JP7691724B2

JP7691724B2 - 結氷抑制用組成物

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Publication number: JP7691724B2
Application number: JP2019219063A
Authority: JP
Inventors: ジュンアンドン; ユップイサン; ホチョヨン
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Priority date: 2019-11-27
Filing date: 2019-12-03
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Description

本発明は、結氷抑制用組成物に関する。

低温保護剤（cryoprotective agent、ＣＰＡ）は、溶液中に存在するとき、０℃下の温度にさらされる溶液における氷結晶の形成を低減または阻害できる化合物である。現在のＣＰＡは、小分子（浸透性ＣＰＡと呼ばれることもある。）、合成ポリマー、および凍結防止剤タンパク質を含む。

現在、臓器移植は、生存率、生活の質および費用対効果の側面で末期臓器不全の最良の治療法である。しかし、残念ながら、臓器移植物の供給と需要の間には相当な格差が存在する。この格差は、体を衰弱させる疾患を有する患者に長期間の待機期間中の生活の質の低下を招き、重大な医療障壁になっている。臓器の顕著な不足は、信頼できる保存方法の不在により発生するかなりの廃棄物に起因する。実際に肺、膵臓および心臓の５０％以上は、死亡したドナーから提供されないままである。

臓器を適切に保存するためには、臓器を保存溶液で洗浄して血液を除去し、臓器を安定化させなければならない。保存溶液中で安定化した後も、ドナーから摘出後に臓器の割り当て、輸送及び移植に利用可能な時間は限られている（６～１２時間）。この短い時間は、ほとんどの臓器が地域の患者に提供されることをもたらす。遠隔の患者とのマッチは、限られた時間内に確認できないことがしばしばあるからである。この不足の結果として、ほぼ全ての国で人間の臓器の売買を禁止する法律が存在しているにもかかわらず、違法な臓器売買および人身売買が増加して需要を供給してきた。

臓器保存で使用される現在の浸透性ＣＰＡは、一般的に、特にエチレングリコール、１，２－プロパンジオール、ジメチルスルホキシド、ホルムアミド、グリセロール、スクロース、ラクトース、及びＤ－マンニトールを含む。臓器保存温度で氷結晶の成長を低減または阻害するためには、浸透性ＣＰＡの有効濃度が非常に高くなければならない（６０％以上がしばしば求められる。）。その高濃度では、これらの化合物は保存しようとする組織に毒性であることがあり、移植前の加温時のＣＰＡの大量除去は不可逆的な細胞死を引き起こすことがある。

氷結晶の形成を低減または阻害するのに使用される他のＣＰＡは、合成ポリマー及び凍結防止剤タンパク質を含む。浸透性ＣＰＡと同様に、これらはそれぞれ欠点を持っている。例えば、合成ポリマーは、細胞膜を浸透することができない。このため、合成ポリマーＣＰＡは、細胞外の氷の形成のみを制御できる。生物サンプルを効果的に保存するために、氷結晶の形成は、細胞の内部及び外部の両方で制御しなければならない。自然に発生する凍結防止剤タンパク質、例えば魚類、植物または昆虫から単離されたタンパク質は、氷の形成を防止するのに非常に効果的であるが、現在利用可能な凍結防止剤タンパク質は、純度は低く、非常に高価である。付加的に、生物サンプルを保存するための凍結防止剤タンパク質の使用は、免疫原性の潜在的な供給源を導入する。

韓国特許第１６８１９７３号公報

本発明は、結氷抑制用組成物を提供することを目的とする。

また、本発明は、細胞の生存率を高めるための細胞または組織凍結用組成物を提供することを目的とする。

さらに、本発明は、食品の凍結時にも食感を維持できる食品凍結用組成物を提供することを目的とする。

１．少なくとも一部が凹んだ金ナノ構造体を含む結氷抑制用組成物。

２．前記項目１において、前記構造体は、少なくとも一つの面が凹部を有するものであり、四面体、六面体、八面体、十面体、十二面体、二十面体、四六面体（tetrahexahedron）、六八面体（hexoctahedron）、菱形十二面体、円筒状、鞍状またはキャップ状である、組成物。

３．前記項目１において、前記構造体は、少なくとも一つの面が凹部を有するものであり、四面体、六面体、八面体、十面体、十二面体、二十面体、四六面体（tetrahexahedron）、六八面体（hexoctahedron）または菱形十二面体である、組成物。

４．前記項目１において、前記構造体は、サイズが１０ｎｍ～１，０００ｎｍである、組成物。

５．前記項目１において、凹部の表面曲率の絶対値が０．１×１０^－２ｎｍ^－１～５×１０^－２ｎｍ^－１である、組成物。

６．前記項目１において、前記構造体は、その表面が改質されて親水性が増加したものである、組成物。

７．前記項目１～６のいずれか一つの組成物を含む、細胞または組織凍結用組成物。

８．前記項目１～６のいずれか一つの組成物を含む、食品凍結用組成物。

９．前記項目７の前記組成物の存在下で対象細胞または組織を氷点下の温度にさらすステップを含む、細胞または組織の凍結方法。

本発明の組成物は、氷の再結晶の抑制効果に優れる。これにより、細胞の凍結保存時の細胞生存率を高めることができ、食品凍結に使用時にもその食品の食感を維持することができる。

図１は、金属ナノ構造体の結氷抑制シミュレーションの結果である。図２は、金属ナノ構造体の結氷抑制シミュレーションの結果である。図３は、金属ナノ構造体の結氷抑制シミュレーションの結果である。図４は、金ナノキューブを作製する概略図である。図５は、作製された金ナノキューブ、金ナノキャップ、金球状粒子の仕様である。図６は、作製された金ナノキューブのＳＥＭ、ＴＥＭ画像である。図７は、作製された金ナノキューブのサイズを示すものである。図８は、作製された金ナノキューブの吸収スペクトルである。図９は、作製された金ナノキューブの写真である。図１０は、作製された金ナノキューブの粒子サイズ分布である。図１１は、作製された金ナノキャップの顕微鏡画像である。図１２は、作製された金ナノキャップの濃度および粒子サイズ分布を示すものである。図１３は、金球状粒子を作製する概略図および作製された金球状粒子の顕微鏡画像である。図１４は、金ナノキューブの表面改質により、化合物のスルフヒドリルピークが消えることを示すＦＴＩＲ結果である。図１５は、表面改質により、金ナノキューブの吸収スペクトルに変化が起こることを示すものである。図１６は、表面改質により、金ナノキューブの吸収スペクトルに変化が起こることを示すものである。図１７は、表面改質により、金ナノキューブの吸収スペクトルに変化が起こることを示すものである。図１８は、金ナノキューブがＨＳＣ－３細胞内に挿入されることを確認できる画像である。図１９は、金ナノ構造体の氷再結晶の抑制効果を示すものである。図２０は、金ナノ構造体の氷再結晶の抑制効果を示すものである。図２１は、金ナノ構造体の氷再結晶の抑制効果を示すものである。図２２は、金ナノ構造体の氷再結晶の抑制効果を示すものである。図２３は、金ナノ構造体の氷再結晶の抑制効果を示すものである。図２４は、金ナノ構造体の氷再結晶の抑制効果を示すものである。図２５は、金ナノ構造体の氷再結晶の抑制効果を示すものである。図２６は、金ナノ構造体の氷再結晶の抑制効果を示すものである。図２７は、氷再結晶の抑制効果を数値化する概略図である。図２８は、金ナノ構造体の氷再結晶の抑制効果の数値化の結果である。図２９は、金ナノ構造体の氷再結晶の抑制効果の数値化の結果である。図３０は、金ナノ構造体の氷再結晶の抑制効果の数値化の結果である。図３１は、金ナノ構造体の氷再結晶の抑制効果の数値化の結果である。図３２は、金ナノ構造体の氷再結晶の抑制効果の数値化の結果である。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明は、結氷抑制用組成物に関するものである。

氷の結晶は、氷の再結晶化により成長できるが、これは小さな氷結晶から更に大きな氷結晶に成長する過程を意味する。この成長は、オストヴァルト熟成（Ostwald ripening）のメカニズムにより起こる。オストヴァルト熟成（Ostwald ripening）は、常温と結晶の間の表面エネルギーの差による圧力によって、融解－拡散－再凍結または昇華－拡散－凝縮のメカニズムで進行され得る。換言すれば、氷結晶の成長は、氷同士がくっついて成長するのではなく、小さな氷結晶が結晶の間で融解して大きな氷結晶に向かって拡散した後、大きな氷結晶の一部となって再凍結されて起こる。

結氷の抑制は、氷が形成されないようにするか氷の形成速度を遅らせたり、氷の再結晶化が行われないようにしたり、氷再結晶化の速度を遅らせたり、氷結晶の大きさを小さく維持する作用を意味する。

本発明の結氷抑制用組成物は、少なくとも一部が凹んだ金ナノ構造体を含む。

図２に示されるように、少なくとも一部が凹んだ金ナノ構造体は、氷結晶の成長面と接する場合に、その凹部と当接する面は氷が成長せずに液状水層が形成され、凹部の外側に氷が押し出されて、その部分に結氷抑制効果が示され得る。

金ナノ構造体は、少なくとも一つの面が凹部を有するものであり、凹部を有すると、少なくともその部分では結氷抑制効果が示されるので、少なくとも一つの面の少なくとも一部が凹部を有するものであればよい。凹部は一面以上、全面以下に存在することができる。

金ナノ構造体は、例えば、四面体、六面体、八面体、十面体、十二面体、二十面体、四六面体（tetrahexahedron）、六八面体（hexoctahedron）、菱形十二面体、円筒状、鞍状（saddle）またはキャップ状などの構造を有することができるが、これらに限定されるものではない。

金ナノ構造体は、例えば、サイズが１０ｎｍ～１，０００ｎｍであってもよく、具体的には２０ｎｍ～８００ｎｍ、より具体的には４０ｎｍ～７００ｎｍであってもよいが、これらに限定されるものではない。例えば、金ナノ構造体が多面体の場合、前記サイズは一辺の長さであってもよく、キャップ状の場合、前記サイズは直径であってもよいが、これらに限定されるものではない。より具体的には、金ナノ構造体が多面体の場合、サイズは２０ｎｍ～２００ｎｍであってもよく、キャップ状の場合、サイズは１０ｎｍ～１，０００ｎｍであってもよいが、これらに限定されるものではない。

金ナノ構造体は、例えば、凹部の表面曲率の絶対値が０．１×１０^－２ｎｍ^－１～５×１０^－２ｎｍ^－１であってもよく、具体的には０．３×１０^－２ｎｍ^－１～３×１０^－２ｎｍ^－１であってもよいが、これらに限定されるものではない。

金ナノ構造体は、その表面に官能基として、トリメチルアンモニウムクロライドセチル基、又はトリメチルアンモニウムブロミドセチル基を有するものであってもよい。

また、金ナノ構造体は、表面が改質され、親水性、疎水性または両性官能基を有することができる。その場合、結氷の抑制効果が減少または増加して、結氷をより細かく調整することができる。

親水性官能基としては、例えば、ヒドロキシ基、カルボキシ基、アミノ基、カルボニル基、ホスフェート基、アンモニウム基、エステル基、イミド基、チオイミド基、ケト基、エーテル基、インデン基、スルホニル基、ポリエチレングリコール基などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。疎水性官能基としては、例えば、Ｃ１～Ｃ３０のアルキル基、Ｃ３～Ｃ３０のシクロアルキル基、Ｃ６～Ｃ３０のアリール基、Ｃ２～Ｃ３０のヘテロアリール基、ハロゲン基、Ｃ１～Ｃ３０のエステル基、ハロゲン含有基などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。両性官能基としては、例えば、ヒドロキシＣ１～Ｃ１０アルキル基、トレオニンを含むペプチドなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

前記官能基は、例えば、前記親水性、疎水性または両性官能基および末端に－ＳＨ官能基を有する化合物で金ナノ構造体の表面を改質して金ナノ構造体の表面に形成されたものであってもよいが、これに限定されるものではない。

また、本発明は、前記組成物を含む細胞または組織凍結用組成物に関するものである。

細胞または組織を凍結保存すると、その後の使用時、凍結された細胞または組織を溶かす過程で、氷の再結晶化は、細胞膜の損傷、細胞の脱水を進行させ、細胞および組織に損傷を与える。低温環境に住む有機体は、氷の再結晶化によってより簡単に損傷してしまうことがある。

本発明の組成物は、通常的に保存のために凍結して使用するすべての細胞がその適用対象となり、例えば、原核細胞；真核細胞；微生物；動物細胞；癌細胞、精子；卵子；成体幹細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞を含む幹細胞；臍帯血、白血球、赤血球、および血小板を含む血液細胞；腎細胞、肝細胞および筋肉細胞を含む組織細胞であってもよいが、これらに限定されない。

また、組織は、同様に保存のために凍結して使用するすべての組織がその適用対象となり、例えば、角膜、腎臓、心臓、小腸、膵臓、肺、肝臓などのすべての組織を制限なく使用することができる。

また、本発明は、前記組成物の存在下で対象細胞または組織を氷点下の温度にさらすステップを含む、細胞または組織の凍結方法に関するものである。

前記組成物の存在下で対象細胞または組織を凍結させる場合、その後の解凍時の氷再結晶を阻害し、細胞または組織が損傷されることを防止できる。

また、本発明は、前記組成物を含む食品凍結用組成物、そして前記組成物の存在下で食品を氷点下の温度にさらすステップを含む食品の凍結方法に関するものである。

本発明の組成物は、すべての冷凍食品に適用できるものであり、これを使用することにより、解凍時の食品の食感の低下を最小限に抑えることができる。

以下、本発明を具体的に説明するために実施例を挙げて詳細に説明することにする。

実施例
１．シミュレーション
粒子の表面形状による氷成長の差異を調べるために、電算模写シミュレーションを行った。材料としては、凹面を有する正六面体の金ナノ粒子と、凸面を有する球状の金ナノ粒子とを使用した（図１）。

その結果、凹面を有する正六面体の金ナノ粒子は、凹部と当接する面は氷が成長せずに液状水層が形成され、凹部の外側に氷が押し出されて、その部分に結氷抑制効果が示されたが、球状の金ナノ粒子はそうでなかった（図２、３）。

２．金ナノ構造体の作製
（１）凹面を有する金ナノキューブ（Gold Concave Nanocube（AuCC））
作製に使用される材料は、以下の通りである。
－水素化ホウ素ナトリウム（Sodium borohydride（NaBH₄））、≧98.0％
－塩化金（ＩＩＩ）水和物（Gold（III）chloride hydrate（HAuCl₄））、≧99.9％
－塩化セチルトリメチルアンモニウム（Cetyltrimethylammonium chloride（CTAC））溶液、25wt％ in H₂O
－硝酸銀（Silver nitrate（AgNO₃））、99.9999％
－塩酸溶液（Hydrochloric acid solution（HCl））、1.0N
－Ｌ－アスコルビン酸（L-Ascorbic acid）、≧99％

作製のために、１０ｍＭＮａＢＨ_４の０．６０ｍｌを水に溶かした後、冷蔵庫で冷ました。その後、シードの形成のために１０ｍＭＨＡｕＣｌ_４の０．２５ｍｌと、１００ｍＭＣＴＡＣの１０．００ｍｌを混合した。その後、作っておいたＮａＢＨ_４を迅速に混合し、１分間かき混ぜた後、２時間放置した。その後、成長溶液（Growth solution）の製造のために、１０ｍＭＨＡｕＣｌ_４の０．５０ｍｌ、１０ｍＭＡｇＮＯ_３の０．１０ｍｌ、１．０ＭＨＣｌの０．２０ｍｌ、１００ｍＭアスコルビン酸（ascorbic acid）の０．１０ｍｌを混合した。

その後、製造されたシードを×１／１０から×１／１０^４まで希釈した後、その０．１ｍｌを製造しておいた成長溶液に添加した。反応が終わるまで放置した後、遠心分離器で洗浄した（３，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）（図４）。

シードの濃度を希釈して成長させることにより、様々なサイズの金ナノキューブを作製することができる。具体的には、同じ量の成長液をシード溶液に塗布すると、成長液のゴールドイオンがシードの表面にくっついてナノキューブに成長することになる。これはシードの数によって、例えば、数が少ないほど一つのシードにくっつくゴールドイオンが増加して、より大きなサイズの金ナノキューブが作られる。前記方法により、図５に示す仕様のナノキューブを作製した。

作製されたナノキューブは、凹面を有することが確認できる（図６）。そのサイズおよび吸収スペクトルは、図７～９に示す通りである。

また、ＡｕＣＣ４０（サイズ４０ｎｍ）は、４．５４×１０^１０粒子／ｍｌ、ＡｕＣＣ７０（サイズ７０ｎｍ）は、１．００×１０^１０粒子／ｍｌ、ＡｕＣＣ１７０（サイズ１７０ｎｍ）は、１３．７９×１０^８粒子／ｍｌの濃度で得られた。その粒子サイズ分布は、図１０に示す通りである。

（２）金ナノキャップ（Au Cap）
作製に使用される材料は、以下の通りである。
－オルトケイ酸テトラエチル（Tetraethyl orthosilicate （TEOS））、≧99.999％
－水酸化アンモニウム溶液（Ammonium hydroxide solution（NH₄OH））、～25％ NH₃ basis
－エタノール（Ethanol（C₂H₅OH））、≧99.9％
－クリーンガラス（Clean glass）（2.5×2.5cm）
－ゴールドプレート（Gold plate）、半径5インチ（inch radius）
－フッ化水素溶液（Hydrofluoric acid solution（HF））、35％

６．３４ｇのエタノールと１．８６ｇのＴＥＯＳを混ぜた後、予め作成しておいた１６ｇのエタノール＋２．６４ｇのＮＨ４ＯＨの溶液に一滴ずつ添加して反応させた。反応２４時間後、遠心分離器で洗浄して（３，０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎ）、シリカビーズを作製した。その後、５ｍｇ／ｍｌのシリカ溶液をクリーンガラス基板（２．５×２．５ｃｍ）上に０．１０ｍｌ落とし、乾燥した。その後、金属イオン（Ｍｅｔａｌｉｏｎ）ＤＣ／ＲＦスパッタリング（ｓｐｕｔｔｅｒｉｎｇ）装置を用いて金をイオン化して、基板上に２０ｎｍの厚さに積み重ねた。超音波処理（Ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）により、基板上に置かれているシリカ粒子を取り外し、５％ＨＦの溶液を混ぜて内部のシリカ粒子を溶かして、外側の金ナノキャップ粒子のみを残した。

前記方法で、直径５００ｎｍサイズの金ナノキャップ粒子を作製し、ＴＥＯＳ溶液の量を減らして更に小さいサイズのナノキャップ粒子を作成した（図５）。逆に、ＴＥＯＳ溶液の量を増やすと、更に大きいサイズのナノキャップ粒子を作ることができる。

作製されたナノキャップは、凹面を有することが確認できる（図１１）。ＡｕＣａｐ１００（サイズ１００ｎｍ）は、２．３６×１０^８粒子／ｍｌ、ＡｕＣａｐ５００（サイズ５００ｎｍ）は、２．６０×１０^８粒子／ｍｌの濃度で得られた。そのサイズ分布は、図１２に示す通りである。

（３）凸面を有する（凹面を有しない）金球状粒子（Spherical Gold Nanoparticle（AuNS））
作製に使用される材料は、以下の通りである。
－塩化金（ＩＩＩ）水和物（Gold（III）chloride hydrate（HAuCl₄））、≧99.9％
－クエン酸三ナトリウム二水和物（Sodium citrate tribasic dihydrate）、≧99.0％

１．０ｇのＨＡｕＣｌ_４を５０ｍｌの脱イオン水に溶かした。その後、０．５ｇのクエン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍｃｉｔｒａｔｅ）を５ｍｌの脱イオン水に溶かした。製造されたＨＡｕＣｌ_４溶液を１２０℃で沸騰するまで加熱した。溶液が沸騰すると、準備したｓｏｄｉｕｍｃｉｔｒａｔｅ溶液を添加し、１０分間反応させた。反応が終わった溶液は、室温まで冷やした後、０．２０ｕｍで濾過（ｆｉｌｔｅｒｉｎｇ）して冷蔵保管した（図１３）。
作成された粒子は、凸球状粒子であることを確認できる（図１３）。

（４）表面改質
（１）で作製されたサイズ４０、７０、１００ｎｍの金ナノキューブの表面を改質した。
金ナノキューブはＣＴＡＣを用いて作製されたものであるところ、その表面にトリメチルアンモニウムクロライドセチル基を有するものであり、これを下記化合物とそれぞれ反応させ、表面改質された金ナノキューブを得た。

図１４を参照すると、反応でチオールのスルフヒドリル基が金粒子とＡｕ－Ｓ結合をなすので、ＦＴＩＲ測定時に表面が改質され、スルフヒドリルピークが消えることを確認できる。

また、表面改質され、金粒子表面のＳＰＲ（Surface Plasmonic Resonance）効果により吸収スペクトルに変化が起こり、表面積が広いほど変化幅が更に大きいことを確認した（図１５～１７）。

３．細胞内挿入が可能かどうかの確認
ＡｕＣＣ４０のＨＳＣ－３細胞内への挿入が可能であるかを確認した。
具体的には、合成した４．５４×１０^９粒子／ｍｌの濃度のＡｕＣＣ４０の１００μｌを生きている細胞（ＨＳＣ－３）培地に添加した後、約２時間反応させると、ナノサイズのキューブ粒子が細胞膜に入り込み、最終的には細胞内部まで侵入することになる。入り込んだ金キューブ粒子は、散乱効果により光学顕微鏡で観察可能である。
その結果、細胞内に金ナノキューブが挿入されることを確認した（図１８）。

４．結氷抑制効果の評価
結氷抑制の効果を氷の再結晶化の抑制効果を観察して評価した。氷は急速冷却の直後、非常に小さい（数マイクロメートル）氷ドメインを有し、時間が経過するにつれて再結晶化現象によって氷ドメインのサイズが大きくなる。これを定量化するために、スプラット法（ｓｐｌａｔｍｅｔｈｏｄ）と液体窒素を用いて急速冷却を行った後、３０分間－６℃の温度にさらして氷ドメインの面積を測定した。Ｓｐｌａｔｍｅｔｈｏｄは、氷再結晶化の抑制を観察するために定形化された冷却方法であり、液体窒素で急速冷却された基板に高さ１．５ｍの上空から水滴を落として薄い膜状に氷を形成した。

図１９は、６－メルカプト（Ｍｅｒｃａｐｔｏ）－１－ヘキサノール（ｈｅｘａｎｏｌ）（Ｃ６ＯＨ）で改質されたＡｕＣＣ４０の７．５４×１０^－１１Ｍ、図２０は、６－Ｍｅｒｃａｐｔｏ－１－ｈｅｘａｎｏｌ（Ｃ６ＯＨ）で改質されたＡｕＣＣ４０の７．５４×１０^－１２Ｍ、図２１は、６－Ｍｅｒｃａｐｔｏ－１－ｈｅｘａｎｏｌ（Ｃ６ＯＨ）で改質されたＡｕＣＣ４０の７．５４×１０^－１３Ｍ、図２２は、６－Ｍｅｒｃａｐｔｏ－１－ｈｅｘａｎｏｌ（Ｃ６ＯＨ）で改質されたＡｕＣＣ４０の７．５４×１０^－１４Ｍ、図２３は、６－Ｍｅｒｃａｐｔｏ－１－ｈｅｘａｎｏｌ（Ｃ６ＯＨ）で改質されたＡｕＮＳ８０の１．６６×１０^－１１Ｍ、図２４は、６－Ｍｅｒｃａｐｔｏ－１－ｈｅｘａｎｏｌ（Ｃ６ＯＨ）で改質されたＡｕＮＳ８０の１．６６×１０^－１２Ｍ、図２５は、６－Ｍｅｒｃａｐｔｏ－１－ｈｅｘａｎｏｌ（Ｃ６ＯＨ）で改質されたＡｕＮＳ８０の１．６６×１０^－１３Ｍ、図２６は、６－Ｍｅｒｃａｐｔｏ－１－ｈｅｘａｎｏｌ（Ｃ６ＯＨ）で改質されたＡｕＮＳ８０の１．６６×１０^－１４の結氷抑制効果を示すものである。

それを参照すると、親水性官能基が改質された材料は、氷の再結晶化を抑制する効果を示し、材料の形状とサイズによって氷の再結晶化の程度が異なることが確認できる。この結果を図２７に示す方法により数値化した。

具体的には、大きいサイズの氷ドメインを１０個以上選定し、ＩｍａｇｅＪプログラムの粒子分析（ｐａｒｔｉｃｌｅａｎａｌｙｓｉｓ）ツールを用いて面積を算出した。その中、面積が大きい上位１０個の氷の平均面積を求め、同じサンプルに対して３回以上同じように面積を計算して最終平均値として使用した。ＲＩ値は（材料を入れた水の氷平均面積）／（純粋な水の氷平均面積）で、純粋な水と比較して値を導出した。ＲＩの値が０に近づくと、氷の平均面積が非常に小さいことであり、結氷抑制性能に優れるということである。

その結果は、図２８、２９に示す。それを参照すると、ＡｕＣＣの場合には、ＲＩの値が非常に小さくて結氷抑制性能に優れるが、ＡｕＮＳの場合には、はるかに大きいＲＩ値を示した。

また、図３０にはＡｕＣＣ、図３１には表面改質したＡｕＣＣ、図３２にはＡｕＣａｐのＲＩ数値化の結果を示す。

図３０を参照すると、作製時に添加する金シードの量が少ないほど大きい粒子が作られるので、粒子のサイズを大きくすると、高濃度で粒子を得ることは難しいが、各サイズの粒子がすべて凍結抑制効果を示すことを確認できる。

図３１を参照すると、表面改質を行っていない場合（ＣＴＡＣ）、そしてＣ６ＯＨで表面改質した場合に、最も結氷抑制効能に優れることを確認できる。

図３２を参照すると、ＡｕＣａｐの場合には、水と近似したＲＩ値が示された。これは、ＡｕＣａｐは、基板上にスパッタリング方法で製造するため、溶液中で粒子を合成する方法に比べて濃度が低く、優れたＲＩ値を示すには濃度が十分ではなかったからであると判断される。

Claims

少なくとも一部が凹んだ金ナノ構造体を含み、
前記構造体は、少なくとも一つの面が凹部を有するものであり、四面体、六面体、八面体、十面体、十二面体、二十面体、四六面体（tetrahexahedron）、六八面体（hexoctahedron）または菱形十二面体である、結氷抑制用組成物。
前記構造体の前記少なくとも一つの面の前記凹部は、２－メルカプト－１－エタノール（Ｃ２ＯＨ）、３－メルカプト－１－プロパノール（Ｃ３ＯＨ）、３－メルカプト－２－プロパノール（Ｃ２ＯＨ－ＣＨ３）、６－メルカプト－１－ヘキサノール（Ｃ６ＯＨ）のいずれかで表面改質されている請求項１に記載の組成物。
前記構造体は、その径が４０～１００ｎmであるように形成されている請求項２に記載の組成物。
前記構造体は、その径が１０ｎｍ～１，０００ｎｍである、請求項１に記載の組成物。
凹部の表面曲率の絶対値が０．１×１０^－２ｎｍ^－１～５×１０^－２ｎｍ^－１である、請求項１に記載の組成物。
前記構造体は、その表面が改質されて親水性が増加したものである、請求項１に記載の組成物。
請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物を含む、細胞または組織凍結用組成物。
請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物を含む、食品凍結用組成物。
請求項７に記載の前記組成物の存在下で対象細胞または組織を氷点下の温度にさらすステップを含む、細胞または組織の凍結方法。