JP7688941B2 - Ｃｄ８結合ポリペプチドおよびその使用 - Google Patents

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Description

本発明は、生物学的製剤の分野に関するものである。具体的には、本発明は、特定のＣＤ８結合ポリペプチドおよびその使用に関する。
腫瘍の診断には、放出コンピュータ断層撮影法（Ｅｍｉｓｓｉｏｎ Ｃｏｍｐｕｔｅｄ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ、ＥＣＴ）が用いられてきた。ＥＣＴには、単光子放出コンピュータ断層撮影法（Ｓｉｎｇｌｅ－Ｐｈｏｔｏｎ Ｅｍｉｓｓｉｏｎ Ｃｏｍｐｕｔｅｄ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ （ＳＰＥＣＴ））と陽電子放出断層撮影法（Ｐｏｓｉｔｒｏｎ Ｅｍｉｓｓｉｏｎ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ （ＰＥＴ））があり、画像を介して高解像度の腫瘍撮像と定量解析を可能にする。
ヒトでは、ＣＤ８は主に細胞傷害性Ｔリンパ球に発現しているが、樹状細胞やナチュラルキラー細胞などにも発現している。ＣＤ８分子は、ＣＤ８αが形成するホモダイマー、ＣＤ８αとＣＤ８βが形成するヘテロダイマーがあり、αβヘテロダイマーがより一般的である。
ＣＤ８陽性腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）をｉｎ ｖｉｖｏでモニタリングできることは、免疫療法の効果を評価し、より効果的な免疫細胞標的化単剤または併用療法の開発を支援する上で大きな意義がある。腫瘍浸潤リンパ球の 「イムノＰＥＴ （Ｉｍｍｕｎｏ ＰＥＴ）」撮像は、患者が特定の免疫療法レジメンを選択し、治療が有効かどうかを判断するのに役立つ、特異的かつ高感度の方法を提供することができる。
ＣＤ８を発現する細胞を検出するための検出剤、特にＥＣＴ検出に適したＣＤ８抗体ベースの検出剤に対する需要が当技術分野に存在する。
本発明は、少なくとも以下の実施形態を含む。
実施形態１：ＣＤ８αに特異的に結合することができる少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むＣＤ８結合ポリペプチドであって、少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインが、 配列番号５、９、１３、１７、２１、２５、２９、３３、３７、４１、４５、４９、５３、５７、６１、６５、６９、７３、７７および８１のいずれか一つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。
実施形態２：以下から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む、少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインである、実施形態１に記載のＣＤ８結合ポリペプチド。
（１） 配列番号２のＣＤＲ１、配列番号３のＣＤＲ２および配列番号４のＣＤＲ３；
（２） 配列番号６のＣＤＲ１、配列番号７のＣＤＲ２および配列番号８のＣＤＲ３；
（３） 配列番号１０のＣＤＲ１、配列番号１１のＣＤＲ２および配列番号１２のＣＤＲ３；
（４） 配列番号１４のＣＤＲ１、配列番号１５のＣＤＲ２および配列番号１６のＣＤＲ３；
（５） 配列番号１８のＣＤＲ１、配列番号１９のＣＤＲ２および配列番号２０のＣＤＲ３；
（６） 配列番号２２のＣＤＲ１、配列番号２３のＣＤＲ２および配列番号２４のＣＤＲ３；
（７） 配列番号２６のＣＤＲ１、配列番号２７のＣＤＲ２および配列番号２８のＣＤＲ３；
（８） 配列番号３０のＣＤＲ１、配列番号３１のＣＤＲ２および配列番号３２のＣＤＲ３；
（９） 配列番号３４のＣＤＲ１、配列番号３５のＣＤＲ２および配列番号３６のＣＤＲ３；
（１０） 配列番号３８のＣＤＲ１、配列番号３９のＣＤＲ２および配列番号４０のＣＤＲ３；
（１１） 配列番号４２のＣＤＲ１、配列番号４３のＣＤＲ２および配列番号４４のＣＤＲ３；
（１２） 配列番号４６のＣＤＲ１、配列番号４７のＣＤＲ２および配列番号４８のＣＤＲ３；
（１３） 配列番号５０のＣＤＲ１、配列番号５１のＣＤＲ２および配列番号５２のＣＤＲ３；
（１４） 配列番号５４のＣＤＲ１、配列番号５５のＣＤＲ２および配列番号５６のＣＤＲ３；
（１５） 配列番号５８のＣＤＲ１、配列番号５９のＣＤＲ２および配列番号６０のＣＤＲ３；
（１６） 配列番号６２のＣＤＲ１、配列番号６３のＣＤＲ２および配列番号６４のＣＤＲ３；
（１７） 配列番号６６のＣＤＲ１、配列番号６７のＣＤＲ２および配列番号６８のＣＤＲ３；
（１８） 配列番号７０のＣＤＲ１、配列番号７１のＣＤＲ２および配列番号７２のＣＤＲ３；
（１９） 配列番号７４のＣＤＲ１、配列番号７５のＣＤＲ２および配列番号７６のＣＤＲ３；
（２０） 配列番号７８のＣＤＲ１、配列番号７９のＣＤＲ２および配列番号８０のＣＤＲ３。
実施形態３：実施形態１または２に記載のＣＤ８結合ポリペプチドであって、免疫グロブリン単一可変ドメインが、配列番号５、９、１３、１７、２１、２５、２９、３３、３７、４１、４５、４９、５３、５７、６１、６５、６９、７３、７７および８１の一つのアミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
実施形態４：実施形態１～３のいずれか一に記載のＣＤ８結合ポリペプチドであって、免疫グロブリン単一可変ドメインが、 配列番号５、９、１３、１７、２１、２５、２９、３３、３７、４１、４５、４９、５３、５７、６１、６５、６９、７３、７７および８１の一つのアミノ酸配列を含む。
実施形態５：免疫グロブリン単一可変ドメインがＶＨＨである、実施形態１～４のいずれか一に記載のＣＤ８結合ポリペプチド。
実施形態６：実施形態１～５のいずれか一に記載のＣＤ８結合ポリペプチドをコードする核酸分子。
実施形態７：発現調節エレメントに作動可能に連結された実施形態６に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
実施形態８：実施形態６に記載の核酸分子を含むか、実施形態７に記載の発現ベクターによって形質転換された、ＣＤ８結合ポリペプチドを発現することが可能である、宿主細胞。
実施形態９：以下を含む、実施形態１～５のいずれか一に記載のＣＤ８結合ポリペプチドの生成方法：
ａ）ＣＤ８結合ポリペプチドの発現を可能にする条件下で、実施形態８に記載の宿主細胞を培養すること。
ｂ）工程ａ）で得られた培養物から、宿主細胞によって発現されたＣＤ８結合ポリペプチドを回収すること；および
ｃ） 任意選択的に、工程ｂ）で得られたＣＤ８結合ポリペプチドをさらに精製および／または修飾すること。
実施形態１０：実施形態１～５のいずれか一に記載のＣＤ８結合ポリペプチドと、該ＣＤ８結合ポリペプチドに結合した少なくとも１つの検出可能な標識とを含む、コンジュゲート分子。
実施形態１１：検出可能な標識が、放射性核種、蛍光剤、化学発光剤、生物発光剤、常磁性イオン、および酵素から選択される、実施形態１０に記載のコンジュゲート分子。
実施形態１２：検出可能なラベルが、110Ｉｎ、111Ｉｎ、177Ｌｕ、18Ｆ、52Ｆｅ、62Ｃｕ、64Ｃｕ、67Ｃｕ、67Ｇａ、68Ｇａ、68Ｇｅ、86Ｙ、90Ｙ、89Ｚｒ、94mＴｃ、120Ｉ、123Ｉ、124Ｉ、125Ｉ、131Ｉ、154―158Ｇｄ、32Ｐ、11Ｃ、13Ｎ、15Ｏ、186Ｒｅ、188Ｒｅ、51Ｍｎ、52mＭｎ、55Ｃｏ、72Ａｓ、75Ｂｒ、76Ｂｒ、82ｍＲｂ、83Ｓｒまたは他のγ－、β－または正のエミッターから選択され、例えば、検出可能なラベルは68Ｇａまたは125Ｉである、実施形態１１に記載のコンジュゲート分子。
実施形態１３：ＣＤ８結合ポリペプチドが、キレート剤を介して検出可能な標識に結合された、実施形態１０～１２のいずれか一に記載のコンジュゲート分子。
実施形態１４：キレート剤が、ＤＴＰＡ、ＥＤＴＡ、ＮＯＴＡ、ＤＯＴＡ、ＴＲＡＰ、ＴＥＴＡ、ＮＥＴＡ、ＣＢ－ＴＥ２Ａ、Ｃｙｃｌｅｎ、Ｃｙｃｌａｍ、Ｂｉｓｐｉｄｉｎｅ、ＴＡＣＮ、ＡＴＳＭ、ＳａｒＡｒ、ＡｍＢａＳａｒ、ＭＡＧ3、ＭＡＧ2、ＨＹＮＩＣ、ＤＡＤＴ、ＥＣ、ＮＳ3、Ｈ２ｄｅｄｐａ、ＨＢＥＤ、ＤＦＯ、ＰＥＰＡまたはＨＥＨＡ、およびそれらの誘導体から選択される、実施形態１３に記載のコンジュゲート分子。
実施形態１５：検出可能な標識が68Ｇａであり、キレート剤がＮＯＴＡである、実施形態１４に記載のコンジュゲート分子。
実施形態１６：以下を含む、生体試料中のＣＤ８の存在および／または量を検出する方法：
ａ）実施形態１～５のいずれか一に記載のＣＤ８結合ポリペプチドまたは実施形態１０～１５のいずれか一に記載のコンジュゲート分子がＣＤ８と複合体を形成し得る条件下で、生物試料および対照試料を本発明のＣＤ８結合ポリペプチドまたは本発明のコンジュゲート分子に接触させること；および
ｂ）複合体の形成を検出すること、
ここで、生体試料と対照試料との間の複合体形成の差は、試料中のＣＤ８の存在および／または量を示す。
実施形態１７：実施形態１～５のいずれか一に記載のＣＤ８結合ポリペプチドまたは実施形態１０～１５のいずれか一に記載のコンジュゲート分子、および任意に生理学的に許容される担体を含む、ＣＤ８陽性細胞を検出するための検出剤。
実施形態１８：検出剤が造影剤である、実施形態１７に記載の検出剤。
実施形態１９：造影剤が、単光子放出コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）造影剤または陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）造影剤などの放出コンピュータ断層撮影（ＥＣＴ）造影剤である、実施形態１８に記載の検出剤。
実施形態２０：ＣＤ８陽性細胞を検出するための検出剤の調製における、実施形態１～５のいずれか１つに記載のＣＤ８結合ポリペプチドまたは実施形態１０～１５のいずれか１つに記載のコンジュゲート分子の使用。
実施形態２１：検出剤が造影剤である、実施形態２０に記載の検出剤。
実施形態２２：造影剤が、ＳＰＥＣＴ造影剤またはＰＥＴ造影剤などのＥＣＴ造影剤である、実施形態２１に記載の検出剤。
実施形態２３：組織中のＣＤ８陽性細胞の存在および／または量を検出する方法であって、以下を含む方法：
ａ）組織を、実施形態１０～１５のいずれか一に記載のコンジュゲート分子または実施形態１７～１９のいずれか一に記載の検出剤と接触させること；および
ｂ） 組織中のＣＤ８陽性細胞の存在および／または量を測定すること。
実施形態２４：組織が、血液組織、リンパ組織および腫瘍組織から選択される、実施形態２３に記載の方法。
実施形態２５：ＣＤ８陽性細胞がＣＤ８陽性Ｔ細胞である、実施形態２３または２４に記載の方法。
実施形態２６：組織中のＣＤ８陽性細胞の存在および／または量が、組織を撮像することによって決定される、実施形態２３～２５のいずれか一に記載の方法。
実施形態２７：組織中のＣＤ８陽性細胞の存在および／または量がフローサイトメトリーにより決定される、実施形態２３～２５のいずれか一に記載の方法。
実施形態２８：実施形態１０～１５のいずれか一に記載のコンジュゲート分子または実施形態１７～１９のいずれか一に記載の検出剤を対象に投与することを含む、対象の組織におけるＣＤ８陽性細胞の存在および／または量を検出する方法。
実施形態２９：組織が腫瘍組織である、実施形態２８に記載の方法。
実施形態３０：ＣＤ８陽性細胞がＣＤ８陽性Ｔ細胞である、実施形態２８または２９に記載の方法。
実施形態３１：本方法は、ＥＣＴ撮像など、対象を撮像する工程をさらに含み、例えばＥＣＴ撮像はＳＰＥＣＴ撮像またはＰＥＴ撮像である、実施形態２８～３０のいずれか一に記載の方法。
実施形態３２：腫瘍を有する対象が抗腫瘍療法に適しているかどうかを決定する方法であって、以下を含む方法。
１）実施形態１０～１５のいずれか一に記載のコンジュゲート分子または実施形態１７～１９のいずれか一に記載の検出剤を対象に投与すること、および
２）対象の腫瘍がＣＤ８陽性細胞を含むかどうかを判断するために、ＥＣＴ撮像などの方法で対象を撮像すること、
ここで、腫瘍におけるＣＤ８陽性細胞の存在が検出された場合、例えば、対象の腫瘍がＣＤ８陽性細胞によって浸潤されている場合、当該対象は、抗腫瘍療法に適していると同定される。
実施形態３３：抗腫瘍療法に対する腫瘍を有する対象の応答を予測するための方法であって、以下を含む方法：
１）実施形態１０～１５のいずれか一に記載のコンジュゲート分子または実施形態１７～１９のいずれか一に記載の検出剤を対象に投与すること、および
２）対象の腫瘍がＣＤ８陽性細胞を含むかどうかを判断するために、ＥＣＴ撮像などの方法で対象を撮像すること、
ここで、腫瘍におけるＣＤ８陽性細胞（複数可）の存在が検出される場合、例えば、対象の腫瘍がＣＤ８陽性細胞（複数可）によって浸潤されている場合、対象は、抗腫瘍療法に応答し得る。
実施形態３４：対象における腫瘍を治療するための方法であって、以下を含む方法：
１）実施形態１０～１５のいずれか一に記載のコンジュゲート分子または実施形態１７～１９のいずれか一に記載の検出剤を対象に投与すること、および
２）対象の腫瘍がＣＤ８陽性細胞を含むかどうかを判断するために、ＥＣＴ撮像などの方法で対象を撮像すること、
腫瘍におけるＣＤ８陽性細胞の存在が検出された場合、例えば、対象の腫瘍がＣＤ８陽性細胞によって浸潤されている場合、対象に抗腫瘍療法を適用する。
実施形態３５：対象における抗腫瘍療法の有効性をモニタリングする方法であって、以下を含む方法：
１）腫瘍を有し、抗腫瘍療法で治療された対象に、実施形態１０～１５のいずれか一に記載のコンジュゲート分子または実施形態１７～１９のいずれか一に記載の検出剤を投与すること；および
２）対象の腫瘍中のＣＤ８陽性細胞の量を決定するために、ＥＣＴ撮像などの対象の撮像を行うこと。
実施形態３６：抗腫瘍療法が免疫チェックポイント阻害剤療法である、実施形態３２～３５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３７：実施形態３２～３６のいずれか一に記載の方法であって、ここで、抗腫瘍療法が以下の投与から選択される方法。ＰＤ－１阻害剤、ＰＤ－Ｌ１阻害剤、ＣＴＬＡ－４阻害剤、ＴＩＭ３阻害剤、ＢＴＬＡ阻害剤、ＴＩＧＩＴ阻害剤、ＣＤ４７阻害剤、ＧＩＴＲ阻害剤、ＬＡＧ３阻害剤、別のＴ細胞共阻害剤またはリガンドのアンタゴニスト、インドールアミン－２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）阻害剤、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）拮抗剤、Ａｎｇ２阻害剤、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）阻害剤、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤、ＣＤ２０阻害剤、腫瘍特異的抗原に対する抗体、ワクチン、抗原提示を増加させるアジュバント、二重特異性抗体、細胞毒素、化学療法剤、シクロホスファミド、放射線治療、ＩＬ－６Ｒ阻害剤、ＩＬ－４Ｒ阻害剤、 ＩＬ－１０阻害剤、サイトカインおよび抗体－薬物複合体（ＡＤＣ）。
実施形態３８：腫瘍が固形腫瘍である、実施形態３２～３７のいずれか一に記載の方法。
実施形態３９：固形腫瘍が、大腸癌、卵巣癌、前立腺癌、乳癌、脳腫瘍、子宮頸癌、膀胱癌、肛門癌、子宮癌、結腸癌、肝臓癌、膵臓癌、肺癌、子宮内膜癌、骨癌、精巣癌、皮膚癌、腎癌、胃癌、食道癌、頭頸部癌、唾液腺癌および骨髄腫から選ばれる、実施形態３８に記載の方法。
実施形態４０：ＣＤ８陽性細胞を単離および／または精製する方法であって、以下を含む方法：
（ａ）ＣＤ８陽性細胞を含むと疑われる細胞集団（複数可）を提供すること。
（ｂ）細胞集団の亜集団を同定すること、ここで亜集団の細胞は、実施形態１～５のいずれか一に記載のＣＤ８結合ポリペプチドまたは実施形態１０～１５のいずれか一に記載のコンジュゲート分子に結合する、および
（ｃ）亜集団を単離すること。
実施形態４１：ＣＤ８陽性細胞（複数可）を単離する方法であって、以下を含む方法：
（ａ）ＣＤ８陽性細胞を含むと疑われる細胞集団（複数可）を提供すること。
（ｂ）細胞集団を、実施形態１～５のいずれか一に記載のＣＤ８結合ポリペプチドまたは実施形態１０～１５のいずれか一に記載のコンジュゲート分子と接触させ、それによって、ＣＤ８陽性細胞が実施形態１～５のいずれか一に記載のＣＤ８結合ポリペプチドまたは実施形態１０～１５のいずれか一に記載のコンジュゲート分子に結合することを可能にすること。
（ｃ）実施形態１～５のいずれか一に記載のＣＤ８結合ポリペプチドまたは実施形態１０～１５のいずれか一に記載のコンジュゲート分子に結合しない細胞を除去すること；および
（ｄ）実施形態１～５のいずれか一に記載のＣＤ８結合ポリペプチドまたは実施形態１０～１５のいずれか一に記載のコンジュゲート分子に結合するＣＤ８陽性細胞を回収すること。
実施形態４２：ＣＤ８陽性細胞がＣＤ８陽性Ｔ細胞である、実施形態４０または４１に記載の方法。
実施形態４３：ＣＤ８陽性細胞を含む細胞集団が、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である、実施形態４０～４２のいずれか一に記載の方法。
実施形態４４：実施形態１～５のいずれか一に記載のＣＤ８結合ポリペプチドまたは実施形態１０～１５のいずれか一に記載のコンジュゲート分子が固体表面に固定化されており、例えばゲルまたは磁気ビーズの表面に固定化されている、実施形態４０～４４のいずれか一に記載の方法。
実施形態４５：実施形態１～５のいずれか一に記載のＣＤ８結合ポリペプチド、実施形態１０～１５のいずれか一に記載のコンジュゲート分子、または実施形態１７～１９のいずれか一に記載の検出剤を含む、キット。
蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）による、候補抗体のヒトＰＢＭＣ ＣＤ８＋Ｔ細胞表面抗原への結合効果の検討。 125Ｉで標識したＣＤ８単一ドメイン抗体。 125Ｉ標識ＣＤ８α単一ドメイン抗体のＭＣ３８－ＣＤ８細胞への取り込み実験。 125Ｉ標識ＣＤ８単一ドメイン抗体によるＭＣ３８－ＣＤ８細胞飽和結合解析。 125Ｉ－ＳＮＡ００６ａのＭＣ３８－ＣＤ８細胞競合結合解析。 125Ｉ標識ＣＤ８α単一ドメイン抗体によるＳＰＥＣＴ撮像。 68Ｇａ標識ＣＤ８α単一ドメイン抗体の薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）分析。 68Ｇａ標識ＣＤ８α単一ドメイン抗体のｉｎ－ｖｉｖｏ分布データ。 68Ｇａ標識ＣＤ８α単一ドメイン抗体のｉｎ－ｖｉｖｏ分布ターゲット／バックグラウンド比。 68Ｇａ標識ＣＤ８α単一ドメイン抗体によるｉｎ－ｖｉｖｏ ＰＥＴ／ＣＴ撮像。 68Ｇａ標識ＣＤ８α単一ドメイン抗体のｉｎ－ｖｉｖｏ時間生物学的分布曲線。 68Ｇａ－ＮＯＴＡ－ＳＮＡ００６ａのｉｎ－ｖｉｖｏ安定性解析。
定義
指示されているか、明確に規定されていない限り、全ての用語は当該技術分野においてそれらの通常の意味を用いており、当業者には明らかであろう。例えば、 “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ” （２ｎｄ．Ｅｄ．）， Ｖｏｌｓ． １－３， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （１９８９）； Ｌｅｗｉｎ， ”Ｇｅｎｅｓ ＩＶ”， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， （１９９０）； および Ｒｏｉｔｔ ｅｔ ａｌ．， ”Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ” （２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ）， Ｇｏｗｅｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， Ｌｏｎｄｏｎ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８９）のような標準的なハンドブックおよび本明細書で引用している先行技術が参照される。また、特に断りのない限り、具体的に詳述されていない方法、工程、技術、手術はすべて、それ自体既知の方法で行うことができ、当業者には明らかである。例えば、標準マニュアル、上述の一般的な先行技術および本明細書に引用される他の参考文献にも記載されている。
本明細書で互換的に使用される「抗体」または「免疫グロブリン」という用語は、重鎖抗体であろうと従来の４鎖抗体であろうと、特に断らない限り、フルサイズの抗体、その個々の鎖、ならびにそのすべての部分、ドメインまたはフラグメント（それぞれＶＨＨドメインまたはＶＨ／ＶＬドメインなどの抗原結合ドメインまたはフラグメントを含むがこれに限らない）を含む一般用語として使用される。さらに、本明細書で使用される「配列」という用語（例えば、「免疫グロブリン配列」、「抗体配列」、「（単一）可変ドメイン配列」、「ＶＨＨ配列」または「タンパク質配列」などの用語）は、文脈からより限定的な解釈を必要としない限り、関連するアミノ酸配列と同様に、それをコードする核酸配列またはヌクレオチド配列も含むものとして一般的に理解されるべきであろう。
本明細書中で使用される（ポリペプチドまたはタンパク質の）「ドメイン」という用語は、残りのタンパク質とは無関係にその三次構造を保持する能力を有する折りたたまれたタンパク質構造を意味する。一般に、ドメインは、タンパク質の個別の特性に関与し、多くの場合に残りのドメインおよび／またはタンパク質の機能を喪失することなく、別の機能性のタンパク質に付加、除去または移入され得る。
本明細書で使用する用語「免疫グロブリンドメイン」とは、抗体鎖の球状領域（例えば、従来の４鎖抗体の鎖または重鎖抗体の鎖）、または本質的にそのような球状領域からなるポリペプチドを意味する。免疫グロブリンドメインは、抗体分子の特徴である免疫グロブリンフォールドを保持していることが特徴である
本明細書で使用される用語「免疫グロブリン可変ドメイン」は、本質的に４つの「フレームワーク領域」からなる免疫グロブリンドメインを意味し、これらは、当該技術分野および本明細書において、それぞれ「フレームワーク領域１」または「ＦＲ１」；「フレームワーク領域２」または「ＦＲ２」；「フレームワーク領域３」または「ＦＲ３」；および「フレームワーク領域４」または「ＦＲ４」と言及されている。これらのフレームワーク領域は、３つの「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」によって中断されており、これらは、当該技術分野および本明細書において、それぞれ「相補性決定領域１」または「ＣＤＲ１」；「相補性決定領域２」または「ＣＤＲ２」；および「相補性決定領域３」または「ＣＤＲ３」として言及される。したがって、免疫グロブリン可変ドメインの全般的な構造または配列は、以下のように示すことができる： ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４。抗原結合部位をもつことによって抗原に対する抗体に特異性を与えるのは、免疫グロブリン可変ドメインである。
本明細書で使用する「免疫グロブリン単一可変ドメイン」という用語は、追加の可変免疫グロブリンドメインと対になることなく抗原のエピトープに特異的に結合することができる免疫グロブリン可変ドメインを意味する。本発明の意味における免疫グロブリン単一可変ドメインの一例は、免疫グロブリン単一可変ドメインＶＨおよびＶＬ（ＶＨドメインおよびＶＬドメイン）のような「ドメイン抗体」である。免疫グロブリン単一可変ドメインの他の例として、以下に定義するラクダ科動物由来の「ＶＨＨドメイン」（または単に「ＶＨＨ」）がある。
「ＶＨＨドメイン」は、ＶＨＨ、ＶＨＨドメイン、ＶＨＨ抗体フラグメント、およびＶＨＨ抗体としても知られており、元来、「重鎖抗体」（すなわち 「軽鎖を欠いた抗体」）の抗原結合免疫グロブリン（可変）ドメインとして記載されてきた（Ｈａｍａｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎ Ｃ、Ａｔａｒｈｏｕｃｈ Ｔ、Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ Ｓ、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ Ｇ、Ｈａｍａｓ Ｃ、Ｓｏｎｇａ Ｅ Ｂ、Ｂｅｎｄａｈｍａｎ Ｎ、Ｈａｍａｓ Ｒ．：”Ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｄｅｖｏｉｄ ｏｆ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎｓ”； Ｎａｔｕｒｅ ３６３， ４４６－４４８ （１９９３））．「ＶＨＨドメイン」という用語は、これらの可変ドメインを、従来の４鎖抗体に存在する重鎖可変ドメイン（本明細書では「ＶＨドメイン」と呼ぶ）および従来の４鎖抗体に存在する軽鎖可変ドメイン（本明細書では「ＶＬドメイン」と呼ぶ）と区別するために選択されたものである。ＶＨＨドメインは、さらなる抗原結合ドメインなしにエピトープに特異的に結合することができる（従来の４鎖抗体ではＶＨやＶＬドメインとは対照的であるが、この場合はＶＨドメインとともにＶＬによってエピトープが認識される）。ＶＨＨドメインは、単一免疫グロブリンドメインによって形成される、小さくて頑丈で効率的な抗原認識単位である。
本発明の文脈において、用語「重鎖単一ドメイン抗体」、「ＶＨＨドメイン」、「ＶＨＨ」、「ＶＨＨドメイン」、「ＶＨＨ抗体フラグメント」および「ＶＨＨ抗体」は、互換的に使用することが可能である。
免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えばＶＨＨのアミノ酸残基は、Ｋａｂａｔらによって与えられたＶＨドメインの一般的な番号付けに従って番号付けされる（「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、第５版、ＥＤ）。Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ， ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍｄ．， （１９９１））の図２に示すように、ラクダ科動物のＶＨＨドメインに適用したもので、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ａｎｄ Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３１， ２５－３８ （１９９９）に示されている。
ＶＨドメインのアミノ酸残基の番号付けの代替法は当技術分野で知られており、代替法もＶＨＨドメインに同様に適用することができる。例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲは、構造ループの位置を指す（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ， Ｊ． Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． １９６：９０１－９１７ （１９８７））。ＡｂＭ ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ超可変領域とＣｈｏｔｈｉａ構造ループの間の妥協点を表しており、Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ社のＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアで使用されている。「Ｃｏｎｔａｃｔ」 ＣＤＲは、利用可能な複合体の結晶構造に関する分析に基づいている。各手法によるＣＤＲの残基は以下の通りである。
しかしながら、ＶＨドメインおよびＶＨＨドメインについては当技術分野で周知であるように、ＣＤＲの各々におけるアミノ酸残基の総数は様々であり、カバット番号付けによって示されるアミノ酸残基の総数に対応していない可能性がある（すなわち、カバット番号付けによる１つ以上の位置が実際の配列において占有されていないか、または実際の配列カバット番号付けが可能な数よりも多くのアミノ酸残基を含む可能性がある）。これは、一般に、カバットによる番号付けは、実際の配列中のアミノ酸残基の実際の番号付けと対応している場合もあれば、対応していない場合もあることを意味する。
例えば、ＣＤＲは、ＶＬでは２４－３６または２４－３４（ＬＣＤＲ１）、４５－５６または５０－５６（ＬＣＤＲ２）、８９－９７または８９－９６（ＬＣＤＲ３）、ＶＨでは２６－３５（ＨＣＤＲ１）、５０－５６または４９－６５（ＨＣＤＲ２）、９３－１０２、９４－１０２または９５－１０２（ＨＣＤＲ３）などの「拡張ＣＤＲ」を含めることができる。
ＶＨＨドメイン中のアミノ酸残基の総数は、通常、１１０～１２０個であり、しばしば１１２～１１５個である。しかし、より小さい配列およびより長い配列も、本明細書に記載される目的に適している可能性があることに注意すべきである。
ＶＨＨドメインおよびそれを含むポリペプチドのさらなる構造的特徴や機能的特性をまとめると、以下のようになる。
ＶＨＨドメイン（軽鎖可変ドメインの存在なしに、また軽鎖可変ドメインとの相互作用なしに抗原に機能的に結合するように天然で「設計」されている）は、単一の、比較的小さな、機能的抗原結合構造単位、ドメインまたはポリペプチドとして機能することが可能である。ＶＨＨドメインは、従来の４鎖抗体のＶＨドメインやＶＬドメインとは異なり、単独では一般に抗原結合タンパク質や免疫グロブリンの単一可変ドメインとして実用に適さず、何らかの形で結合して機能する抗原結合単位（例えば、Ｆａｂフラグメントなどの従来の抗体フラグメントや、ＶＨドメインとＶＬドメインが共有結合したｓｃＦｖなど）として提供される必要がある。
これらのユニークな特性により、ＶＨＨドメインの使用は、単独または大きなポリペプチドの一部として、従来のＶＨおよびＶＬドメイン、ｓｃＦｖまたは従来の抗体フラグメント（Ｆａｂ－またはＦ（ａｂ’）２フラグメントなど）の使用よりも多くの大きな利点を提供する。抗原を高い親和性と選択性で結合するためには、単一ドメインのみが必要であり、２つの別々のドメインが存在する必要はなく、これらの２つのドメインが正しい空間的コンホメーションと配置で存在することを保証する必要もない（すなわち、ｓｃＦｖのように特に設計したリンカーの使用を介して）。 ＶＨＨドメインは１つの遺伝子から発現させることができ、翻訳後のフォールディングや修飾を必要としない；ＶＨＨドメインは、多価および多重特異的なフォーマット（ｆｏｒｍａｔｅｄ）に容易に設計することができる；ＶＨＨドメインは溶解性が高く、凝集する性質がない；ＶＨＨドメインは、熱、ｐＨ、プロテアーゼ、その他の変性剤または条件に対して非常に安定であるため、冷蔵装置を使用せずに調製、保存、輸送することができ、コスト、時間、環境の節約につながる；ＶＨＨドメインは、生産に必要な規模でも、簡単に、比較的安価に準備することができる；ＶＨＨドメインは、従来の４鎖抗体やその抗原結合フラグメントに比べ、比較的小さい（約１５ｋＤａ、従来のＩｇＧの１０倍）であり、そのため、従来の４鎖抗体やその抗原結合フラグメントに比べ、組織への浸透性が高く、高用量での投与が可能である；ＶＨＨドメインは、いわゆるキャビティ結合性を示すことができるため（特に、従来のＶＨドメインに比べてＣＤＲ３ループが拡張されているため）、従来の４鎖抗体やその抗原結合フラグメントではアクセスできないターゲットやエピトープにもアクセスすることができる。
特異的な抗原またはエピトープに結合するＶＨＨドメインを得る方法は、例えばＲ． ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｉｎｄｅｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２４０（２０００）１８５－１９５； Ｌｉら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．、２８７（２０１２）１３７１３－１３７２１； Ｄｅｆｆａｒら、Ａｆｆａｒ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．８（１２）、 ｐｐ．２６４５－２６５２，１７，２００９ Ｊｕｎｅ；およびＷＯ９４／０４６７８に以前に記載されている。
ラクダ科動物由来のＶＨＨドメインは、元のＶＨＨ配列のアミノ酸配列の１つ以上のアミノ酸残基を、従来のヒト４鎖抗体由来のＶＨドメインの対応する位置に存在するアミノ酸残基で置き換えることで「ヒト化」することができる。（本明細書では「配列最適化」とも呼ばれ、「配列最適化」は、ヒト化に加えて、翻訳後修飾の可能性のある部位の除去など、ＶＨＨに改善された特性を与える１つ以上の変異による配列の追加修飾を包含することができる）。 ヒト化ＶＨＨドメインは、１つ以上の完全ヒトフレームワーク領域配列を含むことができる。ヒト化は、タンパク質の表面アミノ酸をヒト化する方法（リサーフェシング）および／またはヒト化ユニバーサルフレームワークＣＤＲグラフト法（ユニバーサルフレームワークへのＣＤＲグラフト）を用いて行うことができる。
本明細書中で使用される、用語「エピトープ」または互換的に使用される用語「抗原決定基」は、抗体のパラトープが結合する抗原上の任意の抗原決定基を指す。抗原決定基は通常、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面基を含み、通常、特異的な三次元構造特性および特異的電荷特性を有する。例えば、エピトープは、独特の空間的コンホメーションにおいて、通常、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個の連続アミノ酸または非連続アミノ酸を含み、それらは「線形エピトープ」または「立体配置」エピトープであり得る。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ６６， Ｇ．Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ， Ｅｄ．（１９９６）を参照されたい。線形エピトープでは、タンパク質と相互作用する分子（抗体など）との間のすべての相互作用点は、タンパク質の一次アミノ酸配列に沿って直線的に存在する。立体配置エピトープでは、互いに離れたタンパク質アミノ酸残基にわたって相互作用点が存在する。
当該技術分野で周知の多くのエピトープマッピング技術を用いて、所与の抗原のエピトープを同定することができる。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌｕｍｅ ６６， Ｇ．Ｅ． Ｍｏｒｒｉｓ， Ｅｄ． （１９９６）における方法におけるＥｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓを参照されたい。例えば、線形エピトープは、例えば、以下の方法によって決定され得る：多数のペプチドを固体支持上で同時に合成し、ここで、これらのペプチドは、タンパク質分子の一部に対応し、これらのペプチドを、支持体に依然として付着したまま抗体と反応させる。これらの技術は当該技術分野で公知であり、例えば、米国特許第４，７０８，８７１号； Ｇｅｙｓｅｎら（１９８４） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１： ３９９８－４００２； Ｇｅｙｓｅｎら（１９８６） Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：７０９－７１５に記載されている。同様に、立体配置エピトープは、例えば、Ｘ線結晶解析や２次元核磁気共鳴によって、アミノ酸の空間配置を決定することによって同定することができる。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（前掲）を参照のこと。
当業者に公知の従来技術を用いて、同じエピトープへの競合的結合について抗体をスクリーニングすることができる。例えば、競合および交差競合研究を行い、互いに競合する抗体を得るか、または抗原への結合について交差競合する抗体を得ることができる。その交差競合に基づいて同じエピトープに結合する抗体を得るためのハイスループット法は、国際特許出願ＷＯ０３／４８７３１に記載されている。したがって、当業者に公知の従来技術を用いて、ＣＤ８上の同じエピトープに結合するために本発明の抗体分子と競合する抗体およびその抗原結合フラグメントを得ることができる。
一般的に、「特異性」という用語は、特定の抗原結合分子または抗原結合タンパク質（本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインなど）分子が結合し得る様々な種類の抗原またはエピトープの数を意味する。抗原結合タンパク質の特異性は、その親和性および／またはアビディティに基づいて決定することができる。抗原結合タンパク質をもつ抗原の解離に対する平衡定数で表される親和性（ＫＤ）は、抗原結合タンパク質上のエピトープと抗原結合部位との結合強度の尺度である。すなわち、ＫＤの値が小さいほど、エピトープと抗原結合タンパク質との結合強度が強くなる（代替的に、親和性は１／ＫＤである親和定数（ＫＡ）として表されることもある）。当業者にとって明らかであるように、親和性は、対象とする特異的抗原に応じて、それ自体が知られている方法で決定することができる。アビディティは、抗原結合タンパク質（例えば、免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメインまたはそれを含むポリペプチド）と該当する抗原との結合の強さの尺度である。アビディティは、抗原結合分子上のエピトープとその抗原結合部位との親和性と、抗原結合タンパク質上に存在する適切な結合部位の数との両方に関係している。
本明細書において、「ＣＤ８結合タンパク質（ＣＤ８結合ポリペプチド）」という用語は、ＣＤ８αタンパク質と結合することが可能な任意のタンパク質を意味する。ＣＤ８結合タンパク質は、ＣＤ８αに対する抗体、例えば、本明細書で定義される抗体を含むことができる。ＣＤ８結合タンパク質は、免疫グロブリンスーパーファミリー抗体（ＩｇＳＦ）やＣＤＲグラフト分子もカバーする。ＣＤ８αの例示的なアミノ酸配列は、 配列番号１に示すとおりである。
本発明の「ＣＤ８結合タンパク質」は、ＣＤ８と結合するＶＨＨなどの免疫グロブリン単一可変ドメインを少なくとも１つ含むことができる。いくつかの実施形態では、本発明の「ＣＤ８結合分子」は、ＣＤ８に結合するＶＨＨなどの２、３、４またはそれ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインを含むことができる。ＣＤ８に結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを除く本発明のＣＤ８結合タンパク質は、リンカーおよび／またはエフェクター機能を有する部位、例えば半減期延長部位（血清アルブミンを結合する免疫グロブリン単一可変ドメインなど）および／または融合リガンド（血清アルブミンなど）および／またはコンジュゲートポリマー（ＰＥＧなど）および／またはＦｃ領域を含むことができる。いくつかの実施形態では、本発明の「ＣＤ８結合タンパク質」は、異なる抗原に結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含む二重特異性抗体をさらに企図する。
一般に、本発明のＣＤ８結合タンパク質は、結合する抗原（すなわち、ＣＤ８タンパク質）と、ＢｉａｃｏｒｅまたはＫｉｎＥｘＡまたはＦｏｒｔｉｂｉｏアッセイで測定された、好ましくは１０-7～１０-10 ｍｏｌ／Ｌ（Ｍ）、より好ましくは１０-8～１０-10 ｍｏｌ／Ｌ、さらに好ましくは１０-9～１０-10 ｍｏｌ／Ｌ以下の解離定数（ＫＤ）で、および／または少なくとも１０7 Ｍ-1、好ましくは少なくとも１０8 Ｍ-1、より好ましくは少なくとも１０9 Ｍ-1、より好ましくは少なくとも１０10Ｍ-1の会合定数（ＫＡ）で、結合する。１０ -4 Ｍ より大きいＫＤ 値は、一般に、非特異的結合を示すと見なされる。抗原またはエピトープに対する抗原結合タンパク質の特異的結合は、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイ、スキャッチャードアッセイ、および／または本明細書に記載される競合結合アッセイ（例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）およびサンドイッチ競合アッセイ）を含む、公知の任意の好適な方法で決定され得る。
アミノ酸残基は、当該技術分野で一般に知られ、かつ合意されているように、標準的な３文字または１文字のアミノ酸コードに従って示されるであろう。２つのアミノ酸配列を比較する場合、「アミノ酸の違い」という用語は、第２の配列と比較して、参照配列の位置における指示された数のアミノ酸残基の挿入、欠失または置換を意味する。置換の場合、そのような置換は、アミノ酸置換であることが望ましく、これは、アミノ酸残基が類似の化学構造の別のアミノ酸残基と置換され、かつポリペプチドの機能、活性または他の生物学的特性にほとんど影響を及ぼさないか、本質的に影響を及ぼさないことを意味する。このような保存的アミノ酸置換は当技術分野でよく知られており、保存的アミノ酸置換は、好ましくは、以下の群（ｉ）～（ｖ）内の１つのアミノ酸が、同じ群内の他のアミノ酸残基で置換された置換である。 （ｉ） 小さい脂肪族、非極性またはわずかに極性のある残基：Ａｌａ， Ｓｅｒ， Ｔｈｒ， Ｐｒｏ および Ｇｌｙ；（ｉｉ） 極性で負に帯電した残基とその（帯電していない）アミド。Ａｓｐ， Ａｓｎ， ＧｌｕおよびＧｌｎ； （ｉｉｉ） 極性、正電荷を持つ残基：Ｈｉｓ、ＡｒｇおよびＬｙｓ；（ｉｖ）大きな脂肪族、非極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＶａｌおよびＣｙｓ；ならびに（ｖ）芳香族残基：Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐ。特に好ましい保存的アミノ酸置換は以下の通りである。ＡｌａをＧｌｙへ、またはＳｅｒへ；ＡｒｇをＬｙｓへ；ＡｓｎをＧｌｎへ、またはＨｉｓへ； ＡｓｐをＧｌｕへ； ＣｙｓをＳｅｒへ； ＧｌｎをＡｓｎへ； ＧｌｕをＡｓｐへ； ＧｌｙをＡｌａへ、またはＰｒｏへ； ＨｉｓをＡｓｎへ、またはＧｌｎへ； ＩｌｅからＬｅｕへ、またはＶａｌへ；ＬｅｕからＩｌｅへ、またはＶａｌへ； ＬｙｓをＡｒｇへ、Ｇｌｎへ、またはＧｌｕへ； ＭｅｔをＬｅｕへ、Ｔｙｒへ、またはＩｌｅへ； ＰｈｅをＭｅｔへ、Ｌｅｕへ、またはＴｙｒへ； ＳｅｒをＴｈｒへ；ＴｈｒをＳｅｒへ； ＴｒｐをＴｙｒへ； ＴｙｒをＴｒｐに、またはＰｈｅへ；ＶａｌからＩｌｅへ、またはＬｅｕへ。
２つのポリペプチド配列間の「配列同一性」とは、配列間で同一のアミノ酸が占める割合のことである。「配列の類似性」とは、同一または保守的なアミノ酸の置換の割合のことである。アミノ酸またはヌクレオチド間の配列同一性の程度を評価する方法は、当業者に公知である。例えば、アミノ酸配列の同一性は、通常、配列解析ソフトウェアを用いて測定される。例えば、ＮＣＢＩデータベースのＢＬＡＳＴプログラムを用いて、同一性を決定することができる。配列の同一性の判断については、例えば、以下のようなものがある。Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｌｅｓｋ， ＡＭ， ｅｄ．， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８８； Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ， Ｓｍｉｔｈ， ＤＷ， ｅｄｓ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ， １９９３； Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ， Ｐａｒｔ Ｉ， Ｇｒｉｆｆｉｎ， ＡＭ， ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ， ＨＧ， ｅｄｓ．， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ， １９９４； Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ， Ｇ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９８７ ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ， Ｇｒｉｂｓｋｏｖ， Ｍ． ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ， Ｊ．， ｅｄｓ， Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９１．
ポリペプチドまたは核酸分子は、供給源および／または培地（培養培地）と比較して、ポリペプチドまたは核酸分子が得られる（他のタンパク質／ポリペプチド、別の核酸、別の生物学的成分または高分子、または少なくとも１つの汚染物質、不純物または微量成分など）天然の生物学的供給源または培地（培養培地）において、通常それと関連している少なくとも１つの他の成分から単離された場合、「実質的に単離された」とみなされる。特に、ポリペプチドまたは核酸分子は、少なくとも２回、特に少なくとも１０回、より特に少なくとも１００回、最大で１０００回以上精製された場合に、「実質的に単離された」とみなされる。適切な技術（例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動などの適切なクロマトグラフィー技術）によって決定されるように、「実質的に単離された」ポリペプチドまたは核酸分子は、好ましくは実質的に均質である。
本明細書中で使用される「対象」という用語は、哺乳動物、とりわけ霊長類、とりわけヒトを意味する。
本発明のＣＤ８結合ポリペプチド
本発明は、ＣＤ８と特異的に結合することができる少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含む、ＣＤ８結合ポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態において、ＣＤ８結合ポリペプチドは単離される。いくつかの実施形態では、ＣＤ８結合ポリペプチドは、ＣＤ８αに特異的に結合する。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインは、配列番号５、９、１３、１７、２１、２５、２９、３３、３７、４１、４５、４９、５３、５７、６１、６５、６９、７３、７７および８１のいずれか１つに示すＶＨＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ ＣＤＲ、ＡｂＭ ＣＤＲ、Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲ、またはＣｏｎｔａｃｔ ＣＤＲのいずれでもよい。いくつかの実施形態では、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ ＣＤＲである。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインは、以下から選択される ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む：
（１） 配列番号２のＣＤＲ１、配列番号３のＣＤＲ２および配列番号４のＣＤＲ３；
（２） 配列番号６のＣＤＲ１、配列番号７のＣＤＲ２および配列番号８のＣＤＲ３；
（３） 配列番号１０のＣＤＲ１、配列番号１１のＣＤＲ２および配列番号１２のＣＤＲ３；
（４） 配列番号１４のＣＤＲ１、配列番号１５のＣＤＲ２および配列番号１６のＣＤＲ３；
（５） 配列番号１８のＣＤＲ１、配列番号１９のＣＤＲ２および配列番号２０のＣＤＲ３；
（６） 配列番号２２のＣＤＲ１、配列番号２３のＣＤＲ２および配列番号２４のＣＤＲ３；
（７） 配列番号２６のＣＤＲ１、配列番号２７のＣＤＲ２および配列番号２８のＣＤＲ３；
（８） 配列番号３０のＣＤＲ１、配列番号３１のＣＤＲ２および配列番号３２のＣＤＲ３；
（９） 配列番号３４のＣＤＲ１、配列番号３５のＣＤＲ２および配列番号３６のＣＤＲ３；
（１０） 配列番号３８のＣＤＲ１、配列番号３９のＣＤＲ２および配列番号４０のＣＤＲ３；
（１１） 配列番号４２のＣＤＲ１、配列番号４３のＣＤＲ２および配列番号４４のＣＤＲ３；
（１２） 配列番号４６のＣＤＲ１、配列番号４７のＣＤＲ２および配列番号４８のＣＤＲ３；
（１３） 配列番号５０のＣＤＲ１、配列番号５１のＣＤＲ２および配列番号５２のＣＤＲ３；
（１４） 配列番号５４のＣＤＲ１、配列番号５５のＣＤＲ２および配列番号５６のＣＤＲ３；
（１５） 配列番号５８のＣＤＲ１、配列番号５９のＣＤＲ２および配列番号６０のＣＤＲ３；
（１６） 配列番号６２のＣＤＲ１、配列番号６３のＣＤＲ２および配列番号６４のＣＤＲ３；
（１７） 配列番号６６のＣＤＲ１、配列番号６７のＣＤＲ２および配列番号６８のＣＤＲ３；
（１８） 配列番号７０のＣＤＲ１、配列番号７１のＣＤＲ２および配列番号７２のＣＤＲ３；
（１９） 配列番号７４のＣＤＲ１、配列番号７５のＣＤＲ２および配列番号７６のＣＤＲ３；
（２０） 配列番号７８のＣＤＲ１、配列番号７９のＣＤＲ２および配列番号８０のＣＤＲ３。
いくつかの実施形態では、免疫グロブリン単一可変ドメインが、配列番号５、９、１３、１７、２１、２５、２９、３３、３７、４１、４５、４９、５３、５７、６１、６５、６９、７３、７７および８１の一つのアミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、免疫グロブリン単一可変ドメインが、 配列番号５、９、１３、１７、２１、２５、２９、３３、３７、４１、４５、４９、５３、５７、６１、６５、６９、７３、７７および８１の一つのアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、免疫グロブリン単一可変ドメインはＶＨＨである。いくつかの実施形態では、免疫グロブリン単一可変ドメインは、ヒト化されている。
核酸、ベクター、宿主細胞
別の態様では、本発明は、本発明のＣＤ８結合ポリペプチドをコードする核酸分子に関連する。本発明の核酸は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはｃＤＮＡであり得る。本発明のＣＤ８結合ポリペプチドをコードする核酸分子は、当業者であれば必要に応じて、あるいは慣用手段に従って選択することができる。いくつかの実施形態では、本発明のＣＤ８結合ポリペプチドをコードする核酸分子は、配列番号８２～９１から選択されるヌクレオチド配列を含む。
また、本発明の核酸は、ベクターの形態であってもよく、ベクター中に存在してもよく、および／またはプラスミド、コスミド、ＹＡＣなどのベクターの一部であってもよい。ベクターは、特に、発現ベクター、すなわち、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏ（すなわち、適切な宿主細胞、宿主生物、および／または発現系）でＣＤ８結合ポリペプチドの発現を提供するベクターであってよい。発現ベクターは、典型的には、１つ以上の適切な発現調節要素（例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーターなど）に作動可能に連結した本発明の少なくとも１つの核酸を含む。特定の宿主で発現させるための要素およびその配列の選択は、当業者には常識である。本発明のＣＤ８結合ポリペプチドの発現に有用または必須な調節要素およびその他の要素の具体例としては、例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、組み込み因子、選択マーカー、リーダー配列、レポーター遺伝子が挙げられる。
本発明の核酸は、本明細書に開示された本発明のポリペプチドのアミノ酸配列に関する情報に基づいて、公知の方法で（例えば、自動ＤＮＡ合成および／または組換えＤＮＡ技術によって）調製または取得されてもよく、および／または適切な天然源から単離されてもよい。
別の態様では、本発明は、本発明のＣＤ８結合ポリペプチドの１つ以上を発現する、または発現することができる宿主細胞を含み、および／または本発明の核酸またはベクターを含む。本発明の好ましい宿主細胞は、細菌細胞、真菌細胞または哺乳動物細胞である。
好適な細菌細胞としては、グラム陰性細菌株（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株、Ｐｒｏｔｅｕｓ株、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ株）およびグラム陽性細菌株（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ株、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ株、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ株、およびＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ株）の細胞を含む。
好適な真菌細胞は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓの種の細胞を含み；またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ（例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ（例えばＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、Ｐｉｃｈｉａ（例えばＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓおよびＰｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、およびＨａｎｓｅｎｕｌａの種の細胞を含む。
好適な哺乳類細胞としては、例えば、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞等を含む。
しかし、両生類細胞、昆虫細胞、植物細胞、および異種タンパク質を発現させるための当該技術分野における他の任意の細胞も、本発明に使用することができる。
本発明はさらに、本発明のＣＤ８結合ポリペプチドを製造する方法を提供し、該方法は、以下の工程を含む。
－本発明のＣＤ８結合ポリペプチドの発現を可能にする条件下で、本発明の宿主細胞を培養すること；
－宿主細胞によって発現されたＣＤ８結合ポリペプチドを培養物から回収すること；および
－任意選択的に、本発明のＣＤ８結合ポリペプチドをさらに精製および／または修飾すること。
本発明のＣＤ８結合ポリペプチドは、上記のように細胞内で（例えば、細胞質内、ペリプラズム内、または封入体内で）産生され、その後、宿主細胞から単離し、任意にさらに精製してもよく；または細胞外に（例えば、宿主細胞が培養されている培地で）産生され、その後、培地から単離し、任意にさらに精製してもよい。
ポリペプチドの組換え生産のための方法および試薬、例えば、特定の適切な発現ベクター、形質転換またはトランスフェクション方法、選択マーカー、タンパク質発現の誘導方法、培養条件などは、当技術分野で既知である。同様に、本発明のＣＤ８結合ポリペプチドの製造方法に適したタンパク質の単離・精製技術は、当業者によく知られている。
しかしながら、本発明のＣＤ８結合ポリペプチドは、固相合成または液相合成を含む化学合成など、当技術分野で知られている他のタンパク質製造方法によっても得ることができる。
コンジュゲート分子
別の態様では、本発明は、本発明のＣＤ８結合ポリペプチドと、該ＣＤ８結合ポリペプチドと結合した少なくとも１つの検出可能な標識とを含む、コンジュゲート分子を提供する。
検出可能な標識としては、放射性核種、蛍光剤、化学発光剤、生物発光剤、常磁性イオン、酵素などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
コンジュゲーションに使用できる蛍光剤としては、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ－フタルアルデヒド、およびフルオレキサミンなどがあるが、これらに限定されるわけではない。コンジュゲーションに使用できる化学発光剤には、ルミノール、イソラミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジン塩、シュウ酸塩などがあるが、これらに限定されない。コンジュゲーションに使用できる生物発光剤としては、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、クラゲ発光タンパク質などが挙げられるが、これらに限定されない。コンジュゲーションに使用できる常磁性イオンとしては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。 クロム（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、鉄（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、ネオジム（ＩＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、イッテルビウム（ＩＩＩ）、ガドリニウム（ＩＩＩ）、バナジウム（ＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）、ホルミウム（ＩＩＩ）およびエルビウム（ＩＩＩ）、またはダム（ｄａｍ）、ジアトリゾエート、エチオドオイルなどの放射線不透過性物質、クエン酸ガリウム、イオカルム酸、ロセタミン酸（ｌｏｃｅｔａｍｉｃ ａｃｉｄ）、ヨードアミド、オジパミド、ロドキサム酸、イオプロミド、イオヘキソール、イオパミドール、イオパノイン酸、イオプロセム酸、イオセファム酸、イオセル酸、イオカルム酸（ｌｏｃａｒｍｉｃ Ａｃｉｄ）、イオタスル、イオタラミン酸、イオタラム酸、イオトロクス酸、 イオキサグル酸、イオキソトリゾ酸、イポデート、メグルミン、メトリザミド、メトリゾ酸塩、ジオノシルおよび水酸化タロス。コンジュゲーションに用いることのできる酵素としては、西洋わさびペルオキシダーゼなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
好ましくは、検出可能な標識は放射性核種である。コンジュゲーションに使用できる放射性核種は、２０ＫｅＶ～４０００ＫｅＶのエネルギーを有する放射性核種で、限定されないが、110Ｉｎ、111Ｉｎ、177Ｌｕ、18Ｆ、52Ｆｅ、62Ｃｕ、64Ｃｕ、67Ｃｕ、67Ｇａ、68Ｇａ、68Ｇｅ、86Ｙ、90Ｙ、89Ｚｒ、94mＴｃ、120Ｉ、123Ｉ、124Ｉ、125Ｉ、131Ｉ、154―158Ｇｄ、32Ｐ、11Ｃ、13Ｎ、15Ｏ、186Ｒｅ、188Ｒｅ、51Ｍｎ、52mＭｎ、55Ｃｏ、72Ａｓ、75Ｂｒ、76Ｂｒ、82ｍＲｂ、83Ｓｒまたは他のγ－、β－または正のエミッターを挙げることができる。いくつかの実施形態では、検出可能な標識が、68Ｇａまたは125Ｉである。
検出可能な標識をポリペプチドに結合させる方法は、当業者によく知られている。例えば、いくつかの実施形態では、ＣＤ８結合ポリペプチドは、キレート剤を介して検出可能な標識とコンジュゲートされ得る。
本発明のＣＤ８結合ポリペプチドを68Ｇａ等の放射性核種で標識するためには、本発明のＣＤ８結合ポリペプチドを、イオンとの結合のために複数の組み込み基（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐ）が結合したロングテールを有する試薬と反応させる必要がある。このようなテールは、例えば、以下のようなものがある：ポリリジン、多糖類、またはキレート基と結合可能な側鎖を誘導体化された鎖または誘導体化可能な鎖を有する他のポリマー、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、ＤＯＴＡ（１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－四酢酸）、ＮＯＴＡ、ＴＥＴＡ、ＮＥＴＡ、ポルフィリン、ポリアミン、クラウンエーテル、ビスチオセミカルバゾン、ポリオキシムおよび当該目的に有用な類似の基。キレート剤は、通常の化学的手法で抗体に結合させることができる。いくつかの実施形態では、検出可能な標識は、キレート剤を介して本発明のＣＤ８結合ポリペプチドにコンジュゲートされている。用いられるキレート剤としては、ＤＴＰＡ、ＥＤＴＡ、ＮＯＴＡ、ＤＯＴＡ、ＴＲＡＰ、ＴＥＴＡ、ＮＥＴＡ、ＣＢ－ＴＥ２Ａ、Ｃｙｃｌｅｎ、Ｃｙｃｌａｍ、Ｂｉｓｐｉｄｉｎｅ、ＴＡＣＮ、ＡＴＳＭ、ＳａｒＡｒ、ＡｍＢａＳａｒ、ＭＡＧ3、ＭＡＧ2、ＨＹＮＩＣ、ＤＡＤＴ、ＥＣ、ＮＳ3、Ｈ２ｄｅｄｐａ、ＨＢＥＤ、ＤＦＯ、ＰＥＰＡまたはＨＥＨＡ、およびそれらの誘導体などを含むがこれらに限定されない。
いくつかの具体的な実施形態において、検出可能な標識は68Ｇａであり、キレート剤はＮＯＴＡである。
別の態様では、本発明は、68Ｇａなどの放射性核種で標識された本発明のコンジュゲート分子を調製する方法を提供し、以下を含む。１）本発明のＣＤ８結合ポリペプチドをキレート剤とコンジュゲートして、ＣＤ８結合ポリペプチドとキレート剤とのコンジュゲートを生成させること；および２） 工程１）で得られた生成物を68Ｇａなどの放射性核種と接触させ、ＣＤ８結合ポリペプチドがキレート剤のキレート作用により68Ｇａなどの放射性核種により標識すること。いくつかの実施形態では、キレート剤はＮＯＴＡであり、工程１）において、ＣＤ８結合ポリペプチドとＮＯＴＡとのコンジュゲートは、ＣＤ８結合ポリペプチドをｐ－ＳＣＮ－Ｂｎ－ＮＯＴＡまたはｐ－ＮＨ２－Ｂｎ－ＮＯＴＡと反応させることにより生成される。
別の態様では、本発明は、125Ｉで標識された本発明のコンジュゲート分子を調製する方法であって、１）本発明のＣＤ８結合ポリペプチドをクロラミンＴの存在下で125Ｉと反応させること；および２）メタ重亜硫酸ナトリウムを用いて反応を終了させることを含む、方法を提供する。
検出・診断用途
別の態様では、本発明は、生体試料中のＣＤ８の存在および／または量を検出する方法であって、以下を含む方法を提供する。
ａ）本発明のＣＤ８結合ポリペプチドまたは本発明のコンジュゲート分子がＣＤ８と複合体を形成し得る条件下で、生物試料および対照試料を本発明のＣＤ８結合ポリペプチドまたは本発明のコンジュゲート分子に接触させること；および
ｂ） 複合体の形成を検出すること、
ここで、生体試料と対照試料との間の複合体形成の差は、試料中のＣＤ８の存在および／または量を示す。いくつかの実施形態では、生体試料はｅｘ ｖｉｖｏ試料である。
別の態様では、本発明は、ＣＤ８陽性細胞を検出するための検出剤であって、本発明のＣＤ８結合ポリペプチドまたは本発明のコンジュゲート分子、および任意に生理学的に許容される担体を含む、検出剤を提供する。いくつかの実施形態では、検出剤は、対象の組織におけるＣＤ８陽性細胞の存在および／または量を検出するために使用される。いくつかの実施形態では、組織は、腫瘍組織である。いくつかの実施形態では、ＣＤ８陽性細胞は、ＣＤ８陽性Ｔ細胞である。
本発明のＣＤ８結合ポリペプチドまたは本発明のコンジュゲート分子は、特にインビボ撮像に適しており、例えば、放出コンピュータ断層撮影法（ＥＣＴ）に好適である。例えば、本発明のＣＤ８結合ポリペプチドまたは本発明のコンジュゲート分子は、様々な標識により、単光子放出コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）およびポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）に適用することが可能である。診断においては、ＥＣＴにより高解像度の撮像と画像による定量的な解析が可能である。また、ＳＰＥＣＴ撮像にはＳＰＥＣＴ／ＣＴ撮像を、ＰＥＴ撮像にはＰＥＴ／ＣＴ撮像を含めることができ、より良い撮像効果を得ることができる。
したがって、いくつかの実施形態では、検出剤は造影剤である。いくつかの実施形態において、診断薬は、ＳＰＥＣＴ造影剤またはＰＥＴ造影剤などのＥＣＴ造影剤である。
別の態様では、本発明は、ＣＤ８陽性細胞を検出するための検出剤の調製における、本発明のＣＤ８結合ポリペプチドまたは本発明のコンジュゲート分子の使用を提供する。いくつかの実施形態では、検出剤は、対象の組織におけるＣＤ８陽性細胞の存在および／または量を検出するために使用される。いくつかの実施形態では、組織は、腫瘍組織である。いくつかの実施形態では、ＣＤ８陽性細胞は、ＣＤ８陽性Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、検出剤は造影剤である。いくつかの実施形態において、造影薬は、ＳＰＥＣＴ造影剤またはＰＥＴ造影剤などのＥＣＴ造影剤である。
別の態様では、本発明は、組織におけるＣＤ８陽性細胞の存在および／または量を検出する方法であって、以下を含む方法を提供する。
ａ） 組織を本発明のコンジュゲート分子または本発明の検出剤と接触させること；および
ｂ） 組織中のＣＤ８陽性細胞の存在および／または量を決定すること。
いくつかの実施形態では、組織は血液組織である。いくつかの実施形態では、組織はリンパ組織である。いくつかの実施形態では、組織は、腫瘍組織である。いくつかの実施形態では、ＣＤ８陽性細胞は、ＣＤ８陽性Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、組織中のＣＤ８陽性細胞の存在および／または量は、組織を撮像することによって決定される。いくつかの実施形態において、組織中のＣＤ８陽性細胞の存在および／または量は、フローサイトメトリーによって決定される。
別の態様において、本発明は、本発明のコンジュゲート分子または本発明の検出剤を対象に投与することを含む、対象におけるＣＤ８陽性細胞の検出方法を提供する。いくつかの実施形態において、本方法は、対象の組織におけるＣＤ８陽性細胞の存在および／または量を検出するために使用される。いくつかの実施形態では、組織は、腫瘍組織である。いくつかの実施形態では、ＣＤ８陽性細胞は、ＣＤ８陽性Ｔ細胞である。
いくつかの実施形態において、本方法は、ＥＣＴ撮像など、対象を撮像する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、ＥＣＴ撮像はＳＰＥＣ撮像である。いくつかの実施形態において、ＥＣＴ撮像はＰＥＴ撮像である。ＳＰＥＣＴやＰＥＴの撮像技術や装置は当業界でよく知られており、そのような既知のＥＣＴ撮影技術や装置を使用することができる。
別の態様では、本発明は、腫瘍を有する対象が抗腫瘍療法に適しているかどうかを決定する方法を提供し、該方法は、以下を含む：
１）本発明のコンジュゲート分子または本発明の検出剤を対象に投与すること、および
２）対象の腫瘍がＣＤ８陽性細胞を含むかどうかを判断するために、ＥＣＴ撮像など、対象を撮像すること、
ここで、腫瘍におけるＣＤ８陽性細胞の存在が検出された場合、例えば、対象の腫瘍がＣＤ８陽性細胞によって浸潤されている場合、当該対象は、抗腫瘍療法に適していると同定される。
別の態様では、本発明は、抗腫瘍療法に対する腫瘍を有する対象の応答を予測するための方法を提供し、以下を含む。
１）本発明のコンジュゲート分子または本発明の検出剤を対象に投与すること、および
２）対象の腫瘍がＣＤ８陽性細胞を含むかどうかを判断するために、ＥＣＴ撮像など、対象を撮像すること、
ここで、腫瘍におけるＣＤ８陽性細胞の存在が検出された場合、例えば、対象の腫瘍がＣＤ８陽性細胞によって浸潤されている場合、対象は、抗腫瘍療法に反応し得る。
ＣＤ８陽性Ｔ細胞などのＣＤ８陽性細胞の存在は、抗腫瘍治療効果の予測マーカーや生存の予後マーカーとなり得る。例えば、ベースラインＣＤ８陽性細胞の腫瘍浸潤は、乳癌、頭頸部癌、卵巣癌の生存率の予後指標となる。また、抗ＰＤ－１療法や抗ＰＤＬ－１療法中に検出されるＣＤ８陽性細胞の腫瘍浸潤は、治療効果の予測マーカーとなる。
別の態様では、本発明は、対象における腫瘍を治療するための方法を提供し、該方法は、以下を含む。
１）本発明のコンジュゲート分子または本発明の検出剤を対象に投与すること、および
２）対象の腫瘍がＣＤ８陽性細胞を含むかどうかを判断するために、ＥＣＴ撮像など、対象を撮像すること、
腫瘍におけるＣＤ８陽性細胞の存在が検出された場合、例えば、対象の腫瘍が前記ＣＤ８陽性細胞によって浸潤されている場合、対象に抗腫瘍療法が適用される。
別の態様では、本発明は、対象における抗腫瘍療法の有効性をモニタリングするための方法を提供し、該方法は、以下を含む。
１）本発明のコンジュゲート分子または本発明の検出剤を、腫瘍を有し、抗腫瘍療法で治療された対象に投与すること；および
２）対象の腫瘍におけるＣＤ８陽性細胞の量を決定するため、対象をＥＣＴ撮像などで撮像すること。
本発明の様々な態様のいくつかの実施形態では、抗腫瘍療法は、免疫チェックポイント阻害剤療法である。いくつかの実施形態において、抗腫瘍療法は、以下を投与することを含む：ＰＤ－１阻害剤（例えばＲＥＧＮ２８１０、ＢＧＢ－Ａ３１７、ニボルマブ、Ｐｉｒｉｚｕｍａｂ、およびＰａｍｕｚｕｍａｂ）、ＰＤ－Ｌ１阻害剤（例えばＡｔｚｕｚｕｍａｂ、Ａｖｅｌｕｍａｂ、およびＤｕｖａｌｉｍａｂ）、ＣＴＬＡ－４阻害剤（例えばイピリムマブ）、ＴＩＭ３阻害剤、ＢＴＬＡ阻害剤、ＴＩＧＩＴ阻害剤、ＣＤ４７阻害剤、ＧＩＴＲ阻害剤、ＬＡＧ３阻害剤、別のＴ細胞共阻害剤またはリガンドのアンタゴニスト（例えば、ＣＤ－２８、２Ｂ４、ＬＹ１０８、ＬＡＩＲ１、ＩＣＯＳ、ＣＤ１６０またはＶＩＳＴＡの抗体）、インドールアミン－２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）阻害剤、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）拮抗剤、Ａｎｇ２阻害剤（Ｎｅｖａモノクローナル抗体）、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）阻害剤、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤（例えば、エロチニブおよびセツキシマブ）、ＣＤ２０阻害剤（例えば、リツキシマブなどの抗ＣＤ２０抗体）、腫瘍特異的抗原に対する抗体（例えば、ＣＡ９、ＣＡ１２５、メラノーマ関連抗原３（ＭＡＧＥ３））、 ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ抗原（ＣＥＡ）、ｖｉｍｅｎｔｉｎ、ｔｕｍｏｒ－Ｍ２－ＰＫ、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ｍｕｃｉｎ－１、ＭＡＲＴ－１およびＣＡ１９－９、ワクチン（例えばＢＣＧワクチン、がんワクチン）、 抗原提示を高めるためのアジュバント（例えば顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）、二重特異性抗体（例えば、ＣＤ３×ＣＤ２０二重特異性抗体やＰＳＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体）、細胞傷害剤、化学療法剤 （例えばダカルバジン、テモゾロミド、シクロホスファミド、ドセタキセル、ドノマイシン、シスプラチン、カルボプラチン、ゲムシタビン、メトトレキサート、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセルおよびビンクリスチン）、シクロホスファミド、放射線治療、ＩＬ－６Ｒ阻害剤（例えばＳａｒｅｌｕｍａｂ）、ＩＬ－４Ｒ阻害剤（例えばＤｕｐｉｒｕｍａｂ）、ＩＬ－１０阻害剤、サイトカイン（例えばＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－２１およびＩＬ－１５）、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）（例えば抗ＣＤ１９－ＤＭ４ ＡＤＣおよび抗ＤＳ６－ＤＭ４ ＡＤＣ）。
本発明の様々な態様のいくつかの実施形態において、腫瘍は固形腫瘍であり、大腸癌、卵巣癌、前立腺癌、乳癌、脳腫瘍、子宮頸癌、膀胱癌、肛門癌、子宮癌、結腸癌、肝臓癌、膵臓癌、肺癌、子宮内膜癌、骨癌、精巣癌、皮膚癌、腎癌、胃癌、食道癌、頭頸部癌、唾液腺癌および骨髄腫を含むがこれらに限定されない。
ＣＤ８陽性細胞の単離・精製
別の態様において、本発明はさらに、以下を含む、ＣＤ８陽性細胞を単離および／または精製するための方法を提供する：
（ａ）ＣＤ８陽性細胞を含むと疑われる細胞集団を提供すること；
（ｂ）細胞集団の亜集団を同定し、ここで亜集団の細胞は、本発明のＣＤ８結合ポリペプチドまたは本発明のコンジュゲート分子に結合する；および
（ｃ）亜集団を単離すること。
いくつかの実施形態では、ＣＤ８陽性細胞は、ＣＤ８陽性Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、ＣＤ８陽性細胞を含む細胞集団は、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である。
いくつかの実施形態では、ＣＤ８陽性細胞は、フローサイトメトリーを通じて単離することができる。
別の態様では、本発明はさらに、以下を含む、ＣＤ８陽性細胞を単離する方法を提供する：
（ａ）ＣＤ８陽性細胞を含むと疑われる細胞集団を提供すること；
（ｂ）細胞集団を本発明のＣＤ８結合ポリペプチドまたは本発明のコンジュゲート分子と接触させ、それによってＣＤ８陽性細胞が本発明のＣＤ８結合ポリペプチドまたは本発明のコンジュゲート分子に結合させること；
（ｃ）本発明のＣＤ８結合ポリペプチドまたは本発明のコンジュゲート分子に結合しない細胞を除去すること；および
（ｄ）本発明のＣＤ８結合ポリペプチドまたは本発明のコンジュゲート分子に結合したＣＤ８陽性細胞を回収すること。
いくつかの実施形態では、ＣＤ８陽性細胞は、ＣＤ８陽性Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、ＣＤ８陽性細胞を含む細胞集団は、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である。
いくつかの実施形態では、本発明のＣＤ８結合ポリペプチドまたは本発明のコンジュゲート分子は、固体表面に固定化され、例えば、ゲルまたは磁気ビーズの表面に固定化される。
キット
別の態様において、本発明は、本発明のＣＤ８結合ポリペプチドまたは本発明のコンジュゲート分子または本発明の検出剤を含む、キットを提供する。本キットは、本発明の方法を実施するために使用される。一般に、キットは内容物の期待の用途を示すタグを含む。「タグ」という用語は、キットに記載され、またはキットとともに提供され、あるいはその他の方法でキットとともに提供される任意の書類または記録物を含む。
以下、本発明を実施例によりさらに説明するが、本発明は記載された実施例の範囲に限定されるものではない。
実施例１ ＣＤ８αに対する重鎖単一ドメイン抗体のスクリーニング
ＣＤ８α－Ｆｃ融合タンパク質のアミノ酸配列は、以下の通りである：
アミノ酸１～２１はＣＤ８α受容体のシグナルペプチド、アミノ酸２２～１３６はＣＤ８α受容体の免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメイン、アミノ酸１３７～１８１はＣＤ８α受容体のＩｇドメイン、アミノ酸１８２～２０９はＣＤ８α受容体の膜貫通ドメイン、アミノ酸２１０～２３５はＣＤ８α受容体の細胞質ドメインである。
図中、１本線のマーキング領域はＦｃ領域、２本線のマーキング領域はリンカーである。
１．１ ライブラリの構築
免疫用ＣＤ８α－Ｆｃ融合タンパク質をＣＨＯ細胞で発現させ、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーで精製した。アルパカが選ばれ、免疫された。免疫後、アルパカ末梢血からリンパ球を抽出し、Ｔｒｉｚｏｌの説明書に従ってそこからＲＮＡを抽出し、ＮａｎｏｄｒｏｐでＲＮＡの濃度を測定した。抽出したＲＮＡは、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標） ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ－ＰＣＲ ｋｉｔを用い、説明書に従ってｃＤＮＡに逆転写させた。重鎖抗体の可変領域をコードする核酸フラグメントは、ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲにより増幅された。
ＶＨＨフラグメントをＤＮＡプロダクト精製キットを用いて精製し、ベクターとフラグメントを制限酵素ｓｉｆｉで５０℃で一晩消化した。消化されたフラグメントを切断・回収し、ベクターｐＣｏｍｂ３ＸＳＳにクローニングし、ファージディスプレイを行った。この産物を大腸菌電気受容細胞ＴＧ１に電気的に形質転換し、ＣＤ８αに対する重鎖単一ドメイン抗体ファージディスプレイライブラリを構築し、その検証を行った。勾配希釈とペービング（ｐａｖｉｎｇ）により、ライブラリの体積は５．０４×１０9と算出された。ライブラリの挿入率を検出するために、４８個のクローンを無作為に選び、同定を行った。その結果、挿入率は１００％に達しており、サイズも合っていることが分かった。
１．２ ＣＤ８αに対する重鎖単一ドメイン抗体のパニング
プレートに１０μｇ／ｗｅｌｌのＣＤ８α－ｃＨｉｓ融合タンパク質をコートし、一晩４℃に置いた。翌日、３％ＢＳＡで２時間３７℃でブロッキングし、ＰＢＳＴ（ＰＢＳに０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含む）で５回洗浄後、１００μＬのファージ（１．７１×１０11ｃｆｕ、１．１で構築したキャメル重鎖単一ドメイン抗体ファージディスプレイライブラリーに由来）を加え、３７℃で１時間作用させた。その後、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ中に、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）溶液でプレートを１０回洗浄し、さらにＰＢＳ溶液で１０回洗浄して、結合しなかったファージを洗い流した。その後、各ウェルに１００μＬのＧｌｙ－Ｈｃｌ（ＰＨ＝２．５）を加えて３７℃で６～８分間作用させ、ＣＤ８αに特異的に結合するファージを解離させて滅菌遠心管に移し、滅菌遠心管に１／１０容量のＴｒｉｓ－Ｈｃｌ （ＰＨ＝９．０） 液を素早く加えてバッファーを中和させた。中和後の溶液１０μＬを勾配希釈に取り、力価を測定してパニング回収率を算出し、中和後のファージを対数増殖期のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｉｌ ＴＧ１に感染させて次のスクリーニング用のファージを生産・精製した。同じスクリーニングを数回繰り返し、その都度、パニングの条件を変えて行った。そこで、ファージディスプレイ技術を使って、抗体ライブラリのＣＤ８特異的な抗体をスクリーニングする目的を達成するために、陽性クローンを濃縮した。アフィニティー溶出の条件を下表に示す。
表１ アフィニティーパニングの条件
１．３ ファージの酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を用いた特異的な単一陽性クローンのスクリーニング
３－４回のパニングの後、最後のパニングに供されたプレートから９６個のクローンを無作為に選び、同定を行った。９６個のシングルコロニーをランダムにピックアップし、それぞれを培養してファージを生産・精製した。プレートにＣＤ８α－Ｆｃ融合タンパク質を４℃で一晩コートした後、３％ＢＳＡでブロッキングし、３７℃で１時間反応させた。その後、感染後に得られたファージ上清を各ウェルに加え（対照群はブランクファージ）、３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴ洗浄後、西洋わさびペルオキシダーゼ標識抗Ｍ１３二次抗体（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｙｉｑｉａｏ Ｓｈｅｎｚｈｏｕ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．より購入）を加え、室温で１時間反応させた。洗浄後、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）発色液を加え、４５０ ｎｍの吸光度を読み取った。一方、プレートはＦｃタンパク質で４℃、一晩コートした後、３％ＢＳＡでブロッキングし、３７℃で１時間反応させた。洗浄後、感染後に得られたファージ上清（対照群はブランクファージ）を加え、３７℃で１時間反応させた。洗浄後、過酸化水素標識抗Ｍ１３二次抗体（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｙｉｑｉａｏ Ｓｈｅｎｚｈｏｕ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．より購入）を加え、室温で１時間反応させた。その後、ＴＭＢ発色液を加え、４５０ｎｍの吸収値を読み取った。ここで、ＯＤ値をブランクコントロールのＯＤ値で割った比が４以上であれば、候補の抗体はＣＤ８α－Ｆｃタンパク質に結合できると判断される。 一方、ＣＤ８α－Ｆｃ抗原タンパク質を結合できる上記抗体のＣＤ８α－Ｆｃ結合ＯＤ値をＦｃタンパク質結合ＯＤ値で割った比が５以上であることから、Ｆｃ部分よりもＣＤ８α部分に特異的に結合できる候補と考えられた。その結果、スクリーニングされた抗体の中には、ＦｃではなくＣＤ８αと特異的に結合できるものがあることがわかった。クローン候補の菌は、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ液体培養液に移し、プラスミド抽出と塩基配列の決定を行った。
表２ ＣＤ８α－Ｆｃタグ抗原のファージＥＬＩＳＡによる同定結果
表３ ファージＥＬＩＳＡによるＦｃタグ抗原の同定
各クローンのタンパク質配列は、配列アライメントソフトウェアＤＮＡＭＡＮに従って解析された。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３が同じ配列のクローンは全て同一抗体とし、ＣＤＲの配列が異なるクローンは異なる抗体とした。最終的に、２０の候補配列が得られた。
ＮＯ．２：Ｃ２， ＮＯ．２０：Ｃ２０， ＮＯ．２４：Ｃ２４， ＮＯ．２７：Ｃ２７， ＮＯ．２９：Ｃ２９， ＮＯ．３０：Ｃ３０， ＮＯ．３７：Ｃ３７， ＮＯ．４２：Ｃ４２， ＮＯ．４５：Ｃ４５， ＮＯ．４６：Ｃ４６， ＮＯ．５３：Ｓ５， ＮＯ．５４：Ｓ６， ＮＯ．５５：Ｓ７， ＮＯ．６１：Ｓ１３， ＮＯ．６６：Ｓ１８， ＮＯ．７０：Ｓ２２， ＮＯ．７１：Ｓ２３， ＮＯ．７７：Ｓ２９， ＮＯ．３２：Ｓ８０， ＮＯ．３６：Ｓ８４．
表４ 単一ドメイン抗体候補２０種のアミノ酸配列
注下線部は、抗体配列のＣＤＲ領域である。
実施例２ ＣＤ８αに対する重鎖単一ドメイン抗体の予備的評価と同定
２．１ 宿主細菌大腸菌での重鎖単一ドメイン抗体の発現と精製
実施例１でシークエンス解析により得られた候補単一ドメイン抗体のコード配列を発現ベクターＰＥＴ２２ｂにサブクローニングし、シークエンスが正しく特定された組み換えプラスミドを発現宿主株ＢＬ２１に形質転換し、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ固体培地のプレートに３７℃で一晩植え付けを行った。シングルコロニーを選んで接種し、一晩培養した。翌日、一晩経った株を移し替えて増幅した。株を、ＯＤ値が約０．６になるまで３７℃で振盪培養した後、０．５ ｍＭ ＩＰＴＧで誘導し、２８℃で一晩振盪培養を行った。翌日、菌株を遠心分離して回収し、超音波で破砕して粗抗体抽出物を得た。その後、ニッケルイオンアフィニティークロマトグラフィーで抗体タンパク質を精製した。最終的に、９０％以上の純度の抗体タンパク質を得ることができた。
２．２ 哺乳類細胞を用いたＣＤ８α抗体タンパク質の調製
スクリーニングしたＣＤ８α単一ドメイン抗体のヌクレオチド配列に対してプライマーを設計し、上記原核生物発現プラスミドを鋳型としてＰＣＲにより各抗体のヌクレオチド配列（ヒスチジン標識を含む）を増幅し、ｐＣＤＮＡ４ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｔ Ｖ８６２２０） ベクターにクローン化した。遺伝子配列決定により、得られた目的クローン遺伝子の配列の正しさを判断した。
Ｃ２－ｃＨｉｓ抗体のヌクレオチド配列（配列番号８２）：
Ｃ２４－ｃＨｉｓ 抗体のヌクレオチド配列（配列番号８３） ：
Ｃ２７－ｃＨｉｓ抗体のヌクレオチド配列（配列番号８４）：
Ｃ２９－ｃＨｉｓ抗体のヌクレオチド配列（配列番号８５）：
Ｃ３７－ｃＨｉｓ抗体のヌクレオチド配列（配列番号８６）：
Ｃ４２－ｃＨｉｓ抗体のヌクレオチド配列（配列番号８７）：
Ｃ４６－ｃＨｉｓ抗体のヌクレオチド配列（配列番号８８）：
Ｓ５－ｃＨｉｓ抗体のヌクレオチド配列（配列番号８９）：
Ｓ１３－ｃＨｉｓ抗体のヌクレオチド配列（配列番号９０）：
Ｓ３６－ｃＨｉｓ抗体のヌクレオチド配列（配列番号９１）：
組換えにより構築したヒスチジンタグを有する上記単一ドメイン抗体プラスミドをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトし、抗体発現を行った。組換え発現プラスミドをＦｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３培養液で希釈し、形質転換に必要なポリエチレンイミン（ＰＥＩ）溶液を添加した。プラスミドとＰＥＩの混合物をそれぞれＨＥＫ２９３細胞懸濁液に添加し、３７℃、１０％ＣＯ2、９０ｒｐｍの条件下で培養した。５～６日間培養後、一過性発現培養上清を回収し、ヒスチジン標識単一ドメイン抗体融合タンパク質をＮｉ＋樹脂ゲルアフィニティークロマトグラフィーで精製した。
２．３ ヒトＣＤ８αタンパク質に対する異なる抗ＣＤ８α単一ドメイン抗体のＥＬＩＳＡ活性検出法
ＣＤ８ α－Ｆｃタンパク質をＨＥＫ２９３で一過性に発現させ、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーで精製した。得られたＣＤ８α－Ｆｃタンパク質を０．５μｇ／ｗｅｌｌの濃度で４℃にて一晩プレートコートした後、得られた抗ＣＤ８α単一ドメイン抗体タンパク質の勾配希釈系列を加え、室温にて１時間反応させた。洗浄後、抗Ｈｉｓ西洋わさびペルオキシダーゼ標識抗体を加え、室温で１時間反応させた。洗浄後、発色液を加え、４５０ｎｍの吸光度を読み取った。データ処理とプロット解析は、ソフトウェアＳｏｔｆＭａｘＰｒｏ ｖ５．４を使って行った。４パラメータフィッティングにより、抗体のＣＤ８α結合曲線とＥＣ５０値（試験した全ての抗体のＥＣ５０値は０．９８９ ｎｇ／ｍＬ～４．１１ ｎｇ／ｍＬ）が得られた。選択された１０種類の抗体（詳細は表５参照）のうち、ＣＤ８αに対する抗体の親和性を反映するように、Ｃ２－ｃＨｉｓを対照として異なる抗ＣＤ８α単一ドメイン抗体の相対的な活性を比較した。試験した１０種類の抗体のうち、Ｃ３７、Ｃ４２、Ｃ４６、Ｓ５、Ｓ３６は比較的高い結合活性を持っている。
表５ ＣＤ８α結合に関する１０種類の抗体のＥＬＩＳＡ結果
実施例３ ＣＤ８α単一ドメイン抗体のｉｎ－ｖｉｔｒｏ活性解析
３．１ ＦＡＣＳによる抗ＣＤ８α単一ドメイン抗体の細胞表面ＣＤ８αへの結合作用の検討
ヒトＣＤ８α全長タンパク質遺伝子を安定的に導入したマウス結腸癌ＭＣ３８細胞株を構築し、ヒトＣＤ８αタンパク質を細胞膜上に安定的に発現するＭＣ３８細胞（ＭＣ３８－ＣＤ８α細胞）を取得した。使用前に、９０％以上のコンバージェンスまで培養した。これらの細胞に対して、抗ＣＤ８α単一ドメイン抗体を用いてフローサイトメトリーを行い、間接免疫蛍光染色を定量的に解析し、各細胞表面の受容体の量を決定した。
細胞を回収し、２．５ ×１０6 ｃｅｌｌｓ／ｍＬ の濃度になるように懸濁した。細胞サンプル２００μＬと一次抗体２０μＬを混合し、得られた混合物を氷上で３０分間インキュベートした。細胞を遠心分離し、洗浄、再懸濁した後、５μＬの二次抗体－ＰＥコンジュゲートを加え、上記の混合物を氷上で３０分間インキュベートした。細胞は２回洗浄後、再懸濁し、ＢＤ ＦＡＣＳＣｅｌｅｓｔａＴＭ でフローサイトメトリーを実施した。各チューブについて、少なくとも ５×１０4 のイベントが収集された。解析はすべて単色で、ＦＬ１ではＰＥが検出された。前方散乱（ＦＳ）と側方散乱（ＳＳ）のデータから、すべての細胞集団が密接にクラスター化されていることが証明された。
フローサイトメトリーにより、ｉｎ－ｖｉｔｒｏ ＣＤ８α発現細胞の評価を行った（表６）。ＭＣ３８－ＣＤ８α細胞結合における２０種類の単一ドメイン抗体の陽性率は、いずれも９３．６％以上である。２０個の単一ドメインのうち、Ｃ２、Ｃ３７、Ｃ４２、Ｃ４６、Ｓ５、Ｓ３６の６種の単一ドメイン抗体の陽性率はいずれも９９．５％以上であり、陽性対照のｈｕＯＫＴ８（ｈｕＯＫＴ８はＵＳ２０１６００２４２０９Ａ１の配列を参照した発現・精製タンパク質）の陽性率は９３．０％であった。
表６ ＦＡＣＳで調べた細胞表面ＣＤ８αへの抗体の結合効果
３．２ ヒトＰＢＭＣ ＣＤ８ ＋ Ｔ細胞表面抗原に対する抗ＣＤ８α単一ドメイン抗体の結合性
ヒト末梢血を磁気ビーズで分離してヒトＣＤ８＋Ｔ細胞を得、陽性対照として抗ＣＤ８αＰＥ コンジュゲート （Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｃａｔ ＃ ＦＡＢ１５０９Ｐ） を用いて、ＣＤ８＋Ｔ細胞に対する抗ＣＤ８α単一ドメイン抗体Ｃ３７－ｈｉｓの結合性を解析した。
分離して得られた細胞の濃度を２．５×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整した。細胞サンプル １５０μＬ を一次抗体 ３μｇ と混合し、得られた混合物を氷上で ３０ 分間インキュベートした。細胞を洗浄し再懸濁した後、５μＬの二次抗ＰＥコンジュゲートを加え、上記混合物を暗所にて氷上で３０分静置した。細胞は２回洗浄後、再懸濁し、ＢＤ ＦＡＣＳＣｅｌｅｓｔａＴＭ でフローサイトメトリーを実施した。各チューブについて、少なくとも５×１０4個のイベントが収集された。解析はすべて単色で、ＦＬ１ではＰＥが検出された。前方散乱（ＦＳ）と側方散乱（ＳＳ）のデータは、すべての細胞集団が密接にクラスタリングされていることを証明している。
Ｔ細胞（図１）のＣＤ８α発現の評価には、フローサイトメトリーを用いた。ＣＤ８α単一ドメイン抗体Ｃ３７－ｃｈｉｓは、ヒトＰＢＭＣ ＣＤ８＋ Ｔ細胞表面抗原に対して良好な結合能を有している。
３．３ 抗 ＣＤ８α 単一ドメイン抗体の ＣＤ８α への結合能の同定（ＦｏｒｔｅＢｉｏ 法）
抗ＣＤ８α単一ドメイン抗体－バイオンチンをＳＡバイオセンサーに固定した。その後、６．２５～１００ｎＭの濃度のＣＤ８α－ｃｈｉｓをナノ抗体に結合させ、解離させた。４つの抗体Ｃ３７、Ｃ４２、Ｃ４６、Ｓ５の結合動的変数を評価し、Ｋｏｎ、Ｋｏｆｆ、Ｋｄを含むＯｃｔｅｔ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｖｅｒｓｉｏｎ ９．０を使用して決定した。
測定された抗ＣＤ８α抗体の結合親和性を表７に示す。その結果、Ｃ３７－ｈｉｓタンパク質はＣＤ８α標的タンパク質に大きな親和性を持ち、その比較的高いＫａ値と比較的低いＫｄ値は、この抗体融合タンパク質がＣＤ８α抗原と素早く結合でき、ＣＤ８α抗原が解離しにくいことを示している。
表７ ＣＤ８αに対する抗体の結合親和性
実施例４ 125Ｉ標識ＣＤ８α単一ドメイン抗体のｉｎ－ｖｉｔｒｏ解析
４．１ 標識ＣＤ８α単一ドメイン抗体 125Ｉ
説明の便宜上、単一ドメイン抗体Ｃ３７－ｃＨｉｓをＳＮＡ００６ａ、単一ドメイン抗体Ｃ４２－ｃＨｉｓをＳＮＡ００６ｂ、単一ドメイン抗体Ｃ４６－ｃＨｉｓをＳＮＡ００６ｃ、単一ドメイン抗体Ｓ５－ｃＨｉｓをＳＮＡ００６ｄと名付けた。125Ｉのラベル化実験は、クロラミンＴ法を用いて行われた。
０．０５ ｍｏｌ／Ｌ， ｐＨ＝７．５ ＰＢＳを溶媒として，１０ ｍｇ／ｍＬ クロラミンＴ溶液とメタ重亜硫酸ナトリウム溶液を調製した。タンパク質２μＬをＰＢ溶液５０μＬに希釈し、溶液５０μＬに１．５ｍＣｉ（１０μＬ）のＮａ125Ｉを加えて混合し、クロラミンＴ溶液を混合溶液中に加えて素早く均一に混合し、上記の材料を室温で５分間反応させた。反応後に得られた上記溶液にメタ重亜硫酸ナトリウム溶液５０μＬを加えて混合し、反応を終了させた。標識化率はＲａｄｉｏ－ＴＬＣスキャナーで確認した。未反応の125ＩはＰＤ－１０カラムで除去し、その間にプロダクトバッファーシステムを通常生理食塩水に変更した。標識の結果は図２の通りである。
４．２ 125Ｉ 標識 ＣＤ８α 単一ドメイン抗体の ＭＣ３８－ＣＤ８ 細胞への細胞結合アッセイ
ＭＣ３８－ＣＤ８細胞（ＣＤ８陽性）およびＭＣ３８細胞（陰性対照）を６ウェルプレート４枚に１×１０6細胞／ウェル、３ｍＬ培養液／ウェルでプレートし、３７℃、５％ＣＯ2下で一晩培養した。 細胞を取り出し、４℃で ３０ 分間インキュベートした。 ６ウェルプレートをすべて取り出し、各実験群を全結合群と非特異的結合群に分け、各グ群に３つの平行なサンプルを用意したため、１つの６ウェルプレートが１群の実験に対応した。タンパク質で標識されていない培養液２６μＭを３ウェル培養液に添加し、非特異吸着対照試料とした。培養液を、125Ｉ標識ＣＤ８単一ドメイン抗体を１μｃｉ（約５ｎＭ）含む対応する（125Ｉ標識ＳＮＡ００６ａ、ｂ、ｃ、ｄ）培養液に完全に交換した。細胞を、３７℃、５％ＣＯ2下で１時間インキュベートした。 インキュベーション後、上清を回収し、１％ＢＳＡを含む予冷したＰＢＳで細胞を洗浄し、上清に合わせた。 残りの細胞沈殿物をＳＤＳを含むＰＢＳで再懸濁した後、上清と沈殿した細胞の放射能カウントｃｐｍ値をそれぞれγカウンターで測定し、減衰補正を実施した。
析出回数（ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ｃｏｕｎｔ）は、結合群の細胞結合部（Ｂ）であり 、上清と沈殿物の放射能数の合計が全放射能（Ｔ）である。この群のＢ／Ｔから対応する非特異的結合を差し引いたものが、図３に示すように、この群の１０6個の細胞が結合する放射免疫活性分率（％で計算）である。
図３に示すように、125Ｉ標識ＣＤ８α単一ドメイン抗体はＭＣ３８－ＣＤ８細胞への結合率が高く、対応するＣＤ８陰性細胞は結合できない。 さらに、125Ｉ標識ＣＤ８α単一ドメイン抗体のＭＣ３８－ＣＤ８細胞への結合はすべて非標識ＣＤ８単一ドメイン抗体でブロックできる。これは、125Ｉ標識ＣＤ８単一ドメイン抗体のＭＣ３８－ＣＤ８細胞への特異的結合能力が証明されたことになる。
一方、計算上では、ＭＣ３８－ＣＤ８細胞１０6個に対する125Ｉ－ＳＮＡ００６ａの結合率は約５０％であり、125Ｉ－ＳＮＡ００６ｄの最低結合率も１０％以上であった。125Ｉ標識のＳＮＡ００６ａ、ｂ、ｃ、ｄはいずれも高い結合性を示し、ＳＮＡ００６－ａ、ｂはＳＮＡ００６－ｃ、ｄと比較してＣＤ８に対して高い親和性を有することが証明された。
４．３ 125Ｉ 標識 ＣＤ８α 単一ドメイン抗体の飽和結合アッセイ
細胞の調製：９６ウェルフィルタープレートで飽和試験を実施した。ＭＣ３８－ＣＤ８細胞は５０ｍＬ培養ディッシュで培養した。試験前に培養液を除去し、細胞を０．０１Ｍ滅菌ＰＢＳで２回洗浄し、トリプシンで消化し、再度ＰＢＳで２回洗浄し、最後に５％ＢＳＡを加えた細胞懸濁液に調製した。９６ウェル吸引フィルタープレートに約１０5ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度で添加した。
特異的結合をブロックするためのコールド抗体溶液の調製：１０ ｍｇ／ｍＬ ＣＤ８単一ドメイン抗体溶液（０．０１Ｍ ＰＢＳに溶解）を５％ ＢＳＡで１０倍希釈して１ ｍｇ／ｍＬ 溶液とした。
受容体結合反応：放射性リガンド飽和法を用いた。全結合群および非特異的結合群を含む。全結合群には徐々に濃度を上げる１２投与点を設定し、非特異的結合群に１２投与を設定し、各投与点には４群の並行試料を設定し、総反応量は２００μＬ、これに対応してコールド抗体は１０００倍過剰であった。
細胞を４℃で２時間インキュベートした。その後、上清を抽出し、４℃に予冷したＰＢＳで６回洗浄した後、各ウェルに毎回２００μＬのＰＢＳを添加した。最後に濾過膜を回収し、試料と標準試料の各チューブの放射能カウントをγカウンターで測定した。最後に、Ｐｒｉｓｍ ７．０ （ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ， Ｉｎｃ．） ソフトウェアを使用して、一点結合モデルに従って飽和曲線フィッティングを行い、ＫＤ と Ｂｍａｘ を算出した。
ＭＣ３８－ＣＤ８細胞と125Ｉ－ＣＤ８単一ドメイン抗体とのラジオリガンド結合解析の飽和曲線を図４に示す。
125Ｉ－ＣＤ８単一ドメイン抗体の結合親和性の測定値を表８に示す。125Ｉ標識ＣＤ８単一ドメイン抗体のＭＣ３８－ＣＤ８細胞への結合は、非標識ＣＤ８単一ドメイン抗体によってブロックすることができ、125Ｉ標識ＣＤ８単一ドメイン抗体のＭＣ３８－ＣＤ８細胞への特異的結合能が証明された。125Ｉ－ＳＮＡ００６ａのＫＤ値は０．４６ｎＭ、125Ｉ－ＳＮＡ００６ｃのＫD値は３．８ｎＭ、125Ｉ－ＳＮＡ００６ｄのＫD値は１．５ｎＭで、125Ｉ－ＳＮＡ００６ａの親和性は125Ｉ－ＳＮＡ００６ｃおよびｄのそれより著しく優れていることがわかる。その結果、ＣＤ８単一ドメイン抗体はＣＤ８標的タンパク質に対して有意な親和性を有しており、中でも125Ｉ－ＳＮＡ００６ａは最も強い親和性を有していることがわかった。
表８ ＣＤ８単一ドメイン抗体のＣＤ８への結合親和性
４．４ 125Ｉ 標識 ＣＤ８α 単一ドメイン抗体の競合結合実験 （競合結合アッセイ）
細胞の調製：９６ウェルフィルタープレートで飽和試験を実施した。ＭＣ３８－ＣＤ８細胞は５０ｍＬ培養ディッシュで培養した。試験前に培養液を除去し、細胞を０．０１Ｍ滅菌ＰＢＳで２回洗浄し、トリプシンで消化し、再度ＰＢＳで２回洗浄し、最後に５％ＢＳＡを加えた細胞懸濁液に調製した。９６ウェル吸引フィルタープレートに約１０5ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度で添加した。
９６ウェル細胞吸引フィルタープレートは、使用前に結合バッファーで飽和させ、空気中で乾燥させた。吸引フィルタープレートの各ウェルに、約１０5個の細胞と徐々に濃度を上げたＣＤ８単一ドメイン抗体を添加した後、125Ｉ－ＣＤ８単一ドメイン抗体を約２×１０5カウント／分の速度で各ウェルに添加し、反応量を結合バッファーで２００μＬに調整した
４℃で２時間反応させた後、吸引フィルタープレート内の反応液を真空ポンプと吸引フィルタープレートの補助装置を用いて排出し、２００μＬのＰＢＳ緩衝液（０．０１Ｍ、ｐＨ＝７．４）を各ウェルに加え排出、６回繰り返し細胞洗浄を実施した。吸引ろ板底部のろ膜を乾燥させた後、底部のろ膜を回収し、γカウンターを用いて測定した。計算およびプロットはＰｒｉｓｍ ７．０（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ， Ｉｎｃ）を用いて行い，非線形回帰分析により半減期阻害濃度ＩＣ５０を算出した。各実験ポイントに４つの平行なサンプルを設定し、実験を２回繰り返した。この実験で得られた結果は、平均値に標準偏差を加えた。
図５に示すように、125Ｉ－ＳＮＡ００６ａのＭＣ３８－ＣＤ８細胞受容体への結合は、ＳＮＡ００６ａ「コールド」タンパク質によっても濃度依存的に阻害されることがわかった。Ｐｒｉｓｍ ７．０ （ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ， Ｉｎｃ．） ソフトウェアフィッティングにより得られたＩＣ５０値は約３．０ ｎＭであった。本明細書に記載した競合結合エッセイは、ＣＤ８抗原に対するＳＮＡ００６ａの高い親和性と高い特異性を示す。
実施例５ 125Ｉラベル化ＣＤ８α単一ドメイン抗体とそのＳＰＥＣＴ／ＣＴ撮像
５．１ 125Ｉ標識ＣＤ８α単一ドメイン抗体研究のための動物モデル
６－８週齢の雌性ヌードマウスをｉｎ－ｖｉｖｏ試験に使用した。ヌードマウスは特定病原体フリー（ＳＰＦ）環境で飼育され、自由摂餌、昼夜１２時間の標準的な周期で光をあてた。異種移植は、１００μＬの細胞（ＭＣ３８－ＣＤ８またはＭＣ３８）／ＰＢＳをヌードマウスの右前脚に皮下移植した。細胞の接種密度は、約５～６×１０6個／動物であった。移植はイソフルラン麻酔下で行われた。この条件下で、注射した動物の９０％以上で、１－２週間後に適当な腫瘍（１００－３００ｍｍ3）（ＭＣ３８－ＣＤ８またはＭＣ３８）が得られた。
実験終了後、腫瘍組織を採取してＣＤ８免疫組織化学染色を行い、ＣＤ８の発現量を解析し、ＰＥＴ／ＣＴで検出された腫瘍全体のＣＤ８発現量と比較した。
５．２ 125Ｉ標識ＣＤ８α単一ドメイン抗体を用いたｉｎ－ｖｉｖｏ ＳＰＥＣＴ撮像
ＭＣ３８－ＣＤ８＋／－腫瘍モデルは、５．１の方法に従って接種した。ヌードマウスをイソフルランで麻酔した後、ＳＰＥＣＴ／ＣＴベッドに設置し、放射性標識単一ドメイン抗体約１０μｇ（約１００μＣｉ／１０μｇ）を尾静脈から投与した。ＳＰＥＣＴスキャンは１時間と２時間でそれぞれ行われ、複数の時点での腫瘍と組織臓器の放射性吸収が解析された。結果を図６に示す。
125Ｉ－ＣＤ８単一ドメイン抗体を注入してから１２０分以内に、ＭＣ３８－ＣＤ８を移植した腫瘍がはっきりと確認された。図６より、右のＭＣ３８－ＣＤ８＋腫瘍は対側の陰性対照腫瘍ＭＣ３８－ＣＤ８－と比較して良好なコントラストを示し、125Ｉ－ＣＤ８単一ドメイン抗体は腎臓で有意に濃縮されていることから、主に腎臓で代謝されることがわかる。上記のヨウ素標識法では、必然的に脱ヨウ素化が起こるため、ＳＰＥＣＴの結果、甲状腺や胃に放射性物質が濃縮される可能性がある。さらに、125Ｉのエネルギーは弱く、ＳＰＥＣＴ撮像に適用すると、特定の組織の自己吸収を引き起こす可能性がある。したがって、125Ｉ標識ＣＤ８単一ドメイン抗体のＳＰＥＣＴ撮像への応用は、その後の68Ｇａ標識撮像剤に使用するための最適な候補抗体のスクリーニングを目的としている。その結果、125Ｉで標識したＳＮＡ００６ａ、ＳＮＡ００６ｃ、ＳＮＡ００６ｄは腫瘍部位で高い取り込みを示し、ＳＮＡ００６ａの撮像効果はＳＮＡ００６ｃ、ＳＮＡ００６ｄの撮像効果より有意に優れていることがわかった。ＳＰＥＣＴのｉｎ－ｖｉｖｏスクリーニング実験結果は、対応するｉｎ－ｖｉｔｒｏ実験結果と一致しており、ＳＮＡ００６ａが前述のすべての単一ドメイン抗体の中で最も強いＣＤ８トレーシング能力を有することがさらに証明された。
実施例６ ＮＯＴＡ－ＣＤ８α単一ドメイン抗体前駆体の合成と68Ｇａ－ＮＯＴＡ－ＣＤ８α単一ドメイン抗体の放射性標識化
６．１ ＮＯＴＡ－ＣＤ８α単一ドメイン抗体前駆体の合成
二官能性キレート剤ｐ－ＳＣＮ－ＮＯＴＡをＣＤ８単一ドメイン抗体に結合させた。カップリング生成物をＰＤ－１０カラムで精製し、バッファーを通常生理食塩水に置換した。紫外分光光度計で２８０ｎｍの吸光度を測定し、ＥＳＩ－Ｑ－ＴＯＦ－ＭＳでカップリング効率を分析した。カップリング製品の腫瘍細胞への標的化をｉｎ－ｖｉｔｒｏ細胞試験（腫瘍細胞結合および親和性検出）で、ＣＤ８αタンパク質へのｉｎ－ｖｉｔｒｏ親和性をＥＬＩＳＡで解析した。
ＰＤ－１０カラム（ＧＥ社製）を用いて、ＣＤ８α－ｃＨｉｓ単一ドメイン抗体（Ｃ３７、Ｃ４６、Ｓ５を含む）の緩衝液を所定のｐＨのＮａＨＣＯ3緩衝液に変更し、ｐ－ＳＣＮ－Ｂｎ－ＮＯＴＡ（Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ、商品番号Ｂ－６０５）を２５ｍｇ／ｍＬの濃度でＤＭＳＯに溶解させた。 単一ドメイン抗体上のリジンのモル数が２倍であるｐ－ＳＣＮ－Ｂｎ－ＮＯＴＡ溶液をＣＤ８α単一ドメイン抗体中に加え、上記材料を室温で一定時間反応させ、コンジュゲート生成物をＰＤ－１０カラム（ＧＥ）で精製し、限外ろ過で濃縮した。
標識後の上記ＣＤ８α－ＮＯＴＡの活性は、ＥＬＩＳＡ法により測定した。具体的な方法は、ＣＤ８α－Ｆｃ融合タンパク質を５μｇ／ｗｅｌｌの濃度でコートプレートに入れ、４℃で一晩静置した。３％ＢＳＡで３７℃にブロッキングした後、勾配希釈したサンプル（非結合ＣＤ８α 単一ドメイン抗体は標準物質）を加え、３７℃で１時間作用させた。その後、抗ｈｉｓ－ＨＲＰ（Ａｂｃａｍ Ｃｏｍｐａｎｙより購入）を加え、室温で１時間反応させた。その後、発色液を加え、４５０ｎｍの吸収値を読み取った。ＥＬＩＳＡの活性を表９にまとめた。
表９ ＣＤ８α－ｃＨｉｓ－ＮＯＴＡのＥＬＩＳＡ活性測定結果のまとめ
６．２ 68Ｇａ－ＮＯＴＡ－ＣＤ８α 単一ドメイン抗体の放射性同位元素分析
68Ｇａ溶液（68Ｇａ ｌｅａｃｈｅａｔｅ）は、Ｅｃｋｅｒｔ＆Ｚｉｅｇｌｅｒ ＩＧＧ１００ ゲルマニウム６８／ガリウム６８（Ｇｅ ６８／Ｇａ ６８）ジェネレータを０．１Ｍ滅菌ＨＣｌで溶出し、同量の０．２Ｍ酢酸ナトリウム溶液を加えて調製した。 上記ＮＯＴＡ－ＣＤ８抗体を含み、ｐＨが５．３である０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液を１／４量加え、反応系のｐＨを４．５～４．７とし、上記材料を室温で１０分間反応させた。生成物の緩衝系を通常生理食塩水に交換しながら、未反応のイオンガリウムをＰＤ－１０カラムで除去し、０．２２μｍフィルター膜で濾過した。ｐＨ、Ｒａｄｉｏ－ＴＬＣ、Ｒａｄｉｏ－ＨＰＬＣ、放射能、放射化学純度などの分析を行い、品質管理を行った。また、ＩＴＧゲルマニウム６８／ガリウム６８（Ｇｅ－６８／Ｇａ－６８）ジェネレータを０．０５Ｍ滅菌塩酸で浸出し、０．２Ｍ酢酸ナトリウム溶液を１／２量加え、その他の反応条件、品質管理条件を同じにして68Ｇａ浸出液も調製した。
６．３ インスタント薄層クロマトグラフィー（ＩＴＬＣ）分析
ＩＴＬＣ－ＳＧはあらかじめ１ｃｍ×１２ｃｍの短冊状にカットし、短冊の端と端の距離を鉛筆でラベルした。現像槽にタンクが隠れるまで現像液を注ぎ、現像液のバランスを取った。68Ｇａ－ＣＤ８ 単一ドメイン抗体注入液を、ＩＴＬＣストリップの底から１ｃｍ離れた鉛筆の線に滴下した。ＩＴＬＣストリップを現像室に入れ、サンプリングポイントから１０ｃｍ離れた位置（鉛筆の一番上の線マークまで）で現像した。ＬＴＩＣを放射光ＩＴＬＣスキャナーでスキャンし、クロマトグラム上のピークを積分することで放射化学純度（ＲＣＰ）を算出した。解析結果を図７に示すが、ＣＤ８単一ドメイン抗体は、ポジトロン核種68Ｇａでの標識に成功したことがわかる。
実施例７ 68Ｇａ－ＮＯＴＡ－ＣＤ８α単一ドメイン抗体の生体内分布
７．１ 68Ｇａ－ＮＯＴＡ－ＣＤ８α単一ドメイン抗体研究のための動物モデル
６－８週齢の雌性ヌードマウスをｉｎ－ｖｉｖｏ試験に使用した。ヌードマウスは特定病原体フリー（ＳＰＦ）環境で飼育され、自由摂餌、昼夜１２時間の標準的な周期で光をあてた。異種移植は、１００μＬの細胞（ＭＣ３８－ＣＤ８またはＭＣ３８）／ＰＢＳをヌードマウスの右前脚に皮下移植した。細胞の接種密度は、約５～６×１０6個／動物であった。移植はイソフルラン麻酔下で行われた。この条件下で、注射した動物の９０％以上で、１－２週間後に適当な腫瘍（１００－３００ｍｍ3）（ＭＣ３８－ＣＤ８またはＭＣ３８）が得られた。
実験終了後、腫瘍組織を採取してＣＤ８免疫組織化学染色を行い、ＣＤ８の発現量を解析し、ＰＥＴ／ＣＴで検出された腫瘍全体のＣＤ８発現量と比較した。
７．２ 68Ｇａ－ＮＯＴＡ－ＣＤ８α 単一ドメイン抗体の生体内分布
７．１ の方法に従って ＭＣ３８－ＣＤ８＋／－ 腫瘍モデルを接種し、放射性標識単一ドメイン抗体約 １０μｇ（ 約 １００μＣｉ／１０μｇ）を尾静脈からヌードマウスに投与した。データは１時間後と１．５時間後に収集し、各時点で３匹のヌードマウスを安楽死させた。血液、腎臓、肝臓、脾臓、肺、心臓、腸、胃、筋肉、皮膚、脳、骨、ＣＤ８＋／－腫瘍などの対象組織を剥離し、γカウンターでカウントしてデータ収集した。注入量は総注入量として使用した。各臓器について、総注入量から％注入量（％ＩＤ）を求め、臓器の重量を測定して１グラムあたりの％注入量（％ＩＤ／ｇ）を求めた。
図８は、ＭＣ３８－ＣＤ８腫瘍を有するインタクトの雄マウスにおける68Ｇａ－ＮＯＴＡ－ＣＤ８α単一ドメイン抗体のｉｎ－ｖｉｖｏ摂取による生体内分布データを示し、これは皮下腫瘍を有するインタクトの雄マウスにおける68Ｇａ－ＮＯＴＡ－ＣＤ８摂取によるｅｘ－ｖｉｖｏ生体内分布データ（ｎ＝３）である。データは静脈内投与後１時間および１．５時間後に収集された。データは平均％ＩＤ／ｇ±標準偏差（Ｓ．Ｄ．）で表示されている。比率の誤差は、標準偏差の幾何平均で計算される。図８に示すように、エラーバーはこのグループの標準偏差を表す。
図９は、これらの実験における腫瘍組織と血液の摂取比率、腫瘍組織と対側の正常筋の摂取比率の結果である。ＣＤ８単一ドメイン抗体は、ターゲットを発現しているＭＣ３８－ＣＤ８腫瘍において良好な腫瘍浸潤性を示す。腫瘍と筋肉の比率のピークが高く、68Ｇａ－ＮＯＴＡ－ＳＮＡ００６ａ単一ドメイン抗体は腫瘍特異性が高いことを示す。68Ｇａ－ＮＯＴＡ－ＳＮＡ００６ａは、腫瘍の撮像に有効な薬剤となる可能性がある。
実施例８ 68Ｇａ－ＮＯＴＡ－ＣＤ８α単一ドメイン抗体を用いたｉｎ－ｖｉｖｏ ＰＥＴ撮像
ＭＣ３８－ＣＤ８＋／－腫瘍モデルを６．１の方法に従って接種した。マイクロＰＥＴ／ＣＴ（ＩＲＩＳ ＰＥＴ／ＣＴ、Ｉｎｖｉｓｃａｎ、Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ、Ｆｒａｎｃｅ）スキャンを使用してフォーカス％ＩＤ／ｇを測定した。小動物の連続ＰＥＴ／ＣＴスキャンを１２０分間行い、図１０に示すように複数の時点における腫瘍、筋肉、腎臓の放射能吸収を分析した。画像再構成にはモンテカルロ法に基づく３Ｄ ＯＳＥＭアルゴリズムが使用された。腫瘍、筋肉、肝臓、その他の臓器において、関心領域法（ＲＯＩ）により放射能（ＭＢｑ／ｍＬ）を算出した。得られた値を注入量で割って、ＰＥＴトレーサーに対する各組織の摂取量（％ＩＤ／ｇ）を求めた（組織密度を１ｇ／ｍｌと仮定）。計算結果を図１０に示す。
図１０の結果は、上記ＰＥＴトレーサー68Ｇａ－ＮＯＴＡ－ＳＮＡ００６ａを注入してから１２０分後に、ＭＣ３８－ＣＤ８移植腫瘍がはっきりと確認でき、ＣＤ８陰性発現のＭＣ３８移植腫瘍は注入後摂取されないことを示している。したがって、ＭＣ３８－ＣＤ８腫瘍は、対側の陰性対照腫瘍と比較して、良好な識別性を有している。ＰＥＴ検査の結果、腫瘍、筋肉、腎臓の複数の時点における放射能吸収が解析された。生体分布のＲＯＩ結果を図１１に示すように活性時間曲線で解析した。
その結果、68Ｇａ－ＮＯＴＡ－ＳＮＡ００６ａ、68Ｇａ－ＮＯＴＡ－ＳＮＡ００６ｃ、68Ｇａ－ＮＯＴＡ－ＳＮＡ００６ｄはいずれも腫瘍部位での摂取量が多く、68Ｇａ－ＮＯＴＡ－ＳＮＡ００６ａの撮像効果はｃおよびｄよりも有意に優れていることがわかった。ＰＥＴのｉｎ－ｖｉｖｏスクリーニング実験結果は、対応するｉｎ－ｖｉｔｒｏ実験結果と一致し、68Ｇａ－ＮＯＴＡ－ＳＮＡ００６ａが上記のすべての単一ドメイン抗体の中で最も強いＣＤ８追跡能力を有することをさらに証明するものであった。
実施例９ 68Ｇａ－ＮＯＴＡ－ＣＤ８α単一ドメイン抗体のｉｎ－ｖｉｖｏ安定性実験
正常なマウスを採取し、尾静脈から68Ｇａ－ＮＯＴＡ－ＳＮＡ００６ａ ７４ ＭＢｑ （１ ｍＣｉ／１００μＬ ＰＢＳ） を投与した。注入後０．５時間および１時間後に尿サンプルを採取し、すべてのサンプルを一定量の５０％アセトニトリル水溶液で溶解した後、８０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清を０．２２μｍフィルター膜に取り、その後、ろ液をＲａｄｉｏ－ＴＬＣで分析した。
Ｒａｄｉｏ－ＴＬＣの結果を図１２に示す。図中、顕著な劣化や68Ｇａの脱落現象は見られず、この条件下では放射性標識抗体は構造的に安定で、生体内での安定性も良好であることがわかる。

Claims (48)

  1. ＣＤ８αに特異的に結合することができる少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含み、
    少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインが下記（１）～（２０）から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、免疫グロブリン単一可変ドメインがＶＨＨである、ＣＤ８α結合ポリペプチド:
    （１） 配列番号２６のＣＤＲ１、配列番号２７のＣＤＲ２および配列番号２８のＣＤＲ３；
    （２） 配列番号３０のＣＤＲ１、配列番号３１のＣＤＲ２および配列番号３２のＣＤＲ３；
    （３） 配列番号３８のＣＤＲ１、配列番号３９のＣＤＲ２および配列番号４０のＣＤＲ３；
    （４） 配列番号４２のＣＤＲ１、配列番号４３のＣＤＲ２および配列番号４４のＣＤＲ３；
    （５） 配列番号２のＣＤＲ１、配列番号３のＣＤＲ２および配列番号４のＣＤＲ３；
    （６） 配列番号６のＣＤＲ１、配列番号７のＣＤＲ２および配列番号８のＣＤＲ３；
    （７） 配列番号１０のＣＤＲ１、配列番号１１のＣＤＲ２および配列番号１２のＣＤＲ３；
    （８） 配列番号１４のＣＤＲ１、配列番号１５のＣＤＲ２および配列番号１６のＣＤＲ３；
    （９） 配列番号１８のＣＤＲ１、配列番号１９のＣＤＲ２および配列番号２０のＣＤＲ３；
    （１０） 配列番号２２のＣＤＲ１、配列番号２３のＣＤＲ２および配列番号２４のＣＤＲ３；
    （１１） 配列番号３４のＣＤＲ１、配列番号３５のＣＤＲ２および配列番号３６のＣＤＲ３；
    （１２） 配列番号４６のＣＤＲ１、配列番号４７のＣＤＲ２および配列番号４８のＣＤＲ３；
    （１３） 配列番号５０のＣＤＲ１、配列番号５１のＣＤＲ２および配列番号５２のＣＤＲ３；
    （１４） 配列番号５４のＣＤＲ１、配列番号５５のＣＤＲ２および配列番号５６のＣＤＲ３；
    （１５） 配列番号５８のＣＤＲ１、配列番号５９のＣＤＲ２および配列番号６０のＣＤＲ３；
    （１６） 配列番号６２のＣＤＲ１、配列番号６３のＣＤＲ２および配列番号６４のＣＤＲ３；
    （１７） 配列番号６６のＣＤＲ１、配列番号６７のＣＤＲ２および配列番号６８のＣＤＲ３；
    （１８） 配列番号７０のＣＤＲ１、配列番号７１のＣＤＲ２および配列番号７２のＣＤＲ３；
    （１９） 配列番号７４のＣＤＲ１、配列番号７５のＣＤＲ２および配列番号７６のＣＤＲ３；
    （２０） 配列番号７８のＣＤＲ１、配列番号７９のＣＤＲ２および配列番号８０のＣＤＲ３。
  2. 免疫グロブリン単一可変ドメインが、配列番号２９、３３、４１、４５、５、９、１３、１７、２１、２５、３７、４９、５３、５７、６１、６５、６９、７３、７７および８１の一つのアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＣＤ８α結合ポリペプチド。
  3. 免疫グロブリン単一可変ドメインが、配列番号２９、３３、４１、４５、５、９、１３、１７、２１、２５、３７、４９、５３、５７、６１、６５、６９、７３、７７および８１の一つのアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載のＣＤ８α結合ポリペプチド。
  4. 請求項１～３のいずれか一項に記載のＣＤ８α結合ポリペプチドをコードする核酸分子。
  5. 発現調節エレメントに作動可能に連結された請求項４に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
  6. 請求項４に記載の核酸分子を含むか、または請求項５に記載の発現ベクターによって形質転換された、ＣＤ８α結合ポリペプチドを発現することが可能である、宿主細胞。
  7. 以下を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のＣＤ８α結合ポリペプチドの生成方法：
    ａ）ＣＤ８α結合ポリペプチドの発現を可能にする条件下で、請求項６に記載の宿主細胞を培養すること；
    ｂ）工程ａ）で得られた培養物から、宿主細胞によって発現されたＣＤ８α結合ポリペプチドを回収すること；および
    ｃ）工程ｂ）で得られたＣＤ８α結合ポリペプチドをさらに精製および／または修飾すること。
  8. 請求項１～３のいずれか一項に記載のＣＤ８α結合ポリペプチドと、該ＣＤ８α結合ポリペプチドに結合した少なくとも１つの検出可能な標識とを含む、コンジュゲート分子。
  9. 検出可能な標識が、放射性核種、蛍光剤、化学発光剤、生物発光剤、常磁性イオン、および酵素から選択される、請求項８に記載のコンジュゲート分子。
  10. 検出可能な標識が、110Ｉｎ、111Ｉｎ、177Ｌｕ、18Ｆ、52Ｆｅ、62Ｃｕ、64Ｃｕ、67Ｃｕ、67Ｇａ、68Ｇａ、68Ｇｅ、86Ｙ、90Ｙ、89Ｚｒ、120Ｉ、123Ｉ、124Ｉ、125Ｉ、131Ｉ、32Ｐ、11Ｃ、13Ｎ、15Ｏ、186Ｒｅ、188Ｒｅ、51Ｍｎ、55Ｃｏ、72Ａｓ、75Ｂｒ、76Ｂｒ、83Ｓｒまたは他のγ－、β－または正のエミッターから選択される、請求項９に記載のコンジュゲート分子。
  11. 検出可能な標識が、68Ｇａまたは125Ｉである、請求項９に記載のコンジュゲート分子。
  12. ＣＤ８α結合ポリペプチドが、キレート剤を介して検出可能な標識に結合された、請求項８～１０のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子。
  13. キレート剤が、ＤＴＰＡ、ＥＤＴＡ、ＮＯＴＡ、ＤＯＴＡ、ＴＲＡＰ、ＴＥＴＡ、ＮＥＴＡ、ＣＢ－ＴＥ２Ａ、Ｃｙｃｌｅｎ、Ｃｙｃｌａｍ、Ｂｉｓｐｉｄｉｎｅ、ＴＡＣＮ、ＡＴＳＭ、ＳａｒＡｒ、ＡｍＢａＳａｒ、ＭＡＧ3、ＭＡＧ2、ＨＹＮＩＣ、ＤＡＤＴ、ＮＳ3、Ｈ２ｄｅｄｐａ、ＨＢＥＤ、ＤＦＯ、ＰＥＰＡまたはＨＥＨＡ、およびそれらの誘導体から選択される、請求項１２に記載のコンジュゲート分子。
  14. 検出可能な標識が68Ｇａであり、キレート剤がＮＯＴＡである、請求項１３に記載のコンジュゲート分子。
  15. 以下を含む、生体試料中のＣＤ８αの存在および／または量を検出する方法：
    ａ）請求項１～３のいずれか一項に記載のＣＤ８α結合ポリペプチドまたは請求項８～１４のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子がＣＤ８αと複合体を形成し得る条件下で、生物試料および対照試料を請求項１～３のいずれか一項に記載のＣＤ８α結合ポリペプチドまたは請求項８～１４のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子に接触させること；および
    ｂ）複合体の形成を検出すること；
    ここで、生体試料と対照試料との間の複合体形成の差は、試料中のＣＤ８αの存在および／または量を示す。
  16. 請求項１～３のいずれか一項に記載のＣＤ８α結合ポリペプチドまたは請求項８～１４のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子、および生理学的に許容される担体を含む、ＣＤ８α陽性細胞を検出するための検出剤。
  17. 検出剤が造影剤である、請求項１６に記載の検出剤。
  18. 造影剤が、放出コンピュータ断層撮影（ＥＣＴ）造影剤である、請求項１７に記載の検出剤。
  19. 造影剤が、単光子放出コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）造影剤または陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）造影剤である、請求項１８に記載の検出剤。
  20. ＣＤ８α陽性細胞を検出するための検出剤の調製における、請求項１～３のいずれか一項に記載のＣＤ８α結合ポリペプチドまたは請求項８～１４のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子の使用。
  21. 検出剤が造影剤である、請求項２０に記載の使用。
  22. 造影剤が、ＥＣＴ造影剤である、請求項２１に記載の使用。
  23. 造影剤が、ＳＰＥＣＴ造影剤またはＰＥＴ造影剤である、請求項２２に記載の使用。
  24. 組織中のＣＤ８α陽性細胞の存在および／または量を検出する方法に使用するための請求項８～１４のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子または請求項１６～１９のいずれか一項に記載の検出剤であって、前記方法が、
    ａ）組織を、請求項８～１４のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子または請求項１６～１９のいずれか一項に記載の検出剤と接触させること；および
    ｂ）組織中のＣＤ８α陽性細胞の存在および／または量を測定すること
    を含む、コンジュゲート分子または検出剤。
  25. 組織が、血液組織、リンパ組織および腫瘍組織から選択される、請求項２４に記載のコンジュゲート分子または検出剤。
  26. ＣＤ８α陽性細胞がＣＤ８α陽性Ｔ細胞である、請求項２４または２５に記載のコンジュゲート分子または検出剤。
  27. 組織中のＣＤ８α陽性細胞の存在および／または量が、組織を撮像することによって決定される、請求項２４～２６のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子または検出剤。
  28. 組織中のＣＤ８α陽性細胞の存在および／または量が、フローサイトメトリーにより決定される、請求項２４～２６のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子または検出剤。
  29. 請求項８～１４のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子または請求項１６～１９のいずれか一項に記載の検出剤を対象に投与することを含む、対象の組織におけるＣＤ８α陽性細胞の存在および／または量を検出する方法に使用するための請求項８～１４のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子または請求項１６～１９のいずれか一項に記載の検出剤。
  30. 組織が腫瘍組織である、請求項２９に記載のコンジュゲート分子または検出剤。
  31. ＣＤ８α陽性細胞がＣＤ８α陽性Ｔ細胞である、請求項２９または３０に記載のコンジュゲート分子または検出剤。
  32. ＥＣＴ撮像により、対象を撮像する工程をさらに含む、請求項２９～３１のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子または検出剤。
  33. ＥＣＴ撮像はＳＰＥＣＴ撮像またはＰＥＴ撮像である、請求項３２に記載のコンジュゲート分子または検出剤。
  34. 腫瘍を有する対象が抗腫瘍療法に適しているかどうかを決定する方法に使用するための請求項８～１４のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子または請求項１６～１９のいずれか一項に記載の検出剤であって、前記方法が、
    １）請求項８～１４のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子または請求項１６～１９のいずれか一項に記載の検出剤を対象に投与すること；および
    ２）対象の腫瘍がＣＤ８α陽性細胞を含むかどうかを決定するために、ＥＣＴ撮像により、対象を撮像すること
    を含み、
    ここで、腫瘍におけるＣＤ８α陽性細胞の存在が検出された場合、当該対象は、抗腫瘍療法に適していると同定される、コンジュゲート分子または検出剤。
  35. 腫瘍を有する対象が抗腫瘍療法に適しているかどうかを決定する方法に使用するための請求項８～１４のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子または請求項１６～１９のいずれか一項に記載の検出剤であって、前記方法が、
    １）請求項８～１４のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子または請求項１６～１９のいずれか一項に記載の検出剤を対象に投与すること、および
    ２）対象の腫瘍がＣＤ８α陽性細胞を含むかどうかを判断するために、ＥＣＴ撮像により、対象を撮像すること、
    を含み、
    ここで、腫瘍におけるＣＤ８α陽性細胞の存在が検出された場合、対象は、抗腫瘍療法に応答し得る、コンジュゲート分子または検出剤。
  36. 対象における腫瘍を治療するための方法に使用するための請求項８～１４のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子または請求項１６～１９のいずれか一項に記載の検出剤であって、前記方法が、
    １）請求項８～１４のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子または請求項１６～１９のいずれか一項に記載の検出剤を対象に投与すること；および
    ２）対象の腫瘍がＣＤ８α陽性細胞を含むかどうかを判断するために、ＥＣＴ撮像により、対象を撮像すること
    を含み、
    ここで、腫瘍におけるＣＤ８α陽性細胞の存在が検出された場合、対象に抗腫瘍療法を適用する、コンジュゲート分子または検出剤。
  37. 対象における抗腫瘍療法の有効性をモニタリングする方法に使用するための請求項８～１４のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子または請求項１６～１９のいずれか一項に記載の検出剤であって、前記方法が、
    １）請求項８～１４のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子または請求項１６～１９のいずれか一項に記載の検出剤を、腫瘍を有し、抗腫瘍療法で治療された対象に投与すること；および
    ２）対象の腫瘍におけるＣＤ８α陽性細胞の量を決定するためＥＣＴ撮像により、対象を撮像すること
    を含む、コンジュゲート分子または検出剤。
  38. 抗腫瘍療法が免疫チェックポイント阻害剤療法である、請求項３４～３７のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子または検出剤。
  39. 抗腫瘍療法が、放射線治療であるか、またはＰＤ－１阻害剤、ＰＤ－Ｌ１阻害剤、ＣＴＬＡ－４阻害剤、ＴＩＭ３阻害剤、ＢＴＬＡ阻害剤、ＴＩＧＩＴ阻害剤、ＣＤ４７阻害剤、ＧＩＴＲ阻害剤、ＬＡＧ３阻害剤、インドールアミン－２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）阻害剤、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）拮抗剤、Ａｎｇ２阻害剤、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）阻害剤、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤、ＣＤ２０阻害剤、腫瘍特異的抗原に対する抗体、ワクチン、抗原提示を増加させるアジュバント、二重特異性抗体、細胞毒素、化学療法剤、シクロホスファミド、ＩＬ－６Ｒ阻害剤、ＩＬ－４Ｒ阻害剤、ＩＬ－１０阻害剤、サイトカインおよび抗体－薬物複合体（ＡＤＣ）の投与から選択される、請求項３４～３８のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子または検出剤。
  40. 腫瘍が固形腫瘍である、請求項３４～３９のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子または検出剤。
  41. 固形腫瘍が、大腸癌、卵巣癌、前立腺癌、乳癌、脳腫瘍、子宮頸癌、膀胱癌、肛門癌、子宮癌、結腸癌、肝臓癌、膵臓癌、肺癌、子宮内膜癌、骨癌、精巣癌、皮膚癌、腎癌、胃癌、食道癌、頭頸部癌、唾液腺癌および骨髄腫から選ばれる、請求項４０に記載のコンジュゲート分子または検出剤。
  42. ＣＤ８α陽性細胞を単離および／または精製する方法であって、以下を含む方法：
    （ａ）ＣＤ８α陽性細胞を含むと疑われる細胞集団を提供すること；
    （ｂ）細胞集団の亜集団を同定すること、ここで亜集団の細胞は、請求項１～３のいずれか一項に記載のＣＤ８α結合ポリペプチドまたは請求項８～１４のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子に結合する；および
    （ｃ）亜集団を単離すること。
  43. ＣＤ８α陽性細胞を単離する方法であって、以下を含む方法：
    （ａ）ＣＤ８α陽性細胞を含むと疑われる細胞集団を提供すること；
    （ｂ）細胞集団を、請求項１～３のいずれか一項に記載のＣＤ８α結合ポリペプチドまたは請求項８～１４のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子と接触させ、それによってＣＤ８α陽性細胞が、請求項１～３のいずれか一項に記載のＣＤ８α結合ポリペプチドまたは請求項８～１４のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子に結合することを可能にすること；
    （ｃ）請求項１～３のいずれか一項に記載のＣＤ８α結合ポリペプチドまたは請求項８～１４のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子に結合しない細胞を除去すること；および
    （ｄ）請求項１～３のいずれか一項に記載のＣＤ８α結合ポリペプチドまたは請求項８～１４のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子に結合するＣＤ８α陽性細胞を回収すること。
  44. ＣＤ８α陽性細胞がＣＤ８α陽性Ｔ細胞である、請求項４２または４３に記載の方法。
  45. ＣＤ８α陽性細胞を含むと疑われる細胞集団が、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である、請求項４２～４４のいずれか一項に記載の方法。
  46. 請求項１～３のいずれか一項に記載のＣＤ８α結合ポリペプチドまたは請求項８～１４のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子が固体表面に固定化されている、請求項４２～４５のいずれか一項に記載の方法。
  47. 請求項１～３のいずれか一項に記載のＣＤ８α結合ポリペプチドまたは請求項８～１４のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子がゲルまたは磁気ビーズの表面に固定化されている、請求項４２～４５のいずれか一項に記載の方法。
  48. 請求項１～３のいずれか一項に記載のＣＤ８α結合ポリペプチド、請求項８～１４のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子、または請求項１６～１９のいずれか一項に記載の検出剤を含む、キット。
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