KR102679742B1 - 액적 기반 세포 내 물질 전달 플랫폼 - Google Patents

액적 기반 세포 내 물질 전달 플랫폼 Download PDF

Info

Publication number
KR102679742B1
KR102679742B1 KR1020240010157A KR20240010157A KR102679742B1 KR 102679742 B1 KR102679742 B1 KR 102679742B1 KR 1020240010157 A KR1020240010157 A KR 1020240010157A KR 20240010157 A KR20240010157 A KR 20240010157A KR 102679742 B1 KR102679742 B1 KR 102679742B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
main channel
fluid
mass transfer
intracellular
transfer platform
Prior art date
Application number
KR1020240010157A
Other languages
English (en)
Inventor
정아람
주병주
이주희
Original Assignee
(주)엠엑스티바이오텍
고려대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by (주)엠엑스티바이오텍, 고려대학교 산학협력단 filed Critical (주)엠엑스티바이오텍
Application granted granted Critical
Publication of KR102679742B1 publication Critical patent/KR102679742B1/ko

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502769—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by multiphase flow arrangements
    • B01L3/502784—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by multiphase flow arrangements specially adapted for droplet or plug flow, e.g. digital microfluidics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M35/00—Means for application of stress for stimulating the growth of microorganisms or the generation of fermentation or metabolic products; Means for electroporation or cell fusion
    • C12M35/04—Mechanical means, e.g. sonic waves, stretching forces, pressure or shear stimuli
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/06—Fluid handling related problems
    • B01L2200/0647—Handling flowable solids, e.g. microscopic beads, cells, particles
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0861—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices
    • B01L2300/0877—Flow chambers
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0475—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific mechanical means and fluid pressure
    • B01L2400/0481—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific mechanical means and fluid pressure squeezing of channels or chambers

Abstract

본 발명은 세포내 물질을 전달하는 장치로, 일단에서 타단으로 제1 방향으로 연장되고, 내부에 유체의 통로가 구비된 하나 이상의 메인채널; 상기 메인채널의 일단에 연결되어 상기 세포 및 물질을 포함하는 제1 유체를 주입하는 제1 공급부; 및 상기 메인채널의 일단에 연결되어 상기 제1 유체와 혼합되지 않는 제2 유체를 주입하는 제2 공급부;를 포함하고, 상기 메인채널의 내부에는 하나 이상의 압착블록이 구비되는 것인 세포 내 물질 전달 플랫폼에 관한 것이다.

Description

액적 기반 세포 내 물질 전달 플랫폼 {Platform for intracellular delivery using droplet microfluidics}
본 발명은 액적 기반 세포 내 물질 전달 플랫폼에 관한 것으로, 보다 상세하게는 세포의 손상 없이 높은 효율로 세포 내로 물질을 효과적으로 전달할 수 있는 액적 기반 세포 내 물질 전달 플랫폼에 관한 것이다.
세포 내 물질 전달은 세포공학의 가장 기본이 되는 실험 중 하나로 보통 캐리어를 이용하거나 세포막/핵막에 나노구멍 (nanopore)을 만들어 물질을 전달한다.
바이러스 또는 Lipofectamine 중심의 캐리어 기법들은 최적화 시 고효율 물질 전달이 가능하나 안전성, 느린 전달 속도, 노동/비용 집약적인 캐리어 준비 과정, 낮은 재현성 등의 문제점들이 존재한다.
이에 반하여 세포막에 에너지를 가하여 나노구멍을 만드는 방법들 (예: Electroporation 또는 microneedle)은 상대적으로 여러 물질을 다양한 세포주로 전달이 가능한 장점이 있다. 그러나 이와 같은 방법은 침습성으로 인한 낮은 세포 생존율, 전달 물질의 변성 그리고 낮은 처리량이 큰 한계로 지적되고 있다.
이러한 문제점들을 해결하고자 대량의 세포처리가 가능한 미세유체 기기들의 사용이 두드러진다. 대표적으로 미세관에 병목 구간을 만들고 세포들이 병목 구간을 지날 때 세포의 물리적 변형을 통해 세포막에 나노포어를 만드는 플랫폼이 존재한다. 그러나, 이 접근법은 실험 진행 시 병목 구간 자체가 막히고, 일정하지 못한 물질 전달 효율 등의 큰 단점들을 가진다.
따라서, 다양한 세포에 대해서 다양한 물질을 전달하면서, 세포에 손상이 없이 높은 효율로 물질을 전달할 수 있는 방법에 대해서 다양한 연구가 수행되고 있다.
본 발명의 목적은 다양한 세포에 대해서 높은 효율로 물질을 전달할 수 있는 액적 기반 세포 내 물질 전달 플랫폼을 제공하기 위한 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 전달하고자 하는 물질의 불필요한 로스 (loss)를 감소시키고, 연속적으로 다량의 세포를 처리할 수 있는 세포 내 물질 전달 플랫폼을 제공하기 위함이다.
본 발명의 일측면에 따르면, 본 발명의 실시예들은 세포 내 물질 전달 플랫폼을 포함한다.
일 실시예에 있어서, 세포내 물질을 전달하는 장치로, 일단에서 타단으로 제1 방향으로 연장되고, 내부에 유체의 통로가 구비된 하나 이상의 메인 채널; 상기 메인채널의 일단에 연결되어 상기 세포 및 물질을 포함하는 제1 유체를 주입하는 제1 공급부; 및 상기 메인채널의 일단에 연결되어 상기 제1 유체와 혼합되지 않는 제2 유체를 주입하는 제2 공급부;를 포함하고, 상기 메인채널의 내부에는 하나 이상의 압착블록 (compressing block)이 구비되는 세포 내 물질 전달 플랫폼을 포함한다.
일 실시예에 있어서, 상기 제1 유체는 수상 (water phase)이고, 상기 제2 유체는 유상 (oil phase)일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 제1 공급부는 상기 제1 방향에 대해서 나란하게 연장되어 상기 메인채널의 일단에 연결되고, 상기 제2 공급부는 상기 메인채널의 일단에서 상기 제1 공급부에 대해서 각도를 갖도록 연결될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 제1 공급부에서 상기 제1 유체는 상기 메인채널의 일단으로 전달되고, 상기 제2 공급부에서 상기 제2 유체는 상기 메인채널의 일단으로 전달되되 상기 제1 유체의 흐름방향에 대해서 각도를 갖도록 전달되어 상기 세포, 물질을 포함하는 제1 유체는 액적으로 형성되고, 상기 액적은 상기 제2 유체 내에서 상기 메인채널을 통과할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 제2 공급부는 제1 및 제2 공급채널을 포함하고, 상기 제1 및 제2 공급채널은 상기 메인채널의 일단에 연결되어 정션 (junction)을 형성할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 압착블록은 상기 메인채널의 일단에서 제1 길이로 이격된 부분에 구비되고, 상기 메인채널의 일단에서 타단까지의 전체길이에 대해서 상기 제1 길이는 30 % 내지 90 % 일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 메인채널에서 상기 제2 유체의 유속은 1 mL/h 내지 70 mL/h일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 메인채널에 각도를 갖도록 연결되고, 상기 제2 유체가 유동하는 하나 이상의 서브채널을 더 포함할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 서브채널은 상기 메인채널의 일단에서 제2 길이로 이격된 부분에서 상기 메인채널에 연결되되, 제1 및 제2 서브채널을 포함하고, 상기 제1 및 제2 서브채널은 상기 메인채널의 일측 및 타측에 각각 연결될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 서브채널의 내경은 상기 메인채널의 내경인 제1 직경에 대해서 20 % 내지 150 %로 구비되고, 상기 서브채널을 통하여 상기 제2 유체가 상기 메인채널로 전달될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 서브채널의 내경은 20 ㎛ 내지 200 ㎛이고, 상기 메인채널의 내경인 제1 직경은 20 ㎛ 내지 1.5 mm이고, 상기 서브채널을 통하여 상기 제2 유체가 상기 메인채널로 전달될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 메인채널에서 상기 제2 유체의 유속은 1 mL/h 내지 45 mL/h이고, 상기 서브채널에서 상기 제2 유체의 유속은 1 mL/h 내지 30 mL/h일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 압착블록은 상기 메인채널의 일단에서 제1 길이로 이격된 부분에 구비되고, 상기 제1 길이는 상기 제2 길이에 대해서 1.1 배 내지 5 배일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 제1 직경은 20 ㎛ 내지 1.5 mm이고, 상기 제1 길이는 0.1 mm 내지 30 mm이고, 상기 제2 길이는 0.1 mm 내지 1.5 mm일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 압착블록은 상기 제1 방향으로 나란한 방향의 길이는 10 ㎛ 내지 200 ㎛ 일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 압착블록은 상기 제1 방향으로 나란한 방향의 길이는 20 ㎛ 내지 100 ㎛ 일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 압착블록과 상기 메인채널 내면 사이의 간격 (gap)는 제2 직경으로 구비되고, 상기 제2 직경은 상기 메인채널의 내경인 제1 직경에 대해서 0.1 % 내지 85 %일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 제2 직경은 2 ㎛ 내지 17 ㎛일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 압착블록의 상기 제1 방향에 수직하는 방향의 높이는 상기 제1 직경에 대해서 15 % 내지 99 %일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 압착블록의 상기 제1 방향에 수직하는 방향의 높이는 3 ㎛ 내지 1.5 mm 일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 메인채널은, 상기 제1 공급부와 연결되는 인렛부; 상기 인렛부에 연결되되 복수개의 통로로 분기되는 브랜치부; 및 상기 브랜치부에 연결되는 아웃렛부;를 포함하고, 상기 브랜치부는 상기 인렛부 및 상기 아웃렛부보다 작은 직경으로 구비되는 복수개의 통로, 및 상기 복수개의 통로가 서로 분기되거나 연결되는 링크를 포함하고, 상기 압착블록은 상기 브랜치부 또는 상기 아웃렛부에 구비될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 메인채널 내에는 상기 세포, 물질 및 제1 유체로 형성된 액적이 상기 제2 유체를 통하여 상기 인렛부에서 상기 브랜치부를 통해서 상기 아웃렛부로 전달되고, 상기 인렛부에 구비되는 액적은 상기 브랜치부 또는 상기 아웃렛부에 구비되는 액적보다 평균직경이 더 크게 구비될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 브랜치부는 상기 인렛부와 상기 아웃렛부를 연결하는 가상의 기준선을 중심으로 서로 대칭되는 형태로 구비될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 메인채널은 상기 인렛부 또는 브랜치부에 구비되는 하나 이상의 굴곡통로를 더 포함할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 물질은 핵산, 단백질, 전사인자, 벡터,　플라스미드, 유전자 가위 물질 및 나노입자 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
이상 살펴본 바와 같은 본 발명에 따르면, 다양한 세포에 대해서 세포의 손상을 방지하면서 세포 내로 물질을 전달할 수 있는 고효율의 세포 내 물질 전달 플랫폼을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명에 따르면 신규한 방법을 이용하여 물질을 종류에 제한 없이 세포 내로 전달할 수 있으며, 다양한 물질을 하나의 세포 내로, 혹은 하나의 물질을 다양한 세포 내로 전달할 수 있는 대량생산이 용이한 세포 내 물질 전달 플랫폼을 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 내 물질 전달 플랫폼의 개략도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 내 물질 전달 플랫폼을 나타낸 도면이다.
도 3은 도 2의 단면도이다.
도 4는 본 발명의 다른 실시예에 따른 세포 내 물질 전달 플랫폼을 나타낸 도면이다.
도 5는 도 4의 단면도이다.
도 6은 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 세포 내 물질 전달 플랫폼을 나타낸 도면이다.
도 7은 본 발명의 기타 실시예에 따른 세포 내 물질 전달 플랫폼을 나타낸 도면이다.
도 8은 도 7의 메인 채널의 확대도이다.
도 9는 도 7의 브랜치부를 나타낸 도면이다.
도 10은 본 발명의 그 외의 실시예에 따른 세포 내 물질 전달 플랫폼을 나타낸 도면이다.
도 11은 본 실시예에 따른 세포 내 물질 전달 플랫폼을 이용하여 세포 내 물질전달을 확인한 도면이다.
도 12는 도 11에 따른 세포 내 물질 전달 플랫폼에서 압착블록의 크기에 따른 세포 내 물질전달 효율을 확인한 결과이다.
도 13은 도 11에 따른 세포 내 물질 전달 플랫폼에서 전달물질의 종류에 따른 세포 내 물질전달 효율을 확인한 결과이다.
도 14는 종래 범용 장치를 이용한 세포 내 유전자 전달 결과를 나타낸 도면이다.
도 15는 EMX1 타겟 유전자 편집 효율을 종래 범용 장치와 비교한 결과이다.
도 16은 액적 분리형 세포 내 물질 전달 플랫폼을 이용하여 세포 내 물질전달을 확인한 결과이다.
기타 실시예들의 구체적인 사항들은 상세한 설명 및 도면들에 포함되어 있다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있으며, 이하의 설명에서 달리 명시되지 않는 한, 본 발명에 성분, 반응 조건, 성분의 함량을 표현하는 모든 숫자, 값 및/또는 표현은, 이러한 숫자들이 본질적으로 다른 것들 중에서 이러한 값을 얻는 데 발생하는 측정의 다양한 불확실성이 반영된 근사치들이므로, 모든 경우 "약"이라는 용어에 의해 수식되는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본 기재에서 수치범위가 개시되는 경우, 이러한 범위는 연속적이며, 달리 지적되지 않는 한 이러한 범위의 최소값으로부터 최대값이 포함된 상기 최대값까지의 모든 값을 포함한다. 더 나아가, 이러한 범위가 정수를 지칭하는 경우, 달리 지적되지 않는 한 최소값으로부터 최대값이 포함된 상기 최대값까지를 포함하는 모든 정수가 포함된다
또한, 본 발명에서 범위가 변수에 대해 기재되는 경우, 상기 변수는 상기 범위의 기재된 종료점들을 포함하는 기재된 범위 내의 모든 값들을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 예를 들면, "5 내지 10"의 범위는 5, 6, 7, 8, 9, 및 10의 값들뿐만 아니라 6 내지 10, 7 내지 10, 6 내지 9, 7 내지 9 등의 임의의 하위 범위를 포함하고, 5.5, 6.5, 7.5, 5.5 내지 8.5 및 6.5 내지 9 등과 같은 기재된 범위의 범주에 타당한 정수들 사이의 임의의 값도 포함하는 것으로 이해될 것이다. 예를 들면, "10% 내지 30%"의 범위는 10%, 11%, 12%, 13% 등의 값들과 30%까지를 포함하는 모든 정수들 뿐만 아니라 10% 내지 15%, 12% 내지 18%, 20% 내지 30% 등의 임의의 하위 범위를 포함하고, 10.5%, 15.5%, 25.5% 등과 같이 기재된 범위의 범주 내의 타당한 정수들 사이의 임의의 값도 포함하는 것으로 이해될 것이다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 내 물질 전달 플랫폼의 개략도이다. 도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 내 물질 전달 플랫폼을 나타낸 도면이다. 도 3은 도 2의 단면도이다.
본 발명의 일 실시예는 세포 내로 물질을 전달하는, 세포 내 물질 전달 플랫폼 (100)에 대한 것으로, 일단에서 타단으로 제1 방향 (x)으로 연장되고, 내부에 유체의 통로가 구비된 하나 이상의 메인채널 (110); 상기 메인채널 (110)의 일단에 연결되어 상기 세포 (10), 물질 (20) 및 제1 유체를 주입하는 제1 공급부 (120); 및 상기 메인채널 (110)의 일단에 연결되어 상기 제1 유체와 혼합되지 않는 제2 유체를 주입하는 제2 공급부 (130);를 포함한다.
상기 메인채널 (110)의 내부에는 하나 이상의 압착블록 (compressing block) (150)이 구비되고, 상기 제1 유체는 수상 (water phase)이고, 상기 제2 유체는 유상 (oil phase)일 수 있다.
본 실시예에 따른 세포 내 물질 전달 플랫폼 (100)은 서로 혼합되지 않은 제1 유체와 제2 유체를 이용하여 액적을 형성하되, 상기 액적 (50) 내에 세포 (10)와 상기 세포 내로 전달하고자 하는 물질 (20)을 포획할 수 있다. 상기 액적 (50)은 상기 제1 유체와 동일한 물질로 형성되어, 상기 제2 유체 내에서 액적 (50) 형태를 유지하면서 상기 세포 (10)와 물질 (20)을 이동시킬 수 있다.
통상 세포 내로 물질을 전달하는 방법은 전기천공을 이용하여 세포막을 손상시키는 등 세포에 영구적인 흔적을 남긴다. 또한, 세포와 물질을 유체 내에서 흐르게 하면서 세포에 직접적으로 외력을 가하여 세포 내로 물질을 전달하는 방법은, 세포에 손상을 유발하거나, 세포 내로 전달되는 물질의 효율이 낮다는 단점이 있다.
반면, 본 실시예에 따른 세포 내 물질 전달 플랫폼 (100)은 액적 (50)을 이용함으로써, 세포 (10)의 손상을 방지하면서, 세포 내로 물질 (20)을 효과적으로 전달할 수 있다. 상기 세포 내 물질 전달 플랫폼 (100)에서, 상기 액적 (50)에 의하여 세포 (10)와 물질 (20)은 보호받으면서, 동시에 유체 내에서 효율적으로 유동할 수 있다. 또한, 액적 (50)에 의하여 세포 (10)와 물질 (20) 사이의 거리가 인접하게 유지됨으로써, 물질 (20)이 외부로 로스 (loss)되지 않고, 효율적으로 세포 (10) 내로 전달될 수 있다.
본 실시예에 따른 세포 내 물질 전달 플랫폼 (100)은 압착블록 (150)을 더 포함할 수 있다. 상기 압착블록 (150)은 메인채널 (110) 내부에 구비되어, 상기 메인채널 (110) 내부의 실질적인 직경을 감소시킬 수 있다. 구체적으로, 상기 액적 (50)은 제2 유체에 의하여 소정의 속도로 상기 메인채널 (110)을 통과하되, 상기 압착블록 (150)이 형성된 부분에서 액적 (50)이 가압되면서 통과하게 된다. 상기 액적 (50)이 상기 압착블록 (150)을 통과하는 과정에서, 세포 (10)의 변형이 발생하면서 세포막 또는 핵막에 상기 물질 (20)이 통과할 수 있는 나노포어가 형성되고, 상기 나노포어를 통하여 상기 물질 (20)은 상기 세포 (10) 내로 효과적으로 전달될 수 있다. 또한, 상기 압착블록 (150)을 통과한 액적 (50)은 형상을 회복하면서 상기 액적 (50) 내에서 와류 (vortex)가 형성되고, 상기 와류는 물질 (20)이 상기 세포 (10) 내로 전달되는 추진력을 제공하여 세포 내 물질 전달의 효율을 향상시킬 수 있다. 또한, 상기 압착블록 (150)을 통과한 후 변형된 세포 (10)는 이전 형상으로 회복되고 내부에는 물질 (20)을 포함한다.
상기 액적 (50)은 매우 적은 부피로 대략 ~100 pL/세포로 구비될 수 있다. 상기 메인채널 (110) 내에서, 상기 액적 (50)의 부피에 따라 전달하고자 하는 물질 (20)의 양이 결정될 수 있다. 통상, 세포 내 물질 전달 시스템에서는 세포와 전달하고자 하는 물질 사이의 간격이 멀어서 상기 세포 내의 물질 전달 효율이 저하되거나, 혹은 세포 주변 물질의 농도를 높이기 위해서는 다량의 물질이 소비되고 그 외의 물질은 버려지게 되므로 비효율적으로 공정이 수행되었다. 반면, 본 실시예에 따른 세포 내 물질 전달 플랫폼 (100)은 액적 (50)이라는 작은 시스템 내에서 세포 (10)와 물질 (20)이 존재하고, 상기 세포 (10)와 물질 (20)이 근거리 내에서 위치하므로, 극소량의 물질 (20)만으로도 세포 (10) 내로 효율적으로 전달할 수 있어 물질 (20)의 불필요한 로스 (loss)를 감소시킬 수 있다.
본 실시예에 따른 세포 내 물질 전달 플랫폼 (100)에서, 상기 액적 (50)의 부피는 미량으로 이루어지고, 상기 액적 (50) 내에서 상기 세포 (10)는 고농도의 물질 (20)의 환경으로 구비될 수 있다. 상기 액적 (50)이 압착블록 (150)을 통과하면서 세포 (10)의 변형에 의하여 나노포어가 형성되는 경우, 매우 적은 부피의 액적 (50)만으로도 효과적으로 세포 (10) 내로 물질 전달이 가능하다. 또한, 압착블록 (150)을 통과한 후에도 액적 (50)의 형상은 유지되고, 액적 (50) 내에서 와류와 같은 이차 유동은 물질 (20)이 세포 (10) 내로 보다 효과적으로 전달될 수 있도록 추진력을 제공할 수 있다.
상기 세포 내 물질 전달 플랫폼 (100)은 종래 기술에서는 가능하지 않았던 거대 나노입자 (larger nanoparticle), 플라스미드 (plasmid) DNA 등의 대분자 (macromolecule)에서도 적용이 가능하며, 종래 기술에서 세포를 미세관 또는 상기 미세관의 좁은 통로 (병목)를 통과시킨 방법에서 발생한 막힘현상과 높은 유속을 이용함에 따른 세포의 낮은 생존율 등의 문제를 방지할 수 있다.
본 실시예에 따른 세포 내 물질 전달 플랫폼 (100)에서, 상기 메인채널 (110)의 내벽은 소수성으로 이루어질 수 있다. 상기 메인체널 (110)에서 상기 액적 (50)을 유동시키는 제2 유체는 소수성으로 이루어짐으로써, 상기 제2 유체가 상기 메인채널 (110) 내에서 용이하게 유동할 수 있다. 또한, 상기 액적 (50)은 친수성으로 이루어짐으로써 상기 메인채널 (110)과 친수성 및 소수성 차이로 인하여 막힘현상을 최소화할 수 있다.
본 실시예에 따른 세포 내 물질 전달 플랫폼 (100)은 막힘현상이 발생하지 않아 세포 내 물질 전달을 높은 효율로 수행할 수 있으며, 또한 적정 유속으로 세포를 이동시킴으로써 높은 세포 생존율을 나타낼 수 있다.
상기 제1 공급부 (120)는 상기 제1 방향 (x)에 대해서 나란하게 연장되어 상기 메인채널 (110)의 일단에 연결되고, 상기 제2 공급부 (130)는 상기 메인채널 (110)의 일단에서 상기 제1 공급부 (120)에 대해서 각도를 갖도록 연결될 수 있다. 예컨대, 상기 제1 공급부 (120)와 상기 메인채널 (110)이 서로 연장되어 수평하게 연결되고, 상기 제2 공급부 (130)는 상기 메인채널 (110)에 대해서 소정의 각도로 연결될 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 제2 공급부 (130)는 상기 메인채널 (110)과 수직하게 연결될 수 있다.
상기 제1 공급부 (120)의 일단은 상기 메인채널 (110)의 일단과 연결되고, 상기 제1 공급부 (120)의 타단은 제1 공급챔버 (121)과 연결될 수 있다. 상기 제1 공급챔버 (121)에는 제1 유체, 세포 (10), 물질 (20)이 구비되어, 상기 제1 유체, 세포 (10), 물질 (20)을 상기 제1 공급부 (120)로 전달할 수 있다.
상기 제2 공급부 (130)의 일단은 상기 메인채널 (110)의 일단과 연결되고, 상기 제2 공급부 (130)의 타단은 제2 공급챔버 (131)과 연결될 수 있다. 상기 제2 공급챔버 (131)에는 제2 유체가 구비되어 소정의 유속으로 상기 제2 공급부 (130)로 전달될 수 있다.
상기 제1 공급부 (120)에서 상기 제1 유체, 세포 (10), 물질 (20)은 상기 메인챔버 (110)의 일단으로 전달되고, 상기 제2 공급부 (130)에서 상기 제2 유체는 상기 메인챔버 (110)의 일단으로 상기 제1 유체의 흐름방향에 대해서 각도를 갖도록 전달됨으로써, 상기 세포 (10), 물질 (20)을 포함하는 제1 유체는 액적 (50)으로 형성될 수 있다. 상기 액적 (50)은 상기 제2 유체와 함께 상기 메인채널 (110)의 일단에서 타단을 향하여 흐르면서, 상기 메인채널 (110)의 압착블록 (150)을 통과할 수 있다.
상기 제1 공급부 (120)의 제1 유체의 유속, 또는 상기 제2 공급부 (120)의 제2 유체의 유속을 제어함으로써, 상기 액적 (50)의 크기 및 이동속도를 제어할 수 있다. 본 실시예에 따른 세포 내 물질 전달 플랫폼 (100)은 다양한 크기의 세포 (10) 또는 전달하고자 하는 물질 (20)의 종류에 따라 상기 액적 (50)의 크기 및 이동속도를 제어하여 세포 내 물질 전달 효율을 향상시킬 수 있다.
구체적으로, 상기 제2 공급부 (130)는 제1 및 제2 공급채널을 포함할 수 있다. 상기 제1 및 제2 공급채널은 상기 제1 공급부 (120)에 대해서 일측 및 타측에 각각 구비된 한쌍의 미세채널일 수 있다. 상기 제1 및 제2 공급채널은 상기 메인채널 (110)의 일단에 연결되어 십자형, Y자형 또는 T자형 정션 (junction) (140)을 형성할 수 있다.
구체적으로, 상기 제1 공급부 (120)는 연장되어 상기 메인채널 (110)에 연결될 수 있다. 상기 제1 공급부 (120)와 상기 메인채널 (110)이 연결되는 부분에 상기 제1 공급채널이 상부에서 수직하게 연결되고, 상기 제2 공급채널이 하부에서 수직하게 연결될 수 있다. 상기 제1 공급부 (120)을 통하여 전달되는 제1 유체는 상기 정션 (140)에서, 상기 제1 및 제2 공급채널에서 전달되는 제2 유체에 의하여 액적 (50)으로 형성되고, 상기 제2 유체는 상기 액적 (50)과 함께 상기 메인채널 (110)로 유동할 수 있다.
상기 메인채널 (110) 내면에는 상기 압착블록 (150)이 구비될 수 있다. 상기 압착블록 (150)은 상기 메인채널 (110)의 내면 상부, 하부 및 측면 중 어느 일측에 구비되어 상기 메인채널 (110)의 통로를 감소시킬 수 있다. 상기 압착블록 (150)은 상기 제2 유체의 흐름이 방해받지 않도록 표면이 소수성으로 형성될 수 있다.
상기 압착블록 (150)은 상기 메인채널 (110)의 내면 상부에서 돌출된 높이 (S1)와, 상기 제1 방향 (x)으로 나란한 길이 (S2)를 갖는 대략 박스형태로 구비될 수 있다. 예컨대, 상기 압착블록 (150)은 모서리가 라운드되도록 모따기된 형태로 구비되어, 상기 압착블록 (150)의 모서리에서 와류가 형성되는 것을 방지할 수 있다.
상기 제2 유체와 액적 (50)은 상기 메인채널 (110)의 내부에서 압착블록 (150)을 통과할 수 있다. 상기 압착블록 (150)을 통과하면서, 상기 압착블록 (150)에 의하여 감소된 유로와, 증가된 유속에 의하여 상기 액적 (50)이 변형되면서, 상기 액적 (50) 내부에 구비된 세포 (10)도 변형될 수 있으며, 상기 세포 (10)의 세포막에 나노포어가 형성될 수 있다. 상기 물질 (20)은 상기 나노포어를 통해 세포 내로 전달될 수 있다. 상기 액적 (50)은 압착블록 (150)을 통과한 후 상기 압착블록 (150)에 의해서 변했던 형상이 상기 압착블록 (150)을 통과하기 전으로 회복될 수 있다. 이때, 상기 액적 (50) 내의 세포 (10)도 상기 액적 (50)과 함께 변형되었다 원래의 형상으로 회복될 수 있다. 상기 액적 (50) 및 세포 (10)의 형상이 회복되는 과정에서, 상기 액적 (50) 내에는 이차 와류가 형성될 수 있다. 상기 와류는 상기 물질 (20)의 이동을 촉진하고 이에 따라 상기 세포 (10) 내로 상기 물질 (20)의 전달이 촉진될 수 있다.
상기 메인채널 (110)의 내경은 제1 직경 (a)이고, 상기 압착블록 (150)과 상기 메인채널 (110) 내면 사이의 간격 (gap)은 제2 직경 (b)일 때, 상기 제2 직경 (b)은 상기 제1 직경 (a)에 대해서 0.1 % 내지 85 %로 구비될 수 있다. 상기 제2 직경 (b)이 상기 제1 직경 (a)에 대해서 0.1 % 미만이면, 상기 메인채널 (110)과 상기 압착블록 (150) 사이를 통과하는 세포 (10)에 손상이 생길 수 있고, 85 % 초과이면 상기 액적 (50)이 상기 압착블록 (150)에 의하여 충분히 가압되지 못하여 세포 내 물질 전달 효율이 저하된다.
상기 제2 직경 (b)은 2㎛ 내지 17㎛일 수 있다. 상기 제2 직경 (b)은 전술한 범위 내로 구비됨으로써, 상기 세포 (10)를 손상시키기 않는 범위 내에서 상기 액적 (50)을 가압하여 세포 (10)의 물리적 변형을 유발함으로써 세포 내 물질 전달 효율을 향상시킬 수 있다.
상기 압착블록 (150)에서 상기 제1 방향 (x)으로 나란한 방향의 길이 (S2)는 10 ㎛ 내지 200 ㎛일 수 있다. 상기 길이 (S2)가 10 ㎛ 미만이면 상기 세포 (10) 내 물질 전달이 효과적으로 발생하지 않고, 200 ㎛를 초과하면 압착블록 (150)과의 접촉면적이 증가하여 세포 (10)의 손상이 발생할 수 있다. 구체적으로, 상기 압착블록 (150)에서 상기 제1 방향 (x)으로 나란한 방향의 길이 (S2)는 20 ㎛ 내지 100 ㎛일 수 있다.
상기 압착블록 (150)에서 상기 제1 방향 (x)에 수직하는 방향의 높이 (S1)는 상기 제1 직경 (a)에 대해서 15 % 내지 99 %로 구비될 수 있다. 구체적으로, 상기 압착블록 (150)에서 상기 제1 방향 (x)에 수직하는 방향의 높이 (S1)는 3 ㎛ 내지 1.5 mm일 수 있다. 상기 높이 (S1)는 전술한 범위로 구비됨으로써, 압착블록 (150)에 의한 막힘현상 등을 방지하고, 세포 내 물질 전달을 효과적으로 수행할 수 있다.
상기 압착블록 (150)은 상기 메인채널 (110)의 일단에서 제1 길이 (L1)로 이격된 부분에 구비될 수 있다. 구체적으로, 상기 메인채널 (110)의 일단에서 타단까지의 전체길이 (L2)에 대해서 상기 제1 길이 (L1)는 30 % 내지 90 %인 부분일 수 있다. 상기 제1 길이 (L1)이 상기 전체길이 (L2)에 대해서 30 % 미만으로 구비되면, 상기 압착블록 (150)을 통과하기 전의 액적과 제2 유체의 흐름이 안정적이지 않아 문제되고, 상기 90 % 초과로 구비되면 상기 압착블록 (150)을 통과하여 변형된 액적 및 세포가 회복되기 위한 시간이 충분하지 않아 문제된다.
상기 메인채널 (110), 제1 및 제2 공급부 (120, 130)에는 각각 유속제어기가 구비될 수 있으며, 상기 유속제어기는 상기 메인체널 (110), 제1 및 제2 공급부 (120, 130)을 통과하는 제1 유체 및 제2 유체의 속도와 레이놀즈수를 제어할 수 있다. 구체적으로, 상기 메인채널 (110)에서 상기 제2 유체의 유속은 1 mL/h 내지 70 mL/h일 수 있다. 상기 메인채널 (110)에서의 제2 유체의 유속이 1 mL/h 미만이면 액적 (50)이 서로 뭉치는 등의 문제가 발생할 수 있고, 70 mL/h 초과이면 액적 (50)이 상기 졍선 (140)에서 원활하게 형성되지 못한다.
상기 물질은 핵산, 단백질, 전사인자, 벡터,　플라스미드, 유전자 가위 물질 및 나노입자 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
이하에서, 도 4 내지 도 10을 참조하여, 본 발명의 다른 실시예에 대하여 설명한다. 후술할 내용을 제외하고는, 도 1 내지 도 3에서 설명한 실시예에 기재된 내용과 유사하므로 이에 대한 자세한 내용은 생략한다.
도 4는 본 발명의 다른 실시예에 따른 세포 내 물질 전달 플랫폼을 나타낸 도면이다. 도 5는 도 4의 단면도이다.
도 4 내지 도 5를 참조하면, 본 실시예에 따른 세포 내 물질 전달 플랫폼 (200)은 세포와 물질, 제1 유체를 포함하는 하나 이상의 액적과, 상기 액적을 이동시키는 제2 유체를 포함하는 메인채널 (210), 상기 메인채널 (210)의 일단과 연결되어 제1 유체와 세포, 물질을 전달하는 제1 공급부 (220)와, 상기 메인채널 (210)의 일단과 각도를 갖도록 연결되어 제2 유체를 전달하는 제2 공급부 (230)를 포함할 수 있다. 상기 메인채널 (210)과, 제1 및 제2 공급부 (220, 230)가 서로 만나는 정션 (240)에서는 액적이 형성되어 상기 메인채널 (210)의 일단에서 타단으로 전달될 수 있다.
상기 메인채널 (210)의 내부에는 압착블록 (250)이 구비되어 상기 메인채널 (210)의 내부를 통과하는 액적을 가압할 수 있다. 상기 압착블록 (250)은 상기 액적의 가압에 따른 순간적인 세포 변형에 의한 1차적인 세포 내 물질 전달과 함께, 상기 압착블록 (250)을 통과한 후 상기 액적 내에서 발생되는 와류에 의하여 2차적인 세포 내 물질 전달을 유도할 수 있다.
상기 세포 내 물질 전달 플랫폼 (200)은 상기 제2 유체가 유동하는 하나 이상의 서브채널 (260)을 더 포함할 수 있다. 상기 서브채널 (260)은 상기 메인채널 (210)의 일단에서 제2 길이 (L4)로 이격된 부분에서 각도 (θ)를 갖도록 연결될 수 있다. 상기 서브채널 (260)은 상기 메인채널 (210)에 대해서 대략 30° 내지 75°의 각도로 연결되고, 상기 서브채널 (260)에서 상기 메인채널 (210)로 공급하는 제2 유체의 흐름에 의하여 상기 메인채널 (210) 내에서 난류 (turbulence)가 발생하는 것을 방지하여 액적의 흐름이 원활하도록 할 수 있다.
상기 서브채널 (260)은 상기 액적이 형성된 후, 상기 액적 및 제2 유체가 흐르는 상기 메인채널 (210)로 제2 유체를 전달할 수 있다. 상기 서브채널 (260)에는 유속제어기가 구비될 수 있으며, 상기 유속제어기는 상기 서브채널 (260)을 통과하는 제2 유체의 유량을 제어할 수 있다.
상기 서브채널 (260)은 상기 메인채널 (210)에 흐르는 제2 유체의 흐름에 대해서 외측으로 동일한 제2 유체를 전달함으로써, 상기 액적이 메인채널 (210)의 내벽과 마찰이 발생하는 것을 방지하면서 상기 메인채널 (210)을 통과하도록 할 수 있다.
상기 서브채널 (260)은 한쌍의 제1 및 제2 서브채널을 포함할 수 있다. 상기 제1 및 제2 서브채널은 상기 메인채널 (210)의 일측 및 타측에 각각 구비될 수 있다. 구체적으로, 상기 제1 및 제2 서브채널은 상기 메인채널 (210)의 일단에서 제2 길이 (L4)로 이격된 부분에서 상기 메인채널 (210)에서 각도를 갖도록 상기 메인채널 (210)의 일측 및 타측에 각각 연결될 수 있다. 상기 제1 및 제2 서브채널 (260)은 한쌍으로 구비될 수 있으며, 대략 동일한 위치에 상기 메인채널 (210)에 각각 구비될 수 있다.
상기 서브채널 (260)의 내경 (c)은 상기 메인채널 (210)의 내경인 제1 직경 (a)에 대해서 20 % 내지 150 %로 구비될 수 있다. 상기 서브채널 (260)의 내경 (c)은 전술한 범위 내로 구비됨으로써, 상기 메인채널 (210) 내의 제2 유체의 흐름에서 불필요한 난류를 형성하지 않으면서 상기 제2 유체가 액적을 용이하게 이동시키도록 할 수 있다. 예컨대, 상기 서브채널 (260)의 내경 (c)은 20 ㎛ 내지 200 ㎛이고, 상기 메인채널의 내경인 제1 직경은 20 ㎛ 내지 1.5 mm일 수 있다.
상기 서브채널 (260)을 통하여 상기 메인채널 (210)로 전달되는 상기 제2 유체의 유속은 상기 메인채널 (210) 내의 제2 유체의 유속과 동일하거나 다르게 구비될 수 있다. 구체적으로, 상기 메인채널 (210)에서 상기 제2 유체의 유속은 1 mL/h 내지 45 mL/h이고, 상기 서브채널 (260)에서 상기 제2 유체의 유속은 1 mL/h 내지 30 mL/h일 수 있다.
상기 압착블록 (250)은 상기 메인채널 (210)의 일단에서 제1 길이 (L3)로 이격된 부분에 구비되고, 상기 제1 길이 (L3)는 상기 메인채널 (210)의 일단에서 상기 서브채널 (260)이 구비되는 부분인 제2 길이 (L4)에 대해서 1.1 배 내지 5 배일 수 있다. 상기 제1 길이 (L3)와, 상기 제2 길이 (L4)를 전술한 범위로 제어함으로써, 상기 메인채널 (210) 내에서 압착블록 (250)에 의한 세포 내 물질 전달의 효율을 향상시키고, 대량의 세포에 대해서도 효율적으로 처리할 수 있다.
구체적으로, 상기 제1 직경 (a)은 20 ㎛ 내지 1.5 mm이고, 상기 제1 길이 (L3)는 0.1 mm 내지 30 mm이고, 상기 제2 길이 (L4)는 0.1 mm 내지 1.5 mm일 수 있다.
도 6은 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 세포 내 물질 전달 플랫폼을 나타낸 도면이다.
도 6을 참조하면, 본 실시예에 따른 세포 내 물질 전달 플랫폼 (300)은 상기 액적 (50)이 이동하면서 세포 내로 물질이 전달되는 메인채널 (310)과, 상기 메인채널 (310)로 세포, 물질 및 제1 유체로 이루어진 액적 (50)을 전달하는 제1 공급부 (320)와, 상기 메인채널 (310)로 제2 유체를 전달하는 제2 공급부 (330)를 포함할 수 있다.
상기 메인채널 (310)은 상기 제1 공급부 (320)와 연결되는 인렛부 (310a); 상기 인렛부 (310a)에 연결되되 복수개의 통로로 분기되는 브랜치부 (310b); 및 상기 브랜치부 (310b)에 연결되는 아웃렛부 (310c);를 포함할 수 있다. 상기 브랜치부 (310b)는 상기 인렛부 (310a) 및 상기 아웃렛부 (310c)보다 작은 직경으로 구비되는 복수개의 통로 (311, 312, 313) 및 상기 복수개의 통로 (311, 312, 313)가 서로 분기되거나 연결되는 링크를 포함할 수 있다. 상기 압착블록 (350)은 상기 브랜치부 (310b) 또는 상기 아웃렛부 (310c)에 구비될 수 있다.
상기 메인채널 (310) 내에는 상기 세포, 물질 및 제1 유체로 형성된 액적 (50)이 상기 제2 유체와 함께 상기 인렛부 (310a)에서 상기 브랜치부 (310b)를 통해서 상기 아웃렛부 (310c)로 전달될 수 있다. 상기 인렛부 (310a)에 구비되는 액적 (50)은 상기 브랜치부 (310b) 또는 상기 아웃렛부 (310c)에 구비되는 액적 (50)보다 평균직경이 더 크게 구비될 수 있다.
상기 브랜치부 (310b)는 상기 인렛부 (310a)와 상기 아웃렛부 (310c)를 수평하게 연결하는 가상의 기준선 (SL)을 중심으로 서로 대칭되는 형태로 구비될 수 있다. 구체적으로, 상기 브랜치부 (310b)는 상기 인렛부 (310a) 및 상기 아웃렛부 (310c)보다 작은 직경으로 구비되는 복수개의 통로 (311, 312, 313) 및 상기 복수개의 통로 (311, 312, 313)가 서로 분기되거나 연결되는 링크를 포함하고, 상기 압착블록 (350)은 상기 브랜치부 (310b) 또는 상기 아웃렛부 (310c)에 구비될 수 있다. 상기 가상의 기준선 (SL)을 중심으로 상기 브랜치부 (310b)의 일측과 타측에는 각각 대응되는 형태로 연결된 복수개의 통로 (311, 312, 313) 및 분기가 형성되고, 상기 액적 (50)은 상기 인렛부 (310a)를 통하여 유입되고, 상기 브랜치부 (310b)의 일측과 타측으로 나누어져 상기 브랜치부 (310b)를 통과할 수 있다.
상기 브랜치부 (310b)는 상기 인렛부 (310a)에서 연결되어 상기 브랜치부 (310b)의 일측 및 타측을 형성하는 2개의 1차 통로 (311)로 연결될 수 있다. 상기 1차 통로 (311)는 각각 링크를 통하여 다시 두개의 2차 통로 (312)로 나눠질 수 있다. 상기 두개의 2차 통로 (312)는 각각 개별적으로 연장된 후 링크를 통하여 다시 연결되어 하나의 3차 통로 (313)를 형성할 수 있다. 상기 브랜치부 (310b)의 일측의 3차 통로 (313)와 상기 브랜치부 (310b)의 타측의 3차 통로 (313)는 상기 아웃렛부 (310c)로 연결될 수 있다.
상기 브랜치부 (310b)를 통과하면서 상기 액적 (50)은 상기 브랜치부 (310b)의 평균직경이 상기 인렛부 (310a)보다 감소됨에 따라 상기 액적 (50)의 평균직경도 함께 감소하여 상기 브랜치부 (310b)를 통과할 수 있다. 상기 액적 (50)의 평균직경은 상기 브랜치부 (310b)의 평균직경과 대략 유사하거나 혹은 20% 이하로 작게 구비될 수 있다. 상기 액적 (50)은 상기 브랜치부 (310b)를 통과하면서 액적 (50)이 일렬로 나열되어 흐르고, 이에 따라 세포의 손상을 방지하고 세포 내 물질 전달을 효과적으로 제어할 수 있다.
또한, 상기 브랜치부 (310b) 및 상기 아웃렛부 (310c) 중 어느 하나 이상에서는 압착블록 (350)이 하나 이상 구비될 수 있다. 상기 액적 (50)은 압착블록 (350)을 통과하면서 가압되어 일시적으로 세포 형상이 변형되면서 세포막 또는 핵막에 나노포어가 형성되고, 또한 상기 액적의 형상도 함께 변형되어 물질과 세포 사이의 간격이 가까워지며, 상기 액적 내의 제1 유체의 흐름의 변형에 의하여 상기 나노포어를 통하여 물질은 세포 내부로 효과적으로 전달될 수 있다.
도 7은 본 발명의 기타 실시예에 따른 세포 내 물질 전달 플랫폼을 나타낸 도면이다. 도 8은 도 7의 메인채널의 확대도이다. 도 9는 도 7의 브랜치부를 나타낸 도면이다.
도 7 내지 도 9를 참고하면, 본 실시예에 따른 세포 내 물질 전달 플랫폼 (400)은 세포 및 물질을 포함하는 제1 유체가 공급되는 제1 공급부 (420)와, 상기 제1 공급부 (420)와 연결되는 메인채널 (410)과, 상기 제1 공급부 (420)와 상기 메인채널 (410)이 연결되는 부분으로 제2 유체를 공급하는 제2 공급부 (430)를 포함할 수 있다. 상기 제1 공급부 (420)와, 상기 제2 공급부 (430) 및 상기 메인채널 (410)이 서로 연결되는 상기 십자형, Y자형 또는 T자형 등으로 형성된 정션 (440)에서, 상기 세포 및 물질을 포함하는 제1 유체는 상기 제2 유체에 의하여 액적 (50)으로 형성될 수 있다. 상기 액적은 상기 제2 유체와 함께 상기 메인채널 (410) 내에서 이동할 수 있다.
상기 메인채널 (410)은 순차적으로 연결된 인렛부 (410a, 410b, 410c), 브랜치부 (410d, 410e) 및 아웃렛부 (410f)를 포함할 수 있다. 상기 메인채널 (410)은 상기 인렛부 (410a, 410b, 410c) 또는 브랜치부 (410d, 410e)에 구비되는 하나 이상의 굴곡통로 (410b)를 더 포함할 수 있다. 구체적으로, 본 실시예에서 상기 굴곡통로 (410b)는 상기 인렛부 (410a, 410b, 410c)에 포함될 수 있는데, 상기 굴곡통로 (410b)는 하나 이상의 굴곡된 형태로 구비되어 상기 메인채널 (410) 내의 제2 유체 및 액적 (50)의 흐름속도를 제어하고, 액적 내에서 와류 유동을 발생시킬 수 있다. 상기 와류 유동은 액적 내에서 물질 전달 효율을 향상시키며, 동시에 액적 내에 구비되는 세포를 혼합하는 역할을 수행할 수 있다.
상기 굴곡통로 (410b)에 의하여 발생한 액적 내에서의 유동에 의해 액적 내 세포가 균일하게 혼합되면, 상기 제2 유체의 흐름이 분기되는 부분에서 액적 내에서 세포의 수가 균일한 수로 나누어질 수 있다. 예를 들면, 상기 액적이 상기 분기되는 부분에서 2개로 나누어지는 경우, 상기 액적 내의 세포도 대략 50:50의 비율로 나누어짐으로써 배치당의 균일한 효과가 발생하도록 제어할 수 있다.
상기 세포 내 물질 전달 플랫폼 (400)은 액적 (50)이 형성되는 부분 (①), 액적을 포함하는 제2 유체의 흐름이 분리되는 분기되는 부분 (②) 및 액적이 압착블록 (450)에 의하여 가압되어 세포가 기계적으로 천공되는 메카노포레이션 (mechanoporation)되는 부분 (③)을 포함할 수 있다. 상기 세포 내 물질 전달 플랫폼 (400)은 서로 혼합되지 않는 제1 유체와 제2 유체를 이용하여, 세포, 물질, 및 제1 유체로 이루어지는 액적 (50)을 형성하고, 상기 제2 유체를 통하여 상기 액적 (50)을 이동시키되, 메인채널 (410)의 평균직경 및 통로의 수 등을 통하여 액적 (50)의 평균직경과 이동속도 및 이동형태를 제어할 수 있다. 또한, 상기 세포 내 물질 전달 플랫폼 (400)은 압착블록 (450)을 더 포함하여, 상기 세포나 액적 (50)을 손상시키지 않으면서, 상기 메카노포레이션에 의하여 세포에 가역적인 나노포어를 형성할 수 있다. 상기 나노포어가 개구되는 경우 물질이 세포 내로 전달되고 이어서 나노포어를 바로 닫도록 하여 물질이 세포 외부로 방출되지 않고 세포에 손상이 없이 세포 내로 물질을 전달할 수 있다.
구체적으로, 도 7의 세포내 물질 전달 시스템에서 액적 (50)이 형성되는 부분 (①), 액적을 포함하는 제2 유체의 흐름이 분기되는 부분 (②) 및 액적이 압착블록 (450)에 의하여 가압되어 세포가 기계적으로 천공되는 메카노포레이션 (mechanoporation)되는 부분 (③)은 다음의 방법으로 실험을 수행하여 얻은 도면이다.
구체적으로, 세포, 물질, 제1 유체로는 4,000만개/mL의 Jurkat 세포 (ATCC, TIB-152)를 포함하며 배양배지는 ThermoFisher의 Opti-mem을 사용하여 얻은 물질을 이용하고, 제2 유체로는 플루오로카본 오일을 사용하였다. 세포, 물질, 및 제1 유체로 이루어진 액적은 브랜치부 (410d, 410e)를 통과하면서 보다 작은 크기의 액적 (50)으로 크기가 감소되고, 작은 크기의 액적 (50) 내에는 상대적으로 소량의 세포가 포획된 형태로 구비될 수 있다. 이러한 액적 (50)은 압착블록 (450)에 의하여 가압되어 세포가 기계적으로 천공되는 메카노포레이션 (mechanoporation)되는 부분 (③)에서 액적 내에서 물질이 세포 내부로 전달될 수 있다.
상기 인렛부 (410a, 410b, 410c)는 상기 정션 (440)과 연결되어 액적 (50)이 유입되는 제1 부분 (410a)과, 상기 브랜치부 (410d, 410e)와 연결되는 제2 부분 (410c)과 상기 제1 부분 (410a)과 상기 제2 부분 (410c) 사이에 연결되는 굴곡통로 (410b)를 포함할 수 있다.
상기 브랜치부 (410d, 410e)는 상기 인렛부 (410a, 410b, 410c)와 상기 아웃렛부 (410f)를 수직으로 연결하는 가상의 기준선 (SL)에 대해서 복수개의 통로와 링크가 연결되어 형성되는 형상이 대칭되도록 구비될 수 있다. 구체적으로, 상기 가상의 기준선 (SL)을 중심으로 상기 브랜치부의 일측 (410d)과 상기 브랜치부의 타측 (410e)은 상기 제2 부분 (410c)에서 연결된 1차 링크 (D1)를 통하여 한쌍의 1차 통로 (411)로 각각 연결될 수 있다. 예컨대, 상기 1차 링크 (D1)를 사이에 두고, 상기 제2 부분 (410c)과 한쌍의 1차 통로 (411)는 각도를 갖도록 연결되어, T자형 또는 Y자형으로 통로를 형성할 수 있다.
상기 인렛부 (410a, 410b, 410c)의 말단 부분의 평균직경 (L5)에 비하여, 상기 1차 통로 (411)의 평균직경 (L6)은 더 작게 구비될 수 있으며, 구체적으로 상기 1차 통로 (411)의 평균직경 (L6)은 상기 인렛부 (410a, 410b, 410c)의 말단 부분의 평균직경 (L5)에 대해서 40 % 내지 80 %로 구비될 수 있다.
상기 1차 통로 (411)는 다시 2차 링크 (D2)를 통해서 한쌍의 2차 통로 (412, 413)로 연결되고, 상기 한쌍의 2차 통로 (412, 413)는 각각 3차 링크 (D3)로 연결될 수 있다. 상기 3차 링크 (D3)를 통해서 연결되는 3차 통로 (414, 415)는 한쌍으로 각각 분기되어 구비될 수 있으며, 상기 3차 통로 (414, 415)의 말단에는 각각 원형, 또는 다각형의 형상으로 구비되는 4차 통로 (416)를 거쳐서, 다시 하나의 통로로 연결되는 5차 통로 (417)로 연결될 수 있다. 상기 5차 통로 (417)는 4차 링크 (D4)를 통하여 연결되어 6차 통로 (418)로 연결되고 다시 5차 링크 (D5)를 통하여 7차 통로 (419)로 연결될 수 있다.
상기 브랜치부의 일측 (410d)과 상기 브랜치부의 타측 (410e)에서 연결되는 각각의 7차 통로 (419)는 6차 링크 (D6)을 통하여 아웃렛부 (410f)로 연결될 수 있다. 상기 아웃렛부 (410f)는 상기 인렛부 (410a, 410b, 410c)에 나란하도록 구비되고, 내부에서는 하나 이상의 압착블록 (450)을 포함할 수 있다.
상기 브랜치부 (410d, 410e) 또는 상기 아웃렛부 (410f)는 하나 이상의 압착블록 (450)을 포함할 수 있다. 상기 압착블록 (450)은 액적 (50)을 물리적으로 가압하여 상기 메카노포레이션에 의하여 세포 내 물질 전달을 촉진할 수 있다. 상기 압착블록 (450)은 상기 브랜치부 (410d, 410e)에서, 상기 4차 통로 (416)에 구비될 수 있다.
도 10은 본 발명의 그 외의 실시예에 따른 세포 내 물질 전달 플랫폼을 나타낸 도면이다.
도 10을 참고하면, 본 실시예에 따른 세포 내 물질 전달 플랫폼 (500)은 세포, 물질 및 제1 유체를 공급하는 제1 공급부 (520), 상기 제1 공급부 (520)의 말단과 연결되어 상기 액적 (50)이 이동하면서 세포 내로 물질이 전달되는 메인채널 (510)을 포함할 수 있다.
상기 메인채널 (510)은 상기 제1 공급부 (520)와 연결되는 인렛부 (510a, 510b, 510c), 상기 인렛부 (510a, 510b, 510c)와 연결되어 복수개의 통로로 이루어진 브랜치부 (510d, 510e, 510f)와, 상기 브랜치부 (510d, 510e, 510f)의 말단과 연결되고, 내부에 압착블록 (550)를 갖는 아웃렛부 (510g)를 포함할 수 있다.
상기 브랜치부 (510d, 510e, 510f)는 상기 브랜치부 (510d, 510e, 510f)의 중심부를 기준으로 일측 및 타측이 대칭되는 형상으로 구비될 수 있다. 상기 브랜치부 (510d, 510e, 510f)는 복수개의 통로와 상기 통로를 연결하는 복수개의 링크가 연결되어 이루어지며, 상기 인렛부 (510a, 510b, 510c) 또는 상기 아웃렛부 (510g)의 평균직경보다 작은 크기로 구비될 수 있다.
상기 인렛부 (510a, 510b, 510c) 또는 상기 브랜치부 (510d, 510e, 510f)는 액적과 제2 유체가 통과하는 통로를 제공하도록 채널 형태로 구비되되, 적어도 일부는 선형으로 구비되고 적어도 일부는 굴곡된 형태인 굴곡통로 (510b, 510f)를 포함하도록 구비될 수 있다. 상기 굴곡통로 (510b, 510f)는 커브된 형태로 구비되어 액적 내에서 와류 유동을 발생시킬 수 있다. 상기 와류 유동은 액적 내에서 물질 전달 효율을 향상시키며, 동시에 액적 내에 구비되는 세포를 혼합하는 역할을 수행할 수 있다. 상기 굴곡통로 (510b, 510f)에서 상기 액적 내의 세포는 균일하게 혼합되어, 액적 내의 세포의 수가 균일한 수를 갖도록 할 수 있다. 또한, 상기 굴곡통로 (510b, 510f)를 통과하면서 상기 액적 (50)은 정렬된 형태로 이동할 수 있다. 상기 굴곡통로 (510b, 510f)는 상기 인렛부 (510a, 510b, 510c)에 구비되어 상기 인렛부 (510a, 510b, 510c)에 대응하는 평균직경을 갖는 제1 굴곡통로 (510b)와, 상기 브랜치부 (510d, 510e, 510f)에 구비되어 상기 브랜치부 (510d, 510e, 510f)에 대응하는 평균직경을 갖는 제2 굴곡통로 (510f)를 포함할 수 있다.
상기 인렛부 (510a, 510b, 510c)는 제1 공급부 (520)와 연결되는 제1 부분 (510a), 상기 브랜치부 (510d, 510e, 510f)와 연결되는 제2 부분 (510c)을 포함하고, 상기 제1 부분 (510a)과 상기 제2 부분 (510c) 사이에는 제1 굴곡통로 (510b)가 구비될 수 있다. 상기 제1 굴곡통로 (510b)는 커브된 형태로 구비되어 상기 제1 부분 (510a)에서 형성된 액적 (50) 내에 세포가 균일하게 분배되도록 할 수 있다. 상기 브랜치부 (510d, 510e, 510f)는 패턴의 형태로 통로가 형성된 한쌍의 브랜치부의 일측 (510d) 및 브랜치부의 타측 (510e)을 포함할 수 있다. 또한, 상기 브랜치부 (510d, 510e, 510f)에는 상기 브랜치부의 일측 (510d) 및 상기 브랜치부의 타측 (510e)의 어느 하나 이상에 연결되는 커브된 형태로 구비되는 제2 굴곡통로 (510f)가 구비될 수 있다. 상기 브랜치부의 일측 (510d) 및 상기 브랜치부의 타측 (510e)은 동일한 형상의 패턴을 갖는 통로형태로 구비되거나, 또는 다른 형상의 패턴으로 구비될 수 있다.
상기 제2 부분 (510c)은 두개의 통로로 분기되어 각각 하나 이상의 제2 굴곡통로 (510f)를 갖는 브랜치부의 일측 (510d)과, 하나 이상의 제2 굴곡통로 (510f)를 갖는 브랜치부의 타측 (510e)으로 연결될 수 있다. 상기 브랜치부의 일측 (510d)과 상기 브랜치부의 타측 (510e)은 중심부를 기준으로 대칭되는 형상으로 구비될 수 있다.
상기 제2 굴곡통로 (510f)는 상기 브랜치부의 일측 (510d) 및 브랜치부의 타측 (510e)이 시작되는 부분에 각각 구비되어 상기 브랜치부로 유입되는 제2 유체와 액적 (50)을 일렬로 정렬하고, 상기 액적 (50) 내에 구비되는 세포를 균일하게 분배할 수 있다.
이하 본 발명의 실시예 및 비교예를 기재한다. 그러나, 하기 실시예들은 본 발명의 바람직한 일 실시예일뿐 본 발명의 권리 범위가 하기 실시예들에 의하여 제한되는 것은 아니다.
도 11 내지 도 16은 실시예에 따른 세포 내 물질 전달 플랫폼을 이용하여 세포 내 물질전달을 확인하고, 종래 기술을 비교하여 물질 전달의 효율을 확인한 결과이다.
도 11은 본 실시예에 따른 세포 내 물질 전달 플랫폼을 이용하여 세포 내 물질전달을 확인한 도면이다.
도 11을 참조하면, 세포 내 물질 전달 플랫폼은 PDMS (Polydimethylsiloxane) (Dow, Sylgard 184)와 슬라이드 글라스 (Marienfeld Superior, HSU-1000612)로 제조하였다. 실리콘 웨이퍼의 포토리소그래피 (photolithography) 및 식각 (DRIE) 공정을 통해 미세유체 패턴이 새겨진 마스터 몰드 (Master mold)를 제작하고, PDMS의 소프트 리소그래피 (Soft lithography) 공정을 통해 미세유체 패턴을 PDMS 표면에 복제하였다. 플라즈마 클리너 (Femto science, CUTE)를 이용하여 미세유체 패턴이 새겨진 PDMS와 슬라이드 글라스를 산소 플라즈마 본딩을 하여 세포 내 물질 전달 플랫폼을 제조하였다. 안정적인 액적 생성을 위해 Surface coating oil 10 μL (RAN Biotechnologies, 909-FluoroCoat)를 이용하여 세포 내 물질 전달 플랫폼의 미세채널 내부를 소수성 처리하고, 강제 순환 건조기 (Forced convection oven) (Jeio Tech, OF4-S)에서 75 ℃ 조건으로 O/N 본딩과 건조를 수행하였다.
위와 같이 제조된 세포 내 물질 전달 플랫폼은 액적이 형성되어 이동하는 메인채널의 전체 길이는 3.1538 mm이고, 메인채널의 평균내경은 80 μm이고, 압착블록은 메인채널의 일단에서 2.0538 mm만큼 이격된 부분에 구비시켰다. 여기서, 압착블록의 높이는 4.8 μm이고, 길이는 100 μm이다. 또한, 서브채널은 평균내경이 49 μm로, 메인채널의 일단에서 1 mm만큼 이격된 부분에 한쌍이 대략 58 ˚의 각도로 연결시켰다.
전술한 세포 내 물질 전달 플랫폼을 이용한 세포 내 물질전달 실험의 재료로 세포 현탁액 (ATCC, CCL-243)과 플루오로카본 오일 (Fluorocarbon oil) (Bio Rad, Droplet Generation Oil)을 사용하였다. 본 실험에 사용된 세포 현탁액은 mL 당 1,500만 개의 K562 세포를 포함한다. 세포 준비 후 배양배지 (Corning, RPMI)로 세포 현탁액을 만들고, 0.2 μm 주사기 필터 (Advantec, 13HP020AN/25HP020AN)로 오일 내 불순물을 제거하였다. 플루오로카본 오일과, 세포 현탁액을 각각 일회용 주사기 (BD, Luer-lok Tip Syringe)에 주입하고 주사기와 미세유체 플랫폼을 Capillary tubing (IDEX, 1/32" OD PEEK Tubing)으로 연결하였다. 주사기 펌프 (Harvard Apparatus, 11 Elite Microfluidic Syringe Pump)를 사용하여 세포 현탁액과 플루오로카본 오일을 각각 0.5 mL/h와 2.0 mL/h의 일정 유속으로 세포 현탁액과 플루오로카본 오일을 세포 내 물질 전달 플랫폼에 주입하였다. 각각 별도로 주입된 세포 현탁액과 플루오로카본 오일은 Flow focusing junction에서 만나 액적을 생성하면서 세포가 액적 내 포획된다. 해당 액적은 플루오로카본 오일과 함께 액적 상태를 유지하면서 메인채널을 통과하였다. 이때, 메인채널에 연결될 서브채널로 플루오로카본 오일이 16 mL/h의 속도로 유입되어 메인채널 내에서 액적의 흐름이 가속된다. 또한, 서브채널을 통하여 플루오로카본 오일이 추가로 전달됨으로써, 상기 메인채널에서 액적은 플루오로카본 오일에 의하여 둘러싸게 되어 이동된다.
이어서 액적은 메인채널 내에 구비된 압착블록을 통과하면서 액적 내 세포의 변형을 유도하여 세포막에 나노포어를 형성하였다. 액적 내에 공존하던 물질은 상기 나노포어를 통하여 세포 내로 전달되는 것을 확인할 수 있었다.
도 12는 도 11에 따른 세포 내 물질 전달 플랫폼에서 압착블록의 크기에 따른 세포 내 물질전달 효율을 확인한 결과이다.
도 12는 도 11과 동일한 형태의 세포 내 물질 전달 플랫폼을 이용하되 내부에 구비되는 압착블록만을 다르게 하여 세포내 물질 전달 효율을 확인하였다. 본 실험에 사용된 세포 현탁액 내에 전달물질인 2,000kDa FITC-conjugated dextran (Sigma Aldrich, FD2000S)을 0.3 mg/mL의 농도로 희석하여 각 조건별로 3회 반복 진행하였다. 세포 내 물질 전달 플랫폼을 통해 처리한 세포를 18시간 배양 후 유세포분석기 (Merck, Guava EasyCyte)를 이용하여 대조군 대비 전달 효율 및 평균 형광 강도 변화 (Mean fluorescence intensity fold change)를 분석하였다.
도 12의 세포 내 물질 전달 플랫폼에서 압착블록이 구비된 부분에서, 메인채널 내면과 압착블록 사이의 간격 (Gap height)가 각각 6.3 ㎛, 4.8 ㎛ 및 3.6 ㎛의 세가지로 다르게 한 결과, 6.3 ㎛, 4.8 ㎛ 및 3.6 ㎛의 순으로 세포 내 물질 전달 효율을 증가함을 확인할 수 있었고, 3.6 ㎛일 때 가장 높은 결과를 나타냈다. 또한, 압착블록의 길이 (Squeezing length)를 40 ㎛, 70 ㎛ 및 100 ㎛로 각각 다르게 하여 물질 전달의 효율을 확인한 결과, 100 ㎛이 가장 우수하게 나타남을 확인할 수 있었다. 본 실험에 따른 압착블록에 따른 세포 내 물질 전달 효율을 하기 표 1 및 표 2에 나타내었다.
Gap height 6.3 ㎛ 4.8 ㎛ 3.6 ㎛
Delivery efficiency(%) 98.09 % 99.82 % 99.95 %
MFI fold change 92.0 112.1 156.9
Squeezing length 40 ㎛ 70 ㎛ 100 ㎛
Delivery efficiency(%) 99.92 % 99.87 % 98.83 %
MFI fold change 65.9 78.7 98.9
도 13은 도 11에 따른 세포 내 물질 전달 플랫폼에서 전달물질의 종류에 따른 세포 내 물질전달 효율을 확인한 결과이다.
도 13에서, 세포 현탁액 내에 전달물질인 2,000kDa FITC-conjugated dextran (Sigma Aldrich, FD2000S)을 0.3 mg/mL의 농도로 희석한 샘플과, 녹색 형광 단백질 발현 mRNA (EGFP mRNA; TriLink, L-7601)을 20㎍/mL의 농도로 희석한 샘플을 이용하여 각각 실험을 진행하였다. 세포 내 물질 전달 플랫폼을 통해 처리한 세포를 2,000kDa FITC-Dextran 전달의 경우에는 18시간, EGFP mRNA 전달의 경우에는 24시간 배양 후 유세포분석기 (Merck, Guava EasyCyte)를 이용하여 비교예 대비 전달 효율을 분석하였다. 광학 현미경 (Zeiss, Axio Observer 7) 및 카메라(ZEISS, Axiocam 305 mono)를 이용해 비교예와 물질 전달 샘플의 Bright field와 GFP 이미지를 얻어 형광 발현 정도를 정성적으로 비교하였다.
여기에서, 비교예는 실시예와 동일 농도의 FITC-dextran 또는 EGFP-mRNA를 동일한 시간 동안 노출시킨 세포이다. FITC-dextran 또는 EGFP-mRNA를 이용하여 세포현탁액 상태로 물질전달을 수행한 것으로, 실시예에 해당하는 세포 내 물질 전달 플랫폼을 사용하지 않고 엔도사이토시스 (endocytosis) 효과를 확인하였다.
액적과 세포 내 물질 전달 플랫폼을 이용하지 않은 비교예의 경우, 2,000kDa FITC-conjugated dextran 및 형광 단백질 발현 mRNA의 양측 모두에서 세포 내로 물질 전달이 거의 발생하지 않음을 확인할 수 있었다. 반면, 본 발명에 따른 세포 내 물질 전달 플랫폼을 이용한 경우, 높은 효율로 세포 내로 물질 전달이 수행됨을 확인할 수 있었다. 또한, 본 실시예와 같이 세포 내로 전달되는 물질의 종류와 무관하게, 본 발명의 실시예에 따른 세포 내 물질 전달 플랫폼을 이용하는 경우 높은 효율을 나타냄을 확인할 수 있었다. 본 실험에 따른 압착블록에 따른 세포 내 물질 전달 효율을 하기 표 3에 나타내었다.
비교예 실시예
2,000kDa FITC-Dextran
Delivery efficiency (%)		 5.06 % 99.85 %
EGFP mRNADelivery efficiency (%) 5.02 % 100.00 %
도 14는 종래 범용 장치를 이용한 세포 내 유전자 전달 결과를 나타낸 도면이다. 도 15는 EMX1 타겟 유전자 편집 효율을 종래 범용 장치와 비교한 결과이다. 도 14는 MaxCyte (2021)에서 공개한 세포 내 물질 전달 데이타이고, 도 15는 본 발명의 세포 내 물질 전달 플랫폼 (droplet)과, 종래 범용 장치인 전기천공기 (EP), 및 지질 나노입자 (LNP)를 비교하여 K562 세포의 EMX1 타겟 유전자 편집 효율을 확인하였다.
도 15의 실험에서는 도 11의 실험 방식을 채택하였으며 세포 현탁액 내에 K562 세포의 EMX1 발현 유전자를 타겟하는 sgRNA (Single guide RNA)와 내독소 (Endotoxin)가 없는 Cas9 단백질을 각각 500pmol을 첨가하였다. 해당 세포 내 물질 전달 플랫폼을 통해 처리한 세포를 48시간 배양 후 DNA 추출 키트 (Intron biotechnology, G-spin?? Total DNA Extraction Mini Kit)을 이용하여 gDNA (Genomic DNA)를 추출하였다. gDNA는 열 순환기 (Thermal cycler; Bio-Rad, T100)를 이용해 중합효소연쇄반응 (PCR)을 일으켜 증폭하였다. 미량분량광도계 (ThermoFisher, NanoDrop One)를 이용해 정량하여 200ng의 PCR 산출물에 대해 10U의 T7 Endonuclease 1 (New England BioLabs, M0302S)를 37℃에서 15분간 처리한 후 전기영동 (Bio-Rad, BR164-0302)을 통해 유전자 편집 효율을 분석하였다. 지질나노입자 (Invitrogen; Lipofectamine 3000) 및 전기천공기 (ThemoFisher, Neon Transfection System)를 처리한 K562 세포도 동일한 방식으로 분석을 수행하였다. 해당 실험은 각 3회 반복 수행하였으며, 종래 범용 장치인 전기천공기 (EP), 및 지질 나노입자 (LNP) 대비 본 발명의 세포 내 물질 전달 플랫폼 (droplet)을 이용하여 처리한 세포의 유전자 편집 효율이 월등히 높음을 확인하였다.
본 발명에 따른 세포 내 물질 전달 플랫폼 (droplet)은 유전자 편집 효율이 전기천공기 (EP), 및 지질 나노입자 (LNP)에 비하여 매우 우수하게 나타났고, Multiplexing editing (두 개 이상의 타겟 편집) 고효율 편집이 가능함을 확인하였다. 또한, 본 실시예인 세포 내 물질 전달 플랫폼은 HDR (Homology Directed Repair) 고효율 편집이 가능하였다. 즉, 본 발명에 따른 세포 내 물질 전달 플랫폼은 세포의 손상 없이 종래 기술에 비하여 높은 효율로 세포 내로 물질을 전달할 수 있고, 다양한 세포에 대해서도 제약없이 적용할 수 있음을 확인하였다.
도 16은 액적 분리형 세포 내 물질 전달 플랫폼을 이용하여 세포 내 물질전달을 확인한 결과이다. 도 16은 도 7에 따른 액적 분리형 세포 내 물질 전달 플랫폼을 이용하였다.
도 16에 사용된 액적 분리형 세포 내 물질 전달 플랫폼의 제조방법은 전술한 도 11에 따른 세포 내 물질 전달 플랫폼과 동일한 방식에 의하여 제조하였다.
도 16의 세포 내 물질 전달 플랫폼은 액적이 형성되어 이동하는 메인채널에서 액적이 형성되는 부분인 인렛에서 직선통로의 길이는 1.4 mm 및 평균내경은 0.4 mm이고, 이어지는 굴곡통로의 길이는 2.51 mm 및 평균내경은 0.2 mm이고, 다시 이어지는 직선통로의 길이는 1 mm 및 평균내경은 0.2 mm이다. 여기에 한쌍의 브랜치부가 연결되는데, 브랜치부의 통로는 평균내경이 0.09 mm로 연결되었다. 여기서, 압착블록의 높이는 8 μm이고, 길이는 70 μm이다.
본 실험에서 사용된 세포 현탁액에는 K562 세포 (ATCC, CCL-243)가 포함되어 있으며 이에 전달물질인 3kDa FITC-conjugated dextran (Sigma Aldrich, FD4)을 0.3 mg/mL의 농도로 희석하였다. 세포 내 물질 전달 플랫폼 구동 후 취득한 세포가 갇혀 있는 액적을 PFO 용액 (Sigma Aldrich, 1H,1H,2H,2H-Perfluoro-1-octanol)을 이용한 해유화 (demulsification) 과정을 통해 세포를 분리하였다. 해당 세포의 생존율을 자동 세포 계수기 (Logos biosystems, Luna-FX7)로 측정하였고, 80% 내외의 세포 생존율을 확인할 수 있었다. 또한 해당 세포를 18시간 배양 후 유세포분석기 (BD, FACSLyric)로 분석하였다. 비교예 대비 90% 이상의 전달 효율과 100배 이상의 평균 형광 강도 변화 (Mean fluorescence intensity fold change)의 결과를 확인할 수 있었다. 광학 현미경 (Zeiss, Axio Observer 7) 및 카메라 (ZEISS, Axiocam 305 mono)를 이용해 비교예와 물질 전달 샘플의 Bright field와 GFP 이미지를 얻어 형광 발현 정도를 정성적으로 비교한 결과도, 본 실시예에 따른 세포 내 물질 전단 플랫폼을 이용한 경우, 보다 높은 물질 전달 효율을 나타냄을 확인할 수 있었다. 여기서 비교예는 실시예와 동일 농도의 전달물질을 동일한 시간 동안 노출시킨 세포를 이용하여 세포현탁액 상태로 물질전달을 수행한 것으로, 실시예에 해당하는 세포 내 물질 전달 플랫폼을 사용하지 않고 엔도사이토시스 (endocytosis)의 영향에 의한 물질전달 효과를 확인한 결과이다.
본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구의 범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구의 범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
100, 200, 300, 400, 500 : 세포 내 물질 전달 플랫폼
110, 210, 310, 410, 510 : 메인채널
120, 220, 320, 420, 520 : 제1 공급부
130, 230, 330, 430 : 제2 공급부

Claims (25)

  1. 세포내 물질을 전달하는 장치로,
    일단에서 타단으로 제1 방향으로 연장되고, 내부에 유체의 통로가 구비된 하나 이상의 메인채널;
    상기 메인채널의 일단에 연결되어 상기 세포 및 물질을 포함하는 제1 유체를 주입하는 제1 공급부; 및
    상기 메인채널의 일단에 연결되어 상기 제1 유체와 혼합되지 않는 제2 유체를 주입하는 제2 공급부;를 포함하고,
    상기 메인채널의 내부에는 하나 이상의 압착블록 (compressing block)이 구비되고,
    상기 메인채널의 내경은 제1 직경으로 구비되고,
    상기 압착블록과 상기 메인채널 내면 사이의 간격(gap)는 제2 직경으로 구비되고, 상기 제2 직경은 상기 메인채널의 내경인 제1 직경에 대해서 0.1 % 내지 85 %로 구비되는 것인 세포 내 물질 전달 플랫폼.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 제1 유체는 수상 (water phase)이고, 상기 제2 유체는 유상 (oil phase)인 것인 세포 내 물질 전달 플랫폼.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 제1 공급부는 상기 제1 방향에 대해서 나란하게 연장되어 상기 메인채널의 일단에 연결되고,
    상기 제2 공급부는 상기 메인채널의 일단에서 상기 제1 공급부에 대해서 각도를 갖도록 연결되는 것인 세포 내 물질 전달 플랫폼.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 제1 공급부에서 상기 제1 유체는 상기 메인채널의 일단으로 전달되고, 상기 제2 공급부에서 상기 제2 유체는 상기 메인채널의 일단으로 전달되되 상기 제1 유체의 흐름방향에 대해서 각도를 갖도록 전달되어 상기 세포, 물질을 포함하는 제1 유체는 액적으로 형성되고,
    상기 액적은 상기 제2 유체 내에서 상기 메인채널을 통과하는 것인 세포 내 물질 전달 플랫폼.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 제2 공급부는 제1 및 제2 공급채널을 포함하고,
    상기 제1 및 제2 공급채널은 상기 메인채널의 일단에 연결되어 정션 (junction)을 형성하는 세포 내 물질 전달 플랫폼.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 압착블록은 상기 메인채널의 일단에서 제1 길이로 이격된 부분에 구비되고,
    상기 메인채널의 일단에서 타단까지의 전체길이에 대해서 상기 제1 길이는 30 % 내지 90 %인 것인 세포 내 물질 전달 플랫폼.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 메인채널에서 상기 제2 유체의 유속은 1 mL/h 내지 70 mL/h인 것인 세포 내 물질 전달 플랫폼.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 메인채널에 각도를 갖도록 연결되고, 상기 제2 유체가 유동하는 하나 이상의 서브채널을 더 포함하는 세포 내 물질 전달 플랫폼.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 서브채널은 상기 메인채널의 일단에서 제2 길이로 이격된 부분에서 상기 메인채널에 연결되되, 제1 및 제2 서브채널을 포함하고,
    상기 제1 및 제2 서브채널은 상기 메인채널의 일측 및 타측에 각각 연결되는 것인 세포 내 물질 전달 플랫폼.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 서브채널의 내경은 상기 메인채널의 내경인 제1 직경에 대해서 20 % 내지 150 %로 구비되고,
    상기 서브채널을 통하여 상기 제2 유체가 상기 메인채널로 전달되는 세포 내 물질 전달 플랫폼.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 서브채널의 내경은 20 ㎛ 내지 200 ㎛이고,
    상기 메인채널의 내경인 제1 직경은 20 ㎛ 내지 1.5 mm이고,
    상기 서브채널을 통하여 상기 제2 유체가 상기 메인채널로 전달되는 세포 내 물질 전달 플랫폼.
  12. 제9항에 있어서,
    상기 메인채널에서 상기 제2 유체의 유속은 1 mL/h 내지 45 mL/h이고,
    상기 서브채널에서 상기 제2 유체의 유속은 1 mL/h 내지 30 mL/h인 것인 세포 내 물질 전달 플랫폼.
  13. 제9항에 있어서,
    상기 압착블록은 상기 메인채널의 일단에서 제1 길이로 이격된 부분에 구비되고,
    상기 제1 길이는 상기 제2 길이에 대해서 1.1 배 내지 5 배로 구비되는 것인 세포 내 물질 전달 플랫폼.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 제1 직경은 20 ㎛ 내지 1.5 mm이고, 상기 제1 길이는 0.1 mm 내지 30 mm이고, 상기 제2 길이는 0.1 mm 내지 1.5 mm인 것인 세포 내 물질 전달 플랫폼.
  15. 제1항에 있어서,
    상기 압착블록은 상기 제1 방향으로 나란한 방향의 길이는 10 ㎛ 내지 200 ㎛인 것인 세포 내 물질 전달 플랫폼.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 압착블록은 상기 제1 방향으로 나란한 방향의 길이는 20 ㎛ 내지 100 ㎛인 것인 세포 내 물질 전달 플랫폼.
  17. 삭제
  18. 제1항에 있어서,
    상기 제2 직경은 2 ㎛ 내지 17 ㎛인 것인 세포 내 물질 전달 플랫폼.
  19. 제1항에 있어서,
    상기 압착블록의 상기 제1 방향에 수직하는 방향의 높이는 상기 제1 직경에 대해서 15 % 내지 99 %로 구비되는 것인 세포 내 물질 전달 플랫폼.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 압착블록의 상기 제1 방향에 수직하는 방향의 높이는 3 ㎛ 내지 1.5 mm인 세포 내 물질 전달 플랫폼.
  21. 제1항에 있어서,
    상기 메인채널은,
    상기 제1 공급부와 연결되는 인렛부;
    상기 인렛부에 연결되되 복수개의 통로로 분기되는 브랜치부; 및
    상기 브랜치부에 연결되는 아웃렛부;를 포함하고,
    상기 브랜치부는 상기 인렛부 및 상기 아웃렛부보다 작은 직경으로 구비되는 복수개의 통로, 및 상기 복수개의 통로가 서로 분기되거나 연결되는 링크를 포함하고,
    상기 압착블록은 상기 브랜치부 또는 상기 아웃렛부에 구비되는 것인 세포 내 물질 전달 플랫폼.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 메인채널 내에는 상기 세포, 물질 및 제1 유체로 형성된 액적이 상기 제2 유체를 통하여 상기 인렛부에서 상기 브랜치부를 통해서 상기 아웃렛부로 전달되고,
    상기 인렛부에 구비되는 액적은 상기 브랜치부 또는 상기 아웃렛부에 구비되는 액적보다 평균직경이 더 크게 구비되는 세포 내 물질 전달 플랫폼.
  23. 제21항에 있어서,
    상기 브랜치부는 상기 인렛부와 상기 아웃렛부를 연결하는 가상의 기준선을 중심으로 서로 대칭되는 형태로 구비되는 세포 내 물질 전달 플랫폼.
  24. 제21항에 있어서,
    상기 메인채널은 상기 인렛부 또는 브랜치부에 구비되는 하나 이상의 굴곡통로를 더 포함하는 세포 내 물질 전달 플랫폼.
  25. 제1항에 있어서,
    상기 물질은 핵산, 단백질, 전사인자, 벡터,　플라스미드, 유전자 가위 물질 및 나노입자 중 어느 하나 이상을 포함하는 세포 내 물질 전달 플랫폼.
KR1020240010157A 2023-11-30 2024-01-23 액적 기반 세포 내 물질 전달 플랫폼 KR102679742B1 (ko)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020230170705 2023-11-30

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR102679742B1 true KR102679742B1 (ko) 2024-07-01

Family

ID=

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3500662B1 (en) High-throughput system and method for the temporary permeabilization of cells
JP6805152B2 (ja) 細胞に物質を注入して細胞を変換させる方法｛Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ ａ Ｃｅｌｌ ｂｙ Ｐｕｔｔｉｎｇ Ｍａｔｅｒｉａｌ ｉｎｔｏ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ｝
US20200115668A1 (en) System and method of using a microfluidic electroporation device for cell treatment
US11745179B2 (en) Microfluidic systems and methods for lipoplex-mediated cell transfection
US20070264320A1 (en) Microfluidic device for forming monodisperse lipoplexes
US11465147B2 (en) Device for intracellular delivery
Chakrabarty et al. Microfluidic mechanoporation for cellular delivery and analysis
US20080248575A1 (en) Drug and Gene Delivery by Polymer Nanonozzle and Nanotip Cell Patch
KR102679742B1 (ko) 액적 기반 세포 내 물질 전달 플랫폼
KR102217407B1 (ko) 관성을 기반으로 한 세포 내 전달 미세 유체 플랫폼 및 이를 이용한 세포 내 물질 전달방법
EP3463664A1 (en) Systems and methods for cell transduction
CN114621979B (zh) 基于柔性可变截面微通道的细胞力学转染的方法和装置
AU2020380721B2 (en) Droplet deformation-based method of transferring material into cells and chip for same
KR20200127546A (ko) 세포 처리 장치 및 세포 처리 방법
CN113840657B (zh) 用于材料的细胞内输送的微流体系统及其方法
US12030052B2 (en) Microfluidic delivery method utilizing an electric field
Lee et al. Highly efficient mRNA transfection with droplet cell squeezing for cellular engineering
CN115595262A (zh) 一种具有纳米孔和微流道结构的生物芯片及其制备方法
KR20200127547A (ko) 세포 처리 장치 및 세포 처리 방법
Huang et al. A flow-through electroporation device utilizing Dean Vortex to enhance cell viability