CN112076808A - 利用超高频声波控制溶液中的微粒移动的方法及设备 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种控制流体中的目标颗粒移动的微流控系统及方法。本发明的系统包括流体通道，其具有入口和多个出口；一个或多个超高频声波谐振器，所述超高频体声波谐振器可在所述流体通道产生频率为约0.5‑50GHz的体声波；通过调节超高频体声波谐振器体声波产生区域的形状和设置方位，使得颗粒在进入体声波在溶液中引发的涡旋通道，按指定位置和方向移动。本发明的系统和方法可以对溶液中的颗粒进行控制和分离，得到指定的颗粒，或得到分离颗粒后的纯化的溶液。

Description

利用超高频声波控制溶液中的微粒移动的方法及设备
本申请要求以下中国专利申请的优先权：2019年6月13日提交的、申请号为201910512148.6、发明名称为“利用超高频声波控制溶液中的微粒移动的方法及设备”，其全部内容通过引用结合在本申请中。
技术领域
本发明涉及细胞研究方法学与医疗器械领域。具体的，本发明涉及一种对细胞或微囊泡进行分离和分析的微流控系统和使用所述系统来分离和分析细胞或微囊泡的方法。
背景技术
人体体液如血液和组织液中存在的细胞或亚细胞颗粒，以及核酸和蛋白质等生物大分子颗粒对生理健康和研究非常重要，因此存在将体液中的细胞或亚细胞颗粒或生物大分子颗粒进行分离的需求。现有技术中通过滤网的方法分离细胞等颗粒的方法很多，但都存在诸如操作复杂，容易出现堵塞，处理量低等缺点。
利用微流控系统对样品中的颗粒进行分离是新兴的技术。已经报道的方法大多数是基于细胞等颗粒的物理性质如大小进行分离，或者是基于生物特异性进行区别和分离。这些方法存在花费巨大和处理量低的问题。
因此，目前亟需一种系统及方法，以实现对溶液中的细胞或微囊泡或生物大分子颗粒的分离，获得需要的细胞或生物大分子颗粒，或是去除细胞等颗粒后得到的纯化的体液。
发明内容
本发明首次发现利用超高频体声波能够在微流控系统中有效地操控溶液中的细胞或囊泡，或核酸或蛋白质或多糖等生物大分子等柔性颗粒的移动位置和方向，由此提供了分离和获得目标细胞或囊泡或生物大分子颗粒，或者是获得去除细胞或囊泡或生物大分子等颗粒后的液体的方法和系统。
具体的，本发明提供了一种控制溶液中柔性微粒的移动的方法，包括：
(1)使含有目标柔性微粒的溶液流经一个微流控设备，所述设备包括；
流体通道，其具有入口和流出通道；
一个或多个超高频体声波谐振器，其设置于所述流体通道的一个壁上，所述超高频体声波谐振器可在所述流体通道产生传向所述流体通道的对侧的壁的频率为约0.5-50GHz的体声波；
(2)所述超高频谐振器发射传向所述流体通道的对侧的壁的体声波，在溶液中产生由超高频谐振器的体声波产生区域的边界限定(define)的涡旋通道；
(3)使得溶液中的目标柔性微粒进入涡旋通道和顺着涡旋通道移动，并在设定的位置离开涡旋通道。
柔性微粒是指具有形变性质的纳米或微米颗粒。柔性颗粒可以是人工的或天然的。所述颗粒可以为带有膜结构的微团，特别是具有脂质双分子层或类脂质双分子层的微团，例如为细胞或囊泡，包括外泌体等，或者是人工制备的，例如为油包水制剂或者水包油包水(W/0/W)双乳液制剂形式的脂质体或微胶囊等。所述颗粒也可以是具有不规则形状的，例如为核酸或蛋白等生物大分子。
在其中一个方面，本发明提供了一种控制溶液中细胞或囊泡的移动的方法，包括：
(1)使含有目标细胞或囊泡的溶液流经一个微流控设备，所述设备包括；
流体通道，其具有入口和流出通道；
一个或多个超高频体声波谐振器，其设置于所述流体通道的一个壁上，所述超高频体声波谐振器可在所述流体通道产生传向所述流体通道的对侧的壁的频率为约0.5-50GHz的体声波；
(2)所述超高频谐振器发射传向所述流体通道的对侧的壁的体声波，在溶液中产生由超高频谐振器的体声波产生区域的边界限定的涡旋通道；
(3)使得溶液中的目标细胞或囊泡进入涡旋通道和顺着涡旋通道移动，并在设定的位置离开涡旋通道。
在本发明中，细胞或囊泡可以是人工的或天然的，通常所述颗粒为带有膜结构的微团，特别是具有脂质双分子层或类脂质双分子层的微团。本发明涉及的柔性颗粒通常具有约0.01-30um的直径，优选为0.2-25um的直径，更优选为0.5-20um。在本发明的其中一个方面，所述柔性颗粒为天然存在的颗粒，例如细胞或细胞释放到细胞外环境中的囊泡。细胞包括天然的或培养的高等植物或动物(例如包括人在内的哺乳动物)的细胞，以及细菌，真菌等单细胞生物或简单多细胞生物。囊泡为各种不同的动物细胞释放到细胞外环境中的微囊泡。这些细胞相关的微囊泡是从细胞膜上脱落或由细胞分泌的具有双层膜结构的囊泡状小体。它们可以具有大约30-1000nm、大约30-800nm、大约30-150nm或者大约30-100nm的直径。细胞释放的微囊泡包括外泌体、微囊泡、囊泡、膜小泡、水泡、气泡、前列腺小体、微颗粒、管腔内囊泡、核内体样囊泡或胞吐囊泡等。
在其中一个方面，本发明提供了一种控制溶液中目标核酸或蛋白质或多糖等生物大分子(特别是核酸)的移动的方法，包括：
(1)使含有目标生物大分子的溶液流经一个微流控设备，所述设备包括；
流体通道，其具有入口和流出通道；
一个或多个超高频体声波谐振器，其设置于所述流体通道的一个壁上，所述超高频体声波谐振器可在所述流体通道产生传向所述流体通道的对侧的壁的频率为约0.5-50GHz的体声波；
(2)所述超高频谐振器发射传向所述流体通道的对侧的壁的体声波，在溶液中产生由超高频谐振器的体声波产生区域的边界限定的涡旋通道；
(3)使得溶液中的目标生物大分子进入涡旋通道和顺着涡旋通道移动，并在设定的位置离开涡旋通道。
在本发明的其中一个方面，所述方法中的生物大分子是指核酸。本文所用的“核酸”(以及等价术语“多核苷酸”)是指在核苷酸亚单位之间包含磷酸二酯键的核糖核苷或脱氧核糖核苷的聚合物。核酸包括，但不限于，基因DNA、cDNA、hnRNA、mRNA、rRNA、tRNA、微RNA、片段核酸、从亚细胞器如线粒体获得的核酸，以及从可能出现在样品上或样品中的微生物或病毒获得的核酸。核酸包括天然或合成的，例如以人工或天然DNA或RNA为模板的扩增反应产物。核酸可以是双链或者单链、环状或线性的。可以用于检测目标核酸的样品包括下述样品：来自细胞培养物、真核微生物或诊断样品如体液、体液沉淀物、洗胃样本、细针抽取物、活组织检查样品、组织样品、癌细胞、来自病人的细胞、来自组织的细胞或来自待测试和/或治疗疾病或感染的个体的体外培养的细胞、或法医样品。体液样品的非限制性实例包括全血、骨髓、脑脊液、腹膜液、胸膜液、淋巴液、血清、血浆、尿、乳糜、粪便、射精、痰、乳头吸液、唾液、棉签样本、冲洗或灌洗液和/或擦拭样本。本发明方法尤其适用于分离长度≥300bp，优选≥1kbp、更优选≥10kbp、例如为≥50kbp的核酸(例如任何形式的DNA和RNA，包括天然或合成核酸，例如以DNA或RNA为模板的扩增反应产物)。
本发明中的超高频体声波谐振器是指能够产生频率超过0.5GHz(优选为超过1GHz)，例如频率为0.5-50GHz的体声波的谐振器。所述超高频体声波谐振器例如可以为薄膜体声波谐振器或固态装配型谐振器等。
在本发明的方法中，超高频谐振器发射传向所述流体通道的对侧的壁(例如流道顶部)的超高频体声波，声波衰减到流体中产生的体积力使得流经的溶液中出现声射流，导致微流道中的液体产生局部的立体的旋涡。由于涡旋是由于声波衰减引发的体积力产生的，涡旋的中心轴在体声波作用边界的上方；超高频体声波引起的连续涡旋形成声流体涡旋通道，涡旋通道的形状基本与体声波作用区域的形状相同，位于体声波作用区域边界的上方，即涡旋通道的形状和位置是由超高频谐振器的体声波产生区域的边界限定(define)的。
在本发明的其中一个方面，所述微流控设备的流体通道具有所述被控制移动的柔性颗粒如细胞或囊泡，或核酸或蛋白质等生物大分子等的流出通道，可称为颗粒流出通道。在本发明的另一个方面，所述流体通道还具有其它流出通道，例如为除去或含有较少所述被控制移动的细胞或囊泡的溶液的流出通道，可称为溶液流出通道。所述颗粒流出通道和溶液流出通道的开口的宽度比例可设为约1:1-1:20，优选为约1:2-1:15，例如为约1:4-1:10。在本发明的其中一个方面，所述柔性颗粒离开涡旋通道的位置接近所述颗粒流出通道的开口。
在上述方法的步骤(3)，可通过调节超高频体声波谐振器的体声波作用区域的形状和位置，使得溶液中的被控制移动的柔性颗粒如细胞或囊泡，或核酸或蛋白质等生物大分子进入涡旋通道和顺着涡旋通道移动，并在设定的位置离开涡旋通道。由此所述柔性颗粒以指定位置和方向离开体声波作用区域，进入希望的流出通道，例如进入所述颗粒流出通道。该设定的离开涡旋通道的位置称为释放点，也即所述柔性颗粒离开体声波作用区域的位置。除去所述被控制移动的细胞或囊泡的溶液则保持流入方向，进入到前述溶液流出通道。
由于柔性颗粒如细胞或囊泡，或核酸或蛋白质等生物大分子等脱离涡旋通道的其中一个重要因素是沿流体通道方向的层流的影响，释放点通常位于涡旋通道的下游区域。在本发明的另一个方面，释放点通常处于涡旋通道出现转折或曲率变化的地方，即对应体声波作用区域边界出现转折或曲率变化的位置的上方，也即，对应所述释放点的体声波作用区域的边界存在转折或曲率变化。在不受有关理论约束的情况下，申请人认为，这个现象的原因在于，在涡流通道的转折或转角处，涡旋方向和声辐射力方向突然变化，进入涡旋通道的柔性颗粒如细胞或囊泡，或核酸或蛋白质等生物大分子中，符合合适的条件(如合适的尺寸)的颗粒由于已经聚焦到涡旋中心，在声辐射力的作用下能够随着涡旋通道改变运动方向并且快速重新聚焦到转折后的涡旋通道的中心；而不符合条件(如具有较小尺寸)的颗粒则会因为层流拖拽方向的跳变而受到更大的影响，从而离开涡旋通道。
在本发明的其中一个方面，本发明提供的上述方法适于处理含有大量柔性颗粒如细胞或囊泡，或核酸或蛋白质等的液体样品；所述大量柔性颗粒可以连续移动的方式进入涡旋通道和顺着涡旋通道移动，并在设定的位置离开涡旋通道，由此达到快速和大通量处理的目的。在本发明的其中一个方面，本发明提供的上述方法适于处理含有大量细胞或囊泡的样品，例如全血或血液级份。
本发明提供的上述方法可用于获得或纯化样品中的需要的柔性颗粒。在本发明的其中一个方面，所述方法可用于富集需要的柔性颗粒。
本发明提供的上述方法还可用于去除样品中的不想要的柔性颗粒，获得纯化的溶液。在本发明的其中一个方面，其可以从血液样品中去除某种细胞或囊泡，例如去除血细胞，获得血浆。
在本发明的其中一个方面，上述方法中还包括通过调节体声波的功率和/或通过调节所述溶液流经体声波区域的速度，来调节进入涡旋通道的柔性颗粒。未进入涡旋通道的柔性颗粒或进入涡旋通道但未到达指定释放点就离开涡旋通道的柔性颗粒则穿过体声波区域，沿样品进入流体通道的方向流出。
在本发明的其中一个方面，上述方法中所述超高频谐振器的体声波产生区域的边界线条(即对应的涡旋通道的形状)设置为适于目标柔性颗粒在涡旋通道中顺着涡旋通道移动至释放点。由此可避免目标柔性颗粒脱离涡旋通道而不按设定从释放点离开涡旋通道。
在本发明的其中又一个方面，其中通过调节所述超高频谐振器的体声波产生区域的边界形状使得目标柔性颗粒保持在涡旋通道中移动至释放点。如前所述，体声波产生区域的边界线条中存在转折或曲率变化，可能会增加柔性颗粒脱离涡旋通道的几率。因此，可以通过减少体声波产生区域的边界线条中出现转折或曲率变化来使得柔性颗粒保持在涡旋通道中移动，即减少脱离涡旋通道的柔性颗粒，提高分离的效率。
在本发明的其中又一个方面，通过调节所述超高频谐振器的体声波产生区域的边界线条与流体通道的角度使得柔性颗粒保持在涡旋通道中移动至释放点。发明人意外地发现，体声波产生区域的边界线条与流体通道的角度越小，越易于使得柔性颗粒保持在涡旋通道中移动，即减少脱离涡旋通道的柔性颗粒，提高分离的效率。
在本发明的其中又一个方面，所述微流控系统中的超高频体声波谐振器的体声波作用区域具有聚焦区与筛分区。聚焦区位于体声波作用区域上游(即靠近样品流入方向，离释放点较远的部分)，筛分区位于体声波作用区域下游(即靠近样品流出方向，离释放点较近或包括释放点的部分)。其中聚焦区的体声波作用区域的设置相对筛分区的设置更适于使得柔性颗粒保持在涡旋通道中移动：在聚焦区的涡流通道中的细胞或囊泡沿着和层流方向相同或相似方向移动，受到的涡旋拖拽力相对较小，更易于细胞或囊泡进入和保留在涡旋通道；在下游的筛分区，聚焦到涡旋中心的细胞相比于未聚焦的细胞能够更稳定的在涡流通道中被移动。在本发明的其中又一个方面，聚焦区的体声波作用区域边界线条与流体通道的角度相对筛分区的体声波作用区域边界线条与流体通道的角度较小。例如，聚焦区的体声波作用区域边界基本与流体通道方向一致或基本一致(例如角度小于10°)，在这个区域的涡流通道中的细胞受到的涡旋拖拽力基本上不改变细胞沿着层流方向的运动状态，只会让细胞横向迁移至涡旋中心，实现对细胞的聚焦；筛分区的体声波作用区域边界与流体通道角度较大，引导细胞移动方向偏离流体通道方向转移到指定的释放点，在筛分区，聚焦到涡旋中心的细胞相比于未聚焦的细胞能够更稳定的在涡流通道中被移动。
在本发明中，所述微流控设备通常包括功率调节装置，其调节所述超高频谐振器产生的体声波的功率。
在本发明中，所述微流控设备通常包括流速调节装置，其调节所述溶液流经体声波影响区域的速度。
在本发明的其中一个方面，其中所述细胞包括细胞簇。所述细胞簇通常由数个，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个，细胞组成。在本发明的其中一个方面，其中所述囊泡包括囊泡群。所述囊泡群通常由数个，例如2-50个囊泡组成。
在本发明的其中一个方面，其中所述功率调节装置的输出功率为约20-5000mW，优选为50-2000mW，更优选为100-1500mW。
在本发明的其中一个方面，其中所述流速调节装置可调节所述溶液流经体声波区域的速度为约0.1-10mm/s，优选为约0.3-5mm/s，更优选为约0.5-3mm/s。
在本发明的其中一个方面，其中所述流速调节装置可调节所述溶液流经体声波区域的速度为约0.01-100μL/min，优选为约0.1-50μL/min，更优选为约0.5-30μL/min。
在本发明的其中一个方面，其中所述微流控设备的流体通道的高度为约5-200μm，优选为约25-100μm，更优选为约30-80μm，例如为约40-60μm。
在本发明的其中一个方面，其中所述超高频体声波谐振器的体声波产生区域面积为约500-200000μm2，优选为约5000-50000μm2，最优选为约10000-25000μm2。
在本发明的其中一个方面，其中所述超高频体声波谐振器的体声波产生区域的边长为约30-500μm，优选为约40-300μm，最优选为约50-200μm。即对应涡流通道的边长(从最接近样品的上游一端到下游的释放点的距离)为约30-500μm，优选为约40-300μm，最优选为约50-200μm。
在本发明的其中一个方面，其中所述入口包括样品入口和设置于所述样品入口的一侧或两侧的辅助溶液入口。基于鞘流作用，辅助溶液可以用于控制样品液体在微流道中的流动方向和范围，使得样品液体充分流经所述超高频体声波谐振器的体声波产生区域。例如可通过控制辅助溶液的流速和流入面积来控制样品液体在微流道中的流动方向和范围。
在本发明的其中一个方面，前述方法中的微流控系统中设置多个具有相同的体声波产生区域的超高频谐振器。例如，所述多个超高频谐振器的体声波产生区域的释放点相同，例如其体声波产生区域的形状相同。由此可以将从上游超高频谐振器体声波产生区域发生不希望的脱离的细胞或囊泡，或核酸或蛋白质等生物大分子再次进行收集和按指定方向移动，增加分离的效率。
在本发明的其中一个方面，前述方法中的微流控系统中将所述流体通道分为不同区域，在不同区域设置分离不同细胞或囊泡的超高频谐振器。例如所述分离不同细胞或囊泡的超高频谐振器可具有不同形状的声波产生区域，或者施加不同功率的体声波，或者具有不同的流速。由此，可用于分离溶液中不同的细胞或囊泡，使其流入不同的流道或出口。
在本发明的其中一个方面，前述方法可用于分离(或分开)不同种类或不同性质(例如不同大小或密度等)的柔性颗粒如细胞或囊泡，或核酸或蛋白质等生物大分子。在本发明的其中又一个方面，前述方法可用于从血液中分离(或分开)白细胞和红细胞，例如分离(或分开)有核红细胞。在本发明的其中又一个方面，前述方法可用于从血液中分离(或分开)滋养层细胞。在本发明的其中又一个方面，前述方法可用于从样品中分离CTC。在本发明的其中一个方面，前述方法可用于从溶液中分离细菌尤其是病菌，或是分离(或分开)不同的细菌尤其是病菌。
在本发明的其中又一个方面，可通过以下方式的一种或其任意组合来选择分离(或分开)不同的柔性颗粒如细胞或囊泡，或核酸或蛋白质等生物大分子：
(a)调节体声波的功率；
(b)调节产生体声波的时间；
(c)调节溶液流经体声波区域的速度。
在本发明的其中一个方面，所述方法还包括提高超高频谐振器产生的体声波的功率，破坏细胞膜或囊泡膜，以释放细胞或囊泡内物质，如蛋白质或核酸等。
在本发明的其中一个方面，所述方法中的溶液为含有待分离细胞或囊泡的液体，例如体液、全血、任何含有细胞的血液级份、片段化的肿瘤、肿瘤细胞悬浮液、细胞培养物或培养物上清。在本发明的其中又一个方面，所述溶液为血液，包括全血或稀释的血液。
在本发明中，所述细胞为真核动物细胞，优选为哺乳动物细胞，更优选为人细胞。
本发明还提供了控制溶液中细胞或囊泡，或核酸或蛋白质或多糖等生物大分子等柔性颗粒的移动的微流控设备。所述微流控设备可用于获得或纯化需要的细胞或生物大分子。所述微流控设备也可用于纯化溶液(如血液)，例如通过分离去除溶液中的细胞或囊泡，获得清除了所述细胞或囊泡的纯化的液体(例如除去血细胞的血浆)。本发明提供的微流控设备用于处理生物活性细胞或分子，因此具有处理费生物活性物质的设置或材料。例如，其流道内表面可采用生物相容性的材料制成。又例如，其具有防止交叉污染特别是导致污染扩增的设计。
在本发明的一个方面，提供了一种用于分离细胞或囊泡的微流控设备，包括：
流体通道，其具有入口和出口；
一个或多个超高频体声波谐振器，其设置于所述流体通道的一个壁上，所述超高频体声波谐振器可在所述流体通道产生传向所述流体通道的对侧的壁的频率为约0.5-50GHz的体声波；
功率调节装置，其调节所述超高频谐振器产生的体声波的功率；
流速调节装置，其调节所述溶液流经体声波区域的速度，
所述超高频谐振器可发射传向所述流体通道的对侧的壁的体声波，在溶液中产生由超高频谐振器的体声波产生区域的边界限定的涡旋通道，溶液中的细胞或囊泡进入涡旋通道和顺着涡旋通道移动，并在设定的位置离开涡旋通道，该位置称为释放点。
在本发明的其中一个方面，其中对应所述释放点的体声波作用区域存在转折或曲率变化。
在本发明的其中一个方面，其中所述超高频谐振器的体声波产生区域的边界线条设置为适于细胞或囊泡保持在涡旋通道中顺着涡旋通道移动至释放点。
在本发明的其中一个方面，其中所述超高频谐振器的体声波产生区域的边界线条形状使得细胞或囊泡保持在涡旋通道中移动至释放点。例如通过减少体声波产生区域的边界线条中出现转折或曲率变化。
在本发明的一个方面，其中所述超高频谐振器的体声波产生区域的边界线条与流体通道的角度使得细胞或囊泡保持在涡旋通道中移动至释放点。例如，使得体声波产生区域的边界线条与流体通道的角度较小。
在本发明的其中一个方面，其中超高频体声波谐振器的体声波作用区域具有聚焦区与筛分区，所述聚焦区位于体声波作用区域上游，所述筛分区位于体声波作用区域下游，其中聚焦区的体声波作用区域的设置相对筛分区的设置更适于使得细胞或囊泡保持在涡旋通道中移动。在本发明的其中一个方面，其中聚焦区的体声波作用区域边界线条与流体通道的角度相对筛分区的体声波作用区域边界线条与流体通道的角度较小。在本发明的其中一个方面，其中控制流经聚焦区的体声波作用区域的液流速度小于流经筛分区的体声波作用区域的液流速度。
在本发明的其中一个方面，其中所述功率调节装置的输出功率为约20-5000mW，优选为50-2000mW，更优选为100-1500mW。
在本发明的其中一个方面，其中所述流速调节装置可调节所述溶液流经体声波区域的速度为约0.1-10mm/s，优选为约0.3-5mm/s，更优选为约0.5-3mm/s。
在本发明的其中一个方面，其中所述流速调节装置可调节所述溶液流经体声波区域的速度为约0.1-100μL/min，优选为约0.1-50μL/min，更优选为约0.5-30μL/min。
在本发明的其中一个方面，其中所述微流控设备的流体通道的高度为约20-200μm，优选为约25-100μm，更优选为约30-80μm，例如为约40-60μm。
在本发明的其中一个方面，其中所述超高频体声波谐振器的体声波产生区域面积为约500-200000μm2，优选为约5000-50000μm2，最优选为约10000-25000μm2。
在本发明的其中一个方面，其中所述超高频体声波谐振器的体声波产生区域的边长为约30-500μm，优选为约40-300μm，最优选为约50-200μm。
在本发明的其中一个方面，其中流体通道的所述入口包括样品入口和设置于所述样品入口的一侧或两侧的辅助溶液入口。
在本发明的其中一个方面，其中所述流体通道具有至少两个流出通道，其中一个为所述被控制移动的细胞或囊泡的流出通道，称为颗粒流出通道；另一个为除去所述被控制移动的细胞或囊泡的溶液的流出通道，可称为溶液流出通道。
在本发明的其中一个方面，其中设置多个具有相同的体声波产生区域的超高频谐振器。
在本发明的其中一个方面，其中将所述流体通道分为不同区域，在不同区域设置分离不同细胞或囊泡的超高频谐振器。例如所述分离不同细胞或囊泡的超高频谐振器可具有不同形状的声波产生区域。或者例如施加不同功率的体声波，或者具有不同的流速。
在本发明的其中一个方面，其中所述超高频体声波谐振器为薄膜体声波谐振器或固态装配型谐振器，例如为厚度伸缩振动模式的声波谐振器。
在本发明的其中一个方面，其中所述设备的超高频体声波谐振器的压电层的厚度范围为1nm～2um。
附图标记
100微流道装置 101流体通道
200芯片外壳 201库尔特细胞计数器 202超高频体声波谐振器 203顶电极层 204压电层 205底电极层 206声波反射层 声阻抗层 207底衬层 208顶部
300 PCL控制器 301高频信号发生器 302功率放大器 303阻抗仪
400液体注入和流速调节装置
500声射流 501涡旋
600较大尺寸颗粒 601中等尺寸颗粒 602较小尺寸颗粒
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1本申请实施例提供的一种微流控设备系统的结构示意图；
图2本申请实施例提供的一种微流控设备系统中的超高频体声波谐振器的结构示意图；其中,(a)表示图1所示的微流控系统的微流道的俯视图(左侧)及A-A的剖面图(右侧)；(b)表示超高频体声波谐振器的俯视图(左侧)(其中的黑色五边形部分为超高频体声波谐振器的声波作用区域)以及B-B的剖视图(右侧)；(c)表示微流道+超高频体声波谐振器的俯视图(左侧)以及剖视图(右侧)；
图3显示Hela细胞在本申请实施例提供的一种微流控设备系统中进入涡流通道。图3(a)显示的单个Hela细胞在微流控设备系统超高频体声波谐振器发生体声波形成的涡旋通道中的运动轨迹图像(单个细胞在不同时间的轨迹叠加)；图3(b)显示Hela细胞的运动轨迹示意图(多个细胞的运动轨迹叠加)和分析图；图3(c)为Hela细胞的时间和速度分析图。
图4显示细胞在本申请实施例提供的一种微流控设备系统中的涡旋通道中的运动。图4(a)显示涡旋中细胞移动的图像；图4(b)显示停止体声波后细胞沉降；图4(c)显示涡旋隧道中细胞的排布。
图5显示本申请实施例提供的一种微流控设备系统能够从含有Hela细胞的全血混合液中分离和捕获Hela细胞。图5(c)和(d)显示两种微流道设置方式下Hela细胞被捕捉和血细胞被释放的照片，图5(a)和(b)分别是图5(c)和(d)的分析和示意图。图5(e)显示体声波作用区域上游和下游(图5(c)和(d)中的颜色线)的血细胞分布。
图6显示不同超高频体声波谐振器的体声波作用区域设置方式对分离全血中血细胞的影响。
图7显示不同超高频体声波谐振器的体声波作用区域设置方式对分离全血中血细胞的影响。
图8显示不同微流控设备的设置方式对分离核酸的影响。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的区间。
实施例1实验方法和材料
微流体通道和超高频体声波谐振器制备：
通过软光刻制备由聚二甲基硅氧烷(PDMS)制成的微流体通道。
体声波谐振器装置通过在硅基的晶圆上进行化学气相沉积、金属溅射、光刻等方法制备。具体的方法如下：
1.使用浓硫酸与双氧水体积比为3:1的食人鱼溶液对硅片的表面进行彻底的清洗，该方法可以有效地去除硅片上的有机物和无机物。
2.在清洗过的硅片上，通过表面溅射的方法形成一层氮化铝薄膜，再使用离子增强型化学气相沉积的方法，沉积一层二氧化硅薄膜。接着使用同样的方法，交替沉积氮化铝薄膜和二氧化硅薄膜，形成氮化铝和二氧化硅交替重叠的布拉格声反射结构。
3.在布拉格反射层结构上，溅射出一层600nm的钼薄膜作为底电极。接着采用标准光刻技术，包括涂胶、曝光、显影等，对钼电极薄膜进行光刻，之后进行刻蚀，形成有目标图案的底电极。
4.在钼电极上再溅射一层氮化铝薄膜作为压电层。使用干法刻蚀对氮化铝薄膜定义图案。
5.使用负光刻胶对掩模版上的图案进行转移，再溅射出一层50nm厚的钛钨合金，它作为粘附层可以增加金电极的粘附性。之后使用蒸镀的方法长出一层300nm厚的金薄膜的上电极。最后使用丙酮去除掉目标图案周围的金薄膜，形成有目标图案的金电极。
最后，体声波谐振器装置与PDMS微通道芯片粘合集成。体声波谐振器装置设置在通道的中间位置。
将体声波谐振器装置用标准SMA接口与网络分析仪连接，通过测试频谱找到谐振峰，可测得体声波谐振器装置在微流道中发出的体声波的频率。
仪器和材料
高频信号发生器：(MXG Analog Signal Generator,Agilent,N5181A 100kHz-3GHz
功率放大器：Mini-Circuits,with 35dBm enhancement of the original RFsource power
注射泵：New Era Pump Systems,Inc.,NE-1000
细胞：
Hela细胞株：广州广州吉妮欧生物科技有限公司，ATCC#CCL2
细胞培养：
在补充有10％FBS(Thermo)，100U/ml青霉素(Thermo)和100ug/ml链霉素(Thermo)的DMEM培养基(Thermo)中培养293T细胞。培养的细胞密度在1x 105/mL～2x 106/mL。在进行微流道实验时，可稀释为1x105/mL进行实验。PBS缓冲液(Gibco)。
细胞或肿瘤标记物或染色剂：
Calcein-AM(北京索莱宝科技有限公司，中国)
Anti-EpCAM(Biolegend，USA)
4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(Invitrogen,USA)
实施例2
在本实施例的具体实施过程中，提供了一种微流控设备，其可用于在溶液中分离和捕捉柔性颗粒，特别是直径约为0.2-30um的柔性颗粒。柔性颗粒可以是人工的或天然的，通常所述颗粒为带有膜结构的微团，特别是具有脂质双分子层或类脂质双分子层的微团。本发明涉及的柔性颗粒通常具有约0.2-30um的直径。本发明适合处理的柔性颗粒通常约0.8-25um的直径，优选为约1-20um的直径。
本发明的方法和设备可用于溶液中分离柔性颗粒，例如在血液中分离血细胞，得到纯化的血浆。
如图1所示，所述微流控设备100包括流体通道101，超高频体声波谐振器202，体声波驱动和功率调节装置，液体注入和流速调节装置400。
本发明提供的微流控设备可以单独存在，也可以是一个微流控系统的一部分，例如以可装卸的芯片形式存在。微流控系统或装置可用于容纳和运输液体等流体材料，其流道尺寸在微米甚至纳米级别。典型的微流控系统和设备通常包括毫米级或更小尺寸的结构和功能单位。
所述微流控设备的流体通道，或称为微流道，除了供流体进入和流出的开口以外，一般是封闭的。流体通道的截面通常具有0.1-500μm的尺寸，其可以为各种形状，包括椭圆、矩形、方形、三角形、圆形等。可以用各种已知的微制备技术来制备流体通道，其材料包括但不限于硅石、硅、石英、玻璃或聚合材料(例如PDMS、塑料等)。可以用涂层涂覆所述通道。涂层可改变通道的特性，并且可以图案化。例如，涂层可以是亲水的，疏水的，磁性的，传导的，或生物性功能化的。
在本发明的其中一个方面，所述微流控设备的流体通道的高度为约20-200μm，优选为约25-100μm，更优选为约30-80μm，例如为约40-60μm。
在本发明的其中一个方面，所述微流控设备的流体通道的宽度为约50-1000μm，优选为约100-500μm，更优选为约150-300μm。
本实施例中的微流道100具有供流体出入的入口和出口。所述入口与液体注入装置连接，用于接收液体的注入。本实施方式的所述入口包括样品入口101及缓冲液入口102。其中，所述缓冲液入口为设置于所述样品入口的两侧的两个入口，与所述样品入口交汇相通。所述微流道入口通过上述三相流方式(中间的样品流，两边的缓冲液流)的设置，有利于通过对中间的样品入口通入的样品进行被动聚焦。
如图1所示，本实施例的微流控设备包括液体注入和流速调节装置400，用于控制液体注入及控制液体的流速。所述液体可以为含有样品的液体。例如，所述样品为含有待捕捉细胞的液体。所述样品可以包含体液、全血、任何含有细胞的血液级份、片段化的肿瘤、肿瘤细胞悬浮液、细胞培养物或培养物上清等。所述液体可以为各种体液，包括血液、组织液、细胞外液、淋巴液、脑脊液、房水、尿液、汗液等。
可以通过外部压力源、内部压力源、电子动力学或磁场动力学方式来控制注入液体的流速。外部压力源和内部压力源可以是泵，例如蠕动泵、注射泵或气动泵等。本实施例中采用由电脑微调的注射泵来控制液体注入的流速。
在本发明中，液体的流速范围在约0.1-10mm/s，优选为约0.3-5mm/s，更优选为约0.5-3mm/s。在本发明的另一个方面，所述液体的流量流速范围在约约0.1-100μL/min，优选为约0.1-50μL/min，更优选为约0.5-30μL/min。
所述通道可以为单条通道，或是多个平行或以其它形式共同排布、具有共同输出和输入的通道，其中可以根据需要共同或独立控制各通道的流体的流出流入和其流速。
本发明的微流控设备具有一个或多个超高频体声波谐振器200，其设置于流体通道的一个壁上(通常是设置在流道的底部)。所述超高频体声波谐振器可在所述流体通道产生传向所述流体通道的对侧的壁(通常是指流道的顶部)的频率为约0.5-50GHz的体声波。
可使用于本发明的超高频体声波谐振器可以为薄膜体声波谐振器或固态装配型谐振器，例如为厚度伸缩振动模式的声波谐振器。
如图1所示，本实施方式的微流控设备具有多个设置在流道的底部的超高频体声波谐振器202。
所述超高频体声波谐振器是体声波产生部件，可在所述流体通道产生传向所述流体通道的对侧的壁的体声波。所述超高频谐振器可发射传向所述流体通道的对侧的壁的体声波，在溶液中产生由超高频谐振器的体声波产生区域的边界限定的涡旋通道，溶液中的细胞或囊泡进入涡旋通道和顺着涡旋通道移动，并在设定的位置离开涡旋通道，该位置称为释放点。
如图2(b)右侧的剖面图所示，所述超高频体声波谐振器包括由下往上依次设置的声波反射层206、底电极层205、压电层204及顶电极层203。所述底电极层、压电层、顶电极层及声波反射层相重叠区域构成体声波产生区域。如图2(b)左侧的俯视图所示，所述超高频体声波谐振器的顶部表面配置在流体通道的壁上，向对侧的壁产生传播方向与所述壁垂直的体声波；一般来说，超高频体声波谐振器的顶部表面构成的区域即为体声波产生区域，在本文中也称为体声波区域或体声波作用区域。在本发明的其中一个方面，所述声波作用区域面积为约500-200000μm2，优选为约5000-50000μm2，最优选为约10000-25000μm2。如图2所示的本实施例的体声波作用区域为五角形，其边长为约120μm微米。超高频体声波在溶液中产生的连续涡旋形成声流体涡旋通道。由于涡旋是由于声波衰减引发的体积力产生的，涡旋的中心轴在体声波作用边界的上方，因此涡旋通道的形状基本与体声波作用区域的形状相同，位于体声波作用区域边界的上方。
在本发明中，所述体声波作用区域的形状至少包括但不限于以下其一：圆形，椭圆形、半圆、抛物线、顶点为锐角或者钝角的多边形、顶点用圆弧替代的多边形、顶点为锐角、半圆或抛物线任一组合的多边形，或者同样形状的重复排列的方阵式或圆环式阵列。本申请提供上述形状的声波作用区域，但其他任意形状的声波作用区域也在本申请的保护范围之内。在本发明中，一种优选的超高频谐振器的体声波产生区域的形状为纺锤形。
在本发明的其中一个方面，上述方法中所述超高频谐振器的体声波产生区域的边界线条(即对应的涡旋通道的形状)设置为适于细胞或囊泡在涡旋通道中顺着涡旋通道移动至释放点。由此可避免细胞或囊泡脱离涡旋通道而不按设定从释放点离开涡旋通道。
在本发明的其中又一个方面，其中通过调节所述超高频谐振器的体声波产生区域的边界线条形状使得细胞或囊泡保持在涡旋通道中移动至释放点。如前所述，体声波产生区域的边界线条中存在转折或曲率变化，可能会增加细胞或囊泡脱离涡旋通道的几率。因此，可以通过减少体声波产生区域的边界线条中出现转折或曲率变化来使得细胞或囊泡保持在涡旋通道中移动，即减少脱离涡旋通道的细胞或囊泡，提高分离的效率。
在本发明的其中又一个方面，通过调节所述超高频谐振器的体声波产生区域的边界线条与流体通道的角度使得细胞或囊泡保持在涡旋通道中移动至释放点。发明人意外地发现，体声波产生区域的边界线条与流体通道的角度越小，越易于使得细胞或囊泡保持在涡旋通道中移动，即减少脱离涡旋通道的细胞或囊泡，提高分离的效率。
在本发明的其中又一个方面，所述微流控系统中的超高频体声波谐振器的体声波作用区域具有聚焦区与筛分区。聚焦区位于体声波作用区域上游(即靠近样品流入方向，离释放点较远的部分)，筛分区位于体声波作用区域下游(即靠近样品流出方向，离释放点较近或包括释放点的部分)。其中聚焦区的体声波作用区域的设置相对筛分区的设置更适于使得细胞或囊泡保持在涡旋通道中移动：在聚焦区的涡流通道中的细胞或囊泡沿着和层流方向相同或相似方向移动，受到的涡旋拖拽力相对较小，更易于细胞或囊泡进入和保留在涡旋通道；在下游的筛分区，聚焦到涡旋中心的细胞相比于未聚焦的细胞能够更稳定的在涡流通道中被移动。在本发明的其中又一个方面，聚焦区的体声波作用区域边界线条与流体通道的角度相对筛分区的体声波作用区域边界线条与流体通道的角度较小。例如，聚焦区的体声波作用区域边界基本与流体通道方向一致或基本一致(例如角度小于10°)，在这个区域的涡流通道中的细胞受到的涡旋拖拽力基本上不改变细胞沿着层流方向的运动状态，只会让细胞横向迁移至涡旋中心，实现对细胞的聚焦；筛分区的体声波作用区域边界与流体通道角度较大，引导细胞移动方向偏离流体通道方向转移到指定的释放点，在筛分区，聚焦到涡旋中心的细胞相比于未聚焦的细胞能够更稳定的在涡流通道中被移动。在本发明的其中又一个方面，控制流经聚焦区的体声波作用区域的液流速度小于流经筛分区的体声波作用区域的液流速度。
如图2右侧的剖面图所示，本实施例的流体通道可具有多个超高频体声波谐振器。在本发明的其中一个方面，它们以与流体运动方向一致的方向直线排列。
本发明采用的超高频体声波谐振器是厚度伸缩振动模式，其中的压电材料薄膜层在垂直方向上生长而制成，通过d33压电系数耦合垂直电场而被激发。本发明采用的超高频体声波谐振器可以在装置和液体的界面产生局部化的声流，不需要耦合介质或结构的帮助。
本发明采用的超高频体声波谐振器产生的超高频体声波，在溶液中基本上不产生驻波。如图1右图所示，超高频谐振器发射传向所述流体通道的对侧的壁(例如流道顶部)的体声波，声波衰减到流体中产生的体积力使得流经的溶液中出现声射流500，导致微流道中的液体产生局部的立体的旋涡501，超高频体声波引起的连续涡旋形成声流体涡旋通道。由于涡旋是由于声波衰减引发的体积力产生的，涡旋的中心轴在体声波作用边界的上方，因此涡旋通道的形状基本与体声波作用区域的形状相同，位于体声波作用区域边界的上方。声流体涡旋是由于声波在液体介质中传播的非线性引起的。而声波的振幅的强弱直接决定了声流体涡旋的强度。通过调节施加功率可以调控特超声器件的振幅，即声波的振幅，进而控制了声流体涡旋的流速。在涡旋中的颗粒(包括较大尺寸颗粒600、中等尺寸颗粒601，较小尺寸颗粒602)受到的力包括涡旋产生的流体拖拽力(Stokes drag force)，层流产生的惯性拖拽力(inertial lift force)和声波衰减引起的声辐射力(acoustic radiationforce)。由于流体拖拽力的大小与颗粒如颗粒直径成正向关系，而声辐射力的大小与颗粒尺寸的平方成正向关系。随着颗粒的增大，受到的力会从以流体拖拽为主导转变到以声辐射力为主导，声辐射力将颗粒推向涡旋中心。较大的颗粒受到更大的声辐射力从而移动到涡旋中心；而较小的颗粒则在涡旋拖拽力的作用下在外围旋转，进一步的，在层流产生的侧向拖拽力作用下向体声波作用区域的下游移动。
颗粒在涡旋后涡旋通道中受到的流体拖拽力和声波引起的声辐射力可以根据某些公式推算，但声流体涡旋产生的惯性拖拽力(inertial lift force)几乎无法用简单的物理学原理和公式计算，特别是在含有复杂成份的流体的情况下。与现有技术中的二维的颗粒捕获相比，本发明的方法和设备涉及可变形的细胞或囊泡，其在声流体旋涡及其形成的通道中的受力情况和运动轨迹更复杂，因为各个涡旋之间的相互作用和颗粒在涡旋之间的迁移都对流体中的的捕获有影响，特别是在流体中存在大量的所述细胞或囊泡的情况下，因为细胞或囊泡相互之间由于碰撞等现象存在相互作用和影响，其在涡旋中的受力和运动与理论计算和模拟的受力和运动存在不同，在涡旋通道中的运动方式和轨迹更是无法根据理论计算和模拟预测。
申请人通过实验出乎意料地发现，在本发明的方法和装置中，溶液中的细胞或囊泡经过超高频体声波造成的声流体涡旋通道区域时，在适合的流速和体声波功率的条件下，会进入涡旋通道和沿着涡旋通道运动；在层流产生的侧向拖拽力作用下，在涡旋通道的某个(些)位置，细胞或囊泡会离开体声波作用区域，向下游移动，即被释放；细胞或囊泡离开涡旋通道的位置也称为释放点。由于细胞或囊泡脱离涡旋通道的其中一个重要因素是沿流体通道方向的层流的影响，释放点通常位于涡旋通道的最下游区域。
发明人还出乎意料地发现，细胞或囊泡离开涡旋通道的位置通常是在涡旋和声辐射力的跳变点。在产生涡流的体声波功率以及溶液流速、流体通道形状和尺寸不变的条件下，细胞或囊泡离开涡旋通道的位置通常处于涡旋通道出现转折或转角的地方，即对应体声波作用区域边界出现转折或转角的位置的上方。在不受有关理论约束的情况下，申请人认为，这个现象的原因在于，在涡流通道的转折或转角处，涡旋方向和声辐射力方向突然变化，较大的细胞或粒子由于已经聚焦到涡旋中心，并且受到更大的声辐射力，能够随着涡旋通道改变运动方向并且快速重新聚焦到转折后的涡旋通道的中心；而较小的粒子或细胞则会因为层流拖拽方向的跳变而受到更大的影响，从而离开涡旋通道。
通过调节超高频体声波谐振器的体声波作用区域的形状和位置，使得溶液中的细胞或囊泡进入涡旋通道和顺着涡旋通道移动，并在设定的位置离开涡旋通道。由此所述细胞或囊泡以指定位置和方向离开体声波作用区域，进入希望的流出通道，例如进入所述颗粒流出通道。该设定的离开涡旋通道的位置称为释放点，也即所述细胞或囊泡离开体声波作用区域的位置。除去所述被控制移动的细胞或囊泡的溶液则保持流入方向，进入到前述溶液流出通道。
由此，本申请人的发明人发现和提供了更有效地分离目标细胞或囊泡的方法。
在本发明中，薄膜体声波谐振器的频率主要由压电层的厚度和材料决定。本发明采用的薄膜体声波谐振器的压电层的厚度范围为1nm～2um。本发明的超高频体声波谐振器的频率在约0.5-50GHz，优选为约1-10GHz。
所述超高频体声波谐振器产生的体声波由高频信号发生器的信号驱动。驱动谐振器的脉冲电压信号可以用脉冲宽度调制驱动，脉冲宽度调制可以产生任何期望的波形，例如正弦波、方波、锯齿波或三角波。脉冲电压信号也可以具有调幅或调频开始/停止能力，以开始或消除体声波。
本发明的微流控设备还包括功率调节装置，其调节所述超高频谐振器产生的体声波的功率。在本实施例中，所述功率调节装置为具有功率调节功能的功率放大器。在本发明的其中一个方面，所述功率调节装置的输出功率为约20-5000mW，优选为50-2000mW，更优选为100-1500mW。由于薄膜体声波谐振器能量转换效率高，基本没有损耗，所述功率调节装置的输出功率可基本上视为薄膜体声波谐振器在流体中产生体声波的输出功率。本发明的微流控设备中，所述功率调节装置可与高频信号发生器连接。所述功率放大器的输出电路分别与所述超高频体声波谐振器的底电极、压电层、顶电极连接。
实施例3细胞在超高频体声波造成的涡流通道中的移动
将Hela细胞溶于DMEM培养液，制备成样品(细胞含量为约1*105/mL)。另外，用Calcein-AM标记Hela细胞，以便观察其运动途径。将样品从样品入口注入至微流道中。
所述微流道的高度为50μm。超高频体声波谐振器频率1.83GHz，输出功率为30mW。控制样本输入流速为1μL/min，即约0.67mm/s。
结果如图3所示。图3(a)显示单个Hela细胞在微流控设备系统的超高频体声波谐振器发生体声波形成的涡旋通道中的运动轨迹。其为同一个单个细胞在不同时间的多幅图像的叠加，以显示其运动轨迹。图3(b)为不同单个细胞的运动轨迹的示意图：上图为顶视图，下图为侧视图。图3(c)为Hela细胞的时间和速度分析图。
在本发明的微流控设备中，超高频体声波谐振器产生的体声波使得流经的流体产生涡旋，每个涡旋与相邻的涡旋相连通，沿着超高频体声波谐振器的声波作用区域的边界形成声流体涡旋通道或涡旋隧道。多个涡旋的组合效应以及涡流和层流之间的相互作用，使得进入涡旋通道的细胞沿涡旋通道移动，而且细胞是漂浮在微流道底部的上方，与微流道没有接触。
图3(a)中的图像序列显示和证明了单个HeLa细胞的移动轨迹。可以将移动过程分为在区域a-b-c中发生的三个阶段，如图3(a)和图3(c)所示。在区域a中，细胞在侧流中以均匀的速度移动。在区域b中，细胞运动的方向被涡流阵列改变，并且细胞进入声波产生的涡流隧道，同时在3-D轴上聚焦并沿固定路径移动。具有不同初始位置的细胞在进入涡流阵列时的速度差异很大。由于与涡流的相对方向的差异，初始位置在微通道下层的细胞加速，而初始位置在上层的细胞减慢。在区域c中细胞运动的速度逐渐减慢。由于在涡旋隧道调整了细胞的轨迹，细胞的减速和移动的过程具有良好的稳定性，不同的进入初始位置的细胞具有良好的减速和移动的一致性。
图3(b)示意图进一步说明了细胞在流道中和体声波作用下的运动情况。图3(b)是不同的单个细胞的运动轨迹的叠加示意图。图3(b)的上图为顶视图，下图为侧视图。从顶视视角可见，细胞的轨迹仅分布在超高频体声波谐振器的声波作用区域的边界。从侧视角度，可以看出细胞都漂浮在通道底部的上方，与底部没有接触。
在实验和模拟计算上发现，流体，特别是涡流中的细胞受力和运动情况与模拟公式推导的理论值相差甚大，无法预测。细胞具有与聚苯乙烯颗粒等具有明显不同的机械特性，例如惰性，刚性，具有多种物质的复杂结构等。在声波动力学和涡旋流体力学范畴，在理论计算涡流中的物体的运动时，该物体相对于溶液介质的密度和声速差是非常重要的因素。而且，由于细胞在声波力和拖曳力的变形，使得涡流对其所施加的总的力会有明显的不可预测的影响。
实施例4细胞在微流道中的悬浮和沉降
在现有技术的声流涡旋方法中，颗粒或细胞在微流道的z轴(即流道的垂直方向)的运动被忽略，因为平面内声流是主要的涡旋。然而，z轴的轨迹对于单细胞操作和高精度的感测非常重要。由于本发明采用的超高频体声波的独特的TE振动模式，在本发明的微流体系统中主导的涡旋平面外(out-of-plane)的。为了更好地研究本发明的微流体系统中超高频体声波产生的涡旋隧道，采用Calcein-AM标记的Hela细胞，使用共聚焦显微镜(Leica，Germany)观察和测量细胞在z轴上的运动。为了捕获涡流隧道内的粒子轨迹，使用了x-z-t模式。在此模式下，拍摄速度可达到每秒37帧。
根据实施例3的相同实验设置，但将样本含有Hela细胞的输入流速降低为0.1μL/min。在含有细胞的样品及缓冲液通入微流道之后，开启信号发生器，细胞被捕捉在声波作用区域。然后调整入口和出口的压力至相同，流体停滞。观察细胞在涡旋中的运动。然后信号发生器关闭，观察细胞的运动。
结果如图4所示。图4(a)是涡旋中细胞移动的图像，其为复合堆叠图像(6幅图像，相距27ms)，其中红点显示每帧中粒子的中心，绿色虚线圆圈表示范围粒子运动和红色箭头表示粒子运动的方向。当信号发生器电源打开，体声波产生，在流道内形成涡旋和涡旋隧道，颗粒相对“静止”地悬浮在距离芯片表面。如图4(b)所示，当电源关闭时，体声波消失，颗粒在重力和浮力的共同作用下沉淀到芯片表面。结果表明，粒子确实被困在涡旋隧道中。
图4(c)显示，Calcein-AM标记的Hela细胞被捕获在涡旋隧道中，涡旋隧道具有和超高频体声波谐振器的声波作用区域的边界一样的形状。
实施例5全血中分离不同的细胞
血液是最原始和最适合细胞的环境。在血液环境中，细胞具有最佳的活力和完整的功能，这对于生物学研究很重要，例如细胞代谢，蛋白质组学。然而，与稀释的血液样本相比，全血是更具挑战性的样本。从物理参数来看，全血更粘稠和浑浊，这是都会对细胞操作有严重的负面影响。物理场，如介电场，磁场，流体动力场，在血液样本中是紊乱的。此外，高密度的细胞，特别是红细胞(109/mL)，会引起细胞之间的强烈相互作用，从而改变标本的轨迹并影响细胞运动的稳定性。
发明人证明了本发明的设备和方法能够在全血中选择性控制和分离目标细胞。
将Hela细胞溶于DMEM培养液，与全血混合，制备成测试样品样品(Hela细胞含量调节为约1x105个/mL)。
将样品从样品入口注入至微流道中。以及将PBS缓冲液从两侧的缓冲液入口注入至微流道中。PBS作为夹持鞘流，作用是保证样品流体的横向范围，确保所有样品都会经过器件上方。通过三相流的方式对注入样品进行被动聚焦，使得样品更好地流经高频体声波谐振器的声波作用区域。
结果如图5所示，含有Hela细胞的全血中的Hela细胞被选择性地进入涡流通道和在涡流通道内移动。
图5(c)和(d)显示两种微流道设置方式下Hela细胞进入涡流通道和血细胞通过体声波区域的照片，图5(a)和(b)分别是图5(c)和(d)的分析和示意图。本实施例中，超高频体声波谐振器的体声波作用区域为五边形。其中图5(c)中，体声波作用区域设置为液体流入方向下游存在突起拐角(五边形的一个角)：此时，血细胞离开体声波作用区域的其中一个点在该五边形的角附近。图5(d)中体声波作用区域调整为其中一个角对着通道液体流入方向，沿流道中线对称的放置方式：此时，血细胞的释放点，位于沿流体方向的下游边线的两端。图5(e)显示体声波作用区域上游和下游(图5(c)和(d)中的颜色线)的血细胞分布。绿色曲线和蓝色曲线表示血细胞平均在两个对称释放点处释放。图5(f-1)显示三相流的输入方式对注入样品进行被动聚焦，使得样品更好地流经高频体声波谐振器的声波作用区域。图5(f-2)显示电源打开，在微流道内产生体声波时血细胞的流动。图5(f-3)-(f-5)显示CTC被选择性进入涡流隧道：复合堆叠图像序列展示了CTC的运动轨迹。图5(f-6)显示选择性CTC进入涡流隧道的结果：合并图像显示，在本发明的装置在释放血细胞的同时稳定使得CTC进入和保留在涡流隧道。
释放点为涡旋和声辐射力的跳变点。在器件是正五边形的情况中，细胞被涡旋捕捉聚焦后，由于每个边都是直线，意味着层流产生向下游移动的横向拖拽力，涡旋拖拽力在流道径向的分量都是稳定的，这使得被聚焦的细胞在沿着边界运动是不容易脱落的。而到了顶点处，涡旋方向和声辐射力方向都突然变化，较大的细胞由于已经聚焦到涡旋中心，并且受到更大的声辐射力，是能够随着涡旋改变运动方向并且快速重新聚焦到新边的涡旋中心的；而较小的细胞则会因为层流拖拽力为主导而从器件上脱落。通过调整调整微流道装置，例如超高频体声波谐振器的体声波作用区域，使得非目标细胞被层流带走，只有目标细胞能够进入和/或保留在涡流通道。
实施例6不同超高频体声波谐振器的体声波作用区域设置方式对分离全血中血细胞的影响
本实验检测采用本发明的微流控系统和方法将全血中血细胞与血浆分开的效果。
根据实施例1和2的描述的方法，制备和构建如图6所示的微流道。其中每个微流道具有3个体声波发生区域相同的按顺序排列的超高频谐振器。在流道方向上采用多个超高频谐振器可加强对同一目标颗粒转移的控制。其中超高频谐振器的表面(即体声波发生区域，图中显示为三角形器件)位于微流道通道一侧(图中左侧)，微流道设置两个溶液入口，右侧入口通入全血样品。左侧通入PBS溶液，通过调节PBS溶液流速和鞘流聚焦作用，使样品流充分通过体声波发生区域。三角形体声波发生区域(即涡流通道)的下游角为设定的细胞释放点，释放的细胞从下游角位置离开，顺微流道通道方向进入细胞流出通道(图下方左边的通道)。
所述微流道的高度为50um。超高频体声波谐振器频率1.83GHz，检测的三种输出功率如图6所示。控制样本输入流速为0.5uL/min，PBS缓冲液输入流速为5uL/min。
图6最左侧两幅图、中间两幅图和右边两幅图分别显示在超高频体声波功率分别为1660mW、417mW和208mW下分离血细胞的效果。其中每两幅图中的左图中的三角形体声波发生区域的边界(即涡流通道的走向)与微流道中液体(即层流)的流向形成的夹角比右图中的体声波发生区域的边界与微流道中液体的流向形成的夹角较大。
结果如图6所示，涡流通道与层流的流向形成的夹角越小，涡旋通道中脱落的细胞数目就越少，即到达三角形涡流通道的下游角(即细胞释放点)和脱离的细胞越多。可见，涡流通道与层流的流向形成的夹角越小，越易于使得细胞保持在涡旋通道中移动，即减少脱离涡旋通道的细胞，提高分离的效率。
由此，在本发明的其中一个方面，将微流控系统中的所述超高频谐振器的体声波产生区域的边界线条(即对应的涡旋通道的形状)设置为适于细胞或囊泡在涡旋通道中顺着涡旋通道移动至释放点。由此可避免细胞或囊泡脱离涡旋通道而不按设定从释放点离开涡旋通道。
在本发明的其中又一个方面，通过调节所述超高频谐振器的体声波产生区域的边界线条与流体通道的角度使得细胞或囊泡保持在涡旋通道中移动至释放点。发明人意外地发现，体声波产生区域的边界线条与流体通道的角度越小，越易于使得细胞或囊泡保持在涡旋通道中移动，即减少脱离涡旋通道的细胞或囊泡，提高分离的效率。
另外，如图6所示，在其它系统参数条件相同的情况下，功率越高，到达三角形涡流通道的下游角(即细胞释放点)和脱离的细胞越多，分离效率越高。
实施例7不同超高频体声波谐振器的体声波作用区域设置方式对分离全血中血细胞的影响
构建如图7所示的微流道。其中超高频谐振器的表面(即体声波发生区域，图中显示为纺锤形器件)位于微流道通道一侧(图中右侧)并向左倾斜。微流道设置两个溶液入口，右侧入口通入血液样品。左侧通入PBS溶液，通过调节PBS溶液流速和鞘流聚焦作用，使样品流充分通过纺锤形体声波发生区域的右侧。纺锤形体声波发生区域的边界(即为涡流通道所在位置)的下游角为设定的细胞释放点，释放的细胞从下游角位置离开，顺微流道通道方向进入细胞流出通道。
所述微流道的高度为50um。超高频体声波谐振器频率1.83GHz，三种输出功率如图7所示。控制样本输入流速为1uL/min，PBS缓冲液输入流速为10uL/min。
在如图所示的纺锤形体声波发生区域分为两个区域，聚焦区(纺锤形器件上半部分，其右侧边界与层流方向相同)与筛分区(纺锤形器件下半部分，其右侧边界与层流方向形成较大角度)。如图所示，在器件上游，涡旋隧道方向与层流方向相同，涡旋拖拽力并不改变细胞沿着层流方向的运动状态，只会让细胞横向迁移至涡旋中心，实现对细胞的聚焦。而在筛分区部分，聚焦到涡旋中心的细胞相比于未聚焦的细胞，能够更稳定的被移动。将荧光为加入到血液中来表征血浆的运动情况：1mL血液中加入2μL Calcein-AM。如图所示，血细胞被高效率的从血浆中沿着纺锤形器件右侧边界迁移到位于流道左侧的细胞释放点，并在细胞释放点离开纺锤形器件，进入PBS缓冲液中。
可以看到除了少部分血浆由于粘附在细胞中随着血细胞迁移到细胞流出通道，大部分的血浆都沿着原液流方向进入血浆回收通道而被回收。
由此，在本发明的其中一个方面，将系统中的超高频谐振器的体声波产生区域的边界线条(即对应的涡旋通道的形状)设置为适于细胞或囊泡在涡旋通道中顺着涡旋通道移动至释放点。由此可避免细胞或囊泡脱离涡旋通道而不按设定从释放点离开涡旋通道。
在本发明的其中又一个方面，其中通过调节所述超高频谐振器的体声波产生区域的边界线条形状使得细胞或囊泡保持在涡旋通道中移动至释放点。如前所述，体声波产生区域的边界线条中存在转折或曲率变化，可能会增加细胞或囊泡脱离涡旋通道的几率。因此，可以通过减少体声波产生区域的边界线条中出现转折或曲率变化来使得细胞或囊泡保持在涡旋通道中移动，即减少脱离涡旋通道的细胞或囊泡，提高分离的效率。在本发明中，一种优选的超高频谐振器的体声波产生区域的形状为纺锤形。
在本发明的其中又一个方面，所述微流控系统中的超高频体声波谐振器的体声波作用区域具有聚焦区与筛分区。聚焦区位于体声波作用区域上游(即靠近样品流入方向，离释放点较远的部分)，筛分区位于体声波作用区域下游(即靠近样品流出方向，离释放点较近或包括释放点的部分)。其中聚焦区的体声波作用区域的设置相对筛分区的设置更适于使得细胞或囊泡保持在涡旋通道中移动：在聚焦区的涡流通道中的细胞或囊泡沿着和层流方向相同或相似方向移动，受到的涡旋拖拽力相对较小，更易于细胞或囊泡进入和保留在涡旋通道；在下游的筛分区，聚焦到涡旋中心的细胞相比于未聚焦的细胞能够更稳定的在涡流通道中被移动。在本发明的其中又一个方面，聚焦区的体声波作用区域边界线条与流体通道的角度相对筛分区的体声波作用区域边界线条与流体通道的角度较小。例如，聚焦区的体声波作用区域边界基本与流体通道方向一致或基本一致(例如角度小于10°)，在这个区域的涡流通道中的细胞受到的涡旋拖拽力基本上不改变细胞沿着层流方向的运动状态，只会让细胞横向迁移至涡旋中心，实现对细胞的聚焦；筛分区的体声波作用区域边界与流体通道角度较大，引导细胞移动方向偏离流体通道方向转移到指定的释放点，在筛分区，聚焦到涡旋中心的细胞相比于未聚焦的细胞能够更稳定的在涡流通道中被移动。
另外，如图7所示，在其它系统参数条件相同的情况下，功率越高，从血浆中沿着纺锤形器件右侧边界迁移到位于流道左侧的细胞释放点，并在细胞释放点离开纺锤形器件的血细胞越多，分离效率越高。
实施例8控制核酸的移动和分离纯化核酸
根据实施例1和2的描述的方法，制备和设置如图8(a)所示的微流道和超高频谐振器系统。图8(a)为俯视图，图右侧为流道入口，用于输入含有不同大小的核酸片段的PBS溶液。超高频谐振器的表面，即体声波发生区域，如图中显示为纺锤形，其左边尖端为核酸释放点。微流道左侧包括三个流出通道，其中中间为核酸流出通道，从纺锤形左边尖端的核酸释放点流出的核酸进入核酸流出通道。核酸流出通道的上下两个通道为供去除目标核酸后的溶液流出通道。
核酸通过Qubit sDNA HS试剂盒进行染色和定量，用PBS溶液溶解。图8(a)显示系统设置和通入荧光染色核酸溶液后观察现象：上图为亮场，下图为荧光信号观察图，显示超高频谐振器没有工作时荧光染色核酸溶液均匀分布在微流道中的情况。
图8(b)显示大小为约20k的双链核酸样品在如图8(a)所示装置中，在不同流速(0,0.1,0.25,0.5,1μL/min)和不同体声波工作功率(50-1000mW)下的表现。流体通道高度为约20微米。
核酸为提取的绵羊全血基因组DNA，大小为约20kbp。
如图8(b)所示，在从流道入口不断输入核酸溶液，超高频谐振器持续工作的情况下，在合适的流速和体声波功率条件下，核酸顺着纺锤形超高频谐振器器件边缘移动到释放点。结果证明，本发明的装置和方法对20kbp双链DNA具有良好的控制移动的能力，且控制能力与施加功率正相关，与流道中的侧向流体速度负相关。本实验是连续工作实验结果，可以看出，持续工作情况下核酸没有在超高频谐振器器件和流道中产生粘附，也不会在涡旋中出现聚团。
从荧光信号来看，在0.1μL/min流速下，功率1000mW，可对体声波工作范围内的所有核酸进行连续式富集，富集效率(即进入核酸流出通道的核酸的量占)超过90％。在体声波区域边缘的涡旋通道中，20kbp DNA被浓缩在约35微米直径的涡旋隧道中。在释放位点处，核酸脱离涡旋释放后，在次生涡旋和侧向流体的共同作用下扩散为宽度约为125μm的核酸条带流向下游。
图8(c)显示大小为约20k的双链核酸样品在如图8(a)所示装置中，在不同流道高度(50微米和20微米)下的表现。
结果显示，在相同的流速和体声波作用功率下，20微米高度的流道的系统的作用明显比50微米高度的流道的系统更加有效。这证明微流道高度降低，能够提高声流体捕捉小尺寸颗粒的效果。流道高度降低，会提高声流体涡旋的速度梯度，目标颗粒在涡旋中心的聚集与涡旋的梯度力正相关，从而提高了声流体的捕捉效率。可以从上图看出，50μm高度的流道中，体声波边缘形成的涡旋的范围明显大于20μm流道中的涡旋。
图8(d)显示大小为约5k双链核酸样品在如图8(a)所示装置中，在不同流速(0.1,0.25,0.5μL/min)和不同体声波工作功率(50-1000mW)下的表现。流体通道高度为约20微米。
5k双链核酸样品为DNA质粒，为双链环状DNA。
结果证明，本发明的装置和方法对5kbp的质粒DNA具有良好的控制移动的能力，且控制能力与施加功率正相关，与流道中的侧向流体速度负相关。
图8(e)显示大小为约5k的环状核酸与链状核酸样品在如图8(a)所示装置中的表现。流体通道高度为约20微米。
5k链状核酸为将图8(d)中5k双链核酸样品的DNA质粒进行酶切，断裂形成双链链状DNA。
结果显示，在相同的流速和体声波作用功率下，系统对5k环状核酸的控制明显比同样大小的链状核酸作用明显。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种控制溶液中目标柔性颗粒如细胞微囊泡或核酸和蛋白质等生物大分子颗粒的移动的方法，包括：
(1)使含有柔性颗粒如细胞微囊泡或核酸和蛋白质等生物大分子颗粒的溶液流经一个微流控设备，所述设备包括；
流体通道，其具有入口和流出通道；
一个或多个超高频体声波谐振器，其设置于所述流体通道的一个壁上，所述超高频体声波谐振器可在所述流体通道产生传向所述流体通道的对侧的壁的频率为约0.5-50GHz的体声波；
(2)所述超高频谐振器发射传向所述流体通道的对侧的壁的体声波，在溶液中产生由超高频谐振器的体声波产生区域的边界限定(define)的涡旋通道；
(3)通过调节超高频体声波谐振器的体声波作用区域的形状和位置，使得溶液中的柔性颗粒进入涡旋通道和顺着涡旋通道移动，并在设定的位置离开涡旋通道，该位置称为释放点。
2.权利要求1的方法，其中还包括通过调节体声波的功率和/或通过调节所述溶液流经体声波区域的速度，来调节进入涡旋通道的柔性颗粒。
3.权利要求1的方法，其中对应所述释放点的体声波作用区域存在转折或曲率变化。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述超高频谐振器的体声波产生区域的边界线条设置为适于目标柔性颗粒保持在涡旋通道中顺着涡旋通道移动至释放点，例如通过减少体声波产生区域的边界线条中出现转折或曲率变化。
5.权利要求1的方法，其中所述微流控设备的流体通道的高度为约20-200μm，优选为约25-100μm，更优选为约30-80μm，例如为约40-60μm。
6.权利要求1的方法，其中将所述流体通道分为不同区域，在不同区域设置分离不同柔性颗粒的超高频谐振器，例如所述分离不同柔性颗粒的超高频谐振器可具有不同形状的声波产生区域，或者施加不同功率的体声波，或者具有不同的流速，或其组合。
7.权利要求1的方法，其中所述微流控设备的流体通道具有所述被控制移动的柔性颗粒的流出通道，即颗粒流出通道；优选的，所述流体通道还具有其它流出通道，例如为除去或含有较少所述被控制移动的细胞或囊泡的溶液的流出通道，即溶液流出通道，
优选的，其中所述颗粒流出通道和溶液流出通道的开口的宽度比例为约1:1-1:20，优选为约1:2-1:15，例如为约1:4-1:10。
8.一种控制溶液中目标柔性颗粒如细胞微囊泡或核酸和蛋白质等生物大分子颗粒的移动的微流控设备，包括：
流体通道，其具有入口和出口；
一个或多个超高频体声波谐振器，其设置于所述流体通道的一个壁上，所述超高频体声波谐振器可在所述流体通道产生传向所述流体通道的对侧的壁的频率为约0.5-50GHz的体声波；
功率调节装置，其调节所述超高频谐振器产生的体声波的功率；
流速调节装置，其调节所述溶液流经体声波区域的速度，
所述超高频谐振器可发射传向所述流体通道的对侧的壁的体声波，在溶液中产生由超高频谐振器的体声波产生区域的边界限定的涡旋通道，溶液中的细胞或囊泡进入涡旋通道和顺着涡旋通道移动，并在设定的位置离开涡旋通道，该位置称为释放点。
9.权利要求8的微流控设备，其中对应所述释放点的体声波作用区域存在转折或曲率变化。
10.权利要求8的微流控设备，其中所述超高频谐振器的体声波产生区域的边界线条设置为适于柔性颗粒保持在涡旋通道中顺着涡旋通道移动至释放点，例如通过减少体声波产生区域的边界线条中出现转折或曲率变化。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113926221A (zh) * 2021-10-11 2022-01-14 天津大学 一种量子点溶液纯化方法及纯化系统
CN114112826A (zh) * 2021-11-25 2022-03-01 天津大学 用于荧光微粒的声光互联微流控检测系统和检测方法
CN114177960A (zh) * 2021-12-15 2022-03-15 天津大学 基于超高频体声波谐振器的微液滴操纵方法以及装置
CN115041245A (zh) * 2022-08-12 2022-09-13 天津大学 基于超高频体声波声流势阱捕获与分离微粒方法及装置
CN116337728A (zh) * 2023-05-30 2023-06-27 天津大学 一种单片集成微流式细胞仪荧光检测装置

Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101765762A (zh) * 2007-04-16 2010-06-30 通用医疗公司以马萨诸塞州通用医疗公司名义经营 使粒子在微通道中聚集的系统和方法
US20130048565A1 (en) * 2011-08-29 2013-02-28 The Charles Start Draper Laboratory, Inc. System and method for blood separation by microfluidic acoustic focusing
US20140033808A1 (en) * 2012-08-01 2014-02-06 The Penn State Research Foundation High-efficiency separation and manipulation of particles and cells in microfluidic device using surface acoustic waves at an oblique angle
CN104726331A (zh) * 2015-03-27 2015-06-24 西安交通大学 基于声表面波的微流控血浆分离芯片及方法
CN104870077A (zh) * 2012-01-31 2015-08-26 宾夕法尼亚州立大学研究基金会 使用可调谐声表面驻波进行微流体操控和颗粒分选
WO2017127686A1 (en) * 2016-01-22 2017-07-27 Carnegie Mellon University Three-dimensional acoustic manipulation of cells
CN107979352A (zh) * 2016-10-24 2018-05-01 天津大学 一种薄膜体声波微流控混合装置
US20180369815A1 (en) * 2015-10-10 2018-12-27 Shenzhen Institutes Of Advanced Technology Chinese Academy Of Sciences Microfluidic system and method of controlling particles based on artificially structured acoustic field
CN109126918A (zh) * 2018-10-18 2019-01-04 天津大学 一种用于产生声流体镊的装置
WO2019046483A1 (en) * 2017-08-29 2019-03-07 Duke University SYSTEMS, METHODS AND STRUCTURES FOR SEPARATION BASED ON SURFACE ACOUSTIC WAVES
CN109562375A (zh) * 2016-05-24 2019-04-02 法国国家科研中心 声学镊子

Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101765762A (zh) * 2007-04-16 2010-06-30 通用医疗公司以马萨诸塞州通用医疗公司名义经营 使粒子在微通道中聚集的系统和方法
US20130048565A1 (en) * 2011-08-29 2013-02-28 The Charles Start Draper Laboratory, Inc. System and method for blood separation by microfluidic acoustic focusing
CN104870077A (zh) * 2012-01-31 2015-08-26 宾夕法尼亚州立大学研究基金会 使用可调谐声表面驻波进行微流体操控和颗粒分选
US20140033808A1 (en) * 2012-08-01 2014-02-06 The Penn State Research Foundation High-efficiency separation and manipulation of particles and cells in microfluidic device using surface acoustic waves at an oblique angle
CN104726331A (zh) * 2015-03-27 2015-06-24 西安交通大学 基于声表面波的微流控血浆分离芯片及方法
US20180369815A1 (en) * 2015-10-10 2018-12-27 Shenzhen Institutes Of Advanced Technology Chinese Academy Of Sciences Microfluidic system and method of controlling particles based on artificially structured acoustic field
WO2017127686A1 (en) * 2016-01-22 2017-07-27 Carnegie Mellon University Three-dimensional acoustic manipulation of cells
CN109562375A (zh) * 2016-05-24 2019-04-02 法国国家科研中心 声学镊子
CN107979352A (zh) * 2016-10-24 2018-05-01 天津大学 一种薄膜体声波微流控混合装置
WO2019046483A1 (en) * 2017-08-29 2019-03-07 Duke University SYSTEMS, METHODS AND STRUCTURES FOR SEPARATION BASED ON SURFACE ACOUSTIC WAVES
CN109126918A (zh) * 2018-10-18 2019-01-04 天津大学 一种用于产生声流体镊的装置

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CUI, WEIWEI 等: "Bulk Acoustic Wave Resonator Integrated Microfluidics for Rapid and High Efficience Fluids Mixing and Bioparticle Trapping", IEEE INTERNATIONAL ULTRASONICS SYMPOSIUM, pages 1 - 3 *
CUI, WEIWEI 等: "Theoretical and experimental characterizations of gigahertz acoustic streaming in microscale fluids", NANOTECHNOLOGY AND PRECISION ENGINEERING, vol. 2, pages 15 - 22, XP055764613, DOI: 10.1016/j.npe.2019.03.004 *
HE MEIHANG ET AL: "In-line trapping and rotation of bio-particles via 3-D micro-vortices generated by localized ultrahigh frequency acoustic resonators", ACTUATORS AND MICROSYSTEMS (TRANSDUCERS), IEEE, pages 1789 - 1792 *
WEIWEI CUI ET AL: "Hypersonic-Induced 3D Hydrodynamic Tweezers for Versatile Manipulations of Micro/Nanoscale Objects", PARTICLE AND PARTICLE SYSTEMS CHARACTERIZATION, pages 1 - 8 *
WU MENGXI 等: "Isolation of exosomes from whole blood by integrating acoustics and microfluidics", PNAS, vol. 114, no. 40, pages 10584 - 10589, XP055713992, DOI: 10.1073/pnas.1709210114 *
江源, 常烨, 高传海, 等: "基于薄膜体声波谐振器的柔性有机挥发性气体传感器", 《传感技术学报》, vol. 31, no. 10, 31 October 2018 (2018-10-31), pages 1461 - 1466 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113926221A (zh) * 2021-10-11 2022-01-14 天津大学 一种量子点溶液纯化方法及纯化系统
CN114112826A (zh) * 2021-11-25 2022-03-01 天津大学 用于荧光微粒的声光互联微流控检测系统和检测方法
CN114112826B (zh) * 2021-11-25 2024-04-19 天津大学 用于荧光微粒的声光互联微流控检测系统和检测方法
CN114177960A (zh) * 2021-12-15 2022-03-15 天津大学 基于超高频体声波谐振器的微液滴操纵方法以及装置
CN115041245A (zh) * 2022-08-12 2022-09-13 天津大学 基于超高频体声波声流势阱捕获与分离微粒方法及装置
CN116337728A (zh) * 2023-05-30 2023-06-27 天津大学 一种单片集成微流式细胞仪荧光检测装置
CN116337728B (zh) * 2023-05-30 2023-08-18 天津大学 一种单片集成微流式细胞仪荧光检测装置

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