１頭のリャマに対して皮下の複数箇所で免疫させ、３回の免疫の流れを表３に示す。
上記で製造されたＰＤＬ１－Ｆｃタンパク質抗原で１頭のリャマに対して皮下の複数箇所で免疫させ、３回の免疫の流れを表３に示す。
実施例３．免疫力価の検出
１．５ ｍＬの実施例１における３回目の免疫後の末梢血を採取し、血液サンプルを収集した遠心管を３７℃のインキュベーター内において１時間置いた後、血液サンプルを４℃に移して一晩置いた。
２．血清を新しい無菌遠心管に移し、５０００ ｒｐｍで２０ｍｉｎ遠心し、ＰＤＬ１からＦｃ抗原を切断してあらかじめコーディングされた９６ウェルプレートを使用し、抗ラクダＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体および抗ラクダＶＨＨ二次抗体を選び、ＥＬＩＳＡ実験を行って免疫力価を検出した。
１．５ ｍＬの実施例１における３回目の免疫後の末梢血を採取し、血液サンプルを収集した遠心管を３７℃のインキュベーター内において１時間置いた後、血液サンプルを４℃に移して一晩置いた。
２．血清を新しい無菌遠心管に移し、５０００ ｒｐｍで２０ｍｉｎ遠心し、ＰＤＬ１からＦｃ抗原を切断してあらかじめコーディングされた９６ウェルプレートを使用し、抗ラクダＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体および抗ラクダＶＨＨ二次抗体を選び、ＥＬＩＳＡ実験を行って免疫力価を検出した。
図２のＥＬＩＳＡ検出結果に示すように、未免疫（陰性）血清と比べ、抗ラクダＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体で検出した場合、免疫血清が陽性で、かつ力価が高かった。
上記結果から、免疫血清はＰＤＬ１と特異的に結合し、かつ血清の希釈勾配とともにＯＤ４５０値が勾配的に変化したことがわかり、免疫が成功したことが示された。
１００ ｍＬの末梢血を採取し、ライブラリーの構築に備えた。
１００ ｍＬの末梢血を採取し、ライブラリーの構築に備えた。
実施例４．ＰＢＭＣの分離およびＶＨＨ抗体断片の獲得
１．１５０ ｍＬの実施例１で製造された末梢血を採取し、リンパ球分離液でＰＢＭＣを分離した。
１．１５０ ｍＬの実施例１で製造された末梢血を採取し、リンパ球分離液でＰＢＭＣを分離した。
２．ＲＮＡを抽出し、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（商標） ＩＩ １ｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ合成キットによって逆転写させ、ｃＤＮＡを製造した。
（１） ２００ μＬＰＣＲチューブにおいて表４の反応混合液Ｍｉｘ１を調製した。
（２） ６５℃で５ ｍｉｎ保温した後、氷の上で迅速に冷却した。
（３） 上記ＰＣＲチューブにおいて表５の反応液を調製した。
（４） 吹いて均一に混合した後、８０ μＬ／管で分け、ＰＣＲ装置において４２℃で１時間置き、７０℃で１５分熱不活性化し、最後にｃＤＮＡサンプルを氷の上または－２０℃で長期間保存した。
（１） ２００ μＬＰＣＲチューブにおいて表４の反応混合液Ｍｉｘ１を調製した。
（３） 上記ＰＣＲチューブにおいて表５の反応液を調製した。
３．ＶＨＨ断片の増幅
（１） 表６の一回目のＰＣＲ反応系（５０ μＬ／管）を調製した。
ＰＣＲ反応系を調製した後、表７のプログラムでＰＣＲ装置を設定した。
（２） ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動：
１％のアガロースゲルで電気泳動を行ってＰＣＲ産物を分析し、分子量の大きさが７５０ ｂｐ程度の片段を分離した。ゲル回収キットによってＰＣＲ産物を回収し、そしてＮａｎｏＤｒｏｐで濃度を測定した。
（３） 表８の二回目のＰＣＲ反応系（５０ μＬ／管）を調製した。
ＰＣＲ反応系を調製した後、表９のプログラムでＰＣＲ装置を設定した。
（４） 二回目のＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動分析：
１％のアガロースゲルで電気泳動を行ってＰＣＲ産物を分析し、分子量の大きさが４００ ｂｐ程度のＶＨＨ片段を分離した。ゲル回収キットによってＶＨＨのＰＣＲ産物を回収し、そしてＮａｎｏＤｒｏｐで濃度を測定した。
（１） 表６の一回目のＰＣＲ反応系（５０ μＬ／管）を調製した。
１％のアガロースゲルで電気泳動を行ってＰＣＲ産物を分析し、分子量の大きさが７５０ ｂｐ程度の片段を分離した。ゲル回収キットによってＰＣＲ産物を回収し、そしてＮａｎｏＤｒｏｐで濃度を測定した。
（３） 表８の二回目のＰＣＲ反応系（５０ μＬ／管）を調製した。
１％のアガロースゲルで電気泳動を行ってＰＣＲ産物を分析し、分子量の大きさが４００ ｂｐ程度のＶＨＨ片段を分離した。ゲル回収キットによってＶＨＨのＰＣＲ産物を回収し、そしてＮａｎｏＤｒｏｐで濃度を測定した。
図３に示すように、アガロースゲル電気泳動のＰＣＲ産物の結果が示された。図３Ａは第一回でのＰＣＲで得られた１０００ ｂｐおよび７５０ ｂｐ程度の二本のＰＣＲバンドを示し、ゲルから７５０ ｂｐの断片を回収して第二回のＰＣＲの鋳型とし、図３Ｂは第二回のＰＣＲで得られた４５０ ｂｐ程度のバンドを示し、アガロースゲル電気泳動によって同定したところ、ＶＨＨ断片であると証明された。
ＶＨＨ断片をＳｆｉＩで酵素切断した後、ファージディスプレイベクターｐＣｏｍＦにサブクローニングし、連結産物でＳＳ３２０大腸菌感受性細胞を電気的形質転換させ、単一ドメイン抗体ファージディスプレイライブラリーを構築した。
実施例５．ファージディスプレイライブラリーの構築
１．ファージディスプレイベクターの構築：
（１） ＳｆｉＩでそれぞれｐＣｏｍ Ｆベクターおよび上記実施例４で得られたＶＨＨ ＰＣＲゲル回収産物を酵素切断し、５０℃で一晩酵素切断した。
（２） １％アガロースゲルでｐＣｏｍ Ｆベクター断片を分離し、５０００ ｂｐのベクター断片を切り取ってゲル回収を行った。同時にＤＮＡ断片回収キットによってＰＣＲ酵素切断産物を精製し、そしてＮａｎｏＤｒｏｐで濃度を測定した。
（３） 酵素切断されたｐＣｏｍ ＦベクターおよびＶＨＨ断片をＴ４リガーゼによって連結し、１６℃で一晩連結した。
１．ファージディスプレイベクターの構築：
（１） ＳｆｉＩでそれぞれｐＣｏｍ Ｆベクターおよび上記実施例４で得られたＶＨＨ ＰＣＲゲル回収産物を酵素切断し、５０℃で一晩酵素切断した。
（２） １％アガロースゲルでｐＣｏｍ Ｆベクター断片を分離し、５０００ ｂｐのベクター断片を切り取ってゲル回収を行った。同時にＤＮＡ断片回収キットによってＰＣＲ酵素切断産物を精製し、そしてＮａｎｏＤｒｏｐで濃度を測定した。
（３） 酵素切断されたｐＣｏｍ ＦベクターおよびＶＨＨ断片をＴ４リガーゼによって連結し、１６℃で一晩連結した。
２．ファージ連結産物による大腸菌の電気的形質転換：
（１） エレクトロポレーションカップ、連結産物および電気的形質転換感受性細胞を用意して氷の上において予備冷却した。
（２） 予備冷却されたライブラリー構築連結産物を取って電気的形質転換感受性細胞に入れ、氷の上に１ ｍｉｎ置き、各エレクトロポレーションカップに７０ μＬのＤＮＡ／感受性細胞の混合物を入れ、エレクトロポレーションカップを氷の上に置いた。
（３） ２５００ Ｖで５ ｍｓ電気的形質転換を行った。
（４） 電撃終了後、すぐに室温に平衡化されたＳＯＣ培地で菌体を再懸濁させ、３７℃で１時間シェーカー培養。
（１） エレクトロポレーションカップ、連結産物および電気的形質転換感受性細胞を用意して氷の上において予備冷却した。
（２） 予備冷却されたライブラリー構築連結産物を取って電気的形質転換感受性細胞に入れ、氷の上に１ ｍｉｎ置き、各エレクトロポレーションカップに７０ μＬのＤＮＡ／感受性細胞の混合物を入れ、エレクトロポレーションカップを氷の上に置いた。
（３） ２５００ Ｖで５ ｍｓ電気的形質転換を行った。
（４） 電撃終了後、すぐに室温に平衡化されたＳＯＣ培地で菌体を再懸濁させ、３７℃で１時間シェーカー培養。
（５） 菌液を１５ ｍＬ取ってそのままファージレスキューを行い、残りの５ ｍＬの電気的形質転換産物を等体積の５０％グリセリンに入れ、均一に混合した後、－８０℃で保存した。
（６） 別途に菌液を２０ μＬ取り、９８０ μＬの２ＹＴ培地を入れて希釈した後、１００ μＬの希釈された産物を取り、９００ μＬの２ＹＴ培地を入れて二回目の希釈を行い、５０ μＬ取って均一にアンピシリン含有ＬＢプレートに塗布し、３７℃で一晩培養した。
（７） 翌日に、プレートを取り出し、各連結から得られたクローン数を計算し、ライブラリー容量を計算した。
（８） 同時にプレートにおける単一クローンを２０取ってアンピシリン含有２ＹＴ培地に接種し、３７℃で約６－８時間振とう培養し、菌液のシークエンシングに供し（シークエンシング共通プライマーＭ１３Ｒ）、ライブラリーの多様性を計算した。
（６） 別途に菌液を２０ μＬ取り、９８０ μＬの２ＹＴ培地を入れて希釈した後、１００ μＬの希釈された産物を取り、９００ μＬの２ＹＴ培地を入れて二回目の希釈を行い、５０ μＬ取って均一にアンピシリン含有ＬＢプレートに塗布し、３７℃で一晩培養した。
（７） 翌日に、プレートを取り出し、各連結から得られたクローン数を計算し、ライブラリー容量を計算した。
（８） 同時にプレートにおける単一クローンを２０取ってアンピシリン含有２ＹＴ培地に接種し、３７℃で約６－８時間振とう培養し、菌液のシークエンシングに供し（シークエンシング共通プライマーＭ１３Ｒ）、ライブラリーの多様性を計算した。
図４に示すように、ファージディスプレイライブラリーの配列のアラインメントの結果から、ファージディスプレイライブラリーのブランク率および抗体重複率が良く、大腸菌ライブラリーの容量が６．５３Ｅ８であったことが示された。
実施例６．ファージディスプレイライブラリーの再生とレスキューおよびファージの沈殿
１．実施例５における電気的形質転換後の産物を２ＹＴで希釈してＯＤ６００が０．２程度になるように調整し、最終濃度が１００ μｇ／ｍＬのアンピシリンを入れて恒温シェーカーに置き、３７℃、２２５ ｒｐｍで培養し、ＯＤ６００が０．５になった時点で停止した。
２．Ｍ１３ＫＯ７を投入し、均一に振とうした後、３７℃で３０ ｍｉｎ静置し、さらに３７℃、２２５ ｒｐｍで１ｈ培養した。
３．Ｍ１３ＫＯ７体積＝１０ × 体積 × ＯＤ６００ × ５ × １０８ ／ Ｍ１３ＫＯ７力価。
４．菌液を６０００ ｒｐｍで１０ ｍｉｎ遠心した後、２ＹＴ－ＡＫ培地で再懸濁させ、２５℃、２００ ｒｐｍで一晩培養した。
５．菌液を１００００ ｒｐｍで１５ ｍｉｎ遠心した。
１．実施例５における電気的形質転換後の産物を２ＹＴで希釈してＯＤ６００が０．２程度になるように調整し、最終濃度が１００ μｇ／ｍＬのアンピシリンを入れて恒温シェーカーに置き、３７℃、２２５ ｒｐｍで培養し、ＯＤ６００が０．５になった時点で停止した。
２．Ｍ１３ＫＯ７を投入し、均一に振とうした後、３７℃で３０ ｍｉｎ静置し、さらに３７℃、２２５ ｒｐｍで１ｈ培養した。
３．Ｍ１３ＫＯ７体積＝１０ × 体積 × ＯＤ６００ × ５ × １０８ ／ Ｍ１３ＫＯ７力価。
４．菌液を６０００ ｒｐｍで１０ ｍｉｎ遠心した後、２ＹＴ－ＡＫ培地で再懸濁させ、２５℃、２００ ｒｐｍで一晩培養した。
５．菌液を１００００ ｒｐｍで１５ ｍｉｎ遠心した。
６．沈殿を捨て、上清を新しい遠心管に移し、管内に１／５菌液体積のＰＥＧ／ＮａＣｌを入れ、均一に混合した後、４℃で２ｈ静置した。
７．沈殿させたファージ上清を１００００ ｒｐｍ、４℃で３０ ｍｉｎ遠心し、上清を捨て、各５０ ｍＬ遠心管の沈殿（ファージ）を１ ｍＬの無菌ＰＢＳで再懸濁させた。
８．再懸濁させたファージを１．５ ｍＬのＥＰチューブに移し、遠心機に置き、１２０００ｇ、４℃で５ ｍｉｎ遠心した。
９．上清を新しい１．５ ｍＬのＥＰチューブに移し、管内に２５０μＬのＰＥＧ／ＮａＣｌを入れ、均一に混合した後、４℃で１０ ｍｉｎ静置した。
１０．１２０００ｇで１０ ｍｉｎ遠心し、上清を捨て、１ ｍＬのＰＢＳを入れて再懸濁させた。
７．沈殿させたファージ上清を１００００ ｒｐｍ、４℃で３０ ｍｉｎ遠心し、上清を捨て、各５０ ｍＬ遠心管の沈殿（ファージ）を１ ｍＬの無菌ＰＢＳで再懸濁させた。
８．再懸濁させたファージを１．５ ｍＬのＥＰチューブに移し、遠心機に置き、１２０００ｇ、４℃で５ ｍｉｎ遠心した。
９．上清を新しい１．５ ｍＬのＥＰチューブに移し、管内に２５０μＬのＰＥＧ／ＮａＣｌを入れ、均一に混合した後、４℃で１０ ｍｉｎ静置した。
１０．１２０００ｇで１０ ｍｉｎ遠心し、上清を捨て、１ ｍＬのＰＢＳを入れて再懸濁させた。
１１．１２０００ｇで５ ｍｉｎ遠心し、沈殿を捨て、上清を新しい１．５ ｍＬのＥＰチューブに移した。
１２．１２０００ｇで５ ｍｉｎ遠心し、上清を新しい１．５ｍＬのＥＰチューブに移し、初期ファージライブラリーを得た。
１３．１０ μＬの沈殿を取って９０ μＬの２ＹＴ培地に投入し、１０－１とし、順に１０－９まで１０倍希釈し、１０－７、１０－８、１０－９の三段の勾配の２０ μＬの希釈されたサンプルを取って２００ μＬの予め用意されたＯＤ６００が０．５のＥＲ２７３８に投入し、均一に混合した後、３７℃の水浴鍋に置き、１０ ｍｉｎ静置し、ＬＢ－ＡＭＰ固体プレートに１０８ μＬずつ塗布し、３７℃で一晩置き、翌日に集落を数えて力価を確定した。
１４．力価の計算：集落数が３０－３００の間のプレートを選び、二枚のプレートの平均値を取り、集落数に希釈倍数をかけ、さらに１００をかけて力価を得た。
再生、レスキューおよび計数を経たファージディスプレイライブラリーは後続のファージディスプレイライブラリーの溶液パンニングを行うことができる。
１２．１２０００ｇで５ ｍｉｎ遠心し、上清を新しい１．５ｍＬのＥＰチューブに移し、初期ファージライブラリーを得た。
１３．１０ μＬの沈殿を取って９０ μＬの２ＹＴ培地に投入し、１０－１とし、順に１０－９まで１０倍希釈し、１０－７、１０－８、１０－９の三段の勾配の２０ μＬの希釈されたサンプルを取って２００ μＬの予め用意されたＯＤ６００が０．５のＥＲ２７３８に投入し、均一に混合した後、３７℃の水浴鍋に置き、１０ ｍｉｎ静置し、ＬＢ－ＡＭＰ固体プレートに１０８ μＬずつ塗布し、３７℃で一晩置き、翌日に集落を数えて力価を確定した。
１４．力価の計算：集落数が３０－３００の間のプレートを選び、二枚のプレートの平均値を取り、集落数に希釈倍数をかけ、さらに１００をかけて力価を得た。
再生、レスキューおよび計数を経たファージディスプレイライブラリーは後続のファージディスプレイライブラリーの溶液パンニングを行うことができる。
実施例７．ファージディスプレイライブラリーの溶液パンニング
ストレプトアビジン磁気ビーズを使用し、予めビオチン化された標的抗原と結合させ、さらにスクリーニングされるファージライブラリーとインキュベートし、非特異的に結合したファージを洗浄して除去し、ＴＥＡで標的抗原に結合した組み換えファージを溶離させ、そして増幅した。３－４回のスクリーニング後、単一クレーンを取ってシークエンシングを行った。
ストレプトアビジン磁気ビーズを使用し、予めビオチン化された標的抗原と結合させ、さらにスクリーニングされるファージライブラリーとインキュベートし、非特異的に結合したファージを洗浄して除去し、ＴＥＡで標的抗原に結合した組み換えファージを溶離させ、そして増幅した。３－４回のスクリーニング後、単一クレーンを取ってシークエンシングを行った。
１．ＰＢＳでビオチン化された標的抗原を５０、１０、５、５ μｇ／ｍｌに希釈し（毎回の使用濃度が異なる）、それぞれストレプトアジビン磁気ビーズと４℃で混合して１ｈインキュベートし、遊離の標的抗原を洗浄して除去した。
２．約６×１０１１ Ｐｆｕ １５０ μＬのライブラリーファージまたは前回の増幅産物を６００ μＬに希釈し、予めＦｃがコーディングされたＥＬＩＳＡウェルに入れ、Ｆｃ除去を計三回行い、Ｆｃが結合したファージを除去した。
３．Ｆｃ除去されたファージをストレプトアビジン磁気ビーズと混合し、４℃で１ｈインキュベートし、ストレプトアビジンと結合したファージを除去した。
４．磁気ビーズを捨て、ファージを１％ ＰＢＳＡで約１ ｍＬに希釈し、工程１で標的抗原と予め結合させた磁気ビーズと混合し、４℃で１ｈインキュベートした。
２．約６×１０１１ Ｐｆｕ １５０ μＬのライブラリーファージまたは前回の増幅産物を６００ μＬに希釈し、予めＦｃがコーディングされたＥＬＩＳＡウェルに入れ、Ｆｃ除去を計三回行い、Ｆｃが結合したファージを除去した。
３．Ｆｃ除去されたファージをストレプトアビジン磁気ビーズと混合し、４℃で１ｈインキュベートし、ストレプトアビジンと結合したファージを除去した。
４．磁気ビーズを捨て、ファージを１％ ＰＢＳＡで約１ ｍＬに希釈し、工程１で標的抗原と予め結合させた磁気ビーズと混合し、４℃で１ｈインキュベートした。
５．ファージを吸い取り、ＰＢＳで磁気ビーズを３－５回洗浄し、毎回２－３ ｍｉｎで、同時にＰＢＳで予めＭＰＢＳでブロッキングされた１．５ ｍＬのＥＰチューブを洗浄した。
６．６００ μＬの１×ＴＥＡで磁気ビーズに結合したファージを１０ ｍｉｎ溶離させ、溶離した産物を予めブロッキングされたＥＰチューブに移し、３００ μＬのＴｒｉｓ－ＨＣｌを入れて中和した。
７．１０ μＬのアウトプット産物を取って９０ μＬの２ＹＴ培地に投入し、１００とし、順に１０－２まで１０倍希釈し、１０１、１００、１０－１、１０－２の四段の勾配の２０ μＬの希釈されたサンプルを取って２００ μＬの予め用意されたＯＤ６００が０．５のＥＲ２７３８に投入し（１０１はそのまま未希釈の産物２０μＬをＥＲ２７３８に入れ）、均一に混合した後、３７℃の水浴鍋に置き、１０ ｍｉｎ静置し、ＬＢ－ＡＭＰ固体プレートに１０８ μＬずつ塗布し、３７℃で一晩置き、翌日に集落を数えて力価を確定した。
８．力価の計算：集落数が３０－３００の間のプレートを選び、二枚のプレートの平均値を取り、集落数に希釈倍数をかけ、さらに溶離体積をかけた。
Ｆｃタンパク質をコーティングし、構築されたファージディスプレイライブラリーを６回除去し、さらに予めビオチン－ＰＤＬ１を結合させたストレプトアビジン磁気ビーズとインキュベートし、ＰＤＬ１が特異的に結合したファージを濃縮し、四回濃縮した。毎回のインプットとアウトプットを統計し、そして毎回の濃縮因子を計算した。
６．６００ μＬの１×ＴＥＡで磁気ビーズに結合したファージを１０ ｍｉｎ溶離させ、溶離した産物を予めブロッキングされたＥＰチューブに移し、３００ μＬのＴｒｉｓ－ＨＣｌを入れて中和した。
７．１０ μＬのアウトプット産物を取って９０ μＬの２ＹＴ培地に投入し、１００とし、順に１０－２まで１０倍希釈し、１０１、１００、１０－１、１０－２の四段の勾配の２０ μＬの希釈されたサンプルを取って２００ μＬの予め用意されたＯＤ６００が０．５のＥＲ２７３８に投入し（１０１はそのまま未希釈の産物２０μＬをＥＲ２７３８に入れ）、均一に混合した後、３７℃の水浴鍋に置き、１０ ｍｉｎ静置し、ＬＢ－ＡＭＰ固体プレートに１０８ μＬずつ塗布し、３７℃で一晩置き、翌日に集落を数えて力価を確定した。
８．力価の計算：集落数が３０－３００の間のプレートを選び、二枚のプレートの平均値を取り、集落数に希釈倍数をかけ、さらに溶離体積をかけた。
Ｆｃタンパク質をコーティングし、構築されたファージディスプレイライブラリーを６回除去し、さらに予めビオチン－ＰＤＬ１を結合させたストレプトアビジン磁気ビーズとインキュベートし、ＰＤＬ１が特異的に結合したファージを濃縮し、四回濃縮した。毎回のインプットとアウトプットを統計し、そして毎回の濃縮因子を計算した。
表１０に示された計算結果から、濃縮因子（インプット／アウトプット）では、ファージライブラリーは明らかな濃縮があったことが示され、ＰＤＬ１が特異的に結合したファージライブラリーの構築に成功したことがわかる。
実施例８．ファージディスプレイライブラリーの細胞に基づくパンニング
標的タンパク質を過剰発現する組み換え細胞株を使用し、ファージライブラリーを順に空白細胞および標的タンパク質を過剰発現する細胞とインキュベートした後、数回の洗浄によって非特異的に結合したファージを除去した後、グリシンまたはＴＥＡで細胞の表面に結合した組み換えファージを溶離させ、そして増幅した。３－４回のスクリーニングを経た後、単一クローンを取ってＥＬＩＳＡ検出を行った。
１．１日前に１％ ＰＢＳＡで１．５ ｍＬのＥＰチューブをブロッキングし、４℃で一晩置いた。
２．標的細胞およびコントロール細胞をそれぞれ１×１０７取り、ＰＢＳで三回洗浄し、１０ ｍＬの１％ ＰＢＳＡで再懸濁させ、脱色シェーカーにおいて室温で１ｈ低速ブロッキングした。
３．コントロール細胞に１×１０１１のファージを投入し、１ｈインキュベートし、標的細胞は続いてブロッキングした。
標的タンパク質を過剰発現する組み換え細胞株を使用し、ファージライブラリーを順に空白細胞および標的タンパク質を過剰発現する細胞とインキュベートした後、数回の洗浄によって非特異的に結合したファージを除去した後、グリシンまたはＴＥＡで細胞の表面に結合した組み換えファージを溶離させ、そして増幅した。３－４回のスクリーニングを経た後、単一クローンを取ってＥＬＩＳＡ検出を行った。
１．１日前に１％ ＰＢＳＡで１．５ ｍＬのＥＰチューブをブロッキングし、４℃で一晩置いた。
２．標的細胞およびコントロール細胞をそれぞれ１×１０７取り、ＰＢＳで三回洗浄し、１０ ｍＬの１％ ＰＢＳＡで再懸濁させ、脱色シェーカーにおいて室温で１ｈ低速ブロッキングした。
３．コントロール細胞に１×１０１１のファージを投入し、１ｈインキュベートし、標的細胞は続いてブロッキングした。
４．インキュベート終了後の細胞を遠心機に置き、１０００ｇで５ ｍｉｎ遠心し、標的細胞上清（１％ＰＢＳＡ）を捨て、そしてコントロール細胞の上清を慎重に吸い取り、標的細胞管に入れ、再懸濁させた後、シェーカーに置き、１ｈ低速インキュベートした。
５．標的細胞を遠心機に置き、１０００ｇで５ ｍｉｎ遠心し（同時にＰＢＳで１日前にブロッキングした１．５ ｍＬのＥＰチューブを三回洗浄し）、標的細胞上清を捨て、４ｍｌのＰＢＳを入れて再懸濁させ、分けてブロッキングした１．５ ｍＬのＥＰチューブに入れ、ＰＢＳで遠心して５回洗浄し、さらに細胞を別の四本のＥＰチューブに打ちし、続いて５回洗浄した後、細胞を同一のＥＰチューブに移した。
６．２００ μＬのＰＢＳで細胞を再懸濁させた後、２００ μＬの２×ＴＥＡを入れて迅速に吹いて吸い、溶液の粘稠がなくなるまで繰り返し、さらに２００ μＬのＴｒｉｓ－ＨＣｌを入れて中和し、産物を得た。
７．アウトライブラリーの力価を測定し、実施例７の溶液パンニングの方案における工程７、８と同様である。
５．標的細胞を遠心機に置き、１０００ｇで５ ｍｉｎ遠心し（同時にＰＢＳで１日前にブロッキングした１．５ ｍＬのＥＰチューブを三回洗浄し）、標的細胞上清を捨て、４ｍｌのＰＢＳを入れて再懸濁させ、分けてブロッキングした１．５ ｍＬのＥＰチューブに入れ、ＰＢＳで遠心して５回洗浄し、さらに細胞を別の四本のＥＰチューブに打ちし、続いて５回洗浄した後、細胞を同一のＥＰチューブに移した。
６．２００ μＬのＰＢＳで細胞を再懸濁させた後、２００ μＬの２×ＴＥＡを入れて迅速に吹いて吸い、溶液の粘稠がなくなるまで繰り返し、さらに２００ μＬのＴｒｉｓ－ＨＣｌを入れて中和し、産物を得た。
７．アウトライブラリーの力価を測定し、実施例７の溶液パンニングの方案における工程７、８と同様である。
ファージライブラリーのスクリーニングは実験条件によって実施例７または実施例８における方法を選んで行うことができるが、本発明では、好適に実施例７における方法を使用した。
実施例９．ファージＥＬＩＳＡ
１．２ＹＴ－Ａｍｐ培地を分けて９６ウェルディープウェルプレートに入れ、５００ μＬ／ウェルで、アウトプットプレートにおける単一クローンを取り、３７℃、２２５ ｒｐｍでＯＤ６００が０．５になるまで培養した。最後の二つのウェルのＨ１１とＨ１２はクローンを入れず、培地のみを入れ、ブランク対照とした。
２．同時にＣＢＳで抗原をＥＬＩＳＡプレートにコーティングし、濃度が１ μｇ／ｍＬで、１００ μＬ／ウェルで、３７℃で２ｈコーティングした。
３．別途に一枚の９６ウェルディープウェルプレートを取り、分けて２ＹＴ－Ａ培地を５００ μＬ／ウェル入れ、マルチチャンネルピペットで順にＯＤ６００が０．５の菌液を１０ μＬ吸い取って新しい９６ウェルプレートに入れ、３７℃、２２５ ｒｐｍで一晩培養し、これをシークエンシング用サンプル菌液とした。
４．ＯＤ６００が０．５の菌液に、Ｍ１３ＫＯ７を入れ、均一に混合した後、３７℃で１５ ｍｉｎ静置した。
５．Ｍ１３ＫＯ７体積＝１０ × 体積 × ＯＤ６００ × ５ × １０８ ／ Ｍ１３ＫＯ７力価。
１．２ＹＴ－Ａｍｐ培地を分けて９６ウェルディープウェルプレートに入れ、５００ μＬ／ウェルで、アウトプットプレートにおける単一クローンを取り、３７℃、２２５ ｒｐｍでＯＤ６００が０．５になるまで培養した。最後の二つのウェルのＨ１１とＨ１２はクローンを入れず、培地のみを入れ、ブランク対照とした。
２．同時にＣＢＳで抗原をＥＬＩＳＡプレートにコーティングし、濃度が１ μｇ／ｍＬで、１００ μＬ／ウェルで、３７℃で２ｈコーティングした。
３．別途に一枚の９６ウェルディープウェルプレートを取り、分けて２ＹＴ－Ａ培地を５００ μＬ／ウェル入れ、マルチチャンネルピペットで順にＯＤ６００が０．５の菌液を１０ μＬ吸い取って新しい９６ウェルプレートに入れ、３７℃、２２５ ｒｐｍで一晩培養し、これをシークエンシング用サンプル菌液とした。
４．ＯＤ６００が０．５の菌液に、Ｍ１３ＫＯ７を入れ、均一に混合した後、３７℃で１５ ｍｉｎ静置した。
５．Ｍ１３ＫＯ７体積＝１０ × 体積 × ＯＤ６００ × ５ × １０８ ／ Ｍ１３ＫＯ７力価。
６．侵襲終了後の菌液をシェーカーに置き、３７℃、２２５ｒｐｍで４５ ｍｉｎ培養した。
７．菌液を遠心機に置き、４０００ ｒｐｍで１０ ｍｉｎ遠心し、上清を捨て、２ＹＴ－ＡＫ培地で再懸濁させ、８００μＬ／ウェルで、シェーカーに置き、３０℃、２１０ ｒｐｍで一晩培養した。
８．同時にＥＬＩＳＡプレートから抗原を捨て、ＰＢＳＴ洗液で三回洗浄した後、３％ ＭＰＢＳで２５０ μＬ／ウェルでブロッキングし、４℃で一晩置いた。そして余分に一枚のブランクプレートをブロッキングし、ブランクとした。
９．翌日に、９６ウェルディープウェルプレートを遠心機に置き、４０００ ｒｐｍで１０ ｍｉｎ遠心した。ＥＬＩＳＡプレートにおけるミルクを捨て、２００ μＬのＰＢＳＴで４回洗浄した。各ウェルにまず５０ μＬのＰＢＳＴを入れ、さらにそれぞれ相応して５０ μＬの遠心後のファージ上清を入れ、４℃で１ｈインキュベートした。上清を捨て、そしてＰＢＳＴで５回洗浄した。ＰＢＳＴでＨＲＰ－抗Ｍ１３二次抗体を希釈し、１００ μＬ／ウェルで、４℃で４５ ｍｉｎインキュベートした後、二次抗体を洗浄して除去し、ＰＢＳＴで５回洗浄し、ＴＭＢで常温で１０ ｍｉｎ呈色させ、塩酸で停止させ、数値を読み取り、Ｓ／Ｎ比が大きい値のクローンを選び、保存用の菌液を測定に供した。
７．菌液を遠心機に置き、４０００ ｒｐｍで１０ ｍｉｎ遠心し、上清を捨て、２ＹＴ－ＡＫ培地で再懸濁させ、８００μＬ／ウェルで、シェーカーに置き、３０℃、２１０ ｒｐｍで一晩培養した。
８．同時にＥＬＩＳＡプレートから抗原を捨て、ＰＢＳＴ洗液で三回洗浄した後、３％ ＭＰＢＳで２５０ μＬ／ウェルでブロッキングし、４℃で一晩置いた。そして余分に一枚のブランクプレートをブロッキングし、ブランクとした。
９．翌日に、９６ウェルディープウェルプレートを遠心機に置き、４０００ ｒｐｍで１０ ｍｉｎ遠心した。ＥＬＩＳＡプレートにおけるミルクを捨て、２００ μＬのＰＢＳＴで４回洗浄した。各ウェルにまず５０ μＬのＰＢＳＴを入れ、さらにそれぞれ相応して５０ μＬの遠心後のファージ上清を入れ、４℃で１ｈインキュベートした。上清を捨て、そしてＰＢＳＴで５回洗浄した。ＰＢＳＴでＨＲＰ－抗Ｍ１３二次抗体を希釈し、１００ μＬ／ウェルで、４℃で４５ ｍｉｎインキュベートした後、二次抗体を洗浄して除去し、ＰＢＳＴで５回洗浄し、ＴＭＢで常温で１０ ｍｉｎ呈色させ、塩酸で停止させ、数値を読み取り、Ｓ／Ｎ比が大きい値のクローンを選び、保存用の菌液を測定に供した。
実施例７における第二回および第三回のアウトプット産物を選んでファージＥＬＩＳＡ検出を行った。それぞれストレプトアビジン、ビオチン－ＰＤＬ１－ＦｃおよびＦｃタンパク質をコーティングし、組み換えファージ上清を取ってＥＬＩＳＡ検出を行い、対照群はそのままブロッキングしたウェルプレートであった。
図５－９に示すように、第二回および第三回のアウトプット産物のＥＬＩＳＡ検出の結果では、ここで、赤色の表示は同時にＰＤＬ１抗原およびＦｃの両方と結合するクローンで、青色はＰＤＬ１標的抗原のみと結合し、Ｆｃと結合しないクローンを表し、緑色はＰＤＬ１標的抗原のみと結合し、Ｆｃと結合せず、そしてＰＤＬ１標的抗原との結合が比較的に強いクローン（すなわち、シークエンシングに供するクローン）を表す。中からＳ／Ｎ比が４以上で、かつＦｃと結合しないクローンを選んでシークエンシングし、抗体の配列を分析した。
分析したところ、ストレプトアビジン磁気ビーズおよびビオチン化抗原で溶液パンニングした結果、計６本の異なる抗体配列、すなわち、本発明の１７－Ａ０６、１７－Ｃ１２、１７－Ａ０１、１７－Ｇ０６、２３－Ｇ３、２９－Ｈ９を得た。
標的クローンの菌液を取ってＰＣＲ増幅し、ＶＨＨのＮ末端にシグナルペプチドを付加し、Ｃ末端にＩｇＧ１－Ｆｃを付加し、ＰＣＲ産物をＨＥＫ２９３細胞に一過性形質移入し、発現された抗体上清を取ってＦＡＣＳ検出を行った。
実施例１０．オーバーラップＰＣＲ産物の増幅、一過性形質移入および検出
１．第一回のＰＣＲ：ＣＭＶ、ＶＨＨおよびＦｃの増幅
（１） 表１１のようなＰＣＲ反応系[５０ μＬ系／反応]を調製した（ＣＭＶおよびＦｃ断片は複数製造してもよい）（ＣＭＶ断片増幅プライマー：ＣＭＶ－ＦおよびＰＣｏｍ－Ｒ１；ＶＨＨ断片増幅プライマー：ＰＣｏｍ－Ｆ１およびＰＣｏｍ－Ｒ２；Ｆｃ断片増幅プライマー：ＰＣｏｍ－Ｆ２およびＰＧＫ－Ｒ）。
ここで、ＰＣＲ反応のプログラムは以下の通りである：
９５℃ １０ 分
９５℃ １５秒
５６℃ ３０秒 ２５サイクル
６８℃ ６０秒
６８℃ １０ 分
（２） ５０ μＬのＰＣＲ産物を取り、１／１０体積の１０×仕込み緩衝液を入れ、１％のアガロースゲルで電気泳動による分析を行ったところ、ＣＭＶおよびＦｃのバンドの大きさが７５０ ｂｐ程度で、ＶＨＨのバンドの大きさが５６０ ｂｐ程度であった。
（３） ゲルから標的バンドを切り取り、そしてＰＣＲ産物を精製し、ＮａｎｏＤｒｏｐで濃度を測定した（濃度が高すぎると、希釈してから後続の反応を行う）。
１．第一回のＰＣＲ：ＣＭＶ、ＶＨＨおよびＦｃの増幅
（１） 表１１のようなＰＣＲ反応系[５０ μＬ系／反応]を調製した（ＣＭＶおよびＦｃ断片は複数製造してもよい）（ＣＭＶ断片増幅プライマー：ＣＭＶ－ＦおよびＰＣｏｍ－Ｒ１；ＶＨＨ断片増幅プライマー：ＰＣｏｍ－Ｆ１およびＰＣｏｍ－Ｒ２；Ｆｃ断片増幅プライマー：ＰＣｏｍ－Ｆ２およびＰＧＫ－Ｒ）。
９５℃ １０ 分
９５℃ １５秒
５６℃ ３０秒 ２５サイクル
６８℃ ６０秒
６８℃ １０ 分
（２） ５０ μＬのＰＣＲ産物を取り、１／１０体積の１０×仕込み緩衝液を入れ、１％のアガロースゲルで電気泳動による分析を行ったところ、ＣＭＶおよびＦｃのバンドの大きさが７５０ ｂｐ程度で、ＶＨＨのバンドの大きさが５６０ ｂｐ程度であった。
（３） ゲルから標的バンドを切り取り、そしてＰＣＲ産物を精製し、ＮａｎｏＤｒｏｐで濃度を測定した（濃度が高すぎると、希釈してから後続の反応を行う）。
２．第二回のＰＣＲ：オーバーラップ発現ＰＣＲによるＣＭＶ、ＶＨＨおよびＦｃの連結
（１） 表１２のようなＰＣＲ反応系を調製した。
ここで、ＰＣＲ反応のプログラムは以下の通りである：
９５℃ １０ 分
９５℃ １５秒
６０℃ ３０秒 １５サイクル
６８℃ １２０秒
（１） 表１２のようなＰＣＲ反応系を調製した。
９５℃ １０ 分
９５℃ １５秒
６０℃ ３０秒 １５サイクル
６８℃ １２０秒
（２） ＰＣＲ反応プログラム後、プライマーＣＭＶ－ＦおよびＰＧＫ－Ｒをそれぞれ２ μＬ入れ、さらに次のＰＣＲ反応プログラムを行った。
次のＰＣＲ反応のプログラムは以下の通りである：
９５℃ １５秒
６０℃ ３０秒 ２０サイクル
６８℃ １２０秒
６８℃ １０ 分
（３） ＴａｋａＲａのＤＮＡ断片回収キットによってオーバーラップＰＣＲ産物を精製し、そしてＮａｎｏＤｒｏｐで濃度を測定し、少なくとも１０ μｇのＰＣＲ産物が必要である。後続の細胞形質移入の検証に使用した。
（４） 形質移入の工程は真核発現ベクターの形質移入と同様である。
次のＰＣＲ反応のプログラムは以下の通りである：
９５℃ １５秒
６０℃ ３０秒 ２０サイクル
６８℃ １２０秒
６８℃ １０ 分
（３） ＴａｋａＲａのＤＮＡ断片回収キットによってオーバーラップＰＣＲ産物を精製し、そしてＮａｎｏＤｒｏｐで濃度を測定し、少なくとも１０ μｇのＰＣＲ産物が必要である。後続の細胞形質移入の検証に使用した。
（４） 形質移入の工程は真核発現ベクターの形質移入と同様である。
実施例１１．単一ドメイン抗体の一過性形質移入・発現
１．冷蔵庫からＬＶＴｒａｎｓｍ形質移入試薬および抗体発現ベクターｐｃＤＮＡ３．４－ｈＩｇＧ１－Ｆｃ２またはオーバーラップＰＣＲ産物を取り出し、室温で解凍した後、ピペットで上下に吹いてかき混ぜて完全に均一に混合した。ＰＢＳ緩衝液を取り出し、室温に温めた。５００ μＬのＰＢＳを２４ウェルプレートの一つのウェルに取り、４ μｇのｐｃＤＮＡ３．４－ｈＩｇＧ１－Ｆｃ２を入れ、ピペットで上下に吹いてかき混ぜて完全に均一に混合した後、１２ μＬのＬＶＴｒａｎｓｍを入れ、すぐにピペットで上下に吹いてかき混ぜて完全に均一に混合し、室温において１０分静置した。ここの混合物をＤＮＡ／ＬＶＴｒａｎｓｍ複合体を呼ぶ。
１．冷蔵庫からＬＶＴｒａｎｓｍ形質移入試薬および抗体発現ベクターｐｃＤＮＡ３．４－ｈＩｇＧ１－Ｆｃ２またはオーバーラップＰＣＲ産物を取り出し、室温で解凍した後、ピペットで上下に吹いてかき混ぜて完全に均一に混合した。ＰＢＳ緩衝液を取り出し、室温に温めた。５００ μＬのＰＢＳを２４ウェルプレートの一つのウェルに取り、４ μｇのｐｃＤＮＡ３．４－ｈＩｇＧ１－Ｆｃ２を入れ、ピペットで上下に吹いてかき混ぜて完全に均一に混合した後、１２ μＬのＬＶＴｒａｎｓｍを入れ、すぐにピペットで上下に吹いてかき混ぜて完全に均一に混合し、室温において１０分静置した。ここの混合物をＤＮＡ／ＬＶＴｒａｎｓｍ複合体を呼ぶ。
２．上記５３２ μＬのＤＮＡ／ＬＶＴｒａｎｓｍ複合体を１．５ ｍＬの２９３Ｆ細胞に入れ、軽く振とうして十分に均一に混合した。細胞を３７℃、５％ ＣＯ２のインキュベーターに置き、１３０ ＲＰＭで６～８時間培養した後、１．５ ｍＬの新鮮な２９３培地を入れ、細胞をインキュベーターに戻して続いて培養した。
３．連続３日培養した後、遠心して培地上清を収集し、０．４５ μｍのろ膜でろ過し、ろ液を無菌遠心管に移し、後続のフローサイトメトリーおよびＥＬＩＳＡ検出を行った。
３．連続３日培養した後、遠心して培地上清を収集し、０．４５ μｍのろ膜でろ過し、ろ液を無菌遠心管に移し、後続のフローサイトメトリーおよびＥＬＩＳＡ検出を行った。
実施例１２．ＶＨＨ真核発現ベクターの構築
実施例９におけるファージ単一クローンのＥＬＩＳＡ検出の結果により、陽性クローンを選んでシークエンシングし、ＶＨＨ抗体の配列を得た。得られたＶＨＨ抗体の配列を分析してそれぞれ遺伝子合成を行い、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃと直列に連結して発現ベクターｐｃＤＮＡ３．４－ｈＩｇＧ１－Ｆｃ２にサブクローニングした。ベクターはシークエンシングによって正確だと検証されると、Ｑｉａｇｅｎプラスミドマキシキットによって内毒素除去プラスミドを製造して使用に備えた。
実施例９におけるファージ単一クローンのＥＬＩＳＡ検出の結果により、陽性クローンを選んでシークエンシングし、ＶＨＨ抗体の配列を得た。得られたＶＨＨ抗体の配列を分析してそれぞれ遺伝子合成を行い、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃと直列に連結して発現ベクターｐｃＤＮＡ３．４－ｈＩｇＧ１－Ｆｃ２にサブクローニングした。ベクターはシークエンシングによって正確だと検証されると、Ｑｉａｇｅｎプラスミドマキシキットによって内毒素除去プラスミドを製造して使用に備えた。
実施例１３．フローサイトメトリーによる組み換え抗体と標的タンパク質の結合の検出
１．液体窒素からＣＨＯ－Ｋ１およびＣＨＯ－Ｋ１－ＰＤＬ１細胞株を再生し、細胞の状態を対数生長期に調整した。
２．二種類の細胞をそれぞれいくつかに分け、細胞数は５×１０５個細胞ずつであった。
３．発現された抗体をそれぞれ標的細胞ＣＨＯ－Ｋ１およびＣＨＯ－Ｋ１－ＰＤＬ１とインキュベートし、十分に均一に混合した後、室温で１時間インキュベートした。
４．８００×ｇ、室温で５分遠心し、抗体を含有する上清を捨て、ＰＢＳで細胞を３回洗浄した。
１．液体窒素からＣＨＯ－Ｋ１およびＣＨＯ－Ｋ１－ＰＤＬ１細胞株を再生し、細胞の状態を対数生長期に調整した。
２．二種類の細胞をそれぞれいくつかに分け、細胞数は５×１０５個細胞ずつであった。
３．発現された抗体をそれぞれ標的細胞ＣＨＯ－Ｋ１およびＣＨＯ－Ｋ１－ＰＤＬ１とインキュベートし、十分に均一に混合した後、室温で１時間インキュベートした。
４．８００×ｇ、室温で５分遠心し、抗体を含有する上清を捨て、ＰＢＳで細胞を３回洗浄した。
５．１ μＬのＰＥまたはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８で標識された抗ヒトＩｇＧを入れ、十分に均一に混合した後、室温で光を避けて３０分インキュベートした。
６．８００×ｇ、室温で５分遠心し、二次抗体を含有する上清を捨て、ＰＢＳで細胞を３回洗浄した。
７．５００ μＬのＰＢＳで細胞を再懸濁させ、フローサイトメトリーによる分析を行った。
６．８００×ｇ、室温で５分遠心し、二次抗体を含有する上清を捨て、ＰＢＳで細胞を３回洗浄した。
７．５００ μＬのＰＢＳで細胞を再懸濁させ、フローサイトメトリーによる分析を行った。
候補抗体の配列のＮ末端およびＣ末端にそれぞれ実施例１０のオーバーラップＰＣＲによってＣＭＶプロモーター、シグナルペプチドおよびヒトＩｇＧ１ Ｆｃタグを付加し、実施例１１のようにＰＣＲ産物を精製して２９３細胞に一過性形質移入し、発現された抗体と取ってフローサイトメトリーによる検出を行った。
図１０、図１１に示すように、ＦＡＣＳによる検出の結果、１７－Ａ０６，１７－Ｃ１２，１７－Ａ０１，１７－Ｇ０６および２３－Ｇ３、２９－Ｈ９はＣＨＯ－Ｋ１／ＰＤＬ１組み換え細胞株と特異的に結合することができたが、ＣＨＯ－Ｋ１とは結合しなかったか、ほとんど結合しなかった。
当該配列を合成し、そして発現ベクターｐｃＤＮＡ３．４－ｈＩｇＧ１－Ｆｃ２に挿入し、候補抗体の発現および精製を行った。
当該配列を合成し、そして発現ベクターｐｃＤＮＡ３．４－ｈＩｇＧ１－Ｆｃ２に挿入し、候補抗体の発現および精製を行った。
実施例１４．抗体の発現・精製
１．冷蔵庫からＬＶＴｒａｎｓｍ形質移入試薬および一本鎖抗体発現ベクターを取り出し、室温で解凍した後、ピペットで上下に吹いてかき混ぜて完全に均一に混合した。ＰＢＳまたはＨＢＳＳ緩衝液を取り出し、室温に温めた。２ ｍＬのＰＢＳを６ウェルプレートの一つのウェルに取り、それぞれ１３０ μｇのｐｃＤＮＡ３．４－ｈＩｇＧ１－Ｆｃ２を入れ、ピペットで上下に吹いてかき混ぜて完全に均一に混合した後、４００ μＬのＬＶＴｒａｎｓｍを入れ、すぐにピペットで上下に吹いてかき混ぜて完全に均一に混合し、室温において１０分静置した。
２．上記ＤＮＡ／ＬＶＴｒａｎｓｍ複合体を５０ ｍＬの２９３Ｆ細胞に入れ、軽く振とうして十分に均一に混合した。細胞を３７℃、５％ ＣＯ２のインキュベーターに置き、１３０ＲＰＭで６～８時間培養した後、５０ ｍＬの新鮮な２９３培地を入れ、細胞をインキュベーターに戻して続いて培養した。
１．冷蔵庫からＬＶＴｒａｎｓｍ形質移入試薬および一本鎖抗体発現ベクターを取り出し、室温で解凍した後、ピペットで上下に吹いてかき混ぜて完全に均一に混合した。ＰＢＳまたはＨＢＳＳ緩衝液を取り出し、室温に温めた。２ ｍＬのＰＢＳを６ウェルプレートの一つのウェルに取り、それぞれ１３０ μｇのｐｃＤＮＡ３．４－ｈＩｇＧ１－Ｆｃ２を入れ、ピペットで上下に吹いてかき混ぜて完全に均一に混合した後、４００ μＬのＬＶＴｒａｎｓｍを入れ、すぐにピペットで上下に吹いてかき混ぜて完全に均一に混合し、室温において１０分静置した。
２．上記ＤＮＡ／ＬＶＴｒａｎｓｍ複合体を５０ ｍＬの２９３Ｆ細胞に入れ、軽く振とうして十分に均一に混合した。細胞を３７℃、５％ ＣＯ２のインキュベーターに置き、１３０ＲＰＭで６～８時間培養した後、５０ ｍＬの新鮮な２９３培地を入れ、細胞をインキュベーターに戻して続いて培養した。
３．連続７日培養した後、遠心して培地上清を収集し、０．４５ μｍのろ膜でろ過し、ろ液を無菌遠心管に移し、プロテインＡカラムで抗体を精製した。
候補のＰＤＬ１抗体（すなわち、１７－Ａ０６、１７－Ｃ１２、１７－Ａ０１、１７－Ｇ０６、２３－Ｇ３、２９－Ｈ９）の発現ベクターを２９３Ｆ細胞に一過性形質移入し、形質移入上清を収集し、プロテインＡで候補抗体を精製した。
候補抗体を１０μｇ／ｍＬから、４段の勾配に５倍希釈し、フローサイトメーターによって精製抗体のＰＤＬ１を過剰発現する組み換え細胞株ＣＨＯ－Ｋ１／ＰＤＬ１との結合の様子を検出した。
図１２－１４に示すフローサイトメトリーの結果から、候補抗体の濃度の低下につれ、候補抗体と過剰発現細胞株の結合が変化したことが示され、精製された１７－Ａ０６、１７－Ｃ１２、１７－Ａ０１、１７－Ｇ０６および２３－Ｇ３、２９－Ｈ９抗体はいずれもＰＤＬ１過剰発現細胞株と特異的に結合することができることがわかる。
候補のＰＤＬ１抗体（すなわち、１７－Ａ０６、１７－Ｃ１２、１７－Ａ０１、１７－Ｇ０６、２３－Ｇ３、２９－Ｈ９）の発現ベクターを２９３Ｆ細胞に一過性形質移入し、形質移入上清を収集し、プロテインＡで候補抗体を精製した。
候補抗体を１０μｇ／ｍＬから、４段の勾配に５倍希釈し、フローサイトメーターによって精製抗体のＰＤＬ１を過剰発現する組み換え細胞株ＣＨＯ－Ｋ１／ＰＤＬ１との結合の様子を検出した。
図１２－１４に示すフローサイトメトリーの結果から、候補抗体の濃度の低下につれ、候補抗体と過剰発現細胞株の結合が変化したことが示され、精製された１７－Ａ０６、１７－Ｃ１２、１７－Ａ０１、１７－Ｇ０６および２３－Ｇ３、２９－Ｈ９抗体はいずれもＰＤＬ１過剰発現細胞株と特異的に結合することができることがわかる。
実施例１５．ＰＤ－１－ＰＤＬ１遮断活性の検出
Ｊｕｒｋａｔ－ＰＤ－１－ＮＦＡＴ－Ｌｕｃレポーター遺伝子細胞株およびａＡＰＣＣＨＯ－ＰＤＬ１細胞を再生させ、連続的に対数生長期まで継代培養し、９６ウェルプレートにおいて、各ウェルに２×１０４個のエフェクター細胞Ｊｕｒｋａｔ－ＰＤ－１－ＮＦＡＴ－Ｌｕｃを接種し、１：１で標的細胞ａＡＰＣＣＨＯ－ＰＤＬ１を入れた。相応するウェルに勾配希釈された検出抗体（陽性抗体：ニボルマブ（Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）；被験抗体）を入れ、３倍勾配で抗体を希釈し、連続的に９段の勾配に希釈し、最終濃度が順に３０ μｇ／ｍＬ、１０ μｇ／ｍＬ、３．３３３ μｇ／ｍＬ、１．１１１ μｇ／ｍＬ、０．３７０４ μｇ／ｍＬ、０．１２３５ μｇ／ｍＬ、０．０４１１５ μｇ／ｍＬ、０．０１３７２ μｇ／ｍＬ、０．００４５７２ μｇ／ｍＬで、さらに相応するウェルに入れた。１８ｈ共培養した後、各ウェルに２５ μＬのＯｎｅ－Ｇｌｏ試薬を入れ、Ｔｅｃａｎ Ｍ１０００ｐｒｏマクロプレートリーダーでウェルにおけるルシフェラーゼ活性数値を検出した。
Ｊｕｒｋａｔ－ＰＤ－１－ＮＦＡＴ－Ｌｕｃレポーター遺伝子細胞株およびａＡＰＣＣＨＯ－ＰＤＬ１細胞を再生させ、連続的に対数生長期まで継代培養し、９６ウェルプレートにおいて、各ウェルに２×１０４個のエフェクター細胞Ｊｕｒｋａｔ－ＰＤ－１－ＮＦＡＴ－Ｌｕｃを接種し、１：１で標的細胞ａＡＰＣＣＨＯ－ＰＤＬ１を入れた。相応するウェルに勾配希釈された検出抗体（陽性抗体：ニボルマブ（Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）；被験抗体）を入れ、３倍勾配で抗体を希釈し、連続的に９段の勾配に希釈し、最終濃度が順に３０ μｇ／ｍＬ、１０ μｇ／ｍＬ、３．３３３ μｇ／ｍＬ、１．１１１ μｇ／ｍＬ、０．３７０４ μｇ／ｍＬ、０．１２３５ μｇ／ｍＬ、０．０４１１５ μｇ／ｍＬ、０．０１３７２ μｇ／ｍＬ、０．００４５７２ μｇ／ｍＬで、さらに相応するウェルに入れた。１８ｈ共培養した後、各ウェルに２５ μＬのＯｎｅ－Ｇｌｏ試薬を入れ、Ｔｅｃａｎ Ｍ１０００ｐｒｏマクロプレートリーダーでウェルにおけるルシフェラーゼ活性数値を検出した。
図１５に示すように、陽性対照ニボルマブはＰＤ－１／ＰＤＬ１の相互作用を遮断することができ、ＥＣ５０は０．３２１７ μｇ／ｍＬであった。被験抗体のうち、ＰＤＬ１単一ドメイン抗体１７－Ａ０６、２３－Ｇ３、２９－Ｈ９はいずれもＰＤ－１／ＰＤＬ１の相互作用を遮断することができたが、残りの三つの後方抗体は遮断機能を有さない。しかし、ＰＤＬ１候補抗体１７－Ａ０６、２３－Ｇ３、２９－Ｈ９のＥＣ５０は陽性対照抗体ニボルマブよりも高かったが、単一ドメイン抗体が小さく、エピトープが占める空間が限られたからと推測され、遮断機能を有する３つの抗体をランダムに組み合わせて二価抗体を構築してさらに遮断活性の検出を行った。
候補の３つの抗体をランダムに組み合わせて二価抗体を構築し、二価抗体の発現様態は１７－Ａ０６－Ｇ４Ｓ－２３－Ｇ３、１７－Ａ０６－Ｇ４Ｓ－２９－Ｈ９、２３－Ｇ３－Ｇ４Ｓ－２９－Ｈ９で、抗体を精製した後、Ｊｕｒｋａｔ－ＰＤ－１－ＮＦＡＴ－Ｌｕｃレポーター遺伝子細胞株およびａＡＰＣＣＨＯ－ＰＤＬ１細胞で二価抗体に対してＰＤ－１－ＰＤＬ１遮断活性の検出を行った。
図１６に示すように、陽性対照であるニボルマブ（ＰＤ－１抗体、ＮＩＶ２０）およびアテゾリズマブ（ＰＤＬ１抗体、Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）はＰＤ－１／ＰＤＬ１の相互作用を遮断することができ、ＥＣ５０は相当した。被験二価ＰＤＬ１抗体はいずれもＰＤ－１／ＰＤＬ１の相互作用を遮断することができ、二価抗体の遮断能力は陽性対照と一致する。
実施例１６．組み換え抗体の親和力の検出
ＰＤＬ１候補抗体（Ｆｃタグ）を５ μｇ／ｍＬでプロテインＡプローブに結合させ、勾配希釈されたＰＤＬ１－Ｈｉｓを移動相とし、最終濃度が順に２．６ μｇ／ｍＬ、１．３ μｇ／ｍＬ、０．６５ μｇ／ｍＬ、０．３２５ μｇ／ｍＬ、０．１６２５ μｇ／ｍＬで、ＯＣＴＥＴ Ｒ２で親和力の検出を行った。
ＰＤＬ１候補抗体（Ｆｃタグ）を５ μｇ／ｍＬでプロテインＡプローブに結合させ、勾配希釈されたＰＤＬ１－Ｈｉｓを移動相とし、最終濃度が順に２．６ μｇ／ｍＬ、１．３ μｇ／ｍＬ、０．６５ μｇ／ｍＬ、０．３２５ μｇ／ｍＬ、０．１６２５ μｇ／ｍＬで、ＯＣＴＥＴ Ｒ２で親和力の検出を行った。
ＯＣＴＥＴ Ｒ２で３つの二価ＰＤＬ１抗体に対して親和力の検出を行ったが、親和力検出の結果を表１３に示す。
検出結果から、三つの二価抗体はいずれも親和力が高く、高い順でそれぞれ４．１９８×１０－９ Ｍ、２．７２９×１０－９ Ｍ、１．９１５×１０－９ Ｍであったことが示された。
各文献がそれぞれ単独に引用されるように、本発明に係るすべての文献は本出願で参考として引用する。また、本発明の上記の内容を読み終わった後、当業者が本発明を各種の変動や修正をすることができるが、それらの等価の形態のものは本発明の請求の範囲に含まれることが理解されるはずである。
Claims (12)
- ＰＤＬ１に対するナノ抗体であって、前記ＰＤＬ１に対するナノ抗体のＶＨＨ鎖の相補性決定領域ＣＤＲが以下の群から選ばれる一つまたは複数であることを特徴とするナノ抗体：
（１） 配列番号７で示されるＣＤＲ１、配列番号８で示されるＣＤＲ２、および配列番号 ９で示されるＣＤＲ３；
（２） 配列番号７で示されるＣＤＲ１、配列番号１６で示されるＣＤＲ２、および配列番号 １７で示されるＣＤＲ３；
（３） 配列番号１８で示されるＣＤＲ１、配列番号１９で示されるＣＤＲ２、および配列番号 ２０で示されるＣＤＲ３。 - 前記ＰＤＬ１に対するナノ抗体のＶＨＨ鎖は、さらに、フレームワーク領域ＦＲを含み、前記のフレームワーク領域ＦＲは以下の群から選ばれる一つまたは複数であることを特徴とする請求項１に記載のＰＤＬ１に対するナノ抗体：
（１） 配列番号２１で示されるＦＲ１、配列番号２２で示されるＦＲ２、配列番号２３で示されるＦＲ３、および配列番号 ２４で示されるＦＲ４；
（２） 配列番号３３で示されるＦＲ１、配列番号２２で示されるＦＲ２、配列番号３４で示されるＦＲ３、および配列番号 ２４で示されるＦＲ４；
（３） 配列番号３５で示されるＦＲ１、配列番号３６で示されるＦＲ２、配列番号３７で示されるＦＲ３、および配列番号 ２４で示されるＦＲ４。 - 前記ＰＤＬ１に対するナノ抗体のＶＨＨ鎖のアミノ酸配列は、配列番号１、配列番号５、配列番号６、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれることを特徴とする請求項１に記載のＰＤＬ１に対するナノ抗体。
- 一つまたは複数のＶＨＨ鎖の請求項１に記載のＰＤＬ１に対するナノ抗体を含み、単量体、二価抗体、または多価抗体であることを特徴とするＰＤＬ１に対するナノ抗体。
- 請求項１に記載のＰＤＬ１に対するナノ抗体、または請求項４に記載のＰＤＬ１に対するナノ抗体からなる群から選ばれるタンパク質をコードすることを特徴とするポリヌクレオチド。
- 請求項５に記載のポリヌクレオチドを含有することを特徴とする発現ベクター。
- 請求項６に記載の発現ベクターを含有することを特徴とする宿主細胞。
- ＰＤＬ１に対するナノ抗体を生成する方法であって、以下の工程を含むことを特徴とする方法：
（ａ） ナノ抗体の生成に適する条件において、請求項７に記載の宿主細胞を培養することにより、ＰＤＬ１に対するナノ抗体を含む培養物を得る；
（ｂ） 前記培養物から前記のＰＤＬ１に対するナノ抗体を単離および／または回収する；ならびに
（ｃ） 任意に、工程（ｂ）得られたＰＤＬ１に対するナノ抗体を精製および／または修飾する。 - 以下のものを含有することを特徴とする免疫複合体：
（ａ） 請求項１に記載のＰＤＬ１に対するナノ抗体、または請求項４に記載のＰＤＬ１に対するナノ抗体；ならびに
（ｂ） 検出可能なマーカー、薬物、サイトカイン、放射性核種、酵素、金ナノ粒子／ナノロッド、磁性ナノ粒子、ウイルスコートタンパク質またはＶＬＰ、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる複合部分。 - 宿主細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）－Ｔ細胞またはＣＡＲ－ＮＫ細胞であり、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、細胞外ドメインを含み、細胞外ドメインは、請求項１に記載のＰＤＬ１に対するナノ抗体を含むことを特徴とする、請求項７に記載の宿主細胞。
- 活性成分の使用であって、前記活性成分は、請求項１に記載のＰＤＬ１に対するナノ抗体、または請求項４に記載のＰＤＬ１に対するナノ抗体、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれ、前記活性成分は以下：
（ａ） ＰＤＬ１高発現疾患を予防および／または治療する薬物；
（ｂ） ＰＤＬ１高発現疾患を検出する試薬
を製造するために使用されることを特徴とする、前記使用。 - 以下：
（ａ） 活性成分として、請求項１に記載のＰＤＬ１に対するナノ抗体、または請求項４に記載のＰＤＬ１に対するナノ抗体、またはこれらの組み合わせ；ならびに
（ｉｉ） 薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤
を含有することを特徴とする、薬物組成物。
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