JP7737679B2 - 液滴ベース細胞内物質輸送プラットフォーム - Google Patents

Description

本発明は、液滴ベースの細胞内物質輸送プラットフォームに関するものであり、より詳しくは、細胞の損傷なく高効率で細胞内に物質を効果的に輸送することができる液滴ベースの細胞内物質輸送プラットフォームに関するものである。

細胞内物質輸送は、細胞工学の最も基本的な実験の一つであり、通常キャリアを用いたり、細胞膜／核膜にナノポア（ｎａｎｏｐｏｒｅ）を作成して物質を輸送する。

ウイルスまたはリポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）を中心としたキャリア技術は、最適化された場合、高効率な物質輸送が可能であるが、安全性、遅い輸送速度、労働／コスト集中的なキャリア準備プロセス、低い再現性などの問題点が存在する。

これに対して、細胞膜にエネルギーを加えてナノポアを作成する方法（例：電気穿孔（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）またはマイクロニードル（ｍｉｃｒｏｎｅｅｄｌｅ））、相対的に多様な物質を様々な細胞株へ輸送可能な利点がある。しかし、これらの方法は侵襲性による低い細胞生存率、輸送物質の変性、及び低い処理量が大きな限界として指摘されている。

これらの問題点を解決しようと、大量の細胞処理が可能な微小流体装置の使用が目立っている。代表的には、微細管に瓶首区間を作り、細胞がその瓶首区間を通過する際に細胞の物理的変形を通じて細胞膜にナノポアを作成するプラットフォームが存在する。しかし、このアプローチは実験進行時に瓶首区間自体が詰まることや、不均一な物質輸送効率などの大きな欠点がある。

したがって、様々な細胞に対して多様な物質を輸送しつつ、細胞に損傷なく高効率で物質を輸送できる方法に関して多様な研究が行われている。

本発明の目的は、様々な細胞に対して高効率で物質を輸送できる液滴ベースの細胞内物質輸送プラットフォームを提供することである。

また、本発明の別の目的は、輸送しようとする物質の不必要なロスを減少させ、連続的に多量の細胞を処理できる細胞内物質輸送プラットフォームを提供することである。

本発明の一側面によれば、本発明の実施例は、細胞内物質輸送プラットフォームを含む。

一実施例において、細胞内物質を輸送する装置として、一端から他端へ第１方向に延び、内部に流体の通路が備えられた１つ以上のメインチャネル；該メインチャネルの一端に接続され、該細胞及び物質を含む第１流体を注入する第１供給部；及び該メインチャネルの一端に接続され、該第１流体と混合されない第２流体を注入する第２供給部；を含み、該メインチャネルの内部には１つ以上の圧縮ブロック（ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｎｇ ｂｌｏｃｋ）が備えられる細胞内物質輸送プラットフォームを含む。

一実施例において、該第１流体は水相であり、該第２流体は油相であることができる。

一実施例において、該第１供給部は該第１方向に対して平行に延び、該メインチャネルの一端に接続され、該第２供給部は該メインチャネルの一端で該第１供給部に対して角度を持って接続されることができる。

一実施例において、該第１供給部から該第１流体は該メインチャネルの一端へと送られ、該第２供給部から該第２流体は該メインチャネルの一端へと送られるが、該第１流体の流れ方向に対して角度を持って送られ、該細胞、物質を含む第１流体は液滴として形成され、該液滴は該第２流体内で該メインチャネルを通過することができる。

一実施例において、該第２供給部は第１及び第２供給チャネルを含み、該第１及び第２供給チャネルは該メインチャネルの一端に接続され、ジャンクションを形成することができる。

一実施例において、該圧縮ブロックは該メインチャネルの一端から第１の長さに離れた部分に備えられ、該メインチャネルの一端から他端までの全長に対して、該第１の長さは３０％から９０％であることができる。

一実施例において、該メインチャネルで該第２流体の流速は１ｍＬ／ｈから７０ｍＬ／ｈであることができる。

一実施例において、該メインチャネルに角度を持って接続され、該第２流体が流動する１つ以上のサブチャネルを更に含むことができる。

一実施例において、該サブチャネルは該メインチャネルの一端から第２の長さに離れた部分で該メインチャネルに接続されるが、第１及び第２サブチャネルを含み、該第１及び第２サブチャネルは該メインチャネルの一側及び他側にそれぞれ接続されることができる。

一実施例において、該サブチャネルの内径は該メインチャネルの内径である第１の直径に対して２０％から１５０％であり、該サブチャネルを通じて該第２流体が該メインチャネルへと送られることができる。

一実施例において、該サブチャネルの内径は２０μｍから２００μｍであり、該メインチャネルの内径である第１の直径は２０μｍから１．５ｍｍであり、該サブチャネルを通じて該第２流体が該メインチャネルへと送られることができる。

一実施例において、該メインチャネルで該第２流体の流速は１ｍＬ／ｈから４５ｍＬ／ｈであり、該サブチャネルで該第２流体の流速は１ｍＬ／ｈから３０ｍＬ／ｈであることができる。

一実施例において、該圧縮ブロックは該メインチャネルの一端から第１の長さに離れた部分に設置され、該第１の長さは該第２の長さに対して１．１倍から５倍であることができる。

一実施例において、該第１の直径は２０μｍから１．５ｍｍであり、該第１の長さは０．１ｍｍから３０ｍｍであり、該第２の長さは０．１ｍｍから１．５ｍｍであることができる。

一実施例において、該圧縮ブロックは該第１方向に平行な方向の長さが１０μｍから２００μｍであることができる。

一実施例において、該圧縮ブロックは該第１方向に平行な方向の長さが２０μｍから１００μｍであることができる。

一実施例において、該圧縮ブロックと該メインチャネル内面との間隔（ｇａｐ）は第２の直径で設けられ、該第２の直径は該メインチャネルの内径である第１の直径に対して０．１％から８５％であることができる。

一実施例において、該第２の直径は２μｍから１７μｍであることができる。

一実施例において、該圧縮ブロックの該第１方向に垂直な方向の高さは該第１の直径に対して１５％から９９％であることができる。

一実施例において、該圧縮ブロックの該第１方向に垂直な方向の高さは３μｍから１．５ｍｍであることができる。

一実施例において、該メインチャネルは、該第１供給部に接続されるインレット部；該インレット部に接続されるが複数の通路に分岐されるブランチ部；及び該ブランチ部に接続されるアウトレット部；を含み、該ブランチ部は該インレット部及び該アウトレット部よりも小さい直径で設けられる複数の通路、及び該複数の通路が互いに分岐されたり接続されるリンクを含み、該圧縮ブロックは該ブランチ部または該アウトレット部に設置されることができる。

一実施例において、該メインチャネル内には該細胞、物質及び第１流体で形成された液滴が該第２流体を通じて該インレット部から該ブランチ部を通して該アウトレット部へと輸送され、該インレット部に設置される液滴は該ブランチ部または該アウトレット部に設置される液滴よりも平均直径が大きく設置されることができる。

一実施例において、該ブランチ部は該インレット部と該アウトレット部を結ぶ仮想の基準線を中心に互いに対称的な形で設置されることができる。

一実施例において、該メインチャネルは該インレット部またはブランチ部に設置される１つ以上の曲線通路を更に含むことができる。

一実施例において、該物質は核酸、タンパク質、転写因子、ベクター、プラスミド、遺伝子はさみ物質及びナノ粒子のいずれか一つ以上を含むことができる。

以上のように、本発明によれば、様々な細胞に対して、細胞の損傷を防ぎながら細胞内に物質を輸送できる高効率の細胞内物質輸送プラットフォームを提供することができる。

また、本発明によれば、新しい方法を用いて物質を種類に制限なく細胞内に輸送でき、様々な物質を一つの細胞内に、または一つの物質を様々な細胞内に輸送できる大量生産が容易な細胞内物質輸送プラットフォームを提供することができる。

図１は、本発明の一実施例による細胞内物質輸送プラットフォームの概略図である。 図２は、本発明の一実施例による細胞内物質輸送プラットフォームを示す図面である。 図３は、図２の断面図である。 図４は、本発明の別の実施例による細胞内物質輸送プラットフォームを示す図面である。 図５は、図４の断面図である。 図６は、本発明のさらに別の実施例による細胞内物質輸送プラットフォームを示す図面である。 図７は、本発明のその他の実施例による細胞内物質輸送プラットフォームを示す図面である。 図８は、図７のメインチャネルの拡大図である。 図９は、図７のブランチ部を示す図面である。 図１０は、本発明のその他の実施例による細胞内物質輸送プラットフォームを示す図面である。 図１１は、本実施例による細胞内物質輸送プラットフォームを利用して細胞内物質輸送を確認した図面である。 図１２は、図１１による細胞内物質輸送プラットフォームでの圧縮ブロックの大きさによる細胞内物質輸送効率を確認した結果である。 図１３は、図１１による細胞内物質輸送プラットフォームでの輸送物質の種類による細胞内物質輸送効率を確認した結果である。 図１４は、従来の汎用装置を用いた細胞内遺伝子輸送結果を示す図面である。 図１５は、ＥＭＸ１ターゲット遺伝子編集効率を従来の汎用装置と比較した結果である。 図１６は、液滴分離型細胞内物質輸送プラットフォームを利用して細胞内物質輸送を確認した結果である。

その他の実施例の具体的な詳細は、詳細な説明および図面に含まれている。

本発明の利点及び特徴、およびそれらを達成する方法は、添付される図面とともに詳細に後述される実施例を参照すれば明確になるだろう。しかし、本発明は以下で開示される実施例に限定されるものではなく、様々な形態で実現可能であり、以下の説明で別途指定されていない限り、本発明に含まれる成分、反応条件、成分の含有量を表すすべての数字、値及び／または表現は、これらの数字が本質的に異なるものの中からこれらの値を得る際に発生する測定の様々な不確実性を反映した近似値であるため、すべての場合において「約」という用語によって修飾されると理解されるべきである。また、本記載で数値範囲が開示される場合、これらの範囲は連続的であり、別途指示がない限り、これらの範囲の最小値から最大値を含むすべての値を含む。さらに、これらの範囲が整数を指す場合、別途指示がない限り最小値から最大値を含むすべての整数を含む。

また、本発明で範囲が変数について記述される場合、該当する変数は、記述された範囲の終点を含む記述された範囲内のすべての値を含むものと理解される。例えば、「５から１０」の範囲は、５、６、７、８、９、および１０の値だけでなく、６から１０、７から１０、６から９、７から９などの任意のサブ範囲を含み、５．５、６．５、７．５、５．５から８．５、および６．５から９など、記述された範囲のカテゴリ内の任意の整数の間の任意の値も含むことと理解される。例えば、「１０％から３０％」の範囲は、１０％、１１％、１２％、１３％などの値と３０％までのすべての整数だけでなく、１０％から１５％、１２％から１８％、２０％から３０％などの任意のサブ範囲を含み、１０．５％、１５．５％、２５．５％など、記述された範囲のカテゴリ内の任意の整数の間の任意の値も含むことと理解される。

図１は、本発明の一実施例による細胞内物質輸送プラットフォームの概略図である。図２は、本発明の一実施例による細胞内物質輸送プラットフォームを示す図面である。図３は、図２の断面図である。

本発明の一実施例は、細胞内に物質を輸送する細胞内物質輸送プラットフォーム（１００）に関するもので、一端から他端へ第１方向（ｘ）に延び、内部に流体の通路が備えられた１つ以上のメインチャネル（１１０）；該メインチャネル（１１０）の一端に接続され、該細胞（１０）、物質（２０）および第１流体を注入する第１供給部（１２０）；及び該メインチャネル（１１０）の一端に接続され、該第１流体と混合されない第２流体を注入する第２供給部（１３０）；を含む。

該メインチャネル（１１０）の内部には１つ以上の圧縮ブロック（ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｎｇ ｂｌｏｃｋ）（１５０）が備えられ、該第１流体は水相（ｗａｔｅｒ ｐｈａｓｅ）であり、該第２流体は油相（ｏｉｌ ｐｈａｓｅ）であることができる。

本実施例による細胞内物質輸送プラットフォーム（１００）は、互いに混合されない第１流体と第２流体を使用して液滴を形成し、該液滴（５０）内に細胞（１０）と該細胞内に輸送することを目的とする物質（２０）を捕捉することができる。該液滴（５０）は該第１流体と同じ物質で形成され、該第２流体内で液滴（５０）の形を維持しながら該細胞（１０）と物質（２０）を移動させることができる。

通常、細胞内に物質を輸送する方法は電気穿孔を利用して細胞膜を損傷するなど、細胞に永続的な痕跡を残す。また、細胞と物質を流体内で流しながら細胞に直接外力を加えて細胞内に物質を輸送する方法は、細胞に損傷を引き起こすか、または細胞内に輸送される物質の効率が低いという欠点がある。

一方、本実施例による細胞内物質輸送プラットフォーム（１００）は、液滴（５０）を利用することで、細胞（１０）の損傷を防ぎながら、細胞内に物質（２０）を効果的に輸送することができる。本発明の細胞内物質輸送プラットフォーム（１００）では、液滴（５０）によって細胞（１０）と物質（２０）が保護されながら、同時に流体内で効率的に流れることができる。また、液滴（５０）によって細胞（１０）と物質（２０）の間の距離が近接して維持されることにより、物質（２０）が外部に失われることなく、効率的に細胞（１０）内に輸送されることができる。

本実施例による細胞内物質輸送プラットフォーム（１００）は、圧縮ブロック（１５０）を更に含むことができる。該圧縮ブロック（１５０）は、メインチャネル（１１０）内部に設けられ、該メインチャネル（１１０）内部の実質的な直径を減少させることができる。具体的には、液滴（５０）は第２流体によって所定の速度でメインチャネル（１１０）を通過するが、圧縮ブロック（１５０）が形成された部分で液滴（５０）が圧迫されながら通過する。液滴（５０）が圧縮ブロック（１５０）を通過する過程で、細胞（１０）の変形が発生し、細胞膜または核膜に物質（２０）が通過するためのナノポアが形成され、ナノポアを通じて物質（２０）は細胞（１０）内に効果的に輸送されることができる。また、圧縮ブロック（１５０）を通過した液滴（５０）は形状を回復し、液滴（５０）内に渦（ｖｏｒｔｅｘ）が形成され、該渦は物質（２０）が細胞（１０）内に輸送される推進力を提供し、細胞内物質輸送の効率を向上させることができる。また、圧縮ブロック（１５０）を通過した後に変形した細胞（１０）は元の形状に回復し、内部には物質（２０）を含む。

該液滴（５０）は非常に少ない体積で、約１００ ｐＬ／細胞として提供されることができる。メインチャネル（１１０）内では、該液滴（５０）の体積に応じて輸送される物質（２０）の量が決定されることができる。通常、細胞内物質輸送システムでは、細胞と輸送される物質との間の距離が遠く、細胞内の物質輸送効率が低下するか、または細胞周辺の物質の濃度を高めるために多量の物質が消費され、その他の物質は廃棄されるため、非効率的なプロセスが行われていた。しかし、本実施例による細胞内物質輸送プラットフォーム（１００）では、液滴（５０）という小さなシステム内で細胞（１０）と物質（２０）が存在し、細胞（１０）と物質（２０）が近接して位置するため、非常に少量の物質（２０）だけでも細胞（１０）内に効率的に輸送することができ、物質（２０）の無駄なロスを減少させることができる。

本実施例による細胞内物質輸送プラットフォーム（１００）では、該液滴（５０）の体積は少量であり、該液滴（５０）内で細胞（１０）は高濃度の物質（２０）の環境に設定されることができる。該液滴（５０）が圧縮ブロック（１５０）を通過する際に細胞（１０）の変形によってナノポアが形成される場合、非常に少ない体積の液滴（５０）だけでも効果的に細胞（１０）内に物質を輸送することが可能である。さらに、圧縮ブロック（１５０）を通過した後でも液滴（５０）の形状は保持され、液滴（５０）内での渦などの二次流れは物質（２０）が細胞（１０）内により効果的に輸送されるための推進力を提供することができる。

本実施例における細胞内物質伝達プラットフォーム（１００）は、従来の技術では不可能であった大きなナノ粒子やプラスミドＤＮＡなどの大分子にも適用可能であり、従来技術で細胞を微細管またはその狭い通路（ボトルネック）を通過させた方法で生じた詰まり現象や、高速流で細胞の生存率が低下する問題を防止できる。

本実施例による細胞内物質伝達プラットフォーム（１００）では、メインチャネル（１１０）の内壁は疎水性で構成されている可能性がある。メインチャネル（１１０）において、液滴（５０）を流動させる第２の流体は疎水性であり、メインチャネル（１１０）内で容易に流動することができる。また、液滴（５０）は親水性であり、メインチャネル（１１０）との親水性および疎水性の差により、詰まり現象を最小化できる。

本実施例による細胞内物質伝達プラットフォーム（１００）は、詰まり現象が発生しないため、細胞内物質伝達を高い効率で行うことができ、また、適切な流速で細胞を移動させることにより、高い細胞生存率を示すことができる。

第１供給部（１２０）は、第１方向（ｘ）に対して平行に延長され、メインチャネル（１１０）の一端に接続される。また、第２供給部（１３０）は、メインチャネル（１１０）の一端から第１供給部（１２０）に対して角度を持って接続される可能性がある。例えば、第１供給部（１２０）とメインチャネル（１１０）は互いに延長されて水平に接続され、第２供給部（１３０）はメインチャネル（１１０）に対して所定の角度で接続されることができる。より具体的には、第２供給部（１３０）はメインチャネル（１１０）に対して垂直に接続される可能性がある。

第１供給部（１２０）の一端はメインチャネル（１１０）の一端と接続され、第１供給部（１２０）の他端は第１供給チャンバー（１２１）と接続される可能性がある。第１供給チャンバー（１２１）には第１流体、細胞（１０）、物質（２０）が備えられており、第１流体、細胞（１０）、物質（２０）を第１供給部（１２０）に送ることができる。

第２供給部（１３０）の一端はメインチャネル（１１０）の一端と接続され、第２供給部（１３０）の他端は第２供給チャンバー（１３１）と接続される可能性がある。第２供給チャンバー（１３１）には第２流体が備えられており、所定の流速で第２供給部（１３０）に送ることができる。

第１供給部（１２０）から第１流体、細胞（１０）、物質（２０）はメインチャンバー（１１０）の一端に送られ、第２供給部（１３０）から第２流体はメインチャンバー（１１０）の一端に第１流体の流れ方向に対して角度を持って送られることにより、第１流体に含まれる細胞（１０）、物質（２０）は液滴（５０）として形成される可能性がある。この液滴（５０）は第２流体と共にメインチャネル（１１０）の一端から他端に流れながら、メインチャネル（１１０）の圧縮ブロック（１５０）を通過することができる。

第１供給部（１２０）の第１流体の流速、または第２供給部（１３０）の第２流体の流速を制御することにより、液滴（５０）の大きさ及び移動速度を制御することができる。本実施例による細胞内物質伝達プラットフォーム（１００）は、さまざまな大きさの細胞（１０）または伝達したい物質（２０）の種類に応じて、液滴（５０）の大きさ及び移動速度を制御することにより、細胞内物質伝達の効率を向上させることができる。

具体的に、第２供給部（１３０）は第１および第２供給チャネルを含むことができる。第１および第２供給チャネルは、第１供給部（１２０）に対して一方および他方にそれぞれ備えられた一対の微細チャネルである可能性がある。第１および第２供給チャネルは、メインチャネル（１１０）の一端に接続され、十字形、Ｙ字形、またはＴ字形のジャンクション（ｊｕｎｃｔｉｏｎ）（１４０）を形成することができる。

具体的に、第１供給部（１２０）は延長されてメインチャネル（１１０）に接続することができる。第１供給部（１２０）とメインチャネル（１１０）が接続される部分に、第１供給チャネルが上部から垂直に接続され、第２供給チャネルが下部から垂直に接続される可能性がある。第１供給部（１２０）を通じて送られる第１流体は、ジャンクション（１４０）で、第１および第２供給チャネルから送られる第２流体によって液滴（５０）として形成され、第２流体は液滴（５０）と共にメインチャネル（１１０）に流れることができる。

メインチャネル（１１０）の内面には圧縮ブロック（１５０）が備えられる可能性がある。圧縮ブロック（１５０）はメインチャネル（１１０）の内面の上部、下部、および側面のいずれか一方に備えられ、メインチャネル（１１０）の通路を減少させることができる。圧縮ブロック（１５０）は第２流体の流れが妨げられないように表面が疎水性で形成される可能性がある。

圧縮ブロック（１５０）は、メインチャネル（１１０）の内面上部から突出する高さ（Ｓ１）と、第１方向（ｘ）に平行な長さ（Ｓ２）を持つおおよそ箱形状で備えられる可能性がある。例えば、圧縮ブロック（１５０）は角が丸められた形状で備えられ、圧縮ブロック（１５０）の角で渦が形成されるのを防ぐことができる。

第２流体および液滴（５０）は、メインチャネル（１１０）の内部で圧縮ブロック（１５０）を通過することができる。圧縮ブロック（１５０）を通過する際、圧縮ブロック（１５０）によって減少した流路と、増加した流速により、液滴（５０）が変形しながら、液滴（５０）内に備えられた細胞（１０）も変形する可能性がある。この細胞（１０）の細胞膜にはナノポアが形成される可能性があり、物質（２０）はこのナノポアを通じて細胞内に伝達されることができる。液滴（５０）は圧縮ブロック（１５０）を通過した後、圧縮ブロック（１５０）によって変化した形状が圧縮ブロック（１５０）を通過する前に回復することができる。この際、液滴（５０）内の細胞（１０）も液滴（５０）と共に変形して元の形状に回復することができる。液滴（５０）および細胞（１０）の形状が回復する過程で、液滴（５０）内には二次渦が形成される可能性がある。この渦は物質（２０）の移動を促進し、それによって細胞（１０）内への物質（２０）の伝達が促進される可能性がある。

メインチャネル（１１０）の内径は第１直径（ａ）であり、圧縮ブロック（１５０）とメインチャネル（１１０）の内面との間隔（ｇａｐ）は第２直径（ｂ）である場合、第２直径（ｂ）は第１直径（ａ）に対して０．１％から８５％の範囲で備えられる可能性がある。第２直径（ｂ）が第１直径（ａ）に対して０．１％未満の場合、メインチャネル（１１０）と圧縮ブロック（１５０）を通過する細胞（１０）に損傷が発生する可能性があり、８５％を超える場合は液滴（５０）が圧縮ブロック（１５０）によって十分に加圧されず、細胞内物質伝達の効率が低下する可能性がある。

第２直径（ｂ）は２μｍから１７μｍの範囲である可能性がある。第２直径（ｂ）が前述の範囲内で設定されることにより、細胞（１０）を損傷しない範囲内で液滴（５０）を加圧し、細胞（１０）の物理的変形を引き起こすことによって、細胞内物質伝達の効率を向上させることができる。

圧縮ブロック（１５０）で、第１方向（ｘ）に平行な方向の長さ（Ｓ２）は１０μｍから２００μｍの範囲である可能性がある。長さ（Ｓ２）が１０μｍ未満の場合は細胞（１０）内物質伝達が効果的に行われず、２００μｍを超える場合は圧縮ブロック（１５０）との接触面積が増加し、細胞（１０）の損傷が発生する可能性がある。具体的に、圧縮ブロック（１５０）で、第１方向（ｘ）に平行な方向の長さ（Ｓ２）は２０μｍから１００μｍの範囲である可能性がある。

圧縮ブロック（１５０）で、第１方向（ｘ）に垂直な方向の高さ（Ｓ１）は、第１直径（ａ）に対して１５％から９９％の範囲で設定される可能性がある。具体的には、圧縮ブロック（１５０）で、第１方向（ｘ）に垂直な方向の高さ（Ｓ１）は３μｍから１．５ｍｍの範囲である可能性がある。高さ（Ｓ１）が前述の範囲内で設定されることにより、圧縮ブロック（１５０）による詰まり現象などを防ぎ、細胞内物質伝達を効果的に行うことができる。

圧縮ブロック（１５０）は、メインチャネル（１１０）の一端から第１長さ（Ｌ１）の距離に設置される可能性がある。具体的には、メインチャネル（１１０）の一端から他端までの全長（Ｌ２）に対して、第１長さ（Ｌ１）は３０％から９０％の範囲である可能性がある。第１長さ（Ｌ１）が全長（Ｌ２）に対して３０％未満で設定されると、圧縮ブロック（１５０）を通過する前の液滴と第２流体の流れが不安定になる問題があり、９０％を超えると、圧縮ブロック（１５０）を通過して変形した液滴および細胞が回復するための時間が不足する問題がある。

メインチャネル（１１０）、第１および第２供給部（１２０、１３０）にはそれぞれ流速制御器が備えられる可能性があり、この流速制御器はメインチャネル（１１０）、第１および第２供給部（１２０、１３０）を通過する第１流体および第２流体の速度とレイノルズ数を制御することができる。具体的に、メインチャネル（１１０）での第２流体の流速は１ｍＬ／ｈから７０ｍＬ／ｈの範囲である可能性がある。メインチャネル（１１０）での第２流体の流速が１ｍＬ／ｈ未満の場合は液滴（５０）が互いに結合するなどの問題が発生する可能性があり、７０ｍＬ／ｈを超えると液滴（５０）がジャンクション（１４０）で円滑に形成されない。

該当物質は核酸、タンパク質、転写因子、ベクター、プラスミド、遺伝子編集物質、ナノ粒子などのいずれか一つ以上を含むことができる。

以下、図４から図１０を参照して、本発明の他の実施例について説明する。後述する内容を除き、図１から図３で説明した実施例に記載された内容と類似しているため、詳細な説明は省略する。

図４は、本発明の他の実施例による細胞内物質伝達プラットフォームを示す図面である。図５は図４の断面図である。

図４および図５を参照すると、本実施例による細胞内物質伝達プラットフォーム（２００）は、細胞と物質、第１流体を含む一つ以上の液滴と、該液滴を移動させる第２流体を含むメインチャネル（２１０）、メインチャネル（２１０）の一端と接続され、第１流体と細胞、物質を伝達する第１供給部（２２０）および、メインチャネル（２１０）の一端と角度を持って接続され、第２流体を伝達する第２供給部（２３０）を含むことができる。メインチャネル（２１０）および第１および第２供給部（２２０、２３０）が交差するジャンクション（２４０）で、液滴が形成され、メインチャネル（２１０）の一端から他端へ伝達されることができる。

メインチャネル（２１０）の内部には圧縮ブロック（２５０）が備えられ、メインチャネル（２１０）の内部を通過する液滴を加圧することができる。圧縮ブロック（２５０）は、液滴の加圧による瞬間的な細胞変形による一次的な細胞内物質伝達と共に、圧縮ブロック（２５０）を通過した後、液滴内で発生する渦によって二次的な細胞内物質伝達を誘導することができる。

細胞内物質伝達プラットフォーム（２００）は、第２流体が流れる一つ以上のサブチャネル（２６０）をさらに含むことができる。サブチャネル（２６０）は、メインチャネル（２１０）の一端から第２長さ（Ｌ４）の距離に角度（θ）を持って接続されることができる。サブチャネル（２６０）は、メインチャネル（２１０）に対して約３０°から７５°の角度で接続され、サブチャネル（２６０）からメインチャネル（２１０）へ供給される第２流体の流れによって、メインチャネル（２１０）内での乱流が発生するのを防ぎ、液滴の流れが円滑になるようにすることができる。

サブチャネル（２６０）は、液滴が形成された後、液滴および第２流体が流れるメインチャネル（２１０）へ第２流体を供給することができる。サブチャネル（２６０）には流速制御器が備えられる可能性があり、この流速制御器はサブチャネル（２６０）を通過する第２流体の流量を制御することができる。

サブチャネル（２６０）は、メインチャネル（２１０）に流れる第２流体の流れに対して外側から同じ第２流体を供給することにより、液滴がメインチャネル（２１０）の内壁との摩擦が発生するのを防ぎながらメインチャネル（２１０）を通過するようにすることができる。

サブチャネル（２６０）は一対の第１および第２サブチャネルを含むことができる。第１および第２サブチャネルは、メインチャネル（２１０）の一方および他方にそれぞれ備えられる可能性がある。具体的には、第１および第２サブチャネルは、メインチャネル（２１０）の一端から第２長さ（Ｌ４）の距離にメインチャネル（２１０）に角度を持ってメインチャネル（２１０）の一方および他方にそれぞれ接続されることができる。第１および第２サブチャネル（２６０）は一対として備えられることができ、メインチャネル（２１０）のおおよそ同じ位置にそれぞれ備えられる可能性がある。

サブチャネル（２６０）の内径（ｃ）は、メインチャネル（２１０）の内径である第１直径（ａ）に対して２０％から１５０％の範囲で設定される可能性がある。サブチャネル（２６０）の内径（ｃ）は前述の範囲内で設定されることにより、メインチャネル（２１０）内の第２流体の流れで不要な乱流を形成せずに、第２流体が液滴を容易に移動させるようにすることができる。例えば、サブチャネル（２６０）の内径（ｃ）は２０μｍから２００μｍであり、メインチャネルの内径である第１直径は２０μｍから１．５ｍｍの範囲である可能性がある。

サブチャネル（２６０）を通してメインチャネル（２１０）へ供給される第２流体の流速は、メインチャネル（２１０）内の第２流体の流速と同じか異なる範囲で設定される可能性がある。具体的には、メインチャネル（２１０）での第２流体の流速は１ｍＬ／ｈから４５ｍＬ／ｈであり、サブチャネル（２６０）での第２流体の流速は１ｍＬ／ｈから３０ｍＬ／ｈの範囲である可能性がある。

圧縮ブロック（２５０）は、メインチャネル（２１０）の一端から第１長さ（Ｌ３）の距離に設置され、第１長さ（Ｌ３）はメインチャネル（２１０）の一端からサブチャネル（２６０）が設置される第２長さ（Ｌ４）に対して１．１倍から５倍の範囲である可能性がある。第１長さ（Ｌ３）および第２長さ（Ｌ４）を前述の範囲で制御することにより、メインチャネル（２１０）内で圧縮ブロック（２５０）による細胞内物質伝達の効率を向上させ、大量の細胞に対しても効果的に処理することができる。

具体的には、第１直径（ａ）は２０μｍから１．５ｍｍであり、第１長さ（Ｌ３）は０．１ｍｍから３０ｍｍであり、第２長さ（Ｌ４）は０．１ｍｍから１．５ｍｍの範囲である可能性がある。

図６は、本発明のさらなる実施例による細胞内物質伝達プラットフォームを示す図面である。

図６を参照すると、本実施例による細胞内物質伝達プラットフォーム（３００）は、液滴（５０）が移動しながら細胞内に物質が伝達されるメインチャネル（３１０）と、メインチャネル（３１０）に細胞、物質、および第１流体で形成された液滴（５０）を伝達する第１供給部（３２０）および、メインチャネル（３１０）に第２流体を伝達する第２供給部（３３０）を含むことができる。

メインチャネル（３１０）は、第１供給部（３２０）に接続されるインレット部（３１０ａ）、インレット部（３１０ａ）に接続され複数の通路に分岐されるブランチ部（３１０ｂ）、およびブランチ部（３１０ｂ）に接続されるアウトレット部（３１０ｃ）を含むことができる。ブランチ部（３１０ｂ）は、インレット部（３１０ａ）およびアウトレット部（３１０ｃ）よりも小さい直径の複数の通路（３１１、３１２、３１３）およびこれらの通路（３１１、３１２、３１３）が互いに分岐または接続されるリンクを含むことができる。圧縮ブロック（３５０）は、ブランチ部（３１０ｂ）またはアウトレット部（３１０ｃ）に設置される可能性がある。

メインチャネル（３１０）内には、細胞、物質、および第１流体で形成された液滴（５０）が第２流体と共にインレット部（３１０ａ）からブランチ部（３１０ｂ）を通じてアウトレット部（３１０ｃ）へ伝達されることができる。インレット部（３１０ａ）に設置される液滴（５０）は、ブランチ部（３１０ｂ）またはアウトレット部（３１０ｃ）に設置される液滴（５０）よりも平均直径が大きく設定される可能性がある。

ブランチ部（３１０ｂ）は、インレット部（３１０ａ）とアウトレット部（３１０ｃ）を水平に接続する仮想の基準線（ＳＬ）を中心に互いに対称な形で設置される可能性がある。具体的に、ブランチ部（３１０ｂ）はインレット部（３１０ａ）およびアウトレット部（３１０ｃ）よりも小さい直径の複数の通路（３１１、３１２、３１３）およびこれらの通路（３１１、３１２、３１３）が互いに分岐または接続されるリンクを含み、圧縮ブロック（３５０）はブランチ部（３１０ｂ）またはアウトレット部（３１０ｃ）に設置される可能性がある。仮想の基準線（ＳＬ）を中心に、ブランチ部（３１０ｂ）の一方と他方にはそれぞれ対応する形で接続された複数の通路（３１１、３１２、３１３）および分岐が形成され、液滴（５０）はインレット部（３１０ａ）を通じて流入し、ブランチ部（３１０ｂ）の一方と他方に分かれてブランチ部（３１０ｂ）を通過することができる。

ブランチ部（３１０ｂ）はインレット部（３１０ａ）から接続され、ブランチ部（３１０ｂ）の一方と他方を形成する２つの一次通路（３１１）に接続される可能性がある。各一次通路（３１１）はそれぞれリンクを通じて２つの二次通路（３１２）に分岐される可能性がある。これら２つの二次通路（３１２）はそれぞれ個別に延長された後、リンクを通じて再び接続され、１つの三次通路（３１３）を形成する可能性がある。ブランチ部（３１０ｂ）の一方の三次通路（３１３）とブランチ部（３１０ｂ）の他方の三次通路（３１３）はアウトレット部（３１０ｃ）に接続される可能性がある。

ブランチ部（３１０ｂ）を通過する間、液滴（５０）はブランチ部（３１０ｂ）の平均直径がインレット部（３１０ａ）よりも減少するにつれて液滴（５０）の平均直径も減少し、ブランチ部（３１０ｂ）を通過することができる。液滴（５０）の平均直径はブランチ部（３１０ｂ）の平均直径とほぼ同様またはそれよりも２０％以下である可能性がある。液滴（５０）はブランチ部（３１０ｂ）を通過する際に液滴（５０）が一列に並んで流れ、これにより細胞の損傷を防ぎ、細胞内物質伝達を効果的に制御することができる。

また、ブランチ部（３１０ｂ）およびアウトレット部（３１０ｃ）のいずれか一方以上で、圧縮ブロック（３５０）が一つ以上設置される可能性がある。液滴（５０）は圧縮ブロック（３５０）を通過しながら加圧され、一時的に細胞の形が変形し、細胞膜または核膜にナノポアが形成される。また、液滴の形状も変形し、物質と細胞の間の距離が近づく。液滴内の第１流体の流れの変形により、ナノポアを通じて物質が細胞内部に効果的に伝達される可能性がある。

図７は、本発明の他の実施例による細胞内物質伝達プラットフォームを示す図面である。図８は図７のメインチャネルの拡大図であり、図９は図７のブランチ部を示す図面である。

図７から図９を参照すると、本実施例による細胞内物質伝達プラットフォーム（４００）は、細胞および物質を含む第１流体が供給される第１供給部（４２０）、第１供給部（４２０）と接続されるメインチャネル（４１０）、および第１供給部（４２０）とメインチャネル（４１０）が接続される部分に第２流体を供給する第２供給部（４３０）を含むことができる。第１供給部（４２０）、第２供給部（４３０）、およびメインチャネル（４１０）が交差する十字形、Ｙ字形、またはＴ字形などのジャンクション（４４０）で、細胞および物質を含む第１流体は第２流体によって液滴（５０）として形成される可能性がある。この液滴は第２流体と共にメインチャネル（４１０）内を移動することができる。

メインチャネル（４１０）は、順次接続されるインレット部（４１０ａ， ４１０ｂ， ４１０ｃ）、ブランチ部（４１０ｄ， ４１０ｅ）、およびアウトレット部（４１０ｆ）を含むことができる。メインチャネル（４１０）は、インレット部（４１０ａ， ４１０ｂ， ４１０ｃ）またはブランチ部（４１０ｄ， ４１０ｅ）に設置された一つ以上の曲がり通路（４１０ｂ）をさらに含むことができる。具体的に、本実施例では曲がり通路（４１０ｂ）はインレット部（４１０ａ， ４１０ｂ， ４１０ｃ）に含まれる可能性があり、この曲がり通路（４１０ｂ）は一つ以上の曲がった形状で設置され、メインチャネル（４１０）内の第２流体および液滴（５０）の流れの速度を制御し、液滴内で渦流を発生させることができる。この渦流は液滴内の物質伝達効率を向上させ、同時に液滴内に含まれる細胞を混合する役割を果たすことができる。

曲がり通路（４１０ｂ）によって発生する液滴内の流れにより、液滴内の細胞が均一に混合されると、第２流体の流れが分岐する部分で液滴内の細胞の数が均等に分割されることができる。例えば、液滴が分岐する部分で２つに分かれる場合、液滴内の細胞も約５０：５０の割合で分かれることにより、バッチごとに均一な効果が得られるように制御することができる。

細胞内物質伝達プラットフォーム（４００）は、液滴（５０）が形成される部分（１）、液滴を含む第２流体の流れが分岐される部分（２）、および液滴が圧縮ブロック（４５０）によって加圧されて細胞が機械的に穿孔されるメカノポレーション（ｍｅｃｈａｎｏｐｏｒａｔｉｏｎ）される部分（３）を含むことができる。細胞内物質伝達プラットフォーム（４００）は、互いに混ざらない第１流体と第２流体を使用して、細胞、物質、および第１流体で構成される液滴（５０）を形成し、第２流体を通じて液滴（５０）を移動させるが、メインチャネル（４１０）の平均直径や通路の数などによって液滴（５０）の平均直径、移動速度、および移動形態を制御することができる。また、細胞内物質伝達プラットフォーム（４００）は圧縮ブロック（４５０）をさらに含み、細胞や液滴（５０）を傷つけずに、メカノポレーションによって細胞に可逆的なナノポアを形成することができる。ナノポアが開いた場合、物質が細胞内に伝達され、その後すぐにナノポアを閉じて物質が細胞外に放出されず、細胞に損傷を与えることなく細胞内に物質を伝達することができる。

具体的に、図７の細胞内物質伝達システムでは、液滴（５０）が形成される部分（１）、液滴を含む第２流体の流れが分岐される部分（２）、および液滴が圧縮ブロック（４５０）によって加圧されて細胞が機械的に穿孔されるメカノポレーション（ｍｅｃｈａｎｏｐｏｒａｔｉｏｎ）される部分（３）は、以下の方法で実験を行い得られた図面である。

具体的には、細胞、物質、第１流体としては、４，０００万個／ｍＬのＪｕｒｋａｔ細胞（ＡＴＣＣ、ＴＩＢ－１５２）を含み、培養培地はＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒのＯｐｔｉ－ｍｅｍを使用し得られた物質を使用し、第２流体としてはフルオロカーボンオイルを使用した。細胞、物質、および第１流体で構成される液滴はブランチ部（４１０ｄ、４１０ｅ）を通過する際により小さな液滴（５０）のサイズに減少し、小さいサイズの液滴（５０）内には相対的に少量の細胞が捕捉される形で構成される可能性がある。これらの液滴（５０）は圧縮ブロック（４５０）によって加圧され、メカノポレーション（ｍｅｃｈａｎｏｐｏｒａｔｉｏｎ）される部分（３）で液滴内の物質が細胞内部に伝達される可能性がある。

インレット部（４１０ａ、４１０ｂ、４１０ｃ）はジャンクション（４４０）に接続され、液滴（５０）が流入する第１部分（４１０ａ）と、ブランチ部（４１０ｄ、４１０ｅ）に接続される第２部分（４１０ｃ）および第１部分（４１０ａ）と第２部分（４１０ｃ）の間に接続される曲がり通路（４１０ｂ）を含むことができる。

ブランチ部（４１０ｄ、４１０ｅ）はインレット部（４１０ａ、４１０ｂ、４１０ｃ）とアウトレット部（４１０ｆ）を垂直に接続する仮想の基準線（ＳＬ）に対して、複数の通路とリンクが接続されて形成される形状が対称になるように設置される可能性がある。具体的には、仮想の基準線（ＳＬ）を中心にブランチ部の一方（４１０ｄ）と他方（４１０ｅ）は第２部分（４１０ｃ）から接続された第１リンク（Ｄ１）を介して一対の第１通路（４１１）にそれぞれ接続される可能性がある。例えば、第１リンク（Ｄ１）を挟んで、第２部分（４１０ｃ）と一対の第１通路（４１１）は角度を持って接続され、Ｔ字形またはＹ字形の通路を形成することができる。

インレット部（４１０ａ、４１０ｂ、４１０ｃ）の端部の平均直径（Ｌ５）に比べて、第１通路（４１１）の平均直径（Ｌ６）はより小さく設置される可能性があり、具体的には第１通路（４１１）の平均直径（Ｌ６）はインレット部（４１０ａ、４１０ｂ、４１０ｃ）の端部の平均直径（Ｌ５）に対して４０％から８０％の範囲で設置される可能性がある。

第１通路（４１１）はさらに第２リンク（Ｄ２）を通じて一対の第２通路（４１２、４１３）に接続され、各第２通路（４１２、４１３）はそれぞれ第３リンク（Ｄ３）に接続される可能性がある。第３リンク（Ｄ３）を通じて接続される第３通路（４１４、４１５）は一対としてそれぞれ分岐され、各第３通路（４１４、４１５）の端にはそれぞれ円形または多角形の形状の第４通路（４１６）を経て、さらに一つの通路に接続される第５通路（４１７）に接続される可能性がある。第５通路（４１７）は第４リンク（Ｄ４）を通じて接続され、第６通路（４１８）に接続され、さらに第５リンク（Ｄ５）を通じて第７通路（４１９）に接続される可能性がある。

ブランチ部の一方（４１０ｄ）と他方（４１０ｅ）から接続される各第７通路（４１９）は第６リンク（Ｄ６）を通じてアウトレット部（４１０ｆ）に接続される可能性がある。アウトレット部（４１０ｆ）はインレット部（４１０ａ、４１０ｂ、４１０ｃ）に平行に設置され、内部には一つ以上の圧縮ブロック（４５０）を含むことができる。

ブランチ部（４１０ｄ、４１０ｅ）またはアウトレット部（４１０ｆ）は一つ以上の圧縮ブロック（４５０）を含むことができる。圧縮ブロック（４５０）は液滴（５０）を物理的に加圧し、メカノポレーションによる細胞内物質伝達を促進することができる。圧縮ブロック（４５０）はブランチ部（４１０ｄ、４１０ｅ）や第４通路（４１６）に設置される可能性がある。

図１０は、本発明の他の実施例による細胞内物質伝達プラットフォームを示す図面である。

図１０を参照すると、本実施例による細胞内物質伝達プラットフォーム（５００）は、細胞、物質、および第１流体を供給する第１供給部（５２０）、および第１供給部（５２０）の端部に接続され、液滴（５０）が移動しながら細胞内に物質が伝達されるメインチャネル（５１０）を含むことができる。

メインチャネル（５１０）は、第１供給部（５２０）に接続されるインレット部（５１０ａ、５１０ｂ、５１０ｃ）、インレット部（５１０ａ、５１０ｂ、５１０ｃ）に接続され複数の通路で構成されるブランチ部（５１０ｄ、５１０ｅ、５１０ｆ）、およびブランチ部（５１０ｄ、５１０ｅ、５１０ｆ）の端部に接続され、内部に圧縮ブロック（５５０）を持つアウトレット部（５１０ｇ）を含むことができる。

ブランチ部（５１０ｄ、５１０ｅ、５１０ｆ）は、ブランチ部（５１０ｄ、５１０ｅ、５１０ｆ）の中心部を基準に一方と他方が対称な形で設置される可能性がある。ブランチ部（５１０ｄ、５１０ｅ、５１０ｆ）は複数の通路とこれらの通路を接続する複数のリンクが接続されて構成され、インレット部（５１０ａ、５１０ｂ、５１０ｃ）またはアウトレット部（５１０ｇ）の平均直径よりも小さいサイズで設置される可能性がある。

インレット部（５１０ａ、５１０ｂ、５１０ｃ）またはブランチ部（５１０ｄ、５１０ｅ、５１０ｆ）は、液滴と第２流体が通過する通路を提供するためのチャネル形状で設置され、少なくとも一部は直線形であり、少なくとも一部は曲がった形状の曲がり通路（５１０ｂ、５１０ｆ）を含むように設置される可能性がある。曲がり通路（５１０ｂ、５１０ｆ）はカーブされた形状で設置され、液滴内で渦流を発生させることができる。この渦流は液滴内での物質伝達効率を向上させ、同時に液滴内に含まれる細胞を混合する役割を果たすことができる。曲がり通路（５１０ｂ、５１０ｆ）で液滴内の細胞は均一に混合され、液滴内の細胞の数が均等になるようにすることができる。また、曲がり通路（５１０ｂ、５１０ｆ）を通過する際に液滴（５０）は整列した形で移動することができる。曲がり通路（５１０ｂ、５１０ｆ）はインレット部（５１０ａ、５１０ｂ、５１０ｃ）に設置され、インレット部（５１０ａ、５１０ｂ、５１０ｃ）に対応する平均直径を持つ第１曲がり通路（５１０ｂ）と、ブランチ部（５１０ｄ、５１０ｅ、５１０ｆ）に設置され、ブランチ部（５１０ｄ、５１０ｅ、５１０ｆ）に対応する平均直径を持つ第２曲がり通路（５１０ｆ）を含むことができる。

インレット部（５１０ａ、５１０ｂ、５１０ｃ）は第１供給部（５２０）と接続される第１部分（５１０ａ）と、ブランチ部（５１０ｄ、５１０ｅ、５１０ｆ）と接続される第２部分（５１０ｃ）を含み、第１部分（５１０ａ）と第２部分（５１０ｃ）の間には第１曲がり通路（５１０ｂ）が設置される可能性がある。第１曲がり通路（５１０ｂ）はカーブされた形状で設置され、第１部分（５１０ａ）で形成された液滴（５０）内の細胞が均等に分布するようにすることができる。ブランチ部（５１０ｄ、５１０ｅ、５１０ｆ）はパターンの形で通路が形成された一対のブランチ部の一方（５１０ｄ）と他方（５１０ｅ）を含むことができる。また、ブランチ部（５１０ｄ、５１０ｅ、５１０ｆ）にはブランチ部の一方（５１０ｄ）または他方（５１０ｅ）のいずれか一方以上に接続されるカーブされた形の第２曲がり通路（５１０ｆ）が設置される可能性がある。ブランチ部の一方（５１０ｄ）と他方（５１０ｅ）は同じ形状のパターンを持つ通路形状で設置されるか、または異なる形状のパターンで設置される可能性がある。

第２部分（５１０ｃ）は２つの通路に分岐され、それぞれ一つ以上の第２曲がり通路（５１０ｆ）を持つブランチ部の一方（５１０ｄ）および一つ以上の第２曲がり通路（５１０ｆ）を持つブランチ部の他方（５１０ｅ）に接続される可能性がある。ブランチ部の一方（５１０ｄ）と他方（５１０ｅ）は中心部を基準に対称な形状で設置される可能性がある。

第２曲がり通路（５１０ｆ）は、ブランチ部の一方（５１０ｄ）およびブランチ部の他方（５１０ｅ）の開始部分にそれぞれ設置され、ブランチ部に流入する第２流体と液滴（５０）を一列に整列させ、液滴（５０）内に含まれる細胞を均等に分配することができる。

以下、本発明の実施例および比較例を記述する。しかし、以下の実施例は本発明の好ましい一実施例に過ぎず、本発明の権利範囲が以下の実施例によって限定されるわけではない。

図１１から図１６は、実施例による細胞内物質伝達プラットフォームを使用して細胞内物質伝達を確認し、従来技術と比較して物質伝達の効率を確認した結果である。

図１１は、本実施例による細胞内物質伝達プラットフォームを使用して細胞内物質伝達を確認した図面である。

図１１を参照すると、細胞内物質伝達プラットフォームはＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）（Ｄｏｗ、Ｓｙｌｇａｒｄ １８４）とスライドガラス（ＭａｒｉｅｎｆｅｌｄＳｕｐｅｒｉｏｒ、ＨＳＵ－１０００６１２）で製造された。シリコンウェーハのフォトリソグラフィー（ｐｈｏｔｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ）およびエッチング（ＤＲＩＥ）プロセスを通じて微細流体パターンが彫刻されたマスターモールド（Ｍａｓｔｅｒ ｍｏｌｄ）を製作し、ＰＤＭＳのソフトリソグラフィー（Ｓｏｆｔ ｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ）プロセスを通じて微細流体パターンをＰＤＭＳ表面に複製した。プラズマクリーナー（Ｆｅｍｔｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＣＵＴＥ）を使用して微細流体パターンが彫刻されたＰＤＭＳとスライドガラスを酸素プラズマボンディングし、細胞内物質伝達プラットフォームを製造した。安定した液滴生成のためにサーフェスコーティングオイル１０μＬ（ＲＡＮ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、９０９－ＦｌｕｏｒｏＣｏａｔ）を使用して細胞内物質伝達プラットフォームの微細チャネル内部を疎水処理し、強制対流オーブン（Ｊｅｉｏ Ｔｅｃｈ、ＯＦ４－Ｓ）で７５℃の条件でＯ／Ｎボンディングと乾燥を行った。

上記のように製造された細胞内物質伝達プラットフォームは、液滴が形成され移動するメインチャネルの全長は３．１５３８ｍｍであり、メインチャネルの平均内径は８０μｍである。圧縮ブロックはメインチャネルの一端から２．０５３８ｍｍの距離に設置され、その高さは４．８μｍ、長さは１００μｍである。また、サブチャネルの平均内径は４９μｍで、メインチャネルの一端から１ｍｍの距離に一対が約５８度の角度で接続されている。

上記の細胞内物質伝達プラットフォームを使用した細胞内物質伝達実験の材料として、細胞懸濁液（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ－２４３）とフルオロカーボンオイル（Ｆｌｕｏｒｏｃａｒｂｏｎ ｏｉｌ）（Ｂｉｏ Ｒａｄ、Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｏｉｌ）を使用した。実験に使用された細胞懸濁液には、ｍＬあたり１，５００万個のＫ５６２細胞が含まれている。細胞準備後、培養培地（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＲＰＭＩ）で細胞懸濁液を作り、０．２μｍ注射器フィルター（Ａｄｖａｎｔｅｃ、１３ＨＰ０２０ＡＮ／２５ＨＰ０２０ＡＮ）でオイル内の不純物を除去した。フルオロカーボンオイルと細胞懸濁液をそれぞれ使い捨て注射器（ＢＤ、Ｌｕｅｒ－ｌｏｋ Ｔｉｐ Ｓｙｒｉｎｇｅ）に注入し、注射器と微細流体プラットフォームをカプラリーチューブ（ＩＤＥＸ、１／３２´´ ＯＤ ＰＥＥＫ Ｔｕｂｉｎｇ）で接続した。注射器ポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ、１１ Ｅｌｉｔｅ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ Ｓｙｒｉｎｇｅ Ｐｕｍｐ）を使用して、細胞懸濁液とフルオロカーボンオイルをそれぞれ０．５ｍＬ／ｈおよび２．０ｍＬ／ｈの一定流速で細胞内物質伝達プラットフォームに注入した。それぞれ別々に注入された細胞懸濁液とフルオロカーボンオイルはフローフォーカシングジャンクション（Ｆｌｏｗ ｆｏｃｕｓｉｎｇ ｊｕｎｃｔｉｏｎ）で出会い、液滴を生成しながら細胞が液滴内に捕捉される。該当液滴はフルオロカーボンオイルと共に液滴状態を維持しながらメインチャネルを通過する。この際、メインチャネルに接続されるサブチャネルからフルオロカーボンオイルが１６ｍＬ／ｈの速度で流入し、メインチャネル内で液滴の流れが加速する。また、サブチャネルを通じてフルオロカーボンオイルが追加で供給されることにより、メインチャネル内の液滴はフルオロカーボンオイルによって包まれて移動する。

次に、液滴はメインチャネル内に設置された圧縮ブロックを通過する際に液滴内の細胞の変形を誘導し、細胞膜にナノポアを形成した。液滴内に共存していた物質は、これらのナノポアを通じて細胞内に伝達されることが確認できた。

図１２は図１１に従った細胞内物質伝達プラットフォームで、圧縮ブロックのサイズによる細胞内物質伝達効率を確認した結果である。

図１２は図１１と同様の形状の細胞内物質伝達プラットフォームを使用し、内部に設置される圧縮ブロックのみを変えて細胞内物質伝達効率を確認した。この実験に使用された細胞懸濁液内には、伝達物質として２，０００ｋＤａ ＦＩＴＣ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｄｅｘｔｒａｎ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ＦＤ２０００Ｓ）を０．３ｍｇ／ｍＬの濃度で希釈し、各条件ごとに３回繰り返し実施した。細胞内物質伝達プラットフォームを通じて処理した細胞を１８時間培養後、流式細胞計測器（Ｍｅｒｃｋ、Ｇｕａｖａ ＥａｓｙＣｙｔｅ）を使用して対照群と比較しての伝達効率および平均蛍光強度の変化（Ｍｅａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ）を分析した。

図１２の細胞内物質伝達プラットフォームで圧縮ブロックが設置された部分で、メインチャネル内面と圧縮ブロックの間の隙間（Ｇａｐ ｈｅｉｇｈｔ）がそれぞれ６．３μｍ、４．８μｍ、および３．６μｍの３つの異なるものとした結果、６．３μｍ、４．８μｍ、および３．６μｍの順に細胞内物質伝達効率が増加することが確認でき、３．６μｍの時が最も高い結果を示した。また、圧縮ブロックの長さ（Ｓｑｕｅｅｚｉｎｇ ｌｅｎｇｔｈ）を４０μｍ、７０μｍ、および１００μｍにそれぞれ異なるものとして物質伝達の効率を確認した結果、１００μｍが最も優れていることが確認できた。この実験による圧縮ブロックによる細胞内物質伝達効率を以下の表１および表２に示した。

図１３は、図１１に基づく細胞内物質輸送プラットフォームで、輸送物質の種類に応じた細胞内物質輸送効率を確認した結果である。

図１３では、細胞懸濁液内の輸送物質として２，０００ｋＤａ ＦＩＴＣ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｄｅｘｔｒａｎ （Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ， ＦＤ２０００Ｓ）を０．３ ｍｇ／ｍＬの濃度で希釈したサンプルと、緑色蛍光タンパク質発現ｍＲＮＡ （ＥＧＦＰ ｍＲＮＡ； ＴｒｉＬｉｎｋ， Ｌ－７６０１）を２０μｇ／ｍＬの濃度で希釈したサンプルを使用して実験を行った。細胞内物質輸送プラットフォームを通じて処理した細胞において、２，０００ｋＤａ ＦＩＴＣ－Ｄｅｘｔｒａｎ輸送の場合は１８時間、ＥＧＦＰ ｍＲＮＡ輸送の場合は２４時間培養後にフローサイトメーター （Ｍｅｒｃｋ， Ｇｕａｖａ ＥａｓｙＣｙｔｅ）を使用して対照例と比較して輸送効率を分析した。光学顕微鏡 （Ｚｅｉｓｓ， Ａｘｉｏ Ｏｂｓｅｒｖｅｒ ７） およびカメラ（ＺＥＩＳＳ， Ａｘｉｏｃａｍ ３０５ ｍｏｎｏ）を使用して対照例と物質輸送サンプルのＢｒｉｇｈｔ ｆｉｅｌｄおよびＧＦＰイメージを取得し、蛍光発現の程度を定性的に比較した。

ここで、対照例は実施例と同じ濃度のＦＩＴＣ－ｄｅｘｔｒａｎまたはＥＧＦＰ－ｍＲＮＡを同じ時間露出させた細胞である。ＦＩＴＣ－ｄｅｘｔｒａｎまたはＥＧＦＰ－ｍＲＮＡを使用して細胞懸濁液状態で物質輸送を行ったもので、実施例に該当する細胞内物質輸送プラットフォームを使用せず、エンドサイトーシス（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）効果を確認した。

液滴および細胞内物質輸送プラットフォームを使用しない対照例の場合、２，０００ｋＤａ ＦＩＴＣ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｄｅｘｔｒａｎおよび蛍光タンパク質発現ｍＲＮＡ （ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｍＲＮＡ）の両側で、細胞内への物質輸送がほとんど発生していないことを確認することができた。一方、本発明による細胞内物質輸送プラットフォームを使用した場合、高い効率で細胞内への物質輸送が実行されることが確認できた。また、本実施例のように、細胞内へ輸送される物質の種類に関わらず、本発明の実施例に従う細胞内物質輸送プラットフォームを使用する場合に高い効率を示すことが確認できた。本実験による圧縮ブロックによる細胞内物質輸送効率を以下の表３に示した。

図１４は、従来の汎用装置を利用した細胞内遺伝子伝達結果を示す図面である。図１５はＥＭＸ１ターゲット遺伝子編集効率を従来の汎用装置と比較した結果である。図１４はＭａｘＣｙｔｅ （２０２１）で公開された細胞内物質伝達データであり、図１５は本発明の細胞内物質伝達プラットフォーム（ｄｒｏｐｌｅｔ）と、従来の汎用装置である電気穿孔装置（ＥＰ）およびリポソームナノ粒子（ＬＮＰ）を比較し、Ｋ５６２細胞のＥＭＸ１ターゲット遺伝子編集効率を確認したものである。

図１５の実験では、図１１の実験方法を採用し、細胞懸濁液内にＫ５６２細胞のＥＭＸ１発現遺伝子をターゲットとするｓｇＲＮＡ（Ｓｉｎｇｌｅ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）および内毒素（Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ）がないＣａｓ９タンパク質をそれぞれ５００ｐｍｏｌ添加した。当該細胞内物質伝達プラットフォームを通じて処理した細胞を４８時間培養後、ＤＮＡ抽出キット（Ｉｎｔｒｏｎｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｇ－ｓｐｉｎ（商標） Ｔｏｔａｌ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ）を利用してｇＤＮＡ（Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ）を抽出した。ｇＤＮＡは熱サイクラー（Ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ； Ｂｉｏ－Ｒａｄ， Ｔ１００）を利用してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を起こし増幅した。微量分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ， ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｏｎｅ）を利用して定量し、２００ｎｇのＰＣＲ産物に対して１０ＵのＴ７エンドヌクレアーゼ１（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ， Ｍ０３０２Ｓ）を３７℃で１５分間処理した後、電気泳動（Ｂｉｏ－Ｒａｄ， ＢＲ１６４－０３０２）を通じて遺伝子編集効率を分析した。リポソームナノ粒子（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ； Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００）および電気穿孔装置（ＴｈｅｍｏＦｉｓｈｅｒ， Ｎｅｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）を処理したＫ５６２細胞も同。

本発明による細胞内物質伝達プラットフォーム（ｄｒｏｐｌｅｔ）は、遺伝子編集効率が電気穿孔装置（ＥＰ）、およびリポソームナノ粒子（ＬＮＰ）に比べて非常に優れていたことが示され、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ ｅｄｉｔｉｎｇ（二つ以上のターゲット編集）の高効率編集が可能であることが確認された。また、本実施例の細胞内物質伝達プラットフォームはＨＤＲ（Ｈｏｍｏｌｏｇｙ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｒｅｐａｉｒ）の高効率編集が可能であった。すなわち、本発明による細胞内物質伝達プラットフォームは、細胞の損傷なく従来技術に比べて高い効率で細胞内へ物質を伝達することができ、多様な細胞に対しても制約なく適用できることが確認された。

図１６は、液滴分離型細胞内物質伝達プラットフォームを利用して細胞内物質伝達を確認した結果である。図１６は、図７に基づく液滴分離型細胞内物質伝達プラットフォームを利用したものである。

図１６で使用された液滴分離型細胞内物質伝達プラットフォームの製造方法は、前述した図１１に基づく細胞内物質伝達プラットフォームと同じ方法で製造された。

図１６の細胞内物質伝達プラットフォームは、液滴が形成されて移動するメインチャネルで液滴が形成される部分であるインレットで、直線通路の長さは１．４ ｍｍおよび平均内径は０．４ ｍｍであり、続く曲がり通路の長さは２．５１ ｍｍおよび平均内径は０．２ ｍｍであり、さらに続く直線通路の長さは１ ｍｍおよび平均内径は０．２ ｍｍである。ここに一対のブランチ部が接続されており、ブランチ部の通路は平均内径が０．０９ ｍｍで接続されている。ここで、プレスブロックの高さは８ μｍで、長さは７０ μｍである。

本実験で使用された細胞懸濁液にはＫ５６２細胞（ＡＴＣＣ， ＣＣＬ－２４３）が含まれており、これに輸送物質である３ｋＤａ ＦＩＴＣ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｄｅｘｔｒａｎ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，ＦＤ４）を０．３ ｍｇ／ｍＬの濃度で希釈した。細胞内物質伝達プラットフォーム運転後に取得した細胞が閉じ込められた液滴をＰＦＯ溶液（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ， １Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ－Ｐｅｒｆｌｕｏｒｏ－１－ｏｃｔａｎｏｌ）を使用した脱乳化（ｄｅｍｕｌｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ）プロセスを通じて細胞を分離した。該当細胞の生存率を自動細胞カウンター（Ｌｏｇｏｓ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｌｕｎａ－ＦＸ７）で測定し、８０％前後の細胞生存率を確認することができた。また、該当細胞を１８時間培養後、フローサイトメーター（ＢＤ， ＦＡＣＳＬｙｒｉｃ）で分析した。対照例と比較して９０％以上の伝達効率と１００倍以上の平均蛍光強度変化（Ｍｅａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ）の結果を確認することができた。光学顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ， Ａｘｉｏ Ｏｂｓｅｒｖｅｒ ７）およびカメラ（ＺＥＩＳＳ， Ａｘｉｏｃａｍ ３０５ ｍｏｎｏ）を使用して対照例と物質伝達サンプルのＢｒｉｇｈｔ ｆｉｅｌｄおよびＧＦＰイメージを得て、蛍光発現の程度を定性的に比較した結果も、本実施例に従う細胞内物質伝達プラットフォームを使用した場合、より高い物質伝達効率を示すことが確認された。ここで対照例は、実施例と同じ濃度の輸送物質を同じ時間露出させた細胞を使用して細胞懸濁液状態で物質伝達を行ったもので、実施例に該当する細胞内物質伝達プラットフォームを使用せず、エンドサイトーシス（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）の影響による物質伝達効果を確認した結果である。

本発明が属する技術分野の通常の知識を持つ者は、本発明がその技術的思想や必須的な特徴を変更せずに他の具体的な形態で実施されることができることを理解できるだろう。したがって、上述した実施例はすべての面で例示的なものであり、限定的ではないものと理解されるべきである。本発明の範囲は、上記詳細な説明よりも後述する特許請求の範囲によって示されるものであり、特許請求の範囲の意味及び範囲およびそれに基づいて導出されるすべての変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。

１００， ２００， ３００， ４００， ５００ ： 細胞内物質伝達プラットフォーム
１１０， ２１０， ３１０， ４１０， ５１０ ： メインチャネル
１２０， ２２０， ３２０， ４２０， ５２０ ： 第１供給部
１３０， ２３０， ３３０， ４３０ ： 第２供給部

Claims (25)

1. 細胞内物質伝達プラットフォームであって、一端から他端に第１方向へ延長され、内部に流体の通路が備えられた一つ以上のメインチャネル；前記メインチャネルの一端に接続され、前記細胞及び物質を含む第１流体を注入する第１供給部；および前記メインチャネルの一端に接続され、前記第１流体と混合されない第２流体を注入する第２供給部；を含み、前記メインチャネルの内部には一つ以上の圧縮ブロック（ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｎｇ ｂｌｏｃｋ）が含まれ、
   前記圧縮ブロックが位置する領域における前記メインチャネルの内径は第１直径として定められており、
   前記メインチャネルには、
   前記第１供給部に接続されるインレット部；
   前記インレット部に接続されるが複数の通路に分岐されるブランチ部；および
   前記ブランチ部に接続されるアウトレット部；
   が備えられる、細胞内物質伝達プラットフォーム。
2. 前記第１流体は水相（ｗａｔｅｒ ｐｈａｓｅ）であり、前記第２流体は油相（ｏｉｌ ｐｈａｓｅ）である、請求項１に記載の細胞内物質伝達プラットフォーム。
3. 前記第１供給部は前記第１方向に対して平行に延長されて前記メインチャネルの一端に接続され、前記第２供給部は前記メインチャネルの一端で前記第１供給部に対して角度を持って接続される、請求項１に記載の細胞内物質伝達プラットフォーム。
4. 前記第１供給部から前記第１流体は前記メインチャネルの一端へ伝達され、前記第２供給部から前記第２流体は前記メインチャネルの一端へ伝達されるが、前記第１流体の流れ方向に対して角度を持って伝達され、前記細胞、物質を含む第１流体は液滴として形成され、前記液滴は前記第２流体内で前記メインチャネルを通過する、請求項３に記載の細胞内物質伝達プラットフォーム。
5. 前記第２供給部は第１および第２供給チャネルを含み、前記第１および第２供給チャネルは前記メインチャネルの一端に接続されジャンクション（ｊｕｎｃｔｉｏｎ）を形成する、請求項３に記載の細胞内物質伝達プラットフォーム。
6. 前記圧縮ブロックは前記メインチャネルの一端から第１長さで離隔された部分に備えられ、前記メインチャネルの一端から他端までの全体長さに対して前記第１長さは３０％から９０％である、請求項１に記載の細胞内物質伝達プラットフォーム。
7. 前記メインチャネルで前記第２流体の流速は１ｍＬ／ｈから７０ｍＬ／ｈである、請求項１に記載の細胞内物質伝達プラットフォーム。
8. 前記メインチャネルに角度を持って接続され、前記第２流体が流動する一つ以上のサブチャネルを更に含む、請求項１に記載の細胞内物質伝達プラットフォーム。
9. 前記サブチャネルは第１および第２サブチャネルを含み、前記メインチャネルの一端から第２長さで離隔された部分で前記メインチャネルに接続され、前記第１および第２サブチャネルは前記メインチャネルの一側及び他側にそれぞれ接続される、請求項８に記載の細胞内物質伝達プラットフォーム。
10. 前記サブチャネルの内径は前記メインチャネルの内径である第１直径に対して２０％から１５０％で備えられ、前記サブチャネルを通じて前記第２流体が前記メインチャネルへ伝達される、請求項９に記載の細胞内物質伝達プラットフォーム。
11. 前記サブチャネルの内径は２０μｍから２００μｍであり、前記メインチャネルの内径である第１直径は２０μｍから１．５ｍｍであり、前記サブチャネルを通じて前記第２流体が前記メインチャネルへ伝達される、請求項１０に記載の細胞内物質伝達プラットフォーム。
12. 前記メインチャネルで前記第２流体の流速は１ｍＬ／ｈから４５ｍＬ／ｈであり、前記サブチャネルで前記第２流体の流速は１ｍＬ／ｈから３０ｍＬ／ｈである、請求項９に記載の細胞内物質伝達プラットフォーム。
13. 前記圧縮ブロックは前記メインチャネルの一端から第１長さで離隔された部分に備えられ、前記第１長さは前記第２長さに対して１．１倍から５倍で備えられる、請求項９に記載の細胞内物質伝達プラットフォーム。
14. 前記第１直径は２０μｍから１．５ｍｍであり、前記第１長さは０．１ｍｍから３０ｍｍであり、前記第２長さは０．１ｍｍから１．５ｍｍである、請求項１３に記載の細胞内物質伝達プラットフォーム。
15. 前記圧縮ブロックは前記第１方向に平行な方向の長さが１０μｍから２００μｍである、請求項１に記載の細胞内物質伝達プラットフォーム。
16. 前記圧縮ブロックは前記第１方向に平行な方向の長さが２０μｍから１００μｍである、請求項１５に記載の細胞内物質伝達プラットフォーム。
17. 前記圧縮ブロックと前記メインチャネル内面との間隔（ｇａｐ）は第２直径で備えられ、前記第２直径は前記メインチャネルの内径である第１直径に対して０．１％から８５％で備えられる、請求項１に記載の細胞内物質伝達プラットフォーム。
18. 前記第２直径は２μｍから１７μｍである、請求項１７に記載の細胞内物質伝達プラットフォーム。
19. 前記圧縮ブロックの前記第１方向に垂直な方向の高さは前記第１直径に対して１５％から９９％で備えられる、請求項１に記載の細胞内物質伝達プラットフォーム。
20. 前記圧縮ブロックの前記第１方向に垂直な方向の高さは３μｍから１．５ｍｍである、請求項１９に記載の細胞内物質伝達プラットフォーム。
21. 前記ブランチ部は前記インレット部および前記アウトレット部よりも小さい直径で備えられる複数の通路、および前記複数の通路が互いに分岐されたり接続されるリンクを含み、前記圧縮ブロックは前記ブランチ部または前記アウトレット部に備えられる、請求項１に記載の細胞内物質伝達プラットフォーム。
22. 前記メインチャネル内には前記細胞、物質及び第１流体で形成された液滴が前記第２流体を通じて前記インレット部から前記ブランチ部を通して前記アウトレット部へ伝達され、前記インレット部に備えられる液滴は前記ブランチ部または前記アウトレット部に備えられる液滴よりも平均直径がより大きく備えられる、請求項２１に記載の細胞内物質伝達プラットフォーム。
23. 前記ブランチ部は前記インレット部と前記アウトレット部を接続する仮想の基準線を中心に互いに対称的な形状で備えられる、請求項２１に記載の細胞内物質伝達プラットフォーム。
24. 前記メインチャネルは前記インレット部またはブランチ部に備えられる一つ以上の曲がり通路を更に含む、請求項２１に記載の細胞内物質伝達プラットフォーム。
25. 前記物質は核酸、タンパク質、転写因子、ベクター、プラスミド、及びナノ粒子のいずれか一つ以上を含む、請求項１に記載の細胞内物質伝達プラットフォーム。